JP5798289B2 - 異常蛋白質除去用組成物 - Google Patents
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Description
他方、本発明者等は、異常蛋白質を除去する成分を探索した結果、大豆サポニン以外にケール(特許文献4:特開2004−91398号公報)にその効果を見出している。
異常蛋白質が関与する加齢に伴う種々の疾患の予防及び治療の目的に、上記大豆サポニンを用いると、通常の摂取量として負担量が多くなることが判明し、少ない量でもさらなる効果の高い成分の開発探求を行ってきた。
本発明の主な構成は、以下のとおりである。
(1)異常蛋白質が蓄積したヒトに大豆サポニンBグループを含有する飲食物を経口的に摂取させることにより、蓄積した異常蛋白質であるカルボニル化蛋白質を除去するため、大豆抽出物100重量部のうち、大豆サポニンBグループを40〜100重量部含有する大豆抽出物を飲食物として摂取させる方法(医療行為を除く)。
(2)経口的に摂取させる飲食物中に、さらにコラーゲン、ゼラチン、コラーゲン加水分解物、ゼラチン加水分解物から選択されるいずれか一種以上及び/又はシリマリンが含まれていることを特徴とする(1)に記載の方法(医療行為を除く)。
本発明の異常蛋白質除去用組成物を用いれば、蓄積した異常蛋白質を除去することができる。従って、本発明の製剤は、蛋白質分解異常による疾患又は障害(アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚の光老化、皮膚におけるしわ)等蛋白質分解異常による疾病の予防又は治療において有効である。さらに、抗老化用の化粧料や食品としても有用である。
具体的には、抗老化効果、くすみ抑制効果、しわ抑制効果、保湿効果、紫外線障害予防・改善作用について効果が期待できる。
具体的な利用形態として、医薬、食品、化粧料、飼料などに利用できる。
本発明において、異常蛋白質とは、一般に加齢に伴い、酸化又は糖化又はアルデヒド修飾を受けた蛋白質を言う。
大豆由来のサポニンは、大豆種子中の種皮、子葉、胚軸又は大豆植物体の葉、茎、根等に広く分布する。構造的にはグリチルリチンと類似の構造であるが、トリテルペノイド骨格に2〜5個の糖から成る糖鎖を持つ。大豆サポニンはアグリコン(非糖部)の構造によって4つのグループ(A、B、E及びDDMPグループ)に分類され、すべてのグループのサポニンが多種多様な糖鎖構造を有する。現在までにSoyasapogenol A 、B、E及びDDMPをそれぞれアグリコンとする8種類のAグループ、2種類のEグループ、5種類のBグループ、6種類のDDMPグループが同定されている(非特許文献Agric Biol Chem,55 315-322(1991))(非特許文献Agric Biol Chem,55 911-917(1991))(非特許文献Agric Biol Chem,57 546-550(1993))。
また、本発明者等が、大豆サポニンBグループの安全性を調べる為、変異原性及び急性毒性について試験したところ、いずれも異常なく、その安全性が高いことが証明された。
本発明の高含有大豆サポニンBグループは、以下の工程で得ることが出来る。
原料大豆胚軸は、有機溶媒等であらかじめ脱脂したもの、していないものいずれも使用可能であるが、サポニンの抽出効率から脱脂したものの方が有利である。原料大豆胚軸よりサポニンを抽出する方法は、室温から80℃において原料に対して5〜10倍容量の抽出溶媒を加えて攪拌するのが一般的な方法であるが、サポニンが十分に抽出できる条件であれば特に限定されない。
本発明におけるイオン交換樹脂は、3級アミンを含む弱塩基性陰イオン交換樹脂であれば特に制限はなく、粒径が不均一な樹脂、例えば、三菱化成製ダイヤイオンWA-30なども利用可能であるが、平均粒径±10%の範囲に90%以上の粒度分布をもつ均一粒径のものが好ましい。
上記サポニン抽出液から、蒸留操作により溶媒を溜去し、水で希釈したサポニン溶液を上記イオン交換樹脂に吸着させた後、水、アルコールあるいは含水アルコールで樹脂を洗浄した後、酸又はアルカリを使って樹脂に吸着させたサポニンを溶出する。溶出したサポニン溶液をそのまま乾燥して得られる大豆サポニン粗精製物は純度20〜50重量%と低く、サポニン以外の不純物が多く、生理活性の高い大豆サポニンBグループの比率も20〜30重量%程度と低いものである。
サポニンの純度を高めるために、溶出したサポニンをそのまま水で希釈し、無極性の合成吸着剤にサポニンを吸着させる。無極性の合成吸着剤としては、スチレン・ジビニルベンゼン型樹脂などがあり、例えば、三菱化学製、ダイヤイオンHP-20やローム・アンド・ハース社製のアンバーライトXAD−2などが使用可能である。合成吸着剤に吸着させる際に使用する含水アルコール中のアルコール濃度はアルコールの種類によって異なるが、メタノールの場合は、0〜50重量%、エタノールの場合は、0〜30重量%が好ましい。次に、水あるいは含水エタノールで樹脂を洗浄した後、洗浄時よりアルコール濃度の高い含水アルコールで溶出させてサポニン高純度溶液を得ることができる。
得られたサポニン高純度溶液を、必要に応じてpH調整剤を用いてpH調整した後、加熱乾燥、減圧加熱乾燥、スプレードライ、凍結乾燥などの方法で乾燥することにより高純度大豆サポニン粉末を得ることができる。
以上の工程で効率よく安価に、純度70重量%以上の高純度大豆サポニンを得ることができ、かつ、活性の高い大豆サポニンBグループを50%重量以上の濃度に濃縮できる他、総サポニン中の大豆サポニンBグループ比率を70重量%以上に高めることもできる。
このような作用効果を利用する形態としては、医薬、食品、飲料、サプリメント、食品添加剤、化粧料、飼料、飼料添加剤、動物薬等である。経口あるいは非経口共提供可能である。
高純度大豆サポニンBグループは、そのままでも、様々な用途に使用できるが、目的に応じて予め様々な他の成分と混合、あるいは食品や飼料あるいは動物薬に添加することができる。
本発明の異常蛋白質除去用組成物は、上記高純度大豆サポニンBグループの他に生体コラーゲン合成促進剤を有する化合物を含有させることができる。生体コラーゲン合成促進作用を示す化合物は、特に限定されるものではないが、例えばコラーゲン及びゼラチンの分解物、N末端にグリシンを含むトリペプチドを含有するペプチド混合物などが挙げられる。
これに対してコラーゲン及び/又はゼラチンの分解物は、特定の有効成分として分子量で約400以下のペプチドを含むことにより、その加水分解処理により、生体内でのコラーゲン合成促進活性を向上させることに寄与できる。
油脂類としては、例えば、ツバキ油、月見草油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ナタネ油、トウモロコシ油、ゴマ油、ホホバ油、胚芽油、小麦胚芽油、トリオクタン酸グリセリン、等の液体油脂、カカオ脂、ヤシ油、硬化ヤシ油、パーム油、パーム核油、モクロウ、モクロウ核油、硬化油、硬化ヒマシ油等の固体油脂、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、ヌカロウ、ラノリン、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ等のロウ類が挙げられる。
金属イオン封鎖剤として、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エデト酸、エデト酸ナトリウム塩等のエデト酸塩を挙げることができる。
[高純度大豆サポニンBグループのUV照射マウスの皮膚への効果試験]
導入時6週齢のヘアレスマウス(Hos:HR-1 ♂)を用いて以下の条件で試験を行った。
1)試験対象物の調製及び投与
ヘアレスマウスの群分けは投与開始日に、一般状態が良好な動物を体重により、群間での差が無いように1群5匹に振り分けた。なお、各々の個体は1ゲージ/群で飼育とした。大豆サポニンクルード(大豆サポニンAグループ:14.9%、大豆サポニンBグループ:25.8%)は、蒸留水に懸濁して体重あたりの総サポニン量を50mg/kgとして((a)クルード原料として123mg/kg)、大豆サポニンBグループ(大豆サポニンAグループ:9.5%、大豆サポニンBグループ:69.4%)は、蒸留水に懸濁して体重あたりのサポニンBグループ量を50mg/kgとして((b)サポニンB原料として72mg/kg)それぞれ1日1回10週間、胃ゾンデを用いた強制経口投与にて摂取させた。UV照射を実施した日は照射2時間後に投与を行った。飼育条件を表1に示す。
水分量の測定は、モイスチャーチェッカーを用い、背部の尾付け根より首に向かい2cm、腰椎から右側に0.5cm部位を3回測定して平均を求めた。測定日は、試験開始日、中間観察日及び解剖日とした。
皮膚弾力測定装置(非特許文献Cutometer SEM 575/Electronic Gmbh co.製)を用いて、背部の尾付け根より首に向かい2cm、腰椎から右側に0.5cm部位を3回測定して平均を求めた。測定日は解剖日とした。
酸化蛋白質即ちカルボニル化蛋白質は、酸化障害により生じた蛋白質のカルボニル基に特異的に結合する2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)を用いてカルボニル化蛋白質を標識後、DNPHに特異的に結合する抗DNPH抗体を用いて検出した。具体的な方法は以下の通りである。UV照射部位の皮膚1cm2を切り取り、0.1Mトリスバッファー(pH 7.5)1mlを加えてホモジナイズし、10000rpm×15分間遠心し、その上清をフィルターろ過後解析を行った。蛋白質のジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)化は公知の方法(非特許文献Nakamura他、Journal of Biochemistry、119巻、768〜774頁、1996年)で行った。DNPH化した蛋白質をSDS−PAGEにより分離し、蛋白質転写装置を用いてPolyvinylidene difluoride(PVDF)膜に転写した。転写後の膜は2時間以上、5%スキムミルクを含むPBS(−)溶液中でブロッキングし、洗浄後抗DNPH抗体と2時間反応させ、洗浄後、ビオチン化抗ラビットイムノグルブリンG と1時間反応させた。洗浄後、蛍光検出キット(ECL PLUS)を用いてPVDF膜を感光し、医療用自動現像装置にて画像を転写した。画像解析はデンシトメ−ターを用いて行なった。
UV照射時は、動物を専用のPCケージに移し、1群ずつUVB20mj/cm2及びUVA14j/cm2を照射した。照射は月、水及び金の週3日サイクルで10週間実施した。
各群、本飼育期間終了翌日より18時間絶食後、ネンブタール(40mg/kg)腹腔内投与により麻酔を導入し解剖を実施した。この照射量、期間でヒトの光老化同様の皮膚のしわが形成されることが報告されている(非特許文献J of DermatologicalnScience 27519-525(2001))。
試験結果は平均値±標準誤差で表し、エクセル統計Student’s-t testにより有意差検定を行った。
第4週目頃よりUV照射動物において、頭部の皮膚の軽度褐色化や頸部のしわの深さならびに後肢背部のしわがUV非照射動物に比較して目立つようになった。
解剖時の外観観察にでは、UV照射動物で顔、頸部及び後肢背部のしわが明瞭に確認されたが、UV照射においても大豆サポニンクルード及び大豆サポニンBグループ摂取動物はその症状は軽度であり、特に大豆サポニンBグループ摂取動物のしわの深度が浅く、肉眼的にはしわの色が薄く観られた。また、大豆サポニンBグループ摂取動物は、Controlに比較して皮膚にしっとり感があり、特にUV+大豆サポニンBグループ摂取動物でその症状は顕著に感じられた。
体重推移は、各群大きな差異は認められなかった。
摂餌量についても体重推移同様に大きな差異は認められなかった。
肝臓重量についても大きな差異は認められず異常な症状は観察されなかった。また、他の臓器についても異常は認められなかった。
皮膚水分量はその数値が高いほど、皮膚中の水分が高い即ち保湿力が高いことが推測できる。UV照射により皮膚の水分量が低下することが一般的に知られており、本試験でも中間観察日、解剖日の水分量はコントロール群に比較してUV照射群では低くなっている。
皮膚水分量の測定では、中間観察日で、UV 照射群に比較し、UV照射+大豆サポニン摂取動物は2群とも高い値を示した。解剖日の測定においては、UV照射群に比較してUV照射+大豆サポニンクルード群が低い値を示したものの、UV照射+大豆サポニンBグループ群では平均値において高い値を示し、コントロール群と同程度の値であった。結果を図1に示す。
皮膚弾力性は、その数値が高いほど、皮膚の弾力性が高いことが推測できる。UV照射により皮膚の弾力性が低下することが一般的に知られている。この結果を図2に示す。UV非照射群において、大豆サポニン Bグループ投与群は大豆サポニンクルード群と比較して弾力性が 有意に高かった。
この結果を図3に示す。酸化蛋白質量はカルボニル化蛋白質量として検出される。カルボニル化蛋白質は、その数値が低いほど臓器における蓄積量が少ないことを示す。図3から明らかなように、酸化蛋白質量はUV照射によって、非照射に比べて著しく増加するものの、UV照射と並行して大豆サポニン Bグループを投与した群では有意に減少し、高純度大豆サポニンBグループの酸化蛋白質除去効果を示した。
特に、大豆サポニンクルード群では、UV 照射群と同程度であったのに対し、大豆サポニン Bグループでは、明確に減少しており、大豆サポニン Bの作用が発揮されていることが示されている。
さらに、高純度サポニンBグループ投与により皮膚弾力性が高まる事が明らかになった。高純度大豆サポニンBグループ50mg/kgのマウスへの投与は、体表面積換算式y=(3√x)2を用いてヒトへの投与量に換算すると約450mg/日/60kg体重に相当し、食品として無理なく摂取することが可能な量である。
導入時6週齢のラット(Wistar/Cri ♂)を用いて以下の条件で試験を行った。
Wistar系ラットの群分けは投与開始日に、一般状態が良好な動物を体重により、群間での差が無いように1群5匹に振り分けた。なお、各々の個体は単独飼育とした。大豆サポニンクルード(大豆サポニンAグループ:14.9%、大豆サポニンBグループ:25.8%)は、混餌給餌とし、オリエンタル酵母社製MF飼料に混ぜ、体重あたりの総サポニン摂取量が15mg/kgとなるように給餌した。大豆サポニンBグループ(大豆サポニンAグループ:9.5%、大豆サポニンBグループ:69.4%)についても混餌給餌とし、オリエンタル酵母社製MF飼料に混ぜ、体重あたりの大豆サポニンBグループ摂取量が15mg/kgとなるように給餌した。パラコートは、パラコート1000mgを500mlの生理食塩水に溶解した注射溶液を、体重あたり10mg/kgのDoseにて週1回、2ヶ月間腹腔内に注射投与を行った。飼育条件を表2に示す。
各群、本飼育期間終了翌日より18時間絶食後、ネンブタール(40mg/kg)腹腔内投与により麻酔を導入し解剖を実施した。
試験結果を図4〜6に示す。
パラコートは急性中毒も引き起こす強力な農薬であるため、投与直後には動物個体の体温低下や元気活力の低下及び軟便化が観察される。しかしながら、パラコート+大豆サポニン投与群ではその症状は軽く、投与後2日目にはコントロール群レベルに状態が回復していた。中でもパラコート+大豆サポニンBグループ摂取動物はその症状は軽度であり、投与期間の後半でも同様であった。
体重推移は、各群大きな差異は認められなかった。
摂餌量についても体重推移同様に大きな差異は認められなかった。
採取した各サンプル(皮膚1cm2/血液100μl/肝臓 100mg)に0.1Mトリスバッファー(pH 7.5)1mlを加えてホモジナイズし、10000rpm×15分間遠心し、その上清をフィルターろ過後解析を行った。蛋白質のジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)化は公知の方法(非特許文献Nakamura他、Journal of Biochemistry、119巻、768〜774頁、1996年)で行った。DNPH化した蛋白質をSDS−PAGEにより分離し、蛋白質転写装置を用いてPolyvinylidene difluoride(PVDF)膜に転写した。転写後の膜は2時間以上、5%スキムミルクを含むPBS(−)溶液中でブロッキングし、洗浄後抗DNPH抗体と2時間反応させ、洗浄後、ビオチン化抗ラビットイムノグルブリンG と1時間反応させた。洗浄後、蛍光検出キット(ECL PLUS)を用いてPVDF膜を感光し、医療用自動現像装置にて画像を転写した。画像解析はデンシトメ−ターを用いて行なった。
[カプセル剤]
組成
大豆サポニン(大豆サポニB 50%含有)…50mg
トコトリエノール…30mg
ミツロウ…10mg
ぶどう種子オイル…110mg
上記成分を混合し、ゼラチン及びグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。
[錠剤]
組成
大豆サポニン(大豆サポニB 50%含有)…25mg
マリアアザミ(シリマリン65%含有)…20mg
コラーゲン加水分解物…50mg
セルロース…40mg
デンプン・・・20mg
ショ糖脂肪酸エステル・・・2mg
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。
〔ジュース〕
(組 成) (配合;質量%)
果糖ブトウ糖液糖 5.00
クエン酸 10.4
L−アスコルビン酸 0.20
香料 0.02
色素 0.10
ゼラチン分解物(平均分子量300) 1.00
大豆サポニン(大豆サポニB 50%含有) 1.00
水 82.28
〔クリーム〕
(1)ステアリルアルコール 6.0
(2)ステアリン酸 2.0
(3)水添ラノリン 4.0
(4)スクワラン 9.0
(5)オクチルドデカノール 10.0
(6)POE(25)セチルアルコールエーテル 3.0
(7)モノステアリン酸グリセリン 2.0
(8)ゼラチン分解物(平均分子量300) 1.00
(9)大豆サポニン(大豆サポニB 50%含有) 1.00
(10)防腐剤 適量
(11)香料 適量
(12)1,3ブチレングリコール 6.0
(13)PEG 1500 4.0
(14)精製水 残余
上記成分(1)〜(11)を80℃に加熱溶解し油相とする。成分(12)〜(14)を70℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら40℃まで冷却し、さらに30℃まで攪拌冷却してクリームを得た。
Claims (2)
- 異常蛋白質が蓄積したヒトに大豆サポニンBグループを含有する飲食物を経口的に摂取させることにより、蓄積した異常蛋白質であるカルボニル化蛋白質を除去するため、大豆抽出物100重量部のうち、大豆サポニンBグループを40〜100重量部含有する大豆抽出物を飲食物として摂取させる方法(医療行為を除く)。
- 経口的に摂取させる飲食物中に、さらにコラーゲン、ゼラチン、コラーゲン加水分解物、ゼラチン加水分解物から選択されるいずれか一種以上及び/又はシリマリンが含まれていることを特徴とする請求項1に記載の方法(医療行為を除く)。
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