JP5672751B2 - Liposomes containing pyrroloquinoline quinone - Google Patents

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池本 一人
一人 池本
中野 昌彦
昌彦 中野
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三菱瓦斯化学株式会社
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本発明で取り扱うピロロキノリンキノン(以下PQQと記す)は式1で表される構造の物質で、このフリー体又は塩を含むリポソームの技術に関する。 Pyrroloquinoline quinone handled in the present invention (hereinafter referred to as PQQ) is a material having a structure represented by Formula 1, and liposomes using techniques including the free form or salt.

PQQは新しいビタミンの可能性があることが提案されており(例えば、非特許文献1参照)、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。 PQQ has been proposed that there is a potential for new vitamin (e.g., see Non-Patent Document 1), it has attracted attention as a health supplement, materials useful for cosmetics. さらには細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。 Furthermore, is not limited to bacteria, molds of eukaryotic organisms, present in yeast, is doing an important role as a coenzyme. また、PQQについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラ−ゼI阻害作用−制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。 Further, growth promoting activity of the cells until recently for PQQ, anticataract activity, liver disease prevention and treatment effects, wound healing action, antiallergic - action, reverse transcriptase inhibitory activity and Guriokisara - peptidase I inhibitory effect - carcinostatic action and much the bioactive has been revealed.

このPQQは、有機化学的合成法(非特許文献2)または発酵法(特許文献1)などの方法により得たPQQをクロマトグラフィーに供し、流出液中のPQQ区分を濃縮して、晶析により結晶化し(特許文献2)、乾燥して得ることができる。 The PQQ is subjected PQQ obtained by the method of organic chemical synthesis (Non-Patent Document 2) or fermentation (Patent Document 1) chromatography, and concentration of the PQQ division in the effluent, the crystallization crystallization (Patent Document 2) can be obtained by drying.

このPQQは栄養機能を強化した食品として使用することが期待されるが、酸性条件下では化学的に安定であるが、アルカリ条件下では分解しやすい。 This PQQ is expected to be used as food with enhanced nutritional function, but under acidic conditions is chemically stable, easy to decompose under alkaline conditions. また、カルボニル化合物との反応性も有している。 Also it has reactivity with the carbonyl compound. さらには強酸性では析出しやすい。 Furthermore it is easy to precipitate in strongly acidic. そのため、pHの変化等に対応できる方法が求められている。 Therefore, a method that can respond to changes in pH has been desired. また、吸収性を上げ、ピロロキノリンキノンの機能を向上させる方法も求められている。 Also, increasing the absorbent, a method for improving the function of the pyrroloquinoline quinone is also required.

リポソームとは通常はリン脂質からなる脂質の膜でできたカプセル構造のことをいい、中に水相が閉じこめられている。 Typically the liposome refers to a capsule structure made with a film of lipids consisting of phospholipids, aqueous phase is trapped within. リン脂質の分子は松葉のような形をしていて、頭の部分が親水性、葉のように見える部分が疎水性という2つの性質を併せ持っているので、水に放たれると親水性の部分が水と引きつけあい、リポソームを形成する。 Molecules of phospholipids be in the form, such as pine needles, the head of the part is hydrophilic, so look the part as leaves are combines two of the nature of the hydrophobic, emitted into water and hydrophilic part is mutual attraction with water to form liposomes. リポソームは、水溶性の成分をその親水性の部分に、油溶性の成分をその疎水性の部分に閉じこめることができる。 Liposomes, a water-soluble component to a portion of the hydrophilic, it is possible to confine the components of the oil soluble portion of the hydrophobic. リポソームは、薬剤を投与する方法として主に医学の分野で注目されており、吸収性の向上や分散性の向上、安定性の向上の利点が一般的に知られ、経口、皮膚に塗布する用途で広く使用されている。 Liposomes, drugs are mainly focused in the field of medicine as a method of administering an improvement improved and the dispersibility of the absorbent, the advantages of increased stability is generally known, application of coating orally, to the skin in widely used. そのためPQQを含むリポソームが求められている。 Therefore the liposomes containing PQQ has been demanded.

さらにはPQQは脳機能改善が期待されているが、同様の機能を有するポスファチジルコリンやポスファチジルセリン(非特許文献4)との同時摂取が期待されており、リン脂質成分としてこれらはリポソーム原料に含まれることから、ピロロキノリンキノンのフリー体又は塩を含有するリポソームの提供とそれにより機能性が向上した組成物、その製造方法が求められている。 Although more PQQ cerebral function improvement is expected, and is expected to co-ingestion with post choline or post phosphatidylserine having the same function (Non-patent document 4), these phospholipid component from being included in the liposome raw material composition provides the thus functionality of liposomes containing free form or salt of pyrroloquinoline quinone is improved, its production method has been required.

これまで、PQQを電子メディエーターとして使用し、酵素をリポソームとして固定する燃料電池は開発されている(特許文献3)。 Previously, using PQQ as the electron mediator, a fuel cell fixing the enzyme as liposomes have been developed (Patent Document 3). また、S-ニトロシル化化合物を哺乳類に投与するための組成物として提案されているが、具体的な例はなく、製造方法についても記載がない(特許文献4)。 Further, there have been proposed a S- nitrosylated compound as a composition for administration to a mammal, the specific examples are not, there is no description also a method for producing (Patent Document 4). リン脂質はそのままでは粘度が高く、リポソームにするにはクロロホルムのような溶剤に溶かし、フラスコ内部に液膜を形成して超音波で分散する方法が一般的であるが、この方法は生産性が低く、また、溶剤が残留する危険性がある。 Phospholipids are intact high viscosity, to the liposomes dissolved in a solvent such as chloroform, a method of dispersing ultrasonically to form a liquid film inside the flask is generally, the method is productive low, and there is a risk of solvent remains. このように、具体的な溶液として提供する方法やそのための製造方法は知られていない。 Thus, a manufacturing method of a method and therefor to provide a specific solution is not known.

特開平1−218597号公報 JP-1-218597 discloses 特許第2072284号公報 Patent No. 2072284 Publication 特表2006−508519号公報 JP-T 2006-508519 JP 特表2001−518096号公報 JP-T 2001-518096 JP

本発明の課題は、ピロロキノリンキノンのフリー体及び/又は塩を含むリポソームを提供することと効率的な製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide that the efficient manufacturing method of providing liposomes containing free form and / or salts of pyrroloquinoline quinone.

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ピロロキノリンキノンの性質とリポソーム化の条件を鋭意検討した結果以下の方法により解決できることを見出した。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems and can be solved by the following methods result of intensive studies conditions nature and liposomes of pyrroloquinoline quinone.
(1) 下記式(1); (1) the following formula (1);
で表されるピロロキノリンキノンのフリー体及び/又は塩を含むリポソーム組成物。 Free form and / or liposome composition comprising a salt of in represented by pyrroloquinoline quinone.
(2)ピロロキノリンキノンのフリー体及び/又は塩とリポソームとをpHが1から8で、60℃から190℃で加温する工程を含むことを特徴とするリポソーム組成物を含む溶液の製造方法。 (2) in the free form and / or salts of pyrroloquinoline quinone and the liposome pH is from 1 to 8, a manufacturing method of a solution containing a liposomal composition which comprises the step of heating at 190 ° C. from 60 ° C. .

本発明により、ピロロキノリンキノンのフリー体及び/又は塩を含む安定性の高いリポソームを効率的に製造することを可能とする。 The present invention makes it possible to produce a highly stable liposomes comprising free form and / or salts of pyrroloquinoline quinone efficiently.

リポソーム粒子径 Liposome particle diameter 透析後のリポソーム粒子径 Liposome particle size after dialysis 糖を添加したリポソームの粒子径 Particle size of the liposome with the addition of sugar 凍結融解処理した後のリポソーム粒子径 Liposomes particle size after freeze-thaw treatment 水素添加大豆リン脂質を用いた場合のリポソーム粒子径 Liposomes particle size in the case of using the hydrogenated soybean phospholipid 吸収性試験の結果 The results of the absorption test

本発明で使用するPQQはフリー体、アルカリ金属塩であればよく特に限定されない。 PQQ used in the present invention is free form, not particularly limited as long alkali metal salts. 特に入手しやすい、フリー体、ジナトリム体、ジカリウム体が使用しやすい。 Especially easy to get, free form, Jinatorimu body, dipotassium body is easy to use.

本発明に用いるリポソームは、リン脂質又は糖脂質を単独または混合して用いて調製される。 Liposomes for use in the present invention are prepared using a phospholipid or glycolipid alone or in combination. 生体に含まれるリン脂質の主成分にホスファチジルコリンがあり、レシチンとも呼ばれ、卵黄レシチン、大豆レシチン、精製大豆レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールアミン、カルジオリピン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、およびこれらの混合物等の物質が使用できる。 There is phosphatidylcholine as a main component of the phospholipids contained in the living body, also known as lecithin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, purified soybean lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, sphingomyelin, dicetyl phosphate, stearylamine, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylinositol amine, cardiolipin, ceramide phosphoryl ethanolamine, ceramide phosphoryl glycerol, and substances such as mixtures thereof can be used. 本発明には市販のホスファチジルコリンを用いることができる。 The present invention may be a commercially available phosphatidylcholine. 例えば、日油製COATSOME NC-21(水素添加大豆リン脂質、PC含量90%以上)、日光ケミカルズ製NIKKOL レシノール S-10EX(水素添加大豆リン脂質、PC含量95%以上)を用いることができる。 For example, made by NOF COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid, PC content 90%), manufactured by Nikko Chemicals Co. NIKKOL Lecinol S-10EX (hydrogenated soybean phospholipid, PC content 95%) can be used.

糖脂質としてはジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エルテル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4、ジガラクトシルセラミド、およびこれらの混合物を用いることができる。 The glycolipid can be used digalactosyldiglyceride, galactosyl diglyceride sulfate ester, galactosylceramide, galactosylceramide sulfuric Eruteru, lactosylceramide, ganglioside G7, ganglioside G6, ganglioside G4, di-galactosylceramide, and mixtures thereof.

基剤にステロールを添加してもよい。 Sterol may be added to the base. 添加量は、リン脂質あるいは糖脂質に対して1/5重量が好ましい量の上限であり、1/10重量が更に好ましい。 The addition amount, the upper limit of 1/5 by weight with respect to phospholipids or glycolipids preferred amount, 1/10 weight being more preferred. ステロールとしては、コレステロールが最も好ましいが、その他のステロールを使用してもよい。 The sterol, cholesterol is most preferred, may be used other sterols.

リポソーム組成物は、一般的な定法により製造することが可能であり、例えば、レシチンを有機溶剤、例えば、クロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、フラスコの壁面に付着した脂質のフィルムにPQQ溶液を加えて製造することができる。 Liposomal composition, it is possible to produce by a conventional titration, for example, an organic solvent lecithin, for example, was dissolved in chloroform, the solvent was distilled off on a rotary evaporator, the lipid attached to the wall of the flask Film PQQ solution can be prepared by adding to. しかし、この方法では操作が複雑で、毒性のある有機溶媒が残留する危険性があるうえに、そのための分析も必要になるために費用がかかるため、最適とは言えない。 However, an operation will complex at this method, after which there is a risk soluble organic solvents toxic to remain because the according cost to even require assay for its can not say optimal.

より好ましくはPQQを0.0001〜2重量%に最終濃度になるように溶解した水溶液に、必要に応じステロール、多価アルコール、pH調整剤を加え、60〜190℃に加温し、ホモジナイザーにより分散することにより製造できる。 In an aqueous solution and more preferably, dissolved to a final concentration of PQQ to 0.0001 wt%, sterols necessary, polyhydric alcohols, pH modifiers were added, warmed to from 60 to 190 ° C., a homogenizer It can be prepared by dispersing. ホモジナイザーを使用することで高い生産性で作ることが可能である。 It is possible to produce with high productivity by using a homogenizer. ここでPQQの上限濃度は溶解度の限度であり、これより高いと析出しやすく、下限濃度より低いとピロロキノリンキノンの機能が期待できない。 Wherein the upper limit concentration of PQQ is the limit of solubility, likely to precipitate higher than this, lower the functionality of pyrroloquinoline quinone lower limit concentration can not be expected.

PQQはアルカリ性では安定性が低いため、pHは8以下が好ましく、より好ましくは2から6である。 PQQ has low stability in an alkaline, pH is preferably 8 or less, more preferably 2 to 6. 8よりpHが高い場合はPQQが分解する。 If 8 pH is higher than decompose PQQ is. 酸性にするのは安定性の面では問題がないが、溶解性が下がるために高含有にするのが困難になる。 Although there is no problem in the stability plane to acidification, to the high content it becomes difficult because the solubility decreases.

本発明のリポソームの大きさは0.05から100μmであることを特徴とする。 The size of the liposomes of the present invention is characterized in that it is a 100μm 0.05. リポソームの大きさはその機能性に応じて使い分けることができる。 The size of the liposomes can be selectively used according to their functionality. より好ましくはレシチンを使用し、PQQの重量濃度が0.01から1重量%であり、pHが2から6であり、大きさが0.05から100μmのリポソーム溶液である。 More preferably using lecithin, weight concentration of PQQ is 1 wt% 0.01, a pH of 2 6, a liposomal solution of 100μm from the size is 0.05. PQQの重量濃度がこれより低い場合は適切な効果を出せず、また、濃度が高い場合は温度を上げても溶解できないため、均一な溶液を作ることができない。 Weight concentration of PQQ is not put out the proper effect is lower than this, also because if the concentration is high can not dissolve at elevated temperatures, can not make a homogeneous solution. また、pHがアルカリ性になるとPQQの分解が生じやすくなる。 Further, the decomposition of PQQ is likely to occur when the pH is alkaline. また、強酸性化ではPQQの溶解度が低く、リポソーム内の水層に維持できる濃度が低くなる。 Moreover, low solubility of PQQ in strongly acidic reduction, the concentration can be maintained in the aqueous layer within liposomes decreases. リポソームの大きさは容易に形成できる範囲である。 The size of the liposomes is in the range that can be easily formed. 0.05μmより小さいリポソームの形成は難しく、また、100μmよりも大きなリポソームも形成困難である。 Difficult formation of 0.05μm smaller liposomes, also, large liposomes is also difficult to form than 100 [mu] m. また、大きなリポソームは吸収性等の面では効果が小さいことが予想できる。 Also, large liposomes may expected that the effect is small in terms of such absorption.

高圧乳化機も使用することができる。 It can also be used a high-pressure emulsifier. 高圧乳化機としてはプライミクス製 薄膜旋回型高速ホモミキサー(T.Kフィルミックス)、マイクロフルイディックス製 超高圧ホモジナイザー(マイクロフルイダイザー)、エム・テクニック製 内部せん断力型ミキサー(クレアミックス)、吉田機械興業製 湿式メディアレス微粒化装置(ナノマイザー)等を用いることができる。 A high-pressure emulsifying machine as the Primix thin film made of turning high-speed homo-mixer (T.K Filmics), microfluidics made of ultra-high pressure homogenizer (microfluidizer), M Technique made internal shear mixer (Claire mix), Yoshida Machinery it can be used Kogyo Ltd. wet media-less atomization apparatus (Nanomizer) or the like.

リポソームを形成した後に、透析、凍結融解、フィルター濾過、凍結乾燥、遠心分離等の処理を施すことでリポソームの精製やサイズのコントロールを行うことができる。 After forming the liposome, dialysis, freeze-thaw, filtration, lyophilization, can be performed control of purification and size of the liposomes by performing processing such as centrifugation.

次にこれらの操作について説明する。 Next, a description will be given of these operations. 透析処理はリポソームが大きな分子集合体であるため限外濾過膜を通過できないことを利用する方法で、リポソーム内の水層だけを利用する溶液を作ることができる。 Dialysis treatment is a method of utilizing the fact that can not pass through the ultrafiltration membrane for a liposome to be an large molecular aggregates can make a solution that utilizes only the aqueous layer within liposomes. PQQの場合、低分子であるため使用する限外濾過膜も低分子量を通す膜であればよく、一般的な膜であればよい。 For PQQ, ultrafiltration membranes used for the low molecular also may be a film through a low molecular weight, may be a common layer. 浸透圧をできるだけ合わせた溶液で透析することが望ましいが、浸透圧が異なる液を使用して積極的にこの効果を利用してサイズを変えることもできる。 It is desirable to dialysis with a solution tailored as possible the osmotic pressure, but can also change the size osmotic pressure using actively the effect using different liquid.

凍結融解はリポソーム溶液を冷却して凍らせ、次に溶解することでリポソーム外部にある物質の取り込み、この相変化に伴うサイズの変更を行う。 Freeze-thaw frozen by cooling the liposome solution, the uptake of a substance in the liposome externally by then dissolving, to change the size due to this phase change. この時にはポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、ショ糖等を加えることでリポソーム脂質の分離を起こさず、操作を行うことができる。 Polyols when this, for example, without causing glycerin, sorbitol, xylitol, separation of liposome lipid by adding sucrose and the like, can be operated. フィルター濾過は滅菌やサイズを一定にするために行う。 Filtration is carried out in order to fix the sterilization or size. 凍結乾燥は粉体化やリポソームへの取り込みのために行う操作で、凍結に耐えうる組成にしなければならない。 Lyophilization in operation do for incorporation into powdered or liposomes must the composition to withstand the freezing. 遠心分離は比重差を利用するもので濃縮等に使用できる。 Centrifuge can be used such as concentration in those utilizing difference in specific gravity.

本発明のリポソーム組成物を調製する際に、本発明の効果を損なわない範囲で他のステロール、ポリオキシエチレンステロールエーテル、多価アルコール、pH調整剤、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、油剤、保湿剤、水溶性高分子、抗酸化剤、紫外線吸収剤、キレート剤、防腐剤、抗菌剤、着色剤、香料等を配合することができる。 In preparing liposome compositions of the present invention, other sterols without impairing the effect of the present invention, polyoxyethylene sterol ethers, polyhydric alcohol, pH adjusting agents, non-ionic surfactants, anionic surfactants active agents, cationic surfactants, amphoteric surfactants, oil, humectants, water-soluble polymers, antioxidants, ultraviolet absorbers, chelating agents, preservatives, antimicrobial agents, colorants, perfumes etc. be able to. また、コエンザイムQ10、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール、アラキドン酸、DHA、レチノール誘導体等のビタミン類やイチョウエキス、カンカエキス等の植物抽出液等を配合したリポソームにすることもできる。 Moreover, coenzyme Q10, can be ascorbic acid derivatives, tocopherol, arachidonic acid, DHA, vitamins and ginkgo extract such retinol derivatives, also be a liposome formulated with plant extracts such as Cistanche Tubulosa.

本発明のリポソーム組成物は、リポソームが分散した水溶液、水中油型乳化組成物、油中水型乳化組成物、多重乳化組成物、多層状剤のいずれでもよい。 Liposome compositions of the present invention, an aqueous solution of liposomes dispersed, oil-in-water emulsion composition, the water-in-oil emulsion composition, multiple emulsion composition may be either a multi-layered material. こうして調製される溶液には、更に、薬剤学的に許容されている他の製剤素材を常法により適宜添加混合してもよい。 The solution thus prepared, further, other pharmaceutical materials which are pharmaceutically acceptable may be added suitably mixed by a conventional method. 添加しうる製剤素材としては特に限定されず、例えば、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、矯臭剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤などが挙げられる。 Is not particularly limited as pharmaceutical materials which may be added, for example, emulsifiers, nervousness agents, buffering agents, solubilizing agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, and antioxidants.

本発明による溶液組成物の保存方法としては、特に限定されず、低温保存、密閉容器による嫌気的保存、遮光保存などを用いることができる。 As method of storing solution composition according to the present invention is not particularly limited, and may be cryopreserved, anaerobic preservation by closed container, and stored in the dark. こうして調製される本発明の溶液は、冷蔵あるいは室温で保存した際に、析出物なく安定に保存できる。 The solution of the present invention prepared in this manner, when stored refrigerated or at room temperature, the precipitate without can be stably preserved.

以下に実施例及び調製例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および調製例のみに限定されるものではない。 Examples and Preparation Examples below illustrate the present invention in more detail, but the present invention is not limited to these examples and preparations. 大豆レシチンはJUNSEI、ピロロキノリンキノンジナトリウム(PQQ―Na2)は三菱ガス化学、その他はWAKOの試薬を使用した。 Soy lecithin Junsei, pyrroloquinoline quinone disodium (PQQ-Na2) is Mitsubishi Gas Chemical, others were used reagent WAKO.

実施例1 Example 1
リポソーム溶液の作製3g/L PQQ―Na2水溶液100gに大豆レシチン3.0g加えた。 It was added soy lecithin 3.0g to produce 3g / L PQQ-Na2 solution 100g of liposome solution. この時のpHは3.5であった。 At this time, the pH was 3.5. 約80℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転、室温に下げ10分処理した。 While heating to about 80 ℃, NISSEI AM-3 homogenizer at 30 minutes 7000 rpm for for 10 minutes down to room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. 均一な溶液で3週間以上安定であった。 It was more than 3 weeks stable uniform solution.

PQQ濃度測定上記のリポソーム溶液を等量のジメチルスルホキシドを加え、下記の溶離液で希釈してPQQ濃度を測定した。 The PQQ concentration measurement above liposome solution was added an equal volume of dimethylsulfoxide was measured PQQ concentration was diluted with eluent below. 測定は島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、LC-20Aで、カラムはYMC-Pack ODS-TMS(5μm)、150x4.6mm IDを40℃で溶離液100mM CH 3 COOH/100mM CH 3 COONH 4 (30/70, pH5.1)を1.5mL/minで260nm検出した。 Measurements Shimadzu high performance liquid chromatography, by LC-20A, column YMC-Pack ODS-TMS (5μm ), eluent at 150x4.6mm ID 40 ℃ 100mM CH 3 COOH / 100mM CH 3 COONH 4 (30 / 70, pH 5.1) was 260nm detected at 1.5 mL / min. その結果、PQQの濃度変化は観測されず、本発明の条件で作ることが出来たPQQ含有リポソームは、濃度低下は起きなかった。 As a result, changes in the concentration of PQQ is not observed, PQQ-containing liposomes could be made in terms of the present invention, the density reduction did not occur.

リポソーム粒子径測定リポソーム粒子径は細胞や生体への吸収性、安定性において重要な因子である。 Liposomes particle size measurement liposome particle size is an important factor in the absorbent, stability of the cells or organism. そこで作成した粒子径を測定した。 So to measure the particle size that you created.
SEISHIN LMS−350を使用して、水に分散して粒度分布を求めた。 Use SEISHIN LMS-350, it was determined particle size distribution dispersed in water. この装置では0.1μmが検出下限である。 0.1μm is lower detection limit for this system. 図1に結果を示す。 The results are shown in Figure 1. 縦軸は体積換算での割合を示す。 The vertical axis shows the percentage in terms of volume. 体積換算で正規分布50% 0.6μmで粒子径を累積したグラフの百分率での90%の粒子径であるx90が2.0μmであった。 Normal distribution is 90% of the particle diameter of a percentage of a graph obtained by accumulating the particle diameter at 50% 0.6 .mu.m x90 were 2.0μm in terms of volume. PQQの濃度を維持した安定なリポソームを製造することができた。 It was possible to produce stable liposomes maintain the concentration of PQQ.

実施例2 Example 2
リポソーム溶液の透析実施例1のリポソーム溶液では、リポソーム内部の水溶液と外側の水溶液にPQQが存在する。 The liposome solution in the dialysis in Example 1 of the liposome solution, PQQ is present in the aqueous solution and the outer solution inside the liposomes. そこで内部だけに存在させるために透析を行った。 Then dialysis was carried out in order to be present only in the interior.
透析キットSlide-A-Lyzer Dialysis Cassetes (Thermo)に約3ml加え、水で透析をおこなった。 About 3ml addition to dialysis kit Slide-A-Lyzer Dialysis Cassetes (Thermo), it was subjected to dialysis with water. 3日間室温で行った後、溶液を回収すると6mlに増加していた。 After 3 days at room temperature, the recovering solution was increased to 6 ml. 溶液は赤から黄色の濁った液に変化した。 The solution was changed to a solution cloudy from red yellow. これをDMSOでリポソームを壊しPQQ濃度を実施例1と同様に分析した結果、0.23g/LのPQQになっていた。 Results This was similarly analyzed the PQQ concentration broke liposomes of Example 1 in DMSO, and has become a PQQ of 0.23 g / L. 元の溶液から85%が透析されていた。 85 percent from the original solution has been dialysis. 残りが内部であると考えられる。 It is considered the rest is internal. さらにリポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。 Furthermore the particle size of the liposome was measured in the same manner as in Example 1. 図2に結果を示す。 The results are shown in FIG. 浸透圧差があるために粒子径が大きくなっていた。 Particle size was larger because of the osmotic pressure difference.

実施例3 Example 3
3g/L PQQ−Na2水溶液100gにソルビトール5g、大豆レシチン3.4g加えた。 Sorbitol 5g, added soy lecithin 3.4g to 3g / L PQQ-Na2 solution 100 g. この時のpHは3.5であった。 At this time, the pH was 3.5. 約80℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転、室温に下げ10分処理した。 While heating to about 80 ℃, NISSEI AM-3 homogenizer at 30 minutes 7000 rpm for for 10 minutes down to room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. 均一な溶液で3週間以上安定であった。 It was more than 3 weeks stable uniform solution. リポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。 The particle size of the liposome was measured in the same manner as in Example 1. 結果を図3に示す。 The results are shown in Figure 3. 正規分布50% 0.6μmでx90が2.0μmであった。 x90 was 2.0μm normal distribution 50% 0.6 .mu.m.

実施例4 Example 4
凍結融解処理実施例3で得られたリポソーム溶液を−20℃に冷却して凍結し、それを室温で融解した。 The liposome solution obtained in freeze-thaw process in Example 3 was frozen by cooling to -20 ° C., it was thawed at room temperature. この操作を3回繰り返した。 This operation was repeated three times. リポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。 The particle size of the liposome was measured in the same manner as in Example 1. 結果を図4に示す。 The results are shown in Figure 4. 正規分布50% 2.8μmでx90が4.5μmであった。 x90 was 4.5μm normal distribution 50% 2.8 .mu.m. 凍結融解によりリポソームの粒子径が大きくなった。 Particle size of the liposome is increased by freeze-thawing.

実施例5 Example 5
3g/L PQQ−Na2水溶液100gにCOATSOME NC-21(水素添加大豆リン脂質)3.0g加えた。 It was added COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipids) 3.0 g to 3g / L PQQ-Na2 solution 100 g. この時のpHは3.5であった。 At this time, the pH was 3.5. 約80℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転、室温に下げ10分処理した。 While heating to about 80 ℃, NISSEI AM-3 homogenizer at 30 minutes 7000 rpm for for 10 minutes down to room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. リポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。 The particle size of the liposome was measured in the same manner as in Example 1. 結果を図5に示す。 The results are shown in Figure 5. 正規分布50% 3.8μmでx90が6.8μmであった。 x90 was 6.8μm normal distribution 50% 3.8 .mu.m. レシチンの種類を変えることで大きさを変えることができた。 We were able to change the the size by changing the type of lecithin.

実施例6 Example 6
3g/L PQQ−Na2水溶液100gに卵黄レシチン3.0g加えた。 It was added yolk lecithin 3.0g to 3g / L PQQ-Na2 solution 100 g. この時のpHは3.5であった。 At this time, the pH was 3.5. 約80℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転、室温に下げ10分処理した。 While heating to about 80 ℃, NISSEI AM-3 homogenizer at 30 minutes 7000 rpm for for 10 minutes down to room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. リポソーム溶液を作成することができた。 It was able to create a liposome solution.

実施例7 Example 7
3g/L PQQ−Na2水溶液100gに大豆レシチン3.0g加え、コエンザイムQ10(三菱ガス化学)を0.06g加えた。 Soy lecithin 3.0g added to 3g / L PQQ-Na2 solution 100 g, coenzyme Q10 (the Mitsubishi Gas Chemical) was added 0.06 g. この時のpHは3.5であった。 At this time, the pH was 3.5. 約80℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転、室温に下げ10分処理した。 While heating to about 80 ℃, NISSEI AM-3 homogenizer at 30 minutes 7000 rpm for for 10 minutes down to room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. リポソーム溶液を作成することができた。 It was able to create a liposome solution.

実施例8 Example 8
実施例3で作製した溶液10mlをステンレス製バットに加え、−80℃で凍結した。 The solution 10ml was prepared in Example 3 was added to a stainless steel vat, and frozen at -80 ° C.. これを凍結乾燥器で乾燥を1晩行い、粉末を得た。 It performed overnight drying in a freeze drier so to obtain a powder.

実施例9 混合試験日油製PS50−ホスファチジルセリン50重量%含有粉末(澱粉含有)1.2gと実施例1の溶液2gを混合した。 Were mixed solution 2g of Example 9 mixed test day oil made PS50- phosphatidylserine 50% by weight containing powder (starch-containing) 1.2 g Example 1. 粉末は均一な分散であった。 The powder was uniform dispersion.

比較例1 Comparative Example 1
3g/L PQQ−Na2水溶液100gに大豆レシチン3.0g加えた。 Plus soy lecithin 3.0g to 3g / L PQQ-Na2 solution 100g. この時のpHは3.5であった。 At this time, the pH was 3.5. 室温でNISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転処理した。 And 30 minutes 7000 rotates treated with NISSEI AM-3 homogenizer at room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. 全体に均一にならず沈殿物が存在した。 The precipitate not uniform across were present.

比較例2 Comparative Example 2
3g/L PQQ−Na2水溶液100gに水酸化カリウム溶液を加えpHを10以上にした。 The pH was added potassium hydroxide solution 3g / L PQQ-Na2 solution 100g was 10 or more. 30℃で一晩放置した後、PQQは60%になっており、リポソーム形成前に分解した。 After standing overnight at 30 ° C., PQQ has reached 60% was degraded before liposome formation.

比較例3 Comparative Example 3
水100gに大豆レシチン3.0g加え約80℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで30分7000回転、室温に下げ10分処理した。 While heating to about 80 ° C. was added soy lecithin 3.0g in water 100 g, NISSEI AM-3 homogenizer at 30 minutes 7000 rpm for for 10 minutes down to room temperature. 処理後、蒸発減少した水分を追加した。 After the treatment, it added the evaporation reduced moisture. PQQを含まないリポソームを作成した。 You create a liposome that does not include the PQQ.

比較例4 Comparative Example 4
3g/L PQQ−Na2水溶液100gに濃塩酸を加えpHを0.8にした。 The pH was added concentrated hydrochloric acid to 3g / L PQQ-Na2 solution 100g was 0.8. PQQは析出し、溶液は透明になった。 PQQ is deposited, the solution became clear. PQQは溶解していないため、リポソーム形成してもリポソーム内に取り込めない。 Since PQQ is not dissolved, not be captured in the liposomes be liposome formation.

吸収性試験PQQは培養動物細胞に対して非常に高濃度にすると細胞の増殖を抑える。 Absorbing test PQQ suppress the cell proliferation when very high concentration against cultured animal cells. これを利用してリポソーム化により動物細胞を使用して細胞吸収がどのように変化するかを試験した。 Using animal cells by liposome by using this was tested whether cellular uptake how changes.
実施例10 Example 10
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-DHFR)をα‐MEM+10%牛胎児血清の培地で5%CO2, 37℃で培養してした。 Chinese hamster ovary cells (CHO-DHFR) were cultured in 5% CO2, 37 ℃ in medium α-MEM + 10% fetal calf serum. イワキ製96穴プレート使用し、1個の穴に6500個の細胞になるように100μlの培地とともに加え、一晩培養した。 Iwaki 96-well plate made using, in addition with medium of 100μl to be 6500 cells in one well, and cultured overnight. 培養液を抜き、所定の試験濃度の培地を加えた。 Remove the culture medium, it was added to the culture medium of a given test concentration. 1日培養後、培地を入れ替え同仁化学 WSTアッセイキットを使用して1時間反応させ、450nmの吸光度を測定した。 After one day culture, using Dojindo WST assay kit interchanged media allowed to react for 1 hour, the absorbance was measured at 450nm. この時の吸光度は細胞数に比例する。 Absorbance when this is proportional to cell number.

試験サンプルは、PQQジナトリウム、大豆レシチン-PQQリポソーム(実施例1)と、大豆レシチンリポソーム(比較例3)を用いた。 Test samples were used PQQ disodium, and soy lecithin -PQQ liposome (Example 1), soy lecithin liposomes (Comparative Example 3). これらのサンプルを培地で希釈して試験した。 These samples were tested was diluted with the medium. 各サンプル2回行い平均化した。 Each sample twice was done averages.
試験濃度は500, 250, 125, 62, 31, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 0μMで行った。 Test concentrations 500, 250, 125, 62, 31, 16, 8, 4, 2, 1, was conducted at 0.5 0 [mu] M.
全細胞数が無添加と比較して10%少なくなる添加量はPQQジナトリウムでは500μM, 実施例1のリポソーム溶液では31μMであった。 The addition amount of the total cell number is 10% less compared to the no additive is 500μM in PQQ disodium, the liposome solution of Example 1 was 31MyuM. 比較例3のリポソーム単独の場合は、細胞濃度の急激な低下はなかった。 For liposomes alone in Comparative Example 3 was not sharp drop in cell concentration. リポソーム化により16倍吸収性が上がっていると考えられる。 Is considered 16 times the absorbent is raised by the liposome. 図6にPQQを添加しない時の細胞濃度の平均を100とした各条件での濃度をグラフに示す。 The concentration of each condition the mean cell concentration of 100 when in FIG. 6 without the addition of PQQ shown in the graph.

本発明の溶液は、医療用、化粧用、食品用、園芸用、酪農用など広い範囲で使用できる。 The solution of the present invention, medical, cosmetic, food, gardening, can be used in a wide range, such as for dairy. より具体的な形態としては、注射剤、輸液、液剤、点眼剤、内服用液剤、ローション剤、ヘヤートニック、化粧用乳液、スプレー液、エアロゾル、ドリンク液、液体肥料、保存用溶液などが挙げられる。 More specific embodiments, injection, infusion, solutions, eye drops, inner dosing liquid, lotion, hair tonic, cosmetic milky lotion, a spray solution, and aerosols, drink solution, liquid manure, etc. for storage solution .

Claims (3)

  1. 下記式(1); The following formula (1);
    で表されるピロロキノリンキノンジナトリウム塩とリン脂質及び/又は糖脂質とをpHが1から8で、60℃から190℃で加温する工程と、 In at pyrroloquinoline quinone disodium salt and the phospholipid and / or glycolipid pH of from 1 to 8 are represented, a step of heating at 190 ° C. from 60 ° C.,
    ホモジナイザーを使用して分散させる工程とを含むことを特徴とする、 Characterized in that it comprises a step of dispersing using a homogenizer,
    ピロロキノリンキノン含有リポソームの製造方法。 Method of manufacturing a pyrroloquinoline quinone-containing liposomes.
  2. 前記リン脂質がレシチンである請求項1記載の製造方法。 The method according to claim 1, wherein the phospholipid is lecithin.
  3. 前記レシチンが大豆レシチン又は卵黄レシチンである請求項2記載の製造方法。 The process of claim 2 wherein said lecithin is soybean lecithin or egg yolk lecithin.
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