JP5655125B2 - Fluorescence detection method - Google Patents
Fluorescence detection method Download PDFInfo
- Publication number
- JP5655125B2 JP5655125B2 JP2013211774A JP2013211774A JP5655125B2 JP 5655125 B2 JP5655125 B2 JP 5655125B2 JP 2013211774 A JP2013211774 A JP 2013211774A JP 2013211774 A JP2013211774 A JP 2013211774A JP 5655125 B2 JP5655125 B2 JP 5655125B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- metal
- detected
- fine particles
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Description
本発明は、蛍光検出方法に関するものであり、特に詳細には表面プラズモンを利用した蛍光検出方法に関するものである。 The present invention relates to a fluorescence detection method, and more particularly to a fluorescence detection method using surface plasmons.
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。 In bio-measurement and the like, the fluorescence method is widely used as a highly sensitive and easy measurement method. The fluorescence method is qualitative or qualitative by irradiating a sample considered to contain a substance to be detected that emits fluorescence when excited by light of a specific wavelength, by irradiating the excitation light of the specific wavelength and detecting the fluorescence emitted at this time. This is a method for quantitatively confirming the presence of a substance to be detected. In addition, when the substance to be detected is not a fluorescent material, the substance to be detected is labeled with a fluorescent label such as an organic fluorescent dye, and then the fluorescence is detected in the same manner. It is a method to confirm.
とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光 ５２５ｎｍ、蛍光量子収率 ０．６）やＣｙ５（蛍光 ６８０ｎｍ、蛍光量子収率 ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。 In particular, in recent years, the fluorescence method has become an indispensable tool for bioresearch, coupled with the development of high-performance photodetectors such as the development of cooled CCDs. Also in the material used for fluorescent labeling, fluorescent dyes with high fluorescence quantum yield, particularly in the visible region, such as FITC (fluorescence 525 nm, fluorescence quantum yield 0.6) and Cy5 (fluorescence 680 nm, fluorescence quantum yield 0.3). ) And more than 0.2 fluorescent dyes, which are practical guidelines, have been developed and widely used.
さらに、特許文献１や非特許文献１に示すように、プラズモンによる電場増強効果を用いて蛍光信号を増大することにより１ｐＭを切るような高感度検出が可能である蛍光法、いわゆる表面プラズモン電場増強蛍光分光法も報告されている。 Furthermore, as shown in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, a fluorescence method capable of high-sensitivity detection that cuts 1 pM by increasing the fluorescence signal using the electric field enhancement effect by plasmon, so-called surface plasmon electric field enhancement. Fluorescence spectroscopy has also been reported.
しかしながら、上記のような方法では分子の個数に換算すると未だ１０５個レベルであり、一分子の検出には程遠いのが現状である。 However, in the method described above is still 10 5 level in terms of the number of molecules, at present, far from the detection of a single molecule.
そこで、非特許文献２等に示されているように、一分子レベルでの検出が可能である金属プローブを用いたラマン分光法が挙げられる。これは、金属プローブ先端に光を入射して、この先端に局在プラズモンを生じさせ、これにより基板とプローブの間に生じる局所的な電場増強場を利用するものである。これにより、プローブ直下にある分子によるラマン過程の散乱断面積を実効的に増大し、理論的には入射光強度の数１０倍から１０６倍の増強度が得られると考えられている（非特許文献２ ｐｐ．２７７ ２．２．１節）。 Therefore, as shown in Non-Patent Document 2 and the like, there is a Raman spectroscopy using a metal probe that can be detected at a single molecule level. In this method, light is incident on the tip of the metal probe to generate a localized plasmon at the tip, thereby utilizing a local electric field enhancement field generated between the substrate and the probe. This effectively increases the scattering cross section of the Raman process by the molecules directly under the probe, and theoretically, it is considered that an increase in intensity of several tens to 10 6 times the incident light intensity can be obtained (non- Patent Document 2 pp. 277 Section 2.2.1).
しかしながら、ラマン信号は、溶媒などの被検出物質が置かれている状態及び環境に大きく左右され、また夾雑物の振動もスペクトルに現れるため、定性分析としては有用であるが定量性は期待できない。また、金属プローブによる局所的な強電場の幅はせいぜい数十ｎｍ程度であって測定できる領域が小さいため、金属プローブの走査が必要となり測定が面倒である。さらには、一般的にラマン分光装置は、大型かつ高価であり操作性も良くない。 However, the Raman signal is greatly influenced by the state and environment in which a substance to be detected such as a solvent is placed, and vibrations of impurities appear in the spectrum. Therefore, the Raman signal is useful as a qualitative analysis but cannot be expected to be quantitative. In addition, since the local strong electric field due to the metal probe has a width of about several tens of nanometers at most and the area that can be measured is small, the metal probe needs to be scanned, and the measurement is troublesome. Furthermore, in general, a Raman spectroscopic device is large and expensive, and its operability is not good.
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法によって、一分子レベルでの高感度検出を可能とし、かつ広い検出範囲を有する蛍光検出方法を提供することを目的とするものである。 The present invention has been made in view of the above problems, and provides a fluorescence detection method that enables high-sensitivity detection at a single molecule level and has a wide detection range by a fluorescence method that is easier and less expensive than Raman spectroscopy. It is intended to do.
本発明による第１の蛍光検出方法は、
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質及び複数の金属微粒子を含む試料を供給し、
金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、金属微粒子間及び金属膜と金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、誘電体プリズムと金属膜との界面に対して誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出することを特徴とするものである。
The first fluorescence detection method according to the present invention comprises:
Supplying a sample containing a substance to be detected and a plurality of metal fine particles to a detection unit including a metal film provided on one surface of a dielectric prism;
An electric field enhancement field due to surface plasmons is generated on the upper surface of the metal film, and an electric field enhancement field due to surface plasmons is generated between the metal fine particles and between the metal film and the metal fine particles. Irradiate the interface with excitation light through a dielectric prism,
Fluorescence from the fluorescent label attached to the substance to be detected is detected by a photodetector,
The abundance of the substance to be detected is detected based on the amount of fluorescence detected by the photodetector.
そして、本発明による第２の蛍光検出方法は、
誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む検出部に被検出物質を含む試料を供給し、
試料を供給した後、蛍光標識を検出部に供給し、
被検出物質および蛍光標識を検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を検出部に供給し、
金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、金属微粒子間及び金属膜と金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、誘電体プリズムと金属膜との界面に対して誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
被検出物質に付与された蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出することを特徴とするものである。
And the 2nd fluorescence detection method by this invention is:
Supply a sample containing a substance to be detected to a detection unit containing a metal film provided on one surface of a dielectric prism,
After supplying the sample, supply the fluorescent label to the detection unit,
After the process of fixing the substance to be detected and the fluorescent label to the detection unit is finished, supply a plurality of metal fine particles to the detection unit,
An electric field enhancement field due to surface plasmons is generated on the upper surface of the metal film, and an electric field enhancement field due to surface plasmons is generated between the metal fine particles and between the metal film and the metal fine particles. Irradiate the interface with excitation light through a dielectric prism,
Fluorescence from the fluorescent label attached to the substance to be detected is detected by a photodetector,
The abundance of the substance to be detected is detected based on the amount of fluorescence detected by the photodetector.
ここで、「検出部」とは、誘電体プリズムの一面に設けられた金属膜を含む、試料等を供給して接せしめる場所であって、励起光を、誘電体プリズム基板と金属膜との界面に対して、この界面での全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板を通し入射して、この界面表面にエバネッセント波を発生させ、このエバネッセント波との共鳴により金属膜中に表面プラズモンを発生せしめるように配されたものである。 Here, the “detection unit” is a place where a sample or the like including a metal film provided on one surface of a dielectric prism is supplied and brought into contact, and excitation light is transmitted between the dielectric prism substrate and the metal film. Incident light is incident on the interface through the dielectric prism substrate so as to satisfy the total reflection condition at the interface, and an evanescent wave is generated on the interface surface. Surface plasmon is generated in the metal film by resonance with the evanescent wave. It is arranged to generate.
「電場増強場」とは、誘電体プレートと金属膜との界面に対してこの界面で全反射条件を満たすように励起光を照射することによって生じるエバネッセント波と、このエバネッセント波に誘起されて金属膜中に生じる表面プラズモンの電場増強効果とによって、局所的に金属膜の上面に発生する電場の増強作用を有する領域を意味するものとする。 The “electric field enhancement field” is an evanescent wave generated by irradiating the interface between the dielectric plate and the metal film with excitation light so as to satisfy the total reflection condition at the interface, and the evanescent wave induced by the metal. By the electric field enhancing effect of surface plasmon generated in the film, it means a region having an enhancing action of an electric field locally generated on the upper surface of the metal film.
また、「被検出物質の存在量」とは、被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず定性的な量も意味するものとする。 Further, the “abundance of the substance to be detected” includes the presence or absence of the substance to be detected, and means not only a quantitative amount but also a qualitative amount.
そして、「ホットスポット」とは、微小構造の物質に静電気力が集中（電界集中）する結果形成される局所的な強い電場領域を意味するものとする。 The “hot spot” means a local strong electric field region formed as a result of concentration of electrostatic force (electric field concentration) on a microstructure material.
特に金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に形成される「ホットスポット」においては、上記プラズモンによって増強された電場が集中し巨大な電場が形成されるとともに、それによって相手側のプラズモンをさらに強く誘起し合うという相乗効果が生じるため、他の場合（例えば粒子が単独で存在する場合や非金属の粒子が近接する場合）に較べ格段に強い電場増強場が生じる。例えば、２つの金属微粒子が数ｎｍまで近接した場合には、隙間に生じる「ホットスポット」での電場増強度は、非特許文献２にも記載されているように１０６以上にもなることが知られている。 In particular, in the “hot spot” formed in the gap between the metal fine particle and the metal fine particle or the gap between the metal fine particle and the metal film, the electric field enhanced by the plasmon is concentrated and a huge electric field is formed. Since a synergistic effect of inducing the plasmons on the other side more strongly occurs, an electric field enhancement field much stronger than in other cases (for example, when particles are present alone or non-metallic particles are close to each other) is generated. For example, when two metal fine particles are close to several nanometers, the electric field enhancement at the “hot spot” generated in the gap may be 10 6 or more as described in Non-Patent Document 2. Are known.
さらに、本発明による蛍光検出方法において、金属微粒子の粒径は４０〜２００ｎｍであることが好ましく、金属微粒子はナノロッドであることが好ましい。また、蛍光標識は消光防止性蛍光物質であることが好ましい。 Furthermore, in the fluorescence detection method according to the present invention, the particle size of the metal fine particles is preferably 40 to 200 nm, and the metal fine particles are preferably nanorods. The fluorescent label is preferably a quenching-proof fluorescent substance.
そして、検出部は、誘電体プリズムがある反対側の金属膜表面に、疎水性材料からなる膜厚１０〜１００ｎｍの不撓性膜を有するものであることが好ましく、この場合、不撓性膜はポリマー材料から構成されるものであることが好ましい。 And it is preferable that a detection part is what has an inflexible film | membrane with a film thickness of 10-100 nm which consists of hydrophobic materials on the metal film surface of the other side with a dielectric prism, and in this case, an inflexible film | membrane is a polymer. It is preferable that it is comprised from material.
ここで、金属微粒子の「粒径」とは、微粒子の最大径を意味するものとする。 Here, the “particle diameter” of the metal fine particles means the maximum diameter of the fine particles.
さらに、「ナノロッド」とは、形状がロッド状（棒状）のナノ微粒子であって、縦軸と横軸との長さの比（アスペクト比）が概ね１〜２０であるものを意味するものとする。 Furthermore, “nanorod” means a nanoparticle having a rod-like (rod-like) shape, and the ratio of the length of the vertical axis to the horizontal axis (aspect ratio) is approximately 1 to 20. To do.
そして、「消光防止性蛍光物質」とは、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる蛍光標識材料を意味するものとする。消光防止性蛍光物質の消光防止材料により包含される蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、消光防止性蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が消光防止材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が消光防止材料の外部に露出していてもよい。なお、金属消光とは、エネルギーを吸収し励起した蛍光体の近傍に金属が存在する場合、蛍光体から金属へエネルギー移動が起こり金属内でエネルギーが消失される、無放射的なエネルギー失活現象のことである。 And, “quenching anti-fluorescent substance” means a fluorescent labeling material comprising a fluorescent dye molecule that is transmitted by the fluorescence generated from the fluorescent dye molecule and is included by an anti-quenching material that prevents metal quenching. To do. Although the number of fluorescent dye molecules included in the quenching preventing material of the quenching preventing fluorescent substance may be one, it is more preferable that it is plural. In addition, when the quenching-resistant fluorescent substance includes a plurality of fluorescent dye molecules, it is sufficient that at least one fluorescent dye molecule is encased in the quenching-preventing material, and a part of the other fluorescent dye molecules is quenched. It may be exposed to the outside of the prevention material. Metal quenching is a non-radiative energy deactivation phenomenon in which energy is transferred from the phosphor to the metal when the metal exists in the vicinity of the phosphor that has absorbed and excited energy, and the energy is lost in the metal. That is.
また、「不撓性」とは、検出装置を普通に使用しているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を意味するものとする。 In addition, “inflexibility” means rigidity that does not cause deformation such that the film thickness changes during normal use of the detection device.
本発明による蛍光検出方法では、複数の金属微粒子を検出部の上に分散させて蛍光を光検出器により検出している。これにより、金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に生じるホットスポットによって、このホットスポット内に存在する蛍光標識から生じる蛍光を増強することができる。一方、複数の金属微粒子を検出部上に広く分散させているため、上記ホットスポットは広い範囲にわたり形成させることができる。この結果、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法を用いても、一分子レベルでの高感度検出が可能となり、さらに電場増強効果を有する領域が金属プローブの先端付近に限られるラマン分光法に比べて、広い範囲にわたる測定を短時間で行うことが可能となる。 In the fluorescence detection method according to the present invention, a plurality of metal fine particles are dispersed on a detection unit, and fluorescence is detected by a photodetector. Thereby, the fluorescence generated from the fluorescent label existing in the hot spot can be enhanced by the hot spot generated in the gap between the metal fine particle and the metal fine particle or the gap between the metal fine particle and the metal film. On the other hand, since the plurality of metal fine particles are widely dispersed on the detection portion, the hot spot can be formed over a wide range. As a result, high-sensitivity detection at the single molecule level is possible even when using fluorescence methods that are easier and less expensive than Raman spectroscopy, and the region that has an electric field enhancement effect is limited to the vicinity of the tip of a metal probe. Compared to, measurement over a wide range can be performed in a short time.
また、金属微粒子は同体積の他の微粒子に較べ格段に光を散乱させる力(散乱能)が大きいため、この散乱光を二次的な励起光として用いることにより蛍光色素をさらに効率的に照明することができる。 In addition, metal fine particles have a much larger light scattering power (scattering ability) than other fine particles of the same volume, so this scattered light can be used as secondary excitation light to illuminate fluorescent dyes more efficiently. can do.
以下、本発明の実施形態及び実施例について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。 Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto.
「蛍光検出方法」
＜第１の実施形態＞
図１は、本実施形態による蛍光検出装置の概略部分断面図である。本実施形態では、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合について説明する。
"Fluorescence detection method"
<First Embodiment>
FIG. 1 is a schematic partial cross-sectional view of the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment. In the present embodiment, a case where the antigen A is detected from the sample S containing the antigen A as the substance to be detected will be described.
図１に示すように、本実施形態による蛍光検出装置は、所定波長の励起光Ｌｉを発する光源２１と、この励起光Ｌｉを一面から透過させるように配された、励起光Ｌｉを透過させる材料からなる誘電体プリズム基板２２と、この誘電体プリズム基板２２の励起光Ｌｉ入射面とは異なる一面に成膜された金属膜１２と、金属膜１２上に形成された不撓性膜１４と、不撓性膜１４上に固定されかつ抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１と、不撓性膜１４に試料Ｓが接するように試料Ｓを保持する試料保持部１３と、蛍光標識Ｆが発する蛍光を検出可能な位置に配された光検出器３０とを備えてなるものである。なお、図中には、検出部の上に分散された金属微粒子Ｐと、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆと、これに施され、かつ抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２も同時に示している。 As shown in FIG. 1, the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment includes a light source 21 that emits excitation light Li having a predetermined wavelength, and a material that transmits the excitation light Li and is arranged so as to transmit the excitation light Li from one surface. A dielectric prism substrate 22 made of the metal prism 12, a metal film 12 formed on a surface different from the excitation light Li incident surface of the dielectric prism substrate 22, an inflexible film 14 formed on the metal film 12, and an inflexibility A primary antibody B1 that is immobilized on the membrane 14 and specifically binds to the antigen A, a sample holder 13 that holds the sample S so that the sample S is in contact with the inflexible membrane 14, and a fluorescence emitted by the fluorescent label F And a photodetector 30 arranged at a position where the light can be detected. In the figure, the metal fine particles P dispersed on the detection unit, the fluorescent label F contained in the sample S, and the secondary antibody B2 applied thereto and specifically bound to the antigen A are also shown. It shows at the same time.
励起光Ｌｉは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、蛍光標識Ｆを励起発光させることが可能なものならば特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。 The excitation light Li may be, for example, single wavelength light obtained from a laser light source or the like, or broad light obtained from a white light source or the like, and is not particularly limited as long as the fluorescent label F can be excited and emitted. It can be selected appropriately according to
光源２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源２１は、励起光Ｌｉを誘電体プリズム基板２２と金属膜１２の界面１２ａに向けて、この界面１２ａでの全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板２２を通して入射させるために、励起光Ｌｉを導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。 The light source 21 may be a laser light source, for example, and is not particularly limited, but can be appropriately selected according to detection conditions. If necessary, the light source 21 directs the excitation light Li toward the interface 12a between the dielectric prism substrate 22 and the metal film 12 through the dielectric prism substrate 22 so as to satisfy the total reflection condition at the interface 12a. Therefore, a light guide system such as a mirror or a lens for guiding the excitation light Li can be appropriately combined.
誘電体プリズム基板２２は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プリズム基板２２は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。 The dielectric prism substrate 22 is made of a transparent material such as transparent resin or glass. The dielectric prism substrate 22 is preferably formed from a resin. In this case, it is more preferable to use a resin such as polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), or amorphous polyolefin (APO) containing cycloolefin. desirable.
金属膜１２は、その薄膜材料として、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点からＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。また、金属膜１２の堆積方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法、めっき法、金属コロイドを用いた塗布法やスプレー法などの各種の薄膜作製方法によって形成することができ、これらの方法は使用する材料に応じて適宜選択することができる。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあることが望ましい。 The metal film 12 is not particularly limited as the thin film material and can be appropriately selected according to detection conditions. However, Au, Ag, Pt, or the like is preferably used from the viewpoint of surface plasmon generation conditions. Moreover, the deposition method of the metal film 12 can be formed by various thin film production methods, such as a sputtering method, a vapor deposition method, a plating method, the coating method using a metal colloid, and a spray method, These methods are used. It can select suitably according to the material to do. On the other hand, the film thickness is not particularly limited and can be appropriately selected according to detection conditions. However, from the viewpoint of surface plasmon generation conditions and the like, the film thickness is preferably in the range of 20 nm to 60 nm.
不撓性膜１４は、その薄膜材料として、例えばシリコン酸化膜やポリマー材料等を用いることができる。この場合、特に成膜条件や表面処理条件等の観点からポリマー材料が望ましい。例えばこの場合、スピンコート等の簡便な方法により作成することができる。また、本発明のように不撓性膜１４が疎水性材料から形成されている場合には、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる因子が不撓性膜１４の内部にまで入り込むことが無く、これらの消光因子によって蛍光標識Ｆの励起エネルギーが奪われることが防止される。 As the thin film material, for example, a silicon oxide film or a polymer material can be used for the inflexible film 14. In this case, a polymer material is particularly desirable from the viewpoints of film forming conditions and surface treatment conditions. For example, in this case, it can be prepared by a simple method such as spin coating. In addition, when the inflexible film 14 is formed of a hydrophobic material as in the present invention, factors that cause quenching such as metal ions and dissolved oxygen present in the sample liquid are the inflexible film 14. The quenching factor prevents the excitation energy of the fluorescent label F from being taken away without entering the inside.
不撓性膜１４の具体的な材料は、誘電体プリズム基板２２に用いられている材料と比して線（熱）膨張係数の差が３５×１０−６以内にあるものを選択することが望ましく、例えば下記表１に挙げたものの中から適宜選択することができる。 It is desirable to select a specific material for the inflexible film 14 that has a difference in linear (thermal) expansion coefficient within 35 × 10 −6 as compared with the material used for the dielectric prism substrate 22. For example, it can be suitably selected from those listed in Table 1 below.
ここで、上記のように線（熱）膨張係数の差を３５×１０−６以内と規定したのは以下の理由による。 Here, the reason why the difference in coefficient of linear (thermal) expansion is defined to be within 35 × 10 −6 as described above is as follows.
環境、特に温度の変動に対する安定性を高める上では、不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２は互いに熱膨張係数が近い方が望ましい。つまり、それら両者の熱膨張係数が大きくかけ離れていると、温度変動が生じた際に両者の剥離や密着度の低下等の問題を招きやすい。具体的には、それら両者の線（熱）膨張係数の差が３５×１０−６以内の範囲にあることが望ましい。なお、不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２との間には金属膜１２が存在しているが、この金属膜１２は温度変動が有ったとき、上下の不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２に追随して伸縮するので、結局、不撓性膜１４と誘電体プリズム基板２２の熱膨張係数が近い方が望ましいことに変わりは無い。以上の点を考慮すると、不撓性膜１４をポリマー材料から形成する場合、誘電体プリズム基板２２の材料としても一般にはガラスより樹脂を選択する方がより望ましいと言える。 In order to increase the stability against environmental fluctuations, particularly temperature fluctuations, it is desirable that the inflexible film 14 and the dielectric prism substrate 22 have close thermal expansion coefficients. That is, if the thermal expansion coefficients of both of them are greatly different from each other, problems such as separation of the two and a decrease in the degree of adhesion tend to be caused when temperature fluctuation occurs. Specifically, it is desirable that the difference between the linear (thermal) expansion coefficients of the two is in the range of 35 × 10 −6 or less. Note that a metal film 12 exists between the inflexible film 14 and the dielectric prism substrate 22, but the metal film 12 has upper and lower inflexible films 14 and a dielectric prism when the temperature fluctuates. Since it expands and contracts following the substrate 22, it is still desirable that the inflexible film 14 and the dielectric prism substrate 22 have closer thermal expansion coefficients. In consideration of the above points, when the inflexible film 14 is formed from a polymer material, it can be said that it is generally more preferable to select a resin than the glass as the material of the dielectric prism substrate 22.
一方、不撓性膜１４の膜厚は１０ｎｍ〜１００ｎｍとする。ここで、上記膜厚の下限値および上限値をそれぞれ１０ｎｍ、１００ｎｍと規定したのは以下の理由による。 On the other hand, the film thickness of the inflexible film 14 is 10 nm to 100 nm. Here, the reason why the lower limit value and the upper limit value of the film thickness are defined as 10 nm and 100 nm, respectively, is as follows.
金属の近傍に存在する蛍光材料は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして、金属膜の場合は、金属と蛍光材料との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。これにより、本発明では不撓性膜１４の膜厚の下限値を１０ｎｍとする。一方、蛍光材料は、エバネッセント波によって励起される。このエバネッセント波は、金属膜表面から高々励起光の波長程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際に、波長６３５ｎｍの可視光について両者の関係を計算によって求めると、エバネッセント波が到達するのは波長（６３５ｎｍ）程度である。しかしながら、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光材料を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光材料との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。それにより、本発明では不撓性膜１４の膜厚の上限値を１００ｎｍとする。ただし、後述するように本発明においてホットスポット４０を形成させるために、金属微粒子Ｐと金属膜１２との距離を少なくとも１０ｎｍ程度に保つように不撓性膜１４の膜厚を考慮する必要がある。 The fluorescent material existing in the vicinity of the metal is quenched by energy transfer to the metal. The degree of energy transfer is inversely proportional to the third power of the distance if the metal has a semi-infinite thickness, inversely proportional to the fourth power of the distance if the metal is infinitely thin, and It becomes smaller in inverse proportion to the sixth power. In the case of a metal film, the distance between the metal and the fluorescent material is preferably at least several nm or more, more preferably 10 nm or more. Thereby, in this invention, the lower limit of the film thickness of the inflexible film | membrane 14 shall be 10 nm. On the other hand, the fluorescent material is excited by an evanescent wave. This evanescent wave is at most about the wavelength of the excitation light from the surface of the metal film, and the electric field strength is known to rapidly decay exponentially according to the distance from the surface of the metal film. Actually, when the relationship between the two is obtained by calculation for visible light having a wavelength of 635 nm, the evanescent wave arrives at a wavelength of about 635 nm. However, when it exceeds 100 nm, the electric field strength rapidly attenuates. Since it is desirable that the electric field intensity for exciting the fluorescent material is larger, it is desirable to make the distance between the metal film surface and the fluorescent material smaller than 100 nm in order to perform effective excitation. Thereby, in this invention, the upper limit of the film thickness of the inflexible film | membrane 14 shall be 100 nm. However, as will be described later, in order to form the hot spot 40 in the present invention, it is necessary to consider the film thickness of the inflexible film 14 so as to keep the distance between the metal fine particles P and the metal film 12 at least about 10 nm.
なお、ポリマーからなる不撓性膜１４を用いた場合、被検出物質がタンパク等であれば容易に非特異的吸着しやすくなっている。これは、ポリマーとタンパク等が疎水性を有することに起因する疎水性効果による。この場合、非特異的吸着したタンパク等が蛍光検出を行う上で定量性を損なう要因となってしまうため、不撓性膜１４の表面に親水性表面修飾を施すことが望ましい。さらに、この表面修飾は上記のような機能の他に、特異的結合物質を固定するリンカーとしての機能も持たせることができる。 When the inflexible film 14 made of a polymer is used, nonspecific adsorption is easily performed if the substance to be detected is a protein or the like. This is due to the hydrophobic effect resulting from the hydrophobic nature of the polymer and protein. In this case, since non-specifically adsorbed protein or the like becomes a factor that impairs the quantitativeness when performing fluorescence detection, it is desirable to perform hydrophilic surface modification on the surface of the inflexible film 14. Furthermore, this surface modification can have a function as a linker for immobilizing a specific binding substance in addition to the above function.
試料保持部１３は、試料Ｓを検出部上（本実施形態において、より正確には不撓性膜１４上）に接するように保持でき、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光の検出を妨げないような形状や材料であれば特に制限されるものではない。蛍光を上方から検出する場合には、例えば図１中に示すような、光を透過させない側面と光をよく透過させる上端面からなる試料保持部１３等を用いることができる。ここで、光を透過させない側面を用いているのは、意図しない外部からの光を遮断するためである。 The sample holding unit 13 can hold the sample S so as to be in contact with the detection unit (more precisely, on the inflexible film 14 in this embodiment), and does not hinder the detection of the fluorescence emitted from the fluorescent label F. There is no particular limitation as long as it is a material. In the case of detecting fluorescence from above, for example, a sample holder 13 having a side surface that does not transmit light and an upper end surface that transmits light well as shown in FIG. 1 can be used. Here, the reason why the side surface that does not transmit light is used is to block unintended light from the outside.
光検出器３０は、蛍光標識Ｆが発する特定波長の蛍光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。 The photodetector 30 quantitatively detects fluorescence of a specific wavelength emitted by the fluorescent label F. For example, LAS-1000 plus (trade name) manufactured by FUJIFILM Corporation can be suitably used. It can be appropriately selected according to the detection conditions, and a CCD, PD (photodiode), photomultiplier tube, c-MOS or the like can be used.
１次抗体Ｂ１は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原ＡがＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原Ａと特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体Ｂ２と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、ポリマー材料からなる場合の不撓性膜１４に固定することができる。上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０ｕｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。 The primary antibody B1 is not particularly limited and can be appropriately selected according to detection conditions (particularly, a substance to be detected). For example, when the antigen A is a CRP antigen (molecular weight 110,000 Da), a monoclonal antibody that specifically binds to the antigen A (at least an epitope different from the secondary antibody B2) can be used. It can fix to the inflexible film | membrane 14 in the case of consisting of a polymer material by amine coupling method through grouped PEG. The amine coupling method includes the following steps (1) to (3) as an example. This is an example when a 30 ul (micro liter) cuvette / cell is used.
（１）リンカー部先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１ＭのＮＨＳと０．４ＭのＥＤＣとを等体積混合した溶液を３０ｕｌ加え、３０分間室温静置する。
NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
（２）１次抗体の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１次抗体溶液（５００ｕｇ／ｍｌ）を３０ｕｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。
（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０ｕｌ加え、２０分間室温静置する。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄する。
(1) Activate the -COOH group at the tip (end) of the linker part Add 30 ul of a solution in which an equal volume of 0.1 M NHS and 0.4 M EDC is mixed, and let stand at room temperature for 30 minutes.
NHS: N-hydrooxysuccinimide
EDC: 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
(2) Immobilization of primary antibody After washing 5 times with PBS buffer (pH 7.4), 30 ul of primary antibody solution (500 ug / ml) is added and left at room temperature for 30-60 minutes.
(3) After washing unreacted —COOH group 5 times with a blocking PBS buffer (pH 7.4), 30 ul of 1M ethanolamine (pH 8.5) is added, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 20 minutes. Further, it is washed 5 times with PBS buffer (pH 7.4).
一方、図２に示すように、本発明の第１の実施形態による蛍光検出方法は、誘電体プリズム基板２２の一面に成膜された金属膜１２と、この金属膜１２上の不撓性膜１４とからなる検出部上に、１次抗体Ｂ１を固定し、抗原Ａを含む試料Ｓを流して（図２Ａ）、この抗原Ａを１次抗体Ｂ１に固定し（図２Ｂ）、その後蛍光標識Ｆを流し（図２Ｃ）、１次抗体Ｂ１に結合した抗原Ａに、２次抗体Ｂ２を介して蛍光標識Ｆを結合させて、いわゆるサンドイッチ方式により蛍光標識Ｆを検出部に固定し（図２Ｄ）、蛍光標識Ｆを励起発光可能な波長の励起光Ｌｉを、誘電体プリズム基板２２と金属膜１２との界面１２ａに対して、この界面１２ａでの全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板２２を通し入射して、この界面１２ａ表面に生じる電場増強場Ｅｗにより、検出部表面に固定された蛍光標識Ｆを励起させ、これにより発せられる蛍光を検出する（図２Ｅ）ものであって、図３に示すように、蛍光を光検出器３０により検出する際、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて行うものである。 On the other hand, as shown in FIG. 2, the fluorescence detection method according to the first embodiment of the present invention includes the metal film 12 formed on one surface of the dielectric prism substrate 22 and the inflexible film 14 on the metal film 12. The primary antibody B1 is immobilized on the detection part consisting of the following, the sample S containing the antigen A is flowed (FIG. 2A), this antigen A is immobilized on the primary antibody B1 (FIG. 2B), and then the fluorescent label F (FIG. 2C), the fluorescent label F is bound to the antigen A bound to the primary antibody B1 via the secondary antibody B2, and the fluorescent label F is fixed to the detection part by a so-called sandwich method (FIG. 2D). The dielectric prism substrate 22 is configured such that the excitation light Li having a wavelength capable of exciting and emitting the fluorescent label F satisfies the total reflection condition at the interface 12a with respect to the interface 12a between the dielectric prism substrate 22 and the metal film 12. Is incident on the surface of the interface 12a. The field-enhanced field Ew excites the fluorescent label F fixed on the surface of the detection unit and detects the fluorescence emitted thereby (FIG. 2E). As shown in FIG. In the detection, the plurality of metal fine particles P are dispersed on the detection unit.
ここで、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識Ｆであるが、基本的に前処理によって、この蛍光標識Ｆには抗原Ａが結合しているものと考えて、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、間接的に抗原Ａの存在を確認している。 Here, it is the fluorescent label F that is actually confirmed by fluorescence detection, but it is considered that the antigen A is bound to the fluorescent label F basically by pretreatment. By confirming the presence of F, the presence of antigen A is indirectly confirmed.
蛍光標識Ｆは、励起光Ｌｉによって励起されて所定波長の蛍光を発するものであり、特に制限なく、検出条件に応じて適宜選択することができる。例えば、励起光Ｌｉの波長が６５０ｎｍの場合、Ｃｙ５色素等を用いることができる。この場合、蛍光標識Ｆをモノクロナール抗体等（２次抗体Ｂ２であって、１次抗体Ｂ１とはエピトープが異なるもの。）に修飾することにより、抗原抗体反応を用いて、蛍光標識Ｆを抗原Ａと特異的に結合可能にすることができる。なお、上記の蛍光標識Ｆおよび２次抗体Ｂ２の供給のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を１次抗体Ｂ１に結合させる前に、予め試料Ｓに蛍光標識Ｆを添加しておいてもよい。 The fluorescent label F emits fluorescence of a predetermined wavelength when excited by the excitation light Li, and can be appropriately selected according to detection conditions without any particular limitation. For example, when the wavelength of the excitation light Li is 650 nm, a Cy5 dye or the like can be used. In this case, by modifying the fluorescent label F with a monoclonal antibody or the like (secondary antibody B2 having an epitope different from that of the primary antibody B1), the antigen-antibody reaction is used to convert the fluorescent label F to the antigen. A can be specifically bound to A. Note that the timing of supplying the fluorescent label F and the secondary antibody B2 is not particularly limited, and the fluorescent label F is added to the sample S in advance before the target substance (antigen A) is bound to the primary antibody B1. You may keep it.
金属微粒子Ｐの材料は特に制限はないが、局在プラズモンを効果的に誘起することができ、化学的安定性（試料Ｓに対する安定性）にも優れることから、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ等が好ましい。また、金属微粒子Ｐの形状は特に制限はないが、球状およびロッド状等が好ましく、金属微粒子Ｐを検出部の上に密に分散させる点から、ロッド状（ナノロッド）が好ましい。金属微粒子Ｐの粒径は、局在プラズモンを効果的に誘起することから、励起光Ｌｉの波長より小さいことが好ましく、４０〜２００ｎｍが特に好ましい。なお、ここで言う粒径とは微粒子の最大径を意味する。そして、金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させるタイミングは特に制限されるものではないが、蛍光を検出する前に金属微粒子Ｐを供給し分散させることが好ましく、本実施形態のような場合にあっては特に抗原Ａおよび蛍光標識Ｆを検出部に固着させる工程が終わった後に行うことがより好ましい。さらに、検出部に分散させる金属微粒子Ｐの量は、密に分散させることと光を効率よく取出すこととのバランスから、１０６個/ｍｍ２程度であることが好ましい。 The material of the metal fine particle P is not particularly limited, but can induce localized plasmons effectively and is excellent in chemical stability (stability with respect to the sample S). Therefore, Au, Ag, Cu, Pt, Ni, Ti and the like are preferable. The shape of the metal fine particle P is not particularly limited, but a spherical shape or a rod shape is preferable, and a rod shape (nanorod) is preferable from the viewpoint that the metal fine particles P are densely dispersed on the detection unit. The particle size of the metal fine particles P is preferably smaller than the wavelength of the excitation light Li, and particularly preferably 40 to 200 nm, in order to effectively induce localized plasmons. In addition, the particle diameter said here means the maximum diameter of microparticles | fine-particles. The timing of dispersing the metal fine particles P on the detection unit is not particularly limited, but it is preferable to supply and disperse the metal fine particles P before detecting the fluorescence. In particular, it is more preferable to carry out after the step of fixing the antigen A and the fluorescent label F to the detection part is completed. Furthermore, the amount of the metal fine particles P to be dispersed in the detection unit is preferably about 10 6 / mm 2 in view of the balance between dense dispersion and efficient light extraction.
さらに本実施形態では、上記金属微粒子Ｐは誘電体材料からなる誘電体層４１によって覆われている。これにより、金属消光が起きてしまう程度にまで金属微粒子Ｐが蛍光標識Ｆに近接してしまうことを防ぐことができる。 Furthermore, in the present embodiment, the metal fine particles P are covered with a dielectric layer 41 made of a dielectric material. Thereby, it can prevent that the metal microparticle P adjoins to the fluorescent label F to such an extent that metal quenching occurs.
上記の金属微粒子Ｐを覆う誘電体層４１の形成方法は、例えば以下に示す２つの方法が挙げられる。なお、以下の２つの場合において共に金属微粒子Ｐとして金微粒子を扱っている。 Examples of the method of forming the dielectric layer 41 covering the metal fine particles P include the following two methods. In the following two cases, gold fine particles are handled as the metal fine particles P.
まず第１の方法は、誘電体層４１をＳｉＯ２膜から形成するものであり、大きく分けて次の（１）〜（３）の工程からなる。 First, the first method is to form the dielectric layer 41 from a SiO 2 film, and roughly comprises the following steps (1) to (3).
（１）金微粒子となる金コロイドの合成
（２）金コロイド表面分散剤の置換（クエン酸→シロキサン）
５×＝１０−４ｍｏｌの金コロイド水溶液５００ｍｌ（ミリ・リットル）に、ＡＰＳ（（3-Aminopropyl）trimethoxysilane）水溶液（２．５ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間強攪拌することにより、金コロイド表面のクエン酸を置換する。
（３）金コロイド表面のＳｉＯ２修飾
ｐＨ１０〜１１に調整したsodium silicate０．５４重量％水溶液２０ｍｌを工程（２）の金コロイド水溶液に添加し、強攪拌する。２４時間経過すると、厚さが約４ｎｍのＳｉＯ２膜が形成される。この溶液を遠心分離により３０ｍｌまで濃縮した溶液に、１７０ｍｌのエタノールを添加する。さらに０．６ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２８％）を滴下し、８０μｌ（マイクロ・リットル）のＴＥＳ（テトラエトキシシラン）を添加し、２４時間ゆっくり攪拌すると、厚さ２０ｎｍのＳｉＯ２膜からなる誘電体層４１が形成される。
(1) Synthesis of gold colloid to become gold fine particles (2) Replacement of gold colloid surface dispersant (citric acid → siloxane)
By adding APS ((3-aminopropyl) trimethoxysilane) aqueous solution (2.5 ml, 1 mmol) to 500 ml (milliliter) of 5 × = 10-4 mol colloidal gold aqueous solution, and stirring vigorously for 15 minutes, Of citric acid.
(3) Modification of SiO 2 surface of gold colloid surface 20 ml of 0.54 wt% aqueous solution of sodium silicate adjusted to pH 10-11 is added to the aqueous gold colloid solution in step (2) and stirred vigorously. After 24 hours, a SiO 2 film having a thickness of about 4 nm is formed. 170 ml of ethanol is added to a solution concentrated to 30 ml by centrifugation. Further, 0.6 ml of NH 4 OH (28%) is dropped, 80 μl (micro liter) of TES (tetraethoxysilane) is added, and when slowly stirred for 24 hours, a dielectric composed of a 20 nm thick SiO 2 film Layer 41 is formed.
次に第２の方法として、誘電体層４１をポリマー膜から形成する場合について説明する。この方法は、大きく分けて次の（１）〜（２）の工程からなる。 Next, a case where the dielectric layer 41 is formed from a polymer film will be described as a second method. This method is roughly divided into the following steps (1) to (2).
（１）金微粒子となる金ナノ粒子のＤＭＦへの再分散
平均粒径が役３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を最大約３６０ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含む水分散液を１ｍｌ用意し、これを遠心分離にかけた後、上澄み０．９５ｍｌを捨てる。残った暗赤色、粘稠性の沈殿物を１ｍｌのＤＭＦ（N,N-dimethylformamide）に再分散させる。なお、過剰のクエン酸イオンは粒子のカプセル化を阻害する。また、小粒径の粒子を用いる場合は、ＤＭＦを加える前に水で洗浄した方が良い。
(1) Redispersion of gold nanoparticles as gold fine particles into DMF 1 ml of an aqueous dispersion containing a maximum of about 360 pmol (= 7 × 10 −11 wt%) of citric acid-stabilized gold nanoparticles having an average particle size of 30 nm Prepare and centrifuge, then discard 0.95 ml of supernatant. The remaining dark red, viscous precipitate is redispersed in 1 ml DMF (N, N-dimethylformamide). It should be noted that excess citrate ions inhibit particle encapsulation. When using small particles, it is better to wash with water before adding DMF.
（２）金ナノ粒子のカプセル化
上記（１）の工程で得られた、平均粒径（粒径は、透過型電子顕微鏡による直接観察や、光吸収スペクトルから換算する方法にて決定することができる。）が約３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を約６４８ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含むＤＭＦ分散液１ｍｌに、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体（ポリスチレンが約１００量体、ポリアクリル酸が約１３量体)のＤＭＦ溶液(約１０−２ｇ／ｍｌ)１０μｌを加え、シリンジポンプにより８．３μｌ／ｍｉｎの流量で水２００μｌを加えて激しく撹拌する。１０分撹拌すると溶液の色が徐々に紫色に変化するので、そこで１重量％のドデカンチオールＤＭＦ溶液５μｌを加え、２４時間撹拌する。その後、さらにシリンジポンプにより、２ｍｌ／ｈの流量で水３ｍｌを加える。
(2) Encapsulation of gold nanoparticles The average particle size obtained in the step (1) above (the particle size can be determined by direct observation with a transmission electron microscope or a method converted from a light absorption spectrum. Can be added to 1 ml of a DMF dispersion containing about 648 pmol (= 7 × 10 −11 wt%) of citric acid-stabilized gold nanoparticles of about 30 nm, and polystyrene-polyacrylic acid block copolymer (about 100-mer polystyrene). 10 μl of polyacrylic acid (about 13-mer) in DMF (about 10 −2 g / ml) is added, and 200 μl of water is added at a flow rate of 8.3 μl / min with a syringe pump and vigorously stirred. When the solution is stirred for 10 minutes, the color of the solution gradually changes to purple. Then, 5 μl of a 1% by weight dodecanethiol DMF solution is added and stirred for 24 hours. Thereafter, 3 ml of water is further added by a syringe pump at a flow rate of 2 ml / h.
次に透析により２４時間かけてＤＭＦを除去する。次いで撹拌しながら７２μｌのＥＤＣ溶液（水に対して０．１重量％：２４ｎｍｏｌ）を一気に添加し、３０分撹拌したところで１４４μｌのＥＤＯＤＥA溶液（水に対して０．１重量％：９６ｎｍｏｌ）を一気に添加し、撹拌する。 The DMF is then removed by dialysis over 24 hours. Next, 72 μl of EDC solution (0.1 wt% with respect to water: 24 nmol) was added all at once while stirring, and after stirring for 30 minutes, 144 μl of EDODEA solution (0.1 wt% with respect to water: 96 nmol) was added all at once. Add and stir.
その後、透析により２４時間かけて試薬を除去し、次いで４０００Ｇで３０分間遠心分離を行い、体積で８０％に相当する上澄みを捨てる。次に捨てた上澄みと同体積の水を加えて同様に遠心分離を行う。この遠心分離から遠心分離までの操作を３回以上繰り返すことにより、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体の架橋物からなる被膜が金ナノ粒子（金微粒子）の周りに誘電体層４１として形成される。 Thereafter, the reagent is removed by dialysis over 24 hours, followed by centrifugation at 4000 G for 30 minutes, and the supernatant corresponding to 80% by volume is discarded. Next, add the same volume of water as the discarded supernatant and centrifuge in the same manner. By repeating this operation from centrifugation to centrifugation three times or more, a film made of a crosslinked product of polystyrene-polyacrylic acid block copolymer is formed as a dielectric layer 41 around gold nanoparticles (gold fine particles). The
以下、上記に示した本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。 Hereinafter, the operation of the fluorescence detection method and the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment described above will be described.
不撓性膜１４上には、抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１が固定化されている。そして試料保持部１３の中において試料Ｓが流され、試料Ｓ中の抗原Ａは１次抗体Ｂ１に結合し固定される。次いで同様に抗原Ａと特異的に結合するよう施された蛍光標識Ｆが流され、先ほどの１次抗体Ｂ１に結合した抗原Ａと２次抗体Ｂ２を介して上記蛍光標識Ｆが検出部に固定される（サンドイッチ方式）。 On the inflexible membrane 14, a primary antibody B1 that specifically binds to the antigen A is immobilized. Then, the sample S is caused to flow in the sample holder 13, and the antigen A in the sample S is bound and fixed to the primary antibody B1. Next, the fluorescent label F applied to specifically bind to the antigen A is flowed in the same manner, and the fluorescent label F is fixed to the detection part via the antigen A and the secondary antibody B2 that are bound to the primary antibody B1. (Sandwich method)
その後、光源２１から発せられる励起光Ｌｉを、誘電体プリズム基板２２と金属膜１２の界面１２ａに対して、この界面１２ａでの全反射条件を満たすように基板を通し入射する。このとき、この界面１２ａ表面にエバネッセント波が発生し、このエバネッセント波との共鳴により金属膜１２中に表面プラズモンが発生する。そして、この表面プラズモンによる電場増強効果を受けて電場増強されたエバネッセント波（電場増強場Ｅｗ）により、検出部に固定された蛍光標識Ｆが励起されることとなる。この蛍光標識Ｆは所定波長の蛍光を発し、この蛍光検出によって抗原Ａの検出を行うことができる。 Thereafter, the excitation light Li emitted from the light source 21 enters the interface 12a between the dielectric prism substrate 22 and the metal film 12 through the substrate so as to satisfy the total reflection condition at the interface 12a. At this time, an evanescent wave is generated on the surface of the interface 12a, and surface plasmon is generated in the metal film 12 due to resonance with the evanescent wave. And the fluorescent label F fixed to the detection part is excited by the evanescent wave (electric field enhancement field Ew) enhanced by the electric field enhancement due to the electric field enhancement effect by the surface plasmon. This fluorescent label F emits fluorescence of a predetermined wavelength, and antigen A can be detected by this fluorescence detection.
本実施形態による蛍光検出方法ではこの蛍光を検出する際、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて蛍光を光検出器３０により検出している。これにより、金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に生じるホットスポット４０によって、このホットスポット４０内に存在する蛍光標識Ｆからの蛍光を増強することができる。ホットスポットとは、金属微粒子Ｐと金属膜１２が１０ｎｍ程度に近づいたときに微小構造の物質に静電気力が集中（電界集中）する結果形成される局所的な強い電場領域である。 In the fluorescence detection method according to the present embodiment, when detecting the fluorescence, a plurality of metal fine particles P are dispersed on the detection unit, and the fluorescence is detected by the photodetector 30. Thereby, the fluorescence from the fluorescent label F existing in the hot spot 40 can be enhanced by the hot spot 40 generated in the gap between the metal fine particle and the metal fine particle or the gap between the metal fine particle and the metal film. A hot spot is a locally strong electric field region formed as a result of electrostatic force concentration (electric field concentration) on a microstructure material when the metal fine particles P and the metal film 12 approach about 10 nm.
特に金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に形成される「ホットスポット」においては、上記プラズモンによって増強された電場が集中し巨大な電場が形成されるとともに、それによって相手側のプラズモンをさらに強く誘起し合うという相乗効果が生じるため、他の場合（例えば粒子が単独で存在する場合や非金属の粒子が近接する場合）に較べ格段に強い電場増強場が生じる。例えば、２つの金属微粒子が数ｎｍまで近接した場合には、隙間に生じる「ホットスポット」での電場増強度は、非特許文献２にも記載されているように１０６以上にもなることが知られている。 In particular, in the “hot spot” formed in the gap between the metal fine particle and the metal fine particle or the gap between the metal fine particle and the metal film, the electric field enhanced by the plasmon is concentrated and a huge electric field is formed. Since a synergistic effect of inducing the plasmons on the other side more strongly occurs, an electric field enhancement field much stronger than in other cases (for example, when particles are present alone or non-metallic particles are close to each other) is generated. For example, when two metal fine particles are close to several nanometers, the electric field enhancement at the “hot spot” generated in the gap may be 10 6 or more as described in Non-Patent Document 2. Are known.
以上の結果、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法を用いても、一分子レベルでの高感度検出が可能となる。 As a result, high-sensitivity detection at the single molecule level is possible even with a fluorescence method that is easier and less expensive than Raman spectroscopy.
一方、複数の金属微粒子Ｐを検出部上に広く分散させているため、上記ホットスポット４０を広い範囲にわたり形成させることができる。この結果、電場増強効果を有する領域が金属プローブの先端付近に限られるラマン分光法に比べて、広い範囲にわたる測定を短時間で行うことが可能となる。 On the other hand, since the plurality of metal fine particles P are widely dispersed on the detection portion, the hot spot 40 can be formed over a wide range. As a result, it is possible to perform measurement over a wide range in a short time compared to Raman spectroscopy in which the region having the electric field enhancement effect is limited to the vicinity of the tip of the metal probe.
また、金属微粒子は同体積の他の微粒子に較べ格段に光を散乱させる力(散乱能)が大きいため、この散乱光を二次的な励起光として用いることにより蛍光色素をさらに効率的に照明することができる。 In addition, metal fine particles have a much larger light scattering power (scattering ability) than other fine particles of the same volume, so this scattered light can be used as secondary excitation light to illuminate fluorescent dyes more efficiently. can do.
さらに本実施形態による蛍光検出方法では、不撓性膜１４が形成されているので、蛍光標識Ｆから金属膜１２へエネルギー移動が起こり金属内でエネルギーが消失される、いわゆる金属消光を防止することができる。これにより、励起した蛍光標識Ｆから効率よく蛍光を得ることができる。 Furthermore, in the fluorescence detection method according to the present embodiment, since the inflexible film 14 is formed, it is possible to prevent so-called metal quenching in which energy is transferred from the fluorescent label F to the metal film 12 and energy is lost in the metal. it can. Thereby, fluorescence can be efficiently obtained from the excited fluorescent label F.
そして、誘電体層４１が金属微粒子Ｐを覆うように形成されているため、上記と同様な効果により蛍光の金属微粒子Ｐによる金属消光を防止することができる。 Since the dielectric layer 41 is formed so as to cover the metal fine particles P, metal quenching by the fluorescent metal fine particles P can be prevented by the same effect as described above.
また、電場増強場Ｅｗは、界面１２ａから数百ｎｍ程度の領域にしか到達しないため、上記１次抗体Ｂ１を用いて蛍光標識Ｆと抗原Ａの対を検出部に集約させることにより、電場増強場Ｅｗにより励起される蛍光標識Ｆの量を増やすことが可能である。これにより、多くの蛍光量を得ることができ、結果としてより定量性の高い蛍光検出が可能となる。なお、上記のよう電場増強場Ｅｗの到達領域に関する特性により、意図せず試料Ｓ中に残ってしまった不純物９０からの散乱や浮遊蛍光標識Ｆ’からの発光等の影響を大幅に低減することができるため、さらにＳ／Ｎ比のよい蛍光検出が可能となる。 Further, since the electric field enhancement field Ew reaches only a region of about several hundreds of nanometers from the interface 12a, the electric field enhancement is achieved by concentrating the pair of the fluorescent label F and the antigen A in the detection unit using the primary antibody B1. It is possible to increase the amount of fluorescent label F excited by the field Ew. As a result, a large amount of fluorescence can be obtained, and as a result, fluorescence detection with higher quantitativeness becomes possible. In addition, due to the characteristics related to the arrival region of the electric field enhancement field Ew as described above, the influence of the scattering from the impurity 90 unintentionally left in the sample S, the light emission from the floating fluorescent label F ′, etc. is greatly reduced. Therefore, it is possible to detect fluorescence with a better S / N ratio.
＜第２の実施形態＞
図４は、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置における、金属微粒子Ｐを分散させた検出部付近を示す概略部分断面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図１に示す第１の実施形態で説明した蛍光検出装置と同様である。一方、本実施形態による蛍光検出方法は、入射する励起光Ｌｉの波長として、金属微粒子Ｐに局在プラズモンを誘起することが可能である特定の波長を用いている点で第１の実施形態と異なる。そのため、その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１および図２に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
<Second Embodiment>
FIG. 4 is a schematic partial cross-sectional view showing the vicinity of the detection unit in which the metal fine particles P are dispersed in the fluorescence detection method and the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment. The fluorescence detection device used in this embodiment is the same as the fluorescence detection device described in the first embodiment shown in FIG. On the other hand, the fluorescence detection method according to the present embodiment is different from the first embodiment in that a specific wavelength capable of inducing localized plasmons in the metal fine particles P is used as the wavelength of the incident excitation light Li. Different. Therefore, other configurations are the same as in the case of the first embodiment, and descriptions of elements equivalent to those in the first embodiment shown in FIGS. 1 and 2 are omitted unless particularly necessary.
本実施形態による蛍光検出方法では、前述したとおり、入射する励起光Ｌｉの波長として、金属微粒子Ｐに局在プラズモンを誘起することが可能である特定の波長を用いていることにより、金属微粒子Ｐに局在プラズモンが生じる。 In the fluorescence detection method according to the present embodiment, as described above, by using a specific wavelength capable of inducing localized plasmons in the metal fine particle P as the wavelength of the incident excitation light Li, the metal fine particle P Localized plasmons occur in
励起光Ｌｉの波長は特に制限されるものではないが、金属微粒子Ｐに局在プラズモンを誘起できるように、かつ測定条件特に測定対象とする被検出物質や蛍光標識等に応じて適宜選択できる。 The wavelength of the excitation light Li is not particularly limited, but can be appropriately selected so that localized plasmons can be induced in the metal fine particles P and according to the measurement conditions, particularly the substance to be detected, the fluorescent label, and the like.
金属微粒子Ｐは第１の実施形態と同様のものであるが、励起光Ｌｉの波長に応じて局在プラズモンを誘起できるようにその粒径は適宜選択する。 The metal fine particles P are the same as those in the first embodiment, but their particle sizes are appropriately selected so that localized plasmons can be induced according to the wavelength of the excitation light Li.
以下、上記に示した本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。 Hereinafter, the operation of the fluorescence detection method and the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment described above will be described.
本実施形態においても、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて蛍光を光検出器３０により検出しているため、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。 Also in this embodiment, since the plurality of metal fine particles P are dispersed on the detection unit and the fluorescence is detected by the photodetector 30, the same effect as that of the first embodiment can be obtained.
さらに、本実施形態では局在プラズモンが生じた結果、図４に示すように、この局在プラズモンによって増強された近接場光ＮＬが金属微粒子Ｐの周囲に染み出すこととなる。この近接場光ＮＬは、前述したホットスポット４０とは独立して発生するものであるため、ホットスポット４０の形成には影響を及ぼさない。すなわち、本実施形態では金属微粒子Ｐによるホットスポット４０の形成と近接場光ＮＬの発生の両方が起こる。したがって、ホットスポット４０のみならず、この近接場光ＮＬによっても蛍光標識Ｆを励起させることができるので、より高感度の蛍光検出が可能となる。 Furthermore, as a result of the occurrence of localized plasmons in this embodiment, the near-field light NL enhanced by the localized plasmons oozes out around the metal fine particles P as shown in FIG. Since the near-field light NL is generated independently of the hot spot 40 described above, the formation of the hot spot 40 is not affected. That is, in this embodiment, both the formation of the hot spot 40 by the metal fine particles P and the generation of the near-field light NL occur. Therefore, since the fluorescent label F can be excited not only by the hot spot 40 but also by the near-field light NL, fluorescence detection with higher sensitivity is possible.
＜第３の実施形態＞
図５は、本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置における、金属微粒子Ｐを分散させた検出部付近を示す概略部分断面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図１に示す第１の実施形態で説明した蛍光検出装置と同様である。一方、本実施形態による蛍光検出方法は、被検出物質を標識する蛍光標識として、蛍光色素分子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いている点と、金属微粒子Ｐを覆う誘電体層４１を必要としない点で第１の実施形態と異なる。そのため、その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１および図２に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
<Third Embodiment>
FIG. 5 is a schematic partial cross-sectional view showing the vicinity of the detection unit in which the metal fine particles P are dispersed in the fluorescence detection method and the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment. The fluorescence detection device used in this embodiment is the same as the fluorescence detection device described in the first embodiment shown in FIG. On the other hand, the fluorescence detection method according to the present embodiment includes a fluorescent dye molecule as a fluorescent label for labeling a substance to be detected by a quenching prevention material that transmits fluorescence generated from the fluorescent dye molecule and prevents metal quenching. This is different from the first embodiment in that a quenching-proof fluorescent material is used and a dielectric layer 41 that covers the metal fine particles P is not required. Therefore, other configurations are the same as in the case of the first embodiment, and descriptions of elements equivalent to those in the first embodiment shown in FIGS. 1 and 2 are omitted unless particularly necessary.
本実施形態による蛍光検出方法では、前述したとおり、被検出物質を標識する蛍光標識Ｆとして、蛍光色素分子１５を、蛍光色素分子１５から生じる蛍光を透過させると共に、金属消光を防止する消光防止材料１６により包含してなる消光防止性蛍光物質ＦＢを用いている。 In the fluorescence detection method according to the present embodiment, as described above, as the fluorescent label F for labeling the substance to be detected, the fluorescent dye molecule 15 transmits the fluorescence generated from the fluorescent dye molecule 15 and also quenches the metal. 16 is used as the quenching-proof fluorescent material FB.
消光防止性蛍光物質ＦＢは、粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましく、５００ｎｍ以下のものがさらに好ましく、１３０〜５００ｎｍのものが特に好ましい。上記の好ましい粒経は以下のようにして算出された。 The quenching-resistant fluorescent material FB preferably has a particle size of 5300 nm or less, more preferably 500 nm or less, and particularly preferably 130 to 500 nm. The preferred particle size was calculated as follows.
表面プラズモン励起による蛍光検出にあたり、消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱を考慮する必要がある。 When detecting fluorescence by surface plasmon excitation, it is necessary to consider the disturbance of surface plasmons caused by a quenching-proof fluorescent material.
消光防止性蛍光物質の材質には水溶媒より屈折率の高い材料を用いている。例えばポリスチレンの屈折率ｎは、１．５９〜１．６である。このような高屈折率の消光防止性蛍光物質が金属膜近傍に位置することによって表面プラズモンの発生が阻害されうる。この現象をプリズム層１０１、金属膜１０２、溶媒層１０３の三層に分けた多層膜近似で考察した。図６Ａは金属層１０２上に水溶媒層のみである場合、図６Ｂは金属膜１０２にポリスチレンの消光防止性蛍光物質１０４が存在する場合に、プリズム層１０１側から光ビームを入射させた場合に金属膜表面に生じる電場Ｅを模式的に示している。 A material having a refractive index higher than that of the aqueous solvent is used as the material of the quenching-proof fluorescent material. For example, the refractive index n of polystyrene is 1.59 to 1.6. The occurrence of surface plasmons can be inhibited by the presence of such a high refractive index quenching fluorescent substance in the vicinity of the metal film. This phenomenon was considered by a multilayer film approximation divided into three layers of a prism layer 101, a metal film 102, and a solvent layer 103. 6A shows a case where only the aqueous solvent layer is formed on the metal layer 102, and FIG. 6B shows a case where a light beam is incident from the prism layer 101 side when a polystyrene quenching fluorescent substance 104 is present on the metal film 102. An electric field E generated on the surface of the metal film is schematically shown.
プリズム層１０１、溶媒層１０３（１０３’）は十分な膜厚があり、プリズム層１０１の屈折率、金属膜１０２の屈折率、膜厚がすでに決まっていると仮定すると、金属膜表面上に誘起されるプラズモンの状態は金属膜上の溶媒屈折率によって決まる。図７は、金属膜１０２上に水溶媒層のみである場合（実線で示す）と、金属層上にポリスチレン層が存在する場合（破線で示す）について、励起光の界面への入射角度と反射率との関係をシミュレーションにより求めたグラフである。このグラフから溶媒側に水溶媒層(屈折率ｎ＝１．３３）がある場合には、表面プラズモンが発生する共鳴角が存在するが、ポリスチレン層（屈折率ｎ＝１．５９）がある場合には表面プラズモンが発生しない（共鳴角が現れない）ことがわかる。すなわち、図６Ｂに示すように消光防止性蛍光物質１０４により点線で示す領域１０５の電場が乱されている。このことから、屈折率の高い消光防止性蛍光物質(ポリスチレンやガラス製)を用いてアッセイを行い、金属膜近傍に消光防止性蛍光物質が固定されると、表面プラズモンが阻害されて低減してしまい、ＳＰＦ測定ができなくなると推察される。 Assuming that the prism layer 101 and the solvent layer 103 (103 ′) have sufficient film thicknesses, and the refractive index of the prism layer 101, the refractive index of the metal film 102, and the film thickness are already determined, they are induced on the surface of the metal film. The state of the plasmon is determined by the refractive index of the solvent on the metal film. FIG. 7 shows the incident angle and reflection of the excitation light on the interface when there is only an aqueous solvent layer on the metal film 102 (indicated by a solid line) and when a polystyrene layer is present on the metal layer (indicated by a broken line). It is the graph which calculated | required the relationship with a rate by simulation. From this graph, when there is an aqueous solvent layer (refractive index n = 1.33) on the solvent side, there is a resonance angle at which surface plasmons are generated, but there is a polystyrene layer (refractive index n = 1.59). It can be seen that no surface plasmon is generated in (no resonance angle appears). That is, as shown in FIG. 6B, the electric field in the region 105 indicated by the dotted line is disturbed by the quenching-proof fluorescent material 104. Therefore, when an assay is performed using a quenching fluorescent substance (made of polystyrene or glass) having a high refractive index and the quenching fluorescent substance is fixed in the vicinity of the metal film, the surface plasmon is inhibited and reduced. Therefore, it is assumed that SPF measurement cannot be performed.
このような、消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱を考慮に入れ、消光防止性蛍光物質の粒径と蛍光量との関係をシミュレーションした結果を図８に示す。粒径が大きくなれば内包される蛍光分子数が増えるので、粒径が４００ｎｍまでは蛍光量は粒径の増加に伴い増大するが、粒径５００ｎｍを超えると急激に蛍光量が減少していくことが分かった。これは、粒径５００ｎｍを超えると上述の消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱が大きくなってくるためである。図８から、消光防止性蛍光物質の径の増加による蛍光量の増加と消光防止性蛍光物質による表面プラズモンの擾乱とを考慮し、蛍光量が最大ピークを示した粒径３００ｎｍの蛍光量から１桁程度以上蛍光量が落ちないようにするためには、消光防止性蛍光物質の粒径を７０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲とすることが望ましい。なお、上記においては、消光防止性蛍光物質が球状であるとみなして好ましい粒径範囲を求めたが、消光防止性蛍光物質は球状でなくてもよく、球状でない場合には、粒子の最大幅と最小幅との平均の長さを粒径とする球状で近似することができる。 FIG. 8 shows the result of simulating the relationship between the particle size of the quenching-inhibiting fluorescent substance and the amount of fluorescence in consideration of such disturbance of surface plasmons caused by the quenching-inhibiting fluorescent substance. As the particle size increases, the number of fluorescent molecules contained increases, so that the amount of fluorescence increases as the particle size increases up to 400 nm, but the amount of fluorescence rapidly decreases when the particle size exceeds 500 nm. I understood that. This is because when the particle diameter exceeds 500 nm, the disturbance of the surface plasmon due to the above-described quenching-preventing fluorescent material becomes large. From FIG. 8, taking into account the increase in the fluorescence amount due to the increase in the diameter of the quenching fluorescent substance and the disturbance of the surface plasmon due to the quenching fluorescent substance, the fluorescence quantity becomes 1 from the fluorescence quantity with a particle size of 300 nm showing the maximum peak. In order to prevent the fluorescence amount from dropping by an order of magnitude or more, it is desirable that the particle size of the quenching-proof fluorescent material be in the range of 70 nm to 900 nm. In the above description, the preferred particle size range was determined on the assumption that the quenching fluorescent substance is spherical. However, the quenching fluorescent substance may not be spherical, and if it is not spherical, the maximum width of the particle Can be approximated by a sphere having a particle diameter of the average length of the minimum width and the minimum width.
さらに、検出部上に１次抗体を固定するため２次元平面上で蛍光検出を行うとき、消光防止性蛍光物質の粒径の好ましい範囲を２次元充填密度の観点から以下のように導出した。 Furthermore, when fluorescence detection was performed on a two-dimensional plane in order to fix the primary antibody on the detection unit, a preferable range of the particle size of the quenching-resistant fluorescent material was derived as follows from the viewpoint of two-dimensional packing density.
一般的な診断用途において、検出限界の抗原濃度として１ｐＭ（ピコモーラ：×１０-12ｍｏｌ／ｌ）程度は必要であるといわれている。そこで、この１ｐＭ以下の抗原濃度を検出し、ダイナミックレンジ２桁、すなわち、１００ｐＭまで検出できる感度特性を目標値として消光防止性蛍光物質の好ましい粒径を導出した。 In general diagnostic applications, it is said that an antigen concentration of about 1 pM (picomolar: × 10 −12 mol / l) is necessary as a detection limit antigen. Therefore, the antigen concentration of 1 pM or less was detected, and a preferable particle size of the quenching-proof fluorescent substance was derived with a sensitivity characteristic that can be detected up to two digits in the dynamic range, that is, 100 pM as a target value.
１ｐＭの抗原濃度の検体について、アッセイ時の条件を検出領域の直径を１ｍｍ（面積３．１ｍｍ2）、流路を流下する検体量を３０μｌ（この検体量は一般的な簡易血液診断装置において、流路に流す前の前処理後、あるいはメンブレンフィルターによって血球分離された後の標準的な値である。）、抗原捕捉率を０．２％（一般的に抗原捕捉率は、０．２％〜２％程度であることから、ここでは、捕捉率が最低であった場合でも検出可能とするため、０．２％に設定した。）とすると、１．２×１０4個／ｍｍ2の抗原を検出領域に固定し検出できればよい。ここで、１．２×１０4個／ｍｍ2を目標固定量とする。一方、落射蛍光検出装置（ＬＡＳ−４０００、落射蛍光式、富士フイルム社製）を用いて測定した、前述の手順で作製した消光防止性蛍光物質（直径３００ｎｍ、励起波長５４２ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍ）の検量線データを図９に示す。ここでは中心波長５２０ｎｍの緑色ＬＥＤの励起光を用い、緑色蛍光用フィルタを通して蛍光を検出した結果を示している。このときの検出限界密度はエラーバーが蛍光検出装置のバックグラウンド値の３σ(σは標準偏差)と交わった１.０×１０3個／ｍｍ2であった。 For a sample having an antigen concentration of 1 pM, the diameter of the detection region is 1 mm (area: 3.1 mm 2 ), and the amount of sample flowing down the flow path is 30 μl (this sample amount is a general simple blood diagnostic device. Standard value after pretreatment before flowing into the flow path or after blood cell separation by membrane filter), antigen capture rate is 0.2% (generally antigen capture rate is 0.2%) Since it is about ˜2%, in order to enable detection even when the capture rate is the lowest, it is set to 0.2%.) Then, 1.2 × 10 4 pieces / mm 2 What is necessary is just to fix and detect an antigen in a detection region. Here, 1.2 × 10 4 pieces / mm 2 is set as the target fixed amount. On the other hand, an anti-quenching fluorescent substance (diameter: 300 nm, excitation wavelength: 542 nm, fluorescence wavelength: 612 nm) prepared by the above-described procedure, measured using an epifluorescence detection apparatus (LAS-4000, epifluorescence type, manufactured by Fuji Film) The calibration curve data is shown in FIG. Here, a result of detecting fluorescence through a green fluorescence filter using excitation light of a green LED having a center wavelength of 520 nm is shown. The detection limit density at this time was 1.0 × 10 3 pieces / mm 2 where the error bar intersected with 3σ (σ is the standard deviation) of the background value of the fluorescence detection apparatus.
この結果、φ３００ｎｍの消光防止性蛍光物質を用いると目標固定量（１．２×１０4個／ｍｍ2）の１２分の１の固定量で検出可能であるといえ、１ｐＭ以下の抗原濃度で抗原検出が可能となる高感度化が達成できていることが明らかとなった。また、この結果から、消光防止性蛍光物質の粒径を３００ｎｍより小さくしても１ｐＭの検体について測定可能であることが明らかである。同一密度で蛍光色素分子が内包されている場合、消光防止性蛍光物質１個あたりの蛍光発光量は消光防止性蛍光物質半径の三乗（ｒ3）に比例する。従って、φ１３０ｎｍの消光防止性蛍光物質を用いた場合、１個あたりの蛍光量はφ３００ｎｍの消光防止性蛍光物質の１／１２倍になるが１ｐＭの抗原濃度での検出が十分可能であるといえる。ここから、１ｐＭの抗原濃度での検出を行うための消光防止性蛍光物質粒径の下限値はφ１３０ｎｍ程度と定められる。なお、ここでは、消光防止性蛍光物質中の蛍光色素分子密度が略一定であると想定している。 As a result, it can be said that when a quenching fluorescent substance having a diameter of 300 nm is used, it can be detected with a fixed amount of 1/12 of the target fixed amount (1.2 × 10 4 pieces / mm 2 ), and at an antigen concentration of 1 pM or less. It became clear that high sensitivity enabling antigen detection was achieved. Also, from this result, it is clear that even when the particle size of the quenching-inhibiting fluorescent substance is smaller than 300 nm, it is possible to measure a 1 pM specimen. When fluorescent dye molecules are encapsulated at the same density, the amount of fluorescence emitted per quenching fluorescent substance is proportional to the cube of the quenching fluorescent substance radius (r 3 ). Therefore, when a quenching fluorescent substance having a diameter of 130 nm is used, the amount of fluorescence per one is 1/12 times that of the quenching fluorescent substance having a diameter of 300 nm, but detection with an antigen concentration of 1 pM is sufficiently possible. . From this, the lower limit of the quenching-resistant fluorescent substance particle diameter for detection at an antigen concentration of 1 pM is determined to be about φ130 nm. Here, it is assumed that the density of fluorescent dye molecules in the quenching-proof fluorescent material is substantially constant.
一方、消光防止性蛍光物質の粒径を大きくすると内包される蛍光色素分子量が増加するため蛍光信号強度も増大し検出光量の点で有利になるが、２次元平面上の一定面積に固定できる消光防止性蛍光物質の個数は立体障害の観点から固定量に限界がある。ダイナミックレンジ２桁として１００ｐＭを検出上限濃度とすると、固定量は１．２×１０6個／ｍｍ2となる。このとき、１つの抗原に対し１つの消光防止性蛍光物質が結合するとして最密充填となる大きさは、φ５００ｎｍである。このことから目標固定量を実現できる消光防止性蛍光物質の上限サイズはφ５００ｎｍである。 On the other hand, when the particle size of the quenching fluorescent substance is increased, the amount of fluorescent dye molecules contained is increased, and the fluorescence signal intensity is increased, which is advantageous in terms of the amount of detected light. However, the quenching that can be fixed to a fixed area on a two-dimensional plane. The number of preventive fluorescent substances is limited in the fixed amount from the viewpoint of steric hindrance. Assuming that the detection upper limit concentration is 100 pM with two digits in the dynamic range, the fixed amount is 1.2 × 10 6 pieces / mm 2 . At this time, the size of the closest packing as one quenching fluorescent substance binds to one antigen is φ500 nm. From this, the upper limit size of the quenching-preventing fluorescent material capable of realizing the target fixed amount is φ500 nm.
以上の観点から、消光防止性蛍光物質のさらに好ましい粒径は１３０ｎｍ〜５００ｎｍである。 From the above viewpoint, the more preferable particle diameter of the quenching-resistant fluorescent material is 130 nm to 500 nm.
透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ２などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、この蛍光色素１５からの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。消光防止性蛍光物質ＦＢは蛍光色素分子１５が透光材料１６で覆われているものであるため、金属膜１２上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜１２と蛍光色素分子１５との距離をある程度を離間させることができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。消光防止性蛍光物質ＦＢの透光材料１６に含まれる蛍光色素分子１５の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。 Specific examples of the light-transmitting material 16 include polystyrene and SiO 2 , but any material that can encapsulate the fluorescent dye molecule 15 and can transmit the fluorescence from the fluorescent dye 15 to be emitted to the outside. There is no particular limitation. Since the quenching fluorescent substance FB is such that the fluorescent dye molecules 15 are covered with the translucent material 16, the metal film 12 and the fluorescent dye can be formed without providing a metal quenching prevention film on the metal film 12. The distance from the molecule 15 can be separated to some extent, and the metal quenching can be effectively prevented by a very simple method, and the fluorescence signal can be detected stably. The number of fluorescent dye molecules 15 included in the light-transmitting material 16 of the quenching-resistant fluorescent substance FB may be one, but more preferably a plurality.
なお、光源２１と消光防止性蛍光物質ＦＢの好適な組合せの具体例としては以下の組合せが挙げられる。 In addition, the following combination is mentioned as a specific example of the suitable combination of the light source 21 and the quenching prevention fluorescent substance FB.
例えば、波長６５５ｎｍのＬＤ光源(品番ＤＬ−３１４７−１６０Ｆ、ＤＬ−３３５７−１６５、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製)に対して消光防止性蛍光物質(品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製)あるいは消光防止性蛍光物質（品番Ｆ８８０７、直径２００ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）、もしくは波長６３５ｎｍのＬＤ光源（品番ＤＬ−３１４８−０２３、ＤＬ−３０３８−０１１、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製）に対して、消光防止性蛍光物質（品番Ｆ８８１６、直径１０００ｎｍ、励起波長６２５ｎｍ、蛍光波長６４５ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の組合せがある。 For example, with respect to an LD light source having a wavelength of 655 nm (part numbers DL-3147-160F, DL-3357-165, manufactured by StockerYale), a quenching fluorescent substance (part number FC03F / 8196, diameter 510 nm, excitation wavelength 660 nm, fluorescence wavelength 690 nm, Bangs Laboratories) or quenching fluorescent substance (Part No. F8807, diameter 200 nm, excitation wavelength 660 nm, fluorescence wavelength 680 nm, Molecular Probes) or 635 nm LD light source (Part No. DL-3148-023, DL-3038-) 011, manufactured by StockerYale), a combination of a quenching-resistant fluorescent material (product number F8816, diameter 1000 nm, excitation wavelength 625 nm, fluorescence wavelength 645 nm, manufactured by Molecular Probes) is there.
消光防止性蛍光物質ＦＢへの２次抗体Ｂ２修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。 An example of a method for modifying the secondary antibody B2 to the quenching-resistant fluorescent substance FB and a method for producing a labeling solution will be described.
消光防止性蛍光物質溶液（品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクロナール抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより消光防止性蛍光物質ＦＢへの抗体の修飾がなされる。 A quenching fluorescent substance solution (product number FC03F / 8196, diameter 510 nm, excitation wavelength 660 nm, fluorescence wavelength 690 nm, Bangs Laboratories), 50 mM MES buffer, and 5.0 mg / mL anti-hCG monoclonal antibody (Anti-hCG 5008 SP) −5, Medix Biochemica) solution is added and stirred. This modifies the antibody to the quenching-resistant fluorescent substance FB.
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。 Next, a 400 mg / mL aqueous solution of WSC (Product No. 01-62-0011, Wako Pure Chemical Industries) is added and stirred at room temperature.
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。 Furthermore, after adding 2 mol / L Glycine aqueous solution and stirring, particle | grains are settled by centrifugation.
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により消光防止性蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、消光防止性蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。 Finally, the supernatant is removed, PBS (pH 7.4) is added, and the quenching-resistant fluorescent substance is redispersed with an ultrasonic washer. After further centrifugation, the supernatant is removed, and 500 μL of 1% BSA in PBS (pH 7.4) is added to redisperse the quenching-resistant fluorescent substance to obtain a labeling solution.
以下、上記に示した本実施形態による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。 Hereinafter, the operation of the fluorescence detection method and the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment described above will be described.
本実施形態においても、複数の金属微粒子Ｐを検出部の上に分散させて蛍光を光検出器３０により検出しているため、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。 Also in this embodiment, since the plurality of metal fine particles P are dispersed on the detection unit and the fluorescence is detected by the photodetector 30, the same effect as that of the first embodiment can be obtained.
さらに、本実施形態のように蛍光標識として消光防止性蛍光物質ＦＢを用いた場合には、金属微粒子Ｐに金属消光防止のための膜を設けなくても、金属微粒子Ｐと蛍光色素分子との距離をある程度を離間させることができる。第１および第２の実施形態において金属微粒子Ｐによる金属消光を防止するために必要であった誘電体層４１を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。 Furthermore, when the quenching-resistant fluorescent substance FB is used as a fluorescent label as in the present embodiment, the metal fine particles P and the fluorescent dye molecules can be formed without providing the metal fine particles P with a film for preventing metal quenching. The distance can be separated to some extent. In the first and second embodiments, it is possible to eliminate the trouble of forming the dielectric layer 41 necessary for preventing the metal quenching by the metal fine particles P, and the metal quenching can be effectively performed by a very simple method. In addition to preventing, the fluorescence signal can be detected stably.
また、本実施形態の場合には、一つの抗原Ａに対して多くの蛍光色素分子１５が標識されていることになる。一方、金属膜１２から距離があり電場増強場Ｅｗでは充分に励起されない蛍光色素分子１５は、金属微粒子Ｐによる電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓによって励起することができる。以上により本実施形態では、第１の実施形態と同様のホットスポット４０の効果に加え、より多くの蛍光色素分子１５を励起することができるので、より高感度の蛍光検出が可能となる。 In the present embodiment, a large number of fluorescent dye molecules 15 are labeled for one antigen A. On the other hand, the fluorescent dye molecules 15 that are far from the metal film 12 and are not sufficiently excited by the electric field enhancement field Ew can be excited by the scattered light Ls of the electric field enhancement field Ew by the metal fine particles P. As described above, in the present embodiment, in addition to the effect of the hot spot 40 similar to that in the first embodiment, more fluorescent dye molecules 15 can be excited, so that more sensitive fluorescence detection is possible.
＜設計変更＞
以上すべての実施形態において、金属微粒子Ｐを試料Ｓ中の溶媒に分散させて蛍光を検出する場合について説明してきたが、本発明は上記の場合に限られず、溶媒を乾燥させた後に蛍光を検出する方法としても本発明における課題を解決できる。
<Design changes>
In all the embodiments described above, the case where the metal fine particles P are dispersed in the solvent in the sample S to detect the fluorescence has been described. However, the present invention is not limited to the above case, and the fluorescence is detected after the solvent is dried. The problem in the present invention can also be solved as a method to do this.
溶媒を乾燥させる方法は特に制限されるものではなく、静置乾燥および減圧乾燥等を用いことができる。 The method for drying the solvent is not particularly limited, and stationary drying, drying under reduced pressure, and the like can be used.
この場合、金属微粒子Ｐを検出部の表面に凝集させることができるため、より金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間を密にすることができ、蛍光の増強度を向上させることが可能となる。また周囲の媒質が水（１．３３）から空気（１．０）となる、すなわち周囲の媒質の屈折率が下がることにより、プラズモンおよびホットスポットにおける電場増強が強くなるというメリットもある。 In this case, since the metal fine particles P can be agglomerated on the surface of the detection portion, the gap between the metal fine particles and the metal fine particles or the gap between the metal fine particles and the metal film can be made closer, and the fluorescence enhancement intensity can be increased. It becomes possible to improve. There is also an advantage that the electric field enhancement in plasmons and hot spots is increased by changing the surrounding medium from water (1.33) to air (1.0), that is, by reducing the refractive index of the surrounding medium.
１２ 金属膜
１２ａ 誘電体プリズムおよび金属膜の界面
１３ 試料保持部
１４ 不撓性膜
１５ 蛍光色素分子
１６ 透光材料
２１ 光源
２２ 誘電体プリズム
３０ 光検出器
４０ ホットスポット
４１ 誘電体層
９０ 試料中の不純物
Ｓ 試料
Ａ 抗原
Ｂ１ １次抗体
Ｂ２ ２次抗体
Ｆ・Ｆ’ 蛍光標識
ＦＢ 消光防止性蛍光物質
Ｌｉ 励起光
Ｌｓ 散乱光
Ｐ 金属微粒子
Ｅｗ エバネッセント波
ＮＬ 近接場光
ＳＰ 表面プラズモン
12 Metal film 12a Interface between dielectric prism and metal film 13 Sample holder 14 Inflexible film 15 Fluorescent dye molecule 16 Translucent material 21 Light source 22 Dielectric prism 30 Photo detector 40 Hot spot 41 Dielectric layer 90 Impurity in sample S Sample A Antigen B1 Primary antibody B2 Secondary antibody F / F 'Fluorescent labeling FB Quenching prevention fluorescent substance Li Excitation light Ls Scattered light P Fine metal particle Ew Evanescent wave NL Near-field light SP Surface plasmon
Claims (7)
前記試料を供給した後、蛍光標識を前記検出部に供給し、
前記被検出物質および前記蛍光標識を前記検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を前記検出部に供給し、
前記金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、前記金属微粒子間及び前記金属膜と前記金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して前記誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
前記被検出物質に付与された前記蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
該光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出することを特徴とする蛍光検出方法。 Supply a sample containing a substance to be detected to a detection unit containing a metal film provided on one surface of a dielectric prism,
After supplying the sample, a fluorescent label is supplied to the detection unit,
After the step of fixing the substance to be detected and the fluorescent label to the detection unit is finished, supply a plurality of metal fine particles to the detection unit,
The dielectric prism so as to generate an electric field enhancement field due to surface plasmons on the upper surface of the metal film and to generate an electric field enhancement field due to surface plasmons between the metal fine particles and between the metal film and the metal fine particles. And irradiating the interface between the metal film and the excitation light through the dielectric prism,
Fluorescence from the fluorescent label attached to the substance to be detected is detected by a photodetector,
A fluorescence detection method, comprising: detecting an abundance of the substance to be detected based on a fluorescence amount detected by the photodetector.
前記被検出物質および前記蛍光標識を前記検出部に固着させる工程が終わった後、複数の金属微粒子を前記検出部に供給し、
前記金属膜の上面に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめ、かつ、前記金属微粒子間及び前記金属膜と前記金属微粒子との間に表面プラズモンによる電場増強場を発生せしめるように、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して前記誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
前記被検出物質に付与された前記蛍光標識からの蛍光を光検出器により検出し、
該光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出することを特徴とする蛍光検出方法。 Supplying a sample containing a substance to be detected and a fluorescent label to a detection unit including a metal film provided on one surface of a dielectric prism;
After the step of fixing the substance to be detected and the fluorescent label to the detection unit is finished, supply a plurality of metal fine particles to the detection unit,
The dielectric prism so as to generate an electric field enhancement field due to surface plasmons on the upper surface of the metal film and to generate an electric field enhancement field due to surface plasmons between the metal fine particles and between the metal film and the metal fine particles. And irradiating the interface between the metal film and the excitation light through the dielectric prism,
Fluorescence from the fluorescent label attached to the substance to be detected is detected by a photodetector,
A fluorescence detection method, comprising: detecting an abundance of the substance to be detected based on a fluorescence amount detected by the photodetector.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013211774A JP5655125B2 (en) | 2013-10-09 | 2013-10-09 | Fluorescence detection method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013211774A JP5655125B2 (en) | 2013-10-09 | 2013-10-09 | Fluorescence detection method |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008126685A Division JP2009276162A (en) | 2008-05-14 | 2008-05-14 | Fluorescence detecting method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014006266A JP2014006266A (en) | 2014-01-16 |
| JP5655125B2 true JP5655125B2 (en) | 2015-01-14 |
Family
ID=50104075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013211774A Active JP5655125B2 (en) | 2013-10-09 | 2013-10-09 | Fluorescence detection method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5655125B2 (en) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7588827B2 (en) * | 2003-08-18 | 2009-09-15 | Emory University | Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)-active composite nanoparticles, methods of fabrication thereof, and methods of use thereof |
| DE112004001972T5 (en) * | 2003-10-17 | 2006-08-17 | Intel Corporation, Santa Clara | A method and apparatus for detecting small numbers of molecules using surface enhanced coherent anti-Stokes Raman spectroscopy |
| US7906344B2 (en) * | 2004-03-31 | 2011-03-15 | Omron Corporation | Localized plasmon resonance sensor and examining device |
| JP2010503868A (en) * | 2006-09-18 | 2010-02-04 | アプライド バイオシステムズ， エルエルシー | Method, system and apparatus for light concentrating mechanism |
| JP2008102117A (en) * | 2006-09-21 | 2008-05-01 | Fujifilm Corp | Surface plasmon enhanced fluorescence sensor and fluorescence detecting method |
-
2013
- 2013-10-09 JP JP2013211774A patent/JP5655125B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014006266A (en) | 2014-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6379149B2 (en) | Sensitive immunoassay using coated nanoparticles | |
| JP2009276162A (en) | Fluorescence detecting method | |
| JP4851367B2 (en) | Local plasmon enhanced fluorescence sensor | |
| JP5301894B2 (en) | Detection method | |
| US8456158B2 (en) | Detecting method and dielectric particles containing magnetic material employed in the detecting method | |
| US20230213507A1 (en) | Optical probe for bio-sensor, optical bio-sensor including optical probe, and method for manufacturing optical probe for bio-sensor | |
| US8886464B2 (en) | Microwave-accelerated metal-enhanced detection method | |
| JP5190945B2 (en) | Detection method, detection apparatus, detection sample cell, and detection kit | |
| Yan et al. | High-throughput single-particle analysis of metal-enhanced fluorescence in free solution using Ag@ SiO2 core–shell nanoparticles | |
| JP5160985B2 (en) | Detection method, detection apparatus, detection sample cell, and detection kit | |
| JP5450993B2 (en) | Detection method, detection sample cell and detection kit | |
| US20050053974A1 (en) | Apparatus and methods for surface plasmon-coupled directional emission | |
| JP5428322B2 (en) | Assay method using plasmon excitation sensor | |
| JPWO2010134592A1 (en) | Plasmon excitation sensor and assay method used for measurement method by SPFS-LPFS system | |
| JP2009236709A (en) | Surface plasmon sensing method and surface plasmon sensing device | |
| JP2009258034A (en) | Method and apparatus for detecting radiation light from surface plasmon, sample cell for detecting radiation light from surface plasmon and kit | |
| JP2009080011A (en) | Fluorescence detection method | |
| WO2012132384A1 (en) | Localised plasmon enhanced-fluorescence particle, carrier for detection of localised plasmon enhanced-fluorescence particle, device for detection of localised plasmon enhanced-fluorescence particle, and fluorescence detection method | |
| Arcas et al. | Localized surface plasmon resonance-based biosensor on gold nanoparticles for Taenia solium detection | |
| JP2009128136A (en) | Fluorescence detection method | |
| JP5655125B2 (en) | Fluorescence detection method | |
| JP5754309B2 (en) | Quantitative analysis method for measuring fluorescence using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy, and quantitative analysis kit and analyte dissociation inhibitor used therefor | |
| JP2012047621A (en) | Plasmon excitation sensor and assay method using the same | |
| JP2009515181A (en) | Nanoparticle detection method and application field thereof | |
| Stranik | Plasmonic enhancement of fluorescence for biomedical diagnostics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131101 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140521 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140527 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140724 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141111 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141121 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5655125 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |