JP5502275B2 - Thermal reaction device and methods of using thermal reaction device - Google Patents

Thermal reaction device and methods of using thermal reaction device Download PDF

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Description

(優先権主張) (Priority claim)
本願は、以下の出願の各々に対する優先権を主張する: This application claims priority to each of the following applications:
2005年2月14日に出願された米国特許出願第11/058,106号;2005年1月25日に出願された米国特許出願第11/043,895号;2004年6月23日に出願された米国特許出願第10/876,046号;および2004年5月2日に出願された米国特許出願第10/837,885号。 Filed February 14, 2005 U.S. Patent Application Serial No. 11 / 058,106; filed January 25, 2005 U.S. Patent Application Serial No. 11 / 043,895; filed June 23, 2004 U.S. Patent application No. 10 / 876,046; and U.S. Patent application No. 10 / 837,885, filed May 2, 2004. これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。 Each of which in its entirety for all purposes which are incorporated by reference.

(関連出願への相互参照) CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS
本願はまた、2004年4月5日に出願された米国特許出願第10/818,642号;2003年4月3日に出願された米国仮特許出願第60/460,634号;2004年4月5日に出願された米国特許出願第10/819,088号;2004年4月5日に出願された米国特許出願第10/818,642号;2002年11月27日に出願された米国特許出願第10 /3 06,798号;2002年6月24日に出願された米国仮特許出願第60/391,529号;および米国仮特許出願第60/335,292号にも関連する。 Application also April 5, 2004 U.S. Patent Application Serial No. 10 / 818,642, filed; filed April 3, 2003 U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 460,634; 2004 4 filed on 5 days a month U.S. Patent application No. 10 / 819,088; filed April 5, 2004 U.S. Patent application Serial No. 10 / 818,642; filed November 27, 2002 US Patent application No. 10/3 No. 06,798; also relates to and U.S. provisional Patent application No. 60 / 335,292; which filed US provisional Patent application No. 60 / 391,529 on June 24, 2002. これらの各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。 Each of which in its entirety for all purposes it is incorporated by reference herein.

(背景) (background)
近年、種々の化学的および生化学的な分析および合成(いずれも調製的用途および分析的用途のため)を実施する微小流体システムを開発および製造するための協調した努力がなされている。 Recently, various chemical and biochemical analysis and synthesis concerted efforts to develop and manufacture microfluidic systems to implement (for both preparation applications and analytical applications) have been made. マクロ規模で実施される分析および合成に対して微細化によって現実化され得る顕著な利益から、このようなデバイスを作製するという目標が生じている。 From significant benefit that may be realized by miniaturization relative analysis and synthesis is carried out in a macro scale, the target has occurred that making such devices. このような利益としては、分析または合成を行うために利用されるデバイスのために必要とされる実質的な時間、経費および空間の減少が挙げられる。 Examples of such benefits, substantial time is required for the devices utilized to conduct the analysis or synthesis, include reduction in cost and space. さらに、微小流体デバイスは、自動システムと一緒に使用するのに適合しており、それによってさらなる経費削減および人の関与の減少による操作者の誤差の減少というさらなる利益を提供するという潜在性を有する。 Further, the microfluidic device is adapted for use with the automated system, thereby having the potential of providing additional benefits of reduced error of the operator due to further reduction in cost reduction and human involvement . 微小流体デバイスは種々の用途における使用が提唱されており、その用途としては、例えば、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィーおよび細胞分離が挙げられる。 Microfluidic devices are can be proposed for use in various applications, as the use thereof, for example, capillary electrophoresis, and gas chromatography and cell separations.

しかしながら、これらの利益の実現は、これまで製造されてきた微小流体デバイスに関連する種々の複雑さのために、しばしば挫折している。 However, realization of these benefits are useful for a variety of complexity associated with microfluidic devices have been manufactured so far, are often frustrated. 例えば、現在の微小流体デバイスの多くは、シリカベースの基板から製造されているが、これらの材料は、機械加工が困難かつ複雑であり、そしてそのような材料から作製されたデバイスは脆弱である。 For example, many of the current microfluidic devices have been fabricated from silica based substrates, these materials, machining is difficult and complicated, and devices made from such materials are fragile . さらに、多くの現存する微小流体デバイスを通しての流体の移送には、そのデバイスを通して制御された様式で流体を移送するための複雑な電場の制御が必要とされる。 Furthermore, the transfer of fluid through the microfluidic device of many existing, control of complex electric field for transferring fluid in a controlled manner through the device is required.

従って、微小流体デバイスを用いて達成され得る前述の利益と、それに対する現存するデバイスの現在の制限との観点から、種々の化学的および生化学的分析を実施するのに使用するために設計された微小流体デバイスに対する必要性が存在する。 Therefore, the design and the aforementioned benefits may be achieved using a microfluidic device, in view of the current limitations of existing devices for it, for use in carrying out the various chemical and biochemical analyzes there is a need for microfluidic devices. 現代生化学におけるその重要性のため、他のタイプの分析における使用のための十分な汎用性も同様に有しながら、種々の核酸増幅反応を行うのに用いられ得るデバイスに対する必要性が特に存在する。 Because of its importance in modern biochemistry, while having similarly versatile enough for use in other types of analysis, in particular there is a need for a device that may be used to perform various nucleic acid amplification reactions to.

核酸増幅を行う能力を備えたデバイスは、多様な有用性を有する。 Devices with the ability to perform nucleic acid amplification, has a variety of utilities. 例えば、そのようなデバイスは、目的の特定の標的核酸がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかのいずれであるかを決定するための分析ツールとして使用され得る。 For example, such a device can be used as an analytical tool to determine which one of or not either or present a particular target nucleic acid of interest is present in the sample. 従って、このデバイスは、特定の病原体(例えば、ウイルス、細菌または菌類)の存在について、および同定目的(例えば、実父確定および法医学的用途)のために試験するのに使用され得る。 Therefore, the device specific pathogen (e.g., virus, bacteria or fungi) for the presence of, and identification purposes (e.g., paternity and forensic applications) may be used to test for. そのようなデバイスはまた、以前に特定の疾患または遺伝病と関連付けられている具体的な核酸の検出または特徴付けにも使用され得る。 Such devices can also be used in the detection or characterization of specific nucleic acids previously associated with a particular disease or genetic diseases. 分析用ツールとして使用される場合、このデバイスはまた、遺伝型決定分析および遺伝子発現分析(例えば、ディファレンシャル遺伝子発現研究)を行うのに使用され得る。 When used as analytical tools, the device can also be used to perform genotyping analysis and gene expression analysis (e.g., differential gene expression studies). あるいは、このデバイスは、さらなる分析(例えば、増幅産物の配列決定、細胞型決定、DNAフィンガープリントなど)のために十分な核酸を増幅するために、調製的な様式で使用され得る。 Alternatively, the device further analysis (e.g., sequencing of the amplified product, cell typing, DNA fingerprinting, etc.) in order to amplify sufficient nucleic acid for, can be used in the preparation manner. 増幅された産物はまた、種々の遺伝子工学的用途(例えば、所望のタンパク質産物の産生のための細胞の形質転換に使用され得るベクターへの挿入)においても使用され得る。 The amplified products can also various genetic engineering applications (e.g., insertion into a vector may be used to transform cells for the production of the desired protein product) it may also be used in.

(要旨) (Summary)
熱サイクリング反応(例えば、核酸増幅反応)を行うために使用され得るデバイスを含む、微小流体分析を行うための種々のデバイスおよび方法が本明細書中において提供される。 Thermal cycling reactions (e.g., nucleic acid amplification reactions) include devices that can be used to perform a variety of devices and methods for performing microfluidic analysis is provided herein. このデバイスは、エラストマー構成要素を備える点で従来の微小流体デバイスとは異なり、いくつかの例では、このデバイスのほとんどまたは全てがエラストマー材料から構成される。 This device, unlike the conventional microfluidic devices in that it comprises an elastomeric component, in some instances, comprised most or all of the devices of an elastomeric material.

特定のデバイスが、そのデバイスを通る溶液の流れを制御するための1つ以上のエラストマーバルブを備えるデバイスを用いた熱サイクリング反応(例えば、PCR)を行うように設計される。 Particular device, thermal cycling reaction using a device comprising one or more elastomeric valves to control the flow of solution through the device (e.g., PCR) is designed to perform. 従って、この設計のデバイスを用いて増幅反応を行うための方法もまた、提供される。 Therefore, a method for performing an amplification reaction using a device of this design are also provided.

いくつかのデバイスは、反応部位として機能する領域を備えるブラインド(blind)フローチャネルを備える。 Some devices include a blind (blind) flow channels with a region functioning as a reactive site. 特定のそのようなデバイスは、エラストマー材料内に形成されたフローチャネル、およびそのフローチャネルと流体連通している複数のブラインドフローチャネルを備え、各ブラインドフローチャネルの領域が反応部位を規定している。 Certain such devices, the flow channel formed in an elastomeric material, and includes a plurality of blind flow channels in which the flow in fluid channel in fluid communication with a region of each blind flow channel defining a reaction site . このデバイスはまた、このブラインドフローチャネルの各々に重なり、そして交差している1つ以上の制御チャネルを備え得、ここでエラストマー膜が、各交差部においてこのブラインドフローチャネルからその1つ以上の制御チャネルを分離している。 The device also overlaps each of the blind flow channels, and comprise a one or more control channels intersect, wherein the elastomeric film, the one or more control from the blind flow channels at each intersection separating the channel. このようなデバイスにおけるこのエラストマー膜は、駆動力に応答して、そのブラインドフローチャネル内に湾曲するかまたはそのブラインドフローチャネルから離脱するように配置される。 The elastomeric membrane in such devices, in response to a drive force, is arranged so as to leave from or at the blind flow channel is curved in its blind flow channel. このデバイスは、エラストマー材料内に形成され、フローチャネルおよび/または1つ以上の反応部位に重なる複数の保護チャネルを、必要に応じてさらに備えることができる。 The device is formed in the elastomeric material, the flow channel and / or one or more of a plurality of guard channels overlapping the reaction site, can be further provided as needed. この保護チャネルは、デバイスのフローチャネルおよび反応部位からの蒸発を減少させるために、その中を流体を通すように設計される。 The protection channel, in order to reduce evaporation from the flow channels and reaction sites of the device, is designed therein to pass fluid. さらに、このデバイスは必要に応じて、反応部位の各々に配置される1つ以上の試薬を備える。 In addition, the device optionally comprises one or more reagents are arranged in each of the reaction sites.

特定のデバイスにおいて、上記フローチャネルは、複数のフローチャネルのうちの1つであり、このフローチャネルの各々は、それから分岐する多数のブラインドフローチャネルと流体連通している。 In certain devices, the flow channel is one of a plurality of flow channels, each of the flow channel is then communicates multiple blind flow channels in fluid communication with branches. この設計のデバイスでは、いくつかの例では、複数のフローチャネルが互いに相互連結され、その結果流体が単一の注入口を介して各々の反応部位内に導入され得る。 In the design of the device, in some examples, a plurality of flow channels are interconnected to each other, so that fluid can be introduced into the reaction sites via respective single inlet. しかしながら他のデバイスにおいては、複数のフローチャネルは互いに分離され、その結果1つのフローチャネル内に導入される流体は別のフローチャネルに流れることはできず、そして各フローチャネルは一端または両端に注入口を備え、この流入口に流体が導入され得る。 However, in other devices, a plurality of flow channels are separated from one another, note the result fluid introduced into one flow channel can not flow to another flow channel, and each flow channel at one or both ends an inlet, fluid can be introduced into the inlet port.

他のデバイスは、少なくとも50部位/cm の密度を有する反応部位のアレイを備え、この反応部位は代表的にはエラストマー材料中に形成される。 Other device comprises an array of reaction sites having a density of at least 50 sites / cm 2, the reaction site is typically formed in the elastomeric material. 他のデバイスはさらにより高い密度(例えば、少なくとも250部位/cm 、500部位/cm または1000部位/cm )を有する。 Other device further has a higher density (e.g., at least 250 sites / cm 2, 500 sites / cm 2 or 1000 sites / cm 2).

さらに他のデバイスは、エラストマー基板中に形成された反応部位を備え、そこで反応を行うための試薬は非共有結合的に固定される。 Still another device comprises a reaction site formed elastomer substrate, where the reagents for performing the reaction is non-covalently immobilized. この試薬は、本質的に任意のタイプの反応を行うための1つ以上の試薬であり得る。 The reagent can be one or more reagents for conducting essentially any type of reaction. いくつかのデバイスにおける試薬は、核酸増幅反応を行うための1つの試薬を包含する。 Reagent in some devices includes one reagents for performing a nucleic acid amplification reaction. 従って、いくつかのデバイスにおいて、この試薬は、プライマー、ポリメラーゼおよび1つ以上のヌクレオチドを含む。 Thus, in some devices, the reagent comprises a primer, polymerase and one or more nucleotides. 他のデバイスでは、この試薬は核酸の鋳型である。 In other devices, the reagent is a nucleic acid template.

種々のマトリクスベースまたはアレイベースのデバイスもまた提供される。 Various matrix-based or array-based devices are also provided. 特定のこれらのデバイスは、以下: Certain of these devices, the following:
(i)エラストマー基板に形成された第一の複数のフローチャネル、 (I) a first plurality of flow channels formed in an elastomeric substrate,
(ii)第一の複数のフローチャネルと交差してアレイの反応部位を規定する、エラストマー基板に形成された第二の複数のフローチャネル、 (Ii) intersects the first plurality of flow channels defining a reaction site array, a second plurality of flow channels formed in an elastomeric substrate,
(iii)第一および第二の複数のフローチャネル内に配置された複数の分離バルブであって、このバルブが駆動されて各反応部位内の溶液を他の反応部位における溶液から分離することができる、分離バルブ、ならびに (iv)1つ以上のフローチャネルおよび/または1つ以上の反応部位に重なり、反応部位からの溶液の蒸発を防ぐ、複数の保護チャネル、 And (iii) a plurality of isolation valve disposed in the first and second in the plurality of flow channels, is possible to separate solutions of each reaction site the valve is driven from solution in the other reaction sites possible, isolation valve, and (iv) overlap one or more flow channels and / or one or more reactive sites, prevent evaporation of the solution from the reaction site, a plurality of guard channels,
を備える。 Equipped with a.

上述のデバイスは、温度制御が関与する反応(例えば、核酸分析の熱サイクリング)を含む多数の異なるタイプの反応を行うのに使用され得る。 The devices described above, the reaction temperature control is involved (e.g., thermal cycling nucleic acid analysis) may be used to perform a number of different types of reactions involving. 特定のブラインドチャネルタイプのデバイスを用いて行われる方法は、微小流体デバイスを提供する工程を包含する。 Method performed by using the device for a particular blind channel type, comprises providing a microfluidic device. このデバイスは、エラストマー材料内に形成されたフローチャネル;およびこのフローチャネルと流体連通している複数のブラインドフローチャネルを備え、各ブラインドフローチャネルの末端が反応部位を規定している。 This device, the flow channels formed in the elastomeric material; and provided with a plurality of blind flow channels in fluid the flow channel in fluid communication with the end of each blind flow channel defining a reaction site. 少なくとも1つの試薬が各反応部位に導入され、次いで反応が1つ以上のこの反応部位において検出される。 At least one reagent is introduced into each reaction site, then the reaction is detected at one or more of the reaction sites. この方法は、必要に応じて、この反応部位内の少なくとも1つの試薬を加熱する工程を包含する。 This method optionally includes the step of heating at least one reagent within the reaction site. 従って、例えば方法は、核酸増幅反応のための構成要素を導入する工程、および次いでその構成要素を熱サイクリングして増幅産物を形成する工程を包含する。 Thus, for example, the method includes the steps of introducing the components for nucleic acid amplification reaction, and then the step of the component to form an amplified product by thermal cycling.

他の方法は、1つ以上の反応部位を備える微小流体デバイスを提供する工程を包含し、各反応部位は、エラストマー基板上に非共有結合的に配置された、分析を行うための第一の試薬を含む。 Other methods may include one or more include the step of providing a microfluidic device comprising a reaction site, each reaction site was noncovalently disposed elastomeric substrate, a first for the analysis of including the reagent. 次いで第二の試薬が1つ以上の反応部位に導入され、それによって第一の試薬および第二の試薬が混合されて反応混合物を形成する。 Then a second reagent is introduced into one or more reaction sites, whereby the first reagent and the second reagent are mixed to form a reaction mixture. 1つ以上の反応部位における第一の試薬と第二の試薬との間の反応が、続いて検出される。 The reaction between the first reagent and the second reagent in one or more reaction sites, is subsequently detected.

さらに他の方法は、微小流体デバイスを提供する工程を包含し、この微小流体デバイスは、基板内に形成された反応部位のアレイを備え、少なくとも50部位/cm の密度を有する。 Still other methods involve providing a microfluidic device, the microfluidic device comprises an array of reaction sites formed within a substrate, having a density of at least 50 sites / cm 2. 少なくとも1つの試薬が、各反応部位に導入される。 At least one reagent is introduced into each reaction site. 次いで少なくとも1つの反応部位における反応が検出される。 Then the reaction in at least one reaction site is detected.

なお他の方法は、微小流体デバイスを提供する工程を包含し、この微小流体デバイスは、エラストマー基板中に形成された少なくとも1つの反応部位、および同様にそのエラストマー基板中に形成された複数の保護チャネルを備える。 Still other methods involve providing a microfluidic device, the microfluidic device comprises at least one reaction site formed elastomer substrate, and also a plurality of protection formed on the elastomer substrate It provided with a channel. 少なくとも1つの試薬が各反応部位に導入され、次いでその反応部位内で加熱される。 At least one reagent is introduced into each reaction site and then heated within the reaction sites. 流体が、加熱の前またはその間に保護チャネル内を流れ、少なくとも1つの反応部位からの蒸発を減少させる。 Fluid flow through the protection in the channel prior to the heating or during reduce evaporation from the at least one reaction site. その少なくとも1つの反応部位内での反応が、続いて検出される。 At least one reaction in the reaction site is subsequently detected.

デバイスからの流体の蒸発を減少させるように設計されたさらなるデバイスもまた、提供される。 Additional devices designed to reduce evaporation of fluid from the device are also provided. 一般的に、そのようなデバイスは、エラストマー基板に形成された微小流体ネットワークの一部である空洞;およびその空洞に重なり、かつその空洞からエラストマー膜で分離された複数の保護チャネルを備える。 In general, such a device, the cavity is part of the formed microfluidic network in an elastomeric substrate; overlap and cavities thereof, and a plurality of guard channels separated by elastomeric membrane from the cavity. そのようなデバイスにおける保護チャネルは、(i)その中を溶液が流れるのを可能にし、かつ(ii)その結果保護チャネルへの駆動力を加える際にその膜が湾曲することにより、その空洞に流入、流出またはその中を通るときに実質的な減少がない、ようなサイズである。 The protection channel in such a device, by bending its film in adding a driving force in the (i) to allow flow through the solution, and (ii) a result protection channel, to the cavity influx, there is no substantial reduction as it passes through the outlet or therein, is sized so. 他のそのようなデバイスは、(i)1つ以上のフローチャネルおよび/または1つ以上の反応部位;ならびに(ii)微小流体システムに重なり、そこからエラストマーによって分離される複数の保護チャネルを備え、ここで保護チャネル間の間隙は1μmと1mmとの間である。 Other such devices, (i) one or more flow channels and / or one or more reactive sites; includes a plurality of guard channels separated by overlap and (ii) a microfluidic system, the elastomer from which , the gap between where the protection channel is between 1μm and 1 mm. 他のデバイスにおいて、その間隙は、5μmと500μmとの間であり、他のデバイスでは10μmと100μmとの間であり、さらに他のデバイスでは40μmと75μmとの間である。 In other devices, the gap is between 5μm and 500 [mu] m, in other devices is between 10μm and 100 [mu] m, in yet another device is between 40μm and 75 [mu] m.

特定の微小流体デバイスの反応部位において核酸分析を行うための組成物もまた、提供される。 Compositions for performing nucleic acid analysis in a reaction site of a particular microfluidic device is also provided. 特定のそのような組成物としては、以下の1つ以上が挙げられる:エラストマー材料上のタンパク質結合部位を遮断する因子および界面活性剤。 Particular of such compositions include one or more of the following: factors and surfactant to block protein binding sites on the elastomeric material. この遮断因子は、代表的には、タンパク質(例えば、ゼラチンまたはウシ血清アルブミン(BSA)のようなアルブミン)からなる群より選択される。 The blocking agent is typically a protein (e.g., albumin such as gelatin or bovine serum albumin (BSA)) is selected from the group consisting of. この界面活性剤は、例えばSDSまたはTritonであり得る。 The surfactant may be, for example, SDS or Triton.

(詳細な説明) (Detailed description)
(I.定義) (I. Definition)
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the meanings which the present invention is commonly understood by one of ordinary skill in the pertains. 以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する:Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版、1994);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編、1988);THE GLOSSARY OF GENETICS、第5版、R. The following references, a general definition of many of the terms used in the present invention to provide those of ordinary skill in the art: Singleton et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (second edition, 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); tHE GLOSSARY OF GENETICS, 5th edition, R. Riegerら(編)、Springer Verlag(1991);およびHale Rieger et al. (Eds.), Springer Verlag (1991); and Hale
& Marham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。 & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). 本明細書中で使用される場合、以下の用語は、そうでないと明記されない限り、それらに属する意味を有する。 As used herein, the following terms, unless otherwise indicated to the contrary, have the meanings that belong to them.

「フローチャネル」とは、一般に、それを通って溶液が流れ得る流路をいう。 The "flow channel" refers generally to a channel solution can flow through it.

用語「バルブ」とは、他に示されない限り、フローチャネルおよび制御チャネルが交差し、そしてエラストマー膜で分離される構成をいう。 The term "valve", unless indicated otherwise, the flow and control channels intersect, and refers to a structure that is separated by the elastomer membrane. このエラストマー膜は、駆動力に応答してフローチャネルに湾曲またはフローチャネルから離脱し得る。 The elastomeric film may be detached from the curved or flow channels in the flow channel in response to the driving force.

「ブラインドチャネル」または「行き止まりチャネル(dead−end chanel)」とは、入口を有しているが別の出口を有していないフローチャネルをいう。 The "blind channel" or "dead-end channel (dead-end chanel)", has the inlet means flow channels that do not have a separate outlet. 従って、ブラインドチャネル内へのおよびブラインドチャネルからの溶液の流れは、同じ場所で起こる。 Thus, the flow of the solution from and blind channel into the blind channel occurs at the same location. 1つ以上のブラインドチャネルを満たすプロセスは、ときに、単に「ブラインド注入」といわれる。 Process satisfy one or more of the blind channel, when the, simply referred to as "blind injection".

「分離された反応部位」とは、一般的に、デバイス上に存在する他の反応部位と流体連通していない反応部位をいう。 By "isolated reaction site" generally refers to a reaction site that is not passed through other reaction sites in fluid communication present on the device. ブラインドチャネルに関して使用される場合、この分離された反応部位は、ブラインドチャネルに連結されたバルブによって遮断され得るブラインドチャネルの端部における領域である。 When used in reference to a blind channel, the isolated reaction site is the region at the end of the blind channel that can be blocked by concatenated valve blind channel.

「孔」とは、デバイスの外部ポートと1つ以上のフローチャネルとの間に体のアクセスを提供するためにエラストマーデバイス内に形成されたチャネルをいう。 The "pore" refers to a channel formed in an elastomeric device to provide a flow body access between the external ports and one or more flow channels of the device. 従って、孔は、例えばサンプル流入口および流出口として機能し得る。 Therefore, holes may function as for example, a sample inlet and outlet.

用語「エラストマー」および「エラストマーの」は、当該分野で使用される一般的な意味を有する。 The term "elastomer" and "elastomeric" has the general meaning used in the art. 従って、例えばAllcockら(Contemporary Polymer Chemistry、第2版)は、そのガラス遷移温度と液化温度との間の温度にて存在するポリマーとして一般にエラストマーを説明している。 Thus, for example, Allcock et al. (Contemporary Polymer Chemistry, 2nd Ed.) Describes a generally elastomeric as polymer present at a temperature between its glass transition temperature and liquefaction temperature. エラストマー材料は、伸縮特性を示す。 Elastomeric materials exhibit stretch properties. なぜなら、そのポリマー鎖は容易に力に応答して、その力の非存在下では骨格鎖が元の形状をとるために反動し、骨格鎖がまっすぐに戻るのを可能にするねじりの動きを起こすからである。 Because the polymer chains in response to readily force backbone in the absence of the force is to recoil to take its original shape, causing the movement of twisting to allow the backbone to return straight it is from. 一般的に、力が加えられた場合はエラストマーは変形するが、次いでその力が取り除かれたときに、その元の形状に戻る。 In general, if a force is applied elastomer is deformed, then when the force is removed, returns to its original shape. エラストマー材料によって示されるこの伸縮性は、Youngモジュラスによって特徴付けられ得る。 This stretch exhibited by elastomeric materials may be characterized by Young modulus. 本明細書中で開示される、上記微小流体デバイスにおいて使用されるエラストマー材料は、代表的に、約1Pa〜1TPaの間の、他の例においては約10Pa〜100GPaの間の、なお他の例では約20Pa〜1GPaの間の、なお他の例では約50Pa〜10MPaの間の、そして特定の例では約100Pa〜1MPaの間のYoungモジュラスを有する。 Disclosed herein, elastomeric materials used in the microfluidic device is typically between about 1Pa~1TPa, between about 10Pa~100GPa in another example, still other examples in between about 20Pa~1GPa, still other examples of between about 50Pa~10MPa, and in certain instances having a Young modulus of between about 100Pa~1MPa. これらの範囲外のYoungモジュラスを有するエラストマー材料もまた、特定の用途の必要性に依存して使用され得る。 The elastomeric material having a outside these ranges Young modulus may also be used depending on the needs of a particular application.

本明細書中に記載される微小流体デバイスのいくつかは、GE RTV 615(処方物)、ビニルシラン架橋(タイプ)シリコンエラストマー(ファミリー)のようなエラストマーポリマーから製造される。 Some of the microfluidic devices described herein, GE RTV 615 (formulation) is prepared from an elastomeric polymer such as vinylsilane crosslinked (type) silicon elastomer (family). しかしながら、本発明の微小流体システムは、この1つの処方物、タイプまたはこのファミリーのポリマーには限定されず、むしろほぼいずれのエラストマーポリマーが適している。 However, the microfluidic system of the present invention, this one formulation, not limited to the type or polymers of this family, but rather suitable almost any elastomeric polymer. 非常に多様なポリマー化学物質、前駆体、合成方法、反応条件および潜在的な添加剤を考慮すると、一体型のエラストマー微小バルブおよびポンプを作製するのに使用され得る多数の可能なエラストマーシステムが存在する。 Wide variety of polymeric chemicals, precursors, synthetic methods, taking into account the reaction conditions and potential additives, there are a number of possible elastomer systems that could be used to make elastomeric microvalves and pumps integrated to. 材料の選択は、代表的に、行われる用途のために必要とされる具体的な材料の特性(例えば、溶媒耐性、剛性、ガス透過性、および/または温度安定性)に依存する。 Selection of materials typically depends on the characteristics of the specific material required for the application to be performed (e.g., solvent resistance, stiffness, gas permeability, and / or temperature stability). 本明細書中で開示される微小流体デバイスの構成成分の製造において使用され得るエラストマー材料のタイプに関するさらなる詳細は、Ungerら(2000)Science 288:113−116、ならびにPCT公報WO02/43615およびWO01/01025に記載されている。 Further details regarding the type of elastomeric materials that may be used in the manufacture of the components of the infinitesimal fluid device that is disclosed herein, Unger et al. (2000) Science 288: 113-116, and PCT publication WO02 / 43,615 and WO01 / 01025 which is incorporated herein by reference. これらは、その全体が全ての目的のために本明細書中に援用される。 These are incorporated in their entirety herein for all purposes.

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では、任意の長さのヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない)のポリマー形態を包含するように使用される。 The term "nucleic acid", "polynucleotide" and "oligonucleotide", as used herein, (including but ribonucleotides or deoxyribonucleotides, but not limited to) any length of nucleotides include a polymeric form of It is used to.
これらの用語間に意図される長さの差異は存在しない。 The length difference is intended between these terms is not present. さらに、これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。 Further, these terms refer only to the primary structure of the molecule. 従って、特定の実施形態において、これらの用語は、三本鎖DNA、二本鎖DNAおよび一本鎖DNAならびに三本鎖RNA、二本鎖RNAおよび一本鎖RNAを包含し得る。 Thus, in certain embodiments, these terms, triple-stranded DNA, double-stranded DNA and single-stranded DNA, as well as triple-stranded RNA, can include double-stranded RNA and single-stranded RNA. これらはまた、メチル化およびまたはキャッピングによるような改変形態および非改変形態のポリヌクレオチドも包含する。 It also encompass polynucleotides modifications and unmodified forms as by methylation and or capping. より具体的には、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D−リボースを含む)、N−グリコシドまたはC−グリコシドのプリンまたはピリミジン塩基である任意の他の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー(例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(PNA))およびポリモルホリノ(Anti−Virals,Inc.、Corvallis、Oregon、Neugeneとして市販されている)ポリマー、ならびにDNAおよびRNAにおいて見られるような塩基対合および塩基堆積を可能にする構成で核酸塩基を含むポリマーを提供する他の合成配列特異的核 More specifically, the term "nucleic acid", "polynucleotide" and "oligonucleotide", polydeoxyribonucleotides (containing 2-deoxy -D- ribose), (including D- ribose) polyribonucleotides, N- glycoside or C- glycoside of a purine or pyrimidine base is any other type of polynucleotide, as well as other polymers containing non-nucleotide backbones (e.g., polyamides (e.g., peptide nucleic acids (PNA)) and polymorpholino (Anti-Virals , Inc., Corvallis, Oregon, commercially available as Neugene) polymers, and DNA and other synthetic sequence providing a polymer comprising a nucleobase in a configuration that allows for base pairing and base deposition as seen in RNA specific nuclear ポリマー)を包含する。 Including a polymer).

「プローブ」は、1つ以上の型の化学結合を通して相補的配列の標的核酸に結合し得る核酸である。 A "probe" is a nucleic acid capable of binding to a target nucleic acid of complementary sequence through chemical attachment of one or more types. この化学結合は、通常は水素結合の形成による相補的塩基対合により、それによって二本鎖構造を形成する。 The chemical bond, usually through complementary base pairing by the formation of hydrogen bonds, thereby forming a double-stranded structure. プローブは、「プローブ結合部位」に結合またはハイブリダイズする。 The probe binds or hybridizes to a "probe binding site". プローブは、特にそのプローブが一端その相補的な標的にハイブリダイズしたら、そのプローブの容易な検出を可能にするように、検出可能な標識で標識され得る。 Probe, especially When hybridized to one end thereof complementary target is the probe, so as to allow easy detection of the probe may be labeled with a detectable label. プローブに結合される標識は、例えば化学的手段または物理学的手段によって検出され得る、当該分野において公知の任意の種々の異なる標識を包含し得る。 Label that is bound to the probe, for example, chemical means or may be detected by physical means, can include a variety of different labels known any in the art. プローブに結合され得る適した標識としては、放射能、蛍光、発色団、質量標識、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子および酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。 The labels suitable may be coupled to the probe, radioactivity, fluorescence, chromophores, mass labels, electron density particles emit magnetic particles, spin labels, chemiluminescent molecules, electrochemically active molecules, enzymes, cofactors and include enzyme substrates, but not limited thereto. プローブは、サイズがかなり変動し得る。 The probe, the size can vary considerably. いくつかのプローブは、比較的短い。 Some of the probe is relatively short. 一般的に、プローブは、少なくとも7〜15ヌクレオチド長である。 Generally, probes are at least 7 to 15 nucleotides in length. 他のプローブは、少なくとも20、30または40ヌクレオチド長である。 Other probes are at least 20, 30, or 40 nucleotides in length. なお他のプローブは、いくらか長く、少なくとも50、60、70、80、90ヌクレオチド長である。 Still other probes are somewhat longer, at least 50,60,70,80,90 nucleotides in length. なお他のプローブはさらに長く、少なくとも100、150、200またはそれより大きいヌクレオチド長である。 Still other probes are longer, at least 100, 150, 200 or greater nucleotides in length. プローブは、前述の範囲内に入る任意の具体的な長さでもあり得る。 The probe may also be a any specific length that falls within the aforementioned range.

「プライマー」は、適切な条件下(すなわち、4種の異なるヌクレオチド三リン酸および重合のための因子(例えば、DNAまたはRNAポリメラーゼまたは逆転写酵素)の存在下)で、適切な緩衝液中で適した温度において、鋳型依存性DNA合成の開示点として作用することができる一本鎖ポリヌクレオチドである。 "Primer", under appropriate conditions (i.e., factor for four different nucleotide triphosphates and a polymerization (for example, the presence of a DNA or RNA polymerase or reverse transcriptase)), in an appropriate buffer in a suitable temperature, a single-stranded polynucleotide capable of acting as a disclosure point of template-dependent DNA synthesis. プライマーの適切な長さは、そのプライマーの意図されている使用に依存するが、代表的には、少なくとも7ヌクレオチド長であり、より代表的には10ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長の範囲である。 The appropriate length of a primer depends on the intended use of the primer, typically at least 7 nucleotides long, in the range of 10 nucleotides in length to 30 nucleotides in length and more typical. 他のプライマーは、いくらか長い(例えば、30〜50ヌクレオチド長)のものであり得る。 Other primers can be of somewhat longer (e.g., 30 to 50 nucleotides in length). 短いプライマー分子は、一般的に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。 Short primer molecules generally to form a mold sufficiently stable hybrid complexes need lower temperatures. プライマーは、鋳型の正確な配列を反映している必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。 A primer need not reflect the exact sequence of the template but must be sufficiently complementary to hybridize with the template. 用語「プライマー部位」または「プライマー結合部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的DNAのセグメントをいう。 The term "primer site" or "primer binding site" refers to a segment of the target DNA to which a primer hybridizes. 用語「プライマー対」は、増幅対象DNA配列の5'末端の相補体にハイブリダイズする5'「上流プライマー」と、増幅対象配列の3'末端にハイブリダイズする3'「下流プライマー」とのセットを意味する。 The term "primer pair", the set of the '5 which hybridizes to the complement of the 5' end of the amplified DNA sequence "upstream primer", and '3 hybridizes to the 3' end of the amplified target sequence "downstream primer" It means.

「完全に相補的な」プライマーは、そのプライマーの全長にわたって完全に相補的な配列を有し、ミスマッチを有さない。 "Fully complementary" primer has a completely complementary sequence along the entire length of the primer, no mismatches. プライマーは代表的に、標的配列の一部(部分配列)に完全に相補的である。 Primers typically perfectly complementary to a portion of the target sequence (partial sequence). 「ミスマッチ」とは、プライマーにおけるヌクレオチドと、アライメントされている標的核酸におけるヌクレオチドとが、相補的ではない部位をいう。 A "mismatch", and the nucleotide in the primer, the nucleotides in a target nucleic acid that has been alignment, refers to a site not complementary. 用語「実質的に相補的」とは、プライマーに関連して使用される場合、プライマーはその標的配列に完全には相補的ではないが;代わりに、そのプライマーは所望のプライマー結合部位においてそのそれぞれの鎖と選択的にハイブリダイズするのにだけ十分に相補的であることを意味する。 The term "substantially complementary" when used in connection with the primer, the primer is completely but not complementary to its target sequence; instead, the primers each of which at the desired primer-binding site It means that the chain of a selectively to hybridize only be sufficiently complementary.

用語「相補的」とは、1つの核酸が、別の核酸分子と同一であるか、または選択的にハイブリダイズすることを意味する。 The term "complementary" means that one nucleic acid, or is identical to another nucleic acid molecule, or selectively meant to hybridize. ハイブリダイゼーションの選択性は、全体的に特異性を欠く場合よりもハイブリダイゼーションが選択的である場合に存在する。 Hybridization selectivity exists when hybridization is more selective than if the entire devoid of specificity. 代表的に、選択的なハイブリダイゼーションは、1本の少なくとも14〜25ヌクレオチドにわたって少なくとも約55%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも75%、そして最も好ましくは少なくとも90%の同一性が存在する場合に起こる。 Typically, selective hybridization will occur when there is at least about 55% over one of at least 14-25 nucleotides, preferably at least 65%, more preferably at least 75%, and most preferably at least 90% of the present identity It happens in the case of. 好ましくは、一方の核酸は、他方の拡散に特異的にハイブリダイズする。 Preferably, one of the nucleic acid specifically hybridizes to the other diffusion. M. M. Kanehisa,Nucleic Acids Res. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203(1984)を参照のこと。 12: 203 (1984).

用語「標識」とは、物理的、化学的、電磁的および他の関連する分析技術によって検出され得る分子または分子の態様をいう。 The term "label", physical, chemical, refers to aspects of the molecule or molecule that can be detected by the electromagnetic and other related analytical techniques. 使用され得る検出可能な標識の例としては、放射能、蛍光、発色団、質量標識、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、核酸プローブに連結する酵素、補因子および酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of detectable labels that may be used include radioactive, fluorescent, chromophoric, mass labels, electron density particles, magnetic particles, spin labels, molecules that emit chemiluminescence, electrochemically active molecules, the nucleic acid probe enzyme linked include cofactors and enzyme substrates, but not limited thereto. 用語「検出可能に標識された」とは、因子が標識と結合体化されているか、または別個の標識に結合体化されることなく検出されることを可能にする、ある固有の特性(例えば、サイズ、形状または色)を有していることを意味する。 The term "detectably labeled" is factor to allow it to be detected without either being conjugated to a label, or is conjugated to a separate label, there inherent characteristics (e.g. means that it has the size, shape or color).

「多型マーカー」または「多型部位」は、分岐が生じる遺伝子座である。 "Polymorphic marker" or "polymorphic site" is the locus at which divergence occurs. 好ましいマーカーは少なくとも2つの対立遺伝子を有し、各々が選択された集団の1%より多い頻度で発生し、そしてより好ましくは、10%または20%より多い頻度で発生する。 Preferred markers have at least two alleles, each occurring more often than 1% of the selected population, and more preferably, occurs more frequently than 10% or 20%. 多型遺伝子座は、1塩基対もの小ささであり得る。 Polymorphic locus may be as small as one base pair. 多型マーカーとしては、制限酵素断片長多型、タンデムリピートの可変数(VNTR)、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純配列リピート、Aluのような挿入エレメントが挙げられる。 The polymorphic markers, restriction fragment length polymorphisms, variable number of tandem repeats (VNTR), hypervariable regions, minisatellites, dinucleotide repeats, trinucleotide repeats, tetranucleotide repeats, simple sequence repeats, insertion, such as Alu element, and the like. 第一に同定される対立遺伝子形態が参照形態として任意に指定され、他の対立遺伝子の形態は代替対立遺伝子または改変体対立遺伝子形態と指定される。 Allelic forms identified in the first is arbitrarily designated as the reference form, the form of the other allele is designated as alternative alleles or variant allelic forms. 選択された集団において最も頻繁に発生している対立遺伝子形態が、時として野生型形態といわれる。 Allelic form that occurs most frequently in a selected population is sometimes referred to as the wild-type form. 2倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。 Diploid organisms may be heterozygous be homozygous for allelic forms. 2つの対立遺伝子は多型は2つの形態を有する。 Two alleles polymorphism has two forms. 3つの対立遺伝子多型は、3つの形態を有する。 Three allelic polymorphism has three forms.

「一塩基多型(single nucleotide polymorphism)」(SNP)は、単一のヌクレオチドによって占められる多型部位において発生し、対立遺伝子配列間のバリエーションの部位である。 "Single nucleotide polymorphism (single nucleotide polymorphism)" (SNP) is generated at a polymorphic site occupied by a single nucleotide, which is the site of variation between allelic sequences. この部位は、通常、高度に保存された対立遺伝子の配列(例えば、その集団の1/100未満または1/1000未満しか変動しない配列)の前後に存在する。 This site is usually present around the highly conserved sequences of the allele (e.g., sequences only vary or less 1/1000 than 1/100 of the population). 一塩基多型は、通常、その多型部位における1つのヌクレオチドの別のヌクレオチドに代えての置換に起因して生じる。 A single nucleotide polymorphism usually arises due to substitution of instead of another nucleotide of one nucleotide at the polymorphic site. トランジションは、あるプリンの別のプリンへの置換またはあるピリミジンの別のピリミジンへの置換である。 Transition is replaced with another pyrimidine substituted or pyrimidine to another purine certain purine. トランスバーションは、プリンからピリミジンまたはピリミジンからプリンへの置換である。 Transversion is the replacement pyrimidine or pyrimidine to purine purine. 一塩基多型はまた、参照対立遺伝子に対して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。 Single nucleotide polymorphism also relative to the reference allele may result from the insertion of a nucleotide deletion or nucleotides.

「試薬」とは、反応において使用される任意の因子を広範にいう。 By "reagent" broadly refers to any agent used in the reaction. 試薬としては、自身でモニターされ得る単一の因子(例えば、加熱される際にモニターされる物質)または2つ以上の混合物が挙げられ得る。 Reagents, single agent that can be monitored by itself (e.g., monitored substances when heated) may or mixtures of two or more can be mentioned. 試薬は、生きているものもよいし(例えば、細胞)、生きているものでなくてもよい。 Reagents may be those alive (e.g., cells), it may not be construed alive. 核酸増幅反応のための例示的な試薬としては、緩衝液、金属イオン、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。 Exemplary reagents for nucleic acid amplification reaction, buffers, metal ions, polymerase, primers, cast type nucleic acid, nucleotides, labels, dyes, but such nucleases include, but are not limited to. 酵素反応のための試薬としては、例えば、基質、補因子、共役酵素、緩衝液、金属イオン、インヒビター、およびアクチベーターが挙げられる。 Reagents for enzyme reactions include, for example, substrates, cofactors, coupled enzyme, buffer, metal ions, inhibitors, and activators can be cited. 細胞ベースの反応のための試薬としては、細胞、細胞特異的色素および細胞レセプターに結合するリガンド(例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト)が挙げられるが、これらに限定されない。 Reagents for cell-based reactions, cell, ligands which bind to cell-specific dye and cell receptors (e.g., agonists and antagonists) include, but are not limited to.

「リガンド」は、そのリガンドに特異的または非特異的に結合する別の分子(すなわち、「抗リガンド」)が存在する任意の分子である。 "Ligand" is another molecule (i.e., "anti-ligand") which specifically or non-specifically bind to its ligand is any molecule which is present. この結合は、抗リガンドによるリガンドの一部の認識による。 This binding, in accordance with some recognition of ligands by antiligand.

(II.概要) (II. Overview)
独自のフローチャネル構造を有する多数の異なる微小流体デバイス(ときにチップとも呼ばれる)が、本明細書中で提供され、同様に種々のハイスループット分析を行うためのそのようなデバイスの使用も提供される。 Many different microfluidic devices having unique flow channel structure (also referred to as a chip when) are provided herein, as well as the use of such a device to perform various high-throughput analysis is also provided that. このデバイスは、温度制御を必要とする分析、特に熱サイクリング(例えば、核酸増幅反応)に関する分析における使用のために設計される。 The device analyzes requiring temperature control, especially thermal cycling (e.g., nucleic acid amplification reactions) are designed for use in analysis. この微小流体デバイスは、特定の設計の特徴を組み込み、この特徴は、多くの従来の微小流体デバイスよりも顕著に小さいフットプリントを与え、そのデバイスが他の手段に容易に統合されるのを可能にし、自動化された分析を提供する。 The microfluidic device may incorporate features of a particular design, this feature is more than the conventional microfluidic devices provide significantly smaller footprint, enabling the the device is easily integrated into other means to provide an automated analysis.

この微小流体デバイスのうちのいくつかは、本明細書中では代表的に「ブラインドチャネル」または「ブラインドフィル(blind fill)」と呼ばれる設計を使用する。 Some of the microfluidic devices are referred to herein using the designs typically referred to as "blind channel" or "blind fill (blind fill)". これらは、定義の節において示されるように、溶液がそのブラインドチャネルに1つの末端からのみ流入および流出し得るように閉じた末端または分離された末端を有するフローチャネルである(すなわち、ブラインドチャネルについては、別個の入口および出口が存在しない)。 These, as shown in the section of the definition, the solution is a flow channel having one end closed so as to flow in and out only from the end or isolated end to the blind channel (i.e., the blind channel the separate inlet and outlet does not exist). これらのデバイスでは、分離された反応部位を形成するためにそのブラインドチャネルの領域を分離するのに、各ブラインドチャネルあたり1個のバルブのみが必要とされる。 In these devices, to separate the region of the blind channel to form an isolated reaction site, only one of valves per each blind channel is required. このタイプのデバイスの製造の間、分析を行うための1つ以上の試薬が、その反応部位に配置され、それによってインプットおよびアウトプットの数の顕著な減少をもたらす。 During the manufacture of this type of device, one or more reagents for performing the analysis is placed on the reaction site, thereby resulting in a significant reduction in the number of inputs and outputs. さらに、このブラインドチャネルは、チャネルの相互接続ネットワークに接続され、その結果全ての反応部位が、単一の限られた数のサンプルインプットによって充填され得る。 Furthermore, the blind channels are connected to the interconnection network of channels, the result all the reaction sites can be filled by a single limited number of sample input. インプットおよびアウトプットにおける複雑さの減少および各反応部位を分離する1個のバルブのみの使用に起因して、反応部位のために利用可能な空間が増加する。 Due to the use of only one valve for separating the reduced and each reaction site of the complexity in inputs and outputs, the space available for reaction sites is increased. したがって、これらのデバイスの特徴は、各デバイスが多数(例えば、数万まで)の反応部位を備えることができ、そして高い反応部位密度(例えば、1000〜4000反応部位/cm を超える)を達成し得ることを意味する。 Therefore, achieving the characteristics of these devices, each device number (e.g., up to several 50,000) can comprise a reactive site, and a high reaction site densities (e.g., greater than 1000 to 4000 reaction sites / cm 2) it means that that may be. 個別にも集合的にも、これらの特徴はまた、従来の微小流体デバイスと比較した場合の本発明の微小流体デバイスのサイズにおける顕著な減少へと直接転換されている。 Also individually collectively also these characteristics have also been converted directly into a significant reduction in the size of the microfluidic device of the present invention when compared to conventional microfluidic devices.

本明細書中で開示される他の微小流体デバイスは 、マトリクス設計を使用する。 Other microfluidic devices disclosed herein, using a matrix design. 一般的に、このタイプの微小流体デバイスは、複数の交差する水平方向および垂直方向のフローチャネルを使用し、その交差点において反応部位のアレイを規定する。 Generally, this type of microfluidic devices using the horizontal and vertical flow channels to a plurality of intersecting to define an array of reaction sites at the intersection. 従って、この設計のデバイスはまた、反応部位のアレイを有するが、この設計で多数のサンプルに適応するために多数のサンプル注入口および対応する出口が存在する。 Thus, devices of this design also have an array of reaction sites, outlet corresponding number of sample inlet and to accommodate the large number of samples in this design exists. 切り替え可能な流れアレイ構造と呼ばれるバルブシステムによって、横方向のみまたはフローチャネルを通って選択的に溶液が流れることが可能になり、それによりマトリクスにおける種々のフローチャネルの切り替え可能な分離が可能になる。 By a valve system referred to as switchable flow array structure, only the horizontal direction or through the flow channel makes it possible to selectively solution flows, becomes thereby enabling switchable isolation of various flow channels in the matrix . 従って、ブラインドチャネルデバイスは、限られた数のサンプルを用いて異なる条件下で多数の分析を行うために設計される一方、マトリクスデバイスは、限られた数の条件下で多数のサンプルを分析するように構築される。 Therefore, blind channel devices, while being designed to perform a number of analyzes under different conditions using samples of limited number, matrix device analyzes a large number of samples under a limited number It is constructed so. なお他のデバイスは、これら2つの設計タイプの混成である。 Still other devices are two design types of the hybrid.

上記の微小流体デバイスは、種々の構成要素(例えば、フローチャネル、制御チャネル、バルブおよび/またはエラストマー材料でできたポンプ)を利用することによって一部はさらに特徴付けられる。 Additional microfluidic devices, various components (e.g., flow channel, control channel, a pump made of valves and / or elastomeric material) portion by utilizing the further characterized. いくつかの例において、本質的に完全なデバイスは、エラストマー材料から作製される。 In some instances, essentially complete device is made from an elastomeric material. 結果的に、このようなデバイスは、シリコンベースの材料から形成される大多数の従来の微小流体デバイスとは、形態および機能が顕著に異なる。 Consequently, such devices, the majority of conventional microfluidic devices that are formed from silicon-based materials, form and function are significantly different.

このデバイスの設計は、多数の種々の加熱システムと組み合わせて利用されることを可能にする。 The design of this device, to be utilized in combination with a number of different heating systems. 従って、このデバイスは、温度制御を必要とする種々の分析を行なうのに有用である。 Accordingly, this device is useful in performing various analyzes that require temperature control. さらに、加熱適用において使用するための微小流体デバイスは、反応部位からのサンプルの蒸発を最小限にするために、さらなる設計特徴を組み込ませ得る。 Additionally, microfluidic devices for use in heating applications, in order to minimize evaporation of sample from the reaction sites, thereby incorporate additional design features. この型のデバイスは、一般に、エラストマーデバイス内に形成される多数の保護チャネルを備え、この保護チャネル内を水が流れて、エラストマー材料内の水蒸気圧を増加させ、このデバイスは、そのエラストマー材料から形成され、それによって反応部位からのサンプルの蒸発を減少させる。 This type of device is generally provided with a number of protection channels formed in an elastomeric device, the protection in the channel water flow, increases the water vapor pressure within the elastomeric material, the device, from the elastomeric material formed, thereby reducing evaporation of sample from the reaction sites.

別の実施形態において、熱サイクリングデバイスは、微小流体デバイスの温度を制御するために使用され得る。 In another embodiment, the thermal cycling device may be used to control the temperature of the microfluidic device. 好ましくは、この微小流体デバイスは、その微小流体デバイスと熱的に接触させるように適合される。 Preferably, the microfluidic device is adapted to the microfluidic device in thermal contact. この微小流体デバイスが、基板物質(例えば、ガラススライド)またはキャリアプレートの底(例えば、プラスチックキャリア)によって支持される場合、窓は、キャリアまたはスライドの領域内に形成され、その結果微小流体デバイス、好ましくはエラストマーブロックを有するデバイスは、熱サイクリングデバイスの加熱/冷却ブロックと直接接触し得る。 The microfluidic device, the substrate material (e.g., a glass slide) if the bottom or the carrier plate (e.g., plastic carriers) is supported by a window is formed in the region of the carrier or slide, so that the microfluidic device, preferably the device having an elastomeric block, may directly contact the heating / cooling block of a thermal cycling device. 好ましい実施形態において、この加熱/冷却ブロックは、その中に溝を有し、微小流体デバイス、好ましくは、反応が生じる部分に吸引力を加えるための真空供給源と連絡する。 In a preferred embodiment, the heating / cooling block has a groove therein, the microfluidic device, preferably in communication with a vacuum source for applying suction to the portion where reaction occurs. あるいは、硬い、熱伝導性のプレートは、効率的な熱伝導を生じるための加熱ブロックおよび冷却ブロックと結合する微小流体デバイスに結合され得る。 Alternatively, hard, thermally conductive plate may be coupled to the microfluidic devices that associate with the heating block and cooling block for producing an efficient heat transfer.

特定のデバイスのアレイフォーマットは、そのデバイスがハイスループットを達成し得ることを意味する。 An array format for a particular device, which means that the device can achieve a high throughput. 集合的に、ハイスループット性能および温度制御性能は、そのデバイスを、多数の核酸増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応−PCR)を行なうために有用なものにする。 Collectively, the high throughput performance and temperature control performance, the device, a number of nucleic acid amplification (e.g., polymerase chain reaction -PCR) make them useful for performing. このような反応は、このデバイスの有用性の例示として(特に温度制御を必要とする任意の反応における使用の例示として)本明細書中で詳細に考察される。 Such reactions (as an illustration of use in any reaction which requires particular temperature control) exemplified as the utility of the device is discussed in detail herein. しかし、このデバイスが、これらの特定の適用に限定されないことが理解されるべきである。 However, this device is that these are not limited to a specific application is to be understood. このデバイスは、広範な種々の他の型の分析または反応に利用され得る。 This device can be used to analyze or reaction of a wide variety of other types. 例としては、タンパク質−リガンド相互作用および細胞と種々の化合物との間の相互作用が挙げられる。 Examples include proteins - it includes interactions between ligand interaction and cell and various compounds. さらなる例は、以下で提供される。 Additional examples are provided below.

(III.微小流体デバイスの一般的構造) (III. The general structure of the microfluidic device)
(A.ポンプおよびバルブ) (A. pumps and valves)
本明細書中に開示される微小流体デバイスは、代表的に少なくとも一部は、エラストマー材料から構成され、単層および多層のソフトリソグラフィ(MSL)技術および/または犠牲層カプセル化法(sacrificial−layer encapsulation methods)により構築される(例えば、Ungerら、(2000)、Science 288:113−116およびPCT公開WO 01/01025、これらは両方とも全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される)。 Microfluidic devices disclosed herein are typically at least partially, it consists of an elastomeric material, a single-layer and multilayer soft lithography (MSL) techniques and / or sacrificial-layer encapsulation methods (Sacrificial-layer is constructed by encapsulation methods) (e.g., Unger et al., (2000), Science 288: 113-116 and PCT Publication WO 01/01025, in their entirety for all purposes both of which are reference herein which is incorporated by). このような方法を利用して、微小流体デバイスは、そのデバイスのフローチャネルを通って流れる溶液が少なくとも一部は、エラストマー膜またはセグメントによりフローチャネルから分離された一つ以上の制御チャネルで制御されるように設計され得る。 Using such a method, a microfluidic device, some solution flowing through the flow channel of the device at least is controlled by one or more control channels that are separated from the flow channel by an elastomeric membrane or segment It can be designed so that. この膜またはセグメントは、フローチャネル内に偏向され得るか、またはフローチャネルから引っ込められ、そのフローチャネルには、制御チャネルに作動力を適用することによって制御チャネルが結合されている。 This membrane or segment can either be deflected into the flow channel, or retracted from the flow channel, in its flow channel, the control channel is bonded by applying an actuation force to the control channel. 膜が、フローチャネル内に偏向されるか、またはフローチャネルから引っ込む程度を制御することによって、溶液の流れは、遅くなり得るか、またはフローチャネルを通して完全に遮断され得る。 Film, by controlling the degree to which retracts from the flow or is deflected in a channel, or flow channels, the flow of the solution can be completely blocked throughout slows down, or can be the flow channel. Ungerら(2000)Science 288:113−116およびPCT公開WO/02/43615およびWO 01/01025に広範に詳細に記載されるように、この型の制御チャネルおよびフローチャネルの組み合わせを使用して、溶液の流れを調節するための種々の異なる型のバルブおよびポンプを作製し得る。 Unger et al. (2000) Science 288: 113-116 and PCT as publication WO / 02/43615 and WO 01/01025 to broadly described in detail, using a combination of control channels and flow channels of this type, It may produce a variety of different types of valves and pumps for regulating solution flow.

本明細書中に提供されるデバイスは、試薬が反応することが可能である反応部位を選択的に分離するために、このようなポンプおよびバルブを組み込む。 Devices provided herein, for the reagent to selectively separate reaction sites capable of reacting, incorporating such pumps and valves. 反応部位は、デバイス内の多数の異なる位置のいずれかに位置し得る。 The reaction site may be located in any of a number of different locations within the device. 例えば、いくつかのマトリクス型のデバイス内では、反応部位は、一組のフローチャネルの交点に位置する。 For example, within some matrix devices, the reaction site is located at the intersection of a set of flow channels. ブラインドチャネルデバイスでは、反応部位は、ブラインドチャネルの末端に位置する。 In blind channel devices, the reaction site is located at the end of the blind channel.

このデバイスが、温度制御反応(例えば、熱サイクリング反応)に利用される場合、以下により詳細に記載されるように、エラストマーデバイスは、代表的に支持体(例えば、ガラススライド)に固定される。 This device, when used in temperature control reactions (e.g., thermocycling reactions), as described in more detail below, the elastomeric device is fixed as a typical support (e.g., a glass slide). 次いで、生じる構造物は、例えば、種々の反応部位の温度を制御するために、温度制御プレート上に配置され得る。 Then, the structure resulting, for example, in order to control the temperature of the various reaction sites may be placed in a temperature controlled plate. 熱サイクリング反応の場合、このデバイスは、多数の熱サイクリングプレートの任意のものの上に配置され得る。 When thermal cycling reactions, the device may be disposed on any of a number of thermocycling plates.

このデバイスは、比較的光学的に透明なエラストマー材料から作製されるので、反応は、微小流体デバイスの本質的に任意の位置で、種々の異なる検出システムを使用して容易にモニタリングされ得る。 This device is made from a relatively optically transparent elastomeric material, the reaction is essentially arbitrary position of the microfluidic device can be readily monitored using a variety of different detection systems. しかし、最も代表的には、検出は、それ自体の反応部位(例えば、フローチャネルの交点またはフローチャネルのブラインド端部を備える領域内)で行われる。 However, most typically, detection is the reaction site itself (e.g., within a region comprising a blind end of the intersection or the flow channels of the flow channel) takes place in. このデバイスが、実質的に透明な材料から製造されるという事実はまた、従来のシリコンベースの微小流体デバイスと一緒には使用不可能である特定の検出システムが、現在のデバイスと一緒に利用され得ることを意味する。 This device is also the fact that is manufactured from a substantially transparent material, particular detection system is unusable with conventional silicon-based microfluidic devices, utilized with current device which means that may be. 検出は、デバイス内に組み込まれたか、またはデバイスからは離れているが、検出されるべきデバイスの領域内に整列した検出器を用いて達成され得る。 Detection is either incorporated within the device, or away from the device, can be achieved using detectors aligned in the region of the device to be detected.

(B.保護チャネル) (B. protection channel)
本明細書中に提供されるエラストマー微小流体デバイスからのサンプルおよび試薬の蒸発を減少させるために、複数の保護チャネルが、そのデバイス中に形成され得る。 To reduce sample and reagent evaporation from an elastomeric microfluidic devices provided herein, a plurality of guard channels can be formed in the device. この保護チャネルは、代表的にフローチャネルおよび/または反応部位を覆うエラストマーの層に形成される点で制御チャネルに類似している。 The protection channel is similar to the control channel at a point which is formed in a layer of elastomer typically cover the flow channels and / or reaction sites. 従って、制御チャネルと同様に、保護チャネルは、その下にあるフローチャネルおよび/または反応部位から、エラストマー材料の膜またはセグメントにより分離される。 Therefore, similarly to the control channel, the protection channel, from the flow channel and / or reaction site thereunder, are separated by a membrane or segment of elastomeric material. しかし、制御チャネルとは違って、保護チャネルは、断面積はかなり小さい。 However, unlike the control channel, the protection channel, the cross-sectional area is quite small. 一般に、より小さい面積を有する膜は、同じ適用圧力下では、より大きい面積の膜より偏向が小さい。 In general, membranes having a smaller area, under the same applied pressure, is smaller deflection than the film of larger area. 保護チャネルは、溶液(代表的に水)が保護チャネル内に流動することを可能にするような圧力に設計される。 Protection channel, solution (typically water) is designed to pressure such as to allow flow into the protection channels. 保護チャネルに由来する水蒸気は、フローチャネルまたは反応部位に隣接するエラストマーの細孔に拡散し得、従って、フローチャネルまたは反応部位に隣接する水蒸気の濃度を増加させ、そこからの溶液の蒸発を減少させる。 Water vapor from the protection channels will diffuse into the pores of the elastomer adjacent to the flow channel or reaction site, thus, increasing the concentration of water vapor adjacent to the flow channel or reaction site, reducing evaporation of solution therefrom make.

一般に、保護チャネルは、十分に小さく、従って加圧される場合、保護チャネルを下にあるフローチャネルまたは反応部位から分離する膜は、保護チャネルが覆うフローチャネルまたは反応部位内、それらの外またはそれらを通して溶液が流れることを実質的に制限しない。 In general, the protection channel is sufficiently small, therefore if the pressurized, membrane separating the protective channel from the flow channel or reaction site under the flow channel or the reaction site protection channel covers, their outer or their It does not substantially restrict the flow solution through. 本文脈中で使用される場合、用語「実質的に制限する」または他の類似する用語は、フローチャネルまたは反応部位内、それらの外またはそれらを通して流れる溶液が、保護チャネルを通した溶液の流れを達成するように保護チャネルが加圧されない場合の同じ条件下でのフローチャネルまたは反応部位内の溶液の流れ、それらへの溶液の流れ、またはそれらを通した溶液の流れと比較して、40%超に、代表的には30%未満に、通常は20%未満に、そしていくつかの場合には10%未満に減少しないことを意味する。 When used in the present context, the term "substantially limits" or other similar terms, the flow channel or a reaction site, their outer or solution that flows through them is, flow through the protection channel solution the flow channel or solution flow within the reaction site under the same conditions when the protection channel so as to achieve is not pressurized, as compared to the solution flow to those or solution flow through them, 40 in percent, to typically less than 30%, usually means not decrease below 10% in the case of less than 20%, and some. 通常、このことは、保護チャネルが100μm と50,000μm との間の断面積、またはその間の任意の整数または整数でない断面積を有することを意味する。 Usually, this means that the guard channels have a cross-sectional area or cross-sectional area not any integer or integer therebetween, between 100 [mu] m 2 and 50,000 2. 従って、例えば、いくつかの例において、その断面積は、50,000μm 未満であり、他の例において10,000μm 未満であり、さらに他の例において、1,000μm 未満であり、なお他の例において、100μm 未満である。 Thus, for example, in some instances, the cross-sectional area is less than 50,000 2, less than 10,000 2 In another example, in yet another embodiment, less than 1,000 .mu.m 2, Note in another example, less than 100 [mu] m 2. 保護チャネルは、任意の種々の形状をとり得、それらとしては、円形、楕円形、正方形、長方形、六角形、および八角形の形状が挙げられるが、それらに限定されない。 Protection channel may take any of a variety of shapes, is in it found a circular, oval, square, rectangular, hexagonal, and the shape of the octagonal include, but are not limited to.

保護チャネルは、熱サイクリング反応を行なうために必要とする時間の間かつその条件下で、サンプルおよび試薬のデバイスからの蒸発を50%未満、他の例においては45%未満、40%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満または1%未満減少させるように設計される。 Protection channels between and the conditions of the time required to perform the thermal cycling reaction, evaporate less than 50% from the device of the sample and reagents, less than 45% in another embodiment, less than 40%, 30 %, less than 25%, less than 20%, less than 15%, less than 10%, is designed to reduce than 5% or less than 1%. 従って、例えば、40サイクル行なう代表的なPCR反応は、120分以内に行われ得る。 Thus, for example, a typical PCR reaction performed 40 cycles may be performed within 120 minutes. 保護チャネルシステムは、以下のセットの制限に対するほぼこの時間枠の間の蒸発を減少させるように設計される。 Protection channel system is designed to reduce evaporation during approximately this time frame for the restriction of the following set. このレベルの蒸発の減少を達成するために、保護チャネルは、代表的に少なくとも10ライン/cm 〜1000ライン/cm の密度で、またはその間の任意の整数の密度レベルで存在する。 To achieve a reduction in this level of evaporation, the protection channel, at a density of typically at least 10 lines / cm 2 to 1000 lines / cm 2, or present any integer of density levels in between. より詳細には、保護チャネルは、一般的に少なくとも25ライン/cm 、他の例では少なくとも50ライン/cm 、さらに他の例では少なくとも100ライン/cm 、そしてなお他の例では少なくとも500ライン/cm である。 More specifically, the protection channel is in general at least 25 lines / cm 2, and still other instances at least 100 lines / cm 2, at least 50 lines / cm 2, still another example in another embodiment at least 500 a line / cm 2. このレベルの蒸発の減少を達成するために、保護チャネルは、代表的に、一つのラインの外側の端から隣接するラインの最も近い外側の端まで測定した場合、1mm〜1μmの間の間隔、またはその間の任意の整数の密度レベルで存在する。 To achieve a reduction in this level of evaporation, the protection channel is typically when measured to the nearest outer edge of adjacent lines from the outer end of one line, the spacing between 1Mm~1myuemu, or present any integer of density levels in between. より詳細には、保護チャネルは、一般的に、500μm〜5μmの間の間隔を開け、他の例では、100μm〜10μmの間、なお他の例では、75μm〜40μmの間の間隔を開けている。 More specifically, the protection channel generally spaced between 500Myuemu~5myuemu, in another example, between 100Myuemu~10myuemu, In yet another example, an interval between 75μm~40μm there. 従って、その間隔は、代表的に、少なくとも1μmであるが、1mm未満であり、他の例では、500μm未満であり、さらに他の例では、400μm未満であり、なお他の例では、300μm未満であり、他の例では、200μm未満であり、なお他の例では、100μm未満、50μm未満または25μm未満である。 Therefore, the interval is typically is at least 1 [mu] m, less than 1 mm, in other instances less than 500 [mu] m, in yet another example, less than 400 [mu] m, still other instances, less than 300μm and a, in other instances less than 200 [mu] m, still other instances, less than 100 [mu] m, less than 50μm or less than 25 [mu] m.

保護チャネルは、チャネルの別個のネットワークとして形成され得るか、または制御チャネルの枝分かれであるチャネルより小さくてもよい。 Protection channels may be smaller than or may be formed as a separate network of channels or a branching of the control channel channel. 保護チャネルは、デバイスを越えて延び得るか、またはデバイスの特定の領域のみを超えてのび得る。 Protection channel, or may extend beyond the device, or may extend beyond only certain regions of the device. 代表的に、保護チャネルは、エバポレーションが最初に関係する最初に位置であるので、フローチャネルおよび反応部位に隣接してそれらをの上に配置される。 Typically, protection channel, since it is the first position where evaporation is involved initially, is placed over the them adjacent the flow channels and reaction sites. 特定のマトリクスデバイス上の保護チャネルの例示的な位置は図1Cに示され、特定のブラインドチャネルデバイス上の例示的な位置は、図3Bおよび図3Cに示され、以下でより詳細に考察される。 Exemplary positions of protection channels on a particular matrix device is shown in Figure 1C, the exemplary locations on a particular blind channel devices, shown in FIGS. 3B and 3C, are discussed in more detail below .

保護チャネルを通して流れる溶液としては、水の蒸発を減少させ得る任意の物質が挙げられる。 The solution flowing through the protection channels include any material capable of reducing the evaporation of water. この物質は、フローラインおよび/または反応部位に隣接する水の蒸発の濃度を増加させる物質であるか、または、フローラインおよび/または反応部位からの水蒸気をブロックするにもかかわらず、 水蒸気の濃度を増加させない物質(ブロッキング因子)であり得る。 This material, or a substance increasing the concentration of the evaporation of the water adjacent to the flow line and / or reaction site, or, despite the block water vapor from the flow line and / or reaction site, the concentration of water vapor It may be not increase the material (blocking factor). 従って、一つの選択肢は、本質的に任意の水溶液を利用することであり、その場合、適切な溶液としては、水および緩衝溶液(例えば、TaqMan緩衝溶液およびリン酸緩衝生理食塩水)が挙げられるが、これらに限定されない。 Thus, one option is essentially the utilize any aqueous solution, in which case, suitable solutions include water and buffered solutions (e.g., TaqMan buffer solution, and phosphate buffered saline) is but, but it is not limited to these. 適切なブロッキング因子としては、例えば、鉱油が挙げられる。 Suitable blocking agents include, for example, mineral oil.

保護チャネルは、代表的に、MSL技術および/または上記で引用した犠牲層カプセル化法を利用してエラストマー内に形成される。 Protection channel is typically, MSL techniques and / or by using a sacrificial layer encapsulation methods cited above are formed in the elastomer.

以下の節は、温度制御を必要とする分析(例えば、核酸増幅反応)を含む種々の分析を実施するために利用され得る多数の特定の配置をより詳細に記載する。 The following section analyzes requiring temperature control (for example, nucleic acid amplification reactions) describes a number of specific configurations which may be utilized to implement the various analyzes, including more detail. しかし、これらの配置は、例示的であり、これらのシステムの改変は当業者に明らかになることが理解されるべきである。 However, these arrangements are exemplary, modification of these systems should be apparent to those skilled in the art will be appreciated.

(IV.マトリクス設計) (IV. Matrix design)
(概要) (Overview)
マトリクス設計を使用するデバイスは、一般的に、アレイの接合部を形成するように交差する複数の垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルを有する。 Devices using matrix design generally have a plurality of vertical flow channels and a horizontal flow channel that intersect to form a junction array. 種々のサンプルおよび試薬(または試薬のセット)が、それぞれのフローチャネルに導入され得るので、多数のサンプルが、比較的多数の反応条件に対して高スループットフォーマットで試験され得る。 Various sample and reagent (or set of reagents) is, because it can be introduced into each of the flow channels, a large number of samples can be tested in high-throughput format for a relatively large number of reaction conditions. 従って、例えば、異なるサンプルがM個の異なる垂直フローチャネルのそれぞれに導入され、異なる試薬(または試薬のセット)が、N個の水平フローチャネルのそれぞれに導入される場合、M×N個の異なる反応が、同時に行なわれ得る。 Thus, for example, be introduced into different samples of M different vertical flow channels, different reagents (or set of reagents) is, when introduced into each of the N horizontal flow channels, M × N number of different reactions can take place simultaneously. 代表的に、マトリクスデバイスは、垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルの切替可能な分離を可能にするバルブを備える。 Typically, the matrix device comprises a valve that allows switchable isolation of the vertical flow channels and horizontal flow channels. 別の言い方をすると、バルブは、垂直フローチャネルまたは水平フローチャネルのみを通って選択的に流れることを可能にするように配置される。 In other words, the valve is positioned to permit selective flow it through only vertical flow channels or horizontal flow channels. この型のデバイスは、サンプルの型および数、ならびに試薬の数および型の選択に関して可撓性を可能にするので、これらのデバイスは、比較的多数の反応条件に対して多数のサンプルのスクリーニングが所望される分析を行なうのに十分に適している。 This type of device, sample type and number, and since the flexibility to allow for the number and type of selection of the reagent, these devices, the screening of large numbers of samples for a relatively large number of reaction conditions It is well suited for performing the desired analysis. マトリクスデバイスは、サンプルおよび反応物の蒸発の防止を補助するために、必要に応じて保護チャネルを組込み得る。 Matrix devices, in order to help prevent evaporation of sample and reactants may incorporate guard channels as needed.

本発明は、デバイスを通したコントロールラインおよび流体ラインを組み立てるために、微小流体デバイスの層の間に流体連通孔を利用する高密度マトリクス設計物を提供する。 The present invention, in order to assemble the control lines and fluid lines through the device, to provide a high-density matrix designs product utilizing the fluid passage between layers of the microfluidic device. 例えば、2つの層のエラストマーブロックの各層に流体ラインを有することにより、より高密度の反応セル配置が可能になる。 For example, by having a fluid line in each layer of the elastomeric block of the two layers, allowing higher density reaction cell arrangement. 図21は、例示的なマトリクス設計物を示し、それぞれ流体チャネルを有する第1のエラストマー層2110(一番目の層)および第2のエラストマー層2120(二番目の層)がその中に形成される。 Figure 21 shows an exemplary matrix design was first elastomeric layer 2110 having a fluid channel, respectively (the first layer) and a second elastomeric layer 2120 (second layer) is formed therein . 例えば、第1の層2110内の試薬流体チャネルは、孔2130を介して第2の層2120内の試薬流体チャネルに接続されるが、第2の層2120は、その中にサンプルチャネルを有し、そのサンプルチャネルおよび試薬チャネルは、それぞれサンプルおよび試薬チャンバ2180内で終結する。 For example, a reagent fluid channel in the first layer 2110 is connected to a reagent fluid channel in the second layer 2120 through the holes 2130, second layer 2120 has a sample channel therein , the sample channel and a reagent channel, terminating in respective sample and within the reagent chamber 2180. サンプルチャンバおよび試薬チャンバ2180は、インターフェースチャネル2150を通して互いに流体連通され、そのインターフェースチャネル2150は、それと結合したインターフェースバルブ2140を有し、反応セル2160のチャンバ2180のそれぞれの間の流体連通を制御する。 Sample chamber and a reagent chamber 2180 in fluid communication with each other through an interface channel 2150, that interface channel 2150, therewith has an interface valve 2140 bound to control fluid communication between the respective chambers 2180 of a reaction cell 2160. 使用する場合、インターフェースが最初に閉じられ、試薬が、試薬注入口から試薬チャネルに導入され、サンプルが、サンプル注入口を通してサンプルチャネルに導入され、次いで、封じ込めバルブ2170が閉鎖され、各反応セル2160を他の反応セル2160から分離する。 When used, the interface is first closed, the reagent is introduced into the reagent channel from the reagent inlet, the sample is introduced into the sample channel through the sample inlet, then containment valves 2170 are closed, each reaction cell 2160 the separated from other reaction cells 2160. 一旦反応セル2160が分離されると、インターフェースバルブ2140は開放され、サンプルチャンバおよび試薬チャンバに互いとの流体連通を引き起こし、その結果所望の反応が起こり得る。 Once the reaction cells 2160 are isolated, the interface valve 2140 is opened, the sample chamber and a reagent chamber causes fluid communication with one another, may occur as a result the desired reaction.

従って、本発明の好ましい局面は、M個の異なるサンプルとN個の異なる試薬とを反応させるための微小流体デバイスを提供し、以下:複数の反応セル(各反応セルはサンプルチャンバおよび試薬チャンバを備える)、サンプルチャンバと試薬チャンバとの間の流体連通を制御するためにインターフェースチャネルに連結したインターフェースバルブを有するインターフェースチャネルを介して流体連通するサンプルチャンバおよび試薬チャンバ、サンプルチャンバとそれぞれ流体連通する複数のサンプル注入口、試薬チャンバとそれぞれ流体連通する複数の試薬注入口を備え、サンプル注入口または試薬注入口の一方は、サンプルチャンバの内の一つまたは試薬チャンバの内の一つとぞれぞれ孔を介して流体連通している。 Accordingly, a preferred aspect of the present invention provides a microfluidic device for reacting M number of different samples with N number of different reagents, the following: a plurality of reaction cells (each reaction cell a sample chamber and a reagent chamber provided), a plurality of sample chambers and reagent chamber, the sample chamber and each in fluid communication with fluid communication through an interface channel having an interface valve coupled to the interface channel to control fluid communication between the sample chamber and the reagent chamber sample inlet of each reagent chamber comprises a plurality of reagent inlets for communication fluid communication, one of the sample inlet or reagent inlet, one of the one or reagent chambers of the sample chamber Tozorezore in fluid communication through the hole. 特定の実施形態は、一緒に結合した複数の層から形成されたエラストマーブロック内に形成される反応セルを有し、インターフェースバルブは、偏向可能膜であり;サンプルチャネルを介してサンプルチャンバと流体連通するサンプル注入口を有し、試薬注入口は、試薬チャネルを介して試薬チャンバと流体連通し、サンプルチャネルの一部および試薬チャネルの一部は、互いにほぼ平行に配向されており、封じ込めバルブを通した流体連通を制御するための、それぞれと連結した封じ込めバルブを有し;サンプルチャネルと連絡したバルブを有し、試薬チャネルと連絡したバルブは、共通封じ込め制御チャネルを通して互いに作動可能に連絡し;封じ込め共通制御チャネルは、サンプルチャネルまたは試薬チャネルの一方にほぼ垂直な列に Particular embodiment has a reaction cell formed in an elastomeric block formed from a plurality of layers bonded together, the interface valve is located in deflectable membrane; through the sample channel sample chamber in fluid communication with has a sample inlet to the reagent inlet, through the reagent chamber in fluid communication through the reagent channel, a portion of the part and the reagent channel of the sample channels are oriented substantially parallel to each other, a containment valve for controlling fluid communication through, having a containment valve coupled respectively; has sample channels and contacts the valve, the valve in communication with the reagent channel, and contact possible with each other operate through a common containment control channel; the containment common control channel, a substantially vertical column on one of the sample channel or the reagent channel って配置される。 They are placed me.

本発明の別の局面は、以下の工程を包含する、エラストマーブロック内に特徴を作製するための方法を提供する:第1のエラストマー層を提供する工程;上記第1のエラストマー層の表面上にフォトレジスト層を適用する工程;上記フォトレジスト層に光パターンを適用し、反応フォトレジスト材料のパターンを形成する工程;第1のエラストマー層の表面上の反応したフォトレジストのパターンを残しておいて未反応のフォトレジスト材料を除去する工程;第1のエラストマー表面にエッチング試薬を適用して反応したフォトレジスト材料のパターンにより覆われていない第一のエラストマー層の表面をエッチングして、それによって、反応したフォトレジストのパターンによって覆われていない第1のエラストマー層の領域を除去する工 Another aspect of the present invention includes the steps of providing a method for making the features in elastomeric block: providing a first elastomeric layer; on the surface of the first elastomeric layer applying to the photoresist layer; have to leave the reaction pattern of the photoresist was on the surface of the first elastomeric layer; applying a light pattern on the photoresist layer, forming a pattern of reaction photoresist material step to remove the photoresist material unreacted; the surface of the first elastomeric layer not covered by the pattern of photoresist material which reacts by applying the etchant to the first elastomeric surface to etch, whereby, Engineering of removing the region of the first elastomeric layer not covered by the reaction pattern of the photoresist was ;および反応したフォトレジスト材料のパターンに対応するエラストマー層のパターンを置いておく工程。 ; And reacted photoresist material step can place a corresponding pattern of the elastomeric layer to the pattern of. 本方法の特定の好ましい実施形態は、反応したフォトレジスト材料のパターンを除去する工程を有すること;除去する工程がエラストマー層の表面に接着テープを適用することによって引き起こされ、次いで、反応したフォトレジスト材料のパターンのいくつかまたは全てがエラストマー層の表面から除去される間に、エラストマー層から接着テープを分離すること;SU8であるフォトレジストを有すること;エッチング試薬が、テトラブチルアンモニウムフルオライド三水和物を含むこと;孔である特徴を有すること;一緒に結合した複数のエラストマー層を含むエラストマーブロックを有することであって、2つ以上のエラストマー層がその中に形成された凹部を有し、一つのエラストマー層の一つの凹部が、孔を介して別のエラスト Certain preferred embodiments of the method, the reacted photoresist material that has a step of removing the pattern of; caused by applying an adhesive tape to a surface of the step Gae elastomer layer to be removed, then reacted Images it has a photoresist is SU8;; while some or all of the pattern of the resist material is removed from the surface of the elastomeric layer, separating the adhesive tape from the elastomeric layer etching reagent, tetrabutyl ammonium fluoride three it has a feature is a hole; include hydrates a to have an elastomeric block including a plurality of elastomeric layers bonded together, have a recess in which two or more elastomeric layers formed therein and, one recess of one elastomeric layer is different elastography through the hole ー層の凹部と連絡することを包含する。 It involves communicating with the recess of the over layer.

本発明の微小流体デバイスは、Ungerにより2004年3月29日に出願された、係属中の共同所有する米国特許出願番号第60/557,715号に記載されるキャリアデバイスにさらに組み込まれ得、この特許出願は、全ての目的で本明細書中に援用される。 The microfluidic devices of the present invention, filed on March 29, 2004 by Unger, further incorporated obtained carrier devices described in U.S. Patent Application Serial No. 60 / 557,715 to co-owned pending, this patent application is incorporated herein for all purposes. Ungerのキャリアは、オンボード継続流体圧を提供し、バルブ閉塞を流体圧(例えば、ハウス気圧)の供給源から離れて維持する。 Carrier of Unger provides on-board continuous fluid pressure, the valve closure fluid pressure (e.g., house pressure) to keep away from the source. Ungerは、その中に記載されるとおり本発明のバルブを荷電し、作動するための自動化システムをさらに提供する。 Unger is charged the valve of the present invention as described therein, yet provides an automated system for operating. 別の好ましい実施形態では、アキュムレーターを負荷し、バルブを作動するための自動化システムは、微小流体デバイスの一つ以上の表面に対して対合する圧盤を有するデバイスを使用し、この圧盤は、制御された真空もしくは加圧供給源と流体連通する少なくとも二つ以上のポートを備え、微小流体デバイスの操作部分のための機械的部分(例えば、チェックバルブが挙げられるが、これらに限定されない)を備え得る。 In another preferred embodiment, the accumulator is loaded, automated system for actuating the valve, using Lud devices that have a platen to which pair against one or more surfaces of the microfluidic device, the platen is provided with at least two ports for vacuum or pressurized supply fluid communication with a controlled, mechanical parts for the operation portions of the microfluidic device (e.g., including but check valve, limited to nOT) can comprise a be.

本発明の別の局面は、エラストマーブロック、キャリアを安定化するための基板としての使用を提供し、好ましくは、以下の特徴の一つ以上を有する:キャリア内またはキャリアとともに形成された少なくとも一つのチャネルを通してエラストマーブロックと流体連通するウェルまたはレザバ;キャリア内またはキャリアとともに形成された少なくとも一つのチャネルを通してエラストマーブロックと流体連通するアキュムレーター;およびエラストマーブロックと流体連通する流体ポートであって、好ましくは真空または加圧の自動化供給源(例えば、上記の自動化システム)にアクセス可能である流体ポート、ここで、この自動化供給源は、流体ポートと対合したポートを有する圧盤をさらに備え、自動化システムの間に別個の流体連通 Another aspect of the present invention, elastomeric block, a carrier provides the use as a substrate for stabilizing preferably has one or more of the following features: at least one formed with the carrier or carriers at least one accumulator is elastomeric block fluid communication through the channel formed with the carrier or carriers; well or reservoir in fluid communication with the elastomeric block through the channel a and an elastomeric block and a fluid port in fluid communication, preferably vacuum or automated source of pressurized (e.g., the automation system) fluid port is accessible, wherein the automated source, further comprising a platen having a port that engages a pair fluid port, while the automation system separate fluid communication with the 形成し、流体圧または真空をエラストマーブロックに適用する。 Formed, to apply fluid pressure or vacuum to the elastomeric block. 特定の実施形態において、自動化供給源は、アキュムレーター内に維持された圧力を増加させるおよび減少させるためにキャリアと連結する一つ以上のアキュムレーターとの流体連通を作製し得る。 In certain embodiments, the automated source can produce a fluid communication with the one or more accumulators for connecting the carrier in order to make and reduce increased pressure maintained within the accumulator. 特定の実施形態において、キャリアはさらに、微小流体デバイスと接触するキャリアの範囲内に位置する領域をさらに備え得、その領域は、キャリアの別の部分とは異なる材料から作製され、その領域の材料は、改良した熱伝導およびキャリアの他の部分とは異なる分布特性に関して選択される。 In certain embodiments, the carrier further further comprise a region located within the carrier in contact with the microfluidic device, the region is made of a different material than the other portions of the carrier, the material of the region It is selected for different distribution characteristics and improved thermal conduction and other portions of the carrier. 改良した熱伝導および分布に対する好ましい材料としては、シリコーンが挙げられるが、これに限定されず、好ましくは、高度に磨いたシリコン (例えば、半導体分野で磨いたウエハとまたはウエハから切断した部分(例えば、チップ)として利用可能な型のシリコン )が挙げられる。 Preferred materials for improved thermal conduction and distribution, including but silicone is not limited thereto, preferably, highly polished silicon (e.g., cut from the wafer and or wafer polished in the semiconductor field portion ( for example, chips) available types of silicon) can be mentioned as.

本発明の別の局面は、熱供給源(例えば、PCRサーモサイクラーであるが、これに限定されない)を使用することを提供し、この熱供給源は、元の製造された状態から改変され得、その熱供給源は、キャリアの部分と対合し得る熱的に調節された部分、好ましくはキャリアの熱伝導部分および熱分配部分を有し、それによりキャリアの熱伝導部分および熱分配部分を介してエラストマーブロックを温度制御する。 Another aspect of the present invention can heat source (e.g., is a PCR thermocycler, but not limited to) providing the use of this heat source is modified from its original manufactured state , the heat source is thermally regulated portion that can engage part paired with the carrier preferably has a thermal conductivity portion and a heat distribution portion of the carrier, thereby the heat conduction portion and heat distribution portion of the carrier controlling the temperature elastomeric block through. 好ましい実施形態において、熱接触は、 真空の供給源を熱供給源の熱調節された部分内に形成される一つ以上のチャネルに適用することにより改善され、そのチャネルは、キャリアの熱伝導部分および熱分配部分の表面に接触するように形成され、キャリアの熱伝導部分および熱分配部分に吸引を適用し、それらの位置を維持する。 In a preferred embodiment, thermal contact is improved by applying a source of vacuum to the one or more channels formed in the heat regulated portion of the thermal source, the channel, the heat conduction portion of the carrier and it is formed so as to contact the surface of the heat distribution portion, applying suction to the heat conduction portion and the heat distribution portion of the carrier, to maintain their position. 好ましい実施形態において、キャリアの熱伝導部分および熱分配部分は、キャリアと物理的に接触していないが、熱伝導部分および熱分配部分をエラストマーブロックのみに添付し、熱伝導部分および熱分配部分の縁を取り囲むギャップを配置することによりキャリアによる過流の(parasitic)温度効果を減少させることにより、そのキャリアおよびエラストマーブロックと結合している。 In a preferred embodiment, the thermal conductivity portion and heat distribution portion of the carrier is not the carrier in physical contact, the heat conduction portion and the heat distribution portion attached only to the elastomeric block, the thermally conductive portion and the heat distribution portion by reducing the (parasitic) temperature effect of the vortex due to carrier by arranging a gap surrounding the edge is bonded to the carrier and the elastomeric block. 本明細書中に記載される本発明の多くの局面において、好ましいエラストマーブロックは、本明細書中には記載されない当該分野の任意の公知の微小流体デバイスと取り替えることができることを理解すべきであり、そのデバイスとしては、例えば、Affymetrix(R)、Santa Clara、California、USAのGene Chip(R)またはCaliper of Mountain View、California、USAのGene Chip(R)が挙げられる。 In many aspects of the present invention described herein, the preferred elastomeric block should be understood that can be replaced with any known microfluidic devices in the art that are not described herein as that device, e.g., Affymetrix (R), Santa Clara, California, Gene Chip (R) or Caliper of Mountain View of USA, California, USA of Gene Chip (R) and the like. Soane、Parce、Fodor、Wilding、Ekstrom、QuakeまたはUngerに発行された米国特許は、熱的な利点および改良点(例えば、吸引の位置、エラストマーブロックの使用との関連で上記の流体デバイスの他の領域への過流熱伝導の減少)を利用して、本発明のエラストマーブロックと取替えられ得る微小流体デバイスまたは中規模の流体デバイスを記載する。 Soane, Parce, Fodor, Wilding, Ekstrom, issued U.S. patents to Quake or Unger, thermal advantages and improvements (e.g., the position of the suction, in the context of the use of elastomeric block other of said fluid device by utilizing the reduction of excessive flow heat conduction) to the area, it describes a microfluidic device or medium fluidic device may be replaced with the elastomer block of the present invention.

(B.例示的な設計および使用) (B. Exemplary design and use)
図1Aは、一つの例示的なマトリクスデバイスの例証を提供する。 Figure 1A provides an illustration of one exemplary matrix device. このデバイス100は、7個の垂直なフローチャネル102および7個の水平なフローチャネル104を備え、これらは交差し、49個の異なる交差点のアレイすなわち反応部位106を形成する。 This device 100 comprises seven vertical flow channels 102 and seven horizontal flow channels 104, they intersect to form an array i.e. reaction sites 106 of 49 different intersections. 従って、この特定のデバイスは、7個のサンプルが、7個の異なる試薬または試薬のセットと反応することを可能にする。 Thus, this particular device, seven samples, allowing to react with a set of seven different reagents or reagent. 垂直な向きの溶液の流れを調節する行バルブ110は、単一の注入口114で全て作動され得る制御チャネル118により制御され得る。 Line valve 110 to regulate the flow of a solution of vertical orientation may be controlled by a control channel 118 that can be operated all at a single inlet 114.

同様に、列バルブ108は、水平な向きの溶液の流れを調節し;これらは、単一コントロール注入口112により作動される制御チャネル116により制御される。 Similarly, the column valve 108 regulates the flow of the solution in the horizontal orientation; these are controlled by a control channel 116 which is operated by a single control inlet 112. 図1Aに示すように、列バルブ108を調節する制御チャネル116は、その位置によって幅が変動する。 As shown in FIG. 1A, the control channel 116 to adjust the column valve 108 is wide by its position varies. 制御チャネル116が、垂直フローチャネル102と交差する場合、制御チャネル116は、作動する場合、垂直フローチャネル102を通る溶液の流れを実質的に減少させるように垂直フローチャネル102に偏向しないように十分に細い。 Control channel 116, to intersect the vertical flow channels 102, the control channel 116, when operating, so as not to deflect the flow of solution through the vertical flow channels 102 to the vertical flow channel 102 so as to substantially reduce sufficiently thin to. しかし、制御チャネル116の幅は、制御チャネル116が一方の水平フローチャネル104の上にある場合、増加し、このことにより、制御チャネルの膜は、水平フローチャネル104を通る溶液の流れをブロックするように十分に大きくされる。 However, the width of the control channel 116, when the control channel 116 is on the one horizontal flow channel 104, increases, Thus, the membranes of the control channel blocks the flow of solution through the horizontal flow channels 104 It is large enough to.

作動中は、試薬R1〜R7は、そのそれぞれの水平フローチャネル104に導入され、サンプルS1〜S7は、そのそれぞれの垂直フローチャネル102に注入される。 In operation, reagents R1~R7 is introduced into their respective horizontal flow channels 104, sample S1~S7 are injected into their respective vertical flow channels 102. 従って、水平フローチャネル104内の試薬は、交差点106で垂直フローチャネル102のそれぞれのサンプルと混合され、この特定のデバイスにおいて、この交差点106は、ウェルまたはチャンバの形状である。 Thus, the reagent in the horizontal flow channels 104 are mixed with each sample of vertical flow channels 102 at an intersection 106. In this particular device, the intersection 106 is in the form of wells or chambers. 従って、核酸増幅反応の特定の場合において、例えば、増幅反応に必要な試薬は、水平フローチャネル104のそれぞれに導入される。 Thus, in the specific case of a nucleic acid amplification reaction, for example, reagents required for the amplification reaction are introduced into each of the horizontal flow channels 104. 種々の核酸テンプレートが、垂直フローチャネル102に導入される。 Various nucleic acid template is introduced into the vertical flow channels 102. 特定の分析において、水平フローチャネル104のそれぞれに導入される試薬混合物の一部として導入されるプライマーは、フローチャネル間で異なり得る。 In certain analyzes, the primer introduced as part of the reagent mixture that is introduced into each of the horizontal flow channels 104 may vary between the flow channel. このことは、各核酸テンプレートが、多数の異なるプライマーと反応することを可能にする。 This is the nucleic acid template and allowed to react with a number of different primers.

図1B〜Eは、デバイスが分析の間にどのように作動するかをより詳細に図示するために、図1Aに示されるデバイスの隣接する反応部位の拡大した平面図を示す。 FIG 1B~E is to illustrate how the device operates during the analysis in more detail, shows an enlarged plan view of adjacent reaction sites of the device shown in Figure 1A. 明瞭性の目的のために、交差点106は、反応ウェルの形状で示されず、制御チャネル116、118は省略され、行および列バルブ110、108のみが示される(長方形)。 For purposes of clarity, the intersection 106 is not shown in the shape of the reaction well, the control channel 116, 118 is omitted, only the row and column valves 110, 108 are shown (rectangular). 図1Bに示されるように、分析は、行バルブ110を閉鎖し、列バルブ108を開放して水平なフローチャネル104を通る溶液の流れを可能にし、一方で垂直フローチャネル102を通る流れをブロックすることにより開始される。 As shown in FIG. 1B, analysis line valve 110 is closed, allowing the flow of solution through the horizontal flow channel 104 by opening the sequence valve 108, while blocking flow through the vertical flow channels 102 It is initiated by. 次いで、試薬R1は、水平フローチャネル104に導入され、水平フローチャネル104の全長に渡って完全に流れ、従って全ての反応部位106が満たされる。 Then, reagent R1 is introduced in a horizontal flow channel 104, completely flows over the entire length of the horizontal flow channels 104, so that all the reaction sites 106 are filled. 水平チャネル104を通した溶液の流れは、外部ポンプにより達成され得るが、より代表的には、例えば、Ungerら、(2000)Science 288:113〜116およびPCT公開WO01/01025号に詳細に記載されるように、ぜん動ポンプをエラストマーデバイス自体の中に組み込むことにより達成される。 The flow of the solution through the horizontal channel 104, but may be accomplished by an external pump, more typically, for example, Unger et al., (2000) Science 288: 113~116 and PCT described in detail in Patent Publication WO01 / 01025 as will be, it is achieved by incorporating a peristaltic pump into the elastomeric device itself.

一旦R1が、導入されると、列バルブ108が閉鎖され、行バルブ102が開放される(図1Cを参照のこと)。 Once R1 is introduced, is closed the column valve 108, the line valve 102 is opened (see FIG. 1C). このことは、サンプルS1およびS2が垂直フローチャネル102に導入され、そのそれぞれのフローチャネルを通って流れることを可能にする。 This sample S1 and S2 is introduced into the vertical flow channels 102, it enables the flow through the respective flow channels. サンプルが垂直フローチャネル102を通って流れるときに、R1を反応部位106から排出し、従って、サンプルを反応部位106に置いたままにする。 When the sample flows through the vertical flow channels 102, and discharged R1 from the reaction sites 106, thus, to leave the sample to the reaction site 106. 次いで、図1Dに示すように、列バルブ108は開放され、S1およびS2が拡散し、R1と混合することを可能にする。 Then, as shown in FIG. 1D, column valve 108 is opened, S1 and S2 are diffused, it makes it possible to mix with R1. 従って、サンプルと反応物との混合物(R1S1およびR1S2)が各交差点の領域、すなわち反応部位106で得られる。 Accordingly, the mixture of sample and reactant (R1S1 and R1S2) the area of ​​each intersection, i.e. obtained by the reaction sites 106. S1およびS2がR1とともに拡散するために十分な時間を可能にした後、全ての列バルブ108および行バルブ110が閉鎖され、そのそれぞれの反応部位106の領域内のS1およびS2を分離し、S1およびS2の混合を防止する(図1Eを参照のこと)。 After S1 and S2 is to allow sufficient time to diffuse together with R1, all columns valve 108 and line valve 110 is closed to separate the S1 and S2 in the region of their respective reaction sites 106, S1 and to prevent mixing of S2 (see FIG. 1E). 次いで、混合物は反応することが可能となり、その反応物は、交差点106または交差点106を含む交差した形状の領域をモニタリングすることにより検出される。 Then, the mixture will be able to react, the reaction is detected by monitoring the area of ​​the cross-shape including an intersection 106 or the intersection 106. 加熱(例えば、増幅反応の間の熱サイクリング)を必要とする分析のために、デバイスは、ヒーター上に配置され、サンプルが分離されたままである間加熱される。 Heating (e.g., thermocycling during amplification reactions) for analysis that requires the device is placed on the heater, the sample is heated while it remains isolated.

図1Aに示すデバイスの改変版が、図1Fに示されている。 Modified version of the device shown in FIG. 1A is shown in Figure 1F. 一般的な構造は、図1Aに示した構造と多くの類似点を有し、両方の図に共通の要素は、同じ参照番号を共有する。 The general structure, the common elements to the structure and has many similarities, both figures shown in FIG. 1A, share the same reference numbers. 図1Fに図示されるデバイス150は、共通の注入口124に結合する水平フローチャネル104の対である点が異なる。 Device 150 illustrated in FIG. 1F, the point is a pair of horizontal flow channels 104 that binds to a common inlet 124 is different. このことは二組の試薬が、注入口124への単一の注入のみを備える2つの隣接するフローチャネルに導入されることを本質的に可能とする。 This is two sets of reagents, and essentially allowing it to be introduced into two adjacent flow channels with a single injection only to inlet 124. 共通の注入口の使用は、垂直フローチャネル102に関してさらに拡張される。 Use of a common inlet is further extended with respect to the vertical flow channels 102. この特定の例において、各サンプルは、サンプル注入口120への単一の注入を備える5つの垂直フローチャネル102に導入される。 In this particular example, each sample is introduced into five vertical flow channels 102 with a single injection into sample inlet 120. 従って、この特定のデバイスには、サンプルおよび試薬の各特定の組合せに対する10個の繰り返された反応が本質的に存在する。 Thus, this particular device, the reaction was repeated with 10 for each particular combination of sample and reagent are present essentially. 当然のことながら、繰り返された反応の数は、共通の注入口120、124に接続された垂直フローチャネル102および/または水平フローチャネル104の数を変更することにより所望のとおり変化され得る。 Of course, the number of repeated reaction can be varied as desired by changing the number of vertical flow channels 102 and / or horizontal flow channels 104 connected to a common inlet 120, 124.

図1Fに示すデバイスはまた、排出口132に対する溶液の流れを制御するために使用され得る制御チャネル130を調節する別個の制御チャネル注入口128、および排出口136への溶液の流れを調節する制御チャネル134を制御する別の制御チャネル注入口132を備える。 Device is shown in FIG. 1F also control to adjust the flow of the solution into a separate control channel inlet 128, and outlet 136 for adjusting the which can control channel 130 is used to control the flow of the solution for the discharge port 132 comprising a separate control channel inlet 132 that controls the channel 134. さらに、デバイス150は保護チャネル138を取り込む。 Furthermore, the device 150 captures the protection channel 138. この特定の設計において、保護チャネル138は、制御チャネル116の一部として形成される。 In this particular design, the protection channel 138 is formed as part of the control channel 116. 上に示したように、保護チャネル138は、列バルブ108より小さく;結果的に保護チャネル138の膜は、溶液の流れが中断されるように下層にある水平フローチャネル10 4に偏向されない。 As indicated above, the protection channel 138 is smaller than the column valve 108; consequently film protection channel 138, the flow of the solution is not deflected to the horizontal flow channels 104 in the lower layer so as to interrupt.

最後に、図1Fに示す設計物は、反応が、水平フローラインと垂直フローラインとの交差点のウェル中で生じるというものでなく、交差点自体の中では生じるという点で異なっている。 Finally, the design object shown in FIG. 1F, the reaction is not intended that arise in the intersection of the horizontal flow line and vertical flow line well, with the difference that occurs in the intersection itself.

(V.ブラインドチャネルの設計) (Design of V. blind channel)
(A.概略) (A. outline)
ブラインドチャネル設計を利用するデバイスは、特定の特徴を有する。 Devices utilizing the blind channel design have certain features. 第一に、そのデバイスは、一つ以上のブラインドチャネルが枝分かれする一つ以上のフローチャネルを備える。 First, the device comprises one or more flow channels in which one or more blind channels is branched. 上に示したように、このようなチャネルの末端領域は、反応部位としての役目を果たし得る。 As indicated above, end region of such channels can serve as reaction sites. フローチャネルの上に置くことにより形成されるバルブは、ブラインドチャネルの末端で反応部位を分離するために作動され得る。 Valve that is formed by placing on top of the flow channel can be actuated to isolate the reaction site at the end of the blind channel. バルブは、反応部位を切替可能に分離するための機構を提供する。 Valve provides a mechanism for the reaction site switchably separated.

第二に、ブラインドチャネルと連絡するフローチャネルネットワークは、全てもしくはほとんどの反応部位が単一または限られた数(例えば、5個未満または10個未満)の注入口で満たされ得るように構成される。 Second, the flow channel network in communication with the blind channels, all or most of the reaction site a single or a limited number (e.g., less than five or fewer than 10) is configured to be filled with the injection port that. ブラインドフローチャネルを満たす能力は、そのデバイスがエラストマー材料から作製されるので、可能になる。 Ability to meet the blind flow channels, because the device is fabricated from an elastomeric material, becomes possible. エラストマー材料は、十分に多孔性であり、従ってフローチャネルおよびブラインドチャネル内の空気は、溶液がチャネル内に導入されるときにこれらの孔を通って漏れ出ることが可能である。 Elastomeric material is sufficiently porous, air thus flow channels and blind in the channel, it is possible to leak through these holes when the solution is introduced into the channel. 他の微小流体デバイスで利用される材料の多孔性がないことにより、ブラインドチャネル設計の使用を不可能にする。 The absence porous materials utilized in other microfluidic devices, precludes use of the blind channel design. これは、通気口がどこか流体の経路に沿って提供されない限り溶液が注入される場合ブラインドチャネル内の空気が、決して漏れ出ないためである。 This is because the air in case the blind channel vent somewhere solution unless provided along the path of the fluid is injected, not appear in any way leakage.

第三の特徴は、一つ以上の試薬が、製造の間に反応部位内のエラストマーの基部層上に非共有結合的に配置されていることである(製造プロセスのさらなる詳細については以下を参照のこと)。 The third feature is one or more reagents, see below further details of that in which (manufacturing processes that are non-covalently disposed on the base layer of the elastomer within the reaction sites during manufacture of it). 試薬は、非共有結合的に結合される。 Reagents are non-covalently bound. なぜならば、試薬は、サンプルが反応部位に導入されるときに溶解するように設計されるからである。 Because the reagent is because the sample is designed to dissolve when introduced into the reaction site. 分析の数を最大にするために、種々の反応物または反応物のセットが、異なる反応部位のそれぞれに配置される。 The number of analyzes in order to maximize the variety of reaction monomers other set of reactants is disposed in each of the different reaction sites.

特定のブラインドチャネルデバイスは、反応部位がアレイの形態で配置されるように設計される。 Certain blind channel devices, the reaction site is designed to be placed in the form of an array.

従って、核酸増幅反応を行なうために設計されるブラインドチャネルデバイスにおいて、例えば、伸長反応を行なうために必要な一種以上の試薬が、デバイスの製造の間に各反応部位に配置される。 Thus, the blind channel devices are designed to perform a nucleic acid amplification reaction, for example, one or more reagents required to perform the extension reaction, are arranged in each of the reaction sites during manufacture of the device. このような試薬としては、例えば、以下の内の全てまたはいくつかが挙げられる:プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子、金属イオン、緩衝液、介在性色素など。 Examples of such reagents include, for example, all or some of the following: primers, polymerase, nucleotides, cofactors, metal ions, buffers, etc. mediated dye. ハイスループット分析を最大にするために、DNAの異なる領域を増幅するために選択される異なるプライマーが、各反応部位に配置される。 To high-throughput analysis of the maximum, different primers are selected to amplify different regions of DNA, it is located at each reaction site. 結果的に、核酸テンプレートが注入口を介して反応部位に導入される場合、多数の伸長反応が、テンプレートの異なるセグメントで実行され得る。 Consequently, if the nucleic acid template is introduced into the reaction sites via inlet, a large number of extension reactions can be performed at different segments of the template. 増幅反応に必要な熱サイクリングは、デバイスを熱サイクリングプレート上に配置し、種々の必要な温度の間でデバイスをサイクリングすることにより達成され得る。 Thermal cycling required for the amplification reaction, the device was placed on a thermal cycling plate, may be achieved by cycling the device between the various required temperatures.

試薬は、種々の方法で固定され得る。 Reagents can be secured in a variety of ways. 例えば、いくつかの例において、一種以上の試薬が、非共有結合的に反応部位に配置されるが、他の例においては、一種以上の試薬が、その反応部位で基板に共有結合される。 For example, in some instances, the one or more reagents, but is arranged non-covalently reactive site, in other examples, one or more reagents is covalently attached to the substrate at the reaction site. 共有結合する場合、試薬は、リンカーを介して基板に結合され得る。 If covalently attached, the reagents can be attached to the substrate via a linker. 種々のリンカー型(例えば、光化学/感光性リンカー、熱不安定性リンカーおよび酵素により切断され得るリンカーなど)が利用され得る。 Various linker type (e.g., such as photochemical / photolabile linkers, linkers that can be cleaved by heat-labile linkers and enzymes) may be utilized. いくつかのリンカーは、二機能性(すなわち、そのリンカーは、各末端に機能性基を含み、それは、リンカーが結合すべき成分上に位置する基と反応性である)であり、その各末端の機能性基は、同じであっても異なっていてもよい。 Some linkers are bifunctional (i.e., the linker comprises a functional group at each end, it is the linker is reactive with groups located on the components to be coupled), and that each end functional groups can be different even for the same. いくつかのアッセイで使用され得る適切なリンカーの例としては、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、複素環リンカーおよびペプチドリンカーが挙げられる。 Some examples of suitable linkers that can be used in the assay, carbon linkers straight or branched chain, and a heterocyclic linkers and peptide linkers. 種々の型のリンカーが、Pierce Chemical Company、Rockford、Illinoiから入手可能であり、EPA188,256号、米国特許第4,671,958号;同第4,659,839号、同第4,414,148号、同第4,669,784号、同第4,680,338号、4,569,789号、および4,589,071号、およびEggenweiler,H. Various types of linker, Pierce Chemical Company, available Rockford, from Illinoi, No. EPA188,256, U.S. Pat. No. 4,671,958; Nos 4,659,839, the first 4,414, 148 items, the No. 4,669,784, the No. 4,680,338, No. 4,569,789, and No. 4,589,071, and Eggenweiler, H. M. M. による、Pharmaceutical Agent Discovery Today 1998、3、552に記載されている。 According to, it is described in Pharmaceutical Agent Discovery Today 1998,3,552. NVOC(6ニトロベラトリルオキシカルボニル)リンカーおよび他のNVOC関連リンカーは、適した光化学リンカーの例である(例えば、WO90/15070およびWO92/10092を参照のこと)。 NVOC (6 nitroveratryloxycarbonyl) linkers and other NVOC-related linkers are examples of suitable photochemical linkers (see, e.g., WO90 / 15070 and WO92 / 10092). プロテアーゼ切断部位を有するペプチドは、例えば、米国特許第5,382,513号に考察される。 Peptide with a protease cleavage site, for example, is discussed in U.S. Patent No. 5,382,513.

図2は、ブラインドチャネル設計を利用する一つの例示的なデバイスの単純化した平面図である。 Figure 2 is a simplified plan view of one exemplary device utilizing the blind channel design. デバイス200は、エラストマー基板202内に形成されるフローチャネル204およびそこから枝分かれする一組の分岐フローチャネル206を備える。 Device 200 includes a set of branch flow channels 206 to flow channels 204 and branched therefrom are formed within an elastomeric substrate 202. 各分岐フローチャネル206は、反応部位208で終結し、それによって反応部位のアレイを形成する。 Each branch flow channel 206 terminates in a reaction site 208, thereby forming an array of reaction sites. 膜212によって分岐フローチャネル206から分離される制御チャネル210は、分岐フローチャネル206の上に置く。 Control channel 210 that is separated from the branch flow channels 206 by membranes 212, placed on a branch flow channel 206. 制御チャネル210の作動は、膜212を分岐フローチャネル206内に偏向させ(すなわち、バルブとして機能させるため)、従って、反応部位208のそれぞれが他の反応部位から分離されることを可能にする。 Operation of the control channel 210, to deflect the membrane 212 to the branch flow channels 206 (i.e., to function as a valve), thus allowing the respective reaction sites 208 are separated from the other reaction sites.

このようなデバイスの操作は、試験サンプルをフローチャネル204内に注入し、その後溶液を分岐チャネル206のそれぞれに流す工程を包含する。 Operation of such a device, the test sample was injected into the flow channel 204, including the step of flowing after which the solution in each of the branch channels 206. 一旦サンプルが各分岐チャネル206を満たすと、制御チャネル210が作動し、バルブ/膜212の活性化を引き起こし、分岐チャネル206内に偏向させ、それにより各反応部位208を密閉する。 Once the sample fills each branch channel 206, control channel 210 is actuated, causing the activation of the valve / membrane 212 to deflect into branch channels 206, thereby sealing the respective reaction sites 208. サンプルが、反応部位208内に流入し、その中に留まるので、サンプルは反応部位208のそれぞれにおいて事前にスポットされた試薬を溶解する。 Sample flows into the reaction site 208, since stays therein, the sample dissolves the reagents spotted previously in each of the reaction sites 208. 一旦溶解すると、その試薬は、サンプルと反応し得る。 Once dissolved, the reagents may react with the sample. バルブ212は、拡散することにより、各反応部位208で溶解した試薬が混合することを防止する。 Valve 212, by spreading, to prevent the reagents dissolved in the reaction site 208 from mixing. 次いで、サンプルと試薬との間の反応が、代表的に反応部位208内で検出される。 Then, the reaction between the sample and the reagent is detected in the typical reaction sites 208. 反応は、必要に応じて以下の温度制御の節に記載されるように加熱され得る。 The reaction may optionally be heated as described in the section of the temperature control described below.

図3Aは、多少複雑な複合体ブラインドフローチャネル設計の例を例証する。 Figure 3A illustrates an example of a less complex conjugate blind flow channel design. この特定の設計物300において、1セットの水平フローチャネル304のそれぞれは、各末端で2つの垂直フローチャネル302と接続する。 In this particular design object 300, each of a set of horizontal flow channels 304, connecting the two vertical flow channels 302 at each end. 複数の分岐フローチャネル306は、水平フローチャネル304のそれぞれから延びている。 A plurality of branch flow channels 306 extend from each of the horizontal flow channels 304. この特定の設計物における分岐フローチャネル304は、交互に配置され、従って、任意の所定の水平フローチャネル304に取り付けられた分岐チャネル306は、水平フローチャネル304に直接隣接して結合する2つの分岐チャネル306の間に配置されるか、またはフローチャネル304および垂直フローチャネル302の一方に直接隣接して結合する分岐フローチャネル306の間に配置される。 Branch flow channels 304 in this particular design thereof are arranged alternately, thus, the branch channel 306 attached to any given horizontal flow channel 304, the two binding immediately adjacent to the horizontal flow channels 304 branch It is disposed between the branch flow channels 306 which is attached directly adjacent to one of either disposed between the channel 306 or flow channel 304 and the vertical flow channels 302,. 図3Aに示される設計物と同様に、各分岐フローチャネル302は、反応部位308内で終結する。 Similar to the design thereof shown in FIG. 3A, each branch flow channel 302 terminates in the reaction site 308. また、図3Aに示す設計物と一致して制御チャネル310は、それぞれの分岐チャネルの上に置き、膜312によって下にある分岐チャネルから分離される。 The control channel 310 consistent with the designed object shown in FIG. 3A is placed on a respective branch channels and is separated from the branch channels at the bottom by a membrane 312. 制御チャネルは、ポート316で作動する。 Control channel operates in a port 316. 垂直フローチャネル302および水平フローチャネル304は、相互接続され、従って、サンプルの注入口314への注入は、水平フローチャネルと垂直フローチャネルとのネットワークを通る溶液の流れを可能にし、最終的に分岐フローチャネル306を介した反応部位308のそれぞれへの流れを可能にする。 Vertical flow channels 302 and horizontal flow channels 304 are interconnected, therefore, injected into the sample inlet 314 allows the flow of solution through the network between the horizontal flow channel and vertical flow channels, ultimately branched to allow flow to the respective reaction sites 308 via the flow channel 306.

従って、作動中、サンプルは、注入口に注入され、溶液を各反応部位に導入する。 Thus, in operation, sample is injected into inlet to introduce solution into each reaction site. 一旦反応部位が満たされると、バルブ/膜が作動し、制御チャネルをポートにて加圧することにより反応部位内に溶液を捕捉する。 Once the reaction sites are filled, valves / membranes are actuated, the solution to trap into the reaction sites by pressurizing the control channels at port. 事前に反応部位内に配置された試薬は、反応部位内に再懸濁され、それにより各反応部位内に配置された試薬とサンプルとの間の反応が可能になる。 Pre reagent disposed within the reaction sites are resuspended within the reaction sites, reaction becomes possible between the arranged reagent and sample within each reaction site thereby. 反応部位内での反応は、検出器によりモニタリングされる。 Reaction in the reaction sites are monitored by a detector. 先と同様に、反応は、必要に応じて以下の温度制御の節に示す方法に従って制御可能に加熱される。 Again, the reaction is controllably heated according to the method shown as required in the section of the temperature control described below.

図3Aに例証される一般的設計物のさらにより複雑なバージョンが、図3Bに示される。 Complex version An even more general design thereof which is illustrated in Figure 3A is shown in Figure 3B. 図3Bに示されるデバイスは、図3Aに示される水平の分岐フローチャネル302の組織化単位が複数回繰り返されるデバイスである。 Device shown in FIG. 3B is a device that organizing units of horizontal branch flow channels 302 shown in FIG. 3A are repeated a plurality of times. 図3Bに示されるデバイスは、加熱(例えば、熱サイクリング)を含む適用に利用されるデバイスに保護チャネル320を備えることをさらに例証する。 Device shown in FIG. 3B, heating (e.g., thermocycling) further illustrates that the devices utilized in applications involving a protective channel 320. 保護チャネル320のフローチャネル304および分岐チャネル306に対する例示的な配向は、図3Bの右のパネルに示される拡大図に示される。 Exemplary orientation for the flow channels 304 and branch channels 306 of the protection channel 320 is shown in the enlarged view shown in the right panel of Figure 3B. 保護チャネル320は、分岐フローチャネル306および反応部位308の上に置く。 Protection channel 320 is placed on the branch flow channels 306 and reaction sites 308. 上に議論したように、水は、デバイス300の加熱の間に保護チャネル320を通して流れ、デバイス内の水の局所的な濃度を増加させ、それによって、フローチャネル306内および反応部位308内の溶液からの水の蒸発を減少させる。 As discussed above, the water flows through the guard channels 320 during heating of the device 300, to increase the local concentration of water in the device, the thereby flow channel and in the reaction sites 308 306 solution reduce evaporation of water from the.

この節の発端で議論したブラインドチャネルデバイスの特徴は、デバイスのフットプリントを最小化し、デバイス上に多数の反応部位が形成されることを可能にし、高密度が得られる。 Features of blind channel devices discussed at outset of this section minimizes the footprint of the device, and allows multiple reaction sites on the device is formed, a high density can be obtained. 例えば、2500個の反応部位を有するこの型のデバイスは、標準的な顕微鏡スライド(25mm×75mm)上に適合するように容易に製造され得る。 For example, this type of device having 2500 reaction sites can readily be manufactured to fit on a standard microscope slides (25mm × 75mm). 上述の特徴はまた、非常に高い密度の反応部位が、ブラインドチャネル設計を利用するデバイスを用いて得られることを可能にする。 Above features are also reactive site very high density, to be obtained with devices utilizing the blind channel design. 例えば、少なくとも50、60、70、80、90または100個の反応部位/cm 、またはその間の任意の整数の密度値が容易に得られ得る。 For example, at least 50,60,70,80,90 or 100 reaction sites / cm 2 or density value of any integer therebetween, can be readily obtained. しかし、特定のデバイスは、さらに高い密度範囲(例えば、100〜4000反応部位/cm またはその間の任意の整数の密度値)を有する。 However, certain devices have even higher densities range (e.g., the density value of any integer from 100 to 4000 reaction sites / cm 2 or between). 例えば、いくつかのデバイスは、少なくとも100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900または1000部位/cm の密度を有する。 For example, some devices have a density of at least 100,150,200,250,300,400,500,600,700,800,900 or 1000 sites / cm 2. 少なくとも2000、3000または4000部位/cm の非常に高密度を有するデバイスもまた入手可能である。 Device having at least 2000, 3000 or 4000 sites / cm 2 very dense also available. このような高密度は、直接デバイス上の非常に多数の反応部位と解釈される。 Such high density is interpreted as a large number of reactive sites on the device directly. ブラインドチャネル構造を利用するデバイスは、代表的に少なくとも10〜100個、またはその間の任意の整数の値の反応部位を有する。 Devices utilizing the blind channel structure, typically having a reactive site of at least 10 to 100, or any integer value therebetween. より代表的には、そのデバイスは、少なくとも100個〜1000個、またはその間の任意の整数の部位を有する。 More typically, the device comprises at least 100 to 1000, or from any integer sites therebetween. より高い密度のデバイスはさらにより多くの反応部位(例えば、少なくとも1,000〜100,000個の反応部位、またはその間の任意の整数の部位)を有し得る。 Higher density devices even more reactive sites (e.g., at least 1,000 to 100,000 pieces of reaction sites or any integer therebetween sites) may have. 従って、特定のデバイスは、デバイスの全体の大きさに依存して少なくとも100、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000または100,000個の反応部位を有する。 Accordingly, particular device, at least depending on the overall size of the device 100,500,1,000,2,000,3,000,4,000,5,000,6,000,7,000, 8,000,9,000,10,000,20,000,30,000,40,000,50,000 or having 100,000 reaction sites.

得られ得る多数の反応部位および密度はまた、非常に小さいウェルまたは穴を作る能力の結果である。 Multiple reaction sites and densities may be obtained it is also a result of the ability to make very small wells or holes. 例えば、穴またはウェルは代表的に50nL未満の体積を有し、他の例では、40nL未満、30nL未満、20nL未満または10nL未満の体積、なお他の例では、5nL未満または1nL未満の体積を有する。 For example, the hole or well has a volume of typically less than 50 nL, in another example, less than 40 nL, less than 30 nL, volume of less 20nL or less than 10 nL, In yet another example, the volume of the less 5nL than or 1nL a. 特定の例では、特定のデバイスは、長さ300ミクロン、幅300ミクロン、深さ10ミクロンのウェルを有する。 In a specific example, certain devices have a 300 micron length, width 300 microns and a depth of 10 microns well.

本明細書中に提供されるブラインドチャネルデバイスは、PCT/US01/44549(WO02/43615として公開される)およびPCT/US02/10875(WO02/082047として公開される)に考察される特定の設計の特徴および方法論を利用し得、それらとしては、例えば、デッドエンドチャネル(dead−ended channel)を満たすための戦略、液体プライミング、圧縮ガス放出プライミングならびに微小流体チャネルを満たす間にガスを置換するための種々の方法が挙げられる。 Blind channel devices provided herein, PCT / US01 / 44549 (WO02 / 43615 is published as) and PCT / US02 / 10875 particular design to be discussed (which published as WO02 / 082,047) utilizing features and methodology obtained, as they, for example, to meet the dead-end channels (dead-ended channel) strategy, liquid priming, for replacing the gas while satisfying the compressed gas release priming and microfluidic channel It includes various ways. これらのPCT公開は、両方ともその全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。 These PCT publication, both are incorporated by reference in their entirety herein for all purposes.

(VI.ハイブリッド設計) (VI. Hybrid design)
なお他のデバイスは、マトリクスのハイブリッドおよびブラインドフィル設計である。 Still other devices are hybrids and blind fill designs of the matrix. この型のデバイスの設計は、各水平フローチャネルがそれ自体のサンプル注入口ポートに接続し、水平フローチャネルが垂直フローチャネルを介して相互接続していないことを除いて、図3Aに示すブラインドチャネルデバイスに類似している。 The design of this type of device, each horizontal flow channel is connected to the sample inlet port of its own, with the exception that no interconnected horizontal flow channel through the vertical flow channels, blind channel shown in FIG. 3A It is similar to the device. 結果的に、任意の所定の水平フローチャネルに導入されたサンプルは、その水平フローチャネルおよびそれに接続する反応部位のみを満たす。 Consequently, the sample introduced into any given horizontal flow channel fills only reactive site to connect the horizontal flow channels and therewith its. それに対して、図3Aに示すブラインドフローチャネルデバイスにおいて、サンプルは、垂直フローチャネル302を介して水平フローチャネル304の間に流れ得る。 In contrast, in the blind flow channel device shown in FIG. 3A, sample can flow between the horizontal flow channels 304 via vertical flow channels 302.

この一般的なデバイスの例を図4に示す。 An example of this general device is shown in Figure 4. デバイス400は、複数の水平フローチャネル404を備え、そのぞれぞれは、そこから延びる複数の分岐フローチャネル406およびそれ自体のサンプル注入口414を有する。 Device 400 includes a plurality of horizontal flow channels 404, the respective, respectively includes a plurality of branch flow channels 406 and the sample inlet 414 itself extending therefrom. コントロール410は、分岐フローチャネル406のそれぞれの上におき、膜(バルブ)412は、下にある分岐フローチャネル406から制御チャネル410を分離する。 Control 410 is placed on each of the branch flow channels 406, membrane (valve) 412 separates the control channel 410 from the branch flow channels 406 at the bottom. ブラインドフローチャネル設計と同様に、注入口416にて制御チャネルの作動は、膜412の分岐フローチャネル406内への偏向および反応部位408の分離を引き起こす。 Like the blind flow channel design, actuation of the control channel at inlet 416 causes deflection and separation of reaction sites 408 into the branch flow channels 406 of the film 412. この設計のバリエーションにおいて、各水平フローチャネル404は、各末端に注入口414を備え得、従って、サンプルが両方の末端から導入されることを可能にする。 In a variation of this design, each horizontal flow channel 404 may comprise an inlet 414 at each end, thus allowing the sample is introduced from both ends.

いくつかの例において、試薬は、そのデバイスの製造の間に反応部位に配置される。 In some instances, reagents are placed in a reaction site during the manufacture of the device. このことは、そのマトリクスデバイスに必要とされる、時間を消費する試薬の添加を必要とすることなく、短い時間で比較的多数の反応条件下で多数のサンプルが試験されることを可能にする。 This is required to that matrix device, without requiring the addition of a reagent that consume time, number of samples to allow it to be tested in a relatively large number of reaction conditions in a short time . あるいは、反応混合物は、チップへの注入の前に調製され得る。 Alternatively, the reaction mixture can be prepared prior to injection into the chip. 一旦混合物が注入されると、それらは、分析され得るか、またはさらに処理され得る(例えば、加熱され得る)。 Once the mixture is injected, they can either be analyzed or can be further processed (e.g., can be heated).

種々のサンプルを水平フローチャネルのそれぞれに注入することにより、多数のサンプルが迅速に分析され得る。 By injecting different samples into each of the horizontal flow channels, a large number of samples can be rapidly analyzed. 試薬が反応部位に事前に配置されたと仮定すると、任意の所定の水平フローチャネルと結合した各反応部位での同じ試薬の存在は、各サンプルを用いた複数の反復反応を行なうための容易な方法を提供する。 When the reagent is assumed to have been arranged in advance to the reaction sites, the presence of the same reagent at each reaction site combined with any given horizontal flow channel, easy way to perform a plurality of iterations reaction with the sample I will provide a. その代わりに反応部位での試薬が任意の所定のフローチャネルに対して異なる場合、各サンプルは、本質的に同時に種々の異なる反応条件に暴露される。 If different reagents at the reaction site but instead for any given flow channel, each sample is essentially exposed to a variety of different reaction conditions at the same time.

従って、本明細書中に提供されるデバイスは、種々の異なる型の研究に対して特別に調整される。 Accordingly, devices provided herein, are specifically tailored for a variety of different types of studies. 研究がユーザーの制御した条件下で比較的多数の異なるサンプルのスクリーニングを含む(例えば、ユーザーの選択した100個の試薬に対して100個のサンプル)場合、マトリクスデバイスは、有用な溶液を提供する。 Research a relatively large number of different samples including screening under controlled conditions user (e.g., 100 samples against 100 reagent selected users), the matrix devices provide a useful solution . しかし、研究が広範な種々の反応条件下で一つ、または限られた数のサンプルの分析を含む場合(例えば、10,000個の反応条件に対して1個のサンプル)、ブラインドチャネル設計は、有用である。 However, if the study including analysis of one or a limited number of samples, a wide variety of reaction conditions (e.g., one sample against 10,000 reaction conditions), the blind channel design , it is useful. 最後に、試薬を注入することなく、規定の反応条件に対して比較的多数のサンプルを試験すること(例えば、事前に規定した100個の試薬に対して100個のサンプル)を望む場合、ハイブリッドデバイスは有用である。 If the last, without injecting a reagent, which wants to test a relatively large number of samples for prescribed reaction conditions (e.g., 100 samples against 100 reagent as defined previously), hybrid the device is useful.

(VII.温度制御) (VII. Temperature control)
(A.デバイスおよび構成要素) (A. Devices and components)
微小流体デバイスの選択された領域またはそのデバイス全体の温度を制御するために、種々の精巧さの多数の異なる選択肢が利用可能である。 To control the selected regions or overall temperature of the device of the microfluidic device, a number of different options of varying sophistication are available. 従って、本明細書中で使用される場合、用語温度コントローラーは、微小流体デバイス全体または微小流体デバイスの一部内(例えば、特定の温度領域内で、またはブラインドチャネル型微小流体デバイスのマトリクス内の一つ以上の接合部で)の温度を調節し得るデバイスまたは要素を広くいうことを意味する。 Thus, as used herein, the term temperature controller is within a portion of a microfluidic device in whole or microfluidic devices (e.g., one in the matrix at a particular temperature region or blind channel microfluidic device, One or more may regulate the temperature of the junction) meant to refer broadly to devices or elements.

一般的に、このデバイスは、デバイスを温度循環させるために、熱サイクリングプレート上に配置される。 Typically, the device, in order to temperature cycling the device, is arranged in thermal cycling plate. 種々のこのようなプレートが商業的供給源から容易に入手可能であり、例えば、ThermoHybaid Px2(Franklin,MA)、MJ Research PTC−200(South San Francisco,CA)、Eppendorf Part# E5331(Westbury,NY)、Techne Part# 205330(Princeton,NJ)が挙げられる。 Readily available variety of such plates are from commercial sources, for example, ThermoHybaid Px2 (Franklin, MA), MJ Research PTC-200 (South San Francisco, CA), Eppendorf Part # E5331 (Westbury, NY ), Techne Part # 205330 (Princeton, NJ), and the like.

アレイデバイスは、熱制御デバイスと接触し、従って、熱制御デバイスは、熱制御供給源と熱的に連絡し、少なくとも1つの反応チャンバ内の反応の温度が、熱制御供給源の温度の変化の結果として変化する。 Array device is in contact with the thermal control device, therefore, the thermal control device, contact a thermally thermal control source, the temperature of the reaction of at least one reaction chamber, the temperature of the thermal control source of variation change as a result.

異なる実施形態において、熱伝達デバイスは、半導体(例えば、シリコン )を含んでいてもよく、反射性材料を含んでいてもよく、そして/または金属を含んでいてもよい。 In different embodiments, the heat transfer device, a semiconductor (e.g., silicon) may include, may contain a reflective material and / or metal may be contained.

上記熱制御デバイスは、熱制御供給源に対して、熱伝達デバイスを推進するために熱伝達デバイスに力を加えるように適合され得る。 The heat control device, to the thermal control source may be adapted to apply a force to the heat-transfer device in order to promote the heat-transfer device. その力は、異なる実施形態において、磁力、静電気力または真空力を含み得る。 The force, in different embodiments, may include a magnetic force, an electrostatic force or vacuum force. 例えば、一実施形態において、その力は、熱制御デバイスまたは熱伝達デバイスの表面に形成されるチャネルを介して熱伝達デバイスに対して適用される真空力を含む。 For example, in one embodiment, the force comprises a vacuum force applied to the heat transfer device through a channel formed in the surface of the thermal control device or heat transfer device. 熱制御デバイスの表面と熱伝達デバイスの表面との間で達成される真空のレベルが検出され得る。 Level of vacuum to be achieved between the thermal control devices of the surface and the heat transfer device of the surface can be detected. このような検出は、 真空の供給源の位置から遠位のチャネルに沿った位置に配置された真空レベル検出器を用いて行なわれ得る。 Such detection may be performed using a vacuum level detector located at a position along the distal channel from the position of a source of vacuum. 真空が前もって設定されたレベルを上回らない場合、警告が鳴るか、再調整プロトコルが連動し得る。 If the vacuum does not exceed the pre-set level, or warning sound, readjustment protocols may be linked.

アレイデバイスは、一種以上の機械的または電気機械的な位置決めデバイスの使用により、熱制御デバイスと接触し得る。 Array device, by the use of one or more mechanical or electromechanical positioning device, may be in contact with the thermal control device. この方法の実施は、自動的に制御され、モニタリングされ得る。 Implementation of the method is automatically controlled, it may be monitored. 例えば、このような自動制御およびモニタリングは、熱制御デバイスからアレイデバイスを導入し、除去するためのロボットの制御システムと作動可能に連絡した自動制御システムを用いて実施され得る。 For example, such automatic control and monitoring introduces array device from the thermal control devices can be carried out using a robotic automatic control system operably communicate with the control system for removal. 反応の進行もモニタリングされ得る。 The progress of the reaction can also be monitored.

熱制御デバイスを備えるユニットが提供され得る。 Unit comprising a thermal control device may be provided. アレイデバイスおよび熱制御デバイスを備えるシステムが提供され得る。 System comprising an array device and thermal control devices may be provided.

熱サイクリング工程の正確さを確実にするために、特定のデバイスにおいて、そのデバイスの種々の領域で温度を検出するセンサーを組み込むことが有用である。 To ensure the accuracy of thermal cycling steps, in certain devices it is useful to incorporate sensors detecting temperature at various regions of the device. 温度を検出するための一つの構造物は、熱電対である。 One structure for detecting temperature is a thermocouple. このような熱電対は、基板材料の下にパターン化した薄いフィルムワイヤとして、またはその微小加工エラストマー材料内に直接組み込まれたワイヤとして作製され得る。 Such thermocouples, as a thin film wires patterned on the lower substrate material, or may be prepared directly as embedded wires in its microfabricated elastomeric material.

温度はまた、電気抵抗の変化を介して計測され得る。 Temperature may also be measured via a change in electrical resistance. 例えば、従来の技術を利用して下にある半導体基板に加工されたサーミスタの抵抗の変化は、所定の温度変化に対して較正され得る。 For example, the change in resistance of the thermistor which is processed into a semiconductor board underneath using conventional techniques can be calibrated to a given temperature change. あるいは、サーミスタは、直接微小加工エラストマー材料内に挿入され得る。 Alternatively, the thermistor can be inserted directly into the microfabricated elastomer material. 抵抗により温度を検出するためのなお別のアプローチは、Wuら、「MEMS Flow Sensors for Nano−fluidic Applications」、Sensors and Actuators、A89、152−158、(2001)に記載され、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される。 Yet another approach for detecting the temperature by resistance, Wu et al., "MEMS Flow Sensors for Nano-fluidic Applications", Sensors and Actuators, A89,152-158, as described in (2001), which is hereby which is incorporated by reference in its entirety to Shochu. この文献は、温度の制御および計測の両方に対するドープされたポリシリコン構造物の使用を記載する。 This document describes the use of polysilicon Con structure doped to both control and measure the temperature. ポリシリコンおよび他の半導体材料のために、抵抗の温度係数は、ドーパントの同一性および量により正確に制御され得、従って、所定の適用に対するセンサーの性能を最適化する。 For polysilicon Con and other semiconductor materials, the temperature coefficient of resistance may be precisely controlled by the identity and amount of dopant, thus, to optimize the performance of the sensor for a given application.

温度クロマティック材料(thermo−chromatic material)は、増幅デバイスの領域の温度を検出するために利用可能な別の型の構造物である。 Temperature chromatic material (thermo-chromatic material) is another type structures that can be used to detect the temperature of the region of the amplifying device. 特に、特定の材料は、異なる温度を通り抜けると劇的かつ再現可能に色を変化する。 In particular, certain materials changes dramatically and reproducibly colors when passing through the different temperatures. このような材料が、異なる温度を通り抜けるときに溶液に添加され得る。 Such materials may be added to the solution when passing through the different temperatures. 温度クロマティック材料は、下にある基板またはエラストマー材料内に組み込まれて形成され得る。 Temperature chromatic materials are groups Saitama other underlying may be formed embedded within the elastomeric material. あるいは、温度クロマティック材料は、粒子の形態でサンプル溶液に添加され得る。 Alternatively, the temperature chromatic material may be added to the sample solution in the form of particles.

温度を検出するための別のアプローチは、赤外線カメラの使用を介する。 Another approach to detecting temperature is through the use of infrared cameras. 顕微鏡と接続した赤外線カメラが利用されて、増幅構造物体の温度プロフィールを決定し得る。 Infrared cameras are used that are connected with the microscope, it can determine the temperature profile of the amplification structure overall. エラストマー材料の照射に対する透過性は、この分析を容易にする。 Permeability to radiation of elastomeric material, to facilitate this analysis.

温度検出のためのなお別のアプローチは、焦電センサーの使用を介する。 Yet another approach for temperature detection is through the use of pyroelectric sensors. 特に、いくつかの結晶性物質、特に圧電挙動を示す物質もまた焦電効果を示す。 In particular, some of the crystalline material, in particular to a substance also pyroelectric effect of a piezoelectric behavior. この効果は、物質の結晶格子の分極の原因となる現象を記載し、従って、物質を越える電圧は、温度に高度に依存する。 This effect describes the phenomena that cause the polarization of the crystal lattice of the material, therefore, the voltage exceeding the material is highly dependent on temperature. このような物質が基板またはエラストマー上に組み込まれ得、温度を検出するために利用され得る。 Such materials can be incorporated onto the substrate or elastomer, it may be utilized to detect temperature.

他の電気的な現象(例えば、キャパシタンスおよびインダクタンス)は、本発明の実施形態に従って、温度を検出するために利用され得る。 Other electrical phenomena (e.g., capacitance and inductance) in accordance with an embodiment of the present invention can be utilized to detect temperature.

(B.正確な熱サイクリング(thermocycling)の評価) (Evaluation of B. accurate thermal cycling (thermocycling))
下記の製作のセクションでより詳細に記載されるように、ブラインドチャネルデバイスは、試薬が配置される基底層を有する。 As described in more detail in the fabrication section below, blind channel devices have a base layer which reagents are placed. フローチャネルおよび制御チャネルを備える2つの層を含む構造物は、上記フローチャネルが沈積された試薬と整列するように基底層上の表面を覆う。 Flow structure including a channel and two layers comprising a control channel, to align with the reagent in which the flow channel has been deposited to cover the surface of the base layer. 次いで、この基底層の反対側は、基材(例えば、ガラス)上に配置される。 Then, the opposite side of the base layer is disposed on a substrate (e.g., glass). 通常、反応が起こる反応部位は、基材/ガラスの界面から約100〜150ミクロン上である。 Usually, the reaction site where reaction occurs is on about 100 to 150 microns from the interface substrate / glass. 熱拡散率についての公知の式および上記デバイスに利用されるエラストマーおよびガラスについて適切な値を使用して、反応部位内の温度がコントローラーが維持を求める温度に達するために必要とされる時間を計算し得る。 For elastomers and glass utilized in the known formulas and the device for the thermal diffusivity using the appropriate values, calculates the time the temperature in the reaction sites are required to reach the temperature the controller seeks to maintain It can be. 表1に示される計算値は、反応部位が約100〜150ミクロンであるデバイス(すなわち、本明細書において記載されるデバイスについての代表的な距離)において利用されるものよりもかなり厚いエラストマーおよびガラスの層を使用した場合でさえも、その温度が迅速に達成されることを実証する。 Calculated values ​​shown in Table 1, the reaction site is approximately 100-150 microns devices (i.e., the typical distance for the devices described herein) fairly thick elastomer and glass than those used in even when using a layer also demonstrates that the temperature is rapidly achieved.

(表1:示した時間期間におけるPDMSおよびガラス層を通した計算された熱拡散長) (Table 1: Calculated heat diffusion lengths through PDMS and glass layers at the time period shown)

図5は、ブラインドチャネルデバイスを使用して所望の温度が達成される速度を示す。 Figure 5 shows the rate at which the desired temperature is achieved using a blind channel device.

別の実施形態において、温度は、既知のtmを有する二重鎖オリゴヌクレオチドポリマーを使用することによって測定され得、ここでその挿入(intercollation)によって、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズまたは変性されたことを示す介在性色素(intercollationg dye)(例えば、SYBR Green(TM)またはエチジウムブロマイド)は、例えば、反応チャンバーのアレイを有する微小流体デバイスのチャンバーに上記オリゴヌクレオチドを含む溶液を色素と共に導入することによって、各チャンバーの温度の程度がアレイのいたる箇所で一定であることを決定するために、使用され得る。 In another embodiment, the temperature is shown can be measured by using a double-stranded oligonucleotide polymers with known tm, by its insertion (intercollation) where that oligonucleotide is hybridized or denatured mediated dye (intercollationg dye) (e.g., SYBR Green (TM) or ethidium bromide), for example, by introducing a solution containing the oligonucleotide with dye chamber of the microfluidic device having an array of reaction chambers, each to determine the extent of the temperature of the chamber is constant at the location throughout the array, it may be used. この実施形態において、温度がtmを超えて上昇した場合、介在性色素は、そのオリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドに変性(denataturation)する際に、オリゴヌクレオチドに対する関係を変化させる。 In this embodiment, when the temperature rises above the tm, mediated dye, when the oligonucleotide is modified (denataturation) to the single-stranded oligonucleotides, varying the relationship oligonucleotide. あるいは、温度がtmを超え、そして低くなる場合、その時にアニーリングされているオリゴヌクレオチドへの色素の挿入がモニタリングされ得る。 Alternatively, if the temperature exceeds tm, and lower, insertion of the dye to an oligonucleotide that is annealed at that time it can be monitored. 本質的に、色素の使用は、オリゴヌクレオチドのtmに関連する温度変化に応答して、特性(例えば、蛍光)を変化させる「オリゴヌクレオチドサーモメーター」を提供する。 Essentially, the use of dyes, in response to the temperature changes associated with tm oligonucleotides characteristics (e.g., fluorescence) to provide a "oligonucleotide thermometer" to change the. 選択されたtmを有するオリゴヌクレオチドの設計または使用によって、同様の様式で反応チャンバーのアレイが温度を変化させる程度が、決定され得る。 The design or use of the oligonucleotide having a selected tm, the degree of changing the array temperature of the reaction chamber in a similar manner, can be determined.

(VIII.検出) (VIII. Detection)
(A.概要) (A. Overview)
多くの異なる検出ストラテジーが、本明細書において提供される微小流体デバイスを用いて利用され得る。 Many different detection strategies can be utilized with the microfluidic devices provided herein. 適切なシステムの選択は、事象の型および/または検出される因子に関して部分的に知られている。 Selection of suitable systems are known in part with respect to factors type and / or detection of an event. 検出器は、多くの異なるシグナル型を検出するために設計され得、これらのシグナル型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:放射性同位体、フルオロフォア、発色団、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、核酸プローブおよび酵素基質に関連した酵素からのシグナル。 The detector, as many are designed to detect different signal type obtained, these signals types, including but not limited to, radioisotopes, fluorophores, chromophores, electron-dense particles, magnetic particles, spin labels, molecules that emit chemiluminescence, electrochemically active molecules, enzymes, cofactors, signals from the enzyme associated with the nucleic acid probes and enzyme substrates.

本発明の微小流体デバイスで使用するために適切な例証的な検出方法論としては、光散乱、マルチチャネル蛍光検出、UVおよび可視波長吸収、ルミネセンス、示差反射、および共焦点レーザースキャニング法が挙げられるが、これらに限定されない。 Suitable exemplary detection methodology for use in microfluidic devices of the present invention, light scattering, multichannel fluorescence detection, UV and visible wavelength absorption, luminescence, differential reflection, and confocal laser scanning method and the like but, but it is not limited to these. 特定の適用において使用され得るさらなる検出方法としては、シンチレーション近接アッセイ技術、放射化学検出、蛍光偏光、蛍光相関分光(FCS)、時間分解エネルギー移動(TRET)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)およびバリエーション(例えば、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET))が挙げられる。 Additional detection methods that can be used in certain applications, scintillation proximity assay techniques, radiochemical detection, fluorescence polarization, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-resolved energy transfer (TRET), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and variations ( For example, bioluminescent resonance energy transfer (BRET)). さらなる検出オプションとしては、電気抵抗、抵抗率、インピーダンス、および電圧センシングが挙げられる。 Additional detection options, electrical resistivity, resistivity, impedance, and voltage sensing like.

検出は、「検出セクション」または「検出領域」において起こる。 Detection takes place in the "detection section" or "detection region". これらの用語および他の関連する用語は、検出が起こる微小流体デバイスの部分をいう。 The term These terms and other related refers to the portion of the microfluidic device detection occurs. 上記に示されるように、ブラインドチャネル設計を利用するデバイスに関して、上記検出セクションは、一般的に、各反応部位に連結するバルブによって単離される反応部位である。 As indicated above, with respect to devices utilizing the blind channel design, the detection section is generally the reaction site isolated by a valve connected to each reaction site. マトリクスベースのデバイスのための検出セクションは、通常、インターセクションに隣接するフローチャネルの領域、インターセクション自体、またはインターセクションと周囲領域とを含む領域内にある。 Detection section for matrix-based devices are typically regions of the flow channel adjacent to the intersection, in a region including the intersection itself, or intersection and the surrounding area.

上記検出セクションは、顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス(例えば、レーザー)、光電子増倍管、プロセッサー、および前述のものの組み合わせのうちの1以上と連絡し得、これらは共働して特定の事象および/または因子に関連するシグナルを検出する。 The detection section, microscopes, diodes, light stimulating devices (e.g., a laser), photomultiplier tubes, processors, and be in communication with one or more of the combinations of the foregoing, these particular events and to cooperate / or detecting a signal associated with the factors. 多くの場合、検出されるシグナルは、光学的検出器によって検出セクション中で検出される光学的シグナルである。 Often, the signal detected is an optical signal that is detected in the detection section by an optical detector. 光学的検出器は、1以上のフォトダイオード(例えば、アバランシェフォトダイオード)、光ファイバー光ガイドリーディング(fiber−optic light guide leading)(例えば、光電子増倍管、顕微鏡、および/またはビデオカメラ(例えば、CCDカメラ))を備え得る。 Optical detector, one or more photodiodes (e.g., avalanche photo diode), an optical fiber light guide leading (fiber-optic light guide leading) (e.g., a photomultiplier tube, a microscope, and / or video camera (eg, CCD can be equipped with a camera)).

検出器は、微小流体デバイス内に微小加工(microfabricate)されてもよいし、別個のエレメントであってもよい。 Detector may be micromachined (microfabricate) within the microfluidic device, or can be a separate element. 上記検出器が別個のエレメントとして存在し、微小流体デバイスが複数の検出セクションを備える場合、検出は、任意の所定のモーメントにおける単一検出セクション内で起こり得る。 There the detector as a separate element, if the microfluidic device comprises a plurality of detection sections, detection can occur within a single detection section at any given moment. あるいは、スキャニング系が使用されてもよい。 Alternatively, scanning systems may be used. 例えば、特定の自動系が、微小流体デバイスに関して光供給源をスキャンし、他の系は、検出器上の発光をスキャンするか、またはマルチチャネル検出器を備える。 For example, certain automatic system, scans the light source with respect to the microfluidic device, the other system is provided for scanning of a light emission on the detector, or a multi-channel detector. 特定の説明的な実施例として、上記微小流体デバイスは、移動可能な(translatable)ステージに結合され、顕微鏡の対物レンズの下でスキャンされ得る。 Specific illustrative embodiments, the microfluidic device is coupled to the movable (translatable) stage can be scanned under a microscope objective. 次いで、このように得られたシグナルは、シグナルの解析および処理のためのプロセッサーに対して経路を定められる。 Then, thus obtained signal is routed against processor for analyzing and processing signals. 光電子増倍管のアレイもまた利用され得る。 An array of photomultiplier tubes can also be utilized. さらに、全ての異なる検出セクションからのシグナルを収集すると同時に各セクションからのシグナルを決定する能力を有する光学系が、利用され得る。 Further, the optical system having the ability to determine the signal from each section at the same time to collect signals from all the different detection sections may be utilized.

外部検出器も利用可能である。 External detectors are also available. なぜならば、提供されるデバイスは、モニタリングされる波長において光学的に透明な物質から完全に作製されるか、または主にそれらの物質から作製されるからである。 This is because device provided is because made from an optically transparent or material is completely made of or mainly those materials at the wavelength being monitored. この特徴は、本明細書において記載されるデバイスが従来のシリコンベースの微小流体デバイスによっては可能でない多くの光学的検出系を利用することを可能にする。 This feature makes it possible to use a number of optical detection systems devices described is not possible by conventional silicon-based microfluidic devices in this specification.

特に好ましい検出器は、CCDカメラと、大きな視野および多くのアパーチャを提供して各反応チャンバーから収集される光の量を最大化する光学的経路とを使用する。 Particularly preferred detector uses an optical path that maximizes a CCD camera, a large field of view and many provide an aperture amount of light collected from each reaction chamber. この点に関して、上記CCDは、光検出器のアレイとして使用され、ここで、各ピクセルまたはピクセルの群は、アレイの像を生じるために使用されるチャンバーではなく反応チャンバーに対応する。 In this regard, the CCD is used as an array of photodetectors, wherein each group of pixels or pixel corresponds to a reaction chamber rather than a chamber is used to produce an image of the array. 従って、光学は、画質が低下または焦点がずれて各反応チャンバーからより多くの光を収集する光学系の被写界深度を増加させるように変更され得る。 Thus, optics, image quality can be changed to increase the depth of field of the optical system to collect more light from each reaction chamber deviates decrease or focus. 好ましい実施形態において、高いアスペクト比を使用すること、またはサンプルを濃縮するための円柱チャンバーが光学系の光軸に沿った検出器によって、そして好ましくは被写界深度を増加させるために像の焦点をずらすことによって、応答指令信号を送られることは有用である。 In a preferred embodiment, high using the aspect ratio, or the focus of the image for a cylinder chamber for enrichment by the detector along the optical axis of the optical system, and which preferably increases the depth of field samples by shifting the, it is useful to be sent interrogated. 低NAレンズ系の使用、好ましくは左右対称レンズ系が使用される。 The use of low NA lens system, preferably symmetrical lens system is used. 検出器デバイス、例えば、画像化されるエラストマーブロックの領域のサイズ、またはそれより大きいサイズを有する1以上のCCDデバイスを使用することもまた、有用である。 Detector device, for example, it is also useful to use one or more CCD devices having the size of the area of ​​the elastomeric block being imaged or larger size than,. 低NA光学と共に使用される場合、改善された検出感度が実現され得る。 When used with low NA optics, improved detection sensitivity can be realized.

検出器は、検出可能なシグナルを生じるレポーターを刺激するための光供給源を備え得る。 The detector may comprise a light source for stimulating a reporter that produces a detectable signal. 利用される光供給源の型は、部分的に、活性化されるレポーターの性質に依存する。 The type of light source to be utilized depends in part on the nature of the reporter being activated. 適切な光供給源としては、レーザー、レーザーダイオードおよび高強度ランプが挙げられるが、これらに限定されない。 Suitable light sources, lasers, although laser diodes and high intensity lamps include, but are not limited to. レーザーが利用される場合、そのレーザーを利用して1セットの検出セクションまたは単一検出セクション全体をスキャンし得る。 If the laser is used, it can scan the entire detection sections or a single detection section set by utilizing the laser. レーザーダイオードは、微小流体デバイス自体に微細加工され得る。 Laser diodes can be microfabricated into the microfluidic device itself. あるいは、レーザーダイオードは、熱サイクリング反応を実施するために利用される微小流体デバイスに隣接して配置される別のデバイスに製作され得、それによってダイオードからのレーザー光は、検出セクションに向けられる。 Alternatively, the laser diode may be fabricated into another device that is positioned adjacent to the microfluidic devices utilized to implement the thermal cycling reaction, the laser light therefrom by the diode is directed to the detection section.

検出は、多くの非光学的アプローチも同様に含み得る。 Detection, many non-optical approaches may also include as well. 例えば、検出器はまた、例えば、温度センサー、伝導度センサー、電位差測定センサー(例えば、pH電極)および/または電流測定センサー(例えば、酸化反応および還元反応をモニタリングするため)を備え得る。 For example, the detector can also be, for example, temperature sensors, conductivity sensors, potentiometric sensors (eg, pH electrode) may comprise and / or current measuring sensor (e.g., to monitor oxidation and reduction reactions).

多くの市販の外部検出器が利用され得る。 Many commercial external detectors can be utilized. 蛍光標識試薬の調製が容易であるので、これらの多くは蛍光検出器である。 Since the preparation of the fluorescent labeling reagent is easy, many of these are fluorescent detectors. 利用可能な検出器の特定の例としては、Applied Precision ArrayWoRx(Applied Precision,Issaquah,WA)が挙げられるが、これに限定されない。 Specific examples of available detectors, Applied Precision ArrayWoRx (Applied Precision, Issaquah, WA) include, but are not limited thereto.

(B.増幅核酸の検出) (B. Detection of amplified nucleic acid)
(1.介在性色素) (1. mediated dye)
二本鎖DNAへの結合の際にのみ蛍光を発する特定の介在性色素が、二本鎖増幅DNAを検出するために使用され得る。 Specific intervening dyes that fluoresce only upon binding to double-stranded DNA can be used to detect double-stranded amplified DNA. 適切な色素の例としては、SYBR TMおよびPico Green(Molecular Probes,Inc.of Eugene,ORから入手)、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、クロモマイシン、アクリジンオレンジ、Hoechst 33258、Toto−1、Yoyo−1、およびDAPI(4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドールヒドロクロライド)が挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of suitable dyes, SYBR TM and Pico Green (Molecular Probes available, Inc. of Eugene, from OR), ethidium bromide, propidium iodide, chromomycin, acridine orange, Hoechst 33258, Toto-1, Yoyo-1 , and DAPI (4 ', 6- diamidino-2-phenylindole hydrochloride) include, but are not limited to. 介在性色素の使用に関するさらなる考察は、Zhuら、Anal. Further discussion regarding the use of mediated dyes, Zhu et al., Anal. Chem. Chem. 66:1941−1948(1994)(これはその全体が本明細書において参考として援用される)によって提供される。 66: 1941-1948 (1994) (which is in its entirety which is incorporated by reference herein) is provided by.

(2.FRETベースの検出方法) (2.FRET-based detection methods)
この型の検出方法は、ドナー/アクセプターフルオロフォア対中のドナー(レポーター)および/またはアクセプター(クエンチャー)フルオロフォアからの蛍光の変化を検出する工程を包含する。 Detection methods of this type comprises detecting the change in fluorescence from the donor / acceptor fluorophore pair Medium donor (reporter) and / or acceptor (quencher) fluorophore. ドナーおよびアクセプターのフルオロフォア対は、上記ドナーの発光スペクトルが上記アクセプターの励起スペクトルと重なるように選択される。 Fluorophore pairs of donor and acceptor, the emission spectrum of the donor are selected to overlap with the excitation spectrum of the acceptor. 従って、フルオロフォアの対が互いに十分に近接してもたらされる場合、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が起こり得る。 Therefore, if the pair of fluorophores are brought sufficiently close to each other can occur energy transfer from the donor to the acceptor. このエネルギー移動が、検出され得る。 This energy transfer can be detected.

(FRETおよびテンプレート伸長反応) (FRET and template extension reactions)
これらの方法は、一般的にドナー/アクセプター対の1つのメンバーで標識されたプライマーと、ドナー/アクセプター対の他のメンバーで標識されたヌクレオチドとを利用する。 These methods generally utilize a single member in the labeled primer of the donor / acceptor pair and a nucleotide labeled with the other member of the donor / acceptor pair. テンプレート依存伸長反応の間にプライマーに標識ヌクレオチドを組み込む前に、上記ドナーおよびアクセプターは、エネルギー移動が起こり得ないように十分離れて配置される。 Before incorporating the primer-labeled nucleotides during the template-dependent extension reaction, the donor and acceptor, the energy transfer is sufficiently apart arranged not occur. しかし、標識ヌクレオチドがプライマーに組み込まれてその配置が十分に近い場合、エネルギー移動が起こり、それが検出され得る。 However, if the labeled nucleotide is sufficiently close its arrangement is incorporated into the primer, energy transfer occurs, it can be detected. これらの方法は、一塩基多型を検出する際の一塩基対伸長反応の実施において特に有用であり(前出)、米国特許第5,945,283号およびPCT公開公報WO 97/22719に記載される。 These methods, (supra) particularly useful in the practice of single base pair extension reactions in the detection of single nucleotide polymorphisms, USA Patent 5,945,283 and PCT Publication WO 97/22719 It is.

(定量的RT−PCR) (Quantitative RT-PCR)
種々の、いわゆる「リアルタイム増幅」方法または「リアルタイム定量的PCR」方法もまた、増幅プロセスの間またはその後に形成される増幅産物の量を測定することによって、サンプル中に存在する標的核酸の量を決定するために利用され得る。 Various so-called "real-time amplification" methods or "real-time quantitative PCR" methods can also by measuring the amount of or during the amplification product which is subsequently formed in the amplification process, the amount of target nucleic acid present in the sample It may be utilized to determined. 蛍光発生ヌクレアーゼアッセイは、本明細書において記載されるデバイスを用いて首尾よく使用され得るリアルタイム定量方法の1つの特定の例である。 Fluorogenic nuclease assays are one specific example of the real-time quantitative method successfully may well be used with the devices described herein. 増幅産物の形成をモニタリングするこの方法は、二重標識の蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用してPCR産物蓄積を連続的に測定することを包含する。 The method of monitoring the formation of amplification product involves continuously measuring the PCR product accumulation using a fluorogenic oligonucleotide probe dual labeled. 参考文献において、このアプローチは、しばしば「TaqMan」方法といわれる。 In reference, this approach is often referred to as the "TaqMan" method.

このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、2種の異なる蛍光色素で標識される短い(約20〜25塩基)ポリヌクレオチドである。 The probes used in such assays are typically labeled with two different fluorochromes short (about 20-25 bases) is a polynucleotide. このプローブの5'末端は、代表的にはレポーター色素に結合され、3'末端はクエンチャー色素に結合されるが、これらの色素は、同様にプローブ上の他の位置に結合されてもよい。 5 of the probe 'end is typically coupled to a reporter dye and the 3' end is coupled to the quencher dye, the dyes can likewise be coupled to other locations on the probe . 上記プローブは、標的核酸上のプローブ結合部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計される。 The probe is designed to have at least substantial sequence complementarity with the probe binding site on the target nucleic acid. プローブ結合部位に隣接する領域に結合する上流および下流のPCRプライマーはまた、上記反応混合物中に含まれる。 PCR primers upstream and downstream binds to a region adjacent to the probe binding site are also included in the reaction mixture.

プローブがインタクトである場合、2つのフルオロフォアの間でエネルギー移動が起こり、クエンチャーは、レポーターからの発光をクエンチする。 When the probe is intact, energy transfer occurs between the two fluorophores, quencher quenches emission from the reporter. PCRの伸長期の間、上記プローブは、Taqポリメラーゼのような核酸ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド−クエンチャーからレポーターが放出されて適切な検出器によって測定され得るレポーター発光強度の増加を生じる。 During the extension phase of PCR, the probe is cleaved by 5 'nuclease activity of a nucleic acid polymerase such as Taq polymerase, thereby polynucleotide - reporter emission reporter from the quencher can be measured by a suitable detector is released result in an increase in strength.

例えば、蛍光発生アッセイの間に作製されるような蛍光発光を測定するために特異的に適合された1つの検出器は、Applied Biosystems,Inc. For example, one detector which is specifically adapted for measuring fluorescence emissions such as those made during the fluorogenic assay, Applied Biosystems, Inc. in Foster City,CAによって製造されたABI 7700である。 in Foster City, it is an ABI 7700 manufactured by CA. この機器と共に提供されるコンピューターソフトウェアは、増幅の過程の間のレポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録し得る。 Computer software provided with this instrument may record the fluorescence intensity of reporter and quencher during the course of amplification. 次いで、これらの記録された値を使用して、継続的に標準化レポーター発光強度の増加を計算し得、最終的に増幅されたmRNAの量を定量し得る。 Then, using these recorded values ​​may quantify the amount of the resulting calculated continuously increase in normalized reporter emission intensity, finally amplified mRNA.

増幅生成物の濃度をリアルタイムで決定するための蛍光発生方法の理論および操作に関するさらなる詳細は、例えば、以下に記載される:Gelfandらに対する米国特許第5,210,015号、Livakらに対する米国特許第5,538,848号、およびHaalandに対する米国特許第5,863,736号、ならびにHeid,C. Further details on the theory and operation of fluorogenic methods for determining the concentration of the amplified product in real time, for example, are described below: Gelfand U.S. Patent No. 5,210,015 for al, U.S. patent to Livak et al. No. 5,538,848, and U.S. Patent No. 5,863,736 for Haaland, as well as Heid, C. A. A. ら,Genome Research,6:986−994(1996);Gibson,U. Al, Genome Research, 6: 986-994 (1996); Gibson, U. E. E. Mら,Genome Research 6:995−1001(1996);Holland,P. M, et al., Genome Research 6: 995-1001 (1996); Holland, P. M. M. ら,Proc. Et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 88:7276−7280,(1991);およびLivak,K. USA 88: 7276-7280, (1991); and Livak, K. J. J. ら,PCR Methods and Applications 357−362(1995)(これらの各々は、その全体が本明細書において参考として援用される)。 Al, PCR Methods and Applications 357-362 (1995) (each of which are incorporated by reference in their entirety herein).

従って、増幅反応が進行するにつれて、結合する色素の量が増加し、同時にシグナルの量が増加する。 Thus, as the amplification reaction progresses, the amount of dye that binds increases, the amount of signal is increased at the same time.

例えば、上記に記載された介在性色素は、定量的PCR方法に対する異なるアプローチにおいても利用され得る。 For example, intervening dyes described above may also be utilized in different approach to quantitative PCR methods. 上記したように、これらの色素は、二本鎖DNAに優先的に結合し(例えば、SYBR GREEN)、一旦結合するとシグナルのみを生じる。 As noted above, these dyes bind preferentially to double-stranded DNA (e.g., SYBR GREEN), produce a signal only once bound. 従って、増幅反応が進行するにつれて、結合する色素の量が増加し、同時に検出され得るシグナルが増加する。 Thus, as the amplification reaction progresses, the amount of dye that binds increases, signal increases that can be detected simultaneously.

(分子ビーコン) (Molecular beacons)
分子ビーコンに関して、増幅産物の相補性領域にハイブリダイズする場合のプローブのコンホメーションの変化は、検出可能なシグナルを形成させる。 Regard molecular beacons, a change in probe conformation when hybridized to a complementary region of the amplification product to form a detectable signal. プローブ自体は、2つのセクションを含む:1つは5'末端のセクションであり、もう一方は3'末端のセクションである。 Probe itself includes two sections: one for 'a terminal section, the other 3' 5 is the end section. これらのセクションは、プローブ結合部位にアニーリングするプローブのセクションに隣接し、互いに相補的である。 These sections, adjacent to the section of the probe that anneals to the probe binding site, complementary to each other. 一方の末端セクションは、代表的にレポーター色素に結合され、もう一方の末端セクションは、通常クエンチャー色素に結合される。 One end section is typically coupled to a reporter dye and the other end section, is coupled to the normal quencher dye.

溶液において、上記2つの末端セクションは互いにハイブリダイズしてヘアピンループを形成し得る。 In solution, the two end sections can hybridize to form a hairpin loop to each other. このコンホメーションにおいて、レポーター色素とクエンチャー色素とは、そのレポーター色素からの蛍光がクエンチャー色素によって効率的にクエンチされるように十分に近接している。 In this conformation, the reporter dye and quencher dye, fluorescence from the reporter dye is sufficiently close to be efficiently quenched by the quencher dye. 対照的に、ハイブリダイズしたプローブは、クエンチングの程度が低下する直鎖状のコンホメーションを生じる。 In contrast, hybridized probe, resulting in linear conformational degree of quenching is decreased. 従って、2種の色素について発光変化をモニタリングすることによって、増幅産物の形成を間接的にモニタリングすることが可能である。 Thus, by monitoring emission changes for the two dyes, it is possible to indirectly monitor the formation of amplification product. この型のプローブおよびこれらの使用の方法は、さらに、例えば以下に記載される:Piatek,A. Probes and methods of their use of this type are described in further, for example the following: Piatek, A. S. S. ら,Nat. Et al., Nat. Biotechnol. Biotechnol. 16:359−63(1998);Tyagi,S. 16: 359-63 (1998); Tyagi, S. およびKramer,F. And Kramer, F. R. R. ,Nature Biotechnology 14:303−308(1996);およびTyagi,S. , Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996); and Tyagi, S. ら,Nat. Et al., Nat. Biotechnol. Biotechnol. 16:49−53(1998)(これらの各々は、全ての目的のために、その全体が本明細書において参考として援用される)。 16: 49-53 (1998) (each of these is, for all purposes, the entirety of which is incorporated herein by reference).

(インベーダー) (Invader)
インベーダーアッセイ(Third Wave Technologies,(Madison,WI))は、SNP遺伝型決定のために使用され、そして単一プローブと名付けられるオリゴヌクレオチド(これは、標的核酸(DNAまたはRNA)または多型部位に相補的である)を利用する。 Invader Assay (Third Wave Technologies, (Madison, WI)) is used for SNP genotyping and oligonucleotide, termed single probe (which is the target nucleic acid (DNA or RNA) or polymorphism site to use a complementary). インベーダーオリゴと名付けられる第二のオリゴヌクレオチドは、同じ5'ヌクレオチド配列を含むが、3'ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド多型を含む。 Invader second oligonucleotide, termed oligo 'including nucleotide sequences, 3' the same 5 nucleotide sequence comprises a nucleotide polymorphism. このインベーダーオリゴは、標的核酸に対するシグナルプローブの結合に干渉し、それによってシグナルプローブの5'末端は多型を含むヌクレオチドにおいて「フラップ」を形成する。 The Invader Oligo interferes with the binding of the signal probe to the target nucleic acid, whereby the 5 'end of the signal probe forms a "flap" in nucleotide containing the polymorphism. この複合体は、Cleavase酵素と呼ばれる構造特異的エンドヌクレアーゼによって認識される。 This complex is recognized by the structure specific endonuclease, called the Cleavase enzyme. Cleavaseは、ヌクレオチドの5'フラップを切断する。 Cleavase cleaves the 5 'flap of the nucleotides. 放出されたフラップは、FRET標識を有する第三のプローブに結合し、それによってCleavase酵素によって認識される別の二重鎖構造体を形成する。 The released flap binds with a third probe having a FRET label, thereby forming another duplex structure recognized by Cleavase enzyme. 今回は、上記Cleavase酵素は、クエンチャーからフルオロフォアを切断して除き、蛍光シグナルを生成する。 This time, the Cleavase enzyme removed by cutting the fluorophore from the quencher, to generate a fluorescent signal. SNP遺伝子型決定のために、上記シグナルプローブは、参照(野生型)対立遺伝子または改変体(変異体)対立遺伝子のいずれかとハイブリダイズするように設計される。 For SNP genotyping, the signal probe, see (wild-type) allele or variant (mutant) are designed to hybridize to any allele. PCRとは異なり、核酸の増幅を用いないシグナルの線形的増幅が存在する。 Unlike PCR, there is a linear amplification of the signal without using a nucleic acid amplification. 当業者を手引きするために十分なさらなる詳細は、例えば、Neri,B. Sufficient additional details to guide the person skilled in the art, for example, Neri, B. P. P. ら,Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826:117−125,2000)によって提供される。 Et al., Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826: 117-125,2000) is provided by.

(Nasba) (Nasba)
核酸配列ベースの増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)(NASBA)は、テンプレートとしてRNAを使用する検出方法である。 Nucleic acid sequence based amplification (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (NASBA) is a detection method using RNA as a template. RNAに対して相補的なプライマーは、T7プロモーター部位のための配列を含む。 Primer complementary to the RNA contains the sequence for the T7 promoter site. このプライマーは、テンプレートRNAと添加された逆転写酵素(RT)との結合を可能にし、3'から5'に相補鎖を作製する。 This primer, to allow the binding of the reverse transcriptase is added to the template RNA (RT), to produce a complementary strand 3 'to 5'. 続いて、RNase HがRNAを分解するために添加され、1本鎖cDNAはそのまま残る。 Subsequently, it added to RNase H degrades the RNA, 1-stranded cDNA remains intact. 次いで、プライマーの第二のコピーが1本鎖cDNAに結合し、二本鎖cDNAとなり得る。 Then, the second copy of the primer binds to single-stranded cDNA, it can be a double-stranded cDNA. 第1のプライマーによってcDNA配列に組み込まれたT7プロモーター部位から多くのRNAコピーを作製するために、T7 RNAポリメラーゼが添加される。 To make the number of RNA copies from the T7 promoter site that was incorporated into the cDNA sequence by the first primer, T7 RNA polymerase is added. 言及される全ての酵素は、41℃において機能し得る(例えば、Compton,J.Nucleic Acid Sequence−based Amplification,Nature 350:91−91,1991を参照のこと)。 All enzymes mentioned can function at 41 ° C. (e.g., Compton, J.Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature 350: 91-91,1991 see).

(Scorpion) (Scorpion)
この方法は、例えばThelwell N. This method is, for example Thelwell N. ら,Nucleic Acids Research,28:3752−3761,2000(これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される)によって記載され、図20はそのスキームを示す。 Al, Nucleic Acids Research, 28: 3752-3761,2000 (which, in its entirety for all purposes which is incorporated by reference) as described by FIG. 20 shows the scheme. ここでScorpionプロービング機構は以下のとおりである。 Here Scorpion probing mechanism is as follows. 工程1:標的およびScorpionステム配列(stem sequence)の最初の変性。 Step 1: initial denaturation of target and Scorpion stem sequences (stem sequence). 工程2:標的に対するScorpionプライマーのアニーリング。 Step 2: annealing of the Scorpion primer to the target. 工程3:Scorpionプライマーの伸長が、二本鎖DNAを生じる。 Step 3: Scorpion primer extension results in a double-stranded DNA. 工程4:工程3で産生された二本鎖DNAの変性。 Step 4: two degeneration chain DNA produced in Step 3. これによってScorpionプライマーが結合された一本鎖の標的分子が生じる。 This occurs target molecule single-stranded Scorpion primer is bound. 工程5:冷却の際、分子内様式でScorpionプローブ配列がその標的に結合する。 Step 5: Upon cooling, Scorpion probe sequence in an intramolecular fashion to bind its target. これは相補的な標的鎖の分子内結合に関して好ましい。 This preferred for intramolecular binding complementary target strand. Scorpion(図24に示される)は、上記プローブの5'側および3'側の相補的なステム配列によってヘアピンループコンフィグレーションに保持される特異的プローブ配列からなる。 Scorpion (shown in FIG. 24) consists of a specific probe sequence that is held in a hairpin loop configuration by complementary stem sequences on the 5 'side and 3' side of the probe. 5'末端に結合するフルオロフォアは、上記ループの3'末端に結合した部分(通常は、メチルレッド)によってクエンチされる。 5 'fluorophore attached to a terminal, the third the loop' part component attached to the end (usually methyl red) is quenched by. ヘアピンループは、PCR停止配列(ストッパー)を介してプライマーの5'末端に連結される。 Hairpin loop is linked to the 5 'end of the primer via PCR stop sequence (stopper). PCR増幅の間のプライマーの伸長の後、その特異的なプローブ配列は、DNAの同じ鎖内の相補体に結合し得る。 After primer extension during PCR amplification, the specific probe sequences may bind to the complement of the same strand of DNA. このハイブリダイゼーション事象がヘアピンループを開裂し、それによって蛍光はもはやクエンチされず、そしてシグナルの増加が観察される。 This hybridization event a hairpin loop was cleaved, whereby the fluorescence is no longer quenched and an increase in signal is observed. PCR停止配列は、特異的標的配列の非存在下においてヘアピンループを開裂させるリードスルーを妨げる。 PCR stop sequence prevents readthrough of cleaving hairpin loop in the absence of a specific target sequence. このようなリードスルーは、非特異的PCR産物(例えば、プライマーダイマーまたはミスプライミング(mispriming)事象)の検出をもたらす。 Such read-through results in the detection of non-specific PCR products (e.g. primer dimers or mispriming (Mispriming) event).

(3.容量性DNA検出) (3. capacitive DNA detection)
1−kHzの電場を核酸が通過することによって引き起こされるDNA濃度と静電容量の変化との間には、直線的な関係が存在する。 An electric field of 1-kHz between the change in the DNA concentration and the electrostatic capacitance caused by the nucleic acid to pass through the linear relationship exists. この関係は、種に依存しないことが見出されている(例えば、Sohnら,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:10687−10690を参照のこと)。 This relationship has been found to be independent of the species (e.g., Sohn et al., (2000) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97: 10687-10690 see). 従って、特定のデバイスにおいて、フローチャネル内(例えば、図1の実質的に円形のフローチャネル、または図2の反応チャンバー)の核酸は、そのような場に供されて増幅産物の濃度を決定する。 Thus, in certain devices, the flow in the channel (e.g., substantially circular flow channel or reaction chamber in FIG. 2, in FIG. 1) nucleic acid determines the concentration of such fly subjected has been amplified product . あるいは、増幅産物を含有する溶液が回収され、次いで電場に供される。 Alternatively, the solution containing the amplification product is recovered and then subjected to an electric field.

(IX.反応を行うための混合物の組成) (Composition of IX. The reaction mixture for performing)
本明細書において開示される微小流体デバイスを用いて行われる反応は、代表的には、その反応を促進するために特定の添加剤と共に行われる。 Reaction carried out using a microfluidic device disclosed herein is typically carried out with specific additives in order to promote the reaction. だから、例えば、試薬が沈積されるデバイスの場合においては、これらの添加剤は、例えば反応部位において1以上の反応物と共にスポットされ得る。 So, for example, in the case of devices in which reagents are deposited, these additives can be spotted with one or more reactants, for example in the reaction site. 添加剤の1つのセットは、エラストマー基材上でタンパク質結合部位をブロックするブロッキング試薬である。 One set of additives are blocking reagents that block protein binding sites on the elastomeric substrate. 多くの異なるタンパク質(例えば、ゼラチンおよび種々のアルブミンタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン))およびグリセロールを含む、多種多様なこのような化合物が利用され得る。 Many different proteins (e.g., gelatin and various albumin proteins (e.g., bovine serum albumin)) and a glycerol, a wide variety of such compounds may be utilized.

界面活性添加物もまた有用であり得る。 Surfactant additives may also be useful. 多くの種々の界面活性剤の任意のものが、利用され得る。 Any of the many various surfactants may be utilized. 例としては、SDSおよび種々のTriton界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。 Examples include, but SDS and various Triton detergents include, but are not limited to.

核酸増幅反応の特定の場合において、多くの種々の型の添加剤が含まれ得る。 In the specific case of nucleic acid amplification reactions may include many different types of additives. 1つのカテゴリーは、その増幅反応を促進するエンハンサーである。 One category is the enhancer to promote the amplification reaction. このような添加剤としては、核酸中の二次構造を低減させる試薬(例えば、ベタイン)、およびミスプライミング事象を低減させる因子(例えば、塩化テトラメチルアンモニウム)が挙げられるが、これらに限定されない。 Such additives, reagents that reduce secondary structure in the nucleic acid (e.g., betaine), and agents that reduce mispriming events (e.g., tetramethyl ammonium chloride) include, but are not limited to.

いくつかのポリメラーゼが増強された結果を与えることも、特定の増幅反応を行う際に見出されている。 Also give results several polymerases have been enhanced, it has been found in performing the specific amplification reaction. 例えば、Thermus aquaticus由来のAmpliTaq Goldポリメラーゼ(Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いて良好な結果が得られた一方、いくつかの例において、Finnzyme, Espoo, Finlandから入手したDyNAzymeポリメラーゼを使用して改善された反応が得られた。 For example, AmpliTaq Gold polymerase from Thermus aquaticus (Applied Biosystems, Foster City, CA) while good results were obtained with, in some instances, using Finnzyme, Espoo, a DyNAzyme polymerase obtained from Finland improved reaction was obtained. このポリメラーゼは、好熱性細菌であるThermus brockianusに由来する。 This polymerase is derived from Thermus brockianus a thermophilic bacterium. 利用され得る他の例示的なポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:rTHポリメラーゼXL(これは、Thermus thermophilus(Tth)とThermococcus litoralis(Tli)との組み合わせである)、超好熱性古細菌Pyrosoccus woesei(Pwo)、およびTgo DNAポリメラーゼ。 Other exemplary polymerases that can be utilized include but are not limited to: rTH polymerase XL (which is a combination of Thermus thermophilus (Tth) and Thermococcus litoralis (Tli)), hyperthermophilic thermophilic archaea Pyrosoccus woesei (Pwo), and Tgo DNA polymerase. 反応混合物中で2以上のポリメラーゼを合わせてPCR反応の忠実度または感度を上昇させることもまた、有用であり得る。 It causes combined two or more polymerase in the reaction mixture increases the fidelity or sensitivity of the PCR reactions may also be useful. 他の試薬(例えば、DMSO)の添加(特に、介在性色素を含むものをPCRカクテルに添加すること)は、反応の実施をさらに援助し得る。 Other reagents (e.g., DMSO) is added (in particular, the addition of those containing mediated dye PCR cocktail) may further assist the implementation of the reaction. コントロールライン(line)流体にグリセロールまたはPEG溶液を使用することはまた、PCR反応の性能を改善し得る。 It uses glycerol or PEG solution to the control line (line) fluid may also improve the performance of the PCR reaction.

本明細書において開示される特定のデバイスを用いて反応(核酸増幅反応を含む)を行う際に有用な添加剤に関するさらなる詳細は、下の実施例に提供される。 Further details regarding additives useful in conducting the reaction (including nucleic acid amplification reaction) using the specific devices disclosed herein are provided in the Examples below.

(X.例示的適用) (X. exemplary application)
本明細書において提供される微小流体デバイスは多くの反応部位を含むように製造され得るので、このデバイスは、多種多様なスクリーニング方法および分析方法において有用である。 Since microfluidic devices provided herein can be fabricated to include a number of reaction sites, the device is useful in a wide variety of screening methods and analytical methods. 一般的に、上記デバイスは、検出可能なシグナルを形成するために反応する物質種、または検出可能なシグナルを生じる別の物質種との相互作用に関する生成物との間の反応を検出するために利用され得る。 Generally, the device, in order to detect the reaction between the product of the interaction with another species producing species or detectable signal, react to form a detectable signal It may be utilized. 種々の型の温度制御システムの使用を考慮して、上記デバイスはまた、温度制御に必要とされる多くの異なる型の分析または反応において利用され得る。 Taking into account the use of various mold temperature control system, the device can also be utilized in the analysis or reaction of many different types are required for temperature control.

(A.核酸増幅反応) (A. nucleic acid amplification reaction)
本明細書に開示されるデバイスを利用して、本質的に全ての型の核酸増幅反応を行い得る。 Using the devices disclosed herein may perform essentially any type of nucleic acid amplification reactions. 従って、例えば、増幅反応は、直線的な増幅(単一プライマーによる増幅)であってもよいし、指数関数的な増幅(すなわち、順方向および逆方向のプライマーセットによって行われる増幅)であってもよい。 Thus, for example, the amplification reaction may be a linear amplification (amplification by single primer), an exponential amplification (i.e., amplification performed by forward and reverse primer set) it may be.

ブラインドチャネル型デバイスが核酸増幅反応を行うために利用される場合、代表的に反応部位内に沈積される試薬は、所望の型の増幅反応を行うために必要な試薬である。 If blind channel type devices are utilized to perform a nucleic acid amplification reaction, the reagents are deposited as a representative reaction sites is necessary reagents to carry out the amplification reaction of the desired type. 通常、このことは、以下のもの(例えば、プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、金属イオン、緩衝液、および補因子)の一部または全てが沈積されることを意味する。 Usually, this is the following ones (e.g., primers, polymerase, nucleotides, metal ions, buffer, and cofactors) means that some or all of which are deposited a. このような場合に反応部位に導入されるサンプルは、核酸テンプレートである。 Sample introduced into the reaction site in such cases is a nucleic acid template. あるいは、しかし、このテンプレートは沈積され得、そして増幅試薬が反応部位に流れ得る。 Alternatively, however, the template is obtained is deposited, and the amplification reagent may flow into the reaction sites. 上で議論したとおり、マトリクスデバイスが増幅反応を行うために利用される場合、核酸テンプレートを含有するサンプルは垂直方向のフローチャネルを通って流れ、そして増幅試薬は水平方向のフローチャネルを通って流れるか、あるいは核酸テンプレートを含有するサンプルは水平方向のフローチャネルを通って流れ、そして増幅試薬は垂直方向のフローチャネルを通って流れる。 As discussed above, flow case, the sample containing nucleic acid template flows through the vertical flow channels, and amplification reagents through the horizontal flow channel matrix device is utilized to perform the amplification reaction or, alternatively the sample containing nucleic acid template flows through the horizontal flow channels, and the amplification reagent flows through the vertical flow channels.

PCRはおそらく最も知られた増幅技術であるが、本デバイスはPCR増幅を行うことに限定されない。 PCR is probably best known amplification techniques, the present device is not limited to performing PCR amplification. 行われ得る増幅反応の他の型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:(i)リガーゼ連鎖反応(LCR)(WuおよびWallace,Genomics 4:560(1989)ならびにLandegrenら,Science 241:1077(1988)を参照のこと);(ii)転写増幅(Kwohら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173(1989)を参照のこと);(iii)自立的配列複製(Guatelliら,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1874(1990)を参照のこと);ならびに(iv)核酸ベースの配列増幅(NASBA)(Sooknanan,R.およびMalek,L.,BioTechnology 13:563−65(1995 Other types of that may be made amplification reactions include, but are not limited to: (i) the ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4: 560 (1989) and Landegren et al., Science 241: 1077 see (1988)); (ii) transcription amplification (Kwoh et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 1173 (1989) see); (iii) self-sustained sequence replication (Guatelli et al. , Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 87: 1874 (1990) that the reference); and (iv) nucleic acid based sequence amplification (NASBA) (Sooknanan, R and Malek, L., BioTechnology 13:. 563 -65 (1995 )を参照のこと)。 )checking). 前述の参考文献の各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される。 Each of the foregoing references, in their entirety for all purposes is incorporated herein by reference.

得られた増幅産物の検出は、増幅DNAを検出するための、前出に記載された任意の検出方法を使用して達成され得る。 The resulting detection of amplification products for the detection of amplified DNA, can be accomplished using any detection methods described supra.

(B.SNP分析および遺伝子型決定) (B.SNP analysis and genotyping)
(1.概要) (1. Overview)
宿主生物または感染生物のいずれかの、ゲノム改変に関連する多くの疾患は、少数のヌクレオチドの変化の結果であり、しばしば単一ヌクレオチドの変化に関連する。 One of the host organism or infectious organism, many diseases associated with genome modification is the result of a change of a few nucleotides, often associated with a change of a single nucleotide. このような単一のヌクレオチド変化は、一塩基多型(single nucleotide polymorphism)または単にSNPといわれ、SNPが起こる部位は、代表的には多型部位といわれる。 Such single nucleotide changes are referred to as single nucleotide polymorphisms (single nucleotide polymorphism), or simply SNP, site SNP occurs is typically referred to as a polymorphic site. 本明細書において記載されるデバイスは、そのような多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するために利用され得る。 The devices described herein can be utilized to determine the identity of the nucleotide present at such polymorphic sites. この性能を拡張すると、上記デバイスは、遺伝子型決定分析において利用され得る。 Extending this performance, the device can be utilized in genotyping analyzes. 遺伝子型決定は、二倍体生物(すなわち、各遺伝子の2つのコピーを有する生物)が、参照対立遺伝子の2つのコピー(参照型ホモ接合体)、参照対立遺伝子および改変体対立遺伝子の各1コピー(すなわち、ヘテロ接合体)を含むか否か、または改変体対立遺伝子の2つのコピー(すなわち、改変体型ホモ接合体)を含むか否かの決定を包含する。 Genotyping diploid organism (i.e., an organism with two copies of each gene), two copies of a reference allele (a reference type homozygote), each of the reference allele and the variant allele 1 copy (i.e., a heterozygote) including whether including or two copies of the variant allele (i.e., the modified type homozygote) determining whether including. 遺伝子型決定分析を行う場合、本発明の方法は、単一改変体部位を問いただす(interrogate)ために利用され得る。 When performing genotyping analysis, the methods of the present invention can be utilized to interrogate a single variant site (interrogate). しかし、多重化に関するセクションにおいて以下にさらに記載されるように、この方法は、多くの異なるDNA遺伝子座(同じ遺伝子、異なる遺伝子、またはその組み合わせのいずれか)において個体の遺伝子型を決定するためにも使用され得る。 However, as will be described further below in the section on multiplexing, the method, many different DNA loci (the same gene, different genes or any combination thereof) to determine the genotype of the individual at It can also be used.

遺伝子型決定分析を行うために利用されるべきデバイスは、適切な大きさの反応部位を利用して、統計学的な観点から、二倍体被験体について2つの対立遺伝子の各々のコピーが有効なDNA濃度で反応部位に存在することが確実になるように設計される。 Device to be utilized to perform the genotyping analysis, utilizing the reaction sites of appropriate size, from a statistical point of view, that each copy of the two alleles for a diploid subject effective It is designed to be ensured that present in the reaction site at a DNA concentration. さもなければ、単に第二の対立遺伝子のコピーが反応部位に存在しないというだけの理由で、ヘテロ接合体がホモ接合体であることを示唆する結果が分析から得られる。 Otherwise, simply a copy of the second allele simply because not present in the reaction site, the results suggest that heterozygotes are homozygous are obtained from the analysis. 以下の表2は、本明細書において記載されるデバイスによって利用され得る種々の例示的なDNA濃度において1nlの反応容量中に存在するゲノムのコピー数を示す。 Table 2 below shows the number of copies of the genome present in the reaction volume of 1nl In various exemplary DNA concentrations that can be utilized by the devices described herein.

(表2:示されるDNA濃度における1nL容量中に存在するゲノムコピーの数) (Table 2: Number of genome copies present in 1nL capacity in DNA concentrations shown)

一般的な問題として、サンプルの確率論的比率に起因して、増幅反応が開始される前に存在するコピー数は、測定における誤差の可能性を決定する。 As a general matter, due to stochastic ratio of the sample, the copy number present before an amplification reaction is initiated, determining the likelihood of error in the measurement. 特定のデバイスを使用する遺伝子型決定分析は、代表的に約0.10μg/μLのDNA濃度を有するサンプルを用いて行われるが、本発明は、反応部位1つにつき単一のゲノムが存在する濃度においてTaqMan反応を首尾よく行う。 Genotyping analysis using a specific device is performed using a sample having a DNA concentration of typically about 0.10 .mu.g / [mu] L, the present invention is a single genome is present per reactive site one perform successfully the TaqMan reactions in concentration.

(2.方法) (2. Method)
遺伝子型決定分析は、種々の異なるアプローチを使用して行われ得る。 Genotyping analyzes can be performed using a variety of different approaches. これらの方法において、「イエス」または「ノー」の結果を得ることが一般的に十分である。 In these methods, to obtain the result of "yes" or "no" is generally sufficient. すなわち、検出は、所定の対立遺伝子が存在するか否かという質問に回答し得ることのみを必要とする。 That is, the detection requires only that can answer the question of whether a given allele is present. 従って、分析は、潜在的に多型部位において1つの対立遺伝子の存在を検出するのに必要とされるプライマーまたはヌクレオチドによってのみ行われ得る。 Therefore, analysis can be potentially carried out only by the primers or nucleotides necessary to detect the presence of one allele at a polymorphic site. しかし、より代表的には、潜在的に多型部位で各対立遺伝子の存在を検出するためのプライマーおよびヌクレオチドが含まれる。 However, more typically, it is potentially include primers and nucleotides to detect the presence of each allele at the polymorphic site. 適切なアプローチの例は以下である。 Examples of suitable approach is less.

(単一塩基対伸長(SBPE)反応) (Single base pair extension (SBPE) reaction)
SBPE反応は、遺伝子型決定分析を行うために特異的に開発された技術の1つである。 SBPE reaction is one of the specifically developed techniques for performing genotyping analysis. 多くのSPBEアッセイが開発されているが、一般的なアプローチはかなり似ている。 Although many of SPBE assays have been developed, the general approach is quite similar. 代表的には、これらのアッセイは、標的核酸に対して相補的であるプライマーをハイブリダイズする工程を包含し、これによってそのプライマーの3'末端が直接改変体部位の5'であるか、またはそれに隣接するようになる。 Typically, these assays involve a step of hybridizing a primer that is complementary to the target nucleic acid, whereby the or 3 'primer end 5 of the direct variant site' is, or It will be adjacent to it. 改変体部位およびポリメラーゼを占めるヌクレオチドに対して相補的である1以上の標識された伸長可能でないヌクレオチドの存在下において、伸長は行われる。 In the presence of one or more labeled non-extendible nucleotides that are complementary to nucleotides occupying variant site and a polymerase extension is performed. この伸長可能でないヌクレオチドは、一旦プライマーに組み込まれた場合にポリメラーゼによるさらなる伸長を妨げるヌクレオチドアナログである。 The non-extendible nucleotide is a nucleotide analog that prevents further extension by the polymerase when once incorporated into the primer. 添加された伸長可能でないヌクレオチドが、改変体部位でのヌクレオチドに相補的である場合、標識された伸長可能でないヌクレオチドは、上記プライマーの3'末端に組み込まれて、標識された伸長産物を産生する。 The added non-extendible nucleotide, if it is complementary to the nucleotide at the variant site, is labeled non-extendible nucleotides, incorporated into the 3 'end of the primer, to produce a labeled extension product . 従って、伸長プライマーは、そのヌクレオチドが標的核酸の改変体部位に存在することの指標を提供する。 Thus, the extension primer provides an indication of that the nucleotide is present in the variant site of a target nucleic acid. このような方法および関連する方法は、例えば、米国特許第5,846,710号;米国特許第6,004,744号;米国特許第5,888,819号;米国特許第5,856,092号;および米国特許第5,710,028号;ならびにWO 92/16657に議論されている。 Such methods and related methods are described, for example, U.S. Pat. No. 5,846,710; U.S. Pat. No. 6,004,744; U.S. Pat. No. 5,888,819; U.S. Pat. No. 5,856,092 They are discussed as well as WO 92/16657; No.; and U.S. Patent No. 5,710,028.

伸長産物の検出は、前出の検出セクションにおける伸長反応について記載されたFRET検出アプローチを利用して検出され得る。 Detection of extension products can be detected using the described FRET detection approach for extension reactions in the detection section supra. 従って、例えば、本明細書に記載されたデバイスを使用して、ドナー/アクセプターフルオロフォアの1つのメンバーで標識されたプライマー、1個〜4個の標識された伸長可能でないヌクレオチド(1を超える伸長可能でないヌクレオチドが含まれる場合、示差的に標識される)、およびポリメラーゼを含む試薬混合物が、反応部位に導入される(または前もってスポットされる)。 Thus, for example, using the devices described herein, more than donor / acceptor fluoro one labeled primer members of foreground, one to four labeled non-extendible nucleotides (1 if it contains not extendible nucleotides, differentially labeled), and reagent mixture comprising a polymerase is to be (or pre spots introduced into the reaction site). 次いで、テンプレートDNAを含むサンプルが反応部位に導入されて、テンプレート伸長が起こり得る。 Then, a sample containing a template DNA is introduced into the reaction site, the template extension can occur. 形成される任意の伸長産物は、FRETシグナルの形成によって検出される(例えば、米国特許第5,945,283号およびPCT公開公報WO 97/22719を参照のこと)。 Any extension product formed is detected by the formation of a FRET signal (see, eg, US Patent 5,945,283 and PCT Publication WO 97/22719). この反応は、上記に記載される温度制御方法および機器を使用してシグナルを増加させるために、必要に応じて熱サイクリング的に行われ得る(thermocycled)。 This reaction is to increase the signal using the temperature control method and apparatus described above can be carried out thermally cycling manner if necessary (thermocycled).

(定量的PCR) (Quantitative PCR)
遺伝子型決定分析は、先立って記載された定量的PCR方法を使用して行われ得る。 Genotyping analyzes can be carried out using quantitative PCR methods described before. この場合において、対立遺伝子形態の各々に相補的な示差的に標識されたプローブは、プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に試薬として含まれる。 In this case, it probes complementary differentially labeled to each of the allelic forms are included as reagents, together with primers, nucleotides and polymerase. しかし、反応は、単一プローブのみを使用して行われ得るが、このことから、シグナルの欠如が特定の遺伝子座が存在しないことに起因するのか、または単なる反応の失敗に起因するのかということに関しては、あいまいさが生じ得る。 However, reaction can be carried out using a single probe alone, it Therefore, whether due to lack of signal absence of a particular locus, or that whether caused the failure of the mere reaction With regard to, it can cause ambiguity. 多型部位について2つの対立遺伝子が可能性があるような代表的な2対立遺伝子(biallelic)の場合については、2つの示差的に標識されたプローブは、各々がその対立遺伝子の1つに対して完全に相補的であり、これらのプローブは、通常は試薬混合物中に、増幅プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に含まれる。 If for the typical biallelic as there is a possibility that the two alleles for a polymorphic site (biallelic), two differentially labeled probes, is one of the alleles respectively to Te are fully complementary, these probes are usually in the reagent mixture is included together with amplification primers, nucleotides and polymerase. 標的DNAを含むサンプルは、反応部位に導入される。 Samples containing target DNA is introduced into the reaction site. プローブが相補的である対立遺伝子が標的DNA中に存在する場合、次いで増幅が起こり、それによって上記の検出おいて記載されたように検出可能なシグナルを生じる。 If the allele probe is complementary is present in the target DNA, then it occurs amplified, thereby resulting in a detectable signal as described in advance detection of the. 示差的シグナルが得られた場合には、多型部位においてヌクレオチドの同一性が決定され得る。 When the differential signal is obtained, the identity of the nucleotides can be determined at the polymorphic site. 両方のシグナルが検出される場合、その場合は両方の対立遺伝子が存在する。 If both signals are detected, in which case there are both alleles. 反応の間の熱サイクリングは、前出の温度制御セクションにおいて記載されるように行われる。 Thermal cycling during the reaction is effected as described in the temperature control section supra.

(B.遺伝子発現分析) (B. gene expression analysis)
(1.概要) (1. Overview)
遺伝子発現分析は、1以上の遺伝子が特定の細胞において発現されるレベルを決定する工程を包含する。 Gene expression analysis includes the step of determining the level of one or more genes are expressed in a particular cell. 決定は定性的であり得るが、一般的には定量的である。 Determination can be qualitative, but generally is quantitative. 示差的遺伝子発現分析において、1つの細胞(例えば、試験細胞)における遺伝子のレベルは、別の細胞(コントロール細胞)の同じ遺伝子の発現レベルと比較される。 In differential gene expression analysis, one cell (e.g., a test cell) level of genes in is compared to another cell (control cell) The same gene expression level. 多種多様なこのような比較がなされ得る。 A wide variety of such comparisons can be made. 例としては、健康な細胞と疾患細胞との間の比較、1種の薬物で処置された個体由来の細胞と別の未処置個体由来の細胞との間の比較、特定の毒物に曝された細胞と曝されていない細胞との間の比較などが挙げられるが、これらに限定されない。 Examples, comparison between healthy cells and diseased cells, comparison between one from an individual treated with drug cells and another untreated individual cells from exposed to certain toxic and compare between the cells not exposed to cells including but not limited to. 試験細胞とコントロール細胞との間で発現レベルが異なる遺伝子は、治療のためのマーカーおよび/または標的として役立ち得る。 Gene expression levels vary between the test and control cells can serve as markers and / or targets for therapy. 例えば、特定の群の遺伝子が健康細胞よりも疾患細胞においてアップレギュレートされることが見出される場合、そのような遺伝子は、その疾患のマーカーとして機能し得、診断試験のための基準として利用され得る可能性がある。 For example, if it is found that the gene for a particular group are up-regulated in diseased cells than healthy cells, such genes may function as a marker of the disease, it is utilized as the basis for diagnostic tests there is a possibility of obtaining. これらの遺伝子は標的でもあり得る。 These genes may also be a target. 上記疾患を処置するためのストラテジーとしては、アップレギュレートされた遺伝子の発現の低下をもたらす手順が挙げられる。 The strategy for treating the disease, the procedure results in a decreased expression of up-regulated gene.

本明細書において開示されるデバイスの設計は、種々の遺伝子発現分析を容易にするのに有用である。 Device design disclosed herein are useful in facilitating various gene expression analysis. 上記デバイスは多くの反応部位を含むので、多くの遺伝子および/またはサンプルが同時に試験され得る。 Since the device contains many reaction sites, a number of genes and / or samples can be tested simultaneously. 例えば、ブラインドフローチャネルデバイスを使用して、数百〜数千の遺伝子の発現レベルが同時に決定され得る。 For example, using the blind flow channel devices, hundreds to thousands of genes the expression levels can be determined simultaneously. 上記デバイスはまた、示差的遺伝子発現分析を容易にする。 The device also facilitates the differential gene expression analysis. 例えば、マトリクス設計を用いて、健康細胞から得られたサンプルを1つのフローチャネルで試験しながら、疾患細胞からのサンプルをすぐ近くの隣接チャネルにおいて試験することが可能である。 For example, using a matrix design, while testing a sample obtained from a healthy cell in one flow channel can be tested in the immediate vicinity of the adjacent channel samples from diseased cells. この特徴は、検出の容易さおよび結果の正確さを増強する。 This feature enhances the accuracy of the ease and results of the detection. なぜならば、2つのサンプルが、同じデバイスで同時に、そして同じ条件下で試験されるからである。 Since two samples, at the same time on the same device, and because is tested under the same conditions.

(2.サンプルの調製および濃度) (2. Preparation and concentration of the sample)
遺伝子の転写レベル(そしてそれによって発現レベル)を測定するために、その遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのmRNA転写産物を含む核酸サンプル、またはそのmRNA転写産物に由来する核酸が得られる。 To measure the transcription level (and thereby expression level) of a gene, a nucleic acid derived from a nucleic acid sample, or its mRNA transcript, including mRNA transcript of that gene or gene fragment is obtained. mRNA転写産物に由来する核酸とは、その合成のためにmRNA転写産物またはそのサブ配列が最終的にテンプレートとして役立つ核酸を指す。 The nucleic acid derived from the mRNA transcript refers to a nucleic acid mRNA transcript or a subsequence thereof for the synthesis serve as the final template. 従って、mRNAから逆転写されるcDNA、cDNAから転写されるRNA、cDNAから増幅されるDNA、増幅DNAから転写されるRNAは、全て上記mRNA転写産物に由来し、このような由来産物の検出は、サンプル中のもとの転写産物の存在および/またはアバンダンスの指標である。 Thus, cDNA reverse transcribed from the mRNA, RNA transcribed from cDNA, DNA amplified from the cDNA, RNA transcribed from amplified DNA, all were derived from the mRNA transcript, detection of such derived products , the presence and / or indicators of abundance of the original transcript in a sample. 従って、適切なサンプルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:遺伝子のmRNA転写産物、mRNAから逆転写されるcDNA、cDNAから転写されるcRNA、遺伝子から増幅されるDNA、増幅DNAから転写されるRNA。 Thus, suitable samples include but are not limited to: mRNA transcript of gene, cDNA reverse transcribed from the mRNA, cRNA transcribed from cDNA, DNA amplified from the genes, the amplified DNA RNA transcribed.

いくつかの方法において、核酸サンプルは、生物学的サンプルから単離される全mRNAである;他の例において、上記核酸サンプルは、生物学的サンプルからの全RNAである。 In some methods, nucleic acid samples is the total mRNA isolated from a biological sample; in other instances, the nucleic acid sample is total RNA from a biological sample. 用語「生物学的サンプル」は、本明細書において使用される場合、生物からか、または生物の構成要素から得られるサンプル(例えば、細胞、生物学的組織および流体)をいう。 The term "biological sample", as used herein, refers to a sample obtained from a component of either, or organism from a biological (e.g., cells, biological tissues and fluids). いくつかの方法において、上記サンプルはヒト患者由来である。 In some methods, the sample is from a human patient. このようなサンプルとしては、痰、血液、血球(例えば、白血球)、組織もしくは細針生検サンプル、尿、腹水、および胸膜液(fleural fluid)、またはそれらからの細胞が挙げられる。 Such samples include sputum, blood, blood cells (e.g., white cells), tissue or fine needle biopsy samples, urine, peritoneal fluid, and pleural fluid (Fleural fluid), or cells from thereof. 生物学的サンプルはまた、組織学的な目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を含み得る。 Biological samples may also include sections of tissues such as frozen sections taken for histological purposes. 多くの場合、2つのサンプルが比較目的のために提供される。 Often two samples are provided for comparison purposes. 上記サンプルは、例えば、異なる細胞または組織型に由来しても、異なる個体に由来しても、2種の異なる処理(例えば、薬物処理とコントロール処理)に供された、同じもとのサンプルに由来してもよい。 The sample is, for example, be derived from different cell or tissue types, be derived from different individuals, two different processes (e.g., drug-treated and control treatment) were subjected to, the same original sample it may be derived.

mRNAの単離に対して選択されていない任意のRNA単離技術が、このようなRNAサンプルの精製のために利用され得る。 Any RNA isolation technique that does not select against the isolation of mRNA may be utilized for the purification of such RNA samples. 例えば、核酸の単離および精製の方法は、以下において詳細に記載される:WO 97/10365、WO97/27317、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biologyの第3章: Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I. For example, methods of isolation and purification of nucleic acids are described in detail in the following: WO 97/10365, WO97 / 27317, Laboratory Techniques in Chapter 3 of Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation,(P.Tijssen(編))Elsevier,N. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P.Tijssen (ed.)) Elsevier, N. Y. Y. (1993);Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biologyの第3章:Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part 1. (1993); Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part 1. Theory and Nucleic Acid Preparation,(P.Tijssen(編))Elsevier,N. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P.Tijssen (ed.)) Elsevier, N. Y. Y. (1993);およびSambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N. (1993); and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. Y. ,(1989);Current Protocols in Molecular Biology,(Ausubel,F. M.ら(編))John Wiley & Sons,Inc. , (1989); Current Protocols in Molecular Biology, (. Ausubel, F M., et al. (Eds)) John Wiley & Sons, Inc. ,New York(1987−1993)。 , New York (1987-1993). 多数の組織サンプルは、当該分野で公知の技術(例えば、米国特許第4,843,155号に記載されるChomczynski,P.の1工程RNA単離プロセスが挙げられる)を使用して容易に処理され得る。 Multiple tissue samples are techniques known in the art (e.g., Chomczynski described in U.S. Patent No. 4,843,155, 1 step RNA isolation process are mentioned in P.) Easily processed using It may be.

記載されるデバイスを利用する遺伝子発現分析において、結果に影響する重要な因子は、サンプル中の核酸濃度である。 In gene expression analysis utilizing the device described, a significant factor affecting the results is the nucleic acid concentration in the sample. コピー数が少ない場合、ノイズは、コピー数の平方根に比例する。 If the number of copies is small, the noise is proportional to the square root of the number of copies. 従って、受容可能であるとみなされる誤差のレベルは、必要とされるコピー数に左右される。 Therefore, the level of error is considered to be acceptable is dependent on the number of copies required. 特定のサンプル容量において必要とされるコピー数は、必要とされるDNA濃度を与える。 The number of copies required in a particular sample volume gives the DNA concentration required. 必ずしも最適である必要はないが、定量反応は、50%までの誤差レベル(しかし、好ましくはより低いレベル)で行われ得る。 Need not necessarily optimal, quantitation reactions, error level of up to 50% (but preferably a lower level) may be performed in. 1ナノリットル容量を仮定した場合の特定の誤差レベルを達成するために必要とされるDNA濃度を表3に示す。 The DNA concentration required to achieve a particular error level assuming a 1 nanoliter volume shown in Table 3. 理解され得るように、例えば特定のデバイスで使用される1ナノリットル容量は、微小流体デバイスを用いて実行可能な濃度において十分なコピー数の遺伝子発現産物を有する。 As can be appreciated, for example, 1 nanoliter space used by a particular device has sufficient copies of the gene expression product in viable concentrations using microfluidic devices.

(表3.遺伝子発現−DNA定量) (Table 3. gene expression -DNA quantitative)

さらなる計算により、1ナノリットルの反応部位を利用する本明細書において提供される特定のデバイスは、正確な発現結果を達成するための十分なDNAを含むことを実証する。 The further calculation, specific devices provided herein utilize reactive site 1 nanoliter demonstrate that contain sufficient DNA to achieve the result correct expression. 具体的には、代表的なmRNA調製手順は、約10μgのmRNAを生じる。 Specifically, a typical mRNA preparation procedure yields a mRNA of approximately 10 [mu] g. 代表的に、1つの細胞あたり各mRNAの1〜10,000コピーが存在することが実証されている。 Typically, that 10,000 copies of each mRNA per cell is present it has been demonstrated. 任意の所定の細胞内で発現されるmRNAのうちで、大体、4種の最も一般的なメッセージが、総mRNAレベルの約13%を構成する。 Of mRNA expressed within any given cell, roughly four most common messages comprise about 13% of the total mRNA levels. 従って、このように高く発現されたメッセージは、1.3μgのmRNAを含む(各々、4×10 −12モルまたは約2.4×10 12コピー)。 Thus, such high expressed message, including mRNA of 1.3 ug (each, 4 × 10 -12 mol or about 2.4 × 10 12 copies). 前述の発現範囲を考慮して、まれなメッセージが、約2×10 −8コピーのレベルで存在することが予測される。 Taking into account the expression above-mentioned range, rare messages, it is expected that is present at a level of about 2 × 10 -8 copies. 標準的分析においてmRNAサンプルが10μl中に溶解されている場合、まれなメッセージの濃度は約2×10 コピー/μlであり、この濃度は、1nlウェルあたり20,000コピー(または4×10 11 M)に対応する。 If the mRNA sample is dissolved in 10μl in a standard analysis, the concentration of the rare message is approximately 2 × 10 7 copies / [mu] l, this concentration, 20,000 copies per 1nl well (or 4 × 10 11 corresponding to M).

(3.方法) (3. Method)
代表的に、発現分析は定量分析を包含するので、検出は、上記に記載される定量的リアルタイムPCR方法のうちの1つを使用して、代表的には達成される。 Typically, the expression analysis to encompass a quantitative analysis, detection, using one of the quantitative real-time PCR methods described above, typically is achieved. 従って、TaqManアプローチが利用される場合、反応部位に導入される(または前もってスポットされる)試薬は、プライマー、標識プローブ、ヌクレオチド、およびポリメラーゼのうちの1つまたは全てを含み得る。 Therefore, if the TaqMan approach is utilized, and is (or pre spotted) reagent introduced into the reaction site may comprise a primer, labeled probe, nucleotides, and one or all of the polymerase. 介在性色素が利用される場合、上記反応試薬混合物は、代表的に、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および介在性色素のうちの1つまたは全てを含む。 If mediated dye is utilized, the reaction reagent mixture will typically contain a primer, nucleotides, polymerase, and one or all of the intervening dye.

(D.多重化) (D. multiplexing)
本明細書において記載されるアレイベースのデバイス(例えば、図1A、1F、2、3Aおよび3B、ならびに添付されるテキストを参照のこと)は、本来、同時に多数の増幅反応を行うために設計される。 Array-based devices described herein (e.g., see the text Figure 1A, 1F, 2, 3A and 3B, and is attached) is originally designed to perform a number of amplification reactions at the same time that. しかし、この特徴は、各反応部位内で多重分析(例えば、遺伝子型決定および発現分析)を行うことによってさらに容易に拡張され得る。 However, this feature may be more readily extended by performing multiple analyzes in each reaction site (e.g., genotyping and expression analyzes).

多重増幅は、熱サイクリングプロセスの間に、例えば、目的の特定の標的核酸に各々特異的な複数のプライマーを利用することによって、単一の反応部位内でさえ行われ得る。 Multiplex amplification, during the thermal cycling process, for example, by utilizing each specific plurality of primers to a particular target nucleic acid of interest can be performed even within a single reaction site. 異なる増幅産物の存在は、示差的に標識されたプローブを使用して定量的RT−PCR反応を行うことによってか、または示差的に標識された分子ビーコンを使用することによって検出され得る(前出を参照のこと)。 The presence of different amplification products, differentially or using labeled probes by performing quantitative RT-PCR reactions, or differentially may be detected by using labeled molecular beacons (supra checking). このようなアプローチにおいて、各々の示差的に標識されたプローブは、特定の増幅標識にのみハイブリダイズするように設計される。 In such an approach, each differentially labeled probes is designed to hybridize only to a particular amplification label. 利用される異なる標識の賢明な選択によって、単一の反応の異なる波長において、異なる標識が励起および/または検出される分析が、行われ得る。 By different judicious choice of label utilized in different wavelengths of a single reaction, analysis of the different labels are excited and / or detected, can take place. このようなアプローチで適している適切な蛍光標識の選択に関するさらなる指標としては、以下が挙げられる:Fluorescence Spectroscopy(Pesceら(編))Marcel Dekker,New York,(1971);Whiteら,Fluorescence Analysis:A Practical Approach,Marcel Dekker,New York,(1970);Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,第2版,Academic Press,New York,(1971);Griffiths,Colour and Constitution of Organic Molecule Additional indicators for the selection of appropriate fluorescent labels that are suitable in such approaches include the following: Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al. (Eds)) Marcel Dekker, New York, (1971); White et al, Fluorescence Analysis: a Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition, Academic Press, New York, (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecule ,Academic Press,New York,(1976);Indicators(Bishop(編)). , Academic Press, New York, (1976); Indicators (Bishop (ed.)). Pergamon Press,Oxford,19723;ならびにHaugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Eugene(1992)。 Pergamon Press, Oxford, 19723; and Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992).

多重遺伝子型決定および発現分析は、必要に応じて各反応部位で行われ得る。 Multiple genotyping and expression analyzes can be carried out in each reaction site as necessary. 例えばTaqManのような定量的PCR方法が利用される場合、目的の標的DNA の異なる領域を増幅するためのプライマーは、単一反応部位内に含まれる。 For example, when the quantitative PCR methods such as TaqMan is utilized, a primer for amplifying a different region of the target DNA of interest are included in a single reaction site. 各領域について示差的に標識されたプローブを利用して、形成される産物を識別する。 For each area by using the differentially labeled probes to identify the products formed.

(E.非核酸分析) (E. non-nucleic acid analysis)
上記デバイスは、多種多様な核酸分析を行うために有用であるが、このデバイスはまた、同様に多くの他の適用においても利用され得る。 The device is useful for conducting a wide variety of nucleic acid analysis, the device may also be used in as many other applications. 上に示されるように、上記デバイスは、検出可能なシグナルまたは反応産物との相互作用の際にシグナルを生じる検出試薬と反応し得る反応産物を生じる、2種以上の物質種の間の任意の相互作用を本質的に分析するために利用され得る。 As indicated above, the device produces a reaction product capable of reacting with a detection reagent to produce a signal upon interaction with a detectable signal or reaction products, any between two or more species It may be utilized to essentially analyzing an interaction.

従って、例えば、上記デバイスは、特定の所望の活性を有する試験因子を同定するために、多くのスクリーニング適用において利用され得る。 Thus, for example, the device, in order to identify test agents having a particular desired activity, may be utilized in a number of screening applications. 特定の実施例として、上記デバイスは、1以上の酵素の基質またはインヒビターとしての活性について化合物をスクリーニングするために利用され得る。 As a specific example, the device may be utilized to screen compounds for activity as a substrate or inhibitor of one or more enzymes. このような分析において、試験化合物および他の必要な酵素アッセイ試薬(例えば、緩衝液、金属イオン、補因子および基質)が、反応部位に導入される(さもなければ、前もって沈積される)。 In such an analysis, test compound and other necessary enzymatic assay reagents (e.g., buffers, metal ions, cofactors and substrates) are introduced into the reaction site (otherwise, is previously deposited). 次いで酵素サンプルが導入され、そして反応(上記試験化合物が基質である場合)または反応の阻害(上記試験化合物がインヒビターである場合)が検出される。 Then the enzyme samples are introduced, and the reaction inhibition (the test compound be a substrate) or reaction (if the test compound is an inhibitor) is detected. このような反応または阻害は、標準的な技術(例えば、基質の喪失および/もしくは生成物の出現を直接的または間接的にモニタリングすること)によって達成され得る。 Such reactions or inhibition, standard techniques (e.g., that directly or indirectly monitors the appearance of loss and / or product of the substrate) can be achieved by.

十分に大きいフローチャネルおよび反応部位を備えるデバイスは、細胞と1以上の試薬との間の相互作用を検出するための細胞アッセイを行うために利用され得る。 Sufficiently large flow channels and devices with reactive sites can be utilized to conduct cellular assays to detect interaction between a cell and one or more reagents. 例えば、特定の分析は、特定の細胞型がサンプル中に存在するか否かということの決定を包含する。 For example, the particular analysis, including the determination of that whether a particular cell type is present in the sample. このことを達成するための1つの例は、特定の細胞型と優先的に反応する細胞特異的色素を利用することである。 One example for accomplishing this is to utilize a particular cell type and preferentially react cell specific dye. 従って、このような色素は、反応部位に導入され得、次いで細胞が添加され得る。 Thus, such dyes can be introduced into the reaction site, then the cells may be added. 細胞の染色は、標準的な顕微鏡的技術を使用して検出され得る。 Staining of cells can be detected using standard microscopic techniques. 別の例として、試験化合物は、細胞応答(例えば、シグナル伝達経路)の誘発または阻害の能力についてスクリーニングされ得る。 As another example, test compounds, cellular responses (e.g., signal transduction pathways) may be screened for the ability of inducing or inhibiting. このような分析において、試験化合物が部位に導入され、次いで細胞が添加される。 In such an analysis, test compounds can be introduced to the site, then the cells are added. 次いで、反応部位は、細胞反応の形成を検出するために調べられる。 Then, the reaction site is examined to detect the formation of cellular responses.

関連デバイスおよびこのようなデバイスの適用に関するさらなる考察は、同時係属かつ共同所有の米国仮特許出願60/335,292(2001年11月30日出願)に記載されており、これは、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される。 Further discussion regarding application of the relevant devices and such devices are described in co-pending and commonly owned U.S. Provisional Patent Application 60 / 335,292 (Nov. 30, 2001 filed), which, for all purposes the entirety of which is incorporated herein by reference for.

(XI.製作) (XI. Fabrication)
(一般的局面) (General aspects)
上で示唆されるように、提供される微小流体デバイスは、一般的に、単一および多層のソフトリソグラフィー(multilayer soft lithography)(MSL)技術および/または犠牲層カプセル化法(sacrificial−layer encapsulation method)を利用して構築される。 As suggested above, the microfluidic devices that are provided are generally single and multilayer soft lithography (multilayer soft lithography) (MSL) techniques and / or sacrificial-layer encapsulation methods (sacrificial-layer encapsulation method ) is constructed using. 基本的なMSLアプローチは、一連のエラストマー層を小型機械鋳型で鋳造する工程、その鋳型から層を取り出す工程、次いでその層を一緒に融合させる工程を包含する。 The basic MSL approach involves the steps of casting a series of elastomeric layers compact machine mold, step of removing the layer from the mold, and then a step of fusing the layers together. 犠牲層カプセル化アプローチにおいては、フォトレジストのパターンをチャネルが所望される場所に沈積する。 In the sacrificial-layer encapsulation approach, depositing a pattern of photoresist where a channel is desired. これらの技術および微小流体デバイスを製造する方法におけるこれらの技術の使用は、例えば、以下に詳細に議論される:Ungerら(2000)Science 288:113−116,Chouら,(2000)「Integrated Elastomer Fluidic Lab−on−a−chip−Surface Patterning and DNA Diagnostics, in Proceedings of the Solid State Actuator and Sensor Workshop」,Hilton Head,S. The use of these techniques in the process for preparing these techniques and microfluidic devices, for example, is discussed in detail below: Unger et al. (2000) Science 288: 113-116, Chou et al., (2000) "Integrated Elastomer Fluidic Lab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagnostics, in Proceedings of the Solid State Actuator and Sensor Workshop ", Hilton Head, S. C. C. ;ならびにPCT公開公報WO01/01025(これらの各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される)。 ; And PCT Publication WO01 / 01025 (each of which in its entirety for all purposes is incorporated herein by reference).

手短に言えば、前述の製作方法は、フォトレジスト(Shipley SJR 5740)による写真平版によってシリコンウェーハ上に、上層(例えば、制御チャネルを有するエラストマー層)および下層(例えば、フローチャネルを有するエラストマー層)のための母鋳型(mother mold)を製作する工程を包含する。 Briefly, fabrication method described above, by photolithography by photoresist (Shipley SJR 5740) on silicon wafers, the upper layer (e.g., an elastomer layer having a control channel) and the lower layer (e.g., an elastomeric layer having a flow channel including mother mold the step of making a (mother mold) for). チャネルの高さは、スピンコーティング速度によって正確に制御され得る。 The height of the channel can be precisely controlled by the spin coating speed. フォトレジストチャネルは、フォトレジストをUV光に曝露して次いで顕色(development)することによって形成される。 Photoresist channels are formed by that exposure of photoresist to UV light followed by color developing (development). 熱再フロープロセスおよび保護処置は、代表的にM. Thermal reflow process and protection treatment is typically M. A. A. Unger,H. Unger, H. −P. -P. Chou,T. Chou, T. Throsen,A. Throsen, A. SchererおよびS. Scherer and S. R. R. Quake,Science(2000)288:113によって記載されとおりに達成され、これはその全体が本明細書において参考として援用される。 Quake, Science (2000) 288: 113 is achieved as described by, which are incorporated by reference in their entirety herein. 次いで、混合した2部のシリコンエラストマー(GE RTV 615)が、それぞれ下の鋳型に落ち込み(spun)そして上の鋳型に注がれる。 Then, mixed 2 parts of silicon elastomer (GE RTV 615) is poured in drop (spun) and the upper mold in a mold under each. ここで、またスピンコーティングを利用して下側のポリマー流体層の厚さを制御し得る。 Here, also may control the thickness of the lower polymeric fluid layer using spin coating. 部分的に硬化した上側層は、80℃のオーブンで25分間焼くことによって鋳型からはがされ、下側層に並べて組み立てられる。 Partially cured upper layer is stripped from the mold by baking at 80 ° C. oven for 25 minutes, assembled side by side in the lower layer. 80℃で1.5時間の最後の焼きをして、これらの2つの層を不可逆的に結合させる。 80 to the last baked for 1.5 hours at ° C., thereby irreversibly bind these two layers. 一旦、下側のシリコン母鋳型からはがれると、このRTVデバイスは、代表的にHCLで処理される(0.1N、80℃で30分)。 Once peeled off from the lower side of the silicon mother mold, this RTV device is typically being treated with HCL (0.1 N, 30 min at 80 ° C.). この処理は、一部のSi−O−Si結合を切断するために作用し、それによってヒドロキシ基が露出して、上記チャネルをより親水性にする。 This process acts to cut a part of Si-O-Si bonds, thereby to expose the hydroxy group is more hydrophilic the channel.

次いでこのデバイスは、必要に応じて支持体上に密封してシールされ得る。 Then the device may be hermetically sealed on the support as necessary. この支持体は、本質的にはいずれの材料から製造されてもよいが、その表面は、形成されるシールが第一に接着力に起因する場合、良好なシールを確実にするように平坦であるべきである。 The support is essentially may be manufactured from any material, but its surface, if the seal formed is due to adhesion to the first, a so as to ensure a good seal flat there should be. 適切な支持体の例としては、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。 Examples of suitable supports include glass, such as plastics.

前述の方法に従って形成されるデバイスは、フローチャネルの1つの壁を形成する基材(例えば、ガラススライド)を生じる。 Device formed according to the above methods result substrate which forms one wall of the flow channel (e.g., a glass slide). あるいは、一旦母鋳型から除かれたデバイスは、薄いエラストマー膜にシールされ、それによってフローチャネルは、エラストマー材料に全体的に囲まれる。 Alternatively, once the device is removed from the mother mold is sealed to a thin elastomeric membrane, thereby the flow channel is totally enclosed in elastomeric material. 次いで、得られるエラストマーデバイスは、必要に応じて基材支持体に連結され得る。 Then, the resulting elastomer devices may be coupled to the substrate support as needed.

(B.ブラインドチャネル設計を利用するデバイス) (Devices utilizing B. blind channel design)
(1.層形成) (1. layer formation)
製造の間に試薬が反応部位に沈積されるブラインドチャネル設計に基づく微小流体デバイスは、代表的には3層から形成される。 Microfluidic devices based on the blind channel design in which reagents during manufacture is deposited in the reaction site is typically formed from three layers. 下側の層は、試薬が沈積される層である。 Lower layer is a layer which reagents are deposited. その下側の層は、上記のMLS方法に関して列挙される参考文献中で記載されるように、種々のエラストマー材料から形成され得る。 Lower layer thereof, as described in the references listed with reference to the above MLS method, may be formed from a variety of elastomeric materials. 代表的には、上記材料は、ポリジメチルシロキサン(PMDS)エラストマーである。 Typically, the material is polydimethylsiloxane (PMDS) elastomer. 特定のデバイスのために所望される反応部位の配置および位置に基づいて、適切な試薬がスポットされるべき下側層上の位置を決定することが可能である。 Based on the arrangement and position of the desired reactive sites for a particular device, suitable reagents it is possible to determine the position on the lower layer to be spot. PMDSは親水性であるので、沈積された水性スポットは、小さくなって非常に小さなスポットを形成する。 Because PMDS is hydrophilic deposited aqueous spot forms a very small spot smaller. 沈積された試薬は、試薬とエラストマーの表面との間に共有結合が形成されないように沈積される。 Deposited reagent, covalent bonds are deposited so as not to be formed between the reagent and the elastomer surface. なぜならば、上に記載されたように、上記試薬は、試薬が反応部位に導入されたときに、サンプル溶液中に溶解することが意図されるからである。 Because, as described above, the reagent, when the reagent is introduced into the reaction site, because it is intended to dissolve in the sample solution.

上記デバイスの他の2つの層は、フローチャネルが形成される層であり、そして制御チャネルおよび任意の保護チャネルが形成される層である。 Another two layers of the device is a layer flow channels are formed, and a layer control channel and any protecting the channel is formed. これら2つの層は、このセクションの前の方に記載された一般的方法に従って調製される。 These two layers are prepared according to the general methods described earlier in this section. 次いで、得られる2層の構築物は、試薬が沈積される第1の層の上に配置される。 Then, construct 2 resulting layer is disposed on the first layer which reagents are deposited. これら3層の組成物の特異的な例は、以下のとおりである(成分Bに対する成分Aの比):第1の層(サンプル層)30:1(重量);第2の層(フローチャネル層)30:1;および第3の層(コントロール層)4:1。 These specific examples of three layers of the composition are as follows (the ratio of component A to component B): first layer (sample layer) 30: 1 (by weight); the second layer (flow channel layer) 30: 1; and the third layer (control layer) 4: 1. しかし、これらのエラストマー成分の他の組成物および比は、同様に利用され得る。 However, other compositions and ratios of these elastomer component may be utilized as well. 2以上の層または基材を結合する他の方法の使用には、エラストマーブロックまたは上記微小流体デバイスの他の部分を形成するための、接着剤またはプラズマ結合(好ましくは、エアープラズマ結合)が挙げられ得る。 The use of other methods of joining two or more layers or substrates, for forming the other part of the elastomeric block or the microfluidic device (preferably, an air plasma binding) adhesive or plasma binding include It can be. いくつかの実施形態において、孔を介して他の層と相互に連結したさらなる層(好ましくはエラストマー層)を使用して、エラストマーブロックの単位面積あたりの反応物の密度を上昇し得るか、またはエラストマーブロックのサイズを減少させ得る。 In some embodiments, either (preferably elastomeric layer) further layers interconnected with other layers through the holes, can be used to increase the density of the reaction product per unit area of ​​the elastomeric block, or the size of the elastomeric block may reduce.

このプロセスの間、上記反応部位は、沈積された試薬と共に整列され、試薬が適切な反応部位内に位置決めされるようになる。 During this process, the reaction sites are aligned with the deposited reagents, so the reagent is positioned within the appropriate reaction site. 図6は、デバイスの4つの角から得た図を示す。 Figure 6 shows a diagram obtained from the four corners of the device. これらの図は、沈積された試薬が前述のアプローチを利用して反応部位内に正確に整列され得ることを実証する。 These figures demonstrate that deposited reagents can be accurately aligned within the reaction sites utilizing the foregoing approach. これらの図は、分岐フローチャネルの末端に位置決めされた保護チャネルおよび反応部位を示す。 These figures show the protection channels and reaction sites positioned at the ends of the branch flow channels. 白色の円は、反応部位に対して沈積された試薬の位置を示す。 White circles indicate the position of the deposited reagent relative to the reaction site. 示されるように、各試薬スポットは、十分にその反応部位の範囲内である。 As shown, each reagent spot is well within the reaction site.

(2.スポッティング) (2. Spotting)
上記試薬は、多くの市販の試薬スポッターのいずれかを利用して、種々の確立されたスポッティング技術を用いて堆積され得る。 The reagent can utilize any of a number of commercially available reagent spotters may be deposited using a variety of established spotting techniques. 上記デバイスの調製で利用され得る適切なスポッターの例としては、ピンスポッター、アコースティックスポッター、自動マイクロピペッター、電気泳動ポンプ、インクジェットプリンタデバイス、インクドロッププリンタ、および特定の浸透圧ポンプが挙げられる。 Examples of suitable spotter that can be utilized in the preparation of the device, the pin spotters, acoustic spotters, automated micropipettor, electrophoretic pumps, ink jet printer devices, ink drop printers, and certain osmotic pumps and the like. 市販のスポッターとしては、Cartesian Technologies MicroSys 5100(Irvine,CA)、Hitach SPBIO(Alameda,CA)、Genetix Q−Array(United Kingdom)、Affymetrix 417(Santa Clara,CA)およびPackard Bioscience SpotArray(Meriden,CT)が挙げられる。 Examples of commercially available spotter, Cartesian Technologies MicroSys 5100 (Irvine, CA), Hitach SPBIO (Alameda, CA), Genetix Q-Array (United Kingdom), Affymetrix 417 (Santa Clara, CA) and Packard Bioscience SpotArray (Meriden, CT ), and the like. 一般的に、試薬の非常に小さいスポットが堆積される;通常は、10nl未満のスポットが堆積され、他の例では、5nl未満、2nl未満または1nl未満、そしてさらに他の例では、0.5nl未満、0.25nl未満、または0.1nl未満のスポットが堆積される。 Generally, very small spot is deposited reagents; usually spots of less than 10nl is deposited, in other instances less than 5 nl, less 2nl or less than 1 nl, and in still another embodiment, 0.5 nl , less than 0.25Nl, or less than the spot 0.1nl is deposited.

材料のアレイはまた、Foderら、米国特許第5,445,934号:発明の名称「Array of oligonucleotides on a solid substrate」(これは、参考として本明細書に援用される)に記載される方法によって形成され得、ここで、オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、SNPプローブ)は、空間光指向性フォトリソグラフィーを用いてインサイチュで合成される。 Array of materials also may Foder et al, U.S. Pat. No. 5,445,934: entitled "Array of oligonucleotides on a solid substrate" (which is herein incorporated by reference) method described in It is formed by, where, oligonucleotide probes (e.g., SNP probes) is synthesized in situ using a spatial light directivity photolithography. このようなアレイは、本発明の微小流体デバイスの基板またはベース(base)として使用され、その結果、反応部位に対応する基板の領域(例えば、ブラインドフィルチャンバ(blind fill chamber))が、その基板の既知の位置に配置された1つまたは好ましくは1つよりも多いオリゴヌクレオチドプローブを含む。 Such arrays may be used as a substrate or base of the microfluidic device of the present invention (base), as a result, the area of ​​the substrate corresponding to the reaction site (e.g., blind fill chamber (blind fill chamber)), the substrate one or preferably disposed at known locations contains more than one oligonucleotide probe. 分割する微小流体構造物の場合(例えば、本明細書の図15に示されるもの)において、反応部位(曲がった流体チャネルに沿って正方形の箱で示される)は、複数の異なるSNPプローブを含み、好ましくは個体の集団から個体を同定するのに適切なSNPプローブのコレクションを含み、そして好ましくは、この曲がった流体チャネルに沿った複数の反応部位(複数の個体に由来する核酸配列を含む流体サンプルが曲がったフローチャネルに導入された場合)および作動される場合に曲がったフローチャネルと連絡する複数のバルブは、曲がったフローチャネルを分割し、それによって、各反応部位中の流体サンプルの画分を含むように、各反応部位を互いから分離する。 In the case of microfluidic structures for dividing (e.g., that shown in Figure 15 of this specification), the reaction site (shown by curved along the fluid channel square box) includes a plurality of different SNP probe preferably includes a collection of appropriate SNP probes to identify individuals from a population of individuals, and preferably, the fluid comprising a nucleic acid sequence derived from this bent plurality of reaction sites (multiple individuals along the fluid channel has a plurality of valves in communication with the bent flow channel when the sample is flow when introduced into the channel) and operating bent divides the curved flow channel, whereby the image of the fluid sample in each reaction site to include the minutes to separate the respective reaction sites from one another. サンプルの成分の増幅は、各反応部位内に位置するSNPプローブのアレイに結合するために分子(例えば、核酸分子)の数を増加するように行われ得る。 Amplification of the sample components, molecules to bind to the array of SNP probes located within each reaction site (e.g., a nucleic acid molecule) may be performed to increase the number of. いくつかの実施形態では、曲がった流体チャネルに沿った各々の反応部位は、同じアレイであり、すなわち、配置された同じSNPプローブを有し、そして他の実施形態では、曲がった流体チャネルに沿った2つ以上の反応部位は、異なるセットのSNPプローブを有する。 In some embodiments, the reaction site of each along a curved fluid channel are the same array, i.e., have placed the same SNP probes, and in other embodiments, along a curved fluid channel two or more reactive sites was has a SNP probe different sets. 他の分割した流体チャネルアーキテクチャ(例えば、分岐システムおよび/または分岐した分岐システムなど)もまた使用され得る。 Other divided fluid channel architecture (e.g., a branch system and / or branched branch system) may also be used. 他の配置技術(例えば、本明細書で記載されるスポッティング)も同様に、曲がった流体チャネルまたは一般的に分岐した流体チャネルに沿った分割可能な反応部位内に位置するアレイを形成するために使用され得る。 Other placement techniques (e.g., by spotting the described herein) as well, in order to form an array that is located a curved fluid channel or generally branched dividable reaction sites along the fluid channel It can be used.

以下の実施例は、本明細書中で開示されるデバイスおよび方法の特定の局面をさらに示すために提供される。 The following examples are provided to further demonstrate certain aspects of the devices and methods disclosed herein. これらの実施例は、本発明を限定するものとみなされるべきではない。 These examples should not be considered as limiting the present invention.

(実施例1) (Example 1)
(シグナル強度評価) (Signal intensity evaluation)
I. I. 緒言 この一連の実験の目的は、本明細書に示される設計の微小流体デバイスを用いて、Macro TaqMan反応に関して50%を超えるシグナル強度で、成功したPCR反応が行われ得ることを実証することであった。 Introduction The purpose of this series of experiments, using the microfluidic device of the design shown herein, in signal intensity greater than 50% for Macro TaqMan reactions, to demonstrate that the successful PCR reactions can be carried out there were.

II. II. 微小流体デバイス MSLプロセスを用いて組み立てられる三層微小流体デバイスを設計し、以下の実施例で記載される実験を行うために組み立てた。 The three-layer microfluidic device assembled by using the microfluidic device MSL processes were designed and assembled to perform the experiments described in the following examples. 図7Aはこのデバイスの断面図を示す。 Figure 7A is a sectional view of this device. 示されるように、このデバイス700は、フローチャネルが形成される層722を備える。 As shown, the device 700 includes a layer 722 of the flow channel is formed. この流体層722は、上にある層720と下にあるシーリング層724の間にはさまれ、この上にある層は、制御層および保護層を備える。 This fluid layer 722 is sandwiched between the sealing layer 724 and the underlying layer 720 on the top layer overlying the includes a control layer and a protective layer. このシーリング層724は、フローチャネルの片側を形成する。 The sealing layer 724 forms one side of the flow channel. こうして得られる三層構造物は、基板726(この例では、スライドまたはカバースリップ)に固定され、このことが構造的な固さを提供し、熱伝導率を増加させ、そして微小流体デバイス700の底部からの蒸発を防止することに役立つ。 Three-layer structure thus obtained, (in this example, a slide or coverslip) substrate 726 is fixed, this is to provide structural rigidity, increased thermal conductivity, and the microfluidic device 700 It helps to prevent evaporation from the bottom.

図7Bは、フロー層722におけるフローチャネルの設計、ならびに制御/保護層720における制御チャネルおよび保護チャネルの設計の概略図を示す。 Figure 7B shows a schematic diagram of a design of a control channel and protection channel in the flow channel design, as well as the control / protection layer 720 in the flow layer 722. デバイス700は、10個の独立したフローチャネル702からなり、各々はそれ自体の入口708を有し、そしてブラインドチャネル704を分岐し、各ブラインドチャネル704は1nlの反応部位706を有する。 Device 700 consists of ten independent flow channels 702, each having its own inlet 708, and branching blind channels 704, each blind channel 704 having a reaction site 706 of 1 nl. デバイス700は、制御ライン712のネットワークを含み、このネットワークは、十分な圧力が適用されるときに反応部位706を分離し、一連の保護チャネル716もまた、液体が反応部位706から蒸発することを妨げるために備えられる;流体は入口718を介して導入される。 Device 700 includes a network of control lines 712, the network, separates the reaction sites 706 when sufficient pressure is applied, a series of guard channels 716 are also that the liquid evaporates from the reaction sites 706 provided in order to prevent; fluid is introduced through the inlet 718.

II. II. 実験のセットアップ 男性のヒトゲノムDNAに由来するβ−アクチン遺伝子のエキソン3(Promega,Madison WI)を増幅するために、β−アクチンプライマーおよびTaqManプローブを用いるPCR反応をデバイス700で行った。 Exon 3 (Promega, Madison WI) of β- actin gene derived from human genomic DNA setup men experiments to amplify the PCR reactions were performed using β- actin primers and TaqMan probes on the device 700. このTaqMan反応は、以下の成分からなる:1× TaqMan緩衝液A(50mM KCl、10mM Tris−HCl、0.01M EDTA、60nM 受動的参照1(Passive Reference 1)(PR1)、pH8.3);3.5〜4.0mM MgCl;200nM dATP、dCTP、dGTP、400nM dUTP;300nM β−アクチン順方向プライマーおよび逆方向プライマー;200nM FAM標識β−アクチンプローブ;0.01U/μl AmpEraseUNG(Applied Biosystems,Foster City CA);0.1〜0.2U/μl DyNAzyme(Finnzyme,Espoo,Finland);0.5% Triton−x−100(Sigma,St. Lo The TaqMan reaction consists of the following components: 1 × TaqMan Buffer A (50mM KCl, 10mM Tris-HCl, 0.01M EDTA, 60nM Passive reference 1 (Passive Reference 1) (PR1), pH8.3); 3.5~4.0mM MgCl; 200nM dATP, dCTP, dGTP, 400nM dUTP; 300nM β- actin forward primer and reverse primer; 200 nM FAM-labeled beta-actin probe; 0.01U / μl AmpEraseUNG (Applied Biosystems, Foster City CA); 0.1~0.2U / μl DyNAzyme (Finnzyme, Espoo, Finland);. 0.5% Triton-x-100 (Sigma, St Lo is,MO);0.8μg/μl ゼラチン(Calbiochem,San Diego,CA);5.0% グリセロール(Sigma,St.Louis,MO);脱イオン水ならびに男性のゲノムDNA。 It is, MO); 0.8μg / μl gelatin (Calbiochem, San Diego, CA); 5.0% glycerol (Sigma, St.Louis, MO); genomic DNA of deionized water and men. この反応成分を、25μlの総反応容積を生じるように添加した。 The reaction components were added to produce a total reaction volume of 25 [mu] l. 標的DNA以外のすべての上記TaqMan反応成分からなるネガティブコントロール(コントロール)を、PCR反応の各セットに含めた。 Negative controls (Control) composed of all of the above TaqMan reaction components other than the target DNA, were included in each set of PCR reactions.

一旦、上記TapMan反応サンプルおよびコントロールを準備すると、1mlシリンジに取り付けたゲルローディングピペットチップを用いることによって、それらを微小流体デバイス700に注入した。 Once the the TapMan preparing a reaction sample and control, by using a gel loading pipette tip attached to 1ml syringe, and injected them into microfluidic device 700. このピペットチップを反応サンプルで満たし、次いで、708を介して流体に挿入した。 Meet this pipette tip with the reaction samples and then inserted into the fluid via 708. すべてのブラインドチャネル704および反応部位706が満たされるまでシリンジに背圧を適用することによって、手動でフローチャネル702を満たした。 By applying a back pressure to the syringe until all the blind channels 704 and reaction sites 706 are filled, filled flow channel 702 manually. すべてのサンプルがフローライン702、704に充填された後に、制御ライン712を脱イオン水で満たし、15〜20psiに加圧した。 After all samples have been filled in the flow line 702 and 704, satisfy the control line 712 with deionized water and pressurized to 15~20Psi. この加圧した制御ライン712を作動させてバルブを閉じ、サンプルを1nlのウェル706に分離した。 Closing the valve by operating the pressurized control lines 712 to separate the sample into the well 706 of 1 nl. 次いで、保護チャネル716を脱イオン水で満たし、5〜7psiに加圧した。 Then filled protection channel 716 with deionized water and pressurized to 5~7Psi. ミネラルオイル(15μl)(Sigma)をサーモサイクラーのフラットプレートに置き、次いで、微小流体デバイス/カバーガラス700をこのサーモサイクラーに置いた。 Mineral oil (15 [mu] l) (Sigma) was placed on a flat plate thermocycler was then placed microfluidic device / coverglass 700 to the thermocycler. 次いで、初期傾斜(initial ramp)、および3段階もしくは2段階のいずれかの熱サイクリングプロフィールを用いて、微小流体デバイス700を熱サイクリングした: Then, the initial slope (initial 'ramp), and 3 with either thermal cycling profile step or two steps, a microfluidic device 700 was thermally cycling:
1. 1. 95℃まで初期傾斜し、1分間維持する(75℃まで1秒あたり1.0℃、95℃まで1秒あたり0.1℃) Initial inclination to 95 ° C., maintained for 1 minute (1.0 ° C. per second to 75 ° C., 0.1 ° C. per second to 95 ° C.)
2. 2. 3段階の熱サイクリングを40サイクル(92℃で30秒間、54℃で30秒間、そして72℃で1分間);または 3. 3 stages of thermal cycling for 40 cycles (92 ° C. for 30 seconds, 30 seconds at 54 ° C., and 1 min at 72 ° C.); or 3. 2段階の熱サイクリングを40サイクル(92℃で30秒間、そして60℃で60秒間)。 The two-step thermal cycling 40 cycles (92 ° C. for 30 seconds, and 60 seconds at 60 ° C.).

残りの反応混合物を含むMicroAmpチューブ(Applied Biosystems,Foster City,CA)(これらを微小流体デバイスで行った反応と区別するためにMacro TaqMan反応と称する)を、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems,Foster City,CA)に置き、9600モードで熱サイクリングした。 The remaining reaction mixture MicroAmp tube containing (Applied Biosystems, Foster City, CA) to (these referred to as Macro TaqMan reactions to distinguish them from reactions performed in the microfluidic devices), GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City , placed in CA), and thermal cycling in the 9600 mode. このMacro TaqMan反応は、微小流体デバイスで行った反応に対するマクロ的なコントロールとしての役割を果たした。 The Macro TaqMan reactions served as macroscopic controls for reactions performed in the microfluidic device. 上記Macro TaqMan反応について初期傾斜速度を制御しなかったこと以外は上記微小流体デバイスのプロトコルと一致するように、熱サイクリングプロトコルを設定した。 Except for not controlling the initial ramp rate for the Macro TaqMan reactions to coincide with the microfluidic device of the protocol, setting the thermal cycling protocol.

一旦、熱サイクリングが完了すると、制御ラインおよび保護ラインを減圧し、チップをガラススライド(VWR,West Chester,PA)に移した。 Once the thermal cycling is complete, the pressure was reduced control lines and protection lines were transferred tip glass slides (VWR, West Chester, PA) to. 次いで、このチップを、改変キャリアとともにArray WoRx Scanner(Applied Precision,Issaquah,WA)に置いた。 Then placed the chip, along with the modified carrier Array WoRx Scanner (Applied Precision, Issaquah, WA) to. 蛍光強度を、3つの異なる励起/放射波長について測定した:475/510nm(FAM)、510/560nm(VIC)、および580/640nm(受動的参照1(PR1))。 The fluorescence intensity was measured for three different excitation / emission wavelengths: 475 / 510nm (FAM), 510 / 560nm (VIC), and 580/640 nm (passive reference 1 (PR1)). Array Works Softwareを使用して、微小流体デバイスにおける蛍光を画像化し、各1nlウェルのシグナル強度およびバックグラウンド強度を測定した。 Use Array Works Software, to image the fluorescence in the microfluidic device, to measure the signal intensity and background intensity of each 1nl well. 次いで、この結果をMicrosoft Excelファイルを用いて分析して、β−アクチンTaqMan反応についてのFAM/PR1比を計算した。 Then the results were analyzed using a Microsoft Excel file was calculated FAM / PR1 ratio for β- actin TaqMan reactions. 従来のMacro TaqManについて、製造業者によって提供されたプロトコル(TaqMan PCR試薬キットプロトコル)に記載される計算を使用して、標的DNAに対するポジティブサンプルを決定した。 For conventional Macro TaqMan, using the calculations described in the protocol provided by the manufacturer (TaqMan PCR Reagent Kit Protocol) to determine the positive samples for target DNA. サンプルのFAM/PR1比をコントロールのFAM/PR1比で除算することによって、シグナル強度を計算した。 By dividing the FAM / PR1 ratio of the sample with FAM / PR1 ratio of the control was calculated signal strength. 成功した反応を、99%の信頼閾値レベルを超えるサンプル比として規定した。 The successful reaction was defined as a sample ratio above the confidence threshold level of 99%.

III. III. 結果 最初に、AmpliTaq Gold(Applied Biosystems,Foster City,CA)をTaqMan反応で使用し、1.5〜2.0のFAM/PR1/コントロール比を生じ、5.0〜14.0のMacro TaqMan反応比と比較した。 Results First, AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) was used in TaqMan reactions occur FAM / PR1 / Control ratio of 1.5 to 2.0, 5.0 to 14.0 of Macro TaqMan reactions It was compared to the ratio. 結果はポジティブであったが、シグナル強度の増加が望ましかった。 The results were positive, but the increase in signal intensity was desirable. それゆえ、DyNAzymeポリメラーゼの熱安定性、校正、および不純物に対する抵抗性に起因して、AmpliTaq GoldポリメラーゼをDyNAzymeポリメラーゼに置き換えた。 Thus, the thermal stability of DyNAzyme polymerase, calibration, and due to the resistance to impurities, replacing the AmpliTaq Gold polymerase DyNAzyme polymerase. 0.025U/μlの標準的なMacro TaqMan DyNAzyme濃度を、微小流体実験で使用した。 Standard Macro TaqMan DyNAzyme concentration of 0.025 U / [mu] l, was used in the microfluidic experiments. このDyNAzymeへのポリメラーゼの変更は、3.5〜5.8のFAM/ROX/コントロール比を生じた。 Change of the polymerase to this DyNAzyme resulted in a FAM / ROX / control ratio of 3.5 to 5.8. シグナル強度は改善されたが、一貫した結果を得ることは困難であった。 Signal strength was improved, but it was difficult to obtain consistent results. 理由として、いくつかのタンパク質がPDMSに結合すること、ポリメラーゼの濃度が増加したこと、および表面を改変する添加物が含まれていたことが分かっている。 The reason, that some proteins bind to the PDMS, it has been found that the concentration of the polymerase was increased and that additives modifying the surface is included. 2つの増加させた濃度のDyNAzymeについて試験した(微小流体デバイス中、1nlあたり100pgまたは10pgのゲノムDNAで、Macro TaqManについての標準的な濃度の8倍(0.2U/μl)および4倍(0.1U/μl))。 Were tested for the two increased so concentrations of DyNAzyme (in microfluidic devices, in the genomic DNA of 100pg or 10pg per 1 nl, 8 times the standard concentration for Macro TaqMan (0.2U / μl) and 4 times (0 .1U / μl)). ゼラチン、グリセロール、および0.5% Triton−x−100を添加して、ポリメラーゼがPDMSに結合しないようにした。 Gelatin, glycerol, and the addition of 0.5% Triton-x-100, polymerase was prevented from being bonded to the PDMS. 微小流体デバイス(チップ)およびMacro TaqManコントロールの反応の結果を、図8に示す。 The result of the reaction of the microfluidic device (chip) and Macro TaqMan controls are shown in FIG.

微小流体TaqMan反応比は、4.9〜8.3の範囲であり、一方Macro TaqMan反応は、7.7〜9.7の範囲である。 The microfluidic TaqMan reaction ratios are in the range of 4.9 to 8.3, whereas Macro TaqMan reactions range from 7.7 to 9.7. したがって、チップにおけるTaqMan反応のシグナル強度は、Macro TaqMan反応の87%までである。 Thus, the signal strength of the TaqMan reactions in chip is up to 87% of the Macro TaqMan reactions. 4倍のDyNAzymeと8倍のDyNAzymeとの間で有意な相違は存在しなかった。 Significant difference between four times the DyNAzyme and 8 times DyNAzyme did not exist. この結果は、PCR反応が、Macro TaqMan反応と比較した場合に、微小流体デバイスにおいて50%よりも高いシグナル強度で行われ得ることを示す。 This result indicates that the PCR reaction, when compared to the Macro TaqMan reactions can be performed at a higher signal strength than the 50% in the microfluidic device. この結果は、少なくとも4回の試みを通じて一貫している。 This result is consistent through at least four attempts.

(実施例2) (Example 2)
(スポッティング試薬) (Spotting reagent)
I. I. 緒言 本実験の目的は、微小流体デバイスにおける成功したスポット状の(spotted)PCR反応を実証することであった。 The purpose of the Introduction this experiment was to demonstrate the successful spot-shaped (spotted) PCR reactions in a microfluidic device. この文脈において用語「スポット状の(spotted)」とは、基板に試薬の小さな液滴(スポット)を置くことを指し、次いで、この基板は組み立てられて微小流体デバイスの一部になる。 The term "spot-shaped (spotted)" in this context, refers to placing a small drop of the reagent to the substrate (spot), then it becomes part of a microfluidic device substrate is assembled. スポットした試薬は、一般的に、PCRを行うために必要とされる試薬混合物のサブセットである。 Spotted reagents are generally a subset of the reagent mixture required for performing PCR.

II. II. 手順 A. Procedure A. 試薬のスポッティング コンタクトプリンティングプロセスによって、通常の試薬のスポッティングを行った。 By the reagent spotting contact printing process, it was spotted conventional reagents. 試薬を一連の供給源のウェルから金属ピンに取り、このピンを標的基板に接触させることによって堆積させた。 Takes reagent from a series of source wells on a metal pin and the pin is deposited by contacting the target substrate. このプリンティングプロセスは、図9にさらに概説される。 This printing process is further outlined in FIG. 示されるように、試薬を供給源(例えば、マイクロタイタープレート)から取り、次いで、この充填したピンを基板と接触させることによってプリントした。 As shown, reagent supply source (e.g., a microtiter plate) taken from, and then printed by bringing the filled pin into contact with the substrate. 脱イオン水中での攪拌からなる洗浄工程の後、真空乾燥させた。 After a washing step comprising a stirring in deionized water and dried in vacuo. この試薬スポットをプリントするために使用したシステムは、TeleChem「ChipMaker」ブランドのピンを使用するCartesian Technologies MicroSys 5100(Irvine,CA)であるが、他のシステムが上に記載されるように使用され得る。 System used to print the reagent spots, Cartesian Technologies MicroSys 5100 (Irvine, CA) for use pins TeleChem "ChipMaker" brand is a can be used as another system is described above .

使用したピンは、Telechem ChipMaker 4ピンであり、このピンは、エレクトロ・ミルド・スロット(electo−milled slot)(図9を参照のこと)を組み込んで、取り込み容積を増加させる(それゆえ、プリント可能なスポットの数が増加する)。 Pins used was Telechem ChipMaker 4-pin, this pin incorporates electro-milled slot (electo-milled slot) (see FIG. 9) to increase the uptake volume (and hence printable such number is an increase in the spot). 使用した操作条件(代表的には、75%相対湿度および温度約25℃)下で、1つのピンで1回の充填サイクルあたり、100個よりも多くのスポットがプリントされた。 (Typically, 75% relative humidity and a temperature of about 25 ° C.) operating conditions used under, per filling cycle in one pin, are 100 than many spots were printed. 上の条件下で、PDMS基板上にスポットされた試薬の容積は、0.1nLのオーダーである。 Under the conditions of the above, the volume of the spotted reagent on PDMS substrate is on the order of 0.1 nL.

ピンの先端部の寸法は、125×125μmである。 The dimensions of the distal end portion of the pin is 125 × 125 [mu] m. 乾燥した試薬の最終的なスポットは、この寸法よりも実質的に小さい(直径7μmほど)が、ピンサイズは、下限を容易に達成可能なスポット間隔に規定する。 The final spot of dried reagent is substantially smaller than the dimension (diameter of about 7 [mu] m) is, the pin size defines a lower limit to the readily achievable spot spacing. この達成可能な間隔は、最終的なデバイスにおける最も小さいウェルとウェルとのピッチを決定する。 The achievable spacing determines the pitch of the smallest well and the well in the final device. このようなデバイスおよび上記の方法を使用して、180μmの間隔を有するアレイを達成した。 Using such a device and the method described above, achieved an array having a spacing of 180 [mu] m. ワーキングチップに構築したアレイは、600ミクロン〜1300ミクロンの間隔を有する傾向がある。 Array constructed in the working chips tend to have a spacing of 600 microns to 1300 microns.

スポッティングを一度に1つのピンのみを用いて行った。 The spotting was performed using only one pin at a time. しかし、使用するシステムは、32ピンまで適合し得るピンヘッドを有する。 However, the system used has a pin head which can accommodate up to 32 pins. 標準的なサイズのチップ(20×25mmのオーダーのアレイの寸法)をプリンティングすることは、5分とかからない。 To printing the chip (dimensions of the array of the order of 20 × 25 mm) of a standard size, it does not take 5 minutes.

B. B. スポットしたチップの組み立て 上記PCRデバイスのフロー層および制御層を、上に記載される通常のMSLプロセスに従って組み立てる。 The flowing layer and the control layer of the assembly the PCR device spots chips assembled according to the normal MSL process described above. 微小流体デバイスの設計は、実施例1に記載されるものと同じである。 Design of the microfluidic device are the same as those described in Example 1. 平行して、30:1の構成比A:Bを有する150μmの厚さのPDMSからなる基板層を、無地のシリコンウエハーのスピンコーティングを介して形成し、次いで、80℃で90分間硬化させる。 In parallel, 30: 1 Ratio A: a substrate layer made of PDMS having a thickness of 150μm with B, formed through a spin coating plain silicon wafer, then cured at 80 ° C. 90 minutes .

硬化させた無地の基板層のPDMS(図7Aのシーリング/基板層724)は、試薬のスポッティングのための標的としての役割を果たす。 PDMS plain substrate layer cured (sealing / substrate layer 724 of FIG. 7A) serves as a target for spotting of the reagent. スポットのパターンは、基板上にプリンティングされ、この基板はまだ無地のウエハーにある。 Pattern of spots is printing on a substrate, the substrate is still in the plain wafer. PCR反応のためにスポットした試薬は、増幅すべき特定の遺伝子に対して特異的なプライマーおよびプローブであった。 Reagents spotted for PCR reactions were primers and probes specific for the particular gene to be amplified. スポットした試薬は、1:1:1の体積比の、300nM β−アクチン順方向プライマー(FP)、300nM β−アクチン逆方向プライマー(RP)、および200nM β−アクチンプローブ(Prb)を含んでいた。 Spotted reagent is 1: 1: 1 volume ratio, 300 nM beta-actin forward primer (FP), 300 nM beta-actin reverse primer (RP), and contained 200 nM beta-actin probe (Prb) . いくつかの場合において、スポットした混合物を濃縮することによって化学反応をさらに調整することが有用である。 In some cases, it is useful to further adjust the chemical reaction by concentrating the mixture spotted. プライマーおよびプローブの濃度が、通常のマクロ的なレシピ値と等しいように、またはそれよりもわずかに高いように濃度を調整することにより、一貫して良好な結果が得られることが見出されている。 The concentration of the primers and probes, as equal to the normal macroscopic recipe value, or by adjusting the concentration to be slightly higher than that, been found that good results consistently obtain there. したがって、スポットした試薬を、マクロ反応の3倍および4倍の濃度に濃縮する。 Thus, the reagent spots and concentrated 3 times and 4 times the concentration of the macro reaction. 試薬の濃縮は、加熱かつ真空遠心し、相対的なFP:RP:Prb比を変えないCentrivap中で行われる。 Concentration of the reagents, heating and vacuum centrifuge, relative FP: RP: carried out in Prb without changing the ratio Centrivap. 増大したスポット濃度は、試薬を1nLの反応容積に再懸濁する場合に、正しい最終濃度をもたらす。 Increased spot concentration when resuspending the reagent in the reaction volume of 1 nL, resulting in the correct final concentration. スポットされる試薬はプライマーおよびプローブに限定される必要はない:そしてまた3つすべて(FP、RPおよびPrb)をスポットしなくてもよい。 Reagents spot need not be limited to primers and probes: and also all three (FP, RP and Prb) may not be spotted. プローブのみをスポットする適用、またはプライマーのうちの一方をスポットする適用さえ行われ得る。 Apply spotting probe alone, or applied to spot one of the primers may even take place. サンプルプライマー/プローブセットがTaqMan β−アクチンおよびTaqMan RNAse−Pである実験を行った。 Sample primer / probe sets were experimented a TaqMan beta-actin and TaqMan RNAse-P.

基板層へのスポッティングプロセスの後に、組み合わせたフロー層と制御層(すなわち、図7Aの層720および722)とを、スポットパターンと整列させ、接触させた。 After the spotting process onto the substrate layer, the combined flow layer control layer (i.e., layers 720 and 722 in FIG. 7A) and to align the spot pattern were contacted. 80℃で60分〜90分間さらに熱して、基板を残りのチップと結合させた。 80 further heated for 60 minutes to 90 minutes at ° C., the substrate was bonded to the remainder of the chip. チップを組み立てた後、(実施例1に記載した)PCR反応の残りの成分をこのチップのフローチャネルに注入し、チップを実施例1に記載されるように熱サイクリングする。 After assembling the chips, was injected (described in Example 1) the remaining components of the PCR reaction in the flow channel of the chip, thermal cycling as described chip in Example 1.

III. III. 結果 プライマー(順方向プライマーおよび逆方向プライマー)とプローブ分子とをスポットしたデバイスを用いて、PCR反応が首尾よくかつ再現可能に行われた。 Results primers (forward and reverse primers) and using a device spotting and probe molecules, PCR reaction was carried out successfully and reproducible. 反応が首尾よく行われたチップに由来するデータの例を、図10に示す。 Examples of data which the reaction is derived from successfully performed chips, shown in FIG. 10.

スポットした試薬は、実施例1に規定されるような成功したPCR反応をもたらした。 Spot reagent resulted in successful PCR reactions as defined in Example 1. 2段階および3段階の熱サイクリングプロトコルを用いて、成功した反応が行われた。 Using a two-step and three-step thermal cycling protocol, successful reaction has been carried out.

(実施例3) (Example 3)
(遺伝子タイピング) (Genotyping)
I. I. 緒言 以下の実験の目的は、本明細書に記載されるような微小流体デバイスまたはチップを利用して遺伝子タイピング実験が行われ得ることを実証することであった。 Introduction The purpose of the following experiments was to demonstrate that by utilizing a microfluidic device or chip such as described herein genotyping experiments can be performed. 具体的には、上記デバイスで行われる反応が十分な感度を有するかどうかを決定し、そしてβ−アクチンのほかに、他のプライマー/プローブセットが微小流体デバイスで実施され得ることを確実にするように、これらの実験を設計した。 Specifically, to determine whether the reaction takes place in the device has a sufficient sensitivity, and β- Besides actin, to ensure that other primer / probe set can be carried out in microfluidic device as described above, it was designed these experiments.

II. II. 方法/結果 A. Way / result test A. RNase P実験 RNase P TaqMan反応(Applied Biosystems;Foster City,CA)を、実施例1に記載されるように微小流体デバイスで行って、他のプライマー/プローブセットが検出可能な結果を生じることを実証した。 Demonstration; (Foster City, CA Applied Biosystems) and carried out in microfluidic device as described in Example 1, that other primer / probe sets produce a potential detection result RNase P Experiment RNase P TaqMan reactions did. RNase Pプライマー/プローブセットがβ−アクチンプライマー/プローブセットと対照的に単一コピー遺伝子(2コピー/ゲノム)を検出するので、RNase P反応もまたより高いレベルの感度を必要とする。 And detects RNase P primer / probe set and β- actin primer / probe set as opposed to a single copy gene (2 copies / genome), RNase P reaction also requires a higher level of sensitivity. β−アクチンセットは、単一コピーβ-アクチン遺伝子および数個の偽遺伝子を検出し、これは1ゲノムあたりまとめて合計およそ17コピーである。 β- actin set detects a single copy β- actin gene and several pseudogenes, which is the sum of approximately 17 copies collectively per genome. β−アクチンプライマー/プローブセットをRNase Pプライマー/プローブセットに置き換えたことを除いて実施例1に記載したものと同じ成分で、RNase P反応を行った。 The β- actin primer / probe set with the same ingredients as described in Example 1 except that was replaced by RNase P primer / probe set was subjected to RNase P reaction. さらに、蛍光シグナルを増強するために、RNase Pプライマー/プローブセットを、製造業者の推奨する値の4倍で使用した。 Furthermore, in order to enhance the fluorescent signal, the RNase P primer / probe set was used at 4 times the recommended value of the manufacturer. VIC色素をRNase Pに対するプローブに結合させ、この分析をVIC/PR1比に集中した。 The VIC dye was coupled to the probe for RNase P, it focused the analysis on VIC / PR1 ratio. 4回の実験のうちの1つの結果を、図11に示す。 4 times the result of one of the experiment, shown in Figure 11.

Macro TaqMan反応についてのVIC/PR1/コントロール比は、1.23である。 VIC / PR1 / Control ratios for Macro TaqMan reactions are 1.23. 微小流体デバイスにおけるTaqMan反応についての対応する比は、1.11および1.12である。 Corresponding ratio for TaqMan reactions in the microfluidic device are 1.11 and 1.12. 微小流体デバイスにおけるゲノムDNAサンプルの比は、99%の信頼閾値レベルを上回る。 The ratio of the genomic DNA samples in the microfluidic device is greater than a confidence threshold level of 99%. さらに、微小流体デバイスにおけるTaqMan反応のシグナル強度は、Macro TaqMan反応の50%および93.7%である。 Moreover, the signal strength of the TaqMan reactions in the microfluidic device is 50% and 93.7% of the Macro TaqMan reactions. 微小流体デバイスにおけるコントロールのTaqMan反応は、0.006および0.012の標準偏差を有し、これは、微小流体デバイスにわたる反応の一貫性を示す。 TaqMan reaction control in a microfluidic device has a standard deviation of 0.006 and 0.012, indicating the consistency of the reaction over the microfluidic device. したがって、上記チップにおけるTaqMan反応が、1ゲノムあたり2コピーを検出するのに十分に感度がよいことが決定される。 Thus, TaqMan reactions in the chip is sufficiently sensitive that good is determined to detect 2 copies per genome.

B. B. DNA希釈実験 微小流体デバイスにおけるTaqMan反応の感度をさらに決定するために、β−アクチンプライマー/プローブセットを用いて、ゲノムDNAの希釈物を試験した。 To further determine the sensitivity of TaqMan reactions in DNA dilution experiments microfluidic device, using β- actin primer / probe sets were tested dilutions of genomic DNA. 反応組成は、4倍のDyNAzymeおよびゲノムDNAの希釈物を用いて、概して、実施例1に記載されるように構成した。 Reaction composition, using dilutions of four times the DyNAzyme and genomic DNA, generally constructed as described in Example 1. ゲノムDNAを、0.25pg/nl(これは、1nlあたり約1コピーに対応する)まで希釈した。 Genomic DNA, 0.25pg / nl (which corresponds to approximately 1 copy per 1 nl) was diluted to. 1つの希釈シリーズの結果を、図12に示す。 The results of one dilution series is shown in FIG. 12.

ポアソン分布によれば、平均標的数が1の場合、ウェルの総数の37%がネガティブであるべきである。 According to a Poisson distribution, if the average number target is 1, 37% of the total number of wells should be negative. ウェル番号5、6および7は、計算閾値よりも下であり、したがって、ネガティブである。 Well number 5, 6 and 7 are below a than the calculated threshold value, therefore, is negative. このことは、微小流体チップにおけるβ−アクチンTaqMan反応が、1nlあたり平均1コピーを検出し得ることを示唆する。 This suggests that β- actin TaqMan reactions in the microfluidic chip can detect an average of copies per 1 nl. したがって、微小流体デバイスにおける反応の感度は、遺伝子タイピング実験を行うのに十分である。 Thus, the sensitivity of the reactions in the microfluidic device is sufficient to perform genotyping experiments.

C. C. 遺伝子タイピング実験 微小流体デバイスにおけるTaqManは少ない標的数を検出し得るので、SNP(Single Nucleotide Polymorphism:一塩基多型)遺伝子タイピングの予備試験を、Predetermined Allelic Discriminationキット(Applied Biosystems;Foster City,CA)を用いて、CYP2D6 P450シトクロム遺伝子に対して行った。 Since TaqMan may detect a small target number in genotyping experiments microfluidic device, SNP: a preliminary test (Single Nucleotide Polymorphism single nucleotide polymorphism) genotyping, Predetermined Allelic Discrimination kit (Applied Biosystems; Foster City, CA) and used, was carried out on CYP2D6 P450 cytochrome gene. このキットは、1つのプライマーセットおよび2つのプローブ;野生型対立遺伝子もしくは参照対立遺伝子に対して標識されたFAM、CYP2D6 1、およびCYP2D6 3変異体対立遺伝子もしくは改変体遺伝子に対して標識されたVIC 含む。 The kit, one primer set and two probes; labeled against FAM labeled relative to a wild-type allele or reference allele, CYP2D6 * 1, and CYP2D6 * 3 mutant allele or variant gene It was, including the VIC. ゲノムDNAとともに各々の対立遺伝子に対するポジティブコントロール(PCR産物)を、実施例1に記載される条件と同じ条件を用いて、上記デバイスで試験した。 With genomic DNA positive control (PCR product) for each allele, using the same conditions as described in Example 1, it was tested in the device. 1つの実験に由来する結果を、図13および図14に示す。 The results from one experiment are shown in FIGS. 13 and 14. 実験を少なくとも3回繰り返して、結果を確認し、信頼性を実証した。 Repeat at least three times the experiment, to see the results, and demonstrated reliability.

図13に示されるように、Al−1(対立遺伝子1、CYP2D6 1野生型対立遺伝子)およびゲノムDNA(100pg/nl)は、それぞれ、3.5および2.2の平均VIC/PR1/コントロール比を生じ、これは、このゲノムDNAがCYP2D6 1(野生型対立遺伝子)に対してポジティブであったことを示す。 As shown in FIG. 13, Al-1 (allele 1, CYP2D6 * 1 wild type allele) and genomic DNA (100 pg / nl), respectively, the average VIC / PR1 / Control 3.5 and 2.2 resulting ratio, which indicates that this genomic DNA was positive for CYP2D6 * 1 (wild-type allele). これらの値は、反応についての閾値限界を上回る。 These values exceed the threshold limit boundary for the reaction. 微小流体デバイスにおけるTaqMan反応のシグナル強度は、それぞれ、Macro TaqManコントロールの59%および40%である。 Signal intensities of TaqMan reactions in the microfluidic device, respectively, a 59% and 40% of the Macro TaqMan controls. Al−2(対立遺伝子2、CYP2D6 3変異体対立遺伝子もしくは改変体遺伝子)(これは、VICチャネルにおいてネガティブであるべきである)は、コントロールを超えるいくつかのシグナルを示し(1.5)、これは、FAM蛍光が検出器のVICチャネルに漏れることに起因するものと思われる。 Al-2 (allele 2, CYP2D6 * 3 mutant allele or variant gene) (This should be negative in VIC channel), it shows some signal above control (1.5) , which, FAM fluorescence is considered to be attributable to leak to VIC channel of the detector. この漏出は、改善された検出プロセスによって最小限にされ得る。 This leakage may be minimized by improved detection process.

Al−2ポジティブコントロールは、3.0の平均FAM/PR1/コントロール比を生じ、これは、Macro TaqManシグナルの37%であり、計算閾値限界を上回った(図14を参照のこと)。 Al-2 positive control gave an average FAM / PR1 / Control ratio of 3.0, which is 37% of the Macro TaqMan signal exceeds the calculated threshold limit boundary (see Figure 14). ゲノムサンプルは、CYP2D6 3変異体対立遺伝子に対してネガティブであり、CYP2D6 3対立遺伝子の頻度が低いので予期された結果である。 Genomic samples are negative for CYP2D6 * 3 mutant allele, which is a result of the expected due to the low frequency of CYP2D6 * 3 allele. 再度、検出器のFAMチャネルへのAl−1、VICプローブのいくらかの漏出が存在するようである。 Again, it seems some leakage of Al-1, VIC probe into the FAM channel of the detector is present. 全体的に、SNP検出反応は、微小流体デバイスで成功した。 Overall, SNP detection reactions were successful in the microfluidic device.

(実施例4) (Example 4)
(ゲル電気泳動によるPCRの確認) (Confirmation of PCR by gel electrophoresis)
I. I. 緒言 DNAの増幅を証明する代替的な方法が微小流体デバイスで生じるように、ゲル電気泳動によってPCR産物を検出するための実験を行った。 An alternative method to prove amplification of Introduction DNA as occurs in the microfluidic device, an experiment was performed to detect the PCR products by gel electrophoresis. TaqManプローブを省きβ−アクチン順方向プライマーをFAMに結合させたことを除いて、PCR反応組成は実施例1に記載したとおりであった。 The β- actin forward primer eliminates the TaqMan probe, except that bound to FAM, PCR reaction composition was as described in Example 1.

II. II. 手順 A. Procedure A. 微小流体デバイス MSLプロセスを使用して製造される三層微小流体デバイスを、本実施例に記載される実験を行うために設計し、製造した;図15は、この設計の概略図を示す。 The three-layer microfluidic devices fabricated using the microfluidic device MSL process, was designed to perform the experiments described in this example was prepared; Figure 15 shows a schematic diagram of this design. このデバイス1500は、概して、サンプル領域1502および制御領域1504からなる。 The device 1500 generally consists of a sample region 1502 and a control region 1504. サンプル領域1502は、フローチャネル1506に沿って配置された長方形で表される341個の1nl反応部位1508を含み、このフローチャネルは、入口孔1510および出口孔1512を備える。 Sample area 1502 includes 341 pieces of 1nl reaction sites 1508 represented by the rectangles arranged along the flow channel 1506, the flow channel comprises an inlet hole 1510 and an outlet hole 1512. 制御領域1504は、3つの制御フローチャネル1514を含み、各々が10個の1nlの反応部位1518(これもまた長方形で表される)および入口孔1516を含む。 Control region 1504 contains three control flow channels 1514, each reaction site ten 1 nl 1518 (which is also represented by the rectangles) and comprises an inlet hole 1516. 制御ライン1522のネットワークは、十分な圧力が入口孔1524に適用される場合に、各々の反応部位1508、1518を分離する。 Network control line 1522, if sufficient pressure is applied to the inlet port 1524, to separate the respective reaction sites 1508,1518. 一連の保護チャネル1520は、液体が反応部位1508、1518からエバポレートするのを防ぐために備えられる。 A series of guard channels 1520, liquid is provided to prevent the evaporated from the reaction sites 1508,1518. このデバイスは、実施例1に記載されるように三層デバイスである(図7Aを参照のこと)。 This device is a three-layer device as described in Example 1 (see FIG. 7A). この全チップがカバースリップに置かれる。 The entire chip is placed on the cover slip.

B. B. 実験のセットアップ 微小流体デバイス1500を充填し、実施例1に記載される3つの温度プロフィールを用いて熱サイクリングした。 Filling the setup microfluidic device 1500 of the experiment, it was thermal cycling using three temperature profile described in Example 1. 残りの反応サンプルを、微小流体デバイス1500に関する熱サイクリングプロフィールと同じ熱サイクリングプロフィールを用いてGeneAmp 9700で熱サイクリングした。 The remaining reaction sample was thermally cycling GeneAmp 9700 using the same thermal cycling profile as thermal cycling profiles for the microfluidic device 1500. 熱サイクリングが完了した後、反応生成物を回収した。 After the thermal cycling was complete, the reaction product was recovered. 増幅されたDNAを回収するために、3μlの水をサンプル入力孔1506に注入し、そして3〜4μlの生成物を出口孔1512から取り出した。 To recover the amplified DNA, injected 3μl of water sample input hole 1506, and the product removed for 3~4μl from the outlet hole 1512. デバイス1500およびMacro反応からの反応生成物を、2μlのExoSAP−IT(USB,Cleveland,OH)(これは、DNAエキソヌクレアーゼIおよびShrimpアルカリホスファターゼからなる)で処理して、過剰なヌクレオチドおよびプライマーを除去した。 The reaction products from device 1500 and Macro reactions, 2 [mu] l of ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH) (which consists of DNA Exonuclease I and Shrimp Alkaline Phosphatase) was treated with excess nucleotides and primers It was removed. Macro生成物を、1:10〜1:106に希釈した。 The Macro product, 1: 10-1: 106 diluted. デバイス1500からの生成物を脱水し、4μlのホルムアミドに再懸濁させた。 Dehydrating the product from the device 1500, resuspended in 4μl formamide.

III. III. 結果 両方の生成物を、ネガティブコントロールとともに、ポリアクリルアミドゲルで分析した。 Results Both products, along with negative controls were analyzed on polyacrylamide gels. 図16は、ゲル電気泳動の結果を示す。 Figure 16 shows the results of gel electrophoresis. 長さ294塩基対の適切なサイズのDNAバンドが、図16で観察される。 Appropriate size DNA band of 294 base pairs in length is observed in FIG. 16.

Macro反応に由来する生成物は、ゲルの左手側に示され、これは、β−アクチンPCR産物の予測されるサイズである約294塩基対に対応する。 Products derived from the Macro reactions are shown on the left hand side of the gel, which corresponds to approximately 294 base pairs is the expected size of the β- actin PCR product. ネガティブコントロールは、PCR産物を欠く。 Negative controls, lacking the PCR product. 同様に、上記デバイスに由来する生成物は、予測されるβ−アクチンPCR産物を生じた。 Similarly, products derived from the device yielded the expected β- actin PCR product. したがって、標的DNAは、微小流体デバイスで増幅された。 Thus, the target DNA was amplified in the micro fluidic device.

(実施例5) (Example 5)
(大規模な分割) (Large-scale division)
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、分子生物学において必須のツールになっている。 Polymerase chain reaction (PCR) has become the essential tool in molecular biology. 感度(DNAの単一分子の増幅)、特異性(一塩基ミスマッチを区別すること)およびダイナミックレンジ(リアルタイム計測で10 )の組み合わせは、PCRを既存の最も強力な分析ツールの1つにする。 Sensitivity (amplification of single molecules of DNA), combinations of specificities (possible to distinguish single base mismatches) and dynamic range (5 10 in real time measurement) makes it one of the PCR existing most powerful analytical tools . PCRの性能により反応容積が減少するように改善されることが実証された:本発明者らは、単一の微小流体チップで、1反応あたり90pLの容積で単一のテンプレート分子感度で、21,000の同時PCR反応を行った。 The reaction volume by the performance of the PCR is improved to reduce have been demonstrated: The present inventors have, in a single microfluidic chip, a single template molecule sensitivity volume per reaction 90PL, 21 , it was carried out simultaneous PCR reaction of 000.

図17a〜図17dは、微小流体デバイスを分割する単一のバンク(bank)および二重のバンクを示す。 Figure 17a~ Figure 17d shows a single bank (bank) and dual bank to divide the microfluidic device. ここで、多層ソフトリソグラフィー(MSL)(1)を使用して、エラストマー微小流体チップを作製し、このチップは、数種の液体サンプルの各々を多数の分離した反応容積に大規模に分割するための能動バルブを使用する。 Here, using multilayer soft lithography (MSL) (1), to prepare an elastomeric microfluidic chip, the chip is to divide the large scale of each of several liquid samples into a number of separate reaction volumes the use of the active valve. 入口1703(これは、微小流体デバイス1701の分岐した分割チャネルシステム1705に連絡している(図17b))へのサンプルの注入の後、各サンプルの2400の90pL容積1709を、単純な微小流体チャネルに沿って間隔をあけた閉鎖バルブ1707によって分離する(図17d)。 Inlet 1703 (which is in communication with the divided channel system 1705 that branches of microfluidic device 1701 (Fig. 17b)) after injection of the sample into the 90pL volume 1709 of 2400 of each sample, a simple microfluidic channel separated by a closure valve 1707 spaced along (Figure 17d). 次いで、このチップデバイスを、フラットプレートサーモサイクラーで熱サイクリングし、市販の蛍光読み取り器で画像化する。 Then, the chip device, and thermal cycling in a flat plate thermocycler, imaged with a commercial fluorescence reader.

テンプレートDNAの濃度を変化させ、そしてポジティブなTaqman tmシグナルを生じたウェルの数を測定することによって、上記チップにおいてPCRの性能を評価した。 The concentration of the template DNA is changed, and by measuring the number of wells that produced positive Taqman tm signal was used to evaluate the performance of the PCR in the chip. 本発明者らは、1ウェルあたりの平均コピー数が少ない場合にデジタル増幅が観察されることを見出した(図18aおよび図18b)。 The present inventors have found that a digital amplification is observed when the average number of copies per well is small (FIG. 18a and FIG. 18b). 1ウェルあたりの平均コピー数が1未満である場合でも、強いポジティブシグナルおよび明らかにネガティブなシグナルの混合が観察される;これは、単一コピーの標的でも良好な増幅が生じ得ることを意味する。 Even if the average number of copies per well is less than 1, a mixture of a strong positive signal and apparently negative signal is observed; this means that even better amplification in a single copy of the target may occur . ポジティブなウェルの数は、ポアソン分布によって1以上の標的のコピーを有すると計算されたウェルの数と一致した(図19)。 The number of positive wells was consistent with the number of calculated well to have a copy of one or more target by a Poisson distribution (Figure 19). この結果は、このシステムが単一コピーの標的からでも一貫して増幅を生じることを実証する。 The results demonstrate that this system results in a consistently amplified even from a single copy of the target. 微小流体Taqman tm PCRに由来する蛍光シグナル強度は、同じDNA濃度でのMacro PCR反応(このマクロ反応は、1反応あたり10 を超えるテンプレートコピーを含んでいたが)に匹敵した。 Fluorescent signal intensity derived from the microfluidic Taqman tm PCR is Macro PCR reaction in the same DNA concentration (this macro reaction is contained template copy more than 10 per reaction 4) was comparable to.

おそらく観察された忠実度の主な源は、標的の有効濃度である:90pL容積中の単一分子は、5μL容積中の単一分子よりも55,000倍濃縮されている。 Perhaps the main source of the observed fidelity is the effective concentration of the target: a single molecule in 90pL volume is concentrated 55,000 times than a single molecule in 5μL volume. 標的の分子数(n )は変化せず(すなわち、n =1)、副反応を生じ得る分子の数(n )(すなわち、サンプル中のプライマーダイマーおよび非相補的DNA配列)は容積に対して直線的に比例する(すなわち、n ∝V)ので、副反応に対する標的の比は、容積に対して反比例(n /n ∝1/V)する。 Target number of molecules (n t) does not change (i.e., n t = 1), the number of molecules that can cause side reactions (n s) (i.e., primer dimers and non-complementary DNA sequences in the sample) is the volume since linearly proportional to (i.e., n s alpha] V) with respect to the ratio of the target to side reactions, inverse (n t / n s α1 / V) to relative volume. 副反応はPCRの失敗の主な原因であるので(4)、反応の容積を減少させることに対する利点は明らかである。 The side reaction because it is the major cause of failure of PCR (4), advantage to reducing the volume of the reaction is clear.

テンプレートの単一コピーからのPCR増幅は、以前に報告されている(5)。 PCR amplification from single copy of template, has been previously reported (5). しかし、マクロ容積中の単一コピーから信頼性のある増幅を得る現在の方法は、多くの場合、変更された熱サイクリングプロトコル(例えば、長い伸長時間、多くのサイクル数)、ミスプライミングおよび非特異的な増幅に対する予防(例えば、「ホットスタート」PCR(ポリメラーゼの熱活性化)、「ブースター」PCR、非特異的なハイブリダイゼーションを減少させるための添加物など)を必要とし、ほとんどの場合、2ラウンドのPCR(第一のPCRのアリコートが第二の反応においてテンプレートとして使用される)で完了する。 However, current methods for the single copy of the macro volume obtain reliable amplification is often modified thermal cycling protocol (e.g., longer extension times, the number of number of cycles), mispriming and non prevention (e.g., "hot start" PCR (thermal activation of the polymerase), "booster" PCR, additives to reduce nonspecific hybridization, etc.) for specific amplification requires, in most cases, 2 completed round of PCR (aliquot of the first PCR is used as a template in a second reaction). 対照的に、このシステムは、標準的な条件(既製のプライマーおよびプローブ)ならびに1ラウンドの標準的な熱サイクリングプロトコルを用いて、単一コピーから信頼性のある増幅を達成する。 In contrast, the system using standard conditions (ready-made primers and probes) and one round standard thermal cycling protocol, achieving amplification reliable from a single copy. 完全に封入されれば、環境汚染に対してほぼ耐えられる。 If fully enclosed, it is substantially resistant to environmental pollution. 多くの数のPCR反応を行う能力は、同時に、マクロ容積と比較して明らかなロジスティックな費用利益および時間利益を与える(21,000個の反応を備える1つのチップ 対 219個の個々の96ウェルプレート、ならびに関連する時間、機器およびトラッキングインフラ)。 The ability to perform a greater number of PCR reactions simultaneously, as compared with the macro volume gives a clear logistical costs benefits and time benefits (one chip versus 219 amino individual 96 wells with a 21,000 reaction plate, as well as associated time, equipment and tracking infrastructure).

デジタルPCR読み出しを伴う大規模分割の原理は、サンプル中の標的濃度の絶対的定量化に使用され得る。 The principle of a large division with digital PCR readout may be used in absolute quantification of target concentration in the sample. 例えば、単純に特定の対立遺伝子もしくは上に記載される多くの対立遺伝子に対してポジティブであるウェルの数をカウントすることによってプールされたゲノムDNAサンプルを遺伝子タイピングするために、使用され得る。 For example, a genomic DNA samples pooled by counting the number of which is positive wells for genotyping for many alleles described simply a particular allele or above, may be used. 副反応に対する増大した抵抗性に起因して、野生型DNAのバックグラウンドにおける変異体を定量すること(癌の検出において関係する問題)においても有用であるはずである。 Due to the increased resistance against side reactions, it should also be useful in quantifying the variants in a background of wild type DNA (problems related in the detection of cancer). 分割することによる濃縮の一般的な原理はまた、単一の分子、細菌、ウイルスまたは細胞の検出が目的である他の反応(例えば、タンパク質検出のためのELISA反応)においても有用であり得る。 The general principle of concentration by dividing may also be useful in other reactions single molecules, bacteria, the detection of virus or cell that is the purpose (eg, ELISA reaction for protein detection). デジタルPCRは、Brownら、米国特許第6,143,496号、発明の名称「Method of sampling,amplifying and quantifying segment of nucleic acid,polymerase chain reaction assembly having nanoliter−sized chambers and methods of filling chambers」、およびVogelsteinら、米国特許第6,446,706号、発明の名称「Digital PCR」によって記載されており、これらの両方はその全体が参考として本明細書に援用される。 Digital PCR can, Brown et al., U.S. Patent No. 6,143,496, entitled "Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized chambers and methods of filling chambers", and Vogelstein et al., U.S. Patent No. 6,446,706, is described by the name "Digital PCR" in the invention, both of which is incorporated in its entirety herein by reference. 微小流体工学を用いて達成され得る小さい容積は、大規模な並列度および非常に高い標的 対 バックグラウンドの濃度比の両方を可能にする。 Small volume which can be achieved using microfluidics enables both large parallelism and very high target-to-background ratio of concentration of. 高い標的 対 バックグラウンド比は、単一分子増幅の忠実さを可能にする。 High target-to-background ratio allows the fidelity of a single molecule amplification. これらの因子は、PCRについてより小さいものが現実にはより良いことを示唆する。 These factors suggest a smaller ones better it is in reality for PCR.

本発明は、微小流体環境においてデジタルPCRを行うための方法およびデバイスを提供し、この方法は、流体チャネルをその中に有する微小流体デバイスを提供する工程であって、この流体チャネルはこのチャネルに結合される2つ以上のバルブを有し、このバルブは、作動されるときに、流体チャネルを2つ以上の反応部位もしくはチャンバに分割し得る、工程;少なくとも1つの標的核酸ポリマーを含むサンプルを導入する工程;バルブを作動させて、流体サンプルを2つ以上の部分に分割する工程であって、少なくとも1つの部分が標的核酸ポリマーを含み、別の部分は標的核酸ポリマーを含まない、工程;標的核酸ポリマーを増幅する工程;ならびに標的分子を含む流体チャネル部分の数を決定する工程を包含する。 The present invention provides a method and a device for performing digital PCR in a microfluidic environment, the method comprising: providing a microfluidic device having a fluid channel therein, the fluid channel in the channel has two or more valves are attached, the valve, when actuated, may divide the fluid channel into two or more reaction sites or chambers, step; a sample containing at least one target nucleic acid polymer introduced to the process; actuate the valve, and dividing the fluid sample into two or more portions, at least one portion comprises a target nucleic acid polymer and another portion does not include the target nucleic acid polymer, the process; comprising the step of determining the number of the fluid channel portion including a well target molecule; step for amplifying a target nucleic acid polymer. 好ましい実施形態では、微小流体デバイスは、エラストマー材料を含み、より好ましくは、エラストマー材料を含む少なくとも1つの層を含む。 In a preferred embodiment, the microfluidic device comprises an elastomeric material, more preferably, at least one layer comprising an elastomeric material. 特定の好ましい実施形態では、微小流体デバイスはさらに、湾曲可能な膜を含み、この湾曲可能な膜は、流体チャネル内の流体の流れを制御するように、および/または流体チャネルの一部分を別の部分から分割するように流体チャネル内および流体チャネル外に湾曲可能であり、好ましくは、この湾曲可能な膜は、デバイスに形成されるチャネルもしくは凹部を有する微小流体デバイスの層に不可欠であり、そして好ましくは、湾曲可能な膜は、第一の層における第一のチャネルがその微小流体デバイスの第二の層における第二のチャネルによって重なる場合に形成される。 In certain preferred embodiments, the microfluidic device further comprises a deflectable membrane, the bendable membrane, to control the flow of fluid in the fluid channel, and / or fluid channel portion of another It is bendable outside the fluid channel and a fluid channel so as to divide the portion, preferably the deflectable membrane is integral to the layer of the microfluidic device having a channel or recess is formed in the device, and preferably, bendable membrane is formed when the first channel in the first layer overlaps the second channel in the second layer of the microfluidic device. いくつかの実施形態では、サンプル流体は、増幅反応を行うのに必要な成分のすべてを含むが、他の実施形態では、微小流体デバイスは、サンプル流体の導入前に、増幅反応の少なくとも1つの成分を含む。 In some embodiments, the sample fluid, including all components necessary to carry out the amplification reaction, in other embodiments, the microfluidic device, prior to introduction of the sample fluid, the amplification reaction at least one including the component. いくつかの実施形態では、微小流体デバイスはさらに検出試薬を含み、好ましくは、標的核酸ポリマーの少なくとも一部分に相補的な1つ以上の核酸ポリマー、好ましくは、微小流体デバイスの反応部位もしくはチャンバ内に別々に配置される複数の異なる核酸ポリマーを含む。 In some embodiments, the microfluidic device further comprises a detection reagent, preferably at least a portion complementary to one or more nucleic acid polymers of the target nucleic acid polymer, preferably, the reaction site or chamber of a microfluidic device comprising a plurality of different nucleic acid polymers are arranged separately.

増幅は、熱サイクリング反応(例えば、PCR)、または等温反応(例えば、米国特許出願番号第10/196,740号(これは、US 2003/0138800 A1として公開されている)(これは、等温増幅スキームを教示する目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される)においてVan Nessらによって記載されるような反応)によって達成され得る。 Amplification thermal cycling reactions (e.g., PCR), or isothermal reaction (e.g., U.S. Patent Application Serial No. 10 / 196,740 (which has been published as US 2003/0138800 A1) (which, isothermal amplification in its entirety for the purpose of teaching the scheme can be achieved by the reaction) as described by Van Ness et al. in to) incorporated herein by reference.

本発明はさらに、特に、タンパク質の変性温度がそのタンパク質が別の部分(例えば、リガンドまたは化合物あるいは他のタンパク質)と相互作用するときに変化する場合に、タンパク質の構造変化(例えば、変性)を測定するために蛍光色素(例えば、SYBER Green(TM))を用いるタンパク質マイクロ熱量アッセイを提供する。 The invention further especially denaturation temperature of the protein portion thereof protein is different (e.g., ligand or compound, or other proteins) to vary when interacting with the structural change of the protein (e.g., denaturation) fluorescent dyes to measure (for example, SYBER Green (TM)) to provide a protein microcalorimetry assay using. SYBR Green(TM)を用いることのさらなる利点は、このSYBR Green(TM)が他のUV領域の色素よりも短い波長で使用され、それゆえ、多くのプラスチック材料で典型的に関連するバックグラウンドの問題を減少させることである。 A further advantage of using SYBR Green (TM), the SYBR Green (TM) is used in the wavelengths shorter than dyes other UV region, therefore, the background typically associated with many plastic materials it is to reduce the problem.

図22Bは、図22Aに示される構成要素を備え、そしてさらに、完全な微小流体デバイス2899(図22C)を形成するために、基板2800のエラストマーブロック位置2807に、付着されたか、または、より好ましくは、接着剤を用いて接着され、そして、なおより好ましくは、好ましくは接着剤を使用せず、直接接着された、エラストマーブロック2808を備える、完全な微小流体デバイス2899の分解図を示す。 22B is provided with the components shown in FIG. 22A, and further, in order to form a complete microfluidic device 2899 (FIG. 22C), the elastomeric block location 2807 of substrate 2800, or has been deposited, or, more preferably is bonded using an adhesive, and, even more preferably, preferably without the use of adhesives, bonded directly includes an elastomeric block 2808, it shows an exploded view of a complete microfluidic device 2899. エラストマーブロック2808内には、1以上の孔2814と流体連通する、1以上のチャネルがあり、この孔は、今度は、エラストマーブロック内のチャネルと、基板内のチャネルとの間に流体連通を提供し、次いで、基板2800のウェル2805とエラストマーブロック2808内のチャネルとの間に流体連通を提供するために、ウェルの列2806a〜d内のウェル2805につながる。 Within elastomeric block 2808 are one or more holes 2814 in fluid communication with, there are one or more channels, the holes, in turn, provides fluid communication between the channels within the elastomeric block and channels within the substrate and, then, in order to provide fluid communication between the channels within the well 2805 and elastomeric block 2808 of the substrate 2800, leading to the well 2805 in the column of wells 2806A~d. 蓄圧器ウェルの上部2809および2810は、蓄圧器ウェル2801および2802に取り付けられて、蓄圧器チャンバ2815および2816を形成する。 Upper 2809 and 2810 of the pressure accumulator wells, attached to accumulator wells 2801 and 2802 to form accumulator chambers 2815 and 2816. 蓄圧器ウェルの上部2809および2810は、それぞれ、バルブ2812および2811を備え、これらは、好ましくは、圧力下で蓄圧器チャンバ2815および2816内に気体を導入および保持するためのチェックバルブである。 Upper 2809 and 2810 of the pressure accumulator wells, respectively, a valve 2812 and 2811, these are preferably check valves for introducing and holding gas into the accumulator chamber 2815 and in 2816 under pressure. バルブ2811および2812は、ドライウェル2802および2804の内側に据え付けられ、液体が、蓄圧器チャンバ2815および2816内に存在する場合、バルブ2811および2812と接触しない状態を保つ。 Valve 2811 and 2812, it mounted inside the de Raiweru 2802 and 2804, liquid, when present in accumulator chambers 2815 and in 2816, keeping the state not in contact with the valve 2811 and 2812. バルブ2811および2812は、好ましくは、シェーブ、ピンなどを、好ましいチェックバルブ内に押し付けて、チェックバルブの自己封鎖力に打ち克って、蓄圧器チャンバからの圧力の解放を可能にして、蓄圧器チャンバ内に含まれる流体の圧力を減少させることによって、機械的に開放され得る。 Valve 2811 and 2812 are preferably Shave, pins, and pressed against the preferred check the valve, and cut out the self-blockade force of the check valve, and enables the release of pressure from the accumulator chamber, the accumulator by reducing the pressure of the fluid contained within the chamber, it can be mechanically opened.

図22Bは、図22Aに示される構成要素を備え、そしてさらに、完全な微小流体デバイス2899(図22C)を形成するために、基板2800のエラストマーブロック位置2807に、付着されたか、または、より好ましくは、接着され、そして、なおより好ましくは、好ましくは接着剤を使用せず、直接接着された、エラストマーブロック2808を備える、完全な微小流体デバイス2899の分解図を示す。 22B is provided with the components shown in FIG. 22A, and further, in order to form a complete microfluidic device 2899 (FIG. 22C), the elastomeric block location 2807 of substrate 2800, or has been deposited, or, more preferably is contact wear, and, even more preferably, preferably without the use of adhesives, bonded directly includes an elastomeric block 2808, it shows an exploded view of a complete microfluidic device 2899. エラストマーブロック2808内には、1以上の孔2814と流体連通する、1以上のチャネルがあり、この孔は、今度は、エラストマーブロック内のチャネルと、基板内のチャネルとの間に流体連通を提供し、次いで、基板2800のウェル2805とエラストマーブロック2808内のチャネルとの間に流体連通を提供するために、ウェルの列2806a〜d内のウェル2805につながる。 Within elastomeric block 2808 are one or more holes 2814 in fluid communication with, there are one or more channels, the holes, in turn, provides fluid communication between the channels within the elastomeric block and channels within the substrate and, then, in order to provide fluid communication between the channels within the well 2805 and elastomeric block 2808 of the substrate 2800, leading to the well 2805 in the column of wells 2806A~d. 蓄圧器ウェルの上部2809および2810は、蓄圧器ウェル2801および2802に取り付けられて、蓄圧器チャンバ2815および2816を形成する。 Upper 2809 and 2810 of the pressure accumulator wells, attached to accumulator wells 2801 and 2802 to form accumulator chambers 2815 and 2816. 蓄圧器ウェルの上部2809および2810は、それぞれ、バルブ2812および2811を備え、これらは、好ましくは、圧力下で蓄圧器チャンバ2815および2816内に気体を導入および保持するためのチェックバルブである。 Upper 2809 and 2810 of the pressure accumulator wells, respectively, a valve 2812 and 2811, these are preferably check valves for introducing and holding gas into the accumulator chamber 2815 and in 2816 under pressure. バルブ2811および2812は、ドライウェル2802および2804の内側に据え付けられ、液体が、蓄圧器チャンバ2815および2816内に存在する場合、バルブ2811および2812と接触しない状態を保つ。 Valve 2811 and 2812, it mounted inside the de Raiweru 2802 and 2804, liquid, when present in accumulator chambers 2815 and in 2816, keeping the state not in contact with the valve 2811 and 2812. バルブ2811および2812は、好ましくは、シェーブ、ピンなどを、好ましいチェックバルブ内に押し付けて、チェックバルブの自己封鎖力に打ち克って、蓄圧器チャンバからの圧力の解放を可能にして、蓄圧器チャンバ内に含まれる流体の圧力を減少させることによって、機械的に開放され得る。 Valve 2811 and 2812 are preferably Shave, pins, and pressed against the preferred check the valve, and cut out the self-blockade force of the check valve, and enables the release of pressure from the accumulator chamber, the accumulator by reducing the pressure of the fluid contained within the chamber, it can be mechanically opened.

図22Dは、微小流体デバイス2899およびウェル2805の平面図を示し、ここで、ポートは、基板2800内(好ましくは、ウェル2805に対向する基板2800の側面上)に形成されるチャネル内に、ウェルから流体を通過させるために、ウェルの基部(好ましくは底部)、あるいは、ウェル2805の側部に隣接して配置されている。 Figure 22D shows a plan view of a microfluidic device 2899 and the well 2805, where the port is within the substrate 2800 (preferably, on the side of the substrate 2800 facing the well 2805) in channels formed in the well for the passage of fluid from the base (preferably bottom) of the well, or are positioned adjacent the sides of the well 2805. 特に好ましい実施形態において、基板2800は、内部に凹部が成形されており、この凹部は、シーリング層(好ましくは、接着フィルムまたはシーリング層)によって、チャネル内に作製されている。 In a particularly preferred embodiment, the substrate 2800, the internal and recess is molded, the recess, the sealing layer (preferably, adhesive film or a sealing layer) by being produced in the channel.

基板2800およびその関連する構成要素は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、高密度ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンPTFEまたはテフロン(登録商標)(R)などのポリマー、ガラス、石英、または金属(例えば、アルミニウム)、透明材料、ポリシリコンどから製作され得る。 Component substrate 2800 and associated thereof include polypropylene, polyethylene, polycarbonate, high density polyethylene, polytetrafluoroethylene PTFE or Teflon (registered trademark) (R) polymers, such as, glass, quartz, or metals, (e.g., aluminum), transparent material may be fabricated polysilicon con a cathodic et al. アキュムレーターウェル上部2809および2810は、接近ねじ281 をさらに備え得、これは、アキュムレーターチャンバー2815および2816からガスまたは液体を導入または除去するために取り外され得る。 Accumulator wells upper 2809 and 2810 may further include a proximity screw 281 3, which may be removed to introduce or remove gas or liquid from accumulator chambers 2815 and 2816. 好ましくは、バルブ2812および2811は、流体圧力を解放するために作動され得、そうでなければ、アキュムレーターチャンバー2815および2816の内側に保持される。 Preferably, valve 2812 and 2811 may be actuated to release the fluid pressure otherwise held inside of accumulator chambers 2815 and 2816. ノッチ2817は、微小流体デバイスの、その他の機器、例えば、微小流体デバイスまたはその中で実施される反応を作動または分析するために用いられる機器中への正確な配置を支援するために用いられる。 Notch 2817, the microfluidic device, other devices, for example, used to assist in accurate placement of the infinitesimal fluidic device or a device used to operate or analyze the reaction carried out in the . 図22Dは、エラストマーブロック領域2807を取り囲む水和チャンバー2850をさらに描写し、これは、水和カバー2851で覆われ得、加湿チャンバーを形成し、このエラストマーブロックの周りの湿度の制御を容易にする。 Figure 22D is a hydration chamber 2850 surrounding the elastomeric block region 2807 further depicts, this is obtained is covered with a hydrated cover 2851 to form a humidification chamber to facilitate the control of humidity around the elastomeric block . 湿度は、揮発性の液体、例えば、水を、好ましくは、吸い取り材料またはスポンジを濡らすことによって加湿チャンバー2851に添加することにより増加され得る。 Humidity, volatile liquid, for example, water, preferably, may be increased by adding a humidification chamber 2851 by wetting the blotting material or sponge. 好ましくは、ポリビニルアルコールが用いられる。 Preferably, polyvinyl alcohol is used. 湿度制御は、好ましくは、吸い取り材料またはスポンジを濡らすために用いられるポリビニルアルコールと水との比率を変えることによって達成され得る。 Humidity control can preferably be achieved by varying the ratio of polyvinyl alcohol and water used to wet the blotting material or sponge. 水和はまた、HUMIDIPAK (商標)加湿パッケージのような湿度制御デバイスを用いることにより制御され得、これは、例えば、所望の湿度レベルを維持するために適切な塩濃度を有する塩溶液を保持する、水蒸気透過性であるが液体不透過性のエンベロープを用いる。 Hydration also may be controlled by using a humidity control device such as a Humidipak (trademark) humidification package which, for example, hold a salt solution having an appropriate salt concentration to maintain the desired humidity level to, but is water vapor permeable using envelope liquid impermeable. Saariらによる米国特許第6,244,432号を参照のこと。 See U.S. Pat. No. 6,244,432 by Saari et al. この特許は、湿度制御デバイスおよび方法の特定の目的を含むすべての目的のために本明細書中に参考として援用される。 This patent is incorporated by reference herein for all purposes including the specific purpose of humidity control devices and methods. 水和カバー2850は、好ましくは、使用の間にエラストマーブロック内の事象が見えることを妨げないよう透明である。 Hydration cover 2850 is preferably transparent so as not to prevent the event in the elastomeric block is visible during use. 同様に、エラストマーブロック領域2807の下の基板2800の部分は、好ましくは透明であるが、不透過性または反射性であっても良い。 Similarly, portions of the substrate 2800 below the elastomeric block region 2807 is preferably a transparent, may be opaque or reflective.

図22Eは、エラストマーブロック2808とは反対の基板2800の側面に取り付けられるシール層2881に沿ったエラストマーブロック領域2807中に位置されるエラストマーブロック808を備えた基板2800の断面図を描写している。 Figure 22E depicts a cross-sectional view of a substrate 2800 having an elastomeric block 808 that is positioned in the elastomeric block region 2807 along the seal layer 2881 attached to the side of the opposite substrate 2800 and elastomeric block 2808. ウェル2805は、第1のポート2890、チャネル2870、および第2のポート2892を通じ、そして基板2800の上面2897によってシールされチャネル2885を形成するエラストマー層2808の凹部中へと、エラストマーブロック2808と流体連通している。 Wells 2805, first port 2890, channel 2870, and through the second port 2892, and the into the recess of the elastomer layer 2808 to form a sealed channel 2885 by the upper surface 2897 of the substrate 2800, an elastomeric block 2808 in fluid communication with doing. シール層2881は、基板2800の底面2898に成形または機械加工される凹部からチャネル2870を形成する。 Sealing layer 2881 forms a channel 2870 from recesses molded or machined into bottom surface 2898 of the substrate 2800. シール層2881は、好ましくは、透明材料であり、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリプロピレンである。 Sealing layer 2881 is preferably a transparent material, for example, polystyrene, polycarbonate or polypropylene. 1つの実施形態では、シール層2881は、接着テープにおけるように可撓性であり、そして接着剤または熱シールでのように結合により、または圧縮によるように機械的に基板2800に取り付けられ得る。 In one embodiment, the seal layer 2881 is flexible, as in adhesive tape, and the combined as an adhesive or heat sealing, or mechanically attached to the substrate 2800, such as by compression. 好ましくは、シール層2881のための材料は、最小の漏れで流体チャネルを形成するために各々の凹部とともに流体シールを形成するように順応している。 Preferably, the material for the sealing layer 2881 is adapted to form a fluid seal with each recess to form a fluidic channel with minimal leakage. シール層2881は、剛直であるさらなる支持層(図示せず)によってさらに支持され得る。 Seal layer 2881 may be further supported by additional support layer is rigid (not shown). 別の実施形態では、シール層2881は剛直である。 In another embodiment, the seal layer 2881 is rigid.

流体の至近距離からの詳細は、エラストマーブロック2808と基板2800のエラストマーブロック領域2807との間の界面を示す。 Details of the short distance of the fluid shows the interface between the elastomeric block region 2807 of the elastomeric block 2808 and the substrate 2800. 同時係属中のGrossmanらによる米国特許出願第11/043,395号中に記載されように、エラストマーブロックは、一緒に結合されたエラストマー材料の複数層から形成され得、エラストマーブロックを形成し、この特許出願は、本明細書中およびこの特許出願で記載されるすべての目的のため、および集積キャリアおよび自動作動デバイスの使用に関するさらなる詳細を開示する目的のために本明細書中に援用される。 Ni will be described by Grossman et al. In copending in U.S. Patent Application No. 11 / 043,395, the elastomeric block may be formed from multiple layers of elastomeric material bonded together to form an elastomeric block, the patent application for all purposes described herein and in this patent application, and are incorporated herein for the purpose of disclosing further details on the use of integrated carrier and automatic actuation device. 好ましくは、エラストマーブロックの少なくとも2つの層は凹部を有する。 Preferably, at least two layers of elastomeric block have recesses. 例えば、その中に形成された凹部を有する第1のエラストマー層は、その中に形成された凹部を有する第2のエラストマー層に結合され、その中に形成された凹部を有するエラストマーブロックを形成する。 For example, a first elastomeric layer having recesses formed therein is bonded to the second elastomeric layer having a recess formed therein to form an elastomeric block having a recess formed therein . 第1のエラストマー層の凹部は、全体または部分的に閉鎖され、第1のエラストマー層中にチャネルを形成する。 Recesses of the first elastomeric layer is wholly or partially closed, to form a channel in the first elastomeric layer. 第2のエラストマー層中に形成された凹部は、同様に、このエラストマー層が基板に結合されるとき全体または部分的に閉鎖され、第2のエラストマー層中にチャネルを形成し、それによって、その中に形成されたチャネルを備えた複数層を有する微小流体デバイスを形成する。 Recess formed in the second elastomeric layer are likewise the elastomeric layer is wholly or partially closed when coupled to the substrate, a channel is formed in the second elastomeric layer, thereby, the forming a microfluidic device having a plurality of layers having the formed channel during.

図23では、その中に形成された第1の凹部2901を備えた底面を有する第1のエラストマー層2920、ならびに上面およびその中に形成された第2の凹部2905を備えた底面を有する第2のエラストマー層2923は、一緒に結合されて、第1の凹部2901および第2のエラストマー層2923の上面から形成されるチャネル2907を有するエラストマーブロックを形成する。 In Figure 23, the first has a first elastomeric layer 2920 and the top and bottom surfaces having a second recess 2905 formed therein, having a bottom surface having a first recess 2901 formed therein 2 elastomeric layer 2923 of, are joined together to form an elastomeric block having a channel 2907 formed from the upper surface of the first recess 2901 and second elastomeric layer 2923. 基板2800は、第2のエラストマー層2923の底面に取り付けられ、基板2800の上面2897および第2のエラストマー層2923の底面からチャネル2909を形成する。 Substrate 2800 is attached to the bottom surface of second elastomeric layer 2923, to form the channel 2909 from the bottom of the upper surface 2897 and second elastomeric layer 2923 of the substrate 2800. ポート2892は、基板2800のチャネル2872を、基板2800の上面によって部分的に形成される第2のエラストマー層のチャネル2909と連結し得る。 Port 2892, a channel 2872 of the substrate 2800 may be connected to the channel 2909 of second elastomer layer is partially formed by the upper surface of the substrate 2800. あるいは、図23に示されるように、ポート2892は、基板2800のチャネル2872を、孔 950を通りエラストマーブロック2808の第1のエラストマー層2920のチャネル2907と連結する。 Alternatively, as shown in FIG. 23, the port 2892, the channel 2872 of the substrate 2800 is connected to the channel 2907 of the first elastomeric layer 2920 as elastomeric block 2808 the hole 2 950. 孔2950は、エラストマー層2920とのその結合の前に、基板表面2897にほぼ垂直に形成され、好ましくは第2のエラストマー層2923中に形成され、そしてより好ましくは、第1および第2のエラストマー層が一緒に結合された後に形成される。 Hole 2950, ​​prior to its coupling with the elastomer layer 2920 is substantially vertically formed on the substrate surface 2897, preferably formed in second elastomeric layer 2923, and more preferably, the first and second elastomeric layer is formed after being joined together. 同時係属中であり、そして2004年3月29日に出願され、本出願人に譲渡されたUngerによる米国仮特許出願第60/557、715号を参照のこと。 Is a co-pending, and filed on March 29, 2004, see US Provisional Patent Application No. 60 / 557,715 on the sale has been Unger to the present assignee. この特許出願は、すべての目的および自動化レーザーアブレーションシステムおよび方法を用いる形成を経由する教示の特有の目的のために参考として援用される。 This patent application is for the specific purpose of teaching via the formation using all purposes and automated laser ablation systems and methods are incorporated by reference. 孔を生成するための例示の方法は、第2のエラストマー層2923を形成する間のマイクロ製作、レーザー穿孔、CO レーザーを用いたレーザー穿孔、エキシマレーザーを用いたレーザー穿孔、機械的穿孔、およびコアリング(心抜)を含み、好ましくは、ここで、上記穿孔は、ロボット穿孔システム、好ましくはx、y自動化ステージを有するシステムによって実施される。 Exemplary methods for generating pores, micro-fabrication of during the formation of the second elastomeric layer 2923, laser drilling, laser drilling using a CO 2 laser, laser drilling with an excimer laser, mechanical drilling, and the core includes rings (heart excluded), preferably, wherein said perforations are robotic drilling system is preferably carried out by a system having the x, y automated stage.

図23は、本明細書中に記載される微小流体デバイス中の孔の別の好ましい使用の断面図を描写する。 Figure 23 depicts a cross-sectional view of another preferred use of the holes in the microfluidic devices described herein. 微小流体ブロック2921は、その中に形成された第1の層の凹部(または第2の層に結合されるときチャネル)2907を有する第1の層2920、およびその中の第2の層の凹部(または基板に結合されるときチャネル)を有する第2の層2923を含む。 Microfluidic block 2921, the recess of the first of the first layer 2920 having a 2907 (when the channel is coupled to a or the second layer) recesses of the layer, and the second layer therein formed therein comprising a second layer 2923 having a (or channels when bonded to a substrate). 2つの第2の層のチャネルは、2つ以上の孔2950により第1の層のチャネルを通って流体連通している。 The two channels of the second layer, by two or more holes 2950 are in fluid communication through a channel in the first layer. 好ましくは、少なくとも1つの孔2950が、基板の凹部2892(またはシール層(図示せず)が基板2800に結合される場合、チャネル)を通って基板2800のウェル2999とさらに流体連通している。 Preferably, at least one hole 2950 is, recess 2892 of the substrate is in fluid further fluid communication with well 2999 of the substrate 2800 through (or seal layer (not shown) if the channel coupled to the substrate 2800) and. 少なくとも1つの第2の層のチャネル2909は、流体連通することなく第1の層のチャネル2907の一部によって重複される。 Channel 2909 of the at least one second layer is overlapped by a portion of the first channel layer 2907 without fluid communication. 図23に示される実施形態では、微小流体デバイスの単位面積あたりの反応および/または検出ゾーンのより高い密度が達成され得る。 In the embodiment shown in FIG. 23, a higher density of reaction and / or detection zones per unit area of ​​microfluidic device may be achieved. なぜなら、1つの層中の流体チャネルが、同じ層内の介在する流体チャネルの上また下に経路を取り得るからである。 This is because one fluid channel in the layer, because may take path crotch on the fluid channel interposed in the same layer. アブレーション残渣チャンバー2989が、レーザー切除孔2950から生成された残渣を捕捉するために存在する。 Ablation residue chamber 2989 is present to capture a residue generated from the laser ablation hole 2950. 残渣チャンバー2989は、2層キャスティング法により層2920中にキャストされ得、ここで、フォトレジストの第1の層がパターン化および顕色された後、フォトレジストの第2の層が第1のパターンの上に重層され、そして第2のパターンが第1のフォトレジスト層のパターンの上に、フォトレジストのパターンの領域が異なる高さであり得るように形成される。 The residue chamber 2989 may be cast in the layer 2920 by two layers casting method, wherein the first layer of photoresist after being patterned and developer, a second layer of photoresist first pattern It is layered on top of, and a second pattern on the pattern of the first photoresist layer, areas of the pattern of photoresist is formed as may be at different heights. 複数の層が互いの上に構築され得、変化する高さのパターンを生成する。 A plurality of layers are built on top of each other to give, to produce a height varying pattern of. 異なるフォトレジスト材料もまた、例えば、フォトレジストの上層が加熱されるとき再び流れ得るように用いられ得、その一方、下層は、同じ加熱温度で実質的に再び流れないフォトレジストから作製される。 Different photoresist materials may also be, for example, be used as can flow again when the upper layer of photoresist is heated, while the lower layer is made from photoresist does not flow substantially again at the same heating temperature.

本発明のフローチャネルは、必要に応じて、異なる断面サイズおよび形状で設計され得、それらの所望の適用に依存して異なる利点を提供する。 Flow channels of the present invention may optionally be designed with different cross sectional sizes and shapes obtained, provide their desired different advantages depending on the application. 例えば、下部フローチャネルの断面形状は、その全長に沿って、または上部交差チャネルの下に配置される領域のいずれかに、湾曲した上面を有し得る。 For example, the cross-sectional shape of the lower flow channel, along its entire length, or any area that is located below the upper cross channel may have a curved upper surface. このような湾曲した上面は、以下のようにバルブのシールを容易にする。 Such curved upper surface facilitates the sealing of the valve as follows. 本発明によって企図される膜厚みプロフィールおよびフローチャネル断面は、矩形、台形、円形、楕円、放物線、双曲線、および多角形、ならびに上記形状の断面を含む。 Membrane thickness profiles and flow channel cross-section is contemplated by the present invention include rectangular, trapezoidal, circular, elliptical, parabolic, hyperbolic, and polygonal, as well as the cross section of the shape. フローチャネル中に突出部を備えた実施形態または凹面を有する実施形態のようなより複雑な断面形状もまた、本発明によって企図される。 Complex sectional shape than as embodiments having embodiments or concave with a protrusion in the flow channel, are also contemplated by the present invention.

さらに、本発明を、フローチャネルの壁および天井がエラストマーから形成され、そしてチャネルの床が下にある基板から形成される実施形態と組合せて主に記載されているけれども、本発明は、この特定の配向に制限されない。 Furthermore, the present invention is formed from the wall and ceiling elastomeric flow channels, and although in combination with the embodiment in which the channel floor is formed from the underlying substrate is mainly described, the present invention is, this particular not limited to the orientation. フローチャネルの天井のみがエラストマーから構築されて、チャネルの壁および床はまた、下にある基板中に形成され得る。 Only the ceiling of the flow channel is constructed of an elastomer, the walls and floor of the channel can also be formed in the underlying substrate. このエラストマーフローチャネル天井は、付与される作動力に応答してチャネル中に下方に突出し、それによって、このフローチャネルを通る材料の流れを制御する。 The elastomeric flow channel ceiling, projects downward into the channel in response to actuation force applied, thereby controlling the flow of material through the flow channel. 一般に、モノリシックなエラストマー構造物が、微小流体用途のために好ましい。 In general, monolithic elastomer structures are preferred for microfluidic applications. しかし、基板中に形成されたチャネルを採用することが、このような配置が利点を提供するような場合には、有用であり得る。 However, adopting a channel formed in the substrate, if such such an arrangement provides the advantage may be useful. 例えば、光学的導波管を含む基板は、この光学的導波管が、光りを、微小流体チャネルの側面に特異的に向けるように構築され得る。 For example, a substrate comprising an optical waveguide, the optical waveguide, light and can be constructed to direct specifically to the side of the microfluidic channel.

本発明の微小流体デバイスは、スタンドアローンのデバイスとして用いられ得るか、または、好ましくは、本発明により提供されるシステムの一部として用いられ得る。 The microfluidic device of the present invention can either be used as a stand-alone device, or, preferably, may be used as part of the system provided by the present invention. 図24は、微小流体デバイスを作動するロボットステーションの斜視図を描写する。 Figure 24 depicts a perspective view of a robot station that operates the microfluidic device. 自動化空気力制御およびアキュムレーターチャージングステーション3200は、図22A〜22Eに描写されるタイプのような本発明の微小流体デバイス3205を保持するための受容ベイ3203を含む。 Automation pneumatic control and accumulator charging station 3200 includes a receiving bay 3203 for holding a microfluidic device 3205 of the present invention, such as the type depicted in Figure 22 a to 22 e. プラテン3207は、微小流体デバイス3205の上面3209と接触するように適合される。 The platen 3207 is adapted to contact the upper surface 3209 of microfluidic device 3205. プラテン3207は、その中に微小デバイス3205と整列するポートを有し、流体圧力、好ましくはガス圧力を微小流体デバイス3205内のウェルおよびアキュムレーターに提供する。 The platen 3207 has a port that aligns with microdevice 3205 therein, fluid pressure, preferably provides a gas pressure to the wells and accumulators within microfluidic device 3205. 1つの実施形態では、プラテン3207は、アーム3211の動きによって微小流体デバイス3205の上面3221に対して押され、このアームは、ピボット3213上にヒンジ付けされ、そして1つの端部でアーム3211に取り付けられ、そして他方の端部でプラットホーム3217に取り付けられるピストン3215によって動かされる。 In one embodiment, the platen 3207 is pushed against the upper surface 3221 of microfluidic device 3205 by movement of the arm 3211, the arm is attached to the arm 3211 in the hinged on a pivot 3213, and one end It is, and is moved by a piston 3215 which is attached to the platform 3217 at the other end. ピストン3215に沿ったセンサーは、ピストンの動きを検出し、そしてピストン位置に関する情報を、コントローラー、好ましくはソフトウェアスクリプトに従うコンピューター(図示せず)の制御下のコントローラーにリレーする。 Sensors along piston 3215 detect movement of the piston, and the information about the piston position, the controller, preferably a relay under the control of the controller computer (not shown) according to the software script. プレート検出器3219は、受容ベイ3203の内側の微小流体デバイス3205の存在を検出し、そして好ましくは、微小流体デバイス3205の適正な配向を検出し得る。 Plate detector 3219 detects the presence of the inner microfluidic device 3205 of receiving bay 3203, and preferably can detect proper orientation of microfluidic device 3205. これは、例えば、微小流体デバイス3205の側面から光を反射することにより微小流体デバイス3205の存在および配向を光学的に検出することにより生じ得る。 This can occur, for example, by detecting the presence and orientation of microfluidic device 3205 optically by reflecting light from the side surface of the microfluidic device 3205. プラテン3207は、ロボットにより、空気力により、電気的に、などで低下され得る。 The platen 3207 by the robot, the air force, electrically, may be reduced in like. いくつかの実施形態では、プラテン3207は、手動で低下され、デバイス3205に係合させる。 In some embodiments, platen 3207 is lowered manually into engagement with the device 3205.

1つの実施形態では、プラテン3207に至る流体ラインは、アーム3211内に位置し、そして流体圧力源、好ましくは、コントローラーの制御下の自動空気力圧力源に連結される。 In one embodiment, fluid lines leading to platen 3207 are located within arm 3211, and a source of fluid pressure, is preferably connected to an automatic air force pressure source under the control of the controller. この圧力源は、プラテン3207のプラテン面(図示せず)内のポートに制御された流体圧力を提供し、微小流体デバイス3205に制御された加圧流体を提供する。 The pressure source provides the platen surface fluid pressure is controlled to a port (not shown) within the platen 3207, to provide a controlled microfluidic device 3205 pressurized fluid. プラテン3207の微細位置決めが、少なくとも一部、ジンバル接続部3223を採用することにより達成され、ここで、プラテン3207は、微小流体デバイス3205の上面3221に垂直な軸の周りで角運動し得るようにアーム3211に取り付けられる。 Fine positioning of platen 3207 is at least partially, be achieved by employing a gimbal connection portion 3223, wherein the platen 3207, so as to angular movement about an axis perpendicular to the top surface 3221 of microfluidic device 3205 It is attached to the arm 3211.

図25 は微小流体デバイス3205の上面3221に対して押されたプラテン3207の一部切断側面図を描写している。 Figure 25 is depicts a partially cut-away side view of the platen 3207 pressed against the upper surface 3221 of the infinitesimal fluid device 3205. プラテン3207は、微小流体デバイス3205の上面3221に対して押され、微小流体デバイス3205とプラテン面3227との間、またはデバイス3205の一部と面3227の一部との間に流体密なシールを形成する。 The platen 3207 is pushed against the upper surface 3221 of microfluidic device 3205, between the microfluidic device 3205 and a platen face 3227, or a fluid tight seal between a portion of the part and the surface 3227 of the device 3205 Form. プラテン面3227は、1つの実施形態では、弾性エラストマー、好ましくは化学薬品抵抗性ゴムなどのような対応材料を含むか、またはそれから作製される。 Platen surface 3227, in one embodiment, the resilient elastomer, or preferably includes a corresponding material, such as chemical resistance rubber, or is made therefrom. プラテン3207の内側には、別個の流体圧力ライン、好ましくはガス圧力ラインがあり、これは、微小流体デバイス3205の上面3221上の種々の位置と嵌合する。 Inside the platen 3207, separate fluid pressure lines, there is preferably a gas pressure line, which various positions and fitting on the upper surface 3221 of microfluidic device 3205. チェックバルブパージアクチュエーター3233がまた示され、これは、好ましくは空気力により作動され、そしてこれは、作動されるとき、ピン3231をチェクバルブ2812中に下方に押し、流体圧力を開放および軽減するか、またはその開放抵抗性に打ち勝つことによりチェックバルブ2812を通る流体の導入を許容する。 Check illustrated Kamata valve purge actuators 3233, which are either preferably actuated by air force, and this, when actuated, press down the pin 3231 in Chekubarubu 2812, opening and relieve fluid pressure, or to permit introduction of fluid through the check valve 2812 by overcoming its opening resistance. 1つの実施形態では、プラテン3207は、第1および第2のパージアクチュエーター3233を有し、これらは、チェックバルブ2811および2812と係合する(図22Bを参照のこと)。 In one embodiment, the platen 3207 has first and second purge actuators 3233, they engage the check valve 2811 and 2812 (see FIG. 22B).

別の実施形態では、チップまたはデバイス3205は、通常は閉鎖された閉じ込めおよび/またはインターフェースバルブとともに製造される。 In another embodiment, chip or device 3205 is normally produced along with containment and / or interface valves closed. この実施形態では、アキュムレーターは、インキュベーションの間にバルブの閉じを保持するために必ずしも必要ではないであろう。 In this embodiment, the accumulator will not be necessary to hold the closing of the valve during the incubation. 圧力は、インターフェースおよび/または閉じバルブが開かれるように所望されるとき、キャリアまたはデバイス3205ウェル領域に付与され得る。 The pressure, when desired to interface and / or closed valve is opened, may be applied to the carrier or device 3205 well regions. すべてまたは大部分のその他の時間の間には、上記バルブは閉鎖されたままであり得、種々のチップ実験を互いから分離し、そして/またはチップ上の試薬ウェルおよびタンパク質ウェルを互いから分離する。 Between the other time of all or most, the valve may remain closed to separate the various chip experiments from one another, and / or separating the reagent wells and protein wells on the chip from one another.

図25は、微小流体デバイス3205の上面3221に対して押されるプラテン3207の一部切り欠き図を描写し、ここで、圧力腔3255が、上面3221のリッジ3250に対してプラテン面3227を接触することによりウェルの列2806の上に形成される。 Figure 25 depicts a partially broken away view of a platen 3207 is pressed against the top surface 3221 of microfluidic device 3205 wherein a pressure cavity 3255, contacts the platen surface 3227 relative to the ridge 3250 of the upper surface 3221 It is formed on the row of wells 2806 by. 流体圧力、好ましくはガス圧力が、次いで、流体をチャージングステーション3200のアーム3211を下方に走る圧力ラインから圧力腔3255中に導入することにより圧力腔3225に付与される。 Fluid pressure, preferably gas pressure, is then applied to the pressure lumen 3225 by introducing the pressure lines running the arm 3211 of charging station 3200 fluid downward in a pressure lumen 3255. 圧力は、チャージングステーション3200と組み合わされた圧力調節器により、好ましくはコンピューター制御下にあるチャージングステーションコントローラーによって送られる信号に従って出力圧力を変更し得る、電気的に制御された可変圧力調節器によって好ましくは調節される。 Pressure, the charging station 3200 combined with a pressure regulator, preferably by may change the output pressure in accordance with signals sent by a charging station controller under computer control, variable pressure regulator that is electrically controlled preferably it is adjusted. 圧力腔3255の内側の流体圧力は、次に、基板2800内のチャネルを通り、そしてチャネルおよび/またはエラストマーブロック2808のチャンバー中へのウェル2805内の液体を流し、チャネルまたはチャンバーを充填するか、または好ましくは先に記載のような偏向可能な膜バルブである、エラストマーブロック2808の偏向可能な部分を作動する。 Or inside of the fluid pressure in the pressure cavity 3255, then through the channel in the substrate 2800, and flowing a liquid in the well 2805 into chamber channel and / or elastomeric block 2808, to fill the channel or chamber, or preferably a deflectable membrane valve as previously described, operates the deflectable section of the elastomeric block 2808.

図27Aおよび27Bは、システム3500の、そしてより特定すればインターフェースプレート3520の特定の実施形態を描写している。 Figure 27A and 27B depict a particular embodiment of the interface plate 3520 of the system 3500, and, more particularly. 図27Aでは、インターフェースプレート3520は、集積チップおよびキャリア3400に、その特定領域を流体的にシールする様式で連結されている。 In Figure 27A, interface plate 3520, the integrated chip and carrier 3400 are connected by a fluidly sealed to fashion the specific area. 特に、流体シールが、インターフェースプレート3520とキャリア3400およびチップの1つ以上の領域(例えば、第1のタンパク質領域3430、第2のタンパク質領域3432、第1のウェル領域3420、第2のウェル領域3422、インターフェースアキュムレーター3460、チェックバルブ3465、閉じ込めアキュムレーター3450、および/またはチェックバルブ3455)との間に提供される。 In particular, the fluid seal, interface plate 3520 and the carrier 3400 and one or more regions of the chip (e.g., a first protein region 3430, second protein region 3432, first well region 3420, second well region 3422 , interface accumulator 3460, check valve 3465 is provided confinement accumulator 3450, and / or between the check valve 3455). 1つの実施形態では、インターフェースプレート3520は、領域3420、3422、3430、3432、ならびにアキュムレーター3450および3460に流体シールを提供する。 In one embodiment, interface plate 3520 provides a fluid seal in the region 3420,3422,3430,3432, and accumulator 3450 and 3460. 1つの実施形態では、インターフェースプレート3520は、図27Bに最もよく観察されるように、1つ以上のチェックバルブアクチュエーター3570を提供する。 In one embodiment, interface plate 3520, as is best observed in FIG. 27B, to provide one or more check valve actuators 3570.

いくつかの実施形態では、インターフェースプレート3520は、すべての所望の流体シールをキャリア3400および微小流体デバイスに提供する。 In some embodiments, interface plate 3520 provides all of the desired fluid seal carrier 3400 and the microfluidic device. そのようにすることで、インターフェースプレート3520は、シールガスケット3580を含み得る。 By doing so, interface plate 3520 may include a sealing gasket 3580. シールガスケット3580は、広範な範囲の材料を含み得、制限されないで、シリコンゴム、エラストマーなどを含む。 Seal gasket 3580 may include a wide range of materials, but are not limited to, include silicon rubber, elastomer and the like. いくつかの実施形態では、ガスケット3580は、所望の位置で流体シールを支援して形成する対応材料を含む。 In some embodiments, the gasket 3580 includes a corresponding material formed by supporting a fluid seal at the desired position. この様にして、システム3500は、チップおよびキャリア3400の適切な領域に所望の圧力を提供し得る。 In this way, system 3500 may provide a desired pressure to the appropriate areas of the chip and carrier 3400. その他の実施形態では、インターフェースプレート3520は、2つ以上の構成要素である。 In other embodiments, interface plate 3520 is a two or more components. 例えば、キャリア3400および微小流体デバイス上の領域またはポートは、各々、そのポートまたは領域に適合するよう適合された別個のプレート3520に流体的に連結され得る。 For example, regions or ports on carrier 3400 and the microfluidic device each may be fluidly coupled to a separate plate 3520 adapted to fit that port or region. システム3500は、次いで、種々のポートまたは領域のために必要な数のインターフェースプレート3520を含む。 System 3500 then includes a number of interface plates 3520 required for the various ports or regions. さらに、いくつかの実施形態では、1つを超える領域またはポートが、特定のインターフェースプレート3520に連結され、その一方、その他の領域またはポートが別個のインターフェースプレート3520に連結される。 Furthermore, in some embodiments, region or port more than one is connected to a particular interface plate 3520, while other regions or ports are coupled to a separate interface plate 3520. インターフェースプレートおよびキャリア/チップ領域およびポートのその他の組み合わせが、本発明の範囲内に入る。 Other combinations of interface plates and carrier / chip regions and ports, fall within the scope of the present invention.

システム3500の作動は、1つの実施形態において、1つ以上のキャリア3400の受容ステーション(単数または複数)3510中への装填を含む。 Operation of the system 3500, in one embodiment, includes a loading to one or more receiving stations of the carrier 3400 (s) in 3510. いくつかの実施形態では、キャリア3400は、それに結合された微小流体デバイスを含み、そして上記キャリアを受容ステーション3510中に配置する前にキャリアウェル中に装填される所望の試薬およびタンパク質を有する。 In some embodiments, the carrier 3400 includes a combined microfluidic devices to it and having the desired reagents and proteins loaded into the carrier wells prior to placing the carrier into the receiving station 3510. その他の実施形態では、上記キャリア3400は、受容ステーション3510中に配置され、そして次に、試薬およびタンパク質が装填される。 In other embodiments, the carrier 3400 is placed in the receiving station 3510, and then the reagents and proteins loaded. キャリア3400は、さらに、水和流体で装填され得る。 Carrier 3400 may be further loaded with hydrating fluid. 水和流体は、水和チャンバー3440中に配置され得る。 Hydrating fluid may be placed in a hydration chamber 3440. キャリア3400がシステム3500中に装填された後、インターフェースプレート3520が低下されるか、またはそうでなければ、キャリア3400を係合するために移動される。 After the carrier 3400 is loaded into the system 3500, or interface plate 3520 is lowered, or otherwise, it is moved to engage the carrier 3400. プレート3520は、手動により、ロボットにより、またはそうでなければ低下され、チップ/キャリア3400の部分またはすべてを流体的にシールする。 Plate 3520, manually, by a robot, or is reduced otherwise, parts or all of the chip / carrier 3400 to seal fluidly. 水和流体は、インターフェースアキュムレーター3460および/または閉じ込めアキュムレーター3450に提供され、そしてインターフェースプレート3520に連結された圧力源を用い、アキュムレーター3450、3460に適切な圧力を付与することによってチップ中に流す。 Hydrating fluid is provided to interface accumulator 3460 and / or containment accumulator 3450, and using a pressure source coupled to interface plate 3520, the chip in by applying appropriate pressure to the accumulator 3450,3460 flow. 特定の実施形態では、システム3500は、このプロセスを自動的に実施し、これは、特定の実施形態では、水和流体がキャリア3400に添加された後、約20時間以内に生じる。 In certain embodiments, the system 3500, this process automatically performed, which, in certain embodiments, after the hydration fluid is added to the carrier 3400, occurs within about 20 hours. 結果として、このチップは、水圧流体で十分に装填され、本明細書中、そしてより詳細には、本明細書中に参考として先に援用された特許および出願に記載されるように、チップ閉じ込めおよび/またはインターフェースバルブを作動する。 As a result, the chip is sufficiently loaded with hydraulic fluid, herein, and more specifically, as described in the incorporated patents and applications previously by reference herein, chip confinement and / or to operate the interface valve.

試薬およびサンプルを含む溶液は、適切な入口の周りで適切にシールされたチップ領域に所望の圧力を付与することによりチップ中に分与される。 The solution containing the reagents and samples are dispensed into the chip by applying the desired pressure suitably in sealed chip regions around the appropriate inlets. 例えば、約1psiと約35psiとの間の圧力を第1および第2のウェル領域3420および3422に付与することは、試薬をチップ中に流すよう作動する。 For example, applying a pressure of between about 1psi and about 35psi to the first and second well regions 3420 and 3422 are actuated to flow the reagent in the chip. 同様に、約1psiと約35psiとの間の圧力を第1および第2のタンパク質領域3430および3432に付与することは、タンパク質をチップ中に流すよう作動する。 Similarly, applying a pressure of between about 1psi and about 35psi to the first and second protein regions 3430 and 3432 are operative to pass a protein in the chip. 特定の実施形態では、これは、チップに水圧流体を装填した後約60分以内に起こる。 In certain embodiments, this occurs within about 60 minutes after loading the hydraulic fluid to the chip. 一旦、上記溶液が、チップ内の所望のウェル、チャンバー、リザーバーなどに流されると、チップ内のインターフェースバルブが、インターフェースアキュムレーター3460中のチェックバルブ3465を解放することによって開かれる。 Once the solution is desired wells in the chip chamber and flows like reservoir, the interface valves within the chip are opened by releasing check valve 3465 in interface accumulator 3460. 特定の実施形態では、チェックバルブ3465が解放され、システム3500が、チェックバルブ3465に係合するチェックバルブアクチュエーター3570を能動化するとき、チップ中のインターフェースバルブを開く。 In certain embodiments, the released check valve 3465, the system 3500, when active the check valve actuator 3570 which engages check valve 3465, opening the interface valves in the chip. いくつかの実施形態では、チェックバルブアクチュエーター3570は、インターフェースアキュムレーター3460内の圧力を解放するために、チェックバルブ3465に係合するよう適合されたピン、ポストなどを含む。 In some embodiments, check valve actuator 3570 includes to release the pressure in the interface accumulator 3460, a pin adapted to engage the check valve 3465, posts and the like. 代替の実施形態では、チェックバルブ3465は、手動で解放または開かれる。 In an alternative embodiment, check valve 3465 is manually released or opened.

上記溶液が、拡散、またはチャンバー中の流体の移動を増加するために、対流混合またはインターフェースバルブの反復開放および閉鎖のようなその他のプロセスを用いて、所望の時間の間混合されるようにされた後、このインターフェースバルブは閉鎖される。 The solution is to increase the movement of the fluid diffusion, or in the chamber, using other processes such as repeated opening and closing of convective mixing or interface valves, are to be mixed for the desired time after, the interface valves are closed. 閉鎖されたインターフェースバルブおよび閉じ込めバルブを維持するために、圧力がアクチュエーター3450および/または3460に付与される。 To maintain the closed interface valves and containment valves, pressure is applied to the actuator 3450 and / or 3460. キャリア3400は、本明細書中に記載されるプロセスにおけるインキュベーション、または貯蔵、または使用のためにシステム3500から除去され得る。 Carrier 3400 may be removed from the system 3500 for incubation or storage or use, in a process described herein. アクチュエーター3450および3460は、閉じ込めおよびインターフェースバルブが開くことを防ぐか、または支援して防ぐために、数時間から数日まで、所望の時間の間この圧力を保持する。 Actuator 3450 and 3460, anti-tool or that containment and interface valve opens, or to prevent and support, from a few hours to a few days, to maintain this pressure for a desired period of time. 特定の実施形態では、アクチュエーター3450および3460は、チップ内の圧力を、閉じ込めおよび/またはインターフェースバルブを閉鎖して維持するために十分な閾値圧力を超えて維持する。 In certain embodiments, the actuator 3450 and 3460, the pressure in the chip is maintained above a sufficient threshold pressure in order to maintain closed containment and / or interface valves. 1つの実施形態では、アクチュエーター3450および3460は、圧力を、少なくとも2日、少なくとも7日、などの間、閾値圧力を超えて維持する。 In one embodiment, actuators 3450 and 3460, the pressure of at least 2 days, at least 7 days, during such is maintained above a threshold pressure. 所定の時間、アクチュエーター3450および3460は、インキュベーション温度に一部依存して所望の圧力を維持する。 Predetermined time, actuators 3450 and 3460 are partially dependent to maintain the desired pressure in the incubation temperature. 所望のインキュベーション期間長さおよび/またはインキュベーション条件に一部依存して、キャリア3400は、アクチュエーター3450、3460を再チャージまたは再加圧するためにシステム3500に戻され得る。 Depending in part on the desired incubation period length and / or incubation conditions, carrier 3400 may be returned to the system 3500 for applying recharge or re-pressurize the actuator 3450,3460. この様にして、上記インキュベーション期間は、このようであり得る。 In this manner, the incubation period is may By so.

特定の実施形態では、集積キャリア3400および微小流体デバイスは、本発明のシステムを用いることにより本発明の実施形態による所望の実験を実施するために適合されている。 In certain embodiments, the integrated carrier 3400 and microfluidic device are adapted to carry out the desired experiment with an embodiment of the present invention by using the system of the present invention. より詳細には、図26Aに示されるように、システム3500は、各々がキャリア3400を受容するように適合された1つ以上の受容ステーション3510を含む。 More specifically, as shown in FIG 26A, system 3500 includes one or more receiving stations 3510 that are adapted each to receive a carrier 3400. 特定の実施形態では、システム3500は、4つの受容ステーション3510を含むが、より少ないか、またはより多い数のステーション3510が本発明の代替の実施形態で提供される。 In certain embodiments, the system 3500 includes four receiving stations 3510, or fewer, or than the number of stations 3510 are often provided in alternative embodiments of the present invention. 図26Bは、インターフェースプレート3520の下でステーション3510中に配置されたキャリア3400およびデバイスを組み合わせて描写する。 Figure 26B depicts a combination of carrier 3400 and a device disposed in the station 3510 under the interface plate 3520. インターフェースプレート3520は、図26Bで下方に移動するように適合され、インターフェースプレート3520は、キャリア3400の上面およびその微小流体デバイスに係合する。 Interface plate 3520 is adapted to move downward in FIG. 26B, interface plate 3520 engages the upper surface of the carrier 3400 and its microfluidic device. いくつかの実施形態では、ステーション3510およびプラテン3520は、ステーション3200およびプラテン3207と同様である。 In some embodiments, station 3510 and platen 3520 are similar to station 3200 and platen 3207. インターフェースプレート3520は、流体、圧力などを受容するよう適合されているキャリア3400中の領域との連結のための1つ以上のポート3525を含む。 Interface plate 3520 includes a fluid, one or more ports 3525 for coupling with regions in carrier 3400 which are adapted to receive a like pressure. いくつかの実施形態では、インターフェースプレート3520は、2つのポート、3つのポート、4つのポート、5つのポート、6つのポート、7つのポート、8つのポート、9つのポート、10のポート、などを含む。 In some embodiments, interface plate 3520 includes two ports, three ports, four ports, five ports, six ports, seven ports, eight ports, nine ports, 10 ports, etc. including. 好ましい実施形態では、インターフェースプレート3520は、キャリア3400の所望の領域に圧力を提供するために6つのライン、チェックバルブ3455および3465を能動化するための機構を提供するために2つのラインに連結される。 In a preferred embodiment, interface plate 3520 is coupled to two lines for providing a mechanism for activated six lines, check valves 3455 and 3465 to provide the pressure to a desired region of the carrier 3400 that.

図26Aに示されるように、システム3500は、1つの実施形態では、ラップトップコンピューターまたはその他の計算デバイス3530と関連するプロセッサーであるプロセッサーをさらに含む。 As shown in FIG 26A, system 3500, in one embodiment, further comprises a processor is a processor associated with a laptop computer or other computing device 3530. 計算デバイス3530は、ソフトウェア、スクリプトなど、本発明の所望のプロセスを実施するためのソフトウェア、スクリプトなどを維持するように適合されたメモリーを含む。 Computing device 3530 includes software, scripts, etc., software for carrying out the desired process of the present invention, the adapted memory to maintain such as scripts. さらに、計算デバイス3530は、微小流体デバイスの研究および分析の結果を描写するためのスクリーン3540を含み、そして1つの実施形態では、GUIディスプレイがシステム3500とともに用いられる。 Additionally, computing device 3530 includes a screen 3540 for depicting results of studies and analyzes of microfluidic devices, and in one embodiment, GUI display is used with the system 3500. システム3500は、インターフェースプレート(単数または複数)3520と流体により連結されている微小流体デバイスに加圧流体、ガスなどを送達するための、1つ以上の圧力源(加圧流体、ガスなど)と連結される。 System 3500, pressurized fluid to the microfluidic devices that are connected by an interface plate (s) 3520 and a fluid, for delivering such gases, one or more pressure source (pressurized fluid, such as gas) and It is connected.

図27Aおよび27Bは、システム3500の特定の実施形態、そしてより詳細には、インターフェースプレート3520を描写する。 Figures 27A and 27B are specific embodiments of the system 3500, and more particularly, depicts an interface plate 3520. 図27Aにおいて、インターフェースプレート3520は、集積チップおよびキャリア3400に、その特定の領域を流体的にシールする様式で連結される。 In Figure 27A, interface plate 3520, the integrated chip and carrier 3400, that particular area are connected by fluidly seals manner. 特に、流体シールは、インターフェースプレート3520と、第1のタンパク質領域3430、第2のタンパク質領域3432、第1のウェル領域3420、第2のウェル領域3422、インターフェースアキュムレーター3460、チェックバルブ3465、閉じ込めアキュムレーター3450、および/またはチェックバルブ3455のようなキャリア3400およびチップの1つ以上の領域との間の流体シールが提供される。 In particular, the fluid seal includes an interface plate 3520, a first protein region 3430, second protein region 3432, first well region 3420, second well region 3422, interface accumulator 3460, check valve 3465, containment accumulator fluid seal is provided between the aerator 3450, and / or carrier 3400 and one or more regions of the chip, such as a check valve 3455. 1つの実施形態では、インターフェースプレート3520は、領域3420、3422、3430、3432に対する、そしてアキュムレーター3450および3460に対する流体シールを提供する。 In one embodiment, interface plate 3520, for the region 3420,3422,3430,3432, and provides a fluid seal against the accumulator 3450 and 3460. 1つの実施形態では、インターフェースプレート3520は、図27Bで最も良く観察されるように、1つ以上のチェックバルブアクチュエーター3570を提供する。 In one embodiment, interface plate 3520, as best seen in FIG. 27B, to provide one or more check valve actuators 3570.

いくつかの実施形態では、インターフェースプレート3520は、キャリア3400および微小流体デバイスにすべての所望の流体シールを提供する。 In some embodiments, interface plate 3520 provides all of the desired fluid seal carrier 3400 and the microfluidic device. そのようにすることで、インターフェースプレート3520は、シールガスケット3580を含み得る。 By doing so, interface plate 3520 may include a sealing gasket 3580. シールガスケット3580は、広範な範囲の材料を含み得、制限されないで、シリコンゴム、エラストマーなどを含む。 Seal gasket 3580 may include a wide range of materials, but are not limited to, include silicon rubber, elastomer and the like. いくつかの実施形態では、ガスケット3580は、所望の位置で流体シールを支援して形成する対応材料を含む。 In some embodiments, the gasket 3580 includes a corresponding material formed by supporting a fluid seal at the desired position. この様にして、システム3500は、チップおよびキャリア3400の適切な領域に所望の圧力を提供し得る。 In this way, system 3500 may provide a desired pressure to the appropriate areas of the chip and carrier 3400. その他の実施形態では、インターフェースプレート3520は、2つ以上の構成要素である。 In other embodiments, interface plate 3520 is a two or more components. 例えば、キャリア3400および微小流体デバイス上の領域またはポートは、各々、そのポートまたは領域に適合するよう適合された別個のプレート3520に流体的に連結され得る。 For example, regions or ports on carrier 3400 and the microfluidic device each may be fluidly coupled to a separate plate 3520 adapted to fit that port or region. システム3500は、次いで、種々のポートまたは領域のために必要な数のインターフェースプレート3520を含み得る。 System 3500 may then include a number of interface plates 3520 required for the various ports or regions. さらに、いくつかの実施形態では、1つを超える領域またはポートが、特定のインターフェースプレート3520に連結され、その一方、その他の領域またはポートが別個のインターフェースプレート3520に連結される。 Furthermore, in some embodiments, region or port more than one is connected to a particular interface plate 3520, while other regions or ports are coupled to a separate interface plate 3520. インターフェースプレートおよびキャリア/チップ領域およびポートのその他の組み合わせがまた、本発明の範囲内に入る。 Other combinations of interface plates and carrier / chip regions and ports also fall within the scope of the present invention.

システム3500の作動は、1つの実施形態において、1つ以上のキャリア3400の受容ステーション(単数または複数)3510中への装填を含む。 Operation of the system 3500, in one embodiment, includes a loading to one or more receiving stations of the carrier 3400 (s) in 3510. いくつかの実施形態では、キャリア3400は、それに結合された微小流体デバイスを含み、そして上記キャリアを受容ステーション3510中に配置する前にキャリアウェル中に装填される所望の試薬およびタンパク質を有する。 In some embodiments, the carrier 3400 includes a combined microfluidic devices to it and having the desired reagents and proteins loaded into the carrier wells prior to placing the carrier into the receiving station 3510. その他の実施形態では、上記キャリア3400は、受容ステーション3510中に配置され、そして次に、試薬およびタンパク質が装填される。 In other embodiments, the carrier 3400 is placed in the receiving station 3510, and then the reagents and proteins loaded. キャリア3400は、さらに、水和流体で装填され得る。 Carrier 3400 may be further loaded with hydrating fluid. 水和流体は、水和チャンバー3440中に配置され得る。 Hydrating fluid may be placed in a hydration chamber 3440. キャリア3400がシステム3500中に装填された後、インターフェースプレート3520が低下されるか、またはそうでなければ、キャリア3400を係合するために移動される。 After the carrier 3400 is loaded into the system 3500, or interface plate 3520 is lowered, or otherwise, it is moved to engage the carrier 3400. プレート3520は、手動により、ロボットにより、またはそうでなければ低下され、チップ/キャリア3400の部分またはすべてを流体的にシールする。 Plate 3520, manually, by a robot, or is reduced otherwise, parts or all of the chip / carrier 3400 to seal fluidly. 水和流体は、インターフェースアキュムレーター3460および/または閉じ込めアキュムレーター3450に提供され、そしてインターフェースプレート3520に連結された圧力源を用い、アキュムレーター3450、3460に適切な圧力を付与することによってチップ中に流される。 Hydrating fluid is provided to interface accumulator 3460 and / or containment accumulator 3450, and using a pressure source coupled to interface plate 3520, the chip in by applying appropriate pressure to the accumulator 3450,3460 It flowed. 特定の実施形態では、システム3500は、このプロセスを自動的に実施し、これは、特定の実施形態では、水和流体がキャリア3400に添加された後、約20時間以内に生じる。 In certain embodiments, the system 3500, this process automatically performed, which, in certain embodiments, after the hydration fluid is added to the carrier 3400, occurs within about 20 hours. 結果として、このチップは、水圧流体で十分に装填され、本明細書中、そしてより詳細には、本明細書中に参考として先に援用された特許および出願に記載されるように、チップ閉じ込めおよび/またはインターフェースバルブを作動する。 As a result, the chip is sufficiently loaded with hydraulic fluid, herein, and more specifically, as described in the incorporated patents and applications previously by reference herein, chip confinement and / or to operate the interface valve.

試薬およびサンプルを含む溶液は、適切な入口の周りで適切にシールされたチップ領域に所望の圧力を付与することによりチップ中に分与される。 The solution containing the reagents and samples are dispensed into the chip by applying the desired pressure suitably in sealed chip regions around the appropriate inlets. 例えば、約1psiと約35psiとの間の圧力を第1および第2のウェル領域3420および3422に付与することは、試薬をチップ中に流れるよう作動する。 For example, applying a pressure of between about 1psi and about 35psi to the first and second well regions 3420 and 3422 are operative through the reagent in the chip. 同様に、約1psiと約35psiとの間の圧力を第1および第2のタンパク質領域3430および3432に付与することは、タンパク質をチップ中に流れるよう作動する。 Similarly, applying a pressure of between about 1psi and about 35psi to the first and second protein regions 3430 and 3432 are operative through the protein in the chip. 特定の実施形態では、これは、チップに水圧流体を装填した後約60分以内に起こる。 In certain embodiments, this occurs within about 60 minutes after loading the hydraulic fluid to the chip. 一旦、上記溶液が、チップ内の所望のウェル、チャンバー、リザーバーなどに流されると、チップ内のインターフェースバルブが、インターフェースアキュムレーター3460中のチェックバルブ3465を解放することによって開かれる。 Once the solution is desired wells in the chip chamber and flows like reservoir, the interface valves within the chip are opened by releasing check valve 3465 in interface accumulator 3460. 特定の実施形態では、チェックバルブ3465が解放され、システム3500が、チェックバルブ3465に係合するチェックバルブアクチュエーター3570を能動化するとき、チップ中のインターフェースバルブを開く。 In certain embodiments, the released check valve 3465, the system 3500, when active the check valve actuator 3570 which engages check valve 3465, opening the interface valves in the chip. いくつかの実施形態では、チェックバルブアクチュエーター3570は、インターフェースアキュムレーター3460内の圧力を解放するために、チェックバルブ3465に係合するよう適合されたピン、ポストなどを含む。 In some embodiments, check valve actuator 3570 includes to release the pressure in the interface accumulator 3460, a pin adapted to engage the check valve 3465, posts and the like. 代替の実施形態では、チェックバルブ3465は、手動で解放または開かれる。 In an alternative embodiment, check valve 3465 is manually released or opened.

上記溶液が、拡散、またはチャンバー中の流体の移動を増加するために、対流混合またはインターフェースバルブの反復開放および閉鎖のようなその他のプロセスを用いて、所望の時間の間混合されるようにされた後、このインターフェースバルブは閉鎖される。 The solution is to increase the movement of the fluid diffusion, or in the chamber, using other processes such as repeated opening and closing of convective mixing or interface valves, are to be mixed for the desired time after, the interface valves are closed. 閉鎖されたインターフェースバルブおよび閉じ込めバルブを維持するために、圧力がアクチュエーター3450および/または3460に付与される。 To maintain the closed interface valves and containment valves, pressure is applied to the actuator 3450 and / or 3460. キャリア3400は、本明細書中に記載されるプロセスにおけるインキュベーション、または貯蔵、または使用のためにシステム3500から除去され得る。 Carrier 3400 may be removed from the system 3500 for incubation or storage or use, in a process described herein. アクチュエーター3450および3460は、閉じ込めおよびインターフェースバルブが開くことを防ぐか、または支援して防ぐために、数時間から数日まで、所望の時間の間この圧力を保持する。 Actuator 3450 and 3460, anti-tool or that containment and interface valve opens, or to prevent and support, from a few hours to a few days, to maintain this pressure for a desired period of time. 特定の実施形態では、アクチュエーター3450および3460は、チップ内の圧力を、閉じ込めおよび/またはインターフェースバルブを閉鎖して維持するために十分な閾値圧力を超えて維持する。 In certain embodiments, the actuator 3450 and 3460, the pressure in the chip is maintained above a sufficient threshold pressure in order to maintain closed containment and / or interface valves. 1つの実施形態では、アクチュエーター3450および3460は、圧力を、少なくとも2日、少なくとも7日、などの間、閾値圧力を超えて維持する。 In one embodiment, actuators 3450 and 3460, the pressure of at least 2 days, at least 7 days, during such is maintained above a threshold pressure. 所定の時間、アクチュエーター3450および3460は、インキュベーション温度に一部依存して所望の圧力を維持する。 Predetermined time, actuators 3450 and 3460 are partially dependent to maintain the desired pressure in the incubation temperature. 所望のインキュベーション期間長さおよび/またはインキュベーション条件に一部依存して、キャリア3400は、アクチュエーター3450、3460を再チャージまたは再加圧するためにシステム3500に戻され得る。 Depending in part on the desired incubation period length and / or incubation conditions, carrier 3400 may be returned to the system 3500 for applying recharge or re-pressurize the actuator 3450,3460.

いくつかの実施形態では、本明細書中にほぼ記載されたように、集積チップキャリア(ICC)およびそれに取り付けられたエラストマーチップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を容易にするために用いられる。 In some embodiments, as described generally herein, integrated chip carrier (ICC) and elastomer chip attached thereto is used to facilitate the polymerase chain reaction (PCR). しかし、PCRチップを用いてPCRを試みるとき、プラスチックICCの熱伝導性は、このエラストマーチップに宿される反応のアレイの間で均一な熱フィールドを効率的に生成しないかも知れない。 However, when attempting to PCR using the PCR chip, thermal conductivity of the plastic ICC may not efficiently produce a uniform thermal field between the reaction of array harbored in the elastomer chip. 例えば、図28Aに描写されるICCは、その他のプロセスの中でタンパク質結晶化のために有用であるが、それに結合されたチップに十分に均一に熱を移さないかも知れない。 For example, ICC depicted in Figure 28A is useful for protein crystallization among other processes may not sufficiently uniformly transferred heat to the bonded chip it. さらに、図28AのICCの操作は、そのICCがプラテンに対して保持される必要があり得る。 Furthermore, ICC operation of FIG. 28A, it may be necessary that ICC is held against the platen. 図29Aに示されるように、圧縮力の適用は、このチップに悪影響を及ぼし得る。 As shown in FIG. 29A, the application of compressive force may adversely affect the chip. したがって、本発明のいくつかの実施形態では、改善された均質の熱場が図28Bと併せて記載されるICC実施形態を用いて提供され、そして改善されたICC保持方法が図29Bに示される。 Thus, in some embodiments of the present invention, an improved homogeneous heat field is provided using the ICC embodiments described in conjunction with FIG. 28B, and improved ICC holding method is shown in Figure 29B .

いくつかの実施形態では、エラストマーチップは、ICCとの流体接続がそのエラストマーチップの外面に位置付けられるように設計される。 In some embodiments, the elastomeric tip is designed so that the fluid connection between the ICC is positioned on the outer surface of the elastomeric tip. この様式において、ICCの一部は、流体輸送について依存される必要はない。 In this manner, a portion of the ICC, need not be dependent on fluid transport. ICC 3800の1つのこのような実施形態が、図28Aに示される。 One such embodiment of ICC 3800 is shown in Figure 28A. いくつかの実施形態では、ICC表面と接触していないエラストマーチップの領域は、反応チャンバのアレイが置かれるところである。 In some embodiments, the region of the elastomeric tip is not in contact with the ICC surface is where the array of reaction chambers is placed. この反応領域3810は、エラストマーチップ、およびそのチップの下側(他の場合にICCのプラスチック部分と接触するエラストマーブロックの側)に対して嵌合される導電性材料を備える。 The reaction region 3810, elastomer comprises chip, and a conductive material which is fitted against (the side of the elastomeric block in contact with the plastic part of the ICC in the case of the other) the lower of the chip. 反応領域3810のサイズおよび形状は、本発明の範囲内で変化し得、図29Cに示される一実施形態は、ICCとチップとの間の関係を示す。 The size and shape of the reaction zone 3810, one embodiment shown vary and in Figure 29C within the scope of the present invention, showing the relationship between the ICC and the chip.

この様式において、(例えば、PCR装置からの)熱エネルギーは、最小のもしくは減少された熱インピーダンスでエラストマーブロックに伝達され得る。 In this manner, (e.g., from PCR device) thermal energy can be transmitted to the elastomeric block with minimal or reduced thermal impedance. いくつかの実施形態では、熱伝導性材料は、シリコン(Si)を含む。 In some embodiments, thermal conduction material includes silicon (Si). 特定の実施形態では、研磨され滑らかにされたシリコンウエハーに由来するシリコン(半導体産業で使用されるものと類似かまたは同じ)が使用される。 In certain embodiments, the silicon derived from the silicon wafer is smoothed and polished (similar or identical to those used in the semiconductor industry) is used. 他の熱インピーダンスの低い材料もまた、求められる熱プロフィールの性質に依存して、本発明の範囲内で使用され得る。 Other low thermal impedance materials also depend on the nature of the thermal profiles sought, it can be used within the scope of the present invention. いくつかの実施形態では、熱伝導性材料は、低い熱質量(すなわち、良好な熱良導体であるが、温度で迅速な変化を生じる材料(例えば、銅))を有する。 In some embodiments, thermal conduction material has a low thermal mass (i.e., is a good heat conductor, resulting in rapid changes in temperature material (e.g., copper)). いくつかの実施形態では、リアルタイムでまたはPCR反応の終点分析のときに、研磨されたシリコンを使用して、ミラー効果を増強し、このシステムで使用される検出器によって集められ得る光の量を増大させる。 In some embodiments, when the endpoint analysis of real-time or a PCR reaction, using a polished silicon enhances the Miller effect, the amount of light that can be collected by the detector used in this system increase. これらの利益はまた、等温反応を改善し得る。 These benefits may also improve the isothermal reaction.

ICC 3800を用いて、PCRを行うことを望む者は、エラストマーブロックの反応領域を熱制御源と嵌合させることによってPCRを行い得る。 Using ICC 3800, who wishes to carry out the PCR, the reaction area of ​​the elastomeric block may perform PCR by fitting the thermal control source. この熱制御源は、PCR機、加熱プラテン、別個の熱源などを備え得る。 The thermal control source, PCR machine, heating platen may comprise such separate heat source. いくつかの実施形態では、ICCは、平底の反応プレートを許容する標準的なPCR機に適合し、そして/または平らな熱プレートを有し、ここで、チューブベースのPCRの種々の形式のためのアダプタが使用され得る。 In some embodiments, ICC are compatible with standard PCR machine that allows the reaction plate of a flat bottom, and having a / or flat heat plate, wherein, for the various types of tube-based PCR of the adapter may be used. しかし、これらの構成の各々は、一般的に、図29Aに示されるように良好な均一な熱的接触を得るためにプレートを下向きに圧迫することに依存する。 However, each of these configurations will generally depend to compress plate downward in order to obtain a good uniform thermal contact as shown in Figure 29A. 本発明のいくつかの実施形態では、可塑性のバルブおよびエラストマーチャンバが変形し、そのエラストマーチップ内で望ましくない流体作用が生じるので、エラストマーチップは下向きの圧迫は受け入れられない。 In some embodiments of the present invention, deformed plastic of the valve and elastomeric chamber, the fluid undesirable effects within the elastomeric chip occurs, the elastomeric tip downward pressure is unacceptable.

他の実施形態では、ICCを下向きに圧迫することの負の効果は、真空チャックを使用して、他の場合には露出したエラストマーブロックの下側に結合された熱材料に対して嵌合させることによって減少されるかまたは回避される。 In other embodiments, the negative effect of compressing the ICC to downward, using a vacuum chuck, is fitted to heat material bonded to the underside of the exposed elastomeric block in other cases It is or avoided is reduced by. この様式において、真空がチャックに適用されるときに、真空チャックとICCの熱材料との間に密なシールが作製される。 In this manner, when a vacuum is applied to the chuck, tight seal is made between the heat material of the vacuum chuck and ICC. 図29Bに示されるような一実施形態では、真空チャック3950は、熱制御源(例えば、1以上のPeltierデバイス)に結合される良好な熱良導体である1以上の材料を含むか、またはそのような材料から作製される。 In one embodiment as shown in FIG. 29B, the vacuum chuck 3950, thermal control source (e.g., one or more Peltier devices) or comprises one or more materials that are good heat conductor coupled to, or such It is made from such material. 一実施形態では、複数の熱制御が使用されて、反応のアレイ間の熱勾配を生成する。 In one embodiment, a plurality of heat control is used to generate a thermal gradient between the reaction of the array.

使用において、ICCは真空チャック3950の上に配置され、集積チップ3910および真空チャックを備えるICC 3930の熱部分3920に接触するように下に下げられるかまたは他の場合には移動される。 In use, ICC is placed on the vacuum chuck 3950, it is moved in the case of or otherwise lowered below so as to contact the heat portion 3920 of the ICC 3930 comprising an integrated chip 3910 and the vacuum chuck. この場合も、一実施形態では、熱部分3920はシリコンを含む。 Again, in one embodiment, the thermal portion 3920 comprises silicon. 熱部分3920は、エラストマーブロックまたはチップ3910に連結するように描かれ、そのような連結は、いくつかの実施形態では接着剤などを用いて達成される。 Thermal portion 3920 is depicted as coupled to the elastomer block or chip 3910, such coupling may, in some embodiments is accomplished using an adhesive or the like. 示されるように、ブロック3910は、ICC 3930に係合し、一実施形態では、ギャップ3940が熱部分3920とICC 3930との間で維持される。 As shown, block 3910 engages the ICC 3930, in one embodiment, the gap 3940 is maintained between the heat portions 3920 and ICC 3930. ギャップ3940は、ICC 3930を熱ヒート源(例えば、チャックまたはプラテン3950)から熱的に分離することを補助する。 Gap 3940 assists in the ICC 3930 thermal heat source (e.g., chuck or platen 3950) thermally isolated from. さらに、一実施形態において、ギャプ3940は、ブロック3910および/または熱部分3920のいくらかの湾曲を許容する。 Further, in one embodiment, Gap 3940 allows some bending of the block 3910 and / or thermal portion 3920. この様式において、ギャップ3940は、いくつかの実施形態では、真空が1以上の真空ポート3960を通ってチャック3950に適用されて熱部分3920がチャック3950の方に引っ張られるときに、シールを形成することを補助する。 In this manner, the gap 3940, in some embodiments, when the vacuum thermal portion 3920 is applied to the chuck 3950 through one or more vacuum ports 3960 are pulled towards the chuck 3950 to form a seal to assist that. 達成される真空の量は、良好な熱的接触が、チャック3950と熱部分3920との間に実際に作製されたことを確認するためにモニタリングされ得る。 The amount of vacuum to be achieved, good thermal contact can be monitored to verify that it was actually produced between the chuck 3950 and the heat portion 3920. いくつかの実施形態では、真空チャックの1以上のポートが、真空のレベルをモニタリングするために使用される。 In some embodiments, one or more ports of the vacuum chuck is used to monitor the level of vacuum. 図29Dおよび図30に示されるような特定の実施形態では、真空のレベルをモニタリングするために使用される1以上のポートは、その真空ポートの遠位に配置され、互いに通路(好ましくは、蛇行した狭い通路)を通じて流体連通する。 In certain embodiments, such as shown in FIG. 29D and FIG. 30, one or more ports that are used to monitor the level of vacuum is disposed distally of the vacuum ports, are each passage (preferably, meander in fluid communication through the narrow passage) it was. この様式において、真空チャックの一方の側−ICCの熱部分の間の差異が、真空チャックの他方の側−ICCの熱部分と比較されて、真空チャックにおいてICCを再配置する試みが、存在する場合には真空の喪失の問題を解決し得る。 In this manner, the difference between one heat portions of the side -ICC of the vacuum chuck is compared with other heat portions of the side -ICC vacuum chuck, an attempt to relocate the ICC in a vacuum chuck, there You can solve the problem of loss of vacuum in the case. これは、自動または手動、あるいはそれらのいくらかの組み合わせのいずれかで行われる反復性のプロセスである。 This is an automatic or manual or repetitive processes performed either some combination thereof.

図30は、本発明に従うチャックの一実施形態を示す。 Figure 30 shows an embodiment of a chuck according to the present invention. 真空チャック熱部分領域にわたる示差真空レベルの正確な測定を達成するため、そしてICCの熱部分に均質なまたは比較的均質な真空の適用を行うために使用される蛇行した通路の性質は、本発明の範囲内で変更され得る。 To achieve an accurate measurement of differential vacuum level over a vacuum chuck heat partial region, and the nature of the tortuous path is used to perform the application of homogeneous or relatively homogeneous vacuum thermal portion of the ICC, the present invention but it may be modified within the. このアプローチを使用することによって、PCR反応を行うために使用されるエラストマーブロックは、通常の下向きの圧迫が使用されるときにそのエラストマーブロックのエラストマー(湾曲可能な)部分の機能性を損なうことなく、PCR機と良好に熱的接触し得る。 By using this approach, the elastomeric blocks are used to perform PCR reactions without compromising the functionality of the elastomer (bendable) portion of the elastomeric block when the normal downward pressure is used may good thermal contact with the PCR machine.

本発明は、その特定の実施形態を参照して本明細書に記載されているが、一定の許容範囲の改変、種々の変更および置き換えが上述の開示で意図され、そしていくつかの場合において、本発明のいくつかの特徴が、上に記載されるような本発明の範囲から逸脱することなく、他の特徴の対応する使用を伴わずに利用されることが理解される。 The present invention has been described herein with reference to particular embodiments, modifications of certain allowable range, various changes and substitutions are intended in the foregoing disclosure, and in some cases, some of the features of the present invention, without departing from the scope of the invention as described above, are understood to be utilized without the corresponding use of other features. 例えば、上に記載される圧力ベースの作動システムに加えて、任意の静電作動システムおよび磁気作動システムもまた企図される。 For example, in addition to pressure based actuation systems described above, optional electrostatic actuation systems and magnetic actuation systems are also contemplated. 熱膨張または液体から気体を発生させることのいずれかによって、熱エネルギーの適用に基づいて制御チャネルにおける流体の流れを引き起こすことによってデバイスを作動させることも可能である。 Either by generating the gas from the thermal expansion or a liquid, it is also possible to actuate the device by causing a flow of fluid in the control channel based on the application of thermal energy. さらに、別の実施形態では、タンパク質および試薬をチップに入れるために、遠心力が使用される。 Further, in another embodiment, the protein and reagents to take into chips, centrifugal force is used. したがって、特定の状況または材料を本発明の本質的な範囲および精神から逸脱することなく、本発明の教示に適合させるように、多くの改変がなされ得る。 Therefore, without departing from a particular situation or material from the essential scope and spirit of the present invention, to adapt the teachings of the present invention, many modifications may be made. 本発明は、本発明を実施するために企図される最良の形態として開示される特定の実施形態に限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲内に入るすべての実施形態および等価物を包含することが意図される。 The present invention is not limited to the particular embodiment disclosed as the best mode contemplated for carrying out this invention, all embodiments falling within the scope of the appended claims and equivalents It is intended to encompass a.

(参考) (reference)
1. 1. Ungerら、Science 288,113−116(2000)。 Unger et al., Science 288,113-116 (2000).

2. 2. サンプルチャネルおよび制御ラインは、「ブラインドフィリング」で充填される−PDMSは、十分にガス透過性であり、数psiで加圧された液体は、ガスをチャネルから外に出し、チャネルを液体で完全に満たす。 Sample channels and control lines are-PDMS be filled with "blind filling" is sufficiently gas permeable, liquid pressurized by the number psi, put out the gas from the channel, the complete channel liquid fill in. Hansenら、PNAS 99,16531−16536(2002)を参照のこと。 Hansen et al., See PNAS 99,16531-16536 (2002).

3. 3. ヒトβ−アクチン遺伝子の294bpセグメントを、5'−エキソヌクレアーゼアッセイ(Taqman)を使用して増幅した。 The 294bp segment of the human β- actin gene was amplified using 5'-exonuclease assay (Taqman). 順方向プライマーおよび逆方向プライマーの配列は、それぞれ、5'−TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3'および5'−CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3'であった。 Sequences of the forward and reverse primers were respectively, 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3 'and 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3'. 図1bは、TAMRAベースのFRETプローブ、配列5'−(FAM)ATGCCC−X(TAMRA)−CCCCCATGCCATCCTGCGTp−3'を用いて取得した。 Figure 1b, TAMRA based FRET probes, sequence 5 - were obtained using the '(FAM) ATGCCC-X (TAMRA) -CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3'. 図1cのデータは、暗いクエンチャーベースのプローブを用いて取得した。 Data in Figure 1c were obtained using a dark quencher based probes. なぜなら多数のこれらのプライマー−プローブセットが市販されているからである。 Because many of these primers - because probe sets are commercially available. 反応物は、1× Taqman緩衝液A(50mM KCl、10mM Tris−HCl、0.01M EDTA、60nM 受動的参照1、pH 8.3)、4mM MgCl 、200nM dATP、dCTP、dTTP、400nM dUTP、300nM 順方向プライマー、300nM 逆方向プライマー、200nM プローブ、0.01U/μL Amperase UNG(すべてApplied Biosystems製、Foster City,CA)、0.2U/μL DyNAzyme(Finnzyme,Espoo,Finland)、0.5% Triton−x−100、0.8μg/μl ゼラチン(Calbiochem,San Diego,CA)、5.0% グリセロール、脱イオン水およびヒト雄性ゲノムDNA(Pr Reaction, 1 × Taqman Buffer A (50mM KCl, 10mM Tris- HCl, 0.01M EDTA, 60nM Passive reference 1, pH 8.3), 4mM MgCl 2, 200nM dATP, dCTP, dTTP, 400nM dUTP, 300nM forward primer, 300nM reverse primer, 200 nM probe, 0.01U / μL Amperase UNG (all Applied Biosystems Ltd., Foster City, CA), 0.2U / μL DyNAzyme (Finnzyme, Espoo, Finland), 0.5% Triton-x-100,0.8μg / μl gelatin (Calbiochem, San Diego, CA), 5.0% glycerol, deionized water and the human male genomic DNA (Pr mega)を含んだ。 mega) contained.

4. 4. Quantitative PCR Tschnology,Chapter on “Gene Quantification”,LJ McBride,K Livak,M Luceroら、編者、Francois Ferre,Birkauser,Boston,MA p 97−110,1998。 Quantitative PCR Tschnology, Chapter on "Gene Quantification", LJ McBride, K Livak, M Lucero et al., Editors, Francois Ferre, Birkauser, Boston, MA p 97-110,1998.

E. E. T. T. Lagally,I. Lagally, I. Medintz,R. Medintz, R. A. A. Mathies,Anal Chem 73(3),565−570(2001)、ならびにB. Mathies, Anal Chem 73 (3), 565-570 (2001), as well as B. Vogelstein,K. Vogelstein, K. W. W. Kinzler,PNAS 96,9236−9241(1999)を参照のこと。 Kinzler, PNAS 96,9236-9241 (1999) see.

本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のみのためであり、そしてそれを考慮して種々の改変または変更が当業者に示唆され、その種々の改変または変更は、本明細書の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の内に包含されるべきであることが理解される。 Examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only, and to consider it suggested various modifications or changes to those skilled in the art, that various modifications or changes, hereby it is understood that to be embraced within the spirit and scope as well as the appended claims book. 本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各々個々の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個々に参考として援用されるべきであることが示されているかのように、同程度までのすべての目的のためにその全体が参考として援用される。 All publications mentioned herein, patents, and patent applications, as if each individual publication, whether patent or patent application has been shown that it should be incorporated as a distinct and individually helpful as their entirety for all purposes to the same extent are incorporated by reference.

図1Aは、垂直または水平に交差する流体チャネルのマトリクス設計の例示的なデバイスの概略図である。 Figure 1A is a schematic diagram of an exemplary device of the matrix design of the fluid channels intersecting vertically or horizontally. 図1B〜図1Eは、図1Aにおいて示されたデバイスの一部の拡大図を示し、そしてその操作を図示する。 Figure 1B~ Figure 1E shows an enlarged view of a portion of the device shown in Figure 1A, and illustrates its operation. 図1Fは、サンプルの蒸発を減少させるための保護チャネルを使用する別の例示的なマトリクス設計デバイスの概略図である。 Figure 1F is a schematic diagram of another exemplary matrix design device that uses the protection channel for reducing the evaporation of the sample. 図2は、例示的なブラインドチャネルデバイスの平面図である。 Figure 2 is a plan view of an exemplary blind channel device. 図3Aは、別の例示的なブラインドチャネルデバイスの平面図である。 Figure 3A is a plan view of another exemplary blind channel device. 図3Bは、図3Aに示された一般的な設計の単位に基づいたより複雑なブラインドチャネルデバイスの概略図である。 Figure 3B is a schematic diagram of a complex blind channel device than based on the unit of the general design shown in Figure 3A. 図4は、ハイブリッド設計を使用するデバイスの平面図である。 Figure 4 is a plan view of a device that uses a hybrid design. 図5は、熱サイクリング反応を行うための上昇および下降時間を示すグラフである。 Figure 5 is a graph showing the rise and fall times for performing the thermal cycling reaction. 図6は、ブラインドチャネルタイプのデバイスにおける反応部位内のスポットされた試薬の位置を示し、そのデバイスの隅部における反応部位内の試薬の適切な整列を図示している。 Figure 6 shows the location of spotted reagents within reaction sites in the device of the blind channel type, are shown the proper alignment of the reagents within reaction sites at the corners of the device. 図7Aおよび図7Bは、それぞれ、別のハイブリッドタイプの微小流体デバイスの断面図および概略図であり、実施例1〜4に記載される実験を行うために使用されるデバイスのタイプを示す。 7A and 7B are each a cross-sectional view and schematic diagram of another hybrid type microfluidic device, indicating the type of device used to perform the experiments described in Examples 1-4. 図8は、平均FAM/PR1コントロール比が6種の異なるβアクチンTaqman反応に対してプロットされている棒グラフを示す。 Figure 8 shows a bar graph that has been plotted against the mean FAM / PR1 control ratio six different β-actin Taqman reaction. この反応は、図7Bで示される微小流体デバイス(チップ)(無地の棒)およびMacro TaqMan反応(斜線付きの棒)における熱サイクリングであった。 The reaction was heat cycling definitive microfluidic device shown in FIG. 7B (chip) (solid bars) and Macro TaqMan reactions (hatched bars). コントロールは、DNAなしで設定された第一および第四の棒である。 Control is the first and fourth rod set without DNA. 誤差バーは、その比の標準偏差である。 Error bars are standard deviations of the ratio. 図9は、例示的なピンスポッティングプロセスを示す図である。 Figure 9 is a diagram illustrating an exemplary pin spotting process. 試薬は供給源(例えば、マイクロタイタープレート)からピックアップされ、次いで充填されたピンを基板と接触させることによってプリントされる。 Reagent source (e.g., a microtiter plate) is picked up from, then printed by contact with the substrate the filled pin. 洗浄工程は、脱イオン水でかきまぜ、次いで真空乾燥することからなる。 Washing step, stirring with deionized water and then consists of vacuum drying. 図10は、実施例2に記載される実験に基づいた、実施例1(図7Bを参照のこと)に記載された微小流体デバイス(チップ)についてのFAMシグナル強度を示す棒グラフである。 Figure 10 is based on the experiments described in Example 2 is a bar graph showing the FAM signal strength information for an microfluidic device described in Example 1 (see FIG. 7B) (chips). このデータは、参照レーンのFAM/PR1比によってスケーリングされた(FAMシグナル/PR1シグナル)の形式である。 This data is in the form of a scaled by FAM / PR1 ratio of the reference lane (FAM signal / PR1 signal). 誤差バーは、レーンの標準偏差である。 The error bars are the standard deviation of the lane. 「1.3×」および「1×」の表記は、その通常の値に対して、スポッティングされたプライマーおよびプローブの濃度を指す。 Notation "1.3 ×" and "1 ×" refers to that normal value, the concentration of the spotted primers and probes. 図11は、Macro TaqMan(縞の棒)、および微小流体デバイスにおけるTag Man反応(無地の棒)についての9〜10個のウェルに対する平均VIC/PF1/コントロール比を示す棒グラフである。 Figure 11 is a bar graph showing the average VIC / PF1 / Control ratio for 9-10 wells for Macro TaqMan Tag Man reaction in (striped bars), and microfluidic devices (solid bars). 2つのネガティブコントロール(コントロール)および100pg/nlのゲノムDNAを含む2つのサンプルを、標準量の4倍のプライマー/プローブを用いて上で記載された反応構成成分で熱サイクリングした。 Two samples containing two negative controls (control) and 100 pg / nl of genomic DNA, was thermally cycling the reaction components described above with reference to four times the primer / probe of the standard amount. 誤差バーは、平均の比の標準偏差を示す。 Error bars represent the standard deviation of the average ratio. 図12は、微小流体デバイスの単一フローチャネルから分岐する各10〜1nlウェルについてのFAM/PR1/コントロール比を示す棒グラフである(図7Bを参照のこと)。 Figure 12 is a bar graph showing the FAM / PR1 / Control ratios for each 10~1nl well branching from a single flow channel of a microfluidic device (see FIG. 7B). ゲノムDNAの量は、0.25pg/nlであり、これは1ウェルあたり平均標的1コピーをもたらす。 The amount of genomic DNA is a 0.25pg / nl, which results in an average target 1 copy per well. 図13は、図7Bにおいて示された微小流体デバイスを使用した、CYP2D6 SNP反応についての平均VIC/PR1/コントロール比を示す棒グラフである。 13, was used microfluidic device shown in FIG. 7B, is a bar graph showing the average VIC / PR1 / Control ratios for CYP2D6 SNP reactions. 対立遺伝子1(Al−1)は、参照または野生型対立遺伝子CYP2D6 1に対するVICプローブについてのポジティブコントロールである。 Allele 1 (Al-1) is, relative to the reference or wild type allele CYP2D6 * 1 is a positive control for VIC probe. 対立遺伝子2(Al−2)は、改変体または変異体対立遺伝子であるCYP2D6 3に対するFAMプローブについてのポジティブコントロールである。 Allele 2 (Al-2) is a positive control for FAM probe against CYP2D6 * 3 is a variant or mutant allele. コントロールはDNA鋳型を有さない。 Control does not have a DNA template. ゲノムDNAを、100pg/nlまたは20pg/nlのいずれかで使用した。 The genomic DNA, were used with either 100 pg / nl or 20 pg / nl. 誤差バーは、その比の標準偏差である。 Error bars are standard deviations of the ratio. 図14は、図7Bにおいて示された微小流体デバイスにおけるCYP2D6 SNP反応についての平均FAM/PR1/コントロール比を示す棒グラフである。 Figure 14 is a bar graph showing the average FAM / PR1 / Control ratios for CYP2D6 SNP reactions in the microfluidic device shown in FIG. 7B. サンプルは、図13に関して、および実施例3において記載されたものと同じである。 Samples with respect to FIG. 13, and is the same as that described in Example 3. 図15は、実施例4における実験のために使用された微小流体デバイスの概略図である。 Figure 15 is a schematic diagram of a microfluidic device used for the experiments in Example 4. 図16は、Macro PCRおよび図7Bにおいて示された微小流体デバイスにおけるPCR反応由来のPCR産物を含むポリアクリルアミドゲルである。 Figure 16 is a polyacrylamide gel containing PCR products from PCR reactions in a microfluidic device shown in Macro PCR and 7B. 左側の結果は、種々のDNA塩基対長の適切な移動を示す。 Left results show proper migration of various DNA base pairs in length. 散在したバンドを含むレーンは、分子量マーカーである。 Lanes containing interspersed band is a molecular weight marker. 「Macro」と標識されたレーンは異なる希釈度におけるマクロ反応由来のPCR産物である。 Lanes labeled "Macro" is a PCR product derived from the macro reaction at different dilutions. 「In Chip」と標識されたレーンは、チップ内で生成されたPCR産物である。 Lanes labeled "an In Chip" is the PCR products generated in the chip. ゲルの至るところに多くのバンドを含むレーンは、非特異的なバックグラウンドシグナルである。 Lanes containing many bands throughout the gel are nonspecific background signals. 図17a〜図17dは、バルブがオフの状態およびバルブ駆動状態における仕切られた微小流体デバイスの2つの好ましい設計物を示す。 Figure 17a~ Figure 17d shows the valve are two preferred designs of microfluidic devices which are partitioned in the state and the valve drive off. 図18aは、熱サイクリング反応が実施された後の仕切られた微小流体デバイスの画像を示す。 Figure 18a shows an image of a partitioned microfluidic device after thermal cycling reaction was performed. 図18aは、2色の画像を示す。 Figure 18a shows an image of two colors. 図18bは、熱サイクリング反応が実施された後の仕切られた微小流体デバイスの画像を示す。 Figure 18b shows the image of a partitioned microfluidic device after thermal cycling reaction was performed. 図18bは、コントロールの赤色シグナルの減算後に残ったシグナルを示す。 Figure 18b shows the remaining signal after subtraction of the red signal of the control. 図19は、ポジティブウェルの数に対して1ウェルあたりの平均コピー数を比較したグラフを示す。 Figure 19 shows a graph comparing the average number of copies per well for the number of positive wells. 図20は、等温の増幅スキームであるSCORPIONを示す。 Figure 20 shows a SCORPION an amplification scheme isothermal. 図21は、例示的なマトリクス微量流体デバイスの平面図を示す。 Figure 21 shows a plan view of an exemplary matrix microfluidic device. 図22Aは、本発明の実施形態に従う、一体型の蓄圧ウェルを有する微小流体デバイスの基板を示す。 Figure 22A, according to an embodiment of the present invention, showing the substrate of a microfluidic device having a pressure accumulator wells integrated. 図22Bは、図8Aにおいて示され、かつさらにエラストマーブロックを備える微小流体デバイスの分解図である。 Figure 22B is shown in FIG. 8A, and is an exploded view of the microfluidic device further comprises an elastomeric block. 図22Cは、図22Bにおいて示される微小流体デバイスの全体図である。 Figure 22C is an overall view of the microfluidic device shown in FIG. 22B. 図22Dは、図22Bに示される微小流体デバイスの平面図である。 Figure 22D is a plan view of the microfluidic device shown in FIG. 22B. 図22Eは、図22Bに示される微小流体デバイスの断面図を示す。 Figure 22E shows a sectional view of the microfluidic device shown in FIG. 22B. 図23は、本発明の微小流体デバイスのいくつかの実施形態における使用のための孔の断面図である。 Figure 23 is a cross-sectional view of a hole for use in some embodiments of microfluidic devices of the present invention. 図24は、本発明に従う微小流体デバイスを作動させるためのステーションの斜視図である。 Figure 24 is a perspective view of a station for actuating a microfluidic device according to the present invention. 図25は、本発明の実施形態に従う微小流体デバイスの上面に向けて動かされたプラテンの断面図である。 Figure 25 is a cross-sectional view of the platen is moved toward the upper surface of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention. 図26Aは、本発明の実施形態に従うシステムの単純化された全体図である。 Figure 26A is an overall view of a simplified system according to an embodiment of the present invention. 図26Bは、図26Aのシステムにおける受容ステーションの斜視図である。 Figure 26B is a perspective view of a receiving station in the system of FIG. 26A. 図26Cは、本発明の別の実施形態に従うプレートインターフェースまたはプラテン内での流体の経路の後部の平面図である。 Figure 26C is a plan view of the rear part of the path of the fluid at another plate interface or the platen according to the embodiment of the present invention. 図27Aは、本発明の実施形態に従う、キャリアに嵌められたインターフェースプレートを示す側面の断面図である。 Figure 27A according to embodiments of the present invention, is a side sectional view showing a fitted interface plate to the carrier. 図27Bは、本発明の実施形態に従う、キャリアに嵌められたインターフェースプレートを示す側面の断面図である。 Figure 27B, according to an embodiment of the present invention, is a side sectional view showing a fitted interface plate to the carrier. 図28Aは、本発明の実施形態に従う一体型のキャリアの斜視図である。 Figure 28A is a perspective view of an integrated carrier according to an embodiment of the present invention. 図28Bは、PCRと一緒に使用するための本発明の別の実施形態に従う一体型のキャリアの斜視図である。 Figure 28B is a perspective view of an integrated carrier according to another embodiment of the present invention for use with PCR. 図29Aは、図28Aのキャリアを保持するためのシステムの単純化した断面図である。 Figure 29A is a simplified cross-sectional view of a system for holding the carrier of FIG. 28A. 図29Bは、図28Bのキャリアを保持するためのシステムの単純化した断面図である。 Figure 29B is a simplified cross-sectional view of a system for holding the carrier in FIG. 28B. 図29Cは、図28Bのキャリアの一部の単純化した平面図である。 Figure 29C is a plan view simplified for some carriers in FIG 28B. 図29Dは、図29Bのシステムと一緒に使用するための真空チャックの単純化した平面図である。 Figure 29D is a simplified plan view of a vacuum chuck for use with the system of Figure 29B. 図30は、図28Bのシステムと一緒に使用するための真空チャックの単純化した全体図である。 Figure 30 is a simplified overall view of a vacuum chuck for use with the system of Figure 28B.

Claims (11)

  1. 選択された温度または温度範囲において経時的に反応を行う方法であって、該方法は、以下: In selected temperature or temperature range to a method of performing time reaction, the method comprising:
    複数の別個の反応チャンバーを収容するためのアレイデバイスを提供する工程であって、該アレイデバイスは、複数の層から形成されるエラストマーブロックを備え、ここで少なくとも1つの層は、該層の中に形成される少なくとも1つの凹部を有し、該凹部は、該凹部を備える該層と一体型の少なくとも1つの湾曲可能な膜を有し、該アレイデバイスは、熱伝達デバイスをさらに備え、該熱伝達デバイスは、 硬い熱伝導性のプレートであり、該エラストマーブロックに結合され、かつ、熱制御源に接触するように構成されている、工程; The method comprising: providing an array device for containing a plurality of separate reaction chambers, the array device comprising an elastomeric block formed from a plurality of layers, wherein at least one layer in the layer has at least one recess is formed, the concave portion has at least one deflectable membrane of the layer and integral with the recess, the array device further comprises a heat transfer device, the the heat transfer device is a hard heat-conductive plate coupled to the elastomer block, and is configured to contact a thermal control source step;
    熱制御源を含む熱制御デバイスを提供する工程; Providing a thermal control device comprising a thermal control source;
    該アレイデバイスに、所望の反応を実行するための試薬を導入する工程;および Step to the array device, introducing the reagents for performing the desired reaction; and
    伝達デバイスが該熱制御源と熱的に連通するように、該アレイデバイスを該熱制御デバイスと接触させる工程であって、その結果、少なくとも1つの該反応チャンバーにおける該反応の温度が、該熱制御源の温度の変化の結果として変化する、工程、 As the heat transfer device is communicated with the thermal heat control source, the array device comprising the steps of contacting a thermal control device, as a result, the temperature of the reaction in at least one of said reaction chamber, changes as a result of changes in temperature of the heat control source, step,
    を包含し、該熱制御デバイスが、該熱伝達デバイスへ力を加えて熱伝達デバイスを該熱制御源に向けて動かすのに適合している、方法。 Encompasses, heat control devices are added to force the heat transfer device adapted to heat-transfer device to move toward the heat control source, method.
  2. 前記熱伝達デバイスが、 反射性材料を備える、請求項1に記載の方法。 It said heat transfer device comprises a light reflective material, The method of claim 1.
  3. 前記硬い熱伝導性のプレート研磨されたシリコンである、請求項に記載の方法。 Wherein Ru rigid silicon der thermal conductivity of the plate is polished, the method according to claim 2.
  4. 前記力が、磁力、静電気力、または真空を含む、請求項1 、2または3に記載の方法。 It said force is a magnetic force comprises an electrostatic force or a vacuum, The method of claim 1, 2 or 3.
  5. 前記力が、前記熱制御デバイスまたは前記熱伝達デバイスの表面に形成されたチャネルを通して該熱伝達デバイスへ加えられる真空を含む、請求項に記載の方法。 It said force comprises a vacuum applied to the heat transfer device through the thermal control device or the heat transfer surface formed channels of the device, The method of claim 4.
  6. 前記熱制御デバイスの前記表面と前記熱伝達デバイスの表面との間で達成される真空のレベルを検出する工程をさらに包含する、請求項に記載の方法。 The method according to further comprising, claim 5 detecting the level of vacuum achieved between the surface and the heat transfer device of the surface of the thermal control device.
  7. 前記真空のレベルが所定のレベルを超えない場合に、警告が現れるか、または再調整プロトコルが連動し、ここで、該再調整プロトコルが、真空を除去し、かつ、前記アレイデバイスを前記熱制御源に対して再配置することを含む 、請求項に記載の方法。 If the level of the vacuum does not exceed a predetermined level, or warning appears, or in conjunction readjustment protocol, wherein said realignment protocol, removing the vacuum, and the heat control the array device It includes re-positioned relative to the source, method of claim 6.
  8. 前記アレイデバイスを前記熱制御デバイスと接触させる工程は、1つ以上の機械的位置決めデバイスまたは電気機械的位置決めデバイスを用いることによって実行される、請求項1に記載の方法。 Step of the array device is contacted with the thermal control device is executed by using one or more mechanical positioning device or electromechanical positioning device, The method of claim 1.
  9. 前記方法の実行を自動で制御およびモニタリングする工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 Further comprising The method of claim 1 the step of controlling and monitoring automatic execution of the method.
  10. 前記方法の実行を自動で制御およびモニタリングする工程は、前記熱制御デバイスに前記アレイデバイスを導入するため、および該熱制御デバイスから該アレイデバイスを取り外すためのロボットの制御システムに操作可能に連通されている自動制御システムにより実施される、請求項に記載の方法。 Step of controlling and monitoring automatic execution of the method, the order to introduce the array device, and communicates to be operated from the heat control device to the robot control system for removing the array device to the heat control device It is performed by an automatic control system and method according to claim 9.
  11. 前記反応の進行をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 Further comprising monitoring the progress of the reaction, A method according to claim 1.
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