JP5384828B2 - 呼吸器疾患の予防および治療に有用な山豆根抽出物 - Google Patents
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Description
[Chinese Medicine Encyclopedia、Jungdam Publishing、pp.2627-2632、1998]
約1.0cmに刻んだ山豆根250gをよく混ぜた後、2Lの水を加えて攪拌しながら5時間加熱抽出した。濾液を取り集め、残渣に1.5Lの水を加えて3時間加熱抽出した。前記の二つの濾液を混合した後、1.5Lに濃縮した。前記濃縮液に同量の水飽和n−ブチルアルコールを加えて層の分離を3回行った後、n−ブチルアルコール分画のみを集めて58℃で生薬抽出物が乾燥するまで減圧濃縮した。大部分のn−ブチルアルコールと水が蒸発された後、0.1Lの水を加えて3回共沸濃縮し、残渣に同量の蒸留水を加えて懸濁させた後、凍結乾燥し、最終的に粉末の山豆根抽出物を得た。
山豆根抽出物を水で洗浄して乾燥させる。山豆根250gに50%(v/v)エタノール水溶液2Lを加え、攪拌しながら6時間還流抽出した。濾液を取り集めて残渣に30%(v/v)エタノール水溶液1.5Lを加え、3時間加熱抽出した。前記の二つの濾液を混合した後、1.5Lに濃縮した。前記濃縮液に同量の水飽和n−ブチルアルコールを加えて層の分離を3回行った後、n−ブチルアルコール分画のみを集めて58℃で生薬抽出物が乾燥するまで減圧濃縮した。大部分のn−ブチルアルコールと水が蒸発された後、0.2Lの水を加えて3回共沸濃縮し、残渣に同量の蒸留水を加えて懸濁させた後、凍結乾燥し、最終的に粉末の山豆根抽出物を得た。
山豆根抽出物を水で洗浄して乾燥させる。山豆根250gに水飽和ブチルアルコール水溶液2Lを加え、攪拌しながら6時間還流抽出した。濾液を取り集めて残渣に水飽和ブチルアルコール水溶液1.5Lを加え、3時間加熱抽出した。前記の二つの濾液を混合した後、58℃で生薬抽出物が乾燥するまで減圧濃縮した。大部分のn−ブチルアルコールと水が蒸発された後、0.2Lの水を加えて3回共沸濃縮し、残渣に同量の蒸留水を加えて懸濁させた後、凍結乾燥し、最終的に粉末の山豆根抽出物を得た。
前記製造例1〜3により製造された山豆根抽出物の気道収縮抑制効果を評価するために摘出気管支を利用して下記の方法により実験を行い、その結果を下記表1に表した。
Hartely系オスのモルモット(400〜450g、SLC、日本)に抗オボアルブミン抗血清1.5mL/kgを静脈注射して感作させた。感作48時間後にモルモットを放血死させた後、気管を摘出した。Krebs-Heseleit溶液で気管支に付着している他組織を除去した後、軟骨2〜3個が含まれるようにリングの形に切開した。損傷されていない気管支の筋肉を保存しながらリングの軟骨部分を切開し、両側に糸を連結した後、臓器浴槽(organ bath)に懸垂した。安定した後、カルバコール10μg/mLを添加して最大収縮を誘発させた。Krebs-Heseleit溶液で気管支を洗浄して安定化させた。1分後に試験物質であるXを臓器浴槽に入れ、インドメタシン2μmolを添加した。5分内に、オボアルブミン(OVA)10μg/mLを添加して収縮を誘発した。カルバコールとOVAにより誘発された収縮とを比較して気道収縮率を計算した。気道の収縮/弛緩は力変換器(FT4、BioPAC system)と連結された生理活性測定器(MP150、BioPAC system)を利用して測定した。
前記製造例1〜3により製造された山豆根抽出物の気道収縮抑制活性を評価するために感作されたモルモットに抗原を露出させて下記の方法にて実験を行い、その結果を下記表2に表した。
Hartely系オスのモルモット(400〜450g、SLC、日本)に抗オボアルブミン抗血清1.5mL/kgを静脈注射して感作させた。感作48時間後に薬物を経口投与し、30分内にマレイン酸ピリラミン10mg/kg、インドメタシン10mg/kg、およびプロプラノロール0.1mg/kgを各々注射して前処理を行った。その後、モルモットの各種呼吸指数を測定するために足容積測定装置(plethysmometer)が装着されたダブルチャンバー容積脈波計ボックス(Double Chamber Plethysmograph Box、HSE、独)に入れて基本気道抵抗値を測定した。前処理30分後に1%のOVAを高圧下で圧縮空気を利用してエアゾールを作り2分間噴霧した。気管支痙攣の指標として気道抵抗を30分間測定した。
前記製造例1〜3により製造された山豆根抽出物の気道感染抑制活性を評価するために感作されたマウスに抗原を露出させ、肺気管支への好酸球などの白血球の増加反応を利用して下記の方法にて実施し、その結果を下記表3に表した。
BALB/c系メスのマウス(6週、SLC、日本)に10μgのOVAとミョウバン(alum)の混合液0.2mLを0、7および14日に腹腔内に投与して感作させた。最終感作の8日後と10日後に、0.7%OVAを高圧下で圧縮空気を利用してエアゾールを作り、50分間マウスに噴霧して気道感染を誘発させた。気道感染の誘発24時間後に気管支肺胞をリン酸緩衝液1.5mLで洗浄して洗浄液を集め、洗浄液中の白血球の数と好酸球の数を各々数えた。また、肺組織に対するヘマトキシリンとエオシン染色を利用して組織中への白血球浸透、組織の機能的損傷などを観察して点数化した。山豆根抽出物は最終感作の7〜10日後に経口投与した。
前記製造例1〜3により製造された山豆根抽出物の喘息の主要発病作用を行うロイコトリエン生成酵素の抑制効果を評価するために下記の方法にて実験を行い、その結果を下記表4に表した。
ヒトの末梢血単核白血球(PBML)をハンクの平衡塩類溶液(HBSS)にて37℃で安定化させた後、山豆根抽出物を添加して15分間反応させた。ここに基質としてアラキドン酸を添加し、15分間ルイコトリエンB4(LTB4)を生成させた。生成されたLTB4の量は酵素免疫測定法(EIS)キットを利用して測定した。
前記製造例1〜3により製造された山豆根抽出物の喘息の主要発病作用を行うホスホジエステラーゼ4の抑制効果を評価するために下記の方法にて実験を行い、その結果を下記表5に表した。
ヒトのU937細胞を50mMTris−HCLと5mM MgCL2(pH7.5)の混合溶液にて25℃で安定化させた。山豆根抽出物と基質として1.01μMの([3H]cAMP+cAMP)を混合し、20分間反応させてアデノシンを生成した。前記生成されたアデノシンの量を[3H]アデノシンの量を測定することで定量した。
前記製造例1〜3により製造された山豆根抽出物の喘息の主要発病作用を行うLTD4受容体の抑制効果を評価するために下記の方法にて実験を行い、その結果を下記表6に表した。
Duncan Hartely系モルモットの肺組織から分離したLTD4の受容体を50mMTris−HCL緩衝液(5mM CaCaL2、5mM MgCl2、100μg/mLバシトラシン、1mMベンズアミジン、0.1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物)にて25℃で安定化させた後、山豆根抽出物と0.2nM[3H]LTD4を前記混合液に添加して反応させた。放射リガンド結合分析を通して結合率を分析し、非特異的結合は0.1μMLTD4を利用して決定した。特異結合率85%、Kd 0.2nM、Bmax 0.24pmol/mgタンパク質であった。
実験に使用した方法はM.H.Boskabadyなどの方法(Journal of Entnopharmacology97、2005、79-82)を若干変形させたものである。
BALB/c系メスのマウス(6週、SLC、日本)に10μgのOVAとミョウバン(alum)の混合液0.2mLを0、7および14日に腹腔内に投与して感作させた。最終感作の8日後と10日後に、0.7%OVAを高圧下で圧縮空気を利用してエアゾールを作り、50分間噴霧して気道過敏性を誘発させた。気道過敏性の測定は気圧容積脈波計チャンバー(All Medicus、ソウル、韓国)内で実施し、全てのマウスの動きが自由で意識のある状態を維持しながら行われた。気道過敏性の基底値は3分間の測定値の平均を使用し、その後、メタコリンを2.5mg/mLから50mg/mLの濃度まで次第に高めながら各濃度ごとに3分ずつ吸入させた後、各濃度での気道過敏性のレベルを測定した。Enhanced pause(Penh)は気道抵抗の程度を表す優れた指標として知られており、これを算出する公式は下記数学式1の通りである。
Enhanced pause(Penh)= [expiratory time(Te)/relaxation time(RT)-1] X [peak expira
tory flow(PEF)/peak inspiratory flow(PIF)]
無菌処理された8〜10週目のメスのBALB/c系マウスを使用して第1実験日にOVA500μgと水酸化アルミニウム1.0mgを混合して腹腔内に注射することで感作させ(1次)、超音波煙霧器を利用して第11実験日には2%OVAを吸入させ(2次)、第21、22、23実験日には3%OVAを吸入させた(3次)。その後、3日間隔で8週間、1%OVAを吸入させることで、気道リモデリングが誘導された喘息モデルを作った。3次OVA吸入の24時間前の晩に製造例2の抽出物(SOS)を1回投与し、3次OVA吸入日(21、22、23実験日)には吸入1時間前と3次OVA吸入日の晩の1日2回投与した後、気道リモデリングのための8週間のOVA吸入期間には1日2回投与した。また、気道リモデリングの分析法として下記分析法を使用した。
・PAS染色(PAS staining):肺細胞の過形成を測定するための方法
・気管支周囲のトリクロム染色(PeribronchiaL trichrome stain):マッソンのトリクロムを使用して組織を染色した後、気管支周囲の気管支下部の繊維化の程度を見るための染色技法として、全ての気管支は基底膜の長さを基準としてサイズが類似し、円形である10個の気管支を選び平均値を得た。内径が150〜200μmである細気管支を基準に基底膜の厚さをマイクロメーターで表示し、その比率をコンピューター処理画像分析プログラムを利用して測定する。
肺組織の洗浄液内のサイトカイン(IL−4、5および13)の濃度と血清内のOVA−特異性IgEの濃度はELISAキット(サイトカイン:R&D systems、Abingdon、UK/OVA-特異性IgE;BD sciences)を利用して測定した。
6週目の特定病原体未感染(SPF)SD系ラットを使用して反復投与の毒性実験を下記のように実施した。
本発明の山豆根抽出物を利用して下記のような組成で経口投与用錠剤を湿式顆粒法および乾式顆粒法を利用して製造した。
山豆根抽出物250mg、軽質無水ケイ酸10mg、ステアリン酸マグネシウム2mg、微細結晶セルロース50mg、澱粉グリコール酸ナトリウム25mg、トウモロコシ澱粉113mg、無水エタノール適量。
本発明の山豆根抽出物を利用して下記のような組成で軟膏剤を製造した。
山豆根抽出物7g、パルミチン酸セチル20g、セタノール40g、ステアリルアルコール40g、ミリスチン酸イソプロピル80g、モノステアリン酸ソルビタン20g、ポリソルベート60g、パラオキシ安息香酸プロピル1g、パラオキシ安息香酸メチル1g、リン酸および精製水適量。
本発明の山豆根抽出物を利用して下記のような組成で注射剤を製造した。
山豆根抽出物50mg、マンニトール180mg、リン酸水素二ナトリウム25mg、注射用蒸留水2,970mg。
本発明の山豆根抽出物を利用して下記のような組成で局所薬を製造した。
山豆根抽出物0.3g、ポリアクリル酸ナトリウム1.3g、グリセリン3.6g、水酸化アルミニウム0.04g、メチルパラベン0.2g、水14g。
山豆根抽出物0.6g、プロピレングリコール1.6g、流動パラフィン0.8g、ミリスチン酸イソプロピル0.4g、アクリル接着剤1430g、水16.4g。
本発明の山豆根抽出物を利用して下記のような組成でトローチ剤を製造した。
山豆根抽出物1g、白糖50g、ゼラチン3g、グリセリン10g、アカシアガム1g、水適量。
本発明の山豆根抽出物を利用して下記のような組成でシロップ剤を製造した。
山豆根抽出物2g、サッカリン0.8g、糖25.4g、グリセリン8.0g、香味料0.04g、エタノール4.0g、ソルビン酸0.4g、蒸留水適量。
Claims (3)
- 山豆根抽出物を有効成分として含有し、前記山豆根抽出物は単一の中心材料としての山豆根をエタノール水溶液又はブチルアルコール水溶液で抽出した後、水飽和n−ブチルアルコールにより精製したことを特徴とする、呼吸器疾患の予防および治療用薬剤。
- 前記呼吸器疾患は喘息、急性または慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎、急性上気道感染症および急性下気道感染症の中から選択されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
- 前記呼吸器疾患は気道収縮、気道感染、5−リポキシゲナーゼ、ホスホジエステラーゼ4、気道過敏性または気道リモデリング、ロイコトリエンD4、および鎮咳効果により発病されることを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
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