JP5294041B2 - Pancreatic cell regeneration transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes - Google Patents

Pancreatic cell regeneration transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes

Info

Publication number
JP5294041B2
JP5294041B2 JP2010518081A JP2010518081A JP5294041B2 JP 5294041 B2 JP5294041 B2 JP 5294041B2 JP 2010518081 A JP2010518081 A JP 2010518081A JP 2010518081 A JP2010518081 A JP 2010518081A JP 5294041 B2 JP5294041 B2 JP 5294041B2
Authority
JP
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
kit
pancreatic
cell
disclosed
regeneration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2010518081A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2009157559A1 (en )
Inventor
知子 桑原
誠 浅島
Original Assignee
独立行政法人産業技術総合研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37Digestive system
    • A61K35/39Pancreas; Islets of Langerhans
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body

Abstract

Disclosed is a pancreatic cell regeneration/transplantation kit for the regenerative therapy for various pancreatic diseases including diabetes, which comprises an adult neural stem cell and optionally a neuronal differentiation inducer.  Also disclosed is a pancreas regeneration therapy method using the transplantation kit.

Description

本発明は、成体神経幹細胞を用いた膵臓細胞再生移植用キットに関する。 The present invention relates to a pancreatic cell regeneration transplantation kit using adult neural stem cells.

骨髄幹細胞や間葉系幹細胞の移植は、既に臨床応用が始められているが、その標準化、単一化において非常に厳密な制御が必要となる。 Transplantation of bone marrow stem cells or mesenchymal stem cells are already clinical application is started, its standardization, it is necessary to very strict control in unification. 我々「成体」の各臓器には、臓器に必要な細胞群を産み出す源となる幹細胞が存在している。 Each organ of our "adult" stem cells, which is a source of procreation cell group necessary to organs are present. ただ、胎生幹細胞やES細胞の研究に比べ、「成体」の幹細胞の研究自体の歴史はまだ浅く、各臓器の「成体幹細胞」の確立もしっかり統一されていない。 However, compared to the study of embryonic stem cells and ES cells, the study of history itself of the stem cells of the "adult" is still shallow, not been established firmly unification of "adult stem cells" of each organ. また、分化を左右する遺伝子の調節機構の違いについて、胎生幹細胞と詳細に比較解析されている例も少ない。 Further, the difference between adjustment mechanism influences the differentiation gene, fewer examples are comparative analysis and detail embryonic stem cells. 今後、成体組織幹細胞の再生医療への利用開発を促すためには、その分子機構の基礎研究がさらに発展する必要がある。 In the future, in order to encourage the use and development of regenerative medicine of adult tissue stem cells, it is necessary that the basic research of the molecular mechanism further development.
ここで、既に国際的、学術的にも確立された成体幹細胞として、脳の神経幹細胞があげられる。 Here, already international, as adult stem cells, which are also established in the academic, brain of neural stem cells, and the like. ヒトからマウス等、下等動物に至るまで、「成体」神経幹細胞の存在が国際学術誌に多数報告されている(例えば、非特許文献1など)。 Mice from human or the like, up to the lower animals, the presence of "adult" neural stem cells have been reported in international journals (e.g., Non-Patent Document 1). 成体脳内での神経新生は従来不可能だと考えられていたが、成体の脳内にも日々分裂を繰り返し、神経新生を繰り返している神経幹細胞が存在する領域が保持されていることが分かった。 Although neurogenesis in the adult brain was thought previously impossible, it found that repeated daily divisions in the brain of the adult, is the region where the neural stem cells exist that repeatedly neurogenesis is held It was. 最近の研究から、胎生神経幹細胞と成体神経幹細胞からの分化制御機構で、細胞外シグナル分泌には幾らか相同性があるが、そのシグナルに応答して細胞内で発現し、実際に分化開始を誘導する上で、中心となる遺伝子の発現制御機構が違うという重要な事実が、徐々に明らかになってきた。 Recent studies in the differentiation control mechanism from embryonic neural stem cells and adult neural stem cells, there is some homology to extracellular signals secretion, in response to the signal expressed intracellularly, the actual start of differentiation in inducing, expression control mechanism of the gene of the center is an important fact that different, has become gradually clear.
成体の神経幹細胞の存在が1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。 Since it was revealed the existence of adult neural stem cells for the first time in the 1990s, to elucidate the mechanism of adult neural stem cells undergoing neurogenesis in the brain, drug discovery and regenerative medicine, is research to help in the treatment of brain diseases actively It is carried out today. 神経幹細胞からは、成熟神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞の3種が分化して形成される。 From the neural stem cells, mature nerve cells, oligodendrocytes cells, three kinds of astrocytes cells are formed by differentiation.
この分化能力を備えた神経幹細胞は胎生期にも存在する。 Neural stem cells with the differentiation ability are also present in fetal. この胎生神経幹細胞から神経新生を起こす代表転写遺伝子例はNeurogeninという遺伝子である。 Representative transcription gene example causing the neurogenesis from the embryonic neural stem cells is a gene that Neurogenin. 一方、成体の「神経新生」を起こす代表転写遺伝子はNeuroD1/beta2であり、この遺伝子が無いと、成体の脳内で神経新生を起こす領域のみが限定して欠損する。 On the other hand, representative transcription gene that cause "neurogenesis" in the adult is NeuroD1 / beta2, when this gene is not present, the only area that causes neurogenesis in the adult brain is lost is limited.
さらに、成熟神経細胞まで分化全過程に必要な、神経特異的遺伝子群の発現を「活性化」調節する転写因子が、成体脳ではNRSF/REST転写遺伝子なのだが、胎生期では神経細胞以外に発現されることにより、「活性化」ではなく「抑制」している。 Furthermore, matured to neurons necessary for differentiation whole process, a transcription factor that regulates "activation" expression of neural specific genes are, but I of NRSF / REST transfer genes in the adult brain, expression in addition to neurons in the embryonic by being, and "suppressed" rather than "activation". 発現される転写因子の種類や時期、遺伝子の発現調節機構自体も全く違うため、「成体期」と「胎生期」の幹細胞・分化制御は明確に区別できる。 The type and timing of the expressed transcription factor, completely different because even expression control mechanism itself of genes, the "adulthood" stem cell differentiation control of the "embryonic" is clearly distinguishable.
安全な再生医療を考えた場合、増殖性の極端に高い胎生期から樹立された細胞(胎生幹細胞)やES細胞を用いるより、「成体」から樹立された「成体組織幹細胞」は、標的となる各臓器部位で、制御分子機構や細胞応答性がより生体環境に馴染んだ幹細胞であるため、ガン化などのリスクファクターが少ない利点があり、とりわけ「成体」由来の「自己幹細胞」を用いた方が、患者に負担も低く免疫拒絶性も無い、自然で効果的な医療が行えると考えられる。 When considering safe regenerative medicine, than using proliferative extremely high established from embryonic cells (embryonic stem cells) and ES cells established from "adult", "adult tissue stem cells", a target in each organ site, control the molecular mechanisms and cell responsiveness is a stem cell that familiar with the more biological environment, there are a few advantages risk factors, such as cancer of, especially those who used the "adult" from "self stem cells" but, no it is also low immune rejection of the burden to the patient, is considered to be performed is natural and effective medical care.
現在までに、神経幹細胞以外にも種々の組織由来の組織幹細胞である、血液幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、心筋幹細胞、骨格筋幹細胞なども、既に国際的、学術的にも確立された成体幹細胞として報告されている。 To date, in addition to neural stem cells that are tissue stem cells derived from a variety of tissues, blood stem cells, neural stem cells, liver stem cells, cardiac stem cells, also, such as skeletal muscle stem cells, already international, scientifically established even adult stem cells It has been reported as.

しかしながら、膵臓幹細胞については、糖尿病患者など、インシュリン産生膵臓細胞に分化し得る膵臓幹細胞への臨床的期待が大きいにもかかわらず、確立した樹立細胞としては胎児性(ES)幹細胞のみである。 However, for pancreatic stem cells, such as diabetics, despite clinical expectations of pancreatic stem cells capable of differentiating into insulin-producing pancreatic cells is high, as the established cells established only embryonic (ES) stem cells. 唾液腺由来の成体幹細胞の報告はある(非特許文献2)ものの、当該報告中では、多能性を有していることの確認実験はなく、樹立細胞としての要件も不十分である。 Although there are reports of adult stem cells derived from the salivary gland (Non-Patent Document 2), during the reporting is not confirmed experiments to have pluripotency, is insufficient even requirements as established cell. また、膵臓幹細胞のβ細胞等への分化誘導法としても、ES細胞から誘導分化させる手法(非特許文献3)に準じて行われていたが、分化能が限られたり、増殖能の違いから生じるガン化などの欠点があった。 Further, even if the differentiation inducing method into β cells such as pancreatic stem cells, which had been performed in accordance with the method (Non-Patent Document 3) to induce differentiation from ES cells, or a limited differentiation potential, the difference in growth ability there is a problem such as cancer that could occur.
そこで、膵臓組織における再生医療においては、患者への負担も低く免疫拒絶性も無い「自己幹細胞」も視野に入れた、膵臓への移植が可能であり、かつ各種膵臓細胞へ分化可能な成体幹細胞の安定的な提供が強く望まれていた。 Therefore, in the regenerative medicine in pancreatic tissue, the burden on the patient is also low immune rejection resistance even without "autologous stem cells" was also put into the field of view, it can be ported to the pancreas, and can differentiate adult stem cells into various types of pancreatic cells stable provision of has been strongly desired.

本発明の課題は、膵臓組織へ移植可能であり、かつ所望の膵臓細胞への分化が容易な成体幹細胞を提供することであり、当該成体幹細胞を用いた膵臓組織の再生治療方法を提供することである。 An object of the present invention can be implanted into the pancreas tissue, and is that the differentiation of the desired pancreatic cells provide easy adult stem cells, to provide a reproducing method of treating pancreatic tissue using the adult stem cells it is.

本発明者らは、脳内での学習機能に必要なインシュリン産生能を有する神経細胞と、膵臓内で血糖値低下に必要なインシュリン産生能を有する膵臓細胞との間の性質の共通性に着目し、胎生期の発生段階では前者は外胚葉系、後者は内胚葉系という遠い隔たりのある細胞ではあるが、成体幹細胞としての制御機構などにおいて類似している可能性があるとの考えにそって鋭意研究の結果、神経幹細胞で用いられる樹立方法を基本とした膵臓幹細胞の樹立方法を成功させ、はじめて確実な成体組織幹細胞としての要件を備え、糖尿病など各種膵臓細胞の移植治療用に用いることのできる膵臓幹細胞についての発明を完成させた。 The present inventors have focused on the common nature between the nerve cells with insulin production ability required for learning in the brain, and pancreas cells with insulin production ability required drop the blood glucose level in pancreas and, embryonic former ectodermal a developmental stage, the latter is a cell with a far distance as endodermal but along the idea that there is a possibility that are similar in a control mechanism of the adult stem cells result of intensive studies Te, the establishment method used in neural stem cells were successfully established method of basic pancreatic stem cells, provided the requirements as first reliable adult tissue stem cells, be used for transplantation therapy of various pancreatic cells such as diabetes and it completed the invention for pancreatic stem cells that can.
また、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させる際にも、神経幹細胞から各種神経系細胞へ分化させるための方法が転化応用できること、つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を使用すればよいことを見出し、膵臓幹細胞の各種膵臓細胞への効率的な分化方法も確立することができた。 Moreover, in this way the adult pancreatic stem cells established by, alpha cells, beta cells, [delta] cells, even when to differentiate into γ respectively cells, the method for differentiating the neural stem cells into various neural cells can be converted applications, in other words, the method of β is neuronal differentiation in cell differentiation, the method differentiation into astrocytes in the differentiation of α cells, neural differentiation conditions for differentiation δ cells to produce inhibitory interneurons, the γ cell differentiation oligo found that may be used to condition the glial cell differentiation inducing oligodendrocyte cells, efficient differentiation method to various pancreatic cells of pancreatic stem cells could also be established. なお、これらの点については、本願と同日付で出願している。 Note that these points have been filed in this application the same day.
本発明者らは、さらに、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞と、同時に樹立・培養した成体神経幹細胞とについて、分子基盤の詳細な比較解析を行い、両者の分化制御因子群に非常に高い類似性・相補性があることを明らかにした。 The present inventors have further such a adult pancreatic stem cells established in the, for the adult neural stem cells established, cultured simultaneously performs detailed comparative analysis of the molecular basis, very high for both the differentiation regulators group It revealed that there is a similarity-complementarity.
本発明者らは、このように、神経幹細胞と膵臓幹細胞とが、樹立、培養工程のみならず、分化工程においてもきわめて類似した挙動を示すという知見を踏まえ、膵臓幹細胞を神経組織に移植した場合も、神経細胞分化誘導剤又はグリア細胞分化誘導剤を併用することで、神経系細胞又はグリア細胞に分化し、神経幹細胞を膵臓組織に移植した場合は、反対にβ細胞等の各膵臓細胞に分化するという仮説を立て、トランスジェニックマウスを用いた実験系で当仮説を立証した。 The present inventors have found that this way, where the neural stem cells and pancreatic stem cells, establishment, not culturing step but also light of the finding that shows a very similar behavior in the differentiation process, were transplanted pancreatic stem cells to neural tissue also, by a combination of nerve cell differentiation inducer or glial cell differentiation inducer, and differentiate into neural cells or glial cells, neural stem cells when transplanted pancreatic tissue, each pancreatic cells such as β cells in the opposite we hypothesized that differentiation was demonstrated those hypotheses experimental system using the transgenic mice.
以上の知見をもとに、本発明者らは、成体神経幹細胞を用いた、糖尿病など各種膵臓疾患の再生治療のための再生移植用キットなど、膵臓組織への再生移植医療についての本発明を完成させた。 Based on the above findings, the present inventors used adult neural stem cells, such as regenerative medicine reproducing transplantation kit for various pancreatic diseases such as diabetes, the present invention for reproducing transplantation medicine into pancreatic tissue It was completed. なお、同時に成体膵臓幹細胞を用いた糖尿病用の再生移植医療及び神経細胞系疾患用の再生移植医療についての発明も完成し、本願と同日付で別出願をしている(特願2008-168222号)。 Incidentally, at the same time the invention for regeneration medical transplantation for regeneration graft and neuronal system disorders for diabetes using adult pancreatic stem cells also completed, and a different application in this application and the date (Japanese Patent Application No. 2008-168222 ).

すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。 That is, the present invention includes the following inventions.
〔1〕成体神経幹細胞を含むことを特徴とする、膵臓疾患又は糖尿病のための膵臓細胞再生移植用キット。 (1), characterized in that it comprises an adult neural stem cells, pancreatic cells play transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes.
〔2〕さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔1〕に記載の膵臓細胞再生移植用キット。 Characterized in that it comprises a [2] Further neuronal cell differentiation inducer, pancreatic cell regeneration transplantation kit according to the above [1].
〔3〕さらにアストロサイト細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔1〕又は〔2〕に記載の膵臓細胞再生移植用キット。 [3] further comprising a astrocyte cell differentiation inducing agent, pancreatic cell regeneration transplantation kit according to the above [1] or [2].
〔4〕生体適合性シート表面に配置した成体神経幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。 [4] and adult neural stem cells were placed in a biocompatible sheet surface, RA, RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, GSK3β inhibitors, lithium salt, VPA, at least one selected from 5AzaC and β-catenin characterized in that it comprises a neuronal differentiation-inducing agent, pancreatic cell regeneration transplantation kit.
〔5〕前記成体神経幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤の存在下で培養され、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔4〕に記載の膵臓細胞再生移植用キット。 [5] the adult neural stem cells, on the advance the biocompatible sheet surface, RA, RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, GSK3β inhibitors, lithium salt, VPA, at least selected from 5AzaC and β-catenin cultured in the presence of one nerve cell differentiation inducing agent, characterized in that it is a cell of a state which had been differentiated to the β precursor cells, pancreatic cells play transplantation kit according to the above [4].
〔6〕生体適合性シート表面に配置した成体神経幹細胞を、膵臓患部に導入することを特徴とする、膵臓再生治療方法。 [6] the adult neural stem cells were placed in a biocompatible sheet surface, and introducing the pancreas affected area, pancreas regeneration treatment method.
〔7〕前記成体神経幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤の存在下で培養され、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔6〕に記載の膵臓再生治療方法。 [7] the adult neural stem cells, on the advance the biocompatible sheet surface, RA, RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, GSK3β inhibitors, lithium salt, VPA, at least selected from 5AzaC and β-catenin cultured in the presence of one nerve cell differentiation inducing agent, characterized in that it is a cell of a state which had been differentiated to the β precursor cells, pancreatic regeneration treatment method according to the above [6].
〔8〕生体適合性シート表面に配置した成体神経幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを有効成分として含むことを特徴とする、糖尿病用再生治療用組成物。 [8] and adult neural stem cells were placed in a biocompatible sheet surface, RA, RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, GSK3β inhibitors, lithium salt, VPA, at least one selected from 5AzaC and β-catenin characterized in that it comprises a neuronal differentiation-inducing agent as an active ingredient, diabetes reproducing therapeutic compositions.
〔9〕前記成体神経幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤の存在下で培養され、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔8〕に記載の、糖尿病用再生治療用組成物。 [9] the adult neural stem cells, on the advance the biocompatible sheet surface, RA, RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, GSK3β inhibitors, lithium salt, VPA, at least selected from 5AzaC and β-catenin cultured in the presence of one nerve cell differentiation inducing agent, beta characterized in that it is a state of the cell that has been differentiated to a progenitor cell, according to the above [8], play a therapeutic composition for diabetes Stuff.

本発明により、既に樹立方法、培養方法、分化方法が確立している成体神経幹細胞を、糖尿病用治療用キットなどとして、膵臓組織への再生移植医療に転用することができるので、糖尿病などの重篤な膵臓病疾患を患っている患者にとっての福音となる。 The present invention, the manner already established, a culturing method, the adult neural stem cells differentiation process has been established, as such antidiabetic treatment kit, it is possible to divert the reproduction medical transplantation into pancreatic tissue, such as diabetes Weight the gospel for patients suffering from Atsushi pancreatic disease disease.

Sox2-EGFPを導入したトランスジェニックマウスの成体の膵臓(島)と脳(海馬)。 Transgenic mice of the adult pancreas that was introduced Sox2-EGFP (island) and the brain (hippocampus). 上段:両臓器とも、インシュリンを産生している細胞(赤/点線で囲った箇所)に接して、未分化のSox2陽性細胞(緑/GFP発現陽性)、すなわち成体幹細胞が存在している。 Top: Both organs, in contact insulin cells producing (portion enclosed by a red / dashed lines), Sox2-positive cells (green / GFP expression positive) undifferentiated, namely adult stem cells are present. 下段:分化したβ細胞と神経細胞は共に、インシュリンを産生し、かつ神経細胞に分化したことを示すNRSF/REST転写因子陽性である共通点を持つ(左では、核内でNRSF/REST転写因子が発現し、その周りの細胞質内でインシュリンが発現している様子がわかる。) Lower: beta cells and differentiated neural cells both insulin and produce, and have a common point which is NRSF / REST transcription factor-positive indicating that differentiated into neurons (in the left, NRSF / REST transcription factors in the nucleus There was expressed, it can be seen that insulin is expressed in the cytoplasm around it.) 神経幹細胞からの分化と膵臓幹細胞からの分化制御機構の相関図。 Correlation diagram of the differentiation control mechanism from the differentiation and pancreatic stem cells from neural stem cells. 神経幹細胞、膵臓幹細胞から抽出したRNAを用いたRT-PCR解析。 RT-PCR analysis using neural stem cells, RNA extracted from pancreatic stem cells. P;未分化状態、N;神経分化誘導条件、A;グリア分化誘導条件。 P; undifferentiated state, N; neuronal differentiation-inducing conditions, A; glial differentiation-inducing conditions. 神経系、膵臓内分泌系の全ての分化経路マーカー遺伝子が同じ分化条件下[神経=β細胞、δ細胞、グリア(アストロサイト、オリゴデンドロサイト)細胞=α細胞、γ細胞]で検出された。 Nervous system, all differentiation pathway marker genes pancreatic endocrine system is detected under the same differentiation conditions [neural = beta cells, [delta] cells, glia (astrocytes, oligodendrocytes) cells = alpha cells, gamma cells. 膵臓のδ細胞(ソマトスタチン)、γ細胞(Pancreatic polypeptide)の分布と脳内での分布。 Pancreatic δ cells (somatostatin), gamma cells (Pancreatic Polypeptide) of distribution and the distribution in the brain. 同じ抗体を用いた免疫組織染色。 Immunohistochemical staining using the same antibody. 分化誘導後の膵臓幹細胞。 Pancreatic stem cells after induction of differentiation. 未分化状態(FGF2存在下)から、神経分化条件(上矢印)とグリア・アストロサイト分化条件(下矢印)下で、膵臓内分泌系の各種マーカーが出現した。 From undifferentiated state (FGF2 presence), neuronal differentiation conditions (upper arrow) Greer astrocyte differentiation conditions (down arrow) under various markers of pancreatic endocrine system has emerged. β細胞(インシュリン、C-peptide)、α細胞(グルカゴン)、δ細胞(ソマトスタチン)、γ細胞(Pancreatic polypeptide)。 β cells (insulin, C-peptide), α cells (glucagon), [delta] cells (somatostatin), gamma cells (Pancreatic Polypeptide). 神経細胞特異的なマーカーTUJ1はインシュリンを産生する膵臓β細胞でも染色される。 Neuron-specific marker TUJ1 are stained in the pancreatic β cells which produce insulin. 同様に、膵臓β細胞もTUJ1で染色される。 Similarly, pancreatic β cells are also stained with TUJ1. TUJ1陽性細胞はともに、NRSF/REST転写因子陽性でもある。 TUJ1 positive cells together, it is also a NRSF / REST transcription factor-positive. 脳内で神経新生のマーカーであるNeuroD1遺伝子は、膵臓β細胞でも同様に発現しており、染色される。 NeuroD1 genetic markers of neurogenesis in the brain is similarly expressed in pancreatic β cells, it is stained. 出生日の膵臓と脳。 Pancreas and brain of the date of birth. 盛んに新生している細胞群はともに、NeuroD1陽性。 Group of cells that are actively Shinsei together, NeuroD1 positive. 成体膵臓内で分裂している新生細胞(BrDU陽性)はNeuroD1陽性。 Neoplastic cells that are dividing in the adult pancreas (BrDU positive) is NeuroD1 positive. 各種神経分化促進薬剤の投与で、インシュリンプロモーター活性が上昇。 Administration of various neuronal differentiation promoting agent, increase insulin promoter activity. レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子をインシュリンプロモーターの下流に連結したアッセイ系で解析した。 The luciferase gene was analyzed in the assay system that is connected downstream of the insulin promoter as a reporter. 膵臓幹細胞の分化。 Differentiation of pancreatic stem cells. 未分化状態(FGF2存在下)から、神経分化条件(上矢印)とグリア・アストロサイト分化条件(下矢印)下で、膵臓内分泌系の各種マーカーが出現した。 From undifferentiated state (FGF2 presence), neuronal differentiation conditions (upper arrow) Greer astrocyte differentiation conditions (down arrow) under various markers of pancreatic endocrine system has emerged. 分化マーカーとして、β細胞(インシュリン、C-peptide)、α細胞(グルカゴン)、δ細胞(ソマトスタチン)、γ細胞(Pancreatic polypeptide)を用いたところ、神経細胞分化条件では、インシュリン、C-peptideが及びソマトスタチンの発現が確認され、グリア・アストロサイト分化条件下ではPP及びグルカゴンの発現を観察した。 As a differentiation marker, beta cells (insulin, C-peptide), alpha cells (glucagon), [delta] cells (somatostatin), was used γ cells (Pancreatic Polypeptide), the neuronal differentiation conditions, insulin and C-peptide Oyobi expression of somatostatin is confirmed, in Greer astrocytes differentiated conditions expression was observed for PP and glucagon. Wnt3を産出するα細胞。 α cells that produce Wnt3. 脳内でWnt3を産生し、神経新生を促進するアストロサイト細胞(GFAP陽性)と同じ機能をもつ。 Produce Wnt3 in the brain, with the same function as astrocytes (GFAP positive) to promote neurogenesis. α細胞はWnt3を産生することによって、β細胞新生を促進している(以下の図より)。 α cells by producing Wnt3, promotes the β cell neogenesis (from below in FIG.). 膵臓幹細胞をβ細胞新生状態(神経誘導条件下;N)に誘導すると、Wntシグナリングの重要タンパク質であるβカテニンが安定化され蓄積する。 Pancreatic stem cells β cell neogenesis state (neural induction conditions; N) to induce in an important protein β-catenin Wnt signaling is stabilized accumulation. P;未分化状態、A;アストロサイト誘導条件下。 P; undifferentiated state, A; astrocyte-inducing conditions. Wnt/βcateninシグナリングの活性化(試薬)でインシュリン遺伝子の発現が上昇し(Wnt3,GSK3beta-inhibitor)、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化(DnWnt;ドミナントネガティブWnt,βcatenin shRNA)ではインシュリン遺伝子の発現が起きない。 Insulin gene expression in Wnt / βcatenin activation of signaling (reagent) rises (Wnt3, GSK3beta-inhibitor), in contrast to Wnt / βcatenin inactivation of signaling (DnWnt; dominant negative Wnt, βcatenin shRNA) in insulin gene expression does not occur. NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)がWnt3で誘導される(左)。 TCF / LEF activation of transcription factor binding sites of chromatin on promoter NeuroD1 (Anti-Acetyl HistoneH3) is induced by Wnt3 (left). Wnt3によって活性化されたNeuroD1は、インシュリン遺伝子の活性化を起こす。 NeuroD1 activated by Wnt3 may cause activation of the insulin gene. インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位(E-box)へNeuroD1が直接結合し、クロマチンの活性化(Anti-Acetyl HistoneH3を誘導する)を導くことを示している(右)。 NeuroD1 recognition binding site on the promoter of the insulin gene into the (E-box) bonded directly NeuroD1, shows that the leading activation chromatin (induces Anti-Acetyl HistoneH3) (right). 神経幹細胞の膵臓への移植。 Transplantation into the pancreas of neural stem cells. Fisher344ラットへのマイクロインジェクションの結果。 Fisher344 microinjection of the results of the rat. 膵臓へ移植された神経幹細胞(緑、蛍光GFP発現)が、インシュリン陽性(赤、上、中段)であることを示している。 Neural stem cells (green, fluorescent GFP expression) that have been ported to the pancreas, insulin-positive (red, top, middle) shows that it is. また、新規のインシュリン産生を示すC-peptide抗体でも陽性(下段)。 Further, also positive in C-peptide antibodies with novel insulin production (bottom). 神経幹細胞の膵臓への移植。 Transplantation into the pancreas of neural stem cells. コラーゲンシート上で培養された神経幹細胞およびニューロブラスト。 Neural stem cells and neuro blast cultured on collagen sheet. インシュリンプロモーター活性が神経分化誘導条件下で上昇することが、コラーゲンシート上でも確認された That the insulin promoter activity is increased in neuronal differentiation-inducing conditions, it was also confirmed on the collagen sheet 神経幹細胞の膵臓への移植。 Transplantation into the pancreas of neural stem cells. 糖尿病ラットへの移植。 Transplantation into diabetic rats. 尾静脈から採血された血液を用いて、グルコメーター/グルコカード(簡易血糖値検査機)で測定した血糖値の変遷を記録したグラフ。 Using collected blood from the tail vein, the graph which records the evolution of the blood glucose values ​​measured by glucometer / Glucocard (blood sugar value inspection machine). ◇;健康体ラット、○;糖尿病ラット(GKラット)に整理食塩水をインジェクションしたコントロール。 ◇; healthy rats, ○; diabetic rats control was injected with physiological saline to (GK rats). ●;糖尿病ラットにコラーゲンシートのみを移植したコントロール。 ●; controls that were implanted with collagen sheet only in diabetic rats. □;糖尿病ラットに神経幹細胞をマイクロインジェクションしたグループ。 □; group that the neural stem cells were micro-injected into diabetic rats. ■;糖尿病ラットにニューロブラストをマイクロインジェクションしたグループ。 ■; group the neuro blast in diabetic rats was microinjection. △;糖尿病ラットに、コラーゲンシート上の神経幹細胞を移植したグループ。 △; to diabetic rats, the group were transplanted neural stem cells on collagen sheet. ▲;糖尿病ラットに、コラーゲンシート上のニューロブラストを移植したグループ。 ▲; to diabetic rats, the group implanted with neuro blast on the collagen sheet. (参考図1) 樹立した膵臓幹細胞の写真。 Photos of (reference Figure 1) established pancreatic stem cells. 1段目左は、樹立時の培地として、10%FCSを、1段目右及び2段目は、FGF/EGFを、3段目はFCSを用いた場合を示す。 First stage left, as medium at the establishment, the 10% FCS, 1-stage right and the second stage, the FGF / EGF, 3 row shows the case of using the FCS. 最下段は、一定期間培養後、継代した細胞(P1)をFGF2のみで培養した場合、未分化性と増殖能を保持している。 Bottom row, after a certain period of time the culture, when the passaged cells (P1) were cultured only in FGF2, retains the ability to grow and undifferentiated. (参考図2)膵臓幹細胞の脳神経系への移植。 Porting to (reference Figure 2) cranial nerve system of pancreatic stem cells. 実験概要。 Experimental Overview. 成体膵臓幹細胞(GFP陽性)をラット脳(海馬の顆粒細胞層)にインジェクションする。 Adult pancreatic stem cells (GFP positive) is injected into rat brain (granule cell layer of the hippocampus). (参考図2)膵臓幹細胞の脳神経系への移植。 Porting to (reference Figure 2) cranial nerve system of pancreatic stem cells. 脳内へ移植された膵臓幹細胞(緑、蛍光GFP発現)が、神経幹細胞の分化に同調して分化していく様子がインジェクション箇所からの位置変化として観察できる。 Pancreatic stem cells (green fluorescence GFP expression), which is transplanted into the brain, how to continue to differentiate tuned to the differentiation of neural stem cells can be observed as a change in position of the injection point. 上段は、インジェクション付近の海馬の顆粒細胞層で、神経前駆細胞であることを示す遺伝子マーカー、NeuroD1(赤)を発現する細胞と一致し、中段の神経細胞初期マーカーであるTUJ1(マゼンタ)の発現細胞と一致する。 Upper row, in the granule cell layer of the hippocampus near the injection, genetic markers indicative of a neural progenitor cells, consistent with a cell expressing NeuroD1 (red), a middle neuronal early marker expression TUJ1 (magenta) to match the cell. また下段では成熟神経細胞マーカーであるNeuN陽性(赤)細胞とも一致したことを示している。 In the lower part it is indicated that the match NeuN-positive (red) cells are mature nerve cell marker. コラーゲンシート上の神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット(GKラット)の膵臓に移植し、インシュリン産生β細胞に分化したこと、及びそのことによるモデルラットの血糖値が低下したことを確認した。 The neural stem cells on collagen sheet was implanted into the pancreas of type II diabetic model rats (GK rats), that were differentiated into insulin-producing β cells, and the blood glucose level of rats, it was confirmed that the reduction due to that.

1. 1. 成体神経幹細胞と成体膵臓幹細胞について 成体幹細胞の中で、神経幹細胞は国際的、学術的にも確立されている。 In adult neural stem cells and adult pancreatic stem cells in the adult stem cells for neural stem cells have been established internationally, even in academic. 1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。 The 1990s to the beginning and later been revealed, to elucidate the mechanism of adult neural stem cells undergoing neurogenesis in the brain, drug discovery and regenerative medicine, research to help in the treatment of brain diseases is being carried out by actively today.
本発明者らは、内分泌器官である「成体」の膵臓にも、成体神経幹細胞と同じ未分化マーカー遺伝子(Sox2)を発現する膵臓幹細胞が存在することを明らかにさせた(図1)。 The present inventors have also pancreas is an endocrine organ "adult", pancreatic stem cells that express the same undifferentiated marker genes (Sox2) and adult neural stem cells were revealed to be present (Fig. 1). Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子である。 Sox2 gene is a transcription factor that holds a very high undifferentiated expressed in ES cells. トランスジェニックマウスを用いた動物個体の脳と膵臓で、その発現を確認した(Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結した遺伝子改変マウス内で、Sox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発する)。 In brain and pancreas of animal with transgenic mice it was confirmed that expression (in genetically modified mice connecting EGFP is a reporter gene Sox2 promoter, cells expressing Sox2 gene fluoresce) . 重要なこととして、両臓器の神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることである(図1、上図、赤がインシュリン抗体陽性、緑がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞)。 Importantly, is that both organs of neuronal cells and, where β cells are expressing both insulin (Figure 1, top view, adult stem cells red insulin antibody positive, green expressing Sox2 gene) . 神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており(マゼンタ)、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン(緑)を発現していることが分かる(図1、下段)。 Nerve cells and β cells and express the transcription factor of NRSF / REST in the adult (magenta), it can be seen that the cells of the NRSF / REST expression positive expressing insulin (green) (Figure 1, bottom) .
「成体幹細胞」を樹立したことは、得られた成体幹細胞が多能性を有していることを、「sox-2マーカー」によって確認することができる。 It was established "adult stem cells", that obtained adult stem cells have pluripotency can be confirmed by "sox-2 marker". ここで、「sox-2マーカー」とは、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結したものであり、遺伝子改変マウス内でSox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発することで確認できる(非特許文献7)。 Here, "sox-2 marker" is obtained by connecting the EGFP is a reporter gene Sox2 promoter, cells expressing Sox2 genes in genetically modified mice can be confirmed by fluoresce (non Patent Document 7). Sox2遺伝子は、典型的な多能性を有する未分化細胞であるES細胞でも発現している遺伝子であり、未分化状態を示す幹細胞特異的な遺伝子であるとされ、当該遺伝子の発現は、成体組織幹細胞が樹立されたことを示す最もよい指標となる。 Sox2 genes are genes that are expressed in ES cells are undifferentiated cells with a typical pluripotency is to be stem cell-specific genes exhibiting undifferentiated state, expression of the gene, the adult the best indicator that tissue stem cells have been established. 本発明の実施例でも、成体神経幹細胞の樹立は、Sox2遺伝子を発現していることで確認している(図1)。 Also in the embodiment of the present invention, establishment of adult neural stem cells is confirmed by expressing Sox2 gene (Figure 1). Sox2遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトSox2遺伝子は、NM_003106(Gene Bankアクセッションナンバー)、マウスSox2遺伝子はNM_011443(Gene Bankアクセッションナンバー)である。 Sox2 gene sequence is available from known database, such as human Sox2 gene, NM_003106 (Gene Bank accession number), mouse Sox2 gene is NM_011443 (Gene Bank accession number). また、Sox2遺伝子発現は、抗Sox2抗体によっても簡単に確認することができ、抗Sox2抗体はすでに市販されているものを用いることができる(例えば、Chemicon社製)。 Further, Sox2 gene expression can also be confirmed easily by anti Sox2 antibody, anti-Sox2 antibody already can be used those commercially available (e.g., manufactured by Chemicon Co., Ltd.).

2. 2. 神経幹細胞の樹立法及び培養法 本発明では、非特許文献1の記載に基づいて、神経幹細胞存在領域として知られているマウス脳の海馬組織から、多能性をもつ成体神経幹細胞を樹立した。 The establishment method and culture method invention of the neural stem cells, based on the description of Non-Patent Document 1, the hippocampal tissue of mouse brain known as neural stem cells exist regions were established adult neural stem cells with pluripotent. 樹立した成体神経幹細胞は未分化状態を示す成体幹細胞特異的なSox2遺伝子を発現している(図1)。 The established adult neural stem cells expressing adult stem cell specific Sox2 genes exhibiting undifferentiated state (Fig. 1).
なお、本発明において「成体神経幹細胞」というとき、典型的にはドナーとなるヒトの様々な神経組織から得られた「成体神経幹細胞」であり、好ましくは再生治療を行う患者自身の「成体神経幹細胞」であることが好ましいが、ブタなど異種哺乳類由来の「成体神経幹細胞」であってもよい。 Incidentally, the term "adult neural stem cell" in the present invention are typically obtained from different neural tissue of a human comprising a donor "adult neural stem cells", preferably the patient's own performing regeneration therapy "adult neural it is preferably a stem cell ", but may be a pig, etc. from heterologous mammalian" adult neural stem cells. " また、マウス、ラットなどの実験動物由来、又はイヌ、ネコなどの愛玩動物由来の「成体神経幹細胞」であってもよい。 In addition, a mouse, an experimental animal origin, such as a rat, or dog, may be "adult neural stem cells" derived from companion animals such as cats.
具体的な手法は以下の通りである。 Specific procedures are as follows.
神経幹細胞存在領域をマイクロダイセクションしたのち、迅速にトリプシン酵素処理下で細胞を分散させ、次いで、37℃のCO 2インキュベーター内で神経細胞培養用培地中に細胞を懸濁し、培地による洗浄を繰り返し、遠心により、神経幹細胞を含有する神経由来の細胞成分を採取する。 After the neural stem cells exist areas were microdissected, quickly cells were dispersed under trypsin enzymatic treatment, then suspended cells into neural cells in culture medium in a CO 2 incubator at 37 ° C., repeated washing with medium , by centrifugation, collecting the cellular components of neural origin containing neural stem cells. 神経細胞培養用培地としては、典型的には[DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加,Antibiotic-Antimicotic添加]が用いられる。 As the medium for neuronal cell cultures, typically [DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added] is used.
細胞増殖能を上昇させるためには、上記神経幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添加することが好ましい。 To increase cell proliferation ability, the medium for the neural stem cell culture, it is preferable to further add the FCS and FGF2. 例えば、FCSを濃度1〜10%、好ましくは5%で添加すると共に、FGF2を10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期特有の培養方法を続ける。 For example, FCS concentration 1-10%, preferably with the addition of 5%, the FGF2 10~200ng / mL, preferably added 100 ng / mL, continue process of establishing the initial specific culture.
さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約5〜8日間、好ましくは7日間培養することで十分増殖させた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加した神経幹細胞用培地(好ましいFGF2の添加量は、10〜100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。)で培養すれば、成人神経幹細胞の未分化状態を維持し続けることができる。 Moreover, for about 5-8 days with the addition of the FCS and FGF2, preferably the after the fully grown culturing for 7 days, stop the addition of FCS, the addition of neural stem cell medium (preferably FGF2 supplemented with only FGF2 the amount may be 10-100 ng / mL, more preferably be cultured in a 20 ng / mL.), maintains the undifferentiated state of adult neural stem cells.
なお、膵臓幹細胞の場合は、EGF2を添加してもあまり効果が見られないが、神経幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF2を用いても未分化状態の維持効果がある。 In the case of pancreatic stem cells, but not seen very effective be added EGF2, in the case of neural stem cells, there is also the effect of maintaining the undifferentiated state by using the EGF2 instead of FGF2.

3. 3. 膵臓幹細胞の樹立法及び培養法における、神経幹細胞との類似性 成体神経幹細胞の培養法と基本的には同じ条件下で行う。 Pancreatic stem cells in established methods and culture methods, the culture method basically similarity adult neural stem cells and neural stem cells carried out under the same conditions. すなわち、例えば、典型的な神経幹細胞用培地である[DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加,Antibiotic-Antimicotic添加]を用いることができる。 That is, for example, a typical neural stem cell medium [DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added] can be used.
細胞増殖能を上昇させるためには、上記神経幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添加することが好ましい。 To increase cell proliferation ability, the medium for the neural stem cell culture, it is preferable to further add the FCS and FGF2. 例えば、FCSを濃度1〜10%、好ましくは5%で添加すると共に、FGF2を10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期特有の培養方法を続ける。 For example, FCS concentration 1-10%, preferably with the addition of 5%, the FGF2 10~200ng / mL, preferably added 100 ng / mL, continue process of establishing the initial specific culture.
さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約5〜8日間、好ましくは7日間培養することで十分増殖させた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加した神経幹細胞用培地(好ましいFGF2の添加量は、10〜100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。)で培養すれば、成人膵臓幹細胞の未分化状態を維持し続けることができる。 Moreover, for about 5-8 days with the addition of the FCS and FGF2, preferably the after the fully grown culturing for 7 days, stop the addition of FCS, the addition of neural stem cell medium (preferably FGF2 supplemented with only FGF2 the amount may be 10-100 ng / mL, more preferably be cultured in a 20 ng / mL.), maintains the undifferentiated state of adult pancreatic stem cells.
なお、膵臓幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF2を添加してもあまり未分化状態の維持効果は見られない。 In the case of pancreatic stem cells, not seen the effect of maintaining the undifferentiated state substantially with the addition of EGF2 instead of FGF2.
一般に、神経幹細胞など、各種幹細胞が樹立されたことは、上述のように、Sox2遺伝子が発現していることを確認して、未分化状態を示すことを確認する。 In general, such neural stem cells, that various stem cells have been established, as described above, we confirm that the Sox2 gene is expressed, to make sure that indicate the undifferentiated state. 膵臓幹細胞の場合、膵臓細胞が分化した状態で発現が上昇するインシュリンやグルカゴン遺伝子の発現が認められないことも同時に確認できる(図3aおよびb)。 For pancreatic stem cells, it can also simultaneously confirmed that the expression of insulin and glucagon gene expression is increased in a state where pancreatic cells have differentiated are not observed (Figure 3a and b).

4. 4. 膵臓幹細胞の分化誘導法における神経幹細胞との類似性 成体神経幹細胞を分化させる際の手法として、神経分化誘導法やグリアへの分化誘導法は既に確立されている(非特許文献1、4〜6など)。 As a method when differentiating similarity adult neural stem cells and neural stem cells in differentiation inducing method of pancreatic stem cells, neuronal differentiation inducing method or differentiation induction method of the glia is already established (Non-patent Document 1,4~6 Such).
一方、成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させるためにも、各種神経細胞への分化方法を適用することができる。 On the other hand, the adult pancreatic stem cells, alpha cells, beta cells, [delta] cells, in order to differentiate the γ respectively cells, can be applied to differentiate how the various neurons. つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件が適用できる。 In other words, the method of β is neuronal differentiation in cell differentiation, the method differentiation into astrocytes in the differentiation of α cells, neural differentiation conditions for differentiation δ cells to produce inhibitory interneurons, the γ cell differentiation oligo oligodendrocyte cells can be the conditions of glial cell differentiation is applied to induce.

成体膵臓幹細胞の各膵臓細胞への具体的な分化誘導法は、以下の通りである。 Specific differentiation inducing method into the pancreatic cells of adult pancreatic stem cells is as follows.
(a)インシュリン産生能を有するβ細胞への分化 神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、インシュリン産生能を有するβ細胞に分化させることができる。 (A) by applying the differentiation conditions from differentiated neural stem cells into β cells with insulin production ability into neurons, adult pancreatic stem cells can be differentiated into β cells with insulin production ability. 基本的には、非特許文献4又は5に記載の神経細胞への分化条件に従うことが好ましい。 Basically, it is preferable to follow the differentiation conditions of neural cells described in Non-Patent Document 4 or 5. 典型的には、[RA+FSK+KCl]添加培地が用いられ、例えば、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製)を添加する。 Typically, [RA + FSK + KCl] containing medium is used, for example, DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, in Antibiotic-Antimicotic supplemented medium, 1 [mu] M of retinoic acid ( RA, sigma) is added 5μM of forskolin (FSK, sigma) and made 40 mM of KCl (WAKO Co., Ltd.). また、本実施例2−3中では、神経細胞分化誘導剤として典型的に用いられる「RA+FSK+KCl」を添加する以外に、レチノイン酸(RA)単独、またはレチノイン酸+フォスフォコリン(RA+FSK)でも、さらにヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤の一種であるバルプロ酸(VPA)、メチル化酵素阻害剤の5AzaCもインシュリンプロモーターを活性化することを確認した(図3F)。 Further, in this embodiment 2-3, in addition to adding the "RA + FSK + KCl" typically used as a nerve cell differentiation inducer, retinoic acid (RA) alone or retinoic acid + phosphocholine, ( RA + FSK) But further histone deacetylase (valproic acid, which is a kind of HDAC) inhibitor (VPA), it was confirmed that activates insulin promoter also 5AzaC methylation inhibitor (Figure 3F).
また、脳内の神経新生領域で発現する分泌タンパク質として知られるWnt3もしくはその遺伝子又はWnt3のシグナリング促進物質を用いることでも、成体神経幹細胞をインシュリン産生性のβ細胞へ効率的に分化することができることを本発明において、初めて実証できた。 Also, by using the Wnt3 or signaling promoting substance of that gene or Wnt3 known as secreted proteins expressed in neurogenesis region in the brain, that adult neural stem cells can be efficiently differentiated into insulin-producing β cells in the present invention, it could be demonstrated for the first time. すなわち、成体神経幹細胞の培地にWnt3aもしくはその活性化剤を添加するか、当該細胞内にWnt3a遺伝子を導入することでインシュリンを産生できるように分化させることができる。 That is, adult neural stem cell medium in or adding Wnt3a or an activator of insulin to can be differentiated to allow production by introducing Wnt3a gene to the intracellular. Wnt3aについては、下記5. For Wnt3a, following 5. で詳細に述べる。 In will be described in detail.
成体膵臓幹細胞がβ細胞に分化したことを確認するためには、β細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「インシュリン」発現を抗体で確認すればよい。 To confirm that the adult pancreatic stem cells have differentiated into β cells, a widely used are "insulin" expressed as β cell differentiation pathway markers may be confirmed by antibody. インシュリンが新しく生成する反応由来の「C-peptide」で発現を新規のインシュリン産生を同時に確認することもできる。 The expression in the "C-peptide" derived from the reaction of insulin to newly generated can also be used to confirm the new insulin-producing at the same time. 例えば、インシュリン検出用の「guinea pig anti-Insulin(1:300;Sigma社製)」又はC-peptide検出用の「goat anti-C-peptide(1:250,Linco Research社製)」が好適に用いられる。 For example, for insulin detection "guinea pig anti-Insulin (1: 300; Sigma Co.)" or C-peptide for detection of "goat anti-C-peptide (1: 250, Linco manufactured Research)" is preferably used. また、インシュリン又はC-peptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる(図3B)。 Moreover, the presence of mRNA of insulin or C-peptide can be confirmed by RT-PCR method (Figure 3B).

(b)δ細胞への分化 成体膵臓幹細胞に対して、β細胞の場合と同様の神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、δ細胞にも分化させることができるが、δ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞から抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件を適用する。 Relative differentiation adult pancreatic stem cells to (b) [delta] cells, by applying the differentiation conditions from when the same neural stem cells β cells into neural cells, may be also differentiated into [delta] cells, [delta] cells for greater content applies neural differentiation conditions to produce the inhibitory interneurons from neural stem cells. 基本的には、非特許文献4,5に記載の神経分化条件に従うことが好ましい。 Basically, it is preferable to follow the neural differentiation conditions described in Non-Patent Documents 4 and 5. 典型的には、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine),N2 supplement添加,Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)、追加的に40 mMのKCl(WAKO社製)を添加する。 Typically, DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, in Antibiotic-Antimicotic supplemented medium, retinoic acid (RA, Sigma) for 1 [mu] M, 5 [mu] M of forskolin (FSK, Sigma Ltd.), adding additionally 40 mM of KCl (WAKO Co., Ltd.).
成体膵臓幹細胞がδ細胞に分化したことを確認するためには、δ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「ソマトスタチン」発現を確認すればよい。 To confirm that the adult pancreatic stem cells have differentiated into δ cells may be confirmed widely used are "somatostatin" expressed as δ cell differentiation pathway markers. 例えば、ソマトスタチン検出用の「rat anti-Somatostatin(1:300,Chemicon社製)」抗体が好適に用いられる。 For example, for somatostatin detected "rat anti-Somatostatin (1: 300, Chemicon, Inc.)" antibodies are preferably used. また、ソマトスタチンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。 Further, it is possible to confirm the presence of somatostatin mRNA due RT-PCR method.

(c)α細胞への分化 神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、α細胞に分化させることができる。 From differentiated neural stem cells into (c) alpha cells by applying the differentiation conditions into astrocytes, adult pancreatic stem cells can be differentiated into alpha cells. 基本的には、非特許文献4〜6に記載のアストロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。 Basically, it is preferable to follow the differentiation conditions into astrocytes described in Non-Patent Document 4 to 6. 典型的には、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、5%FCSまたはLIF(50 ng/mL;WAKO社製)とBMP2(50 ng/mL;WAKO社製)を添加する。 Typically, DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, the Antibiotic-Antimicotic supplemented medium, 5% FCS or LIF (50 ng / mL; manufactured by WAKO Co.) and BMP2 (50 ng / mL; WAKO Co., Ltd.) is added.
成体膵臓幹細胞がα細胞に分化したことを確認するためには、α細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「グルカゴン」発現を確認すればよい。 To confirm that the adult pancreatic stem cells differentiated into α cells may be confirmed widely used are "glucagon" expressed as α cell differentiation pathway markers. 例えば、グルカゴン検出用の「mouse anti-Glucagon(1:300,Immuno社製)」抗体での検出が好適に用いられる。 For example, for glucagon detection "mouse anti-Glucagon (1: 300, Immuno Ltd.)" is detected with an antibody is suitably used. また、グルカゴンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。 Further, it is possible to confirm the presence of glucagon mRNA due RT-PCR method.

(d)γ細胞への分化 成体膵臓幹細胞に対して、α細胞の場合と同様の神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、γ細胞にも分化させることができるが、γ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を適用する。 Relative differentiation adult pancreatic stem cells to (d) gamma cell, by applying the differentiation conditions from a similar neural stem cells in the case of the α cells into astrocytes, but can also be differentiated into gamma cells, gamma If you want to increase the content of the cells, to apply the conditions of glial cell differentiation from neural stem cells to induce oligodendrocyte cells. 基本的には、非特許文献4〜6に記載のグリア細胞、オリゴデンドロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。 Basically, glial cells described in Non-Patent Document 4 to 6, it is preferable to follow the differentiation conditions to oligodendrocyte. 典型的には、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、1%FCSまたはIGF1 (500 ng/mLが好適。使用範囲として20−1000 ng/mL)を添加する。 Typically, DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, the Antibiotic-Antimicotic supplemented medium, 1% FCS or IGF1 (500 ng / mL is preferred. As used range 20-1000 ng / mL) is added.
成体膵臓幹細胞がγ細胞に分化したことを確認するためには、γ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「Pancreatic polypeptide」発現を確認すればよい。 To confirm that the adult pancreatic stem cells have differentiated into γ cells may be confirmed widely used as γ cell differentiation pathway marker "Pancreatic Polypeptide" expression. 例えば、Pancreatic polypeptide検出用の「guinea pig anti-Pancreatic polypeptide (1:100,Linco Research社製)」抗体が好適に用いられる。 For example, Pancreatic Polypeptide detection of "guinea pig anti-Pancreatic polypeptide (1: 100, Linco manufactured Research)" antibodies are preferably used. また、Pancreatic polypeptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。 Further, it is possible to confirm the presence of mRNA of Pancreatic Polypeptide due RT-PCR method.

5. 5. Wnt3a及びWnt3シグナル伝達機構(Wnt3/βcateninシグナリング)の促進物質について For promoting substance of Wnt3a and Wnt3 signaling mechanism (Wnt3 / βcatenin signaling)
Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞(GFAP陽性)が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストという神経新生細胞(NeuroD1陽性)を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞(GFAP、Glucagon陽性)で発現していることが分かった(参考例3、図3B)。 Wnt3 in neurogenesis region in the brain, in secreted proteins astrocytes (GFAP positive) is expressed, neural stem cells The effect begins neurogenesis, producing neurogenesis cells (NeuroD1 positive) that neuroblastoma substance although, this Wnt3 is pancreatic islet α cells (GFAP, Glucagon-positive) was found to be expressed in (reference example 3, FIG. 3B).
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る(図3C−E。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下(ニューロブラスト産生状態)に置くと24時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した(図4B)。 Moreover, endocrine system pancreas, there is a very high correlation with brain nervous system, a cell neogenesis in β cells, there is common that a NeuroD1 positive (on the promoter of Figure 3C-E.NeuroD1 the, βcatenin / TCF / LEF sequence to which a transcription factor binds recognizes activated by Wnt / βcatenin signaling person - in inducing differentiation are conserved in mouse pancreatic stem cells into β cells, - rats. initial neural induction conditions after placing the 24 hours elapsed (neuroblastoma production state), that stabilization of Betacatenin protein which is important in Wnt / βcatenin signaling is occurring was confirmed by Western blotting (Figure 4B).
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した(図4C)。 Furthermore, NeuroD1 genes, Wnt to activate the insulin gene is essential, Wnt3 was confirmed by RT-PCR that leads to activation of both genes (Figure 4C).
図4Cは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化(試薬)でインシュリン遺伝子の発現が上昇し(Wnt3,GSK3beta-inhibitor)、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化(DnWnt;ドミナントネガティブWnt,βcatenin shRNA)でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。 Figure 4C, Wnt / βcatenin insulin gene expression in activated (reagent) signaling is increased (Wnt3, GSK3beta-inhibitor), in contrast to Wnt / βcatenin inactivation of signaling (DnWnt; dominant negative Wnt, βcatenin shRNA ) shows that the expression of the insulin gene does not occur in.
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化(インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位(E-box))部位へ、直接結合し、クロマチン(染色体)の活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)を誘導する)を導くことを示した(図4D)。 TCF / LEF activation of transcription factor binding sites of chromatin on promoter NeuroD1 (Anti-Acetyl HistoneH3) that is induced by Wnt3, further NeuroD1 activation of the insulin gene (NeuroD1 recognition binding site on the promoter of the insulin gene to (E-box)) site, attached directly showed that directing the chromatin (induced activation of chromosomes) and (Anti-Acetyl HistoneH3)) (Fig. 4D).
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。 From these facts, together with the control factor to keep the adult pancreatic stem cells in an undifferentiated state, controlled factor in the differentiation control is also, it has been demonstrated a high nerve regeneration control mechanism very commonality from adult neural stem cells.
したがって、Wnt3a自身及びWnt/βcateninシグナリングを活性化する物質は、成体膵臓幹細胞を前駆β細胞、さらにはβ細胞へと分化させるβ細胞分化誘導剤となると同時に、インシュリン遺伝子発現を活性化することができることから、これらの物質を、インシュリン産生増強用医薬組成物、糖尿病用治療薬(下記7.などで詳細に述べる。)として用いることができる。 Therefore, the substance activating Wnt3a itself and Wnt / βcatenin signaling, adult pancreatic stem cells progenitor β cells, at the same time further the β cell differentiation inducing agent to differentiate into β cells to activate the insulin gene expression because it can, these substances, insulin production-enhancing pharmaceutical composition can be used as diabetes therapeutics (below 7. discussed in detail the like.). 具体的には、Wnt3a自身、GSK3βインヒビター、リチウム塩(リチウムはWntシグナルを特異的に活性化することで知られている)、及びβカテニンを用いることができる。 Specifically, Wnt3a itself, GSK3 [beta inhibitors, lithium salt (lithium are known to specifically activate Wnt signaling), and β-catenin can be used. なお、β細胞への分化効果、インシュリン産生増強効果のいずれに関しても、神経細胞の分化誘導剤として知られるRA(+FA,KCl)、AzaCとVPAもWnt3aやWntシグナル活性化剤と同様な作用がある(図3F)。 Incidentally, the differentiation effect on β cells for either insulin-producing enhancing effect, RA, known as a differentiation inducer of neuronal (+ FA, KCl), a similar effect as with VPA also Wnt3a or Wnt signaling activator AzaC there (Fig. 3F).

Wntは、細胞外に分泌され、細胞間のシグナル伝達を司るタンパク質として複数種類(哺乳類では19種類)存在し、線虫、ショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を超えて保存されている。 Wnt is secreted extracellularly, there (19 types in mammals) a plurality of types as a protein responsible for signal transduction between cells, it is conserved across species nematodes, Drosophila to humans. ノックアウトマウスの解析によりWntは発生初期における体軸形成や器官形成に必須な、生物学的に重要なタンパク質である。 Analysis of knockout mice Wnt is essential to the body axis formation and organ formation in early development, the biologically important proteins. Wntにより活性化される細胞内シグナル伝達機構には、(1)βカテニン経路、(2)平面内細胞極性(PCP)経路(細胞骨格制御)、及び(3)Ca 2+経路(細胞運動制御)の3種類が存在するが、本発明において「Wntシグナル伝達機構」というときは、βカテニン転写因子(非特許文献8)を介した「βカテニン経路」を指す。 The intracellular signaling mechanisms activated by Wnt, (1) beta-catenin pathway, (2) planar cell polarity (PCP) pathway (cytoskeleton), and (3) Ca 2+ pathway (cell movement three is present), but the term "Wnt signaling mechanism" in the present invention refers to a "β-catenin pathway" through the β-catenin transcription factor (non-Patent Document 8).
Wnt3aは、典型的なWntであり、幹細胞、特に造血幹細胞の増殖および自己再生を含む多数の発達イベントに関与することが知られており、本発明において、成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を誘導する物質であることが見出された。 Wnt3a is a typical Wnt, stem cells, and in particular is known to be involved in a number of developmental events growth and including self-renewal of hematopoietic stem cells, in the present invention, differentiation of adult pancreatic stem cells β to cells it was found to be induced substance.
Wnt3aをインシュリン産生β細胞への分化誘導剤として用いる場合、成体の膵臓組織に対して、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を含む発現ベクターなどを直接導入することも考えられるが、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を常法により作用させた成体膵臓幹細胞、β前駆細胞を膵臓組織に移植する手法が好ましい。 When using a Wnt3a as a differentiation inducing agent into insulin-producing β cells, relative to adult pancreatic tissue, Wnt3a protein, or it may be considered to introduce such expression vectors directly containing Wnt3a gene, Wnt3a protein, or Wnt3a gene adult pancreatic stem cells to act by a conventional method, method of transplanting β precursor cells into the pancreas tissue is preferred.
その際に用いるWnt3aタンパク質としては、生体試料から精製されたもの、化学合成されたものや遺伝子組み換えによって製造されたものを用いることができ、市販Wnt3aを用いることもできる。 The Wnt3a protein used in this case, those purified from a biological sample, those prepared by chemical synthesis work and in its genetic recombination can be used may be a commercially available Wnt3a. Wnt3aは保存性が高いので、由来の生物種はいずれのものであってもよいが、医薬製剤として用いる場合は対象生物種と同一の生物種由来のものが好ましい。 Since Wnt3a is highly conserved, species-derived may be of any, but is preferably derived from the target species of the same species when used as a pharmaceutical preparation. また、Wnt3aタンパク質におけるWntシグナル伝達機構に関与する領域は古くから研究され、ほぼ解明されており(非特許文献9)、当該領域が含まれていれば、Wnt3aタンパク質及びその遺伝子の全長でなく部分配列であってもよい。 Further, regions involved in Wnt signaling mechanism in Wnt3a protein is studied for a long time, has been substantially elucidated (Non-Patent Document 9), if it contains the region, the portion not the total length of Wnt3a protein and its gene it may also be an array.
Wnt3a遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター(例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター)などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター(例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV) ベクターやレンチウイルスベクター)を用いて導入することができる。 Wnt3a gene cells, when introduced into the tissues, with native promoter, or by connecting such a powerful known promoter (e.g., CAG promoter and CMV promoter), it may be directly introduced with a physiologically acceptable carrier but usually various known viral vector used for gene therapy (e.g., adeno-associated virus (AAV) vectors or lentiviral vectors) can be introduced by using a.
なお、「Wnt3a遺伝子」というとき、Wnt3aタンパク質をコードするDNA又はmRNAを指し、Wnt3a遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトWnt3a遺伝子は、NM_033131(Gene Bankアクセッションナンバー)、マウスWnt3a遺伝子はNM_009522(Gene Bankアクセッションナンバー)である。 Incidentally, the term "Wnt3a gene" refers to DNA or mRNA encoding Wnt3a protein, Wnt3a gene sequence is available from known database, such as human Wnt3a gene, NM_033131 (Gene Bank accession number), a mouse Wnt3a gene is NM_009522 (gene Bank accession number).
また、公知のWnt3a活性化剤(Wnt3aの活性を増加させるような化合物やWnt3a 転写を活性化するような化合物)、例えば、Wntのシグナル伝達機構を促進することが知られているグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)インヒビターであるAR-A014418(J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46, p45937-45945, 2003)やCT 99021 - CHIR 99021(Axon Ligands社製やSTEMGENT社製)、リチウム塩(Lithium Chloride, Wakoやシグマ社製;)βカテニン(Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.97. 4262-4266, 2000 )を用いることができる。 Further, it is known Wnt3a activator (compounds to increase the activity of Wnt3a or Wnt3a transfer compounds which activate), for example, glycogen synthase kinase-3β which to promote Wnt signaling mechanism known (GSK3β) is an inhibitor AR-A014418 (.... J Biol Chem, Vol 278, No. 46, p45937-45945, 2003) and CT 99021 - CHIR 99021 (manufactured by Axon Ligands Co., Ltd. and STEMGENT Co., Ltd.), lithium salt (Lithium Chloride, Wako and sigma;) beta-catenin (.. Proc.Natl.Acad.Sci USA, Vol.97 4262-4266, 2000) can be used. また、図3Dに示されるインシュリン遺伝子発現増強効果が確認された、レチノイン酸(RA)は単独でも、フォスフォコリン(FSK)と共に、さらにKCl塩と共に用いることができ、神経分化誘導剤のバルプロ酸ナトリウム(VPA)や5AzaCも用いられる。 Further, insulin gene expression enhancing effect shown in FIG. 3D is confirmed, even in retinoic acid (RA) alone, with phosphocholine (FSK), it can be used with further KCl salt, valproic acid neural differentiation inducer sodium (VPA) or 5AzaC be used.
なお、本発明の実施例4で用いた、Wnt3aのドミナントネガティブタンパク質(dnWnt)は、Wnt3aの作用領域を改変して機能不全タンパク質をコードする遺伝子をレンチウイルスベクター(Lie DC et al. Nature 437, 1370-1375. (2005))に組み込み発現させたものを用いている。 Incidentally, it used in Example 4 of the present invention, a dominant negative protein of Wnt3a (dnWnt) a gene lentiviral vector encoding dysfunctional protein to modify the action area of ​​Wnt3a (Lie DC et al. Nature 437, 1370-1375. I am used those obtained by integrating expression (2005)).

6. 6. 成体膵臓幹細胞を用いた、膵臓細胞移植治療方法について 成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を抽出し、上記成体膵臓幹細胞を樹立する。 Using adult pancreatic stem cells, many islets contained in pancreatic tail portion of the pancreas of adult extracted for pancreatic cell transplantation therapy method, to establish the adult pancreatic stem cells. 市販のコラーゲンシート(例;コラーゲンビトリゲル(旭テクノグラス株式会社))などの生体適合性シート上で前記4. Commercial collagen sheet (eg, collagen Vito Rigel (Asahi Techno Glass Corporation)) the biocompatible sheet such as 4. (a)に示したβ細胞分化を促す薬剤(すなわち、神経系細胞分化を促進する薬剤)による処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の膵臓に移植して戻す方法が考えられる。 (A) a drug to promote β cell differentiation as shown (i.e., agents that promote neural cell differentiation) culturing is subjected to processing by a plurality of adult pancreatic stem cell cultures collagen sheet was implanted into the pancreas of the patient himself how to return can be considered. 例えば重度の合併症を起こす前の糖尿病患者などが対象としてあげられる。 Such as diabetic before cause severe complications can be mentioned as a target. 患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。 To use the patient's own cells, there is no fear of rejection due to donor and transplantation. β細胞分化を促す薬剤処理としては、上述の神経分化を促進する薬剤(1μMのretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製)や、後述のWntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子(Wnt3A,beta-catenin,GSK3betaインヒビター、リチウム塩など)、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤(抗てんかん薬として知られるVPA;バルプロ酸ナトリウム、TSA;トリコスタチンA)などがあげられる。 The chemical treatment to promote β cell differentiation, retinoic acid (RA, Sigma drug (1 [mu] M to promote neuronal differentiation described above), 5 [mu] M of forskolin (FSK, Sigma) and 40 mM of KCl (WAKO Co. ) and drug genes that activate Wnt signaling described later (Wnt3A, beta-catenin, GSK3beta inhibitor, such as a lithium salt), and ever agent that induces neuronal differentiation has been developed (VPA known as anti-epileptics ; sodium valproate, TSA; trichostatin A) and the like.
また、シートを用いる手法の他、成体膵臓幹細胞を、遠心分離した細胞単独で、又は上記神経分化を促進もしくは誘導する薬剤を含有する培養液と共に、注射器などにより膵臓組織(患部)に直接注入する手法を採ることもできる。 Another method using the sheet, the adult pancreatic stem cells, in cells alone centrifugation, or with culture medium containing an agent that promotes or induces the neuronal differentiation, injected directly into pancreatic tissue (affected area) by syringe or the like technique it is also possible to take.

7. 7. インシュリン増強用医薬組成物、又は糖尿病治療薬としての製剤化、及び投与方法 特に、インシュリンを産生するβ細胞への分化作用のある、RA(+FSK,KCl)、VPA、5AzaCなどの神経分化誘導剤、Wnt3aもしくはその活性化剤(GSK3βインヒビター、リチウム塩)、は、分化後のインシュリン産生も増強できるので、糖尿病用治療薬として有効であり、I型糖尿病用、II型糖尿病用のいずれにも効果が期待できる。 Insulin-enhancing pharmaceutical composition or formulation as antidiabetic agent, and methods of administration in particular, a differentiation effect on β cells which produce insulin, RA (+ FSK, KCl), VPA, neuronal differentiation-inducing agents such as 5AzaC , Wnt3a or an activator (GSK3 [beta inhibitors, lithium salt), because insulin production can also be enhanced after differentiation, are effective as diabetic therapeutic agents, I type diabetes for, in any effect for type II diabetes There can be expected.
本発明の医薬組成物は、移植用の成体神経幹細胞と共にこれらの神経分化誘導剤を膵臓の患部に直接注入するか、又はin vitroで成体神経幹細胞又はそれを分化させた前駆β細胞などに注入して移植する方法を用いることもできる。 The pharmaceutical compositions of the present invention, the injection of these neuronal differentiation inducer with adult neural stem cells for transplantation or injected directly into the affected area of ​​the pancreas, or the like adult neural stem cells or progenitor β cells it to differentiate into the in vitro method of implanting and can also be used. 一般的には、コラーゲンシートなど移植用の生体適合性シート上で成体神経幹細胞を分化誘導剤と共に培養し、β前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植するのが最も効率的であるので、その際の培地中に添加するか、その成体神経幹細胞に導入するのが一般的である。 In general, the adult neural stem cells cultured with differentiation inducer on biocompatible sheet for transplantation, such as collagen sheets, it is most efficient to transplanted to the affected area for each sheet after being differentiated to the β precursor cells since, either added to the culture medium at that time, it is common to introduce into the adult neural stem cells. 本発明で生体適合性シートというとき、典型的にはコラーゲンシートであるが、コラーゲンマトリックスやコラーゲンスポンジを用いることもでき、その際の材質としては生体適合性材料製、例えば周知の生体適合性合成樹脂製であってもよい。 The term biocompatible sheet in the present invention is typically a collagen sheet, it is also possible to use a collagen matrix or collagen sponge, as the material when the biocompatible material made, for example, well-known biocompatible synthetic it may be made of resin.
したがって、本発明でインシュリン増強用医薬組成物、糖尿病再生治療用組成物というとき、単に成体神経幹細胞を有効成分とする医薬組成物のみならず、移植用シート上の成体膵臓幹細胞も含めた移植用キットを含む場合、さらに上述のβ細胞分化誘導剤を含む場合も包含し、さらに、成体神経幹細胞をあらかじめ移植用シート上で、上述のβ細胞分化誘導剤存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させた状態の移植用シート上の細胞を含めることもある。 Thus, insulin-enhancing pharmaceutical composition in the present invention, the term diabetes reproducing therapeutic composition, not only the pharmaceutical composition as an active ingredient adult neural stem cells, for adult pancreatic stem cells on transplantation sheet also including transplantation when including kits, further also encompasses the case containing the β cell differentiation inducing agents described above, further, the adult neural stem cells in advance transplantation sheet, and cultured in the presence of inducer β cell differentiation described above, the β precursor cells there also include cells on transplantation sheet in a state where differentiated to.
そして、いずれの場合も、好ましくは通常の注射製剤などと同様、無菌の水溶液に溶解、又は懸濁し、薬学的に許容される安定化剤、等張化剤、緩衝剤などが配合される。 In either case, preferably also including the normal injection preparation, dissolved in a sterile aqueous solution or suspension, pharmaceutically acceptable stabilizing agents, isotonic agents, such as buffering agents are formulated. また、遺伝子製剤の場合は、常法に従い、核内に遺伝子を運搬するためのキャリアが併用されることが好ましい。 In the case of gene preparation according to a conventional method, it is preferable that the carrier for carrying the genes into the nucleus are combined. 生理学的に受容可能なキャリアとしては、リポフェクタミン(Invitrogen社)などの遺伝子導入用カチオン性脂質などがある。 Physiologically acceptable carriers, and the like for gene transfer cationic lipids such as Lipofectamine (Invitrogen).
遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター(例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター)などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター(例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど)を用いて導入する。 Gene Cells, when introduced into the tissues, with native promoter, or by connecting such a powerful known promoter (e.g., CAG promoter and CMV promoter), it may be directly introduced with a physiologically acceptable carrier usually introduced using various known viral vector (e.g. retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors) used for gene therapy to.
また、公知のインシュリン製剤又はアディポネクチン製剤などの公知インシュリン産生増強剤を併用することもできる。 It is also possible to use the known insulin production enhancer, such as the known insulin preparations or adiponectin formulation.
本発明の医薬有効投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人1日当たり1μg/kg〜10mg/kgである。 Pharmaceutically effective dosages and administration frequency of the present invention, the desired therapeutic effect, administration method, treating period, age, varies body weight, etc., and it is usually an adult per day 1μg / kg~10mg / kg.

8. 8. 成体膵臓幹細胞を用いた、神経系再生用移植治療方法について 成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を部分結紮して抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。 Using adult pancreatic stem cells, islet contained much in the pancreatic tail portion of the pancreas of adult for nervous system regeneration transplantation therapy methods extracted by partial ligation, establishing adult pancreatic stem cells using the present techniques therefrom. コラーゲンシート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の神経疾患部位に移植して戻す方法が考えられる。 Culturing subjected to chemical treatment to encourage been such β cell differentiation described present on collagen sheet, a plurality of adult pancreatic stem cell cultures collagen sheet is considered a method of back transplanted into the site of a neurological disease patient himself. また、コラーゲンシートを用いずに、この細胞培養物を神経損傷部位に直接インジェクションする方法も考えられる。 Further, without using the collagen sheet, a method for injecting directly the cell culture to the nerve injury site may be considered. 上述と同様、患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。 The same manner as described above, in order to use the patient's own cells, there is no fear of rejection due to donor and transplantation. 神経分化を促す薬剤処理としては、上述の神経分化を促進する薬剤(1μMのretinoic acid(RA,シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製))や、後述のWntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子(Wnt3A,beta-catenin,GSK3betaインヒビターなど)、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤(抗てんかん薬として知られるVPA;バルプロ酸ナトリウム、TSA;トリコスタチンA)なども用いることができる。 The chemical treatment to promote neuronal differentiation, agent that promotes neuronal differentiation of above (1 [mu] M of retinoic acid (RA, Sigma), 5 [mu] M of forskolin (FSK, Sigma) and 40 mM of KCl (WAKO Co., Ltd.) valproate;) or drug gene (Wnt3A that activates the Wnt signaling later, beta-catenin, etc. GSK3beta inhibitors), also VPA known as drugs (antiepileptic drugs that induce neuronal differentiation have been developed so far sodium, TSA; trichostatin A), or the like can be used.

9. 9. 成体神経幹細胞を用いた、膵臓細胞移植治療方法について 前記2. Using adult neural stem cells, the pancreas cells transplantation therapy wherein said 2. のように樹立された成体神経幹細胞を、上記4. An established adult neural stem cells as the above 4. で述べたと同様、例えばβ細胞分化を促す薬剤(すなわち、神経分化を促進する薬剤)による処理を施したコラーゲンシート上で培養する。 In the same manner as mentioned, the drug (i.e., agents that promote neuronal differentiation) prompting example β cell differentiation cultured on collagen sheet having been subjected to treatment with. 次いで、複数の成体神経幹細胞培養コラーゲンシートを、成体の膵臓組織に移植して戻す。 Then, a plurality of adult neural stem cell cultures collagen sheet, back transplanted into the adult pancreatic tissue. 例えば、重度の合併症を起こす前の糖尿病患者などを対象とすることもでき、その場合は患者自身の成体神経幹細胞を用いることで、拒絶反応の心配のない再生医療が可能となる。 For example, can also be directed to such previous diabetics cause severe complications, the use of the adult neural stem cells of the patient's own case, it is possible to free regenerative medicine worry of rejection. β細胞分化を促す薬剤処理としては、神経分化を促進する薬剤(1μMのretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製))や、Wntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子(Wnt3A,beta-catenin,GSK3betaインヒビターなど)、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤(抗てんかん薬として知られるVPA;バルプロ酸ナトリウム、TSA;トリコスタチンA)なども用いることができる。 The chemical treatment to promote β cell differentiation, agent that promotes neuronal differentiation (retinoic acid (RA of 1 [mu] M, Sigma), 5 [mu] M of forskolin (FSK, Sigma) and 40 mM of KCl (WAKO Co., Ltd.)) and, the drug genes that activate Wnt signaling (Wnt3A, beta-catenin, etc. GSK3beta inhibitors), also ever agent that induces neuronal differentiation has been developed (VPA known as antiepileptic drug; sodium valproate, TSA ; it can be used trichostatin A) and the like.
また、シートを用いる手法の他、成体神経幹細胞の培養液に、上記神経分化を促進又は誘導する薬剤を添加した後、当該培養液と共に注射器などにより患部に直接注入する手法を採ることもできる。 Another method using the sheet, the culture of adult neural stem cells, after addition of agents that promote or induce the neural differentiation, it is also possible to adopt a technique of direct injection into the affected area by syringe or the like together with the culture solution.

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, a detailed explanation of the present invention through examples, the present invention is not intended to be limited to these Examples.
なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); DM Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995;日本生化学会編、「続生化学実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座2、核酸 III(組換えDNA技術)」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Note that genetic engineering techniques used in the Examples of the present invention, PCR methods, and other specific steps and conditions of such techniques, unless otherwise specified, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989);.... DM Glover et al ed, "DNA Cloning", 2nd ed, Vol 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);. Ausubel, FM et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995; Japanese biochemical Society, ed., " continued biochemical experimental course 1, gene research method II ", Tokyo Kagaku Dojin (1986); the Japanese biochemical Society," new biochemistry experimental course 2, nucleic acid III (recombinant DNA technology) ", Tokyo Kagaku Dojin (1992); R ... Wu ed, "Methods in Enzymology", Vol 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980);... R. Wu et al ed, "Methods in Enzymology", Vol 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。 PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983);... R. Wu et al ed, "Methods in Enzymology", Vol 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987) be carried out by methods or substantially similar methods to those of the cited literature methods described or there in such it can.
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。 Also, the description of the prior art or patent application cited in the present invention is intended to incorporate as described herein.

(実施例1) 成体内の神経幹細胞及び膵臓幹細胞の存在の確認 (Example 1) confirmed the presence of neural stem cells and pancreatic stem cells in the adult
Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子であり、多能性を有する幹細胞の存在を確認するマーカーとなる。 Sox2 gene is a transcription factor that holds a very high undifferentiated expressed in ES cells, a marker to confirm the presence of stem cells having pluripotency. 脳内の神経幹細胞存在領域として広く知られている海馬領域でのSox2遺伝子の発現も周知であった。 Expression of Sox2 gene in hippocampal region widely known as neural stem cells exist regions of the brain was also known. この実施例1では、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結し、導入したトランスジェニックマウスを観察したところ、当該マウスの脳と膵臓で、その発現を確認した。 In the first embodiment, connecting the EGFP is a reporter gene Sox2 promoter was observed transgenic mouse introduced, in the brain and pancreas of the mouse, to confirm its expression. その際の組換えベクターの製法、導入量などの実験条件は、非特許文献5に従った。 Preparation of recombinant vectors in that case, the experimental conditions such as the introduction amount, according to Non-Patent Document 5. また、同時に、両臓器の分化した神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることも確認した(図1、上図、点線枠内の細胞がインシュリン抗体陽性、矢印で示した細胞がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞)。 At the same time, both organs differentiated neural cells and, beta cells was also confirmed both that express insulin (Figure 1, upper figure, cells insulin antibody positive in a dotted frame, cell indicated by the arrow adult stem cells expressing Sox2 gene). 神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており(矢印)、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン(同じ矢印で示した細胞。インシュリンは細胞質、NRSF/REST転写因子は核内)を発現していることが分かる(図1、下段)。 Nerve cells and β cells and express the transcription factor of NRSF / REST in the adult (arrow), the NRSF / REST cells expressing positivity indicated by insulin (same arrow cells. Insulin cytoplasm, NRSF / REST transcription factor it can be seen that expressing nuclear) (Fig. 1, bottom).

(参考例1) 膵臓からの幹細胞含有細胞成分の採取 Harvesting of stem cell-containing cell components from (Reference Example 1) Pancreatic
Fisher344成体ラット(7週齢)から成体膵臓を取り出し、ブレードカッターにより十分なマイクロダイセクションを施した後、コラゲナーゼを添加した神経幹細胞培養用培地[DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加,Antibiotic-Antimicotic添加]中で、37℃のCO 2インキュベーター内で30分から45分間、定期的に撹拌しながら細胞を懸濁した。 Removed adult pancreas Fisher344 adult rats (7 weeks old), after performing sufficient Microdissection by a blade cutter, neural stem cell culture medium supplemented with collagenase [DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, in Antibiotic-Antimicotic added], 30 minutes to 45 minutes in a CO 2 incubator at 37 ° C., the cells were suspended with periodic agitation. 次いで、細胞成分を遠心処理で集め(遠心数1000rpm、2分)、新たなコラゲナーゼ入り神経幹細胞培養用培地で洗浄し、当該培地中で撹拌懸濁する、という工程を計3回繰り返した。 Then collected cellular components by centrifugation (centrifuge speed 1000 rpm, 2 minutes), and washed with fresh collagenase containing neural stem cell culture medium and stirred suspended in the medium, the process was repeated a total of three times that.

(参考例2) 膵臓幹細胞の樹立 (Reference Example 2) Establishment of pancreatic stem cells
参考例1の方法により得られた、1000rpmで2分間遠心後の細胞成分を、神経幹細胞を培養する際に用いる、特殊コートを施した培養用ディッシュ[市販の細胞培養用ディッシュ/プレートを、PORN(poly-L-ornithine)で24時間室温でコート(第1コート)し、その後滅菌済み超純水で2回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第2コート液で37℃のCO 2インキュベーター内で24時間コートしたもの]に撒いた。 Obtained by the method of Reference Example 1, the cellular components after centrifugation 2 min at 1000 rpm, is used in culturing neural stem cells, the culture dish [commercially available dish / plate for cell culture which has been subjected to special coating, PORN (poly-L-ornithine) with coated (first coat) at room temperature for 24 hours, then washed twice more with sterile ultrapure water, CO 2 incubator at 37 ° C. in a second coating solution prepared by dissolving Laminin in PBS were seeded to] those 24 hours coated with the inner.
細胞増殖を上昇させるため、10%FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。 To increase the cell proliferation, adding a neural stem cell culture medium supplemented with 10% FCS and 100ng / mL FGF2, 100ng / mL FGF2 and 100 ng / mL EGF2 added neural stem cell culture medium, only the 100 ng / mL FGF2 in the neural stem cell culture medium, it was carried out cell culture. 数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。 It was confirmed that the growth of new cells from all of the conditions after a few days has been started. 最も増殖が促進された,10%FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地での培養は、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。 Most growth was promoted, the culture in addition to neural stem cell culture medium with 10% FCS and 100 ng / mL FGF2, switching to the addition of only FGF2 discontinue the addition of FCS to a week later. これは神経幹細胞の樹立の際に用いられる方法で、一旦増殖を開始させた神経幹細胞は20ng/mLのFGF2存在下で未分化性を効率よく維持できる知見に基づく。 This is the method used for the establishment of neural stem cells, once the neural stem cells that initiated proliferation is based on the finding that the undifferentiated efficiently maintained in the presence of FGF2 20 ng / mL. しかし、同様に神経幹細胞の未分化維持に効果があるとされるEGF2については、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても、FGF2の場合のような効果は見られなかった(図示せず)。 However, the EGF2 being to be effective in the same manner undifferentiated maintenance of neural stem cells, also try added to the culture medium of pancreatic stem cells, without the effect was observed (shown as in the case of FGF2 ).
樹立した成体膵臓幹細胞は20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地(DME/F12, high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加)で培養し、継代可能であることも確認した(図6、P1)。 The established adult pancreatic stem cells culture medium additive neural stem cell culture with 20 ng / mLFGF2 (DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added) were cultured in a possible passage it was also confirmed (Fig. 6, P1).

(参考例3) 成体膵臓幹細胞の分化制御機構の解析 Analysis of differentiation control mechanism (Reference Example 3) adult pancreatic stem cells
参考例2で樹立した成体膵臓幹細胞を用いて、分化制御機構の解析を行った。 Using adult pancreatic stem cells established in Reference Example 2, it was analyzed differentiation control mechanism. 神経幹細胞はSox2遺伝子を発現し、多能性を保持した未分化状態に保つことができる。 Neural stem cells can be kept in an undifferentiated state express Sox2 gene, maintaining the pluripotency. 樹立した膵臓幹細胞を、神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った(図3A、図3G)。 The established pancreatic stem cells, differentiation regulatory control mechanism of neural stem cells to reference, and immunostained analysis divided the differentiated state and undifferentiated state (Fig. 3A, Fig. 3G).
FGF2存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体(guinea pig anti-Insulin;1:300; Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体(mouse anti-Glucagon ;1:300, Immuno社製、以下同様。)を用いる免疫染色法で確認した。 In the presence FGF2, adult pancreatic stem cells, like neural stem cells express Sox2 gene, anti-Sox2 antibody that insulin or α cells β cells express does not express Glucagon gene expression, anti-insulin antibody (guinea pig anti-Insulin; 1:. 300; Sigma Co., hereinafter the same) and anti-Glucagon antibody (mouse anti-Glucagon; 1: 300, immuno Ltd., was confirmed by the following same) immunostaining method using..
次いで、膵臓幹細胞を神経分化条件下(非特許文献4、5)の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製)を含むDME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地([RA+FSK+KCl])を用いて培養すると、β細胞への分化が促進され、インシュリン遺伝子の発現の上昇とともに、細胞表面に神経突起のようなプロセスを伸長させた。 Then, pancreatic stem cells neuronal differentiation conditions (Non-Patent Documents 4 and 5) neural differentiation conditions, namely retinoic acid (RA, Sigma) for 1 [mu] M, of 5 [mu] M forskolin (FSK, Sigma) and 40 mM KCl DME / F12 containing (WAKO Co.), high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, and cultured with Antibiotic-Antimicotic supplemented medium ([RA + FSK + KCl]), differentiation of β into cells There is promoted, together with increased expression of insulin gene was extended to processes such as neurite cell surface.
δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体(rat anti-Somatostatin;1:300,Chemicon社製、以下同様。)で確認できた。 Also increased expression of δ cell specific somatostatin gene anti somatostatin antibody (rat anti-Somatostatin; 1: 300, Chemicon, Inc., hereinafter the same.) Was confirmed by.
一方、細胞をアストロサイト分化条件下(非特許文献4−6による。)のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF(WAKO社製)及び50 ng/mLのBMP(WAKO社製)を含む培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した(抗Glucagon抗体により確認)。 On the other hand, cells (According to Non-Patent Document 4-6.) Astrocyte differentiation conditions astrocyte differentiation conditions, i.e. 50 ng / mL of LIF (manufactured by WAKO Co.) and 50 ng / mL of BMP (WAKO Co., Ltd.) When cultured using a medium containing, promotes differentiation into α cells, express the Glucagon gene is increased (confirmed by anti-Glucagon antibody). この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。 At this time, it appeared several islet structures, that the expression of some at γ cells also increased was confirmed Immunostaining analysis of Pancreatic Polypeptide gene. γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件(500ng/mL IGF-I(WAKO社製)入りのDME/F12,high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加培地)を用いる。 If you want enhance γ cells containing degree, oligodendrocyte differentiation conditions (500ng / mL IGF-I (WAKO Co., Ltd.) containing a DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added use of the medium).
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、未分化、β細胞誘導、α細胞への誘導が行えること、その条件が神経幹細胞の未分化性の維持(FGF2存在下)、神経分化誘導(RA+FSK+KCl)、アストロサイト分化誘導(グリア細胞誘導;LIF+BMP)条件を疑似する条件で行えることを実証した(図3B)。 Not only the expression of proteins by these antibodies, from RT-PCR using cellular extract RNA, undifferentiated, beta cell induction can be made to the induction of the α cells, maintaining the condition of undifferentiated neural stem cells (FGF2 presence), neuronal differentiation-inducing (RA + FSK + KCl), astrocyte differentiation induction (glial cell-derived; LIF + BMP) demonstrated that perform the condition pseudo conditions (Figure 3B).
さらに、未分化状態ではα細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞の指示マーカーが陰性であることに比較し、分化誘導下では対照的に全ての分化経路マーカーの発現が上昇することから、樹立した細胞が膵臓幹細胞の多能性を保持していることを示した。 Further, since the α cells in an undifferentiated state, beta cells, [delta] cells, an instruction marker for γ cells compared to be negative, in contrast to expression of all differentiation pathway marker under differentiation inducing increases, establishment cells showed that holds the pluripotent pancreatic stem cells. 図3Cの免疫組織染色解析により、δ細胞(ソマトスタチン)は脳神経でのInterneuron(興奮性の神経刺激を抑制する神経)に特異的な分布を示し、δ細胞が神経誘導条件下で発現が上昇する背景が判明した。 Immunohistochemical staining analysis of FIG. 3C, [delta] cells (somatostatin) shows a specific distribution interneurons (nerve inhibit the excitability of nerve stimulation) in brain, [delta] cells expressed neural induction conditions increased background has been found. さらに、γ細胞(Pancreatic polypeptide)は、脳神経でオリゴデンドロサイトのマーカーであるGSTπと疑似する分布を示し、γ細胞がグリア細胞誘導条件下で発現が上昇する背景も判明した。 Furthermore, gamma cells (Pancreatic Polypeptide) showed GSTπ and pseudo distribution which is a marker for oligodendrocytes in brain, gamma cells were also found background expression is increased in glia cells inducing conditions. これらの知見は、脳神経の細胞群(神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞)と膵臓内分泌系の細胞群(膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞)の発現する遺伝子に非常に高い相関が有る学術的意義を示しており、β細胞誘導には、従来の神経促進/誘導薬が転化使用できることを示唆している。 These findings, the expression of brain cell groups (neural stem cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes cells) and pancreatic endocrine cell groups (pancreatic stem cells, beta cells, alpha cells, [delta] cells, gamma cells) gene shows an academic significance very high correlation exists that, the β cell-derived, conventional neural promoting / inducing agent suggests that it can be used conversion. レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子をインシュリンプロモーターの下流に連結したアッセイ系で解析したところ、実際に、RA+FSK+KClという神経分化促進条件のみでなく、RA単独、RA+FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの他の神経分化促進薬剤を用いた場合でも、インシュリンプロモーターの活性が上昇することが、本発明の膵臓幹細胞培養系(神経幹細胞培養用培地中)での培養により確認できた。 When the luciferase gene was analyzed in the assay system that is connected downstream of the insulin promoter as a reporter, in fact, RA + FSK + not only neuronal differentiation promoting conditions of KCl, RA alone, RA + FSK, VPA, 5AzaC, other such Wnt3 even with neuronal differentiation promoting agent, that the activity of the insulin promoter is increased, it was confirmed by culturing pancreatic stem cell culture system of the present invention (neural stem cell culture medium). (図3F)。 (Fig. 3F).

参考例1〜3にあるように、成体膵臓幹細胞(Sox2遺伝子陽性)からはα細胞、β細胞、δ細胞、γ(PP)細胞が分化して形成される。 As in Example 1-3, the adult pancreatic stem cells (Sox2 gene positive) from α cells, beta cells, [delta] cells, gamma (PP) cells are formed by differentiation. 神経幹細胞(Sox2遺伝子陽性)からはアストロサイト細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞の三種が分化して形成される。 Neural stem cells (Sox2 gene positive) astrocytes from the cells, nerve cells, the three types of oligodendrocyte cell is formed by differentiation. 膵臓の膵島を構成する内分泌系の細胞で、インシュリンを産生するβ細胞への分化誘導技術や幹細胞移植は、膵臓ガンや糖尿病への画期的な医療法として期待される。 In endocrine cells constituting pancreatic islet differentiation inducing techniques and stem cell transplantation into β cells producing insulin, it is expected as innovative medical methods for pancreatic cancer and diabetes. 膵臓に存在する幹細胞からβ細胞への分化制御機構は、その転写因子の発現変遷や制御機構が、神経幹細胞からの神経細胞への分化過程と非常に高い相関性を示すことが、我々の解析から明らかになった(図2A、模式図)。 Differentiation control mechanism from the stem cells present in the pancreas β to cells expressing changes and control mechanism of the transcription factor, to exhibit very high correlation with the differentiation process of neural cells from neural stem cells, we analyzed from revealed (Fig. 2A, schematic diagrams).

(実施例2) 成体内の神経幹細胞及び膵臓幹細胞の培養工程と分化工程の類似性 (Example 2) Similarity culturing process and differentiation process of neural stem cells and pancreatic stem cells in the adult
(2−1) 未分化状態を維持した培養 (2-1) cultures were maintained undifferentiated state
Sox2遺伝子は未分化状態を保つ機能をもつが、FGF2というgrowth factor存在下で培養することで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞のいずれもの未分化状態が維持される。 Sox2 gene is has the function to maintain the undifferentiated state, by culturing in growth factor presence of FGF2, undifferentiated state any of neural stem cells and pancreatic stem cells are maintained. 神経幹細胞と膵臓幹細胞を、神経幹細胞を培養する条件で培養し、細胞からtotal RNAを抽出、精製し、RT-PCR(mRNAの発現を調べる分子生物学的手法)を行った結果を図2Bに示す。 The neural stem cells and pancreatic stem cells, neural stem cells were cultured under conditions for culturing, total RNA extracted from the cells, purified, the results of RT-PCR (molecular biological techniques to examine the expression of mRNA) in Figure 2B show. 具体的な培養条件は、DME/F12培地中, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加という条件で、ともに、特殊コート[市販の細胞培養用ディッシュ/プレートを、PORN(poly-L-ornithine)で24時間室温でコート(第1コート)、その後滅菌済み超純水で2回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第2コート液で、37度CO2インキュベーター内で24時間コートしたもの]を施した培養用ディッシュ上で培養した。 Specific culture conditions, in DME / F12 medium, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, with the proviso that Antibiotic-Antimicotic added together, the specially-coated [commercially available cell culture dishes / plates, PORN (poly-L-ornithine) at room temperature for 24 hours with coating (first coating), then washed twice more with sterile ultrapure water, a Laminin second coating solution in PBS, in a 37 ° CO2 incubator They were cultured on a culture dish which has been subjected to] those 24 hours coat. この条件で、両細胞はFGF2というgrowth factor存在下でSox2遺伝子を発現する(図2B、上から2段目)。 In this condition, both cells express Sox2 gene in growth factor presence of FGF2 (Fig. 2B, 2 row from the top).
細胞増殖を上昇させるため、両細胞に対して、10%FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。 To increase the cell proliferation, for both cells, 10% FCS and 100 ng / mL FGF2 and medium for neural stem cell cultures supplemented with, 100 ng / mL FGF2 and added 100 ng / mL EGF2 neural stem cell culture medium, 100 ng / mL FGF2 only in neural stem cell culture medium supplemented with were cell culture. 数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。 It was confirmed that the growth of new cells from all of the conditions after a few days has been started. 一旦増殖を開始させた神経幹細胞については、10%FCSに加えて20ng/mLのFGF2を存在させることで、未分化性を効率よく維持できる。 Once the neural stem cells to initiate the growth, in addition to the 10% FCS by the presence of FGF2 of 20 ng / mL, it can be maintained undifferentiated efficiently. 膵臓幹細胞培地についても最も増殖が促進されたクローンに対し、10%FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養した。 To the most growth was promoted clones for pancreatic stem cell medium and cultured with the addition neural stem cell culture medium with 10% FCS and 100 ng / mL FGF2. 両者とも、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。 Both switched to the addition of only FGF2 to stop the addition of FCS to a week later. なお、神経幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF2を用いても同様に未分化維持に効果があるが、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても効果は見られなかった(図示せず)。 In the case of neural stem cells, is effective similarly to undifferentiated maintained using EGF2 instead of FGF2, even try added to the culture medium of pancreatic stem cells effect was not observed (not shown ).
樹立した成体膵臓幹細胞について、20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地(DME/F12,high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加)で培養し、継代可能であることも確認した(図6、P1)。 For the established adult pancreatic stem cells, addition of 20 ng / mLFGF2 neural stem cell culture medium (DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added) were cultured in, passaged possible it was confirmed that there (Fig. 6, P1).

(2−2) 分化制御機構の解析 (2-2) analysis of differentiation control mechanism
成体神経幹細胞と共に成体膵臓幹細胞が樹立できたため、両者の分化制御機構の解析を行った。 Because adult pancreatic stem cells with adult neural stem cells could be established, we analyzed both the differentiation control mechanism.
多能性を保持した未分化状態に保つことはSox2遺伝子の発現により確認できるので、非特許文献1に記載される公知の神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、樹立した神経幹細胞及び膵臓幹細胞について、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った。 Since keeping the undifferentiated state of holding the pluripotency can be confirmed by expression of Sox2 gene, referring differentiation regulatory control mechanism of the known neural stem cells described in Non-Patent Document 1, the established neural stem cells and pancreatic stem cells for, immunostaining was performed analysis is divided into differentiated state and undifferentiated state.
FGF2存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体(guinea pig anti-Insulin;1:300;Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体(mouse anti-Glucagon;1:300,Immuno社製、以下同様。)を用いる免疫染色法で確認した。 In the presence FGF2, adult pancreatic stem cells, like neural stem cells express Sox2 gene, anti-Sox2 antibody that insulin or α cells β cells express does not express Glucagon gene expression, anti-insulin antibody (guinea pig anti-Insulin; 1:. 300; Sigma Co., hereinafter the same) and anti-Glucagon antibody (mouse anti-Glucagon; 1: 300, immuno Ltd., was confirmed by the following same) immunostaining method using..
次いで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞を神経分化条件下(非特許文献4、5)の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製)を含むDME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加培地([RA+FSK+KCl])を用いて培養すると、β細胞への分化が促進されることが、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRから判明した(図2B)。 Then, neuronal differentiation conditions of neural stem cells and pancreatic stem cells neuronal differentiation conditions (Non-Patent Documents 4 and 5), namely retinoic acid (RA, Sigma) for 1 [mu] M, 5 [mu] M of forskolin (FSK, Sigma) and DME / F12, high glucose containing 40 mM of KCl (WAKO Co.) (1mM L-glutamine), N2 supplement added, and cultured with Antibiotic-Antimicotic supplemented medium ([RA + FSK + KCl]), β cell the differentiation into is promoted it was found from the RT-PCR using the cell extract RNA (Figure 2B). 両成体幹細胞を神経分化に導く条件(RA+FSK+KCl)下で培養すると、Insulin、β−III tubulin、ソマトスタチン遺伝子の発現が上昇する(図2B)。 When both adult stem cells are cultured under conditions (RA + FSK + KCl) leading to neuronal differentiation, Insulin, β-III tubulin, the expression of somatostatin gene is increased (Fig. 2B).
両細胞で、δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体(rat anti-Somatostatin;1:300,Chemicon社製、以下同様。)で確認できた。 In both cell, [delta] cell-specific increase in the expression of the somatostatin gene also anti somatostatin antibody (rat anti-Somatostatin; 1: 300, Chemicon, Inc., hereinafter the same.) Was confirmed by. ソマトスタチンは、膵臓ではδ細胞だが、脳神経系では神経伝達の上で、刺激に対して抑制性の機能を示すinterneuronという神経細胞の一種に相当することが分かった(図2C)。 Somatostatin but δ cells in the pancreas, the central nervous system on neurotransmission, was found to correspond to a type of nerve cells called interneuron showing the inhibitory function to stimulation (Figure 2C).
一方、両細胞をアストロサイト分化条件下(非特許文献4−6による。)のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF(WAKO社製)及び50 ng/mLのBMP (WAKO社製)を含むDME/F12、high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した(抗Glucagon抗体により確認)。 On the other hand, astrocyte differentiation conditions both cell astrocytes differentiating conditions (according to Non-Patent Document 4-6.), I.e. 50 ng / mL of LIF (manufactured by WAKO Co.) and 50 ng / mL of BMP (WAKO Co. ) DME / F12 containing, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, and cultured with Antibiotic-Antimicotic supplemented medium, differentiation α into cells is promoted, the expression of the Glucagon gene is increased (anti Glucagon confirmed by the antibody). この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。 At this time, it appeared several islet structures, that the expression of some at γ cells also increased was confirmed Immunostaining analysis of Pancreatic Polypeptide gene. γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件(500ng/mL IGF-I(WAKO社製)入りのDME/F12, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地)を用いる。 If you want enhance γ cells containing degree, oligodendrocyte differentiation conditions (500ng / mL IGF-I (WAKO Co., Ltd.) containing a DME / F12, high glucose (1mM L-glutamine), N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added use of the medium). このように、両成体幹細胞を、グリア細胞に分化させる条件下(グリア細胞誘導;LIF+BMP)で培養すると、グルカゴン(α細胞のマーカー遺伝子)、GFAP(アストロサイト細胞のマーカー遺伝子)、Pancreatic polypeptide(γ細胞のマーカー遺伝子)という遺伝子が上昇することが分かった(図2B)。 Thus, both adult stem cells, under conditions which differentiate into glial cells (glial cell-derived; LIF + BMP) when cultured in the glucagon (marker gene α cells), GFAP (a marker gene of astrocytes), Pancreatic Polypeptide genes, (marker gene γ cells) was found to be elevated (Figure 2B). Pancreatic polypeptide、膵臓ではγ細胞だが、脳神経系ではオリゴデンドロサイト細胞に特異的なGSTπという抗体で共に染色されることが分かった(図2C)。 Pancreatic Polypeptide, but γ cells in the pancreas, but nervous system were found to be both stained with an antibody that specific GSTπ oligodendrocyte cells (Figure 2C).

(2−3) 神経幹細胞の分化誘導 (2-3) induction of differentiation of neural stem cells
細胞抽出RNAを用いたRT-PCR以外にも、免疫組織染色解析(図2C、図3A〜3D)からも、脳神経の細胞群(神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞)と膵臓内分泌系の細胞群(膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞)の発現する遺伝子に非常に高い相関が有ることが示された。 Besides RT-PCR using cellular extract RNA, immunohistochemical staining analysis (Figure 2C, Figure 3A-3D) from, nerve cell groups (neural stem cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes cells) and pancreatic endocrine cell groups (pancreatic stem cells, beta cells, alpha cells, [delta] cells, gamma cells) can be very high correlation is in the expressed gene was shown. さらに、図3Fに示すように、インシュリンを産生するβ細胞への分化誘導には、従来の神経促進/誘導薬が転化使用できることが分かった。 Furthermore, as shown in FIG. 3F, the induction of differentiation into β cells producing insulin, it was found that the conventional neural promoting / inducing agent can be used conversion. 上述したRA+FSK+KClという神経分化促進条件のみでなく、他の神経分化促進薬剤(RA単独、RA+FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの薬剤)でもインシュリンプロモーターの活性が上昇することが膵臓幹細胞培養系で明らかになった(図3F)。 Not only neuronal differentiation promoting conditions that the above-mentioned RA + FSK + KCl, other neural differentiation promoting agent clearly that the activity of even insulin promoter (RA alone, RA + FSK, VPA, 5AzaC, drugs such as Wnt3) is increased in pancreatic stem cell culture system It became (Fig. 3F).
これは、神経分化を促進する試薬、または神経疾患の治療薬の、膵臓疾患への転化応用の可能性が高いことを示す。 This reagent promotes neuronal differentiation or neurological disease therapeutic agent, indicates an increased likelihood of conversion application to pancreatic disease.

(2−4) 成体膵臓幹細胞の分化制御における、神経再生制御機構との類似性 (2-4) in the differentiation control of adult pancreatic stem cells, similarity to nerve regeneration control mechanism
上記実施例(2−1)で樹立した両幹細胞に対して、さらに詳細な分子制御機構の解析を行った。 For both stem cells established in Example (2-1), and further subjected to detailed analysis of molecular control mechanisms. Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞(GFAP陽性)が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストと言う神経新生細胞(NeuroD1陽性)を産生する物質であるが、このWnt3が膵臓の膵島α細胞(GFAP,Glucagon陽性)で発現していることが分かった(図4A)。 Wnt3 in neurogenesis region in the brain, in secreted proteins astrocytes (GFAP positive) is expressed, neural stem cells The effect begins neurogenesis, producing neurogenesis cells (NeuroD1 positive) say neuroblastoma is a substance, it was found that this Wnt3 is expressed in pancreatic islet α cells (GFAP, Glucagon-positive) (FIG. 4A).
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る(図3C-E)。 Moreover, endocrine system pancreas, there is a very high correlation with brain nervous system, a cell neogenesis in β cells, there is a common point that it is NeuroD1 positive (Fig. 3C-E). NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト-ラット-マウスで保存されている。 On promoter NeuroD1 is, βcatenin / TCF / LEF sequence to which a transcription factor binds recognizes activated by Wnt / βcatenin signaling human - rat - are conserved in mouse. Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が、初期神経誘導条件下(ニューロブラスト産生状態)で起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した(図4B)。 Wnt / βcatenin stabilization Betacatenin proteins that are important in signaling, what is happening in the initial neural induction conditions (neuroblastoma production conditions), was confirmed by Western blotting (Figure 4B).
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した(図4C)。 Furthermore, NeuroD1 genes, Wnt to activate the insulin gene is essential, Wnt3 was confirmed by RT-PCR that leads to activation of both genes (Figure 4C). 図4Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化(試薬)でインシュリン遺伝子の発現が上昇し(Wnt3,GSK3beta-inhibitor)、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化(DnWnt;ドミナントネガティブWnt,βcatenin shRNA)でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。 Figure 4F, Wnt / βcatenin insulin gene expression in activated (reagent) signaling is increased (Wnt3, GSK3beta-inhibitor), in contrast to Wnt / βcatenin inactivation of signaling (DnWnt; dominant negative Wnt, βcatenin shRNA ) shows that the expression of the insulin gene does not occur in.
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化(インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位(E-box))部位へ、直接結合し、クロマチン(染色体)の活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)を誘導する)を導くことが示された(図4D)。 TCF / LEF activation of transcription factor binding sites of chromatin on promoter NeuroD1 (Anti-Acetyl HistoneH3) that is induced by Wnt3, further NeuroD1 activation of the insulin gene (NeuroD1 recognition binding site on the promoter of the insulin gene to (E-box)) site, attached directly induces activation of chromatin (chromosomes) and (Anti-Acetyl HistoneH3)) has been shown to lead to (Figure 4D).
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。 From these facts, together with the control factor to keep the adult pancreatic stem cells in an undifferentiated state, controlled factor in the differentiation control is also, it has been demonstrated a high nerve regeneration control mechanism very commonality from adult neural stem cells.

(実施例3) 神経幹細胞の膵臓への移植応用 (Example 3) porting applications to the pancreas of neural stem cells
膵臓幹細胞からのβ細胞分化制御が、神経幹細胞からの神経細胞分化制御と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、本来学習機能の向上等に必要とされていることなどから、神経幹細胞が膵臓の内分泌系に組み込まれるかどうか(転移分化)、移植実験を行った。 β cell differentiation control from pancreatic stem cells, have a neuronal differentiation control and very high similarity from neural stem cells, insulin also been produced in the brain as well pancreas, etc. to the improvement of the original learning function etc. What is needed, whether neural stem cells are incorporated into the endocrine system of the pancreas (transdifferentiation) were performed transplantation experiments. 移植する神経幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP(蛍光を発するタンパク質)を選択した。 As the neural stem cells to be transplanted can track, it was chosen GFP (protein fluoresce) as a marker. GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた神経幹細胞株を作製した。 GFP expression cassette to produce a neural stem cell lines stably integrated into the genome. 10 7 -10 8個の細胞を、Fisher344成体ラット(7−8週齢)の膵臓にマイクロインジェクションした。 10 7 -10 8 cells were microinjected into the pancreas of Fisher344 adult rats (7-8 weeks old). 3週間飼育後、膵臓を抽出してGFPを発現している神経幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。 After 3 weeks of feeding, the neural stem cell-derived transplanted cells which extract the pancreas expressing GFP, were searched on brain sections were prepared using a microtome. 共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体神経幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った膵臓内分泌系に効率よく取り込まれること、インシュリンを産生するβ細胞に転移分化できることがin vivoで示された(図5A)。 Immunohistochemical staining analysis using a confocal microscope, adult neural stem cells, be efficiently incorporated into the pancreatic endocrine system with very similar differentiation control mechanism in the in vivo that insulin can transition differentiate into β cells producing shows It is (Figure 5A).

(実施例4) 糖尿病等膵臓疾患を標的とした再生医療への応用 (Example 4) Application of diabetes such as pancreatic disease regenerative medicine that target
さらに、糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット(GKラット)の膵臓に移植した。 Furthermore, in order to examine the therapeutic effect on diabetes, were transplanted neural stem cells in the pancreas of type II diabetic model rats (GK rats). 効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い(図5B)、神経幹細胞、ニューロブラスト(神経分化の初期状態)の培養が問題なく行えること、およびコラーゲンシート上でも、インシュリンプロモーター活性が神経分化誘導条件下で、上昇することを確認した(図5B、右グラフ)。 To facilitate efficient transplantation, were cultured on collagen sheet (FIG. 5B), neural stem cells, the culture of neuroblastoma (initial state of neuronal differentiation) can be performed without problems, and also on the collagen sheet, insulin promoter activity in neuronal differentiation-inducing conditions it was confirmed to be elevated (Figure 5B, right graph). この神経幹細胞などを培養したコラーゲンシートを糖尿病のモデルラットの膵臓に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図5Cに示す。 The neural stem cells collagen sheets were cultured and implanted into the pancreas of rats of diabetes, shown in Figure 5C the graph of changes of the blood glucose level. 図5Cから分かるように、神経幹細胞、ニューロブラストを移植した全ての系で、手術後に血糖値の低下が確認された。 As can be seen from FIG. 5C, neural stem cells, in all systems implanted with neuroblastoma, lowering of blood glucose level was observed after surgery. さらに、コラーゲンシートが無い場合に比べ、コラーゲンシート上のニューロブラストを移植したケースが、最も効率の良い血糖値の低下が見られた。 Furthermore, compared to when the collagen sheet is not the case with transplanted neuroblastoma on collagen sheet is decreased the most efficient blood glucose level was observed.
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内(学習機能)と膵臓(血糖値低下)の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、神経幹細胞の糖尿病治療への利用が可能であることが実際に疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。 From research above, and ectodermal neural cells that are distant gap in developmental stage of embryonic pancreatic cells of endodermal found in the brain which require insulin in the adult (learning function) and pancreas (blood sugar level endocrine organs of reduction), to meet the common role of "insulin-producing", and that they are produced from adult stem cells by very similar control mechanism, can be utilized to diabetes treatment of neural stem cells it was demonstrated in in vivo levels it was actually used the disease model animal is.

(参考例4) (成体)膵臓幹細胞の、脳神経(疾患)へ効果的な移植応用 (Reference Example 4) (adult) of pancreatic stem cells, efficient transplantation applications to brain (disease)
膵臓幹細胞が、膵臓内分泌系β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞に分化することに加え、神経細胞と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、学習機能の向上等に必要とされていることなどから、膵臓幹細胞と神経幹細胞との間に互換性がある可能性を想定し、樹立した膵臓幹細胞が脳内神経系に組み込まれるかどうかを調べた。 Pancreatic stem cells, pancreatic endocrine β cells, alpha cells, [delta] cells, in addition to differentiate into γ cells, have a nerve cell and a very high similarity, insulin is also produced in the brain as well as pancreatic cage, whether the like that are needed for improvement of learning function, assuming that there may be compatibility between the pancreatic stem cells and neural stem cells, the established pancreatic stem cells are incorporated into brain nervous system They were examined. 移植する膵臓幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP(蛍光を発するタンパク質)を選択した。 As the pancreatic stem cells to be transplanted can track, it was chosen GFP (protein fluoresce) as a marker. GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた膵臓幹細胞株を作製した。 GFP expression cassette to produce a pancreatic stem cell lines stably integrated into the genome. 10 6 -10 7個の細胞を、Fisher344成体ラット(7−8週齢)の脳海馬領域に、Stereotaxic脳固定装置を用いてマイクロインジェクションした。 10 6 -10 7 cells, in the brain hippocampal region of Fisher344 adult rats (7-8 weeks old), were microinjected with Stereotaxic brain fixation device. 5週間飼育後、脳を抽出してGFPを発現している膵臓幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。 After 5 weeks of feeding, pancreatic stem cells derived from transplanted cells expressing GFP was extracted brains were probed on brain sections were prepared using a microtome. 共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体膵臓幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った脳内の神経系に効率よく取り込まれること、神経細胞に転移分化できることがin vivoで示された(図7)。 Immunohistochemical staining analysis using a confocal microscope, adult pancreatic stem cells, efficiently incorporated is that the nervous system very similar brain differentiation control mechanism, it was shown by the in vivo capable of transferring differentiate into neurons (Figure 7).

(実施例5) 糖尿病等膵臓疾患を標的とした再生医療への応用(長期間試験) (Example 5) Application of diabetes such as pancreatic disease regenerative medicine that target (long term test)
糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット(GKラット)の膵臓に移植した。 To examine the therapeutic effect on diabetes, were transplanted neural stem cells in the pancreas of type II diabetic model rats (GK rats). 前記実施例4と同様に、効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い(図5B、同様)、図5Cの短期間試験で効果的な血糖値低下作用を示したニューロブラスト(神経分化の初期状態)の移植で試験を開始した。 Similarly to Example 4, in order to encourage the efficient transplantation, were cultured on collagen sheet (Fig. 5B, the same), neuroblastoma showing effective blood glucose lowering effect in a short period test of FIG. 5C ( the test was started at the implantation of the initial state) of neuronal differentiation. コラーゲンシート上にニューロブラストを培養し、複数枚数(3シート、t2×10の8乗個の細胞数に最終的に相当)重ねたものを糖尿病のモデルラットの膵臓の膵島部に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図に示す。 The neuroblastoma cultured on a collagen sheet and implanted plurality number of those (3 sheet, finally corresponding to the number of cells 8 th power of t2 × 10) superimposed on the islets of the pancreas of rats of diabetes, blood sugar It is shown in figure graph of transition of values. 図5Cと同様、ニューロブラストを移植した系で、手術後に血糖値の低下が確認された。 Similar to FIG. 5C, with implanted system to neuroblastoma, lowering of blood glucose level was observed after surgery. さらに、この効果は3ヶ月の長期の試験に対しても有用であることが判明した。 Moreover, this effect has been found to be useful also for long-term testing of three months.
以上の研究成果から、成体神経幹細胞の培養系の糖尿病治療への利用が、疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。 From research results above, usage of the treatment of diabetes culture system of adult neural stem cells have been demonstrated in in vivo levels using disease model animals.

Claims (4)

  1. 生体適合性シート表面に配置した成体神経幹細胞と、 RA+FSK、RA+FSK+KCl、 Wnt3a、VPA及び5AzaCから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。 And adult neural stem cells were placed in a biocompatible sheet surface, RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, characterized in that it comprises at least one neuronal differentiation-inducing agent is selected from the VPA and 5AzaC, pancreatic cell regeneration transplantation kit .
  2. 前記成体神経幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、 RA+FSK、RA+FSK+KCl、 Wnt3a、VPA及び5AzaCから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤の存在下で培養され、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の膵臓細胞再生移植用キット。 Said adult neural stem cells, on the advance the biocompatible sheet surface, RA + FSK, RA + FSK + KCl, cultured in the presence of at least one neuronal differentiation-inducing agent is selected Wnt3a, from VPA and 5AzaC, until the β precursor cells characterized in that it is a cell of a state which had been differentiated pancreatic cell regeneration transplantation kit according to claim 1.
  3. 生体適合性シート表面に配置した成体神経幹細胞と、 RA+FSK、RA+FSK+KCl、 Wnt3a、VPA及び5AzaCから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを有効成分として含むことを特徴とする、糖尿病用再生治療用組成物。 And adult neural stem cells were placed in a biocompatible sheet surface, characterized in that it comprises RA + FSK, RA + FSK + KCl, Wnt3a, and at least one neuronal differentiation-inducing agent is selected from the VPA and 5AzaC as an active ingredient, the reproducing diabetes therapeutic compositions.
  4. 前記成体神経幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、 RA+FSK、RA+FSK+KCl、 Wnt3a、VPA及び5AzaCから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤の存在下で培養され、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、請求項3に記載の、糖尿病用再生治療用組成物。 Said adult neural stem cells, on the advance the biocompatible sheet surface, RA + FSK, RA + FSK + KCl, cultured in the presence of at least one neuronal differentiation-inducing agent is selected Wnt3a, from VPA and 5AzaC, until the β precursor cells characterized in that it is a cell of a state which had been differentiated, according to claim 3, diabetes reproducing therapeutic compositions.
JP2010518081A 2008-06-27 2009-06-26 Pancreatic cell regeneration transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes Active JP5294041B2 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008168187 2008-06-27
JP2008168187 2008-06-27
JP2010518081A JP5294041B2 (en) 2008-06-27 2009-06-26 Pancreatic cell regeneration transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes
PCT/JP2009/061770 WO2009157559A1 (en) 2008-06-27 2009-06-26 Pancreatic cell regeneration/transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010518081A JP5294041B2 (en) 2008-06-27 2009-06-26 Pancreatic cell regeneration transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2009157559A1 true JPWO2009157559A1 (en) 2011-12-15
JP5294041B2 true JP5294041B2 (en) 2013-09-18

Family

ID=41444619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010518081A Active JP5294041B2 (en) 2008-06-27 2009-06-26 Pancreatic cell regeneration transplantation kit for pancreatic diseases or diabetes

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5294041B2 (en)
WO (1) WO2009157559A1 (en)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538779A (en) * 1999-02-10 2002-11-19 キュリス インコーポレイテッド Pancreatic progenitor cells, the methods and use for their
JP2005515753A (en) * 2001-05-25 2005-06-02 サイセラ,インコーポレイテッド Stem cell differentiation
JP2005534345A (en) * 2002-07-29 2005-11-17 エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド Multistage process for insulin positive, differentiated glucose responsive cells
JP2007061096A (en) * 2005-08-31 2007-03-15 Lifescan Inc Method to promote cell differentiation
US20070154981A1 (en) * 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
JP2007528702A (en) * 2003-06-27 2007-10-18 エチコン、インコーポレイテッドEthicon,Inc. From most postpartum cells from placental tissue, and methods to create and use them.
JP2008505638A (en) * 2004-07-09 2008-02-28 サイセラ,インコーポレイテッド Method for identifying a factor for the differentiation of definitive endoderm

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001078752A3 (en) * 2000-04-13 2002-05-23 Maria A Micci Treatment of disorders by implanting stem cells and/or progeny thereof into gastrointestinal organs

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538779A (en) * 1999-02-10 2002-11-19 キュリス インコーポレイテッド Pancreatic progenitor cells, the methods and use for their
JP2005515753A (en) * 2001-05-25 2005-06-02 サイセラ,インコーポレイテッド Stem cell differentiation
JP2005534345A (en) * 2002-07-29 2005-11-17 エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド Multistage process for insulin positive, differentiated glucose responsive cells
US20070154981A1 (en) * 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
JP2007528702A (en) * 2003-06-27 2007-10-18 エチコン、インコーポレイテッドEthicon,Inc. From most postpartum cells from placental tissue, and methods to create and use them.
JP2008505638A (en) * 2004-07-09 2008-02-28 サイセラ,インコーポレイテッド Method for identifying a factor for the differentiation of definitive endoderm
JP2007061096A (en) * 2005-08-31 2007-03-15 Lifescan Inc Method to promote cell differentiation

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN7012003560; Biochem Biophys Res Commun Vol.326, No.3, 2005, p.570-577 *
JPN7012003561; 最新医学 Vol.61, No.7, 2006, p.1489-1495 *
JPN7012003562; Cogn Dement Vol.6, No.1, 2007, p.18-24 *

Also Published As

Publication number Publication date Type
JPWO2009157559A1 (en) 2011-12-15 application
WO2009157559A1 (en) 2009-12-30 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ohori et al. Growth factor treatment and genetic manipulation stimulate neurogenesis and oligodendrogenesis by endogenous neural progenitors in the injured adult spinal cord
Pagliuca et al. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro
Kobayashi et al. Wnt4-transformed mouse embryonic stem cells differentiate into renal tubular cells
US20050287127A1 (en) Use of stem cells to generate inner ear cells
US20030032183A1 (en) Stem cell differentiation
US6812027B2 (en) Discovery, localization, harvest, and propagation of an FGF2 and BDNF-responsive population of neural and neuronal progenitor cells in the adult human forebrain
Song et al. Transfection of mesenchymal stem cells with the FGF-2 gene improves their survival under hypoxic conditions.
Osada et al. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction
Nakagomi et al. Endothelial Cells Support Survival, Proliferation, and Neuronal Differentiation of Transplanted Adult Ischemia‐Induced Neural Stem/Progenitor Cells After Cerebral Infarction
Fang et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells
US7642091B2 (en) Human trophoblast stem cells and use thereof
US20050014255A1 (en) Stem cells for clinical and commercial uses
Tomita et al. A Comparison of Neural Differentiation and Retinal Transplantation with Bone Marrow‐Derived Cells and Retinal Progenitor Cells
Garcia et al. Treatment of erectile dysfunction in the obese type 2 diabetic ZDF rat with adipose tissue‐derived stem cells
Xu et al. A zebrafish embryo culture system defines factors that promote vertebrate myogenesis across species
Sakuma et al. Mature, adipocyte derived, dedifferentiated fat cells can differentiate into smooth muscle-like cells and contribute to bladder tissue regeneration
Bachelin et al. Efficient myelin repair in the macaque spinal cord by autologous grafts of Schwann cells
US20030194802A1 (en) Novel methods for the in-vitro identification, isolation and differentiation of vasculogenic progenitor cells
US20030124721A1 (en) Endocrine pancreas differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof
Sugaya Potential use of stem cells in neuroreplacement therapies for neurodegenerative diseases
WO2009137613A2 (en) Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
Kruse et al. Pluripotency of adult stem cells derived from human and rat pancreas
Petropavlovskaia et al. Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells?
Sun et al. Retinal stem/progenitor properties of iris pigment epithelial cells
Borlongan et al. CNS grafts of rat choroid plexus protect against cerebral ischemia in adult rats

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120904

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121102

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130226

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130430

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130528

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130529

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250