JP5283064B2 - New microorganism and method for producing glucosylceramide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新種微生物、及び該微生物を利用するグルコシルセラミドの製造方法に関する。 The present invention relates to a novel microorganism and a method for producing glucosylceramide using the microorganism.
スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴイド塩基（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ ｂａｓｅ）を基本骨格として脂肪酸と糖鎖とが結合したものであり、哺乳類、植物、微生物に存在し（非特許文献１参照）、糖鎖や脂肪酸の炭素数、並びに二重結合や水酸基の有無などの違いに基づく種々の構造が報告されている（非特許文献２参照）。
スフィンゴ糖脂質の構成成分であるセラミド（Ｃｅｒ）は、ヒトの角質層の細胞間脂質の主成分として４０〜６０％を占めており、その親水性部分に水分子を保持することで水分の蒸発を抑えると共に、細菌などの体外刺激物が体内へ侵入することを防止する役割を担っていると考えられている。そして、セラミドは加齢に伴い減少し、しわ、肌荒れの原因となることが報告されている。セラミドや、セラミドにグルコースが付加した構造のグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）は、ヒトの乾燥落屑性皮膚への塗布による水分保持機能改善効果、経口摂取による経皮水分蒸発量の低減効果を有するが報告されており、化粧品や健康食品の原料として注目されている。例えば、セラミドやグルコシルセラミドの日本国内の市場規模は、グルコシルセラミド５％含有の粗抽出物として２００５年では５．８トン、金額にすると約１３．５億円であり、毎年約２０％の伸びが見込まれている。
Glycosphingolipids are those in which a fatty acid and a sugar chain are combined with a sphingoid base as a basic skeleton, and are present in mammals, plants, and microorganisms (see Non-Patent Document 1). Various structures based on the number and the difference in the presence or absence of a double bond or a hydroxyl group have been reported (see Non-Patent Document 2).
Ceramide (Cer), a component of glycosphingolipid, occupies 40-60% as the main component of intercellular lipid in human stratum corneum, and evaporates water by retaining water molecules in its hydrophilic part. It is thought that it plays a role of preventing external stimulants such as bacteria from entering the body. It has been reported that ceramide decreases with age, causing wrinkles and rough skin. Ceramide and glucosylceramide (GlcCer) with a structure in which glucose is added to ceramide have been reported to have an effect of improving the water retention function by applying to human dry desquamating skin and the effect of reducing the amount of transdermal water evaporation by ingestion. It is attracting attention as a raw material for cosmetics and health foods. For example, the market size of ceramide and glucosylceramide in Japan is 5.8 tons in 2005 as a crude extract containing 5% glucosylceramide. Is expected.
従来は、スフィンゴ糖脂質の原料として、セラミドとガラクトースとが結合した構造を有するガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）が使用され、これを豊富に含む牛脳が抽出源として利用されてきた。しかし、２００１年の狂牛病の大流行を受け、牛脳由来物質に関する安全性評価の確立が未だ不十分であることから、抽出源として他の生物を利用することが求められるようになってきた。化学合成品は、安全性の観点から食品素材としての利用が制限されるからである。このような背景から、現在では米糠や小麦胚芽などの植物が、グルコシルセラミドの主な抽出源として利用されている。 Conventionally, galactosylceramide (GalCer) having a structure in which ceramide and galactose are combined has been used as a raw material for glycosphingolipid, and bovine brain rich in this has been used as an extraction source. However, following the 2001 epidemic of mad cow disease, the establishment of safety assessment for bovine brain-derived substances is still insufficient, and it has become necessary to use other organisms as an extraction source. It was. This is because the use of chemically synthesized products as food materials is restricted from the viewpoint of safety. Against this background, plants such as rice bran and wheat germ are now used as the main source of glucosylceramide extraction.
しかし、植物の乾燥単位質量あたりから抽出可能なグルコシルセラミドの量は非常に少なく、例えば、精米からは０．００２５質量％、小麦からは０．０２１質量％程度にとどまる（非特許文献３参照）。したがって、抽出・精製工程に多大なコストと労力を要する。そのため、グルコシルセラミドの市場価格は、３％含有品で２００〜３００円／ｇ、すなわち、グルコシルセラミド純品に換算して６７００〜１００００円／ｇとなっており、非常に高価である。そこで、安価なグルコシルセラミドの製造技術の開発が強く望まれている。 However, the amount of glucosylceramide that can be extracted from the dry unit mass of the plant is very small, for example, 0.0025% by mass from milled rice and about 0.021% by mass from wheat (see Non-Patent Document 3). . Therefore, much cost and labor are required for the extraction / purification process. Therefore, the market price of glucosylceramide is 200 to 300 yen / g for a 3% -containing product, that is, 6700 to 10,000 yen / g in terms of pure glucosylceramide, which is very expensive. Therefore, development of a manufacturing technique for inexpensive glucosylceramide is strongly desired.
このような中、生育速度が速く、大量培養による物質の大量生産が可能な微生物の利用が注目されている。そして、グルコシルセラミド生産能を有する微生物の探索も開始されており（非特許文献４参照）、これまでに、例えば、クルブロマイセス ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、デバリオマイセス ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉ）等、いくつかの酵母がグルコシルセラミド生産能を有していることが報告されている。これら酵母は、培養時間が２４〜４８時間程度と短いこと、植物と比較してグルコシルセラミドの抽出が容易であること、消費者に好印象で捉えられていること、等の理由から、グルコシルセラミドの抽出源として期待される。
しかし、グルコシルセラミド生産能を有する酵母は、まだ十分に探索されているとは言えず、より生産性の高いグルコシルセラミドの製造方法の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、グルコシルセラミド生産能を有する新種微生物、及び該微生物を利用するグルコシルセラミドの製造方法を提供することを課題とする。
However, it cannot be said that yeast having glucosylceramide-producing ability has been sufficiently searched, and development of a production method for glucosylceramide with higher productivity is strongly desired.
This invention is made | formed in view of the said situation, and makes it a subject to provide the manufacturing method of the glucosylceramide using the new species microorganisms which have glucosylceramide production ability, and this microorganisms.
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５７１）である。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法である。
To solve the above problem,
The invention described in 請 Motomeko 1 is a Candida (Candida) spp JPCCY0024 strain (NITE P-571).
Invention of Claim 2 is a manufacturing method of the glucosylceramide which has the process of culture | cultivating the microorganisms of Claim 1 .
本発明によれば、高品質のグルコシルセラミドを簡便且つ大量に製造できる。その結果、安価なグルコシルセラミドを提供できる。 According to the present invention, high-quality glucosylceramide can be produced easily and in large quantities. As a result, an inexpensive glucosylceramide can be provided.
以下、本発明について詳しく説明する。
なお、以下において、「キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５７１）」のことを「ＪＰＣＣＹ００２４」と略記することがある。
また、本発明において「グルコシルセラミド」とは、例えば、下記式（１）で表されるように、スフィンゴシン骨格（ａ）中のアミノ基と、脂肪酸骨格（ｂ）中のカルボキシ基とがアミド結合を形成した構造を有するセラミド骨格（ａ＋ｂ）中のうち、前記スフィンゴシン骨格（ａ）の分子末端の１級水酸基に相当する水酸基が、グルコースの１位の炭素原子に結合した構造を有する化合物の総称を指すものとする。したがって、「グルコシルセラミド」には、前記スフィンゴシン骨格（ａ）に由来する炭化水素基の種類や、前記脂肪酸骨格（ｂ）に由来する炭化水素基の種類、あるいは構造式中のいずれかの基の立体配置等が異なる複数の化合物を含む。
The present invention will be described in detail below.
In the following, “Candida genus JPCCY0024 strain (NITE P-571)” may be abbreviated as “JPCCY0024”.
In the present invention, “glucosylceramide” means, for example, an amide bond between an amino group in the sphingosine skeleton (a) and a carboxy group in the fatty acid skeleton (b) as represented by the following formula (1): Of ceramide skeleton (a + b) having a structure in which a hydroxyl group corresponding to the primary hydroxyl group at the molecular end of the sphingosine skeleton (a) is bonded to the carbon atom at the 1-position of glucose Shall be pointed to. Therefore, “glucosylceramide” includes the type of hydrocarbon group derived from the sphingosine skeleton (a), the type of hydrocarbon group derived from the fatty acid skeleton (b), or any group in the structural formula. A plurality of compounds having different configurations and the like are included.
＜ＪＰＣＣＹ００２４の獲得＞
ＪＰＣＣＹ００２４は、以下の手順に従って獲得した。
まず、下記手順で分離培地を作製した。
分離培地：酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、人工海水３７ｇ、クロラムフェニコール０．３ｇ、ストレプトマイシン０．１５ｇ、アンピシリン０．１ｇ、粉末寒天１２ｇを純水１Ｌに添加し、１２１℃で１０分間滅菌処理した後、適量を滅菌済み平板に分取して、寒天平板を作製した。
次いで、奄美大島の原生林から採取した土壌を１００倍量（質量比）の生理食塩水で激しく撹拌し、上澄みを前記分離培地に塗布し、２５℃でインキュベーションを行なった。植菌後３日目に確認できたコロニーを滅菌済み爪楊枝で釣菌し、新たな酵母培地に植菌し、生育を繰り返すことで単菌化を行った。
<Acquisition of JPCCY0024>
JPCCY0024 was obtained according to the following procedure.
First, a separation medium was prepared according to the following procedure.
Separation medium: 5 g of yeast extract, 20 g of glucose, 10 g of peptone, 37 g of artificial seawater, 0.3 g of chloramphenicol, 0.15 g of streptomycin, 0.1 g of ampicillin and 12 g of powdered agar are added to 1 L of pure water, and 10 at 121 ° C. After sterilizing for a minute, an appropriate amount was dispensed onto a sterilized flat plate to prepare an agar flat plate.
Next, the soil collected from the virgin forest of Amami Oshima was vigorously stirred with 100 times (mass ratio) of physiological saline, and the supernatant was applied to the separation medium and incubated at 25 ° C. Colonies that were confirmed on the third day after inoculation were fished with a sterilized toothpick, inoculated into a new yeast medium, and unicellularized by repeating growth.
＜ＪＰＣＣＹ００２４の同定＞
ＪＰＣＣＹ００２４の同定は、株式会社テクノスルガに委託して実施した。そして取得した検体を用いて、「簡易形態観察」、「生理・生化学的性状試験（以下、生理性状試験と略記する）」、「２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の同定」を行った。なお、供試菌体としては、下記条件で培養した菌株を使用した。
［培養条件］
培地；Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ−ｍａｌｔ ａｇａｒ（ＹＭ ａｇａｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
培養温度；温度耐性試験を除き２５℃
培養期間；１週間〜１ヶ月間
その他の培養条件；好気培養
<Identification of JPCCY0024>
JPCCY0024 was identified by entrusting Technosuruga Corporation. Then, using the obtained specimen, “simple morphology observation”, “physiological / biochemical property test (hereinafter abbreviated as physiological property test)”, and “identification of 26S rDNA-D1 / D2 base sequence” were performed. In addition, as a test microbial cell, the strain cultured on the following conditions was used.
[Culture conditions]
Medium; Yeast extract-mal agar (YM agar) (Becton Dickinson)
Culture temperature: 25 ° C except for temperature tolerance test
Culture period: 1 week to 1 month Other culture conditions: Aerobic culture
［簡易形態観察］
以下のものを使用して観察を行なった。
顕微鏡；光学顕微鏡ＢＸ５１（オリンパス株式会社製）（微分干渉観察）
マウント液；滅菌蒸留水
（１） 巨視的観察（コロニー観察）
ＹＭ平板培地上で２５℃の温度条件下、培養７日間でコロニーは表１に示す性状を示した。
[Simple morphological observation]
Observations were made using:
Microscope: Optical microscope BX51 (manufactured by Olympus Corporation) (differential interference observation)
Mount solution: Sterilized distilled water (1) Macroscopic observation (colony observation)
The colonies showed the properties shown in Table 1 on the YM plate medium under the temperature condition of 25 ° C. and cultured for 7 days.
（２） 微視的観察（形態性状観察）
ＹＭ平板培地上で２５℃の温度条件下、培養開始１０日目に、栄養細胞は球形から広楕円形であり、増殖は多極出芽によることが確認された。培養開始から１ヶ月経過した平板で、有性生殖器官の形成は認められなかった。
(2) Microscopic observation (morphological property observation)
On the 10th day from the start of culture under the temperature condition of 25 ° C. on a YM plate medium, it was confirmed that the vegetative cells were spherical to wide oval and that the proliferation was due to multipolar budding. Formation of sexual reproductive organs was not observed on the plate after one month from the start of culture.
［生理性状試験］
試験方法は、Ｂａｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｆｅｌｌ（１９９８）に準拠し、培養は温度耐性試験を除き２５℃で行った。結果を表２〜６に示す。なお、表中、「＋」は反応が陽性であることを、「−」は反応が陰性であることを、「Ｗ（ｗｅｅｋ）」は弱い陽性反応であることをそれぞれ示す。また、「Ｓ（ｓｌｏｗ）」は試験開始後に２週間から３週間以上かけて徐々に陽性反応が認められたことを、「Ｌ（ｌａｔｅｎｔ）」は試験開始２週間以降に急速に陽性反応が認められたことをそれぞれ示す。
[Physiological property test]
The test method is described in Barnet et al. (2000) and Kurtzman and Fell (1998), culturing was performed at 25 ° C. except for the temperature tolerance test. The results are shown in Tables 2-6. In the table, “+” indicates a positive reaction, “−” indicates a negative reaction, and “W (weak)” indicates a weak positive reaction. “S (slow)” showed a positive reaction gradually over 2 to 3 weeks after the start of the test, and “L (latent)” showed a positive reaction rapidly after 2 weeks of the test. Each of them.
［２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の同定］
ＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの各操作は、下記の各プロトコールに基づいて行った。
ＤＮＡ抽出；物理的破壊及びＭａｒｍｕｒ（１９６１）の改変法
ＰＣＲ；ｐｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
サイクルシークエンス；ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
プライマー；ＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ３及びＮＬ４（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３）
シークエンス；ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
配列決定；ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）
相同性検索及び簡易分子系統解析；アポロン２．０（ソフトウェア、テクノスルガ・ラボ）、アポロンＤＢ−ＦＵ２．０（データベース、テクノスルガ・ラボ）、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）
[Identification of 26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence]
Each operation from DNA extraction to cycle sequence was performed based on the following protocols.
DNA extraction; physical disruption and modification of Marmur (1961) PCR; puReTaq Ready-To-Go PCR beads (Amersham Biosciences)
Cycle sequence; BigDye Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems)
Primers; NL1, NL2, NL3 and NL4 (O'Donnell, 1993)
Sequence; ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System (Applied Biosystems)
Sequencing; ChromaPro 1.4 (Technium Pty Ltd)
Homology search and simple molecular phylogenetic analysis: Apollon 2.0 (software, Technosuruga Lab), Apollon DB-FU2.0 (database, Technosuruga Lab), international base sequence database (GenBank / DDBJ / EMBL)
ＪＰＣＣＹ００２４の２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列を同定した結果、配列番号１に示す塩基配列であることが判った。 As a result of identifying the base sequence of 26S rDNA-D1 / D2 of JPCCY0024, it was found to be the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
アポロンＤＢ−ＦＵ２．０に対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、ＪＰＣＣＹ００２４の２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌系アナモルフ（無性時代）酵母の一種であるキャンディダ ヴァルディヴィアナ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ）の基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５）と８塩基の相違で９８．６％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ等の国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果でも、ＪＰＣＣＹ００２４の２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、キャンディダ ヴァルディヴィアナの基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５及びＤＱ４３８２２０）に対し８塩基の相違を有し、９８．６％の相同率を示した。一般に酵母の２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を使用した解析では、基準株との相違塩基数が０〜３塩基であれば、同種又は姉妹種である可能性が高く、相違が１％以上である場合には、別種である可能性が高いとされている（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｎｅｔｔ，１９９８）。本同定試験では、９９％以上の相同率を示す既知種が存在しなかったことから、ＪＰＣＣＹ００２４は新種である可能性が示唆された。図１は、アポロンＤＢ−ＦＵ２．０に対する相同性検索で得られた上位１０塩基配列を基に作成した系統樹であり、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダ属の種で構成される系統群に含まれたことから、キャンディダ属に帰属する可能性が示唆された。また、ＪＰＣＣＹ００２４が含まれる系統群を構成するキャンディダ属の種において、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダ ヴァルディヴィアナの基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５）とクラスターを形成し、その信頼性を表すブートストラップ値は１００％で支持されたことから、ＪＰＣＣＹ００２４と最も近縁な菌種は、キャンディダ ヴァルディヴィアナであると考えられた。しかし、ＪＰＣＣＹ００２４と、キャンディダ ヴァルディヴィアナの基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５）には距離が存在し、異なる分子系統学的位置を示した。以上より、２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダ ヴァルディヴィアナに近縁なキャンディダ属の新種であると推定された。 As a result of BLAST (Altschul et al., 1997) homology search against Apollon DB-FU2.0, the 26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence of JPCCY0024 is a Candida which is a kind of Ascomycena anamorph (asexual era) yeast. It showed 98.6% homology with a difference of 8 bases from the reference strain NRRLY-7791 T (accession number: U45835) of Candida valdiviana. As a result of homology search against international base sequence databases such as GenBank / DDBJ / EMBL, the 26S rDNA-D1 / D2 base sequence of JPCCY0024 is the reference strain NRRLY-7791 T of Candida Valdiviana (accession numbers: U45835 and DQ438220). ) With a difference of 8 bases and a homology rate of 98.6%. In general, in the analysis using the 26S rDNA-D1 / D2 base sequence of yeast, if the number of bases different from the reference strain is 0 to 3 bases, it is highly likely that they are the same species or sister species, and the difference is 1% or more. In some cases, it is highly likely that they are different species (Kurtzman and Robnett, 1998). In this identification test, there was no known species having a homology rate of 99% or more, suggesting that JPCCY0024 may be a new species. FIG. 1 is a phylogenetic tree created based on the top 10 base sequences obtained by homology search for Apollon DB-FU2.0, and JPCCY0024 was included in the lineage group composed of Candida species. This suggested the possibility of belonging to the genus Candida. In addition, in the Candida species constituting the lineage group including JPCCY0024, JPCCY0024 forms a cluster with Candida Valdiviana's reference strain NRRLY-7791 T (accession number: U45835) and represents its reliability. Since the bootstrap value was supported at 100%, it was considered that Candida Valdiviana was the closest species to JPCCY0024. However, there was a distance between JPCCY0024 and Candida Valdiviana reference strain NRRLY-7791 T (accession number: U45835), indicating different molecular phylogenetic positions. From the above, in the analysis result of the 26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence, JPCCY0024 was estimated to be a new species of Candida genus closely related to Candida Valdiviana.
また、簡易形態観察の結果、ＪＰＣＣＹ００２４の栄養細胞は、球形から広楕円形であり、栄養増殖は多極出芽により、子嚢及び子嚢胞子の形成は認められず、ことが確認され、キャンディダ属の形態学的特徴を示した。
２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ００２４が帰属すると推定したキャンディダ属には、「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ，ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ第４版（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｆｅｌｌ，１９９８）」において１６３種が記載されており、これら１６３種は生理性状に基づき１２のグループに分けられている。生理性状試験の結果、ＪＰＣＣＹ００２４は、炭素源としてイノシトールを資化することから、「キャンディダ属生理性状グループＩ（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｆｅｌｌ，１９９８）」に分類される推定された。一方、２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ００２４が近縁であると推定したキャンディダ ヴァルディヴィアナもまた、「キャンディダ属生理性状グループＩ」に分類されている。さらに、「キャンディダ属生理性状グループＩ」に分類されている１０種の区別に有効とされる生理・生化学的特徴において、ＪＰＣＣＹ００２４は、ラフィノース及び硝酸塩を資化し、Ｌ−ラムノース及びエリスリトールを資化せず、２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果においてＪＰＣＣＹ００２４が近縁であると推定したキャンディダ ヴァルディヴィアナの特徴と良く一致した。その一方で、「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ，ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ第４版（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｆｅｌｌ，１９９８）」及び「ＹＥＡＳＴＳ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ第３版（Ｂａｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）」を参考に、ＪＰＣＣＹ００２４とキャンディダ ヴァルディヴィアナについて、その他の生理・生化学的特徴を比較したところ、キャンディダ ヴァルディヴィアナは、グリセロール、コハク酸、クエン酸を資化し、ビタミン欠乏培地において生育性を示さないとされているのに対し、ＪＰＣＣＹ００２４は、グリセロール、コハク酸、クエン酸を資化せず、ビタミン欠乏培地において生育し、異なる特徴を示した。したがって、生理性状試験の結果において、ＪＰＣＣＹ００２４は、２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において近縁である推定したキャンディダ ヴァルディヴィアナと類似した性状を示すものの、グリセロール、コハク酸及びクエン酸の資化能、並びにビタミン要求性において異なる特徴を示すことが明らかとなり、２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果を支持した。
Moreover, as a result of simple morphological observation, it was confirmed that JPPCCY0024 vegetative cells were spherical to wide oval, and that vegetative growth was not caused by multipolar budding, and ascocysts and ascospore formation were not observed. The morphological characteristics of the genus were shown.
In the analysis result of 26S rDNA-D1 / D2 base sequence, 163 species are described in “The Yeasts, a taxonomic study 4th edition (Kurtzman and Fell, 1998)” for the genus Candida to which JPCCY0024 is supposed to belong. These 163 types are divided into 12 groups based on physiological properties. As a result of the physiological property test, JPCCY0024 was inferred to be classified into “Kurtzman and Fell, 1998” because it assimilates inositol as a carbon source. On the other hand, Candida Valdiviana that JPCCY0024 is estimated to be closely related in the analysis result of the 26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence is also classified as “Candida genus physiological property group I”. Furthermore, in the physiological and biochemical characteristics that are effective for distinguishing 10 species classified as “Candida Physiological Properties Group I”, JPCCY0024 uses raffinose and nitrate, and uses L-rhamnose and erythritol. The results of the analysis of the 26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence were in good agreement with the characteristics of Candida valdiviana that JPCCY0024 was estimated to be closely related to. On the other hand, with reference to “The Yeasts, a taxonomic study 4th edition (Kurtzman and Fell, 1998)” and “YEASTS: Characteristics and identity 3rd edition (Barnet et al., 2000)”, YPC and JPC Compared to other physiological and biochemical characteristics of Viana, Candida Valdiviana is said to assimilate glycerol, succinic acid, and citric acid and show no growth in a vitamin-deficient medium. JPCCY0024 did not assimilate glycerol, succinic acid or citric acid, grew in vitamin-deficient medium and showed different characteristics. Therefore, in the results of the physiological property test, JPCCY0024 shows similar properties to the estimated Candida valdiviana, which is closely related in the analysis result of 26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence, but glycerol, succinic acid and citric acid. It became clear that it showed different characteristics in assimilation ability and vitamin requirement, and supported the analysis result of 26S rDNA-D1 / D2 base sequence.
以上より、「簡易形態観察」、「生理性状試験」及び「２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析」の結果から、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダ ヴァルディヴィアナに近縁であり、キャンディダ属の新種であると推定された。そして、Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）に基づく分類学的位置から、ＪＰＣＣＹ００２４は、子嚢菌系アナモルフ（無性時代）酵母であるキャンディダ ヴァルディヴィアナ グリンブ．＆ ヤロウ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ Ｇｒｉｎｂ．＆ Ｙａｒｒｏｗ）に近縁であり、キャンディダ属の新種であると推定された。 From the above results, JPCCY0024 is closely related to Candida valdiviana and is a new species of Candida genus based on the results of “simple morphology observation”, “physiological property test”, and “26S rDNA-D1 / D2 nucleotide sequence analysis”. It was estimated. And Kirk et al. From the taxonomic position based on (2001), JPCCY0024 is a Candida vardiviana glymb. & Yarrow (Candida valdiviana Grimb. & Yarrow) is closely related and presumed to be a new species of the genus Candida.
ＪＰＣＣＹ００２４は、平成２０年５月１４日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−５７１として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。 JPCCY0024 has been entrusted to the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation, under the accession number NITE P-571 as of May 14, 2008.
本発明の微生物は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５７１）である。そして本発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５７１）が属する種に属する微生物、及び２６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有し、グルコシルセラミド生産能を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を包含する。このような微生物は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥ Ｐ−５７１）と同種の微生物であると考えられる。
また、本発明のグルコシルセラミドの製造方法は、上記本発明の微生物を培養する工程を有するものである。
The microorganism of the present invention is Candida sp. JPCCY0024 strain (NITE P-571). The present invention relates to a microorganism belonging to the species to which the Candida genus JPCCY0024 strain (NITE P-571) belongs, and the nucleotide sequence of 26S rDNA-D1 / D2 is 96% or more of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. It includes microorganisms belonging to the genus Candida that have homology and have the ability to produce glucosylceramide. Such a microorganism is considered to be the same type of microorganism as the Candida genus JPCCY0024 strain (NITE P-571).
Moreover, the manufacturing method of the glucosylceramide of this invention has the process of culture | cultivating the said microorganisms of this invention.
上記微生物を培養して得られる培養物中には、該微生物により生産されたグルコシルセラミドが含有される。該培養物は、そのまま目的の用途に使用しても良いし、適宜任意の精製操作を行ってから使用しても良い。
ＪＰＣＣＹ０００４等のキャンディダ属に属する微生物は、公知の手法で培養すれば良い。ＪＰＣＣＹ０００４であれば、例えば、上記の獲得手順に記載した分離培地や、酵母エキス、バクト トリプトン（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ）、グルコース等を含有する培地を使用すると良い。なかでも糖類としては、前記の資化性を有するものであればいずれも使用し得るが、グルコースが特に好ましい。
The culture obtained by culturing the microorganism contains glucosylceramide produced by the microorganism. The culture may be used as it is for the intended purpose, or may be used after performing an arbitrary purification operation.
A microorganism belonging to the genus Candida such as JPCCY0004 may be cultured by a known method. In the case of JPCCY0004, for example, a separation medium described in the above acquisition procedure, or a medium containing yeast extract, Bacto Trypton, glucose or the like may be used. Among them, any saccharide can be used as long as it has the above-mentioned assimilation property, but glucose is particularly preferable.
また、培地中には、所定濃度の塩類を含有させることが好ましく、該塩類としては塩化ナトリウムが好ましい。塩類の濃度は０．１〜３質量％であることが好ましく、０．３〜２．５質量％であることがより好ましく、２質量％程度であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、グルコシルセラミドの生産性が一層向上する。 The medium preferably contains a predetermined concentration of salt, and sodium chloride is preferred as the salt. The concentration of the salt is preferably 0.1 to 3% by mass, more preferably 0.3 to 2.5% by mass, and particularly preferably about 2% by mass. By setting it as such a range, the productivity of glucosylceramide further improves.
培地は中性〜弱アルカリ性であることが好ましい。具体的には、培地のｐＨは６．５〜１０．５であることが好ましく、７．０〜１０．３であることがより好ましく、１０程度であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、グルコシルセラミドの生産性が一層向上する。 The medium is preferably neutral to weakly alkaline. Specifically, the pH of the medium is preferably 6.5 to 10.5, more preferably 7.0 to 10.3, and particularly preferably about 10. By setting it as such a range, the productivity of glucosylceramide further improves.
培地は固形培地及び液体培地のいずれでも良い。
培養時の温度は、１８〜３６℃であることが好ましく、２３〜３３℃であることがより好ましい。
培養時間は、培養温度にもよるが、１２時間以上であることが好ましく、２０時間以上であることがより好ましい。培養時間の上限は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良いが、通常は、５０時間程度で十分である。
培養方法は、静置培養、振とう培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すれば良い。そして、好気培養することが好ましい。
The medium may be either a solid medium or a liquid medium.
The temperature during the culture is preferably 18 to 36 ° C, and more preferably 23 to 33 ° C.
Although the culture time depends on the culture temperature, it is preferably 12 hours or longer, more preferably 20 hours or longer. The upper limit of the culture time is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, but usually about 50 hours is sufficient.
The culture method may be appropriately selected depending on the type of medium, such as stationary culture, shaking culture, and stirring culture. And it is preferable to carry out aerobic culture.
生産されたグルコシルセラミドは、公知の手法で培養物から分離すれば良い。例えば、培養物から遠心分離等の手法でＪＰＣＣＹ００２４等の菌体を回収し、必要に応じて洗浄後、凍結乾燥等の手法で乾燥菌体を得る。そして、得られた乾燥菌体をホモジナイズし、次いで、有機溶媒／水の混合溶媒を使用して、有機溶媒中にグルコシルセラミドを抽出する。さらに、溶媒を除去することでグルコシルセラミドが得られる。ホモジナイズは、クロロホルム／メタノール混合溶媒等の有機溶媒とアルカリ性水溶液とを併用して行うことが好ましく、抽出時の有機溶媒も同様のものを使用することが好ましい。 The produced glucosylceramide may be separated from the culture by a known method. For example, bacterial cells such as JPCCY0024 are collected from the culture by a technique such as centrifugation, washed as necessary, and dried cells are obtained by a technique such as freeze-drying. Then, the obtained dried cells are homogenized, and then glucosylceramide is extracted into the organic solvent using a mixed solvent of organic solvent / water. Furthermore, glucosylceramide is obtained by removing the solvent. Homogenization is preferably performed using an organic solvent such as a chloroform / methanol mixed solvent and an alkaline aqueous solution in combination, and the same organic solvent is preferably used during extraction.
従来の微生物のうち、例えば、クルブロマイセス ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＮＢＲＣ １０９０株は、高いグルコシルセラミド生産性を有することが知られている。そして、ＪＰＣＣＹ００２４は、クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株よりもさらに高いグルコシルセラミド生産性を有する。これは、ＪＰＣＣＹ００２４が、クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株と同等の増殖能を有し、さらに、クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株よりも、一菌体あたりのグルコシルセラミド生産性に優れることが理由であると推測される。 Among conventional microorganisms, for example, Kluyveromyces lactis NBRC 1090 strain is known to have high glucosylceramide productivity. JPCCY0024 has a higher productivity of glucosylceramide than that of Kurbromyces lactis NBRC 1090 strain. It is speculated that this is because JPCCY0024 has a growth ability equivalent to that of Klubromyces lactis NBRC 1090 strain and is more excellent in productivity of glucosylceramide per cell than Kulbromyces lactis NBRC 1090 strain. .
ＪＰＣＣＹ００２４は種々のグルコシルセラミドを生産する。そのうち生産量が多い代表的なものとして、下記式（１）で表されるものが例示できる。
そして、ＪＰＣＣＹ００２４が生産するその他のグルコシルセラミドとしては、下記式（１）中のスフィンゴシン骨格に由来する炭化水素基の種類が異なるもの、脂肪酸骨格に由来する炭化水素基の種類が異なるもの、あるいは構造式中のいずれかの基の立体配置が異なるものが例示できる。ここで、「炭化水素基の種類が異なる」とは、例えば、炭素数、側鎖の有無、側鎖の位置、二重結合の有無、二重結合の位置等が異なることを指す。
クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株も、同様のグルコシルセラミドを生産することが知られている。
JPCCY0024 produces a variety of glucosylceramides. Among them, a representative one with a large production amount is exemplified by the following formula (1).
As other glucosylceramides produced by JPCCY0024, those having different types of hydrocarbon groups derived from the sphingosine skeleton in the following formula (1), those having different types of hydrocarbon groups derived from the fatty acid skeleton, or structures Examples in which the configuration of any group in the formula is different can be given. Here, “the types of hydrocarbon groups are different” means that, for example, the number of carbon atoms, presence / absence of a side chain, position of a side chain, presence / absence of a double bond, position of a double bond, and the like are different.
It is known that the Kulbromyces lactis NBRC 1090 strain also produces the same glucosylceramide.
ＪＰＣＣＹ００２４は、酵母の一種であり、容易に大量培養でき、しかもグルコシルセラミドの生産性が高い。また、生産されたグルコシルセラミドの分離も容易である。したがって、本発明によれば、高品質のグルコシルセラミドを簡便且つ大量に製造でき、安価なグルコシルセラミドを提供できる。 JPCCY0024 is a kind of yeast, which can be easily cultured in large quantities, and has a high productivity of glucosylceramide. Moreover, separation of the produced glucosylceramide is easy. Therefore, according to the present invention, high-quality glucosylceramide can be produced easily and in large quantities, and inexpensive glucosylceramide can be provided.
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
＜ＪＰＣＣＹ００２４を使用したグルコシルセラミドの製造＞
（グルコシルセラミドの定量）
酵母エキス１質量％、バクト ペプトン（Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）２質量％、グルコース２質量％、バクト アガー（Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ）１質量％を含有する固形培地を使用して２日間、試料を静置培養し、コロニー形成が確認された酵母（アルカリ耐性株）１８株を選別した。これらの中には、ＪＰＣＣＹ００２４が含まれていた。
次いで、酵母エキス１質量％、バクト トリプトン（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ）２質量％、グルコース２質量％、塩化ナトリウム２質量％を含有し、ｐＨを１０に調整した液体培地５０ｍｌを使用して、５００ｍｌの坂口フラスコ中で上記１８株の酵母を３０℃、１２０ｒｐｍの条件で４８時間振とう培養した。振とう培養後、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで菌体を回収し、さらに蒸留水で２回洗浄した。得られた菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体の質量を測定した。
得られた乾燥菌体１００ｍｇに対して、クロロホルム／メタノール（１／１， ｖ／ｖ） １ｍｌと、０．８Ｍ水酸化カリウム水溶液１ｍｌを加え、５分間超音波によりホモジナイズした後、４２℃で３０分間インキュベートした。次いで、クロロホルム２．５ｍｌと水１．１２ｍｌを加えて混合した後、有機層を分取し、エバポレーターを使用して４０℃で減圧乾固後、凍結乾燥した。得られたサンプルをクロロホルム／メタノール（２／１， ｖ／ｖ）１００μｌに溶解させ、そのうち１０μｌをＴＬＣ分析し、オルシノール硫酸試薬（硫酸／水／エタノール（５／１３／２７，ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶液４５ｍｌにオルシノール０．１ｇを溶解させた試薬）を噴霧後、ホットプレートを使用して１１０℃で５分間加熱し、呈色させた。この時、ＴＬＣの展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／水（６５／１６／２，ｖ／ｖ／ｖ）を使用した。さらに、グルコシルセラミドの標準物質として、下記式（２）で表される大豆由来の粉末グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）をクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）に溶解させたものを使用した。また、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅを使用してスポットの大きさとその呈色の平均強度を求め、これらを掛け合わせてスポットの呈色強度を算出することで、検量線を作成した。そして、この検量線を使用して、乾燥菌体１ｇあたりから抽出可能なグルコシルセラミドを定量した。
[Example 1]
<Manufacture of glucosylceramide using JPCCY0024>
(Quantification of glucosylceramide)
The sample was statically cultured for 2 days using a solid medium containing 1% by mass of yeast extract, 2% by mass of Bacto Peptone, 2% by mass of glucose, and 1% by mass of Bacto Agar. 18 strains (alkaline resistant strains) confirmed to form were selected. Among these was JPCCY0024.
Subsequently, a 500 ml Sakaguchi flask was prepared using 50 ml of a liquid medium containing 1% by weight of yeast extract, 2% by weight of Bacto Trypton, 2% by weight of glucose and 2% by weight of sodium chloride and adjusted to pH 10. Among them, the 18 strains of yeast were cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 48 hours. After shaking culture, the cells were collected by centrifugation at 8000 rpm for 1 minute, and further washed twice with distilled water. The obtained microbial cells were freeze-dried, and the mass of the dried microbial cells was measured.
To 100 mg of the obtained dried cells, 1 ml of chloroform / methanol (1/1, v / v) and 1 ml of 0.8 M aqueous potassium hydroxide solution were added and homogenized with ultrasonic waves for 5 minutes, and then 30 ° C. at 42 ° C. Incubated for minutes. Next, 2.5 ml of chloroform and 1.12 ml of water were added and mixed, and then the organic layer was separated, dried under reduced pressure at 40 ° C. using an evaporator, and then lyophilized. The obtained sample was dissolved in 100 μl of chloroform / methanol (2/1, v / v), 10 μl of which was subjected to TLC analysis, and orcinol sulfate reagent (sulfuric acid / water / ethanol (5/13/27, v / v / v After spraying a reagent in which 0.1 g of orcinol was dissolved in 45 ml of the mixed solution of), the mixture was heated at 110 ° C. for 5 minutes using a hot plate to cause coloration. At this time, chloroform / methanol / water (65/16/2, v / v / v) was used as a developing solvent for TLC. Furthermore, as a standard substance for glucosylceramide, a soybean-derived powdered glucosylceramide (Avanti polar lipids) represented by the following formula (2) dissolved in chloroform / methanol (2/1, v / v) was used. . In addition, a calibration curve was created by calculating the spot intensity and the average intensity of the coloration using the image analysis software Scion Image, and calculating the color intensity of the spot by multiplying them. Then, using this calibration curve, glucosylceramide extractable from 1 g of dried cells was quantified.
定量結果より、ＪＰＣＣＹ００２４の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり４．５ｇであり、ＪＰＣＣＹ００２４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．７２ｍｇであることが確認された。以上より、ＪＰＣＣＹ００２４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり３．２ｍｇであることが確認された。 From the quantitative results, the amount of dry cells of JPCCY0024 is 4.5 g per liter of culture solution, and the content of glucosylceramide represented by the above formula (1) per 1 g of JPCCY0024 dry cells is 0.72 mg. Was confirmed. From the above, it was confirmed that the productivity of glucosylceramide represented by the above formula (1) of JPCCY0024 is 3.2 mg per liter of culture solution.
（グルコシルセラミドの同定）
得られたグルコシルセラミドの構造を、下記二種類の手法で決定した。
（１）ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
グルコシルセラミドの標準物質として、前記式（２）で表される大豆由来の粉末グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）を使用し、検出条件を最適化した。
具体的には、前記大豆由来グルコシルセラミドをクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）に溶解させ、濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調整し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、正イオンモードの条件で、ＥＳＩ−ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析では、衝突エネルギーを３０％から７０％まで５％間隔で増大させ、そのスペクトルパターンから、グルコシルセラミドの構造を最も正確に反映したスペクトルが得られるエネルギーを決定することで、検出条件を最適化した。
(Identification of glucosylceramide)
The structure of the obtained glucosylceramide was determined by the following two methods.
(1) ESI-MS / MS
As a standard substance of glucosylceramide, powdery glucosylceramide derived from soybean (Avanti polar lipids) represented by the formula (2) was used, and the detection conditions were optimized.
Specifically, the soybean-derived glucosylceramide is dissolved in chloroform / methanol (2/1, v / v), the concentration is adjusted to 0.1 mg / ml, the flow rate is 1.0 ml / min, and the conditions for positive ion mode. Then, ESI-MS and ESI-MS / MS analysis were performed. In the ESI-MS / MS analysis, the collision energy is increased from 30% to 70% at 5% intervals, and from the spectrum pattern, the energy that gives the spectrum that most accurately reflects the structure of glucosylceramide is determined. The detection conditions were optimized.
（２）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
上記グルコシルセラミド定量時に調製したサンプル２０μｌを使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。分析には、前記大豆由来のグルコシルセラミドと、下記式（３）で表されるグルコシルセラミドＣ１２β−Ｄ−ＧｌｕｃｏｓｙｌＣｅｒａｍｉｄｅ（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）の化学合成品を使用した。カラムとしてはＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｏｎｄｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩ．Ｄ×２５０ｍｍＬ）を使用した。また、移動層Ａとして５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル／メタノール／酢酸（９７／２／１，ｖ／ｖ／ｖ）、移動層Ｂとして５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノール／酢酸（９９／１，ｖ／ｖ／ｖ）を使用し、下記グラジエント条件（Ａ．Ｈ．Ｍｅｒｒｉｌｌ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，２００５参照）で、移動層の流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとし、正イオンモードで検出を行った。
グラジエント条件：０％Ｂ（０分）−０％Ｂ（５分）−１０％Ｂ（７．５分）−１０％Ｂ（１２分）−１８％Ｂ（１６分）−１８％Ｂ（２２分）−１００％Ｂ（２６分）−停止（２６．０１分）。「％」はいずれも「容量％」を示す。
ＭＳ／ＭＳ分析の親イオンとしてはナトリウム付加物のイオンを選択し、衝突エネルギーを４０％に設定した。最適化した検出条件に基づいて対象酵母由来の脂質を含むサンプル２０μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
(2) LC-MS / MS
LC-MS analysis was performed using 20 μl of the sample prepared at the time of glucosylceramide determination. For the analysis, a chemically synthesized product of the soybean-derived glucosylceramide and glucosylceramide C12β-D-Glucosyl Ceramide (Avanti polar lipids) represented by the following formula (3) was used. As the column, Aminopropyl-bonded silica gel column (4.6 mm ID × 250 mm L) was used. Further, acetonitrile / methanol / acetic acid (97/2/1, v / v / v) containing 5 mM ammonium acetate as the moving layer A, and methanol / acetic acid (99/1, v / v containing 5 mM ammonium acetate as the moving layer B). / V), and the following gradient conditions (see A. H. Merrill Jr. et al., 2005), the flow rate of the moving bed was 1.0 ml / min, and detection was performed in the positive ion mode.
Gradient conditions: 0% B (0 minutes)-0% B (5 minutes)-10% B (7.5 minutes)-10% B (12 minutes)-18% B (16 minutes)-18% B (22 Min) —100% B (26 min) —stop (26.01 min). “%” Indicates “volume%”.
A sodium adduct ion was selected as the parent ion for MS / MS analysis, and the collision energy was set to 40%. Based on the optimized detection conditions, 20 μl of a sample containing lipids from the target yeast was subjected to LC-MS / MS analysis.
［比較例１］
＜クルブロマイセス ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＮＢＲＣ １０９０株を使用したグルコシルセラミドの製造＞
ＪＰＣＣＹ００２４の代わりに、クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株を使用したこと以外は、実施例１と同様にグルコシルセラミドを製造し、得られたグルコシルセラミドの構造を確認した。クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した。
その結果、本菌株の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり４．８ｇであり、本菌株の乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．４２ｍｇであることが確認された。以上より、本菌株の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり２．０ｍｇであることが確認された。
[Comparative Example 1]
<Production of glucosylceramide using Kluyveromyces lactis NBRC 1090 strain>
Glucosylceramide was produced in the same manner as in Example 1 except that the Krbromyces lactis NBRC 1090 strain was used instead of JPCCY0024, and the structure of the obtained glucosylceramide was confirmed. Krbromyces lactis NBRC 1090 strain was obtained from National Institute of Technology and Evaluation.
As a result, the dry cell amount of this strain was 4.8 g per liter of the culture solution, and the content of glucosylceramide represented by the above formula (1) per 1 g of dry cells of this strain was 0.42 mg. It was confirmed that there was. From the above, it was confirmed that the productivity of glucosylceramide represented by the formula (1) of the present strain was 2.0 mg per 1 L of the culture solution.
上記結果より、ＪＰＣＣＹ００２４は、クルブロマイセス ラクチス ＮＢＲＣ １０９０株よりもグルコシルセラミドの生産性が高いことが確認できた。 From the above results, it was confirmed that JPCCY0024 has a higher productivity of glucosylceramide than that of Kurbromyces lactis NBRC 1090 strain.
本発明は、化粧品や健康食品の製造に利用可能である。 The present invention can be used for the production of cosmetics and health foods.
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