JP5250790B2 - Differentiation regulator and self-renewal regulator - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の分化制御及び自己再生制御に関する。 The present invention relates to cell differentiation control and self-renewal control.
ヘパラン硫酸は、極めて多くの種類の細胞の表面に存在する多糖であり、グリコサミノグリカンの一種である。かかる多糖は、ヘキスロン酸（HexA）残基（D-グルクロン酸（GlcA）又はL-イズロン酸（IdoA）残基）とN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）残基の二糖の繰り返し構造（4GlcAβ1/IdoAα1→4GlcNAcα1→）を基本骨格（ヘパリン骨格）とし、基本的にはそのヘキスロン酸残基の2位水酸基の一部及びN-アセチルグルコサミン残基の2位アミノ基又は6位水酸基の一部に硫酸基が置換しているグリコサミノグリカンである。 Heparan sulfate is a polysaccharide that exists on the surface of numerous types of cells and is a type of glycosaminoglycan. Such a polysaccharide has a disaccharide repeating structure (4GlcAβ1 / IdoAα1) of hexuronic acid (HexA) residue (D-glucuronic acid (GlcA) or L-iduronic acid (IdoA) residue) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) residue. → 4GlcNAcα1 →) as the basic skeleton (heparin skeleton). Basically, sulfuric acid is added to the 2-position hydroxyl group of the hexuronic acid residue and the 2-position amino group or 6-position hydroxyl group of the N-acetylglucosamine residue. Glycosaminoglycans with substituted groups.
ヘパラン硫酸の合成に関係する酵素としては、EXT1、EXT2などが存在することが従来知られており（非特許文献１、非特許文献２）、これらをコードする遺伝子も解明されていた（EXT1：非特許文献３、EXT2：非特許文献４）。
As enzymes related to the synthesis of heparan sulfate, EXT1, EXT2 and the like have been conventionally known (Non-patent
ヘパラン硫酸は、細胞表面で信号伝達に関与していることは知られていたが（非特許文献５など）、かかる信号が、細胞の分化を制御することは知られておらず、従って、ヘパラン硫酸の発現制御が、細胞の分化制御に役立つことは知られておらず、またそのようなことを示唆する事実も存在しない。
Heparan sulfate has been known to be involved in signal transduction on the cell surface (Non-patent
また、ヘパラン硫酸が細胞や組織の自己再生に関与していることは、知られておらず、ヘパラン硫酸の発現制御が自己再生の制御につながることを示唆する事実も存在しない。 In addition, it is not known that heparan sulfate is involved in self-renewal of cells and tissues, and there is no fact suggesting that regulation of heparan sulfate expression leads to self-renewal control.
細胞の分化を制御することができれば、例えば胚性幹細胞（Embryonic Stem Cell：以下「ES細胞」と略記する）の分化制御により再生医療のための材料を効率よく提供することが可能になると考えられるが、かかる分化制御を効率的に且つ効果的に行うための薬剤はこれまでに存在していなかった。 If cell differentiation can be controlled, for example, it will be possible to efficiently provide materials for regenerative medicine by controlling the differentiation of embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as “ES cells”). However, there has not been a drug for efficiently and effectively performing such differentiation control.
すなわち、ES細胞を再生医療に使用するためには通常の発生段階を経ることが必要と考えられ、倫理上の問題からES細胞を再生医療に使用すること自体の道が閉ざされつつあった。 That is, in order to use ES cells in regenerative medicine, it is considered necessary to go through a normal developmental stage, and the use of ES cells in regenerative medicine itself has been closed due to ethical problems.
ES細胞の分化を制御する薬剤が得られれば、かかる懸念は払拭され、ES細胞を特定の組織へ分化させることを検討することが可能となり、ES細胞を再生医療へ応用することが可能となると考えられる。 If a drug that controls the differentiation of ES cells is obtained, such concerns will be dispelled, and it will be possible to consider differentiating ES cells into specific tissues, and it will be possible to apply ES cells to regenerative medicine. Conceivable.
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意検討をした結果、驚くべきことに糖転移酵素の発現を制御することで、細胞の分化、自己再生を制御することができることを見いだし、本発明を完成した。 As a result of intensive studies for solving the above problems, the present inventors have surprisingly found that cell differentiation and self-renewal can be controlled by controlling the expression of glycosyltransferase. Completed the invention.
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記(a)〜(c)のいずれかの塩基配列からなるｓｉＲＮＡを発現するベクターを有効成分として含有する分化制御剤。
(a)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列
(b)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列
(c)(a)又は(b)の配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列
（２）下記(a)〜(c)のいずれかの塩基配列からなるｓｉＲＮＡを発現するベクターを有効成分として含有する自己再生制御剤。
(a)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列
(b)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列
(c)(a)又は(b)の配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列
The gist of the present invention is as follows.
(1) A differentiation regulator comprising, as an active ingredient, a vector that expresses siRNA having any one of the following base sequences (a) to (c).
(a) A base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
(b) a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(c) a base sequence having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases in the sequence of (a) or (b) (2) From any of the base sequences of (a) to (c) below A self-renewal control agent comprising a siRNA-expressing vector as an active ingredient.
(a) A base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
(b) a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(c) A nucleotide sequence having one or several base substitutions, deletions, insertions or rearrangements in the sequence (a) or (b)
本発明により新規な分化制御剤及び自己再生制御剤が提供される。 The present invention provides a novel differentiation regulator and self-renewal regulator.
以下、発明を実施するための最良の形態により、本発明を詳説する。
１．本発明分化制御剤
本発明分化制御剤は、糖転移酵素をコードする遺伝子の発現を制御する核酸を、有効成分として含有することを特徴とする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail according to the best mode for carrying out the invention.
1. The differentiation regulator of the present invention The differentiation regulator of the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a nucleic acid that controls the expression of a gene encoding a glycosyltransferase.
かかる糖転移酵素としては、グリコサミノグリカンの合成に関与する糖転移酵素であることが好ましい。そのような糖転移酵素としては、例えばXylT-I（Gotting, C. et al, J.Mol.Biol., 2000, 304, 517-528）、GalT-I（Okajima, T. et al, J.Biol.Chem., 1999, 274, 22915-22918）、GalT-II（Bai, X. et al, J.Biol.Chem., 2001, 276, 48189-48195）、GlcAT-I（Kitagawa, H. et al., J.Biol.Chem.,1998, 273, 6615-6618）等が例示される。 Such a glycosyltransferase is preferably a glycosyltransferase involved in the synthesis of glycosaminoglycan. Examples of such glycosyltransferases include XylT-I (Gotting, C. et al, J. Mol. Biol., 2000, 304, 517-528) and GalT-I (Okajima, T. et al, J. Biol. Chem., 1999, 274, 22915-22918), GalT-II (Bai, X. et al, J. Biol. Chem., 2001, 276, 48189-48195), GlcAT-I (Kitagawa, H. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 6615-6618) and the like.
かかる糖転移酵素の中でも、特にヘパラン硫酸の合成に関与していること酵素、すなわち、グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンを糖に転移する酵素が好ましく、殊にEXT1及びEXT2が挙げられ、EXT1がもっとも好ましい。 Among such glycosyltransferases, enzymes that are particularly involved in the synthesis of heparan sulfate, that is, enzymes that transfer glucuronic acid and N-acetylglucosamine to sugar are preferred, particularly EXT1 and EXT2, with EXT1 being the most preferable.
本発明分化制御剤の有効成分である核酸は、特に上述の酵素の発現を抑制し、ヘパラン硫酸の合成を抑制する働きを有する核酸であることが好ましい。 The nucleic acid that is an active ingredient of the differentiation regulator of the present invention is particularly preferably a nucleic acid having a function of suppressing the expression of the above-described enzyme and suppressing the synthesis of heparan sulfate.
このようなEXT1の発現を制御する核酸としては、配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列からなる核酸、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列からなる核酸が例示され、更にこれらの塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列も例示される。また、これらの核酸に相補的な塩基配列からなる核酸でも本発明分化制御剤に使用することができる。なお、本発明分化制御剤における「数個」とは、構成する塩基全数の20%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば4個以下）、より好ましくは10%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば2個以下）の整数を表す。
また、上述の核酸に相補的な塩基配列からなる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も、本発明分化制御剤に使用することができる。なお、「ストリンジェントな条件下」とは、50%ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、5×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、0.5% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性サケ精子DNA100μg/ml存在下、42℃の条件下及びこれと実質的に同一の条件下などが例示される。すなわちストリンジェントな条件とは、通常の遺伝子のハイブリダイゼーションに用いられる条件であり、ノザンブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼーションを用いたスクリーニング等に使用される条件であれば、ここにいう「ストリンジェントな条件下」に包含される。
Examples of the nucleic acid that controls the expression of EXT1 include a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 and a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, examples of these base sequences include base sequences having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases. Also, nucleic acids having a base sequence complementary to these nucleic acids can be used for the differentiation regulator of the present invention. Note that “several” in the differentiation regulator of the present invention means less than 20% of the total number of bases (that is, 4 or less if the nucleic acid consists of 21 bases), more preferably less than 10% (that is, 21). 2 or less) in the case of nucleic acids consisting of the above bases.
In addition, a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a base sequence complementary to the above-described nucleic acid can also be used for the differentiation regulator of the present invention. “Stringent conditions” means 50% formamide, 5 × SSPE (sodium chloride / sodium phosphate / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) buffer), 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS ( Examples include sodium dodecyl sulfate), denatured salmon sperm DNA in the presence of 100 μg / ml, conditions at 42 ° C. and substantially the same conditions. In other words, stringent conditions are those used for normal gene hybridization, and are those used for screening using Northern blot, Southern blot, hybridization, etc. Included below.
なお、本発明における「核酸」とは、デオキシリボ核酸、リボ核酸の両者を含む語として使用し、かかる核酸は１本鎖であると２本鎖であるとを問わず、いずれも包含するものとする。 In the present invention, the term “nucleic acid” is used as a term including both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid, and the nucleic acid includes both a single strand and a double strand. To do.
本発明分化制御剤の有効成分となる核酸は好ましくは、配列番号１の塩基配列の塩基番号1954乃至1974の塩基配列に対し、遺伝子解析用コンピュータプログラムGENETYX-MAC（ソフトウェア開発社製）を用いて算出して８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。 The nucleic acid serving as an active ingredient of the differentiation regulator of the present invention is preferably prepared by using the gene analysis computer program GENETYX-MAC (manufactured by Software Development Co., Ltd.) for the base sequence of base numbers 1954 to 1974 of the base sequence of SEQ ID NO: 1. It has a calculated base sequence of 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
かかる本発明分化制御剤の有効成分となる核酸の合成は、当業者であれば、本明細書注で開示された配列の情報に基づいて、適宜既存技術を用いて行うことができる。 A person skilled in the art can synthesize a nucleic acid as an active ingredient of the differentiation regulator of the present invention, using appropriate existing techniques as appropriate based on the sequence information disclosed in this specification.
２．本発明分化制御方法
本発明分化制御方法は、対象となる細胞に対して糖転移酵素の遺伝子の発現を制御する核酸を導入し、対象となる細胞の分化の進行度を制御する方法である。
2. The Differentiation Control Method of the Present Invention The differentiation control method of the present invention is a method for controlling the degree of differentiation of a target cell by introducing a nucleic acid that controls the expression of a glycosyltransferase gene into the target cell.
本発明分化制御方法における「対象となる細胞」とは、未分化な細胞又は脱分化した細胞であって、分化を制御したい細胞であればいずれでも使用することが可能である。かかる細胞の例としては胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等が例示されるが、その中でも特に胚性幹細胞が好ましい。かかる細胞の由来としては、哺乳動物であればいずれでもよく、その中でも特にヒト、イヌ、ネコ、サル、ネズミ、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジが好ましい。 The “target cell” in the differentiation control method of the present invention is an undifferentiated cell or a dedifferentiated cell, and any cell that wants to control differentiation can be used. Examples of such cells include embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells and the like, among which embryonic stem cells are particularly preferable. Such cells may be derived from any mammal, and humans, dogs, cats, monkeys, mice, rats, cows, horses, pigs, goats, and sheep are particularly preferable.
本発明分化制御方法における糖転移酵素とは、グリコサミノグリカンの合成に関与する糖転移酵素であることが好ましい。そのような糖転移酵素としては、例えばXylT-I（Gotting, C. et al, J.Mol.Biol., 2000, 304, 517-528）、GalT-I（Okajima, T. et al, J.Biol.Chem., 1999, 274, 22915-22918）、GalT-II（Bai, X. et al, J.Biol.Chem., 2001, 276, 48189-48195）、GlcAT-I（Kitagawa, H. et al., J.Biol.Chem.,1998, 273, 6615-6618）等が例示される。 The glycosyltransferase in the differentiation control method of the present invention is preferably a glycosyltransferase involved in the synthesis of glycosaminoglycan. Examples of such glycosyltransferases include XylT-I (Gotting, C. et al, J. Mol. Biol., 2000, 304, 517-528) and GalT-I (Okajima, T. et al, J. Biol. Chem., 1999, 274, 22915-22918), GalT-II (Bai, X. et al, J. Biol. Chem., 2001, 276, 48189-48195), GlcAT-I (Kitagawa, H. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 6615-6618) and the like.
かかる糖転移酵素の中でも、特にヘパラン硫酸の合成に関与していること酵素、すなわち、グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンを糖に転移する酵素が好ましく、殊にEXT1及びEXT2が挙げられ、EXT1がもっとも好ましい。 Among such glycosyltransferases, enzymes that are particularly involved in the synthesis of heparan sulfate, that is, enzymes that transfer glucuronic acid and N-acetylglucosamine to sugar are preferred, particularly EXT1 and EXT2, with EXT1 being the most preferable.
かかる糖転移酵素の遺伝子の発現を制御する核酸とは、特に上述の酵素の発現を抑制し、ヘパラン硫酸の合成を抑制する働きを有する核酸であることが好ましい。 Such a nucleic acid that controls the expression of a glycosyltransferase gene is particularly preferably a nucleic acid that functions to suppress the expression of the above-mentioned enzyme and suppress the synthesis of heparan sulfate.
このようなEXT1の発現を制御する核酸としては、配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列からなる核酸、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列からなる核酸が例示され、更にこれらの塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列も例示される。また、これらの核酸に相補的な塩基配列からなる核酸でも本発明分化制御方法に使用することができる。なお、本発明分化制御方法における「数個」とは、構成する塩基全数の20%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば4個以下）、より好ましくは10%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば2個以下）の整数を表す。 Examples of the nucleic acid that controls the expression of EXT1 include a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 and a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, examples of these base sequences include base sequences having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases. Also, nucleic acids having a base sequence complementary to these nucleic acids can be used in the differentiation control method of the present invention. In the differentiation control method of the present invention, “several” means less than 20% of the total number of bases (that is, 4 or less for a nucleic acid consisting of 21 bases), more preferably less than 10% (that is, 21). 2 or less) in the case of nucleic acids consisting of the above bases.
また、上述の核酸に相補的な塩基配列からなる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も、本発明分化制御方法に使用することができる。なお、「ストリンジェントな条件下」とは、50%ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、5×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、0.5% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性サケ精子DNA100μg/ml存在下、42℃の条件下及びこれと実質的に同一の条件下などが例示される。すなわちストリンジェントな条件とは、通常の遺伝子のハイブリダイゼーションに用いられる条件であり、ノザンブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼーションを用いたスクリーニング等に使用される条件であれば、ここにいう「ストリンジェントな条件下」に包含される。 A nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a base sequence complementary to the above-described nucleic acid can also be used in the differentiation control method of the present invention. “Stringent conditions” means 50% formamide, 5 × SSPE (sodium chloride / sodium phosphate / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) buffer), 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS ( Examples include sodium dodecyl sulfate), denatured salmon sperm DNA in the presence of 100 μg / ml, conditions at 42 ° C. and substantially the same conditions. In other words, stringent conditions are those used for normal gene hybridization, and are those used for screening using Northern blot, Southern blot, hybridization, etc. Included below.
なお、本発明における「核酸」とは、デオキシリボ核酸、リボ核酸の両者を含む語として使用し、かかる核酸は１本鎖であると２本鎖であるとを問わず、いずれも包含するものとする。 In the present invention, the term “nucleic acid” is used as a term including both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid, and the nucleic acid includes both a single strand and a double strand. To do.
本発明分化制御方法に使用する核酸は好ましくは、配列番号１の塩基配列の塩基番号1954乃至1974の塩基配列に対し、遺伝子解析用コンピュータプログラムGENETYX-MAC（ソフトウェア開発社製）を用いて算出して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。 The nucleic acid used in the differentiation control method of the present invention is preferably calculated using the gene analysis computer program GENETYX-MAC (manufactured by Software Development Co., Ltd.) for the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1954 to 1974 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Having a base sequence having a homology of 95% or more.
このような核酸の対象となる細胞への導入は、適宜ベクターに核酸を結合して行うことができる。なお、ベクターへの導入に際して、核酸の機能を損なわない限りにおいて、例えば制限酵素断片を連結したり、又は核酸の末端領域の一部を切断してベクターへの導入を行ったとしても、当業者であれば本発明分化制御方法の目的が達成されることは容易である。 Such nucleic acid can be introduced into a target cell by appropriately binding the nucleic acid to a vector. As long as the function of the nucleic acid is not impaired upon introduction into the vector, for example, even if a restriction enzyme fragment is ligated or a part of the terminal region of the nucleic acid is cleaved and introduced into the vector, those skilled in the art If so, it is easy to achieve the object of the differentiation control method of the present invention.
かかるベクターとしては、本発明分化制御方法を適用する対象の細胞で発現するベクターである限りにおいて特に限定はされず、当業者であれば目的の細胞に合わせて適宜選択して使用することが容易である。 Such a vector is not particularly limited as long as it is a vector expressed in a target cell to which the differentiation control method of the present invention is applied, and those skilled in the art can easily select and use it appropriately according to the target cell. It is.
３．本発明自己再生制御剤
本発明自己再生制御剤は、糖転移酵素をコードする核酸の発現を制御する核酸を、有効成分として含有することを特徴とする。
3. Self-regeneration control agent of the present invention The self-regeneration control agent of the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a nucleic acid that controls expression of a nucleic acid encoding a glycosyltransferase.
本発明自己再生制御剤の有効成分となる核酸は、上述した本発明分化制御剤の有効成分となる核酸と同じである。 The nucleic acid that is the active ingredient of the self-renewal control agent of the present invention is the same as the nucleic acid that is the active ingredient of the differentiation control agent of the present invention described above.
かかる糖転移酵素としては、グリコサミノグリカンの合成に関与する糖転移酵素であることが好ましい。そのような糖転移酵素としては、例えばXylT-I（Gotting, C. et al, J.Mol.Biol., 2000, 304, 517-528）、GalT-I（Okajima, T. et al, J.Biol.Chem., 1999, 274, 22915-22918）、GalT-II（Bai, X. et al, J.Biol.Chem., 2001, 276, 48189-48195）、GlcAT-I（Kitagawa, H. et al., J.Biol.Chem.,1998, 273, 6615-6618）等が例示される。 Such a glycosyltransferase is preferably a glycosyltransferase involved in the synthesis of glycosaminoglycan. Examples of such glycosyltransferases include XylT-I (Gotting, C. et al, J. Mol. Biol., 2000, 304, 517-528) and GalT-I (Okajima, T. et al, J. Biol. Chem., 1999, 274, 22915-22918), GalT-II (Bai, X. et al, J. Biol. Chem., 2001, 276, 48189-48195), GlcAT-I (Kitagawa, H. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 6615-6618) and the like.
かかる糖転移酵素の中でも、特にヘパラン硫酸の合成に関与していること酵素、すなわち、グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンを糖に転移する酵素が好ましく、殊にEXT1及びEXT2が挙げられ、EXT1がもっとも好ましい。 Among such glycosyltransferases, enzymes that are particularly involved in the synthesis of heparan sulfate, that is, enzymes that transfer glucuronic acid and N-acetylglucosamine to sugar are preferred, particularly EXT1 and EXT2, with EXT1 being the most preferable.
本発明自己再生制御剤の有効成分である核酸は、特に上述の酵素の発現を抑制し、ヘパラン硫酸の合成を抑制する働きを有する核酸であることが好ましい。 The nucleic acid which is an active ingredient of the self-renewal control agent of the present invention is preferably a nucleic acid having a function of suppressing the expression of the above-mentioned enzyme and suppressing the synthesis of heparan sulfate.
このようなEXT1の発現を制御する核酸としては、配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列からなる核酸、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列からなる核酸が例示され、更にこれらの塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列も例示される。また、これらの核酸に相補的な塩基配列からなる核酸でも本発明自己再生制御剤に使用することができる。なお、本発明自己再生制御剤における「数個」とは、構成する塩基全数の20%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば4個以下）、より好ましくは10%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば2個以下）の整数を表す。 Examples of the nucleic acid that controls the expression of EXT1 include a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 and a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, examples of these base sequences include base sequences having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases. In addition, nucleic acids having a base sequence complementary to these nucleic acids can also be used for the self-renewal control agent of the present invention. The “several” in the self-renewal control agent of the present invention is less than 20% of the total number of bases (that is, 4 or less for nucleic acids consisting of 21 bases), more preferably less than 10% (that is, 21 In the case of a nucleic acid consisting of one base, it represents an integer of 2 or less).
また、上述の核酸に相補的な塩基配列からなる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も、本発明分化制御剤に使用することができる。なお、「ストリンジェントな条件下」とは、50%ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、5×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、0.5% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性サケ精子DNA100μg/ml存在下、42℃の条件下及びこれと実質的に同一の条件下などが例示される。すなわちストリンジェントな条件とは、通常の遺伝子のハイブリダイゼーションに用いられる条件であり、ノザンブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼーションを用いたスクリーニング等に使用される条件であれば、ここにいう「ストリンジェントな条件下」に包含される。 In addition, a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a base sequence complementary to the above-described nucleic acid can also be used for the differentiation regulator of the present invention. “Stringent conditions” means 50% formamide, 5 × SSPE (sodium chloride / sodium phosphate / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) buffer), 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS ( Examples include sodium dodecyl sulfate), denatured salmon sperm DNA in the presence of 100 μg / ml, conditions at 42 ° C. and substantially the same conditions. In other words, stringent conditions are those used for normal gene hybridization, and are those used for screening using Northern blot, Southern blot, hybridization, etc. Included below.
なお、本発明における「核酸」とは、デオキシリボ核酸、リボ核酸の両者を含む語として使用し、かかる核酸は１本鎖であると２本鎖であるとを問わず、いずれも包含するものとする。 In the present invention, the term “nucleic acid” is used as a term including both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid, and the nucleic acid includes both a single strand and a double strand. To do.
本発明分化制御剤の有効成分となる核酸は好ましくは、配列番号１の塩基配列の塩基番号1954乃至1974の塩基配列に対し、遺伝子解析用コンピュータプログラムGENETYX-MAC（ソフトウェア開発社製）を用いて算出して８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。 The nucleic acid serving as an active ingredient of the differentiation regulator of the present invention is preferably prepared by using the gene analysis computer program GENETYX-MAC (manufactured by Software Development Co., Ltd.) for the base sequence of base numbers 1954 to 1974 of the base sequence of SEQ ID NO: 1. It has a calculated base sequence of 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
かかる本発明自己再生制御剤の有効成分となる核酸の合成は、当業者であれば、本明細書注で開示された配列の情報に基づいて、適宜既存技術を用いて行うことができる。 A person skilled in the art can synthesize a nucleic acid as an active ingredient of the self-renewal control agent of the present invention based on the sequence information disclosed in this specification, using existing techniques as appropriate.
４．本発明自己再生制御方法
本発明自己再生制御方法は、対象となる細胞に対して糖転移酵素の遺伝子の発現を制御する核酸を導入し、対象となる細胞の自己再生の進行度を制御する方法である。
4). Self-regeneration control method of the present invention The self-regeneration control method of the present invention is a method of introducing a nucleic acid that controls the expression of a glycosyltransferase gene into a target cell and controlling the degree of self-renewal of the target cell. It is.
本発明自己再生制御方法は、対象となる細胞に対して糖転移酵素の遺伝子の発現を制御する核酸を導入し、対象となる細胞の分化の進行度を制御する方法である。 The self-renewal control method of the present invention is a method for controlling the degree of differentiation of a target cell by introducing a nucleic acid that controls the expression of a glycosyltransferase gene into the target cell.
本発明自己再生制御方法における「対象となる細胞」とは、未分化な細胞又は脱分化した細胞であって、分化を制御したい細胞であればいずれでも使用することが可能である。かかる細胞の例としては胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等が例示されるが、その中でも特に胚性幹細胞が好ましい。かかる細胞の由来としては、哺乳動物であればいずれでもよく、その中でも特にヒト、イヌ、ネコ、サル、ネズミ、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジが好ましい。 The “target cell” in the self-renewal control method of the present invention is an undifferentiated cell or a dedifferentiated cell, and any cell that wants to control differentiation can be used. Examples of such cells include embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells and the like, among which embryonic stem cells are particularly preferable. Such cells may be derived from any mammal, and humans, dogs, cats, monkeys, mice, rats, cows, horses, pigs, goats, and sheep are particularly preferable.
本発明自己再生制御方法における糖転移酵素とは、グリコサミノグリカンの合成に関与する糖転移酵素であることが好ましい。そのような糖転移酵素としては、例えばXylT-I（Gotting, C. et al, J.Mol.Biol., 2000, 304, 517-528）、GalT-I（Okajima, T. et al, J.Biol.Chem., 1999, 274, 22915-22918）、GalT-II（Bai, X. et al, J.Biol.Chem., 2001, 276, 48189-48195）、GlcAT-I（Kitagawa） H. et al., J.Biol.Chem.,1998, 273, 6615-6618）等が例示される。 The glycosyltransferase in the self-renewal control method of the present invention is preferably a glycosyltransferase involved in the synthesis of glycosaminoglycan. Examples of such glycosyltransferases include XylT-I (Gotting, C. et al, J. Mol. Biol., 2000, 304, 517-528) and GalT-I (Okajima, T. et al, J. Biol. Chem., 1999, 274, 22915-22918), GalT-II (Bai, X. et al, J. Biol. Chem., 2001, 276, 48189-48195), GlcAT-I (Kitagawa) H. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 6615-6618) and the like.
かかる糖転移酵素の中でも、特にヘパラン硫酸の合成に関与していること酵素、すなわち、グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンを糖に転移する酵素が好ましく、殊にEXT1及びEXT2が挙げられ、EXT1がもっとも好ましい。 Among such glycosyltransferases, enzymes that are particularly involved in the synthesis of heparan sulfate, that is, enzymes that transfer glucuronic acid and N-acetylglucosamine to sugar are preferred, particularly EXT1 and EXT2, with EXT1 being the most preferable.
かかる糖転移酵素の遺伝子の発現を制御する核酸とは、特に上述の酵素の発現を抑制し、ヘパラン硫酸の合成を抑制する働きを有する核酸であることが好ましい。 Such a nucleic acid that controls the expression of a glycosyltransferase gene is particularly preferably a nucleic acid that functions to suppress the expression of the above-mentioned enzyme and suppress the synthesis of heparan sulfate.
このようなEXT1の発現を制御する核酸としては、配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列からなる核酸、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列からなる核酸が例示され、更にこれらの塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列も例示される。また、これらの核酸に相補的な塩基配列からなる核酸でも本発明自己再生制御方法に使用することができる。なお、本発明制御方法における「数個」とは、構成する塩基全数の20%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば4個以下）、より好ましくは10%未満（つまり21個の塩基からなる核酸であれば2個以下）の整数を表す。 Examples of the nucleic acid that controls the expression of EXT1 include a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 and a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, examples of these base sequences include base sequences having substitution, deletion, insertion or rearrangement of one or several bases. Also, nucleic acids having a base sequence complementary to these nucleic acids can be used in the self-renewal control method of the present invention. In the control method of the present invention, the term “several” means less than 20% of the total number of bases (that is, 4 or less for a nucleic acid consisting of 21 bases), more preferably less than 10% (that is, 21 It represents an integer of 2 or less if the nucleic acid consists of bases.
また、上述の核酸に相補的な塩基配列からなる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も、本発明自己再生制御方法に使用することができる。なお、「ストリンジェントな条件下」とは、50%ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、5×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、0.5% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性サケ精子DNA100μg/ml存在下、42℃の条件下及びこれと実質的に同一の条件下などが例示される。すなわちストリンジェントな条件とは、通常の遺伝子のハイブリダイゼーションに用いられる条件であり、ノザンブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼーションを用いたスクリーニング等に使用される条件であれば、ここにいう「ストリンジェントな条件下」に包含される。 A nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a base sequence complementary to the above-described nucleic acid can also be used in the self-renewal control method of the present invention. “Stringent conditions” means 50% formamide, 5 × SSPE (sodium chloride / sodium phosphate / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) buffer), 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS ( Examples include sodium dodecyl sulfate), denatured salmon sperm DNA in the presence of 100 μg / ml, conditions at 42 ° C. and substantially the same conditions. In other words, stringent conditions are those used for normal gene hybridization, and are those used for screening using Northern blot, Southern blot, hybridization, etc. Included below.
なお、本発明における「核酸」とは、デオキシリボ核酸、リボ核酸の両者を含む語として使用し、かかる核酸は１本鎖であると２本鎖であるとを問わず、いずれも包含するものとする。 In the present invention, the term “nucleic acid” is used as a term including both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid, and the nucleic acid includes both a single strand and a double strand. To do.
本発明自己再生制御方法に使用する核酸は好ましくは、配列番号１の塩基配列の塩基番号1954乃至1974の塩基配列に対し、遺伝子解析用コンピュータプログラムGENETYX-MAC（ソフトウェア開発社製）を用いて算出して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。 The nucleic acid used in the self-renewal control method of the present invention is preferably calculated using the gene analysis computer program GENETYX-MAC (manufactured by Software Development Co., Ltd.) for the base sequence of base numbers 1954 to 1974 of the base sequence of SEQ ID NO: 1. And having a base sequence having a homology of 95% or more.
このような核酸の対象となる細胞への導入は、適宜ベクターに核酸を結合して行うことができる。なお、ベクターへの導入に際して、核酸の機能を損なわない限りにおいて、例えば制限酵素断片を連結したり、又は核酸の末端領域の一部を切断してベクターへの導入を行ったとしても、当業者であれば本発明自己再生制御方法の目的が達成されることは容易である。 Such nucleic acid can be introduced into a target cell by appropriately binding the nucleic acid to a vector. As long as the function of the nucleic acid is not impaired upon introduction into the vector, for example, even if a restriction enzyme fragment is ligated or a part of the terminal region of the nucleic acid is cleaved and introduced into the vector, those skilled in the art If so, it is easy to achieve the object of the self-regeneration control method of the present invention.
かかるベクターとしては、本発明自己再生制御方法を適用する対象の細胞で発現するベクターである限りにおいて特に限定はされず、当業者であれば目的の細胞に合わせて適宜選択して使用することが容易である。 Such a vector is not particularly limited as long as it is a vector expressed in a target cell to which the self-renewal control method of the present invention is applied, and those skilled in the art can appropriately select and use it according to the target cell. Easy.
本発明分化制御剤による細胞表面へのヘパラン硫酸発現の抑制
マウスのES細胞（R1：生理学研究所 等 誠司 博士より恵与、E14TG2a：東京大学 程 久美子 博士より恵与）に対して、siRNA発現プラスミド（pSilencer（Ambion社製）のBamHI-HindIII領域に配列番号２に記載された配列（本発明分化抑制剤及び本発明自己再生制御剤の有効成分である核酸）を常法により連結して構築した）を導入した。陰性対象として配列番号２に記載された配列に代えて、EGFP配列（配列番号３に記載された塩基配列からなる）を連結したプラスミドを使用した。
Inhibition of heparan sulfate expression on the cell surface by the differentiation regulator of the present invention The siRNA expression plasmid for mouse ES cells (R1: Granted by Dr. Seiji et al. (PSilencer (manufactured by Ambion) BamHI-HindIII region was constructed by linking the sequence described in SEQ ID NO: 2 (nucleic acid as an active ingredient of the differentiation inhibitor of the present invention and the self-renewal regulator of the present invention) by a conventional method. ) Was introduced. Instead of the sequence described in SEQ ID NO: 2 as a negative target, a plasmid in which an EGFP sequence (consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 3) was linked was used.
導入２日後にReal Time PCR法（細胞よりインビトロジェン社製のTRIZOL試薬により全RNAを抽出し、インビトロジェン社製のオリゴ-dTプライマーとSuperscriptII first strand合成キットを使用し、アプライドバイオシステムズ社製のABI PRISM 7700により行った。使用したプライマーとマーカーのセットは下記表１に示す。）によりEXT1遺伝子の発現を確認したところ、いずれの細胞においても約80%の発現量の低下が確認された（図１）。 Two days after introduction, Real RNA PCR (total RNA was extracted from cells using TRIZOL reagent manufactured by Invitrogen, and ABI PRISM manufactured by Applied Biosystems was used using oligo-dT primer manufactured by Invitrogen and Superscript II first strand synthesis kit. 7700. The set of primers and markers used is shown in Table 1 below.) When the expression of the EXT1 gene was confirmed, about 80% decrease in the expression level was confirmed in all cells (FIG. 1). ).
また、導入２日後に、抗ヘパラン硫酸抗体を用いてFACS分析を行った（図２）。 Two days after the introduction, FACS analysis was performed using an anti-heparan sulfate antibody (FIG. 2).
すなわち細胞を0.02%EDTAで回収し、氷冷下でFACS緩衝液（0.5%牛血清アルブミン、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS）中で、標準化のためのマウスIgM抗体（ケミコン社製）又は抗ヘパラン硫酸抗体10E4（生化学工業株式会社製）で30分間処理をした。反応度、細胞をFACS緩衝液で洗浄した後、氷冷下で30分間、FACS緩衝液に懸濁させた二次抗体（FITC結合：シグマ社製）と結合させた。セルソートと分析はベクトンディッキンソン社製のFACS Aria Cell Sorterを使用した。 That is, the cells were collected with 0.02% EDTA, and mouse IgM antibody (manufactured by Chemicon) or anti-antigen for standardization in FACS buffer (PBS containing 0.5% bovine serum albumin and 0.1% sodium azide) under ice-cooling. Treated with heparan sulfate antibody 10E4 (Seikagaku Corporation) for 30 minutes. After the reactivity and the cells were washed with FACS buffer, the cells were bound with a secondary antibody (FITC binding: Sigma) suspended in FACS buffer for 30 minutes under ice cooling. Cell sorting and analysis were performed using a FACS Aria Cell Sorter manufactured by Becton Dickinson.
その結果、R1細胞、E14TG2a細胞、いずれも配列番号２記載の塩基配列からなる核酸により、細胞表面のヘパラン硫酸の量が著しく低下していることが明らかとなった。 As a result, it was revealed that the amount of heparan sulfate on the cell surface was remarkably reduced by the nucleic acid consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in both R1 cells and E14TG2a cells.
自己再生及びES細胞の生存とヘパラン硫酸との関係
実施例１の方法で核酸を導入した細胞（以下、配列番号２記載の塩基配列からなる核酸を導入した細胞を「実験群の細胞」という）を、トリプシンにより回収し、1000U/mlで白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor：以下「LIF」と略記する）を含むES細胞培養培地のゼラチンコートを施した60mmディッシュ上に1×104個ずつ播種した。未分化細胞の識別のためにはケミコン社製のALP detection kitで播種した5日経過後に固定して染色した。そして顕微鏡下で染色されたコロニー数をカウントした。その結果、ALP陽性率と全コロニー数が実験群の細胞では、対象と比して少なく、ヘパラン硫酸が細胞の自己再生と増殖を制御していることを示唆する結果が得られた（図３）。
Relationship between self-renewal and survival of ES cells and heparan sulfate Cells into which nucleic acid has been introduced by the method of Example 1 (hereinafter, cells into which a nucleic acid having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 has been introduced are referred to as “experimental group cells”) Collected with trypsin and seeded at a rate of 1000 U / ml, 1 × 10 4 pieces on a 60 mm dish coated with gelatin-coated ES cell culture medium containing leukemia inhibitory factor (hereinafter abbreviated as “LIF”) did. For identification of undifferentiated cells, the cells were fixed and stained after 5 days of seeding with an ALP detection kit manufactured by Chemicon. The number of colonies stained under a microscope was counted. As a result, the ALP positive rate and the total number of colonies were smaller in the experimental group of cells than in the test group, suggesting that heparan sulfate controls cell self-renewal and proliferation (FIG. 3). ).
また、実施例１の方法で調製した実験群の細胞を、トリプシンにより回収し、1000U/mlで白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor：以下「LIF」と略記する）を含むES細胞培養培地のゼラチンコートを施した96穴マルチプレートに0.8×104個ずつ播種した（図４）。その結果、核酸の導入により、細胞の増殖が低下した。 In addition, the cells of the experimental group prepared by the method of Example 1 were collected by trypsin, and gelatin coat of ES cell culture medium containing leukemia inhibitory factor (hereinafter abbreviated as “LIF”) at 1000 U / ml. Each of the 96-well multi-plates subjected to sown was seeded at 0.8 × 10 4 pieces (FIG. 4). As a result, the proliferation of the cells decreased due to the introduction of the nucleic acid.
ヘパラン硫酸の減少によるES細胞の分化
実施例１の方法で配列番号２記載の塩基配列からなる核酸を導入した実験群の細胞を、LIF存在下で５日間培養し、顕微鏡観察した。
Differentiation of ES cells by reduction of heparan sulfate The cells of the experimental group into which the nucleic acid consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 was introduced by the method of Example 1 were cultured in the presence of LIF for 5 days and observed under a microscope.
血清とLIFのみを添加した栄養欠乏状態での培養では、対象細胞は未分化細胞と分化した細胞の混合状態となっていることが観察されたが、実験群の細胞は、プレートに張り付き平たく変形し、遠位内胚葉様への形態変化が観察された（図５）。 In the culture under nutrient deficiency with only serum and LIF added, it was observed that the target cells were in a mixed state of undifferentiated cells and differentiated cells, but the cells in the experimental group were deformed flatly on the plate. However, a morphological change to distal endoderm-like was observed (FIG. 5).
LIFを除去した分化誘導環境における培養では、対象の細胞は多分化性を維持した数種の平たい細胞への形態変化が認められたが、実験群の細胞ではLIF存在下のときと同様に、遠位内胚葉様への形態変化が観察された。 In the culture in the differentiation-inducing environment from which LIF was removed, the target cells showed morphological changes to several flat cells that maintained pluripotency, but in the cells in the experimental group, as in the presence of LIF, Morphological changes to distal endoderm-like were observed.
60%以上の対象細胞は、巨大な胚様体を形成していたが、実験群の細胞は対象の比べて小さな胚様体しか形成していなかった（図６）。胚様体は、外層が胚体外内胚葉（ExE系へ分化）、内層が原始外胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉へと分化）からなり、内層の分化が抑制されれば外層のみで形成される小さな胚様体となる。従って、この結果は、本発明分化制御剤が、分化を抑制していることを示している。 Over 60% of the target cells formed huge embryoid bodies, but the cells in the experimental group formed only embryonic bodies that were smaller than the target cells (FIG. 6). The embryoid body consists of the extra-embryonic endoderm (differentiated into the ExE system), the inner layer consists of primitive ectoderm (differentiated into the ectoderm, mesoderm, and endoderm). A small embryoid body is formed. Therefore, this result shows that the differentiation regulator of the present invention suppresses differentiation.
培養５日目のES細胞の形態学的特徴を把握するために、胚性細胞のマーカー遺伝子によるRT-PCRを行った。すなわち、細胞よりインビトロジェン社製のTRIZOL試薬により全RNAを抽出し、インビトロジェン社製のオリゴ-dTプライマーとSuperscriptII first strand合成キットを使用し、アプライドバイオシステムズ社製のGene Amp（商標名） PCR System 9700 により行った。使用したプライマーとマーカーのセットは下記表２に示す。 In order to understand the morphological characteristics of ES cells on the fifth day of culture, RT-PCR using a marker gene of embryonic cells was performed. In other words, total RNA was extracted from cells using Invitrogen's TRIZOL reagent, and using Invitrogen's oligo-dT primer and Superscript II first strand synthesis kit, Gene Bio (trade name) PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems was used. It went by. The primer and marker sets used are shown in Table 2 below.
LIFの存在下では、栄養外胚葉マーカー（cdx2）、原始内胚葉マーカー（GATA4、GATA6）、遠位内胚葉マーカー（Dab2、LamininB1）、近位内胚葉マーカー（Bmp2、Ihh）、胚盤葉上層マーカー（Fgf5）、外胚葉マーカー（Isl1）、中胚葉マーカー（brachyury）が対照細胞で観察された（図７）。このことは図５で観察される細胞の混合した状態と矛盾しない結果である。 In the presence of LIF, trophectoderm marker (cdx2), primitive endoderm marker (GATA4, GATA6), distal endoderm marker (Dab2, LamininB1), proximal endoderm marker (Bmp2, Ihh), upper blastoderm A marker (Fgf5), ectoderm marker (Isl1), and mesoderm marker (brachyury) were observed in control cells (FIG. 7). This is a result consistent with the mixed state of cells observed in FIG.
一方、未分化マーカー（Oct3/4、Nanog）が実験群の細胞では対照の細胞よりも減少し、胚体外内胚葉(Extraembryonic endoderm：以下「ExE」と略記する)系マーカー(GATA4,GATA6,Dab2,LamininB1,Bmp2,Ihh)以外のマーカー遺伝子の発現が若干観察された。 On the other hand, undifferentiated markers (Oct3 / 4, Nanog) decreased in the experimental cells compared to the control cells, and extraembryonic endoderm (hereinafter abbreviated as “ExE”) type markers (GATA4, GATA6, Dab2 Some expression of marker genes other than LamininB1, Bmp2, and Ihh was observed.
LIFを含まない分化条件下で培養をした場合には、対照の細胞ではOct3/4とNanogの発現が低下し、数種の分化マーカーの発現が亢進していた。実験群の細胞では、ExE系マーカー以外のマーカー遺伝子の発現がほとんど確認できなかった。 When cultured under differentiation conditions not containing LIF, the expression of Oct3 / 4 and Nanog was decreased in the control cells, and the expression of several differentiation markers was increased. In the cells of the experimental group, the expression of marker genes other than the ExE marker was hardly confirmed.
これらの結果から、本発明分化制御剤がExE系列以外への分化を抑制していることが明らかとなった。 From these results, it became clear that the differentiation regulator of the present invention suppresses differentiation to other than ExE series.
本発明により新規な分化制御剤、自己再生制御剤が提供され、再生医療分野における移植片の調製に利用できる。 According to the present invention, a novel differentiation controlling agent and self-renewal controlling agent are provided and can be used for preparation of a graft in the field of regenerative medicine.
Claims (2)
(a)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列
(b)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列 A differentiation regulator comprising, as an active ingredient, a vector that expresses siRNA comprising any one of the following base sequences (a) or (b) :
(a) A base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
(b) a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(a)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1775〜1795からなる塩基配列
(b)配列番号１記載の塩基配列中、塩基番号1954〜1974からなる塩基配列 A self-renewal control agent comprising, as an active ingredient, a vector that expresses siRNA comprising any one of the following base sequences (a) or (b) :
(a) A base sequence consisting of base numbers 1775 to 1795 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
(b) a base sequence consisting of base numbers 1954 to 1974 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1
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