JP5153568B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、液浸対物レンズと乾燥系対物レンズとを備えた顕微鏡装置に関する。

従来、対物レンズの先端と標本との間を液体で満たして使用する液浸顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。このような液浸顕微鏡では、実効ＮＡ（Numerical Aperture）が大きくなるため、検出光学系の解像度を向上することができる。
特開２００４−７０３０７号公報 特開２００７−１３３０７７号公報

ところで、液浸対物レンズにより局所領域の高倍率観察を行った後に、同一標本内においてドライ状態で使用される低倍率の乾燥系対物レンズによりマクロ観察を行いたいという市場要求がある。しかしながら、液浸対物レンズから乾燥系対物レンズへ切り替えて観察する場合には、標本を載せたカバーガラスに液体が残留してしまい、ドライ状態において良好な観察視野を確保することができないという不都合がある。

ここで、特許文献１は、液浸対物レンズのみについての技術内容であり、液浸対物レンズから乾燥系対物レンズへの切り替えについての言及はない。また、特許文献２には、液浸媒質の供給及び回収技術についての言及はあるものの、こちらも液浸対物レンズのみについての技術内容であり、乾燥系対物レンズへの切り替えについての言及はない。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、液浸対物レンズから乾燥系対物レンズへ切り替える際に、液体を乾燥系対物レンズの観察視野から除去することができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本を載置するステージと、該ステージ上の標本からの光を集光する乾燥系対物レンズおよび液浸対物レンズと、前記乾燥系対物レンズと前記液浸対物レンズのいずれか一方を標本に対向する位置に択一的に配置するレンズ切り替え手段と、前記ステージと前記液浸対物レンズとの相対位置を変更する相対位置変更手段と、前記液浸対物レンズを用いた観察から前記乾燥系対物レンズを用いた観察に切り替える際に、対物レンズの切り替えに先立って、前記液浸対物レンズを前記乾燥系対物レンズの非観察領域に配されるまで、光軸に直交する方向の相対位置を変化させるように、前記レンズ切り替え手段および前記相対位置変更手段を制御する制御部とを備える顕微鏡装置を採用する。

本発明によれば、液浸対物レンズを用いた観察から乾燥系対物レンズを用いた観察に切り替える際に、対物レンズの切り替えに先立って、制御部により、レンズ切り替え手段および相対位置変更手段が制御される。具体的には、相対位置変更手段により液浸対物レンズが乾燥系対物レンズの非観察領域に配されるまで、光軸に直交する方向のステージと液浸対物レンズとの相対位置が変更された後に、レンズ切り替え手段により対物レンズの切り替えが行われる。

これにより、液浸対物レンズと標本を載せたスライドガラス（あるいはカバーガラス）との間に充填された液体は、表面張力によって液浸対物レンズと共に、ほぼ残らず乾燥系対物レンズの非観察領域まで移動される。これにより、ポンプ等の回収装置を設けることなく、液体を乾燥系対物レンズの観察領域から除去することができ、良好な視野を確保した状態で乾燥系対物レンズによる標本の観察を行うことが可能となる。

上記発明において、前記相対位置変更手段が、前記液浸対物レンズと前記ステージとの間の液体が分離しない距離の範囲で光軸方向の相対位置を変化させた後に、光軸に直交する方向の相対位置を変更することとしてもよい。
このようにすることで、標本を載せたカバーガラスと液体との接触面積を小さくした状態で、液体を乾燥系対物レンズの観察領域から除去することができる。これにより、ステージおよび／または液浸対物レンズの移動量を小さくすることができると共に、液体の除去効果を向上することができる。

上記発明において、前記乾燥系対物レンズの非観察領域に設けられ、前記液体を除去する除去手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、相対位置変更手段により乾燥系対物レンズの非観察領域まで移動された液体を除去手段により除去することができる。

本発明によれば、液浸対物レンズから乾燥系対物レンズへ切り替える際に、液体を乾燥系対物レンズの観察視野から除去することができるという効果を奏する。

〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置１００について、図１から図４を参照して以下に説明する。
図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置１００の概略構成を示している。図１に示すように、顕微鏡装置１００は、標本を載置する標本ＸＹステージ１と、標本からの光を集光する液浸対物レンズ４および乾燥系対物レンズ５と、液浸対物レンズ４と乾燥系対物レンズ５を切り替える可動式レボルバー（レンズ切り替え手段）６と、標本ＸＹステージ１および可動式レボルバー６を制御する制御部（図示略）とを備えている。

標本ＸＹステージ１は、標本を収容する標本容器２を保持する容器保持部３を備えており、制御部からの指令により液浸対物レンズ４および乾燥系対物レンズ５の光軸と直交する方向（ＸＹ方向）へ動作可能となっている。標本ＸＹステージ１の下部には、液浸対物レンズ４と乾燥系対物レンズ５が取り付けられた可動式レボルバー６が配置されている。

標本ＸＹステージ１は、ブラックアルマイトにより表面処理されたアルミ部材からなり、容器保持部３の形状は標本容器２の形状に合わせて様々な形に加工できる。また、標本容器２の底面には透明部材として、例えば厚さ約０．１７ｍｍのカバーガラス７が配置されている。多くの光学レンズはカバーガラス厚０．１７ｍｍに合わせた設計が成されているため、開口数（ＮＡ）が大きい対物レンズを用いて観察する際、特に液浸対物レンズ４を使用する際には、より解像度を高めるためにも０．１７ｍｍ付近のカバーガラスを利用したほうが良い。

可動式レボルバー６は、液浸対物レンズ４および乾燥系対物レンズ５の光軸方向（Ｚ方向）に動作可能となっている。また、可動式レボルバー６は、液浸対物レンズ４と乾燥系対物レンズ５の切り換えの際に回転することで、液浸対物レンズ４と乾燥系対物レンズ５のいずれか一方を標本に対向する位置に択一的に配置するようになっている。

制御部は、液浸対物レンズ４を用いた観察から乾燥系対物レンズ５を用いた観察に切り替える際に、対物レンズの切り替えに先立って、液浸対物レンズ４を乾燥系対物レンズ５の非観察領域に配されるまで光軸に直交する方向の相対位置を変化させるように、標本ＸＹステージ１および可動式レボルバー６を制御する。

一般的に、生体試料を観察する手順としては、低倍の乾燥系対物レンズ５にて全体を伺った後に、高倍率の対物レンズ、ここでは液浸対物レンズ４を使用して全体画像の中から選択した興味領域の高解像の画像を取得する。
ここで、液浸対物レンズ４の先端と標本容器底面のカバーガラス７の間には液体８が満たされている。液体８として、例えば、超純水を採用した場合の屈折率は１．３３、オイルを採用した場合の屈折率は１．５２である。

また、一般的な対物レンズはワーキングディスタンス（ＷＤ）を保有しており、対物の先端からＷＤの位置に焦点を結ぶようになっている。このためＷＤが小さくＮＡの大きい対物レンズからの切り替えの際は対物先端の縁がステージや標本にぶつからない様に一度Ｚ方向へ下がってから切り替えを行う必要がある。

ここで、液浸対物レンズ４から低倍の乾燥系対物レンズ５へ切り替えを行う際、図２に示すように、液浸対物レンズ４での観察領域９にて液浸対物レンズ４をＺ方向へ下げて乾燥系対物レンズ５に切り替えた場合には、乾燥系対物レンズ５での低倍観察領域１０に液体８が残留してしまう。この液体８の残留物が、乾燥系対物レンズ５での観察に影響を及ぼしてしまう。

そこで、図３に示すように、高倍観察領域９の位置にある標本ＸＹステージ１を、乾燥系対物レンズ５の非観察領域へ移動させてから液浸対物レンズ４をＺ方向下方へ下げることにより、乾燥系対物レンズ５による低倍観察領域１０から液体８の残留物を取り除くことができる。

なお、標本ＸＹステージ１の非観察領域への可動位置は任意に設定できるようにしてもよい。すなわち、液体８の位置は、乾燥系対物レンズ５の観察領域１０の範囲内であっても、観察者が見たい領域が明瞭に観察できていれば良い。

ここで、図４を用いて対物レンズを切り換える際のシーケンスについて説明を行う。
まず、液浸対物レンズ４による観察を行っているところから（Ｓ１）、乾燥系対物レンズ５への切り換えが選択されると（Ｓ２）、標本ＸＹステージ１を動作させて液浸対物レンズ４が乾燥系対物レンズ５の非観察領域に配されるまで、ＸＹ方向の標本ＸＹステージ１と液浸対物レンズ４との相対位置が変更される（Ｓ３）。これにより、液体８は、液浸対物レンズ４からの表面張力により乾燥系対物レンズ５の非観察領域にされる。

次に、液浸対物レンズ４と標本ＸＹステージ１との干渉を防止するために、可動式レボルバー６をＺ方向下方へ降下させる（Ｓ４）。
次に、可動式レボルバー６を回転させて、観察に用いる対物レンズを液浸対物レンズ４から乾燥系対物レンズ５に切り替える（Ｓ５）。

次に、再び標本ＸＹステージ１を動作させて乾燥系対物レンズ５が低倍観察領域１０に対向する位置に移動される（Ｓ６）。
次に、可動式レボルバー６をＺ方向上方へ上昇させ（Ｓ７）、乾燥系対物レンズ５による観察が行われる（Ｓ８）。
なお、上述のフローにおいてＳ６とＳ７との順番を逆にすることとしてもよい。

以上のように、本実施形態に係る顕微鏡装置１００によれば、液浸対物レンズ４を用いた観察から乾燥系対物レンズ５を用いた観察に切り替える際に、液浸対物レンズ４と標本を載せたカバーガラス７との間に充填された液体８は、表面張力によって液浸対物レンズ４と共に、ほぼ残らず乾燥系対物レンズ５の非観察領域まで移動される。これにより、ポンプ等の回収装置を設けることなく、液体８を乾燥系対物レンズ５の低倍観察領域１０から除去することができ、良好な視野を確保した状態で乾燥系対物レンズ５による標本の観察を行うことが可能となる。

また、標本ＸＹステージ１と液浸対物レンズ４との相対位置を変更する相対位置変更手段として、標本ＸＹステージ１をＸＹ方向に移動させるとともに、液浸対物レンズ４をＺ方向に移動させることで、通常の顕微鏡装置に設けられているレンズの上下移動機構およびステージの水平移動機構を相対位置変更手段として兼用することができる。これにより、相対位置変更手段として新たな駆動機構を設ける必要がなく、装置構成を簡易なものとすることができる。
なお、相対位置変更手段は上記の構成に限られず、標本ＸＹステージ１と液浸対物レンズ４との相対位置をＸＹＺ方向に変更可能であればよい。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置について図５から図７を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０１が第１の実施形態と異なる点は、液浸対物レンズ４とカバーガラス７との間に充填された液体８が分離しない距離まで、Ｚ方向の標本ＸＹステージ１と液浸対物レンズ４との相対位置を変化させた後に、ＸＹ方向の相対位置を変更する点である。以下、本実施形態の顕微鏡装置１０１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。なお、装置構成は図１に示す第１の実施形態と同様であるため、第１の実施形態と同一の符号を用いて説明する。

図５から図７は、液浸対物レンズ４とカバーガラス７との間に充填された液体８の状態を説明する図であり、各図において（ａ）は横断面図、（ｂ）は上視図である。
図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、液体８は、液浸対物レンズ４の先端と標本容器２の底面に配置されたカバーガラス７の間に満たされている。この液体８は、カバーガラス７と液浸対物レンズ４の双方からの表面張力によって一定の形状を保ちながら安定している。

この際の表面張力の状態方程式（Ｙｏｕｎｇの式）は以下の（１）式の通りである。
σｓν＝σｓｌ＋σｌνＣＯＳθ・・・（１）
ここで、σｓνは固体−液体の間の界面エネルギー、σｓｌは固体−気体の間の界面エネルギー、σｌνは気体−液体の間の界面エネルギーを表している。
上記の（１）式により、界面における接触角（ＣＯＳθ）を導き出すことができる。

また、液浸対物レンズ４をＺ方向へ動作させることにより、この液体８の形状が変化する。これにより、通常、焦点が合っている状態から標本面へ液浸対物レンズ４を接近させることで、液体８とカバーガラス７との接触面積は上昇する。一方、図６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、液浸対物レンズ４を標本面から遠ざけることで、液体８とカバーガラス７との接触面積は減少する。そして、所定の距離よりも液浸対物レンズ４の先端とカバーガラス７の距離が大きくなった時に、図７（ａ）および図７（ｂ）に示すように、液体８はカバーガラス７側の液体８ａと液浸対物レンズ４側の液体８ｂとに分離する。

ここで、液体８が分離する距離は、液体の種類や固体表面の形状・材質によっても異なる。なお、本願発明者が鋭意検討した結果、液体８が超純水であり、液量が約１００μｌの場合には、カバーガラス７と液浸体物レンズ４の間隔が約３ｍｍで液体が分離することが分かった。また、間隔を約２ｍｍにすることによってカバーガラス７との接触面積が極小となり、標本ＸＹステージ１を動作させる際にカバーガラス７に液体の残留物が残り難くなることがわかった。

以上のように、本実施形態に係る顕微鏡装置１０１によれば、標本を載せたカバーガラス７と液体８との接触面積を小さくした状態で、液体８を乾燥系対物レンズ５の低倍観察領域１０から除去することができる。これにより、標本ＸＹステージ１の移動量を小さくすることができると共に、液体８の除去効果を向上することができる。

〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置について図８から図１０を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０２が前述の各実施形態と異なる点は、乾燥系対物レンズ５の非観察領域まで移動された液体８を除去する点である。以下、本実施形態の顕微鏡装置１０２について、前述の各実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。

図８に示すように、顕微鏡装置１０２は、図１に示す構成に加えて、乾燥系対物レンズ５の非観察領域に設けられ、液体８を除去するポンプ等の吸引装置（除去手段）１１を備えている。吸引装置１１の先端には、多孔質体または繊維質体等の液体吸収部材や、吸引ノズル等の吸引部１１ａが設けられており、吸引部１１ａの構造としては厚みがあってもよい。
また、吸引装置１１と標本ＸＹステージ１の位置が相対的に動くことができる。例えば、図８の場合、吸引装置１１が固定され、標本ＸＹステージ１はＸＹ移動が可能である。

上記構成とすることで、図９および図１０に示すように、標本ＸＹステージ１のＸＹ移動によって液体８を乾燥系対物レンズ５の非観察領域へ誘導した後に、液浸体物レンズ４をＺ方向へ退避して、液体８から液浸体物レンズ４を離間させる。その後、さらに標本ＸＹステージ１をＸＹ方向に移動させて、標本に付着した液体８を吸引装置１１の吸引部１１ａへ移動させ、吸引させる。

以上のように、本実施形態に係る顕微鏡装置１０２によれば、標本ＸＹステージ１をＸＹ方向に移動させることで液浸対物レンズ４からの表面張力によって乾燥系対物レンズ５の非観察領域まで移動された液体８を吸引装置１１により完全に除去することができる。

また、吸引装置１１の吸引部１１ａを、標本と液浸体物レンズ４の間に液体８が存在する状態で、液浸体物レンズ４と接触すること無く液体８に到達できる構造としてもよい。先端の構造としては液浸体物レンズ４のＷＤ以内であることが望ましいが、液体８が分離しない範囲の距離程度（第２の実施形態参照）であれば、吸引時に液浸体物レンズ４を光軸方向に退避させる制御を組み合せることで使用可能である。具体的な構造としては、例えば、極細のノズル、厚みが１ｍｍ程度の吸収部材等が考えられる。

吸引装置１１と標本ＸＹステージ１との相対位置の変更手段としては、吸引装置１１に、液浸対物レンズ４の先端部（近傍）に対して挿脱可能な移動機構を設けることとしてもよい。これにより、標本ＸＹステージ１のＸＹ移動によって液体８を観察視野外に誘導した後、吸引部１１ａを液浸対物レンズ４先端近傍に挿入して液体８を吸引する。
あるいは、標本ＸＹステージ１の下面（対物レンズと対向している面）の観察視野外の位置に吸引部１１ａを取り付けることとしてもよい。これにより、標本ＸＹステージ１をＸＹ方向に移動して液体８を吸引部１１ａの位置に誘導し、吸引させる。

なお、本実施形態において、除去手段をポンプ等の吸引装置であるとして説明したが、毛細管現象を利用した除去手段であることとしても良い。
また、除去手段をヒーターとして、標本ＸＹステージ１の移動に伴って引っ張られてきた液体８をヒーターの熱によって蒸発することとしても良い。

第１および第２の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 標本ＸＹステージ移動前の液体の位置を説明する図である。 標本ＸＹステージ移動後の液体の位置を説明する図である。 図１の顕微鏡装置の対物レンズ切り替え時の動作を示すフローチャートである。 液浸対物レンズ移動前の液体の状態を説明する図であり、（ａ）は横断面図、（ｂ）は上視図である。 液浸対物レンズ移動中の液体の状態を説明する図であり、（ａ）は横断面図、（ｂ）は上視図である。 液浸対物レンズ移動後の液体の状態を説明する図であり、（ａ）は横断面図、（ｂ）は上視図である。 第３の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 標本ＸＹステージ移動前の液体の位置を説明する図である。 標本ＸＹステージ移動後の液体の位置を説明する図である。

符号の説明

１ 標本ＸＹステージ
２ 標本容器
３ 容器保持部
４ 液浸対物レンズ
５ 乾燥系対物レンズ
６ 可動式レボルバー
７ カバーガラス
８，８ａ，８ｂ 液体
９ 高倍観察領域
１０ 低倍観察領域
１１ 吸引装置
１００，１０１，１０２ 顕微鏡装置

Claims (6)

1. 液浸対物レンズから乾燥系対物レンズへ切り替える方法であって、
   前記液浸対物レンズによって標本を観察するステップと、
   前記液浸対物レンズから前記乾燥系対物レンズへの切り替えを選択するステップと、
   前記液浸対物レンズと前記標本との間の液体をこれらの間に保持したまま、前記液浸対物レンズが前記乾燥系対物レンズの非観察領域に配されるまで、前記標本と前記液浸対物レンズとの光軸に直交する方向の相対位置を変更するステップと、
   該光軸に直交する方向の相対位置を変更するステップの後に、前記液浸対物レンズから前記乾燥系対物レンズへ切り替えるステップと、
   前記乾燥系対物レンズを観察領域に対向する位置まで移動するステップとを含む方法。
2. 前記切り替えを選択するステップと前記光軸に直交する方向の相対位置を変更するステップとの間に、前記液浸対物レンズと前記標本との間の液体が分離しない距離の範囲で前記液浸対物レンズと前記標本との光軸方向の相対位置を変更するステップを含む請求項１に記載の方法。
3. 前記光軸に直交する方向の相対位置を変更するステップの後に、前記乾燥系対物レンズの非観察領域において液体を除去するステップを含む請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 請求項１に記載の方法を実行する顕微鏡装置であって、
   標本を載置するステージと、
   該ステージ上の標本からの光を集光する乾燥系対物レンズおよび液浸対物レンズと、
   前記乾燥系対物レンズと前記液浸対物レンズのいずれか一方を標本に対向する位置に択一的に配置するレンズ切り替え手段と、
   前記ステージと前記液浸対物レンズとの相対位置を変更する相対位置変更手段と、
   前記液浸対物レンズを用いた観察から前記乾燥系対物レンズを用いた観察に切り替える際に、対物レンズの切り替えに先立って、前記液浸対物レンズと前記標本との間の液体をこれらの間に保持したまま前記液浸対物レンズを前記乾燥系対物レンズの非観察領域に配されるまで光軸に直交する方向の相対位置を変化させるように、前記レンズ切り替え手段および前記相対位置変更手段を制御する制御部とを備える顕微鏡装置。
5. 前記相対位置変更手段が、前記液浸対物レンズと前記ステージとの間の液体が分離しない距離の範囲で光軸方向の相対位置を変化させた後に、光軸に直交する方向の相対位置を変更する請求項４に記載の顕微鏡装置。
6. 前記乾燥系対物レンズの非観察領域に設けられ、前記液体を除去する除去手段を備える請求項４または請求項５に記載の顕微鏡装置。

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