JP5097247B2 - Observation method using a confocal microscope and confocal microscope apparatus - Google Patents

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Description

本発明は、蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を、励起波長を用いて励起して、前記試料から放出された蛍光を検出する共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法に関する。 The present invention, a sample labeled with a fluorescent dye or fluorescent protein, and excited using excitation wavelength, about observation method using a confocal microscope and confocal microscopy apparatus for detecting fluorescence emitted from the sample .

標本の走査画像を得るための第1の走査光学系と、標本の特定の部位に特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを備えた走査型レーザ顕微鏡が提案されている(特開2000−275529号公報参照)。 A first scanning optical system for obtaining a scanned image of the specimen, scanning laser microscope and a second scanning optical system for expressing specific phenomenon to a specific site of the specimen has been proposed (Japanese Patent open see JP 2000-275529). この走査型レーザ顕微鏡では、第1の走査光学系におけるレーザ光源及び光路で標本面上の特定部位を照射して標本又は標本に注入された化学物質に刺激を加え、第2の走査光学系におけるレーザ光源及び光路で標本面上の上記とは異なる特定部位を励起して蛍光を検出し画像化する。 This scanning laser microscope, a stimulus applied to the first chemical to a specific site on the sample surface by the laser light source and the optical path is injected into the specimen or sample by irradiation in the scanning optical system, the second scanning optical system imaging to detect fluorescence by exciting a different specific site from the above on the sample surface by the laser light source and the optical path. なお、本明細書では、特に明記しない限り、標本の画像取得するための走査光学系を「第1の走査光学系」と称し、標本の特定の部位に特異現象を発現させるための走査光学系を「第2の走査光学系」と称する。 In the present specification, unless otherwise indicated, the scanning optical system for image acquisition of the sample referred to as "first scanning optical system", the scanning optical system for expressing specific phenomenon at a specific site of the specimen It is referred to as "second scanning optical system".

一般的に、共焦点顕微鏡では、標本上の焦点と共役な焦点を検出器前に設けて、そこにピンホールを設置することにより、標本の深さ方向の分解能を1.22λ/NAとして、通常の顕微鏡観察よりも小さくする共焦点効果を利用している。 Generally, in the confocal microscope, provided focus and conjugate focus of the specimen before the detector, by placing a pinhole therein, the resolution in the depth direction of the specimen as 1.22 / NA, It utilizes a confocal effect be less than the normal microscopic observation. この共焦点効果により、分解能があがるので、標本上を走査している断面の切れの良い画像(すなわち、深さ方向に対して薄いスライス像を得られる画像)が得られる。 The confocal effect, since the resolution is increased, a good image with sharp cross section which scans the sample (i.e., image obtained thin slice images in the depth direction) is obtained.

なお、高速に画像を取るときや暗い標本では、ピンホールを開いて共焦点効果を弱め、蛍光の分解能を犠牲にして画像を明るくすることが可能である。 In the dark the specimen or when taking a picture at high speed, weaken the confocal effect open a pinhole, it is possible to brighten the image at the expense of resolution of fluorescence.

この様に、共焦点顕微鏡は、ピンホールを開いて深さ方向の分解能を落とすことにより、深さ方向の情報を得ることができる。 Thus, confocal microscopy, by lowering the resolution in the depth direction to open a pinhole, it is possible to obtain the information in the depth direction. しかし、標本上での焦点深度は対物レンズに入射するコヒーレント光の光束径で決定されるので、ピンホールで、焦点深度を変えることは不可能である。 However, the depth of focus on the specimen since it is determined by the beam diameter of the coherent light incident on the objective lens, pinhole, it is not possible to change the depth of focus.

一方、顕微鏡による標本への照明としてケーラー照明がよく用いられている。 Meanwhile, Koehler illumination is often used as illumination to the specimen by microscope. このケーラー照明による標本断面の厚さ方向の照明は、一様に近い励起をしている。 Lighting in the thickness direction of the specimen cross-section according to the Koehler illumination, has a uniform close excited.

上記のような従来の共焦点顕微鏡において、2つのレーザ走査光路と一つの対物レンズを用いて装置を実現した場合に、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光の標本面上での深さ方向の励起光強度分布が、波長の差しか生じず、ほぼ同一となってしまう。 In conventional confocal microscopy as described above, when realizing the device using two laser scanning optical path and one objective lens, on the specimen surface of the laser beam for the laser beam and the image acquisition applying a stimulus to the specimen excitation light intensity distribution in the depth direction in the not occur only difference wavelength, becomes substantially the same.

本発明は、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光(インコヒーレント光でも良い)との標本面上での深さ方向の励起光強度分布を変化させることができる共焦点顕微鏡装置及び共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法を提供することを目的とする。 The present invention is a confocal microscope capable of changing the excitation light intensity distribution in the depth direction on the specimen surface with the laser beam for the laser beam and the image acquisition applying a stimulus to the specimen (or incoherent light) and to provide an observation method using the apparatus and confocal microscope apparatus.

本発明の一局面に係る顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第1の走査光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを具備し、前記第1の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、前記コヒーレントではない光源から出力された光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出され、前記第2の走査光学系は回転ディスクを介さずに前記レーザ光を前記標本の特定部位に集光し、前記第1の光学系及び前記第2の走査光学系の焦点面は同じ深さ位置にあり、前記第2 Microscope apparatus according to one aspect of the present invention, the first optical scanning of scanning the specimen via the objective lens by the light output from the light source is not a coherent, detecting the fluorescence from the specimen via the objective lens and the system is irradiated with a laser beam output from the laser light source to a specific site of the specimen, and a second scanning optical system for the expression of specific phenomena, the first scanning optical system, a confocal further comprising a rotating disk for obtaining the effect, the light output from the non-coherent light source scans the specimen through the rotary disk, the fluorescence is detected through the rotary disk, the first 2 of the scanning optical system condenses the laser light not through the rotary disk to a specific site of the specimen, the focal plane is the same depth position near the first optical system and said second optical scanning system Ri, the second 走査光学系は、前記レーザ光をXY方向に任意に偏向する走査手段によってそのレーザ光を前記特定の部位に照射することを特徴とする。 Scanning optical system, and then irradiating the laser beam to the specific site by scanning means for deflecting any said laser beam in the XY direction.

本発明によれば、刺激を与える光学系と画像を取得する励起光の標本面での深さ方向の強度分布を変えることにより、異なる3次元空間の動的解析が可能になる。 According to the present invention, by changing the intensity distribution in the depth direction at the sample surface of the excitation light to obtain an optical system and an image to stimulate allows dynamic analysis of different three-dimensional space.

本発明の第1の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図。 Schematic diagram of a confocal microscope apparatus according to a first embodiment of the present invention. 第1のビーム径可変機構と第2のビーム径可変機構の構成例を示す図。 Diagram illustrating a configuration example of a first beam diameter varying mechanism and the second beam diameter varying mechanism. 本発明の第2の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図。 Schematic diagram of a confocal microscope apparatus according to a second embodiment of the present invention. 本発明に適用される回転ディスクの一例を示す図。 It shows an example of the rotating disk used in the present invention. 神経組織の観察を模式的に示した図。 Diagram schematically showing the observation of the neural tissue.

図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。 With reference to the accompanying drawings illustrating the embodiments of the present invention.

(第1の実施形態) (First Embodiment)
図1は、本発明の第1の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図である。 Figure 1 is a schematic diagram of a confocal microscope apparatus according to a first embodiment of the present invention.
図1において、共焦点顕微鏡装置は、第1のレーザ光源101からのレーザ光で標本134の焦点面上を走査する観察用(又は、画像取得用)の第1の走査光学系100と、第2のレーザ光源201から出力されるレーザ光を標本134の任意の位置に照射してケージド試薬を開裂させるため(すなわち、標本刺激用)の第2の走査光学系200とを備えている。 In Figure 1, the confocal microscope apparatus for observing that scans the focal plane of the specimen 134 with the laser beam from the first laser light source 101 (or, for image acquisition) and the first scanning optical system 100, the the laser beam output from the second laser light source 201 is irradiated at an arbitrary position of the specimen 134 for cleaving the caged reagent (i.e., specimen stimulation) and a second scanning optical system 200 of. 第1の走査光学系100の光路と第2の走査光学系200の光路とはダイクロイックミラー120で一致している。 First optical path of the scanning optical system 100 and the optical path of the second scanning optical system 200 are matched by the dichroic mirror 120. これにより、第1の走査光学系100と第2の走査光学系200とが、1つの対物レンズ132を共用している。 Accordingly, the first scanning optical system 100 and the second scanning optical system 200, share a single objective lens 132.

第1の走査光学系100と第2の走査光学系200において、第1のレーザ光源101から出力されたコヒーレント光は第1のビーム径可変機構102及び第1の走査光学ユニット104を介してダイクロイックミラー120に至る。 In the first scanning optical system 100 and the second scanning optical system 200, the coherent light output from the first laser light source 101 through the first beam diameter varying mechanism 102 and the first scanning optical unit 104 dichroic leading to the mirror 120. また、第2のレーザ光源201出力されたコヒーレント光は第2のビーム径可変機構202及び第2の走査光学ユニット203を介してダイクロイックミラー120に至る。 Moreover, coherent light outputted second laser light source 201 reaches the dichroic mirror 120 through the second beam diameter varying mechanism 202 and the second scanning optical unit 203.

また、第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202は、励起光強度分布算出手段160に電気的又は間接的に接続されている。 The first beam diameter varying mechanism 102 and the second beam diameter varying mechanism 202 is electrically or indirectly connected to the excitation light intensity distribution calculating means 160. これにより、励起光強度分布算出手段160が第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202から出力されるビーム径の情報を得ることができる。 This allows the excitation light intensity distribution calculating means 160 to obtain the information of the beam diameter that is output from the first beam diameter varying mechanism 102 and the second beam diameter varying mechanism 202.

第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202は、例えば、図2に示すように、ビームエクスパンダーなどのように光束径を変化できるものが、回転するターレツトに複数個(本)装着されているもので良い。 A first beam diameter varying mechanism 102 and the second beam diameter varying mechanism 202 is, for example, as shown in FIG. 2, it can change the beam diameter such as beam expander is a plurality in rotating Taretsuto ( this) may be those that are installed. 又は、第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202として、複数のレンズ等の光学素子を組み合わせて、レーザのコヒーレントを保ったまま光束径を変化させるような機構(例えば、ズーム機構)を採用しても良い。 Or, a first beam diameter varying mechanism 102 as a second beam diameter varying mechanism 202, a combination of optical elements such as a plurality of lenses, mechanism that changes the beam diameter while maintaining a coherent laser (e.g., zoom mechanism) may be adopted.

上記のように構成された第1の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の動作について説明する。 A description will be given of the operation of the confocal microscope apparatus according to the first embodiment configured as described above.

第1の走査光学系100と第2の走査光学系200は、標本134の任意の(所望の)位置にコヒーレント光を照射するために用いる。 A first scanning optical system 100 and the second scanning optical system 200 is used to irradiate coherent light at any (desired) position of the sample 134. 具体的には、以下の通りである。 Specifically, as follows.

すなわち、第1のレーザ光源101と第2のレーザ光源201から発せられたコヒーレント光は、それぞれ、第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202で光束径が可変(調整)される。 That is, coherent light from the first laser light source 101 emitted from the second laser light source 201, respectively, the first beam diameter varying mechanism 102 and the beam diameter at a second beam diameter varying mechanism 202 is variable (adjusted) It is.

第1のビーム径可変機構102からの出力光は、ダイクロイックミラー150を通過して、第1の走査光学ユニット104の各走査ミラー104a、104bによってXY方向に任意に偏向される。 The output light from the first beam diameter varying mechanism 102 passes through the dichroic mirror 150, the scanning mirror 104a of the first scanning optical unit 104, is deflected optionally in the XY directions by 104b. 偏向された光は、リレーレンズ105を透過した後に、ミラー106で反射されて、ダイクロイックミラー120に入射する。 Polarized light, after passing through the relay lens 105, is reflected by the mirror 106 to be incident on the dichroic mirror 120. 一方、第2のビーム径可変機構202からの出力光は、第2の走査光学ユニット203の各走査ミラー203a、203bによってXY方向に任意に偏向される。 On the other hand, the output light from the second beam diameter varying mechanism 202, the scanning mirror 203a of the second scanning optical unit 203, is deflected optionally in the XY directions by 203b. 偏向された光は、リレーレンズ204を透過してダイクロイックミラー120に入射し、ダイクロイックミラー120で光路が偏向される。 The deflected light is incident on the dichroic mirror 120 passes through the relay lens 204, the optical path by the dichroic mirror 120 is deflected.

そして、ダイクロイックミラー120からのコヒーレント光は、結像レンズ130に入射する。 Then, the coherent light from the dichroic mirror 120 is incident on the imaging lens 130. なお、第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202で第1のレーザ光源からのレーザビームと第2のレーザ光源からのレーザビームの光束径を対物レンズ132の瞳径に対して変化させることにより、各走査光学系に対応する標本134面における深さ方向の励起光分布(そして/又は強度分布)の幅を変化させることができる。 Note that the pupil diameter of the first beam diameter varying mechanism 102 and the second beam diameter varying mechanism 202 with a laser beam of the light flux diameter of the objective lens 132 from a laser beam and a second laser light source from the first laser light source by changing for, it is possible to change the width of the excitation light distribution in a depth direction of the specimen 134 surface corresponding to each scanning optical system (and / or intensity distribution).

結像レンズ130を透過した光は、対物レンズ132に至り、この対物レンズ132を透過して、ステージ136上に載置された標本134の任意の断面138に集光される。 The light transmitted through the imaging lens 130 reaches the objective lens 132, passes through the objective lens 132, is focused on an arbitrary cross section 138 of the specimen 134 placed on the stage 136. なお、ステージ136は、XY平面方向と高さ方向(Z軸方向:図1における矢印方向)に移動可能である。 Incidentally, the stage 136, XY plane direction and the height direction: is movable in the (Z-axis direction of arrow direction in FIG. 1).

上記のように、標本134を走査する場合において、用途に応じて、各走査ミラー203a、203bによってある範囲を走査してもよく、又静止させてスポット的に照射させてもよい。 As described above, in the case of scanning the specimen 134, depending on the application, the scanning mirrors 203a, may scan the range of the 203b, also by stationary may be spot manner is irradiated. 更に、各走査ミラー203a、203bを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させてもよい。 Moreover, the scanning mirror 203a, 203b in any position more instantly momentarily be skipped operate the may be spot manner is irradiated. 一方、第1のレーザ光源101から発せられたコヒーレント光は、上記のように、ダイクロイックミラー150を透過し、第1の走査光学ユニット104の各走査ミラー104a、104bによって偏向される。 On the other hand, coherent light emitted from the first laser light source 101, as described above, passes through the dichroic mirror 150, the scanning mirror 104a of the first scanning optical unit 104, is deflected by 104b.

第1の走査光学系100によって標本134に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。 When light is irradiated on the specimen 134 by the first scanning optical system 100, a fluorescent indicator is excited by the light, fluorescence is emitted.

この標本134からの蛍光は、標本134への入射光路とは逆方向に、対物レンズ132から結像レンズ130、ダイクロイックミラー120、第1の走査光学ユニット104、リレーレンズ103、各走査ミラー104b、104aを通ってダイクロイックミラー150に到達し、このダイクロイックミラー150で反射して測光フィルタ140に入射する。 Fluorescence from the specimen 134, in the opposite direction to the incident light path to the sample 134, an imaging lens 130 from the objective lens 132, dichroic mirror 120, the first scanning optical unit 104, a relay lens 103, the scanning mirror 104b, It reaches the dichroic mirror 150 through 104a, enters the metering filter 140 is reflected by the dichroic mirror 150.

この測光フィルタ140に入射した光は、標本134からの蛍光波長のみが選択され、標本134からの蛍光波長のみを有する光がレンズ142によってピンホール144面に結像される。 Light incident on the light measurement filter 140, only fluorescence wavelength from the specimen 134 is selected, light having only the fluorescence wavelength from the specimen 134 is imaged on the pinhole 144 side by the lens 142. このピンホール144を通過した蛍光は、光電変換素子146によって計測される。 Fluorescence that has passed through the pinhole 144 is measured by the photoelectric conversion element 146.

励起光強度分布算出手段160は、第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202より出力されるビーム径及び現在使用されている対物レンズの性能(仕様)の情報を入力して標本面上での励起光強度分布を算出したり、既に記憶されている値を図では示されていないコンピュータ又はディスプレイなどのインターフェースに出力したりするなどの機能を有する。 Excitation light intensity distribution calculating means 160 receives the information of the performance (specification) of the first beam diameter varying mechanism 102 and the second beam-diameter output from varying mechanism 202 the beam diameter and the objective lens currently used or calculate the excitation light intensity distribution on the sample surface Te, already has a function, such as to output to the interface, such as a computer or display not shown in the figure the value stored.

上記のような、本発明の第1の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置によれば、第1の走査光学系100により標本画像を観察・記録している最中に、第2の走査光学系200によりコヒーレント光を標本134に照射することによって、第2の走査光学系200によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本134の動的特性(化学反応)などを第1の走査光学系100で調査できる。 As described above, according to the confocal microscope apparatus according to a first embodiment of the present invention, while being observed and recorded specimen image by the first scanning optical system 100, the second scanning optical system by irradiating coherent light on the specimen 134 by 200, it can investigate the dynamic properties of the sample 134 caused by the coherent light irradiation by the second scanning optical system 200 and the like (chemical reaction) in the first scanning optical system 100.

この場合において、第1の実施形態では、第1の走査光学系100と第2の走査光学系200による標本面上での深さ方向の励起光分布を、第1のビーム径可変機構102と第2のビーム径可変機構202によって独立に設定できる。 In this case, in the first embodiment, the excitation intensity distribution in the depth direction in the first scanning optical system on the 100 and the specimen surface by the second scanning optical system 200, a first beam diameter varying mechanism 102 It can be independently set by the second beam diameter varying mechanism 202. 従って、例えば、第2の走査光学系によって標本を刺激している範囲の励起光分布の幅が狭い場合であって、その刺激によって標本の厚み方向に対して広い領域に影響があった場合でも、第1の走査光学系の励起光分布の幅を広くすることによって、その様子を観察することが可能である。 Thus, for example, a case where the width of the excitation light distribution in the range that stimulates the specimen by the second scanning optical system is small, even if there is influence on a wide area with respect to the thickness direction of the specimen by the stimulation by increasing the width of the excitation light distribution of the first scanning optical system, it is possible to observe the state.

また、上記とは逆に、第2の走査光学系で標本の厚み方向に対して広範囲な部分を刺激して、第1の走査光学系では深さ方向の励起光分布の幅を狭くすることにより、標本の断面138を高分解能で観察することもできる。 Moreover, contrary to the above, to stimulate a wide range of parts with respect to the thickness direction of the specimen in the second scanning optical system, narrowing the width of the excitation light distribution in the depth direction in the first scanning optical system Accordingly, it is also possible to observe the cross-section 138 of the specimen at high resolution.

第1の実施形態において、第1のレーザ光源101として、IRパルスレーザを用いて、2光子吸収により蛍光画像を取得する構成としても良い。 In the first embodiment, as the first laser light source 101, using the IR pulse laser, the two-photon absorption may be acquired fluorescence image. この場合において、2光子吸収現象は結像位置でのみ発生するので、ピンホール144は理論的には不要になる。 In this case, since the two-photon absorption phenomenon occurs only in the image formation position, the pinhole 144 is unnecessary theoretically. また、ダイクロイックミラー150は、IRレーザを透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子146に導くために、短波長反射の特性を持つものとなる。 The dichroic mirror 150 is transmitted through the IR laser, in order to lead to the photoelectric conversion element 146 to reflect visible fluorescence, and to have the characteristics of short-wave retarder. また、第1のビーム径可変機構102は使用しない構成とする。 The first beam diameter varying mechanism 102 is configured not to use.

上記のように、第1のレーザ光源101として、IRパルスレーザを用いることにより、第1の走査光学系の構成を簡略化することができる。 As described above, the first laser light source 101, by using an IR pulse laser, it is possible to simplify the structure of the first scanning optical system. 加えて、第1のビーム径可変機構102を使用しない場合であっても、走査光学系100の標本面上での深さ方向の励起光分布の幅は、2光子吸収現象により第2の走査光学系200の深さ方向の励起光分布の幅よりも狭くなる。 In addition, even when not using the first beam diameter varying mechanism 102, the width of the excitation light distribution in the depth direction on the specimen surface of the scanning optical system 100, the two-photon absorption phenomenon second scan It is narrower than the width of the excitation light distribution in the depth direction of the optical system 200. また、標本を刺激する標本の厚みを変化させたい場合は、第2のビーム径可変機構202によって第2の走査光学系200の励起光分布の幅を狭くすることができる。 Also, if you want to change the thickness of the specimen to stimulate the specimen, it can be by the second beam diameter varying mechanism 202 to narrow the width of the excitation light distribution of the second scanning optical system 200.

(第2の実施形態) (Second Embodiment)
図3を参照して、本発明の第2の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置を説明する。 Referring to FIG. 3, illustrating a confocal microscope apparatus according to a second embodiment of the present invention. 図3は、本発明の第2の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の概略構成図である。 Figure 3 is a schematic diagram of a confocal microscope apparatus according to a second embodiment of the present invention. 図3において、第2の走査光学系200は、第1の実施形態と同じであるので、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。 3, the second scanning optical system 200 are the same as in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and a detailed description thereof will be omitted.

第2の実施形態において、第1の走査光学系100′は、光源301として水銀光源やハロゲン光源(これらの光源を「ランプ」とも称する)やLED光源等のコヒーレントではない光源を有している。 In a second embodiment, the first scanning optical system 100 'includes a mercury light source or (also referred to as "lamp" these sources) halogen light source or LED light source or the like light sources are not coherent as a light source 301 . 光源301から出射される光の光路上には、光学レンズ302や、偏光板303や、偏光ビームスプリッター(PBS)304が配置されている。 On the optical path of light emitted from the light source 301, and an optical lens 302, and a polarizing plate 303, a polarization beam splitter (PBS) 304 is disposed.

PBS304の反射光路上には、回転ディスク305と、第1結像レンズ307と、1/4波長板308と、対物レンズ309とが配置されており、これらを介して光源からの光が標本310に入射する。 The reflected light path of the PBS 304, the rotary disk 305, a first imaging lens 307, 1/4 wave plate 308 is disposed and the objective lens 309, the light specimen 310 from via these sources incident on.

回転ディスク305は、回転軸306を介して図示しないモータの軸に連結されており、一定の回転速度で回転するようになっている。 Rotating disk 305 is coupled to a motor shaft (not shown) via the rotary shaft 306 so as to rotate at a constant rotational speed. なお、回転ディスク305は、例えば、直線状の光が通過する通過部分と光を遮蔽する遮蔽部分が交互に並んで配置されている。 The rotation disk 305 is, for example, passage portion and shield portion which shields the light linear light passes are arranged side by side alternately. そして、遮蔽部分のラインの幅は、通過部分より広く、例えば、遮蔽部分と通過部分のラインの幅の比は、1:9になっている(図4参照)。 The width of the line of the shielding portion is wider than the pass portion, for example, the ratio of the width of the line of the shielding portion and the passage portion, 1: 9 (see FIG. 4).

また、光が透過する部分の幅をWとすれば、ピンホールの場合と同じく、試料像がディスクに投影される倍率をM、光の波長をλ、対物レンズの開口率をNAとして、 Further, if the width of a portion through which light passes is W, as in the case of a pinhole, the magnification sample image is projected on the disk M, the wavelength of light lambda, the numerical aperture of the objective lens as NA,
W=kλM/NA W = kλM / NA
となる。 To become. ここで、kは係数であり、k=0.5〜1程度の値がよく使われる。 Here, k is a coefficient, k = 0.5 to 1 degree values ​​are often used.

また、PBS304の透過光路上には、第2の結像レンズ311を介してCCDカメラ312が配置されている。 Further, the transmitted light path of PBS304 is, CCD camera 312 via the second imaging lens 311 is disposed. CCDカメラ312には、CCDカメラ312で撮像した画像を観察するモニタ313が接続されている。 The CCD camera 312, a monitor 313 for viewing an image captured by the CCD camera 312 are connected.

上記のように構成された第2の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の動作を説明する。 Illustrating the operation of the confocal microscope apparatus according to the second embodiment configured as described above.

光源301から出射された光は、光学レンズ302を通って、偏光板303で、所定の偏光のみの直線偏光となって、PBS304に入射する。 The light emitted from the light source 301 passes through the optical lens 302, the polarizing plate 303, becomes linearly polarized light of only a predetermined polarization, incident on the PBS 304. PBS304は、偏光板を透過してきた方向の偏光は反射し、それに垂直な方向の偏光は透過する。 PBS304, the polarization direction transmitted through the polarizing plate is reflected, the polarization direction perpendicular thereto is transmitted.

PBS304で反射された光は、一定の速度で回転する回転ディスク305に入射する。 The light reflected by the PBS304 is incident on the rotary disk 305 rotates at a constant speed. 回転ディスク305の透過部分を透過した光は第1の結像レンズ307を通り、1/4波長板308で円偏光となって、対物レンズ309によって結像され、標本310に入射される。 Light transmitted through the transmission portion of the rotating disk 305 passes through the first imaging lens 307, is circularly polarized by the 1/4-wave plate 308, is focused by the objective lens 309, is incident on the specimen 310.

標本310で反射された光は、対物レンズ309を通り、1/4波長板308で、入射時と直交した直線偏光となり、第2の結像レンズ311を介して回転ディスク305上に標本310の像を結像する。 The light reflected by the specimen 310 passes through the objective lens 309, in 1/4-wave plate 308, becomes linearly polarized light perpendicular to the time of incidence, of the specimen 310 on the rotary disk 305 through the second imaging lens 311 to form an image.

回転ディスク305上に結像された像のうち、焦点の合っている成分は、回転ディスク305上の透過部分を通過する。 Of imaged on a rotating disk 305 the image, ingredients in focus passes through the transparent portion on the rotating disk 305. 回転ディスク305を通過した成分は、PBS304を透過して、第2結像レンズ311を介してCCDカメラ312に到達し、その結像面(撮像面)に試料像が結像される。 Components that have passed through the rotation disk 305 is transmitted through the PBS 304, to reach the CCD camera 312 via the second imaging lens 311, the sample image is formed on the imaging plane (the imaging plane).

標本310を観察しているときのある瞬間を考えれば、標本310上には図4のように、ある方向にラインが投影されている。 Given a certain moment when being observed specimen 310, is formed on the sample 310 as shown in FIG. 4, lines in one direction is projected.

このような状態で、標本310から反射した光が回転ディスク305上に結像された場合には、標本310について、その焦点が合っている部分は回転ディスク上にラインが投影される。 In this state, when the light reflected from the specimen 310 are focused on the rotating disk 305, the sample 310, a portion thereof-focus the line is projected on a rotating disk. しかし、非合焦部分は回転ディスク305に投影された像がボケているので、非合焦像の大部分はディスクを透過できないことになる。 However, since the out-of-focus portion projected on the rotation disk 305 the image is blurred, the majority of the non-focused image would not be transmitted through the disk. 従って、合焦した像のみが回転ディスク305を透過することになる。 Therefore, only the in-focus image is transmitted through the rotating disk 305.

なお、回転ディスク305が回転しない場合には、このままの状態であって、単にサンプルとラインが重なった像である。 Incidentally, when the rotation disk 305 does not rotate, a this state is simply image samples and lines are overlapped. しかし、回転ディスク305を回転させることによって、透過部分と遮蔽部分からなるラインが標本310上を方向を変えながら移動して行くことになるので、平均化されてライン像は消えて、焦点のあった画像が観察される。 However, by rotating the rotating disk 305, the line consisting of transmissive portion and the shielding portion so that the upper sample 310 moves while changing the direction, the line image are averaged disappear, a focus image is observed. 従って、CCDカメラ312の露出時間に対して、回転ディスク305の回転が十分速ければ、合焦画像をCCDカメラ312で撮像しモニタ313で観察できることになる。 Therefore, with respect to exposure time of the CCD camera 312, if the rotation of the rotating disk 305 is fast enough, so that can be observed on the monitor 313 captures an in-focus image by the CCD camera 312. 例えば、CCDカメラ312が通常でTVレートならば、露出時間は1/60秒か1/30秒であるから露出時間中に回転ディスク305の回転数を、半回転する程度の1800rpmくらいにすれば良い。 For example, if TV rate CCD camera 312 is in the normal, the rotational speed of the rotary disk 305 during the exposure time from the exposure time is 1/60 second or 1/30 second, if enough of a degree that a half turn 1800rpm good.

この時における第1の走査光学系100′の標本310面上での深さ方向の励起光分布は、スリットの長手方向では、顕微鏡のケーラー照明の照射分布と同じである。 Excitation light distribution in the depth direction on the sample 310 surface of the first scanning optical system 100 'in this case, in the longitudinal direction of the slit is the same as the illumination distribution of the microscope Kohler illumination. スリットの幅方向では、第2の走査光学系と同じ分布である。 The width direction of the slit, the same distribution as the second scanning optical system.

従って、第1の走査光学系の標本面上での探さ方向の励起光分布は、長手方向と幅方向のものとが合成されたものになる。 Accordingly, the excitation intensity distribution of the probe Is direction on the first sample surface of the scanning optical system will those things in the longitudinal direction and the width direction and are synthesized. なお、励起光の深さ方向の強度分布を変更させるには、回転ディスク305のスリット幅及びスリット間隔を変えることで可変可能である。 Incidentally, in order to change the intensity distribution in the depth direction of the excitation light is variably by changing the slit width and the slit spacing of the rotating disk 305.

第2の実施形態では、第1の実施形態で示した第2の走査光学系により照射された光の反応を受けた動的変化を第1の走査光学系100′で検出することで、第1と第2の標本面上での深さ方向の励起光分布が違って出来る。 In the second embodiment, by detecting the dynamic changes that have undergone reaction of the irradiated light by the second scanning optical system shown in the first embodiment in the first scanning optical system 100 ', the 1 and can be excited light distribution in the depth direction is different on the second sample surface. 従って、第2の走査光学系200が励起している範囲よりもより広範囲な測定が第1の走査光学系100′で可能である。 Therefore, a more extensive measurements than the range in which the second scanning optical system 200 is excited is possible in the first scanning optical system 100 '.

特に神経系の測定では、標本の厚み方向に伸びている神経の動きを捉えるには、高速に画像を取得する必要がある。 In particular, measurement of the nervous system, the capture movement of nerves extending in the thickness direction of the specimen, it is necessary to acquire the image at high speed. 通常、共焦点顕微鏡装置では、標本面上での深さ方向の励起光分布の幅が狭いため、標本の厚み方向に伸びていると一度の測定では、画像を捉えることが出来ない。 Usually, in the confocal microscope, since the width of the excitation light distribution in the depth direction on the sample surface is small, the measurement of once extends in the thickness direction of the specimen, you can not capture the image. よって、第2の実施の形態のように、標本面上での探さ方向の励起光分布の幅を広くして測定することにより広範囲の画像測定が出来る効果がある。 Therefore, as in the second embodiment, an effect that can wide image measurements by measuring by the width of Is direction of the excitation light distribution probe on the sample surface. このため、第2の実施形態において、回転ディスク305を省略した構成としても良い。 Therefore, in the second embodiment, it may be omitted rotating disk 305. また、回転ディスクは、図4に示したものに限られず、共焦点効果が得られるようなものであれば、どのような形状或いは、構成のものを用いてもよい。 The rotary disk is not limited to that shown in FIG. 4, as long as such a confocal effect is obtained, any shape or may be used as configuration. 例えば、回転ディスクにピンホールが形成されているものであっても良いし、上記の実施の形態のような透過型ではなく、反射型のものとしても良い。 For example, it may be one that pinholes are formed in the rotation disk, rather than a transmissive type, such as the above-described embodiment, may be of a reflective type.

また、第2の実施形態では、第2のビーム径可変機構202は必ずしも必要ではないが、第2のビーム径可変機構202があれば、第1の断面と第2の断面の比を変えることが可能であり、画像を取得する範囲と刺激を与える部分の微調整により、実験(そして/又は観察)の自由度が広がる。 In the second embodiment, the second beam diameter varying mechanism 202 is not necessary, if the second beam diameter varying mechanism 202, by changing the first section and the ratio of the second cross section are possible, the fine adjustment of the portion giving the range and stimulus for acquiring images, spread freedom experiments (and / or observation). また、第2のビーム径可変機構202を設ける場合には、第1の実施形態と同様に励起光強度分布算出手段160を設けることが好ましい。 Further, in the case of providing the second beam diameter varying mechanism 202 is preferably similar to the first embodiment is provided with the excitation light intensity distribution calculating means 160.

また、上記の構成において、第1の走査光学系100′をケーラー照明による顕微鏡光学系で構成することにより、より広い励起範囲での画像取得が可能である。 Further, in the above configuration, by configuring the first scanning optical system 100 'in the microscope optical system according to Kohler illumination, it is possible to image acquisition in a wider excitation range. なお、この場合には、回転ディスク305は不要になる。 In this case, the rotating disk 305 is not necessary.

上記の第2の実施形態において、PBS304をダイクロイックミラーに変更しても良い。 In the second embodiment described above may be changed PBS304 the dichroic mirror. このようにした場合には、ダイクロイックミラーで光源からの光を反射させ、標本からの蛍光を通過させることによって、励起光学系と測定光学系の光路を分離できるので、偏光板303は不要になる。 In such a case, by reflecting the light from the light source by the dichroic mirror, by passing the fluorescence from the specimen, it is possible to separate the optical path of the measuring optical system and the excitation optical system, a polarizing plate 303 is not required .

上記の各実施形態における共焦点顕微鏡装置の用途としては、例えば、細胞における研究分野では、局所的に励起し、励起した部位からの反応を観察する用途がある。 Applications of confocal microscopy apparatus in each embodiment described above, for example, in the research field in the cell, locally excited, there is a purpose to observe the reactions of the excited site.

アンケージド(Uncaged)という手法では、局所的に励起することで活性物質の濃度が変化する。 The technique of Ankejido (Uncaged), the concentration of the active substance changes by locally excited. その濃度変化を計測する場合に、局所的に励起した部位以外の周辺部分を同時に計測することで、細胞内の機能解析が行なうことが可能である。 When measuring the concentration change, by simultaneously measuring the peripheral portion other than the portion which is locally excited, it is possible to functional analysis of intracellular performed.

フォトブリーチという手法では、細胞を局所的に励起することによって、当該部位の退色を施す。 The technique of photobleach, by locally excite cells, subjected to fading of the site. その部位は、周辺のタンパク質の移動により時間とともに退色した部位が復帰する現象が見られる。 The site is a phenomenon in which portions faded over time due to movement of the periphery of the protein is recovered is observed. 従って、局所的に励起した部位と周辺部分との両者での計測が必要になる。 Therefore, it is necessary to measure in both the locally excited portion and peripheral portion.

図5を参照してその一例を示す。 Referring to FIG. 5 shows an example of this in. 図5は神経組織の観察を模式的に示した図である。 Figure 5 is a diagram schematically showing the observation of the neural tissue.

例えば細胞体1から細胞体2に軸索3を伝わるイオンを細胞体1に注入されたケージド蛍光色素をプローブとして観察しようとする場合には、まず、細胞体1上の焦点面4に標本を刺激するためのレーザ光を照射する。 For example, when the cell body 1 to the cell body 2 ions transmitted axons 3 to be observed a caged fluorescent dye injected into the cell body 1 as a probe, first, a sample in the focal plane 4 on the cell bodies 1 irradiating a laser beam for stimulation. そして、その後の変化を標本観察用のレーザ光で観察する。 Then, to observe the subsequent changes in the laser light for the specimen observation. しかし、観察用のレーザ光の深さ方向の励起光強度分布は、通常は刺激用のレーザ光と同じ深さの励起光強度分布5となるので、従来では、その分布の範囲内に入っていない軸索3を伝わる蛍光色素は励起光が当たらないため観察できないことがある。 However, the excitation light intensity distribution in the depth direction of the laser light for observation, because usually the excitation light intensity distribution 5 of the same depth as the laser light for stimulation, in a conventional, not within the distribution fluorescent dyes transmitted without axons 3 may not be observed because not exposed to the excitation light. これに対して、本発明の各実施形態においては、標本に刺激を加えるレーザ光と画像取得のためのレーザ光との標本面上での深さ方向の励起光強度分布をそれぞれ独立に変化させることができるので、従来の問題を解決できる。 In contrast, in each of the embodiments of the present invention, varying the excitation light intensity distribution in the depth direction on the specimen surface with the laser beam for the laser beam and the image acquisition applying a stimulus to the specimen to independently since it is possible, we can solve the conventional problems.

上記の各実施形態から下記の発明が抽出される。 Following invention is extracted from each of the above embodiments. なお、本発明は、上記の発明の実施の形態に限定されるものではない。 The present invention is not limited to the embodiments of the invention described above. 本発明の要旨を変更しない範囲で種々変形して実施できるのは勿論である。 It is of course can be variously modified without departing from the scope of the present invention.

本発明の第1局面に係る共焦点顕微鏡装置は、第1のレーザ光源からのレーザ光で標本の走査画像を得るための第1の走査光学系と、前記第1のレーザ光源とは異なる第2のレーザ光源からのレーザ光で前記標本の特定部位を走査して、特異現象を発現させるための第2の走査光学系と、前記第1の走査光学系と前記第2の走査光学系の少なくとも一方のレーザ光のビーム径を変化させることができるビーム径可変機構とを具備することを特徴とする。 Confocal microscope apparatus according to a first aspect of the present invention, first a first scanning optical system for obtaining a scanned image of the specimen with the laser beam from the first laser light source, and the first laser light source different scanning a specific part of the specimen with the laser beam from the second laser light source, specifically a phenomenon and a second scanning optical system for the expression of the first scanning optical system and the second scanning optical system characterized by comprising a beam diameter varying mechanism capable of changing a beam diameter of at least one laser beam. レーザ光学系とレーザ走査型顕微鏡の組合せによる、標本面上での深さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。 By a combination of a laser optical system and the laser scanning microscope, it is possible to vary the width of the measurement due to the difference of the excitation intensity distribution in the depth direction on the sample surface. 具体的には、以下の通りである。 Specifically, as follows.

従来においては、標本の動的解析をする場合は、刺激を加える範囲と画像を取得する範囲が異なることはもとより、刺激を加えるレーザ光の標本面上での深さ方向の励起光強度分布と画像を取得するレーザ光の深さ方向の励起光強度分布を互いに異なるようにしたいことがある。 Conventionally, if the dynamic analysis of the specimen, that the scope of obtaining the range and image adding stimulus are different as well, the excitation light intensity distribution in the depth direction on the sample surface of the laser beam applying stimulation there may want to excitation light intensity distribution in the depth direction of the laser beam to obtain an image to be different from each other. その上で、深さ方向の励起光強度分布の幅を意図的に狭くしたいこともある。 On top of that, sometimes you want to narrow the width of the excitation light intensity distribution in the depth direction intentionally.

本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。 The present invention is not limited to the above embodiments, other than can be embodied with may implement various modifications without departing from the scope of the invention. さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。 Furthermore, the above embodiments include inventions of various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent elements.

すなわち、例えば、上記の各実施形態から下記の発明が抽出できる。 Thus, for example, the following inventions from the above-described embodiments can be extracted. なお、下記の各発明は単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。 Incidentally, the respective invention described below may be applied alone, or may be applied in combination.

本発明の第1局面に係る共焦点顕微鏡装置は、各走査光学系のレーザ光の射出口に、レーザ光の光束径を変化させるビーム径可変機構を備えている。 Confocal microscope apparatus according to a first aspect of the present invention, the exit of the laser beam of each scanning optical system, and a beam diameter varying mechanism that changes the beam diameter of the laser beam. このビーム径可変機構によってレーザ光の光束径を小さくした場合、対物レンズの開口数は光束径が大きい場合に比べて小さくなる。 The beam-diameter case having a small beam diameter of the laser beam by varying mechanism, the numerical aperture of the objective lens is smaller than that in the case where the light beam diameter is large. その結果、対物レンズを交換しなくても標本面上で探さ方向の励起光強度分布の幅が狭くなる。 As a result, the width direction of the excitation light intensity distribution to find that on the specimen surface without replacing the objective lens is narrowed. 更に、ビーム径可変機構を各光学系に備えることで、各光学系の標本面上での探さ方向の励起光強度分布を独立に変化させることができる。 Further, by providing the beam diameter variable mechanism to each optical system, it is possible to change the Is direction of the excitation light intensity distribution probe on the sample surface of the optical system independently. 更にその標本面上での深さ方向の励起光分布の幅を意図的に変えることが可能である。 Furthermore it is possible to vary the width of the excitation light distribution in the depth direction on the sample surface intentionally.

本発明の第2局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第1の走査光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを具備し、前記第1の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、前記インコヒーレントな光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出されることを特徴とする。 Confocal microscope apparatus according to a second aspect of the present invention, first of scanning the specimen via the objective lens by the light output from the light source is not a coherent, detecting the fluorescence from the specimen via the objective lens a scanning optical system is irradiated with a laser beam output from the laser light source to a specific site of the specimen, and a second scanning optical system for the expression of specific phenomena, the first scanning optical system , further comprising a rotary disc for obtaining a confocal effect, the incoherent light scans the specimen through the rotary disk, the fluorescence and characterized by being detected through said rotary disk to. レーザ光学系とディスクタイプの共焦点顕微鏡装置の組合せによる標本面上での探さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。 It is possible to vary the width of the measurement by combining the difference of Is direction of the excitation intensity distribution probe on the sample surface by the confocal microscope apparatus of the laser optical system and disk type.

本発明の第3局面に係る共焦点顕微鏡装置は、コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第1の光学系と、レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを具備することを特徴とする。 Confocal microscope apparatus according to a third aspect of the present invention, first that illuminates the specimen via the objective lens by the light output from the light source is not a coherent, detecting the fluorescence from the specimen via the objective lens an optical system, is irradiated with laser light output from the laser light source to a specific site of the specimen, characterized by comprising a second scanning optical system for the expression of specific phenomena. レーザ光学系とケーラー照明における顕微鏡の組合せによる標本面上での深さ方向の励起強度分布の違いによる測定の幅を変えることが可能である。 It is possible to vary the width of the measurement due to the difference of the excitation intensity distribution in the depth direction on the sample surface by the combination of a microscope in the laser optical system and Koehler illumination.

上記の共焦点顕微鏡装置の好ましい実施態様は以下のとおりである。 A preferred embodiment of the above confocal microscope apparatus is as follows. なお、以下の各実施態様は、単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。 Incidentally, each of the following embodiments may be applied alone or may be applied in combination.
(1) 前記第2の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えること。 (1) the second scanning optical system may further comprise a beam diameter varying mechanism for changing the diameter of the laser beam of the laser light source.
(2) 前記ビーム径可変機構より出力されるレーザ光のビーム径から標本面上での深さ方向の励起光強度分布を算出し、又は記憶する励起光強度分布算出手段を更に具備すること。 (2) the beam-diameter to calculate the excitation light intensity distribution in the depth direction on the sample surface from the beam diameter of the laser beam output from the varying mechanism, or the excitation light intensity distribution calculating means, further comprising storing.
(3) 前記第1のレーザ光源はIRパルスレーザであり、前記ビーム可変機構は、前記第2の走査光学系に設けられていること。 (3) the first laser light source is an IR pulse laser, the beam variable mechanism that is provided in the second scanning optical system.
(4) 前記ビーム径可変機構から出力されたレーザ光の標本面上での深さ方向の強度分布を算出する深さ方向強度分布算出手段を更に備えること。 (4) the beam-diameter further comprise a depth direction intensity distribution calculating means for calculating an intensity distribution in the depth direction on the sample surface of the laser beam output from varying mechanism.
(5) 前記コヒーレントではない光源は、ランプもしくはLED光源であること。 (5) The light source is not coherent, it is a lamp or a LED light source.

なお、本発明は、上記の共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法としても成立する。 The present invention is also established as an observation method using the confocal microscope apparatus.
また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。 Moreover, even if some constituent features are deleted from all the components shown in the embodiments, the invention can be solved the problem mentioned in the description of the problem to be solved, are described in the effects of the invention effectively If the obtained, the configuration from which the constituent elements are deleted can be extracted as an invention.

100、100′…第1の走査光学系、101…第1のレーザ光源、102…第1のビーム径可変機構、103…リレーレンズ、104…第1の走査光学ユニット、104a、104b…走査ミラー、105…リレーレンズ、106…ミラー、120…ダイクロイックミラー、130…結像レンズ、132…対物レンズ、134…標本、136…ステージ、140…測光フィルタ、142…レンズ、144…ピンホール、146…光電変換素子、150…ダイクロイックミラー、160…励起光強度分布算出手段、200…第2の走査光学系、201…第2のレーザ光源、202…第2のビーム径可変機構、203…第2の走査光学ユニット、203a、203b…走査ミラー、204…リレーレンズ、301…光源、302…光学レンズ、 100, 100 '... first scanning optical system, 101 ... first laser light source, 102 ... first beam diameter varying mechanism, 103 ... relay lens, 104 ... first scanning optical unit, 104a, 104b ... scanning mirror , 105 ... relay lens, 106 ... mirror, 120 ... dichroic mirror, 130 ... imaging lens 132 ... objective lens, 134 ... sample, 136 ... stage, 140 ... photometric filter, 142 ... lens, 144 ... pin hole, 146 ... photoelectric conversion element, 150 ... dichroic mirror, 160 ... pumping light intensity distribution calculating means, 200 ... second scanning optical system, 201 ... second laser light source, 202 ... second beam diameter varying mechanism, 203 ... second scanning optical unit, 203a, 203b ... scanning mirror, 204 ... relay lens, 301 ... light source, 302 ... optical lens, 03…偏光板、304…偏光ビームスプリッター(PBS)、305…回転ディスク、306…回転軸、307…第1の結像レンズ、308…波長板、309…対物レンズ、310…標本、311…第2の結像レンズ、312…CCDカメラ、313…モニタ。 03 ... polarizing plate, 304 ... polarization beam splitter (PBS), 305 ... rotating disk 306 ... rotary shaft, 307 ... first imaging lens, 308 ... wave plate, 309 ... objective lens, 310 ... sample, 311 ... first second imaging lenses, 312 ... CCD camera, 313 ... monitor.

Claims (7)

  1. コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第1の走査光学系と、 A first scanning optical system to scan the specimen via the objective lens, to detect the fluorescence from the specimen via the objective lens by the light output from the light source is not coherent,
    レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを具備し、 Irradiating a laser beam outputted from the laser light source to a specific site of the specimen, and a second scanning optical system for the expression of specific phenomena,
    前記第1の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、 The first scanning optical system further comprises a rotary disc for obtaining a confocal effect,
    前記コヒーレントではない光源から出力された光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、 The light output from the light source is not a coherent scans the specimen through said rotary disk,
    前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出され、 The fluorescence is detected through the rotary disk,
    前記第2の走査光学系は回転ディスクを介さずに前記レーザ光を前記標本の特定部位に集光し、 The second scanning optical system condenses the laser light not through the rotary disk to a specific site of the specimen,
    前記第1の光学系及び前記第2の走査光学系の焦点面は同じ深さ位置にあり、 The focal plane of the first optical system and the second scanning optical system is located on the same depth position,
    前記第2の走査光学系は、前記レーザ光をXY方向に任意に偏向する走査手段によってそのレーザ光を前記特定の部位に照射することを特徴とする顕微鏡装置。 The second scanning optical system, the microscope apparatus characterized by irradiating the laser beam to the specific site by scanning means for deflecting any said laser beam in the XY direction.
  2. 請求項記載の顕微鏡装置において、前記第2の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えることを特徴とする顕微鏡装置。 In the microscope apparatus according to claim 1, the microscope apparatus characterized by the second scanning optical system further comprises a beam diameter varying mechanism for changing the diameter of the laser beam of the laser light source.
  3. コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本を走査し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第1の走査光学系と、 A first scanning optical system to scan the specimen via the objective lens, to detect the fluorescence from the specimen via the objective lens by the light output from the light source is not coherent,
    レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に照射し、特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを具備し、 Irradiating a laser beam outputted from the laser light source to a specific site of the specimen, and a second scanning optical system for the expression of specific phenomena,
    前記第1の走査光学系は、共焦点効果を得るための回転ディスクを更に具備し、 The first scanning optical system further comprises a rotary disc for obtaining a confocal effect,
    前記コヒーレントではない光源から出力された光は、前記回転ディスクを介して標本を走査し、 The light output from the light source is not a coherent scans the specimen through said rotary disk,
    前記蛍光は、前記回転ディスクを介して検出され、 The fluorescence is detected through the rotary disk,
    前記第2の走査光学系は回転ディスクを介さずに前記レーザ光を前記標本の特定部位に集光し、 The second scanning optical system condenses the laser light not through the rotary disk to a specific site of the specimen,
    前記第1の光学系及び前記第2の走査光学系の焦点面は同じ深さ位置にあり、前記第2の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えることを特徴とする顕微鏡装置。 The focal plane of the first optical system and the second scanning optical system is located on the same depth position, the beam diameter varying mechanism and the second scanning optical system to change the beam diameter of the laser beam of the laser light source microscope apparatus characterized by further comprising.
  4. コヒーレントではない光源から出力された光によって対物レンズを介して標本をケーラー照明し、前記標本からの蛍光を前記対物レンズを介して検出する第1の光学系と、 A first optical system for a specimen with Kohler illumination through the objective lens to detect the fluorescence from the specimen via the objective lens by the light output from the light source is not coherent,
    レーザ光源から出力されたレーザ光を標本の特定の部位に集光して照射し、特異現象を発現させるための第2の走査光学系とを具備し、 Irradiated by focusing a laser beam output from the laser light source to a specific site of the specimen, and a second scanning optical system for the expression of specific phenomena,
    前記第1の光学系及び前記第2の走査光学系の焦点面は同じ深さ位置にあり、 The focal plane of the first optical system and the second scanning optical system is located on the same depth position,
    前記第2の走査光学系が前記レーザ光源のレーザ光のビーム径を変化させるビーム径可変機構を更に備えることを特徴とする顕微鏡装置。 Microscope apparatus, characterized in that the second scanning optical system further comprises a beam diameter varying mechanism for changing the diameter of the laser beam of the laser light source.
  5. 請求項 〜請求項記載の顕微鏡装置において、前記ビーム径可変機構より出力されるレーザ光のビーム径から標本面上での深さ方向の励起光強度分布を算出し、又は記憶する励起光強度分布算出手段を更に具備することを特徴とする顕微鏡装置。 In the microscope apparatus according to claim 2 to claim 4, wherein the beam-diameter to calculate the excitation light intensity distribution in the depth direction on the sample surface from the beam diameter of the laser beam output from the varying mechanism, or storage exciting light microscope apparatus characterized by further comprising an intensity distribution calculating means.
  6. 共焦点顕微鏡装置を用いた観察方法であって、 A observation method using a confocal microscope,
    回転ディスクを介して標本に励起光を照射し、ディスク走査により標本の蛍光像を取得する第1のステップと、 The excitation light is irradiated to the specimen via the rotary disc, a first step of obtaining a fluorescence image of the specimen by the disk scanning,
    特異現象を発現させるためのレーザ光を前記回転ディスクを介さずに前記標本の所望の位置に集光して照射する第2のステップとを具備し、 The laser light for expressing specific phenomenon and a second step of irradiating condensed at a desired position of the specimen without going through the rotary disk,
    前記第1及び第2のステップにおいて同じ深さ位置にある焦点面にそれぞれの光が照射され、 Each of the light is irradiated to the focal plane at the same depth position in the first and second steps,
    前記第2のステップは、前記標本の所望の位置に前記レーザ光を照射するようにそのレーザ光をXY方向に任意に偏向する走査手段によって偏向させるステップを含むことを特徴とする観察方法。 The second step is the observation method characterized by comprising the step of deflecting the scanning means for deflecting any the laser beam so as to irradiate the laser beam in the XY directions to a desired position of the specimen.
  7. 請求項記載の観察方法において、前記第1又は第2のステップは、前記特異現象を発現させるための光の焦点面を同じ位置に保ったまま、その標本面における深さ方向の強度分布を調整するステップを更に含むことを特徴とする観察方法。 In observation method according to claim 6, the first or second step, while maintaining the focal plane of light for the expression of the specific phenomena in the same position, the intensity distribution in the depth direction of the sample surface observation method characterized by further comprising the step of adjusting.
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