JP4989830B2 - Use of a beta-naphthoquinone derivative to produce a drug that exhibits an inhibitory effect on glutamate release by the brain - Google Patents

Description

（式中、Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ_２、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３または−ＯＨ基を表わす）、式（ＩＩ）
【化５】

で示される、対応するグルクロン酸結合された誘導体、あるいは医薬として許容される酸とのこれらの付加塩である使用に向けられている。
【０００６】
最も詳細には、本発明は、それぞれ式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の、国際的一般名に従ってナフタゾン(naftazone)と呼ばれる１，２−ナフトキノン−２−セミカルバゾールに加えて、その対応するグルクロン酸結合された誘導体、１−（１−ヒドロキシ，２−ナフチル）セミカルバジド−１−β−Ｏ−グルコピラノシドウロン酸の使用に向けられている。
【０００７】
【化６】

【０００８】
これらの化合物の酸との付加塩は、鉱酸または有機酸により生成する塩を含む。
【０００９】
例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、更にギ酸、安息香酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、アスパラギン酸およびアルカンスルホン酸が挙げられる。
【００１０】
本発明に従って使用される化合物の調製は、文献、例えばＢＳＭ９２４Ｍまたは特許ＦＲ２１０３５０４号に広く記載されてきた。
【００１１】
後述する実施例に記載する、これらの化合物の抑制性質により、これらの化合物が、過剰に放出されるグルタミン酸塩の有害な作用に関係する神経病および発作を治療することに特に適するようになる。
【００１２】
例えば、外傷性または他の血管由来の脳偶発症候の結果放出される過剰のグルタミン酸塩によるてんかん、筋委縮性側索硬化症、脊髄筋委縮症、ハンチントン舞踏病、有害な作用の治療が挙げられる。
【００１３】
これらの薬剤は、特に経口投与および注入できるチャンネルを経て投与される。有利には、これらの薬剤は、経口投与のために錠剤、糖被覆錠剤、硬質ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、顆粒剤の形態、または注入できるチャンネルを経る投与のために溶液もしくは懸濁液の形態である。
【００１４】
用量は、治療する患者および病状に従って適合させられ、例えば１ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点を下記の実施例に挙げ、ここでは図１および２をそれぞれ参照する：
−図１は、化学発光の測定手法を例証するダイアグラムを表わし、
−図２は、ナフタゾン（図２Ａ）またはそのグルクロン酸結合された誘導体（図２Ｂ）の濃度に対するグルタミン酸塩の自発的な放出および誘発された放出を表わす。
【００１６】
【発明の実施の形態】
実施例１：ナフタゾンおよびそのグルクロン酸結合された誘導体によるグルタミン酸塩に対する抑制効果の検討
Ａ：正常ラットのＣＳＦ（脳脊髄液）中のグルタミン酸塩レベルに対する、ナフタゾンによる１５日間の連続処理の効果の検討
４〜８週齢の、体重２００〜２２０ｇのスプレーグ−ドーリー(Sprague-Dawley)ラットと両性のスイス−ウェブスターマウスとを使用する。
【００１７】
１２時間の明／暗周期を有する２３〜２４℃のよく換気された室内の籠に動物を保つ。
【００１８】
対照中の、またはナフタゾンによる処理後のＣＳＦグルタミン酸塩レベルを調べるために、雄性ラットを３つの群に分ける：
−群Ｉ（ｎ＝８）を対照として使用する。この群のラットに、口当たり(per os)１５日間、ナフタゾンを可溶化するために使用するものと同じ担体(carrier)、すなわち１％メチルセルロース（シグマ社）を与える、
−群ＩＩ（ｎ＝５）およびＩＩＩ（ｎ＝５）の動物に、口当たり１５日間、単一の丸薬として与えて、ｋｇ当たり、１日当たりそれぞれ１０ｍｇおよび１００ｍｇのナフタゾンを与える。
【００１９】
６％ペントバルビタール（ｉ．ｐ．）で麻酔をかけたラットのＣＳＦを、通常の方法に従って操作することにより集める。
【００２０】
次いで動物を断頭する。ＣＳＦ試料を１０℃、６０００ｇで１０分間遠心分離する。
【００２１】
上清を抽出し、血液析出物を含有する沈降物を除去する。
【００２２】
試料を２．５％トリクロロ酢酸中に保持し、−８０℃に保つ。
【００２３】
試料からトリクロロ酢酸を洗い流すためにエーテルを使用する。
【００２４】
ＣＳＦ中のグルタミン酸塩レベルを決定するために、図１のダイアグラムに記載された方法に従って化学発光の測定を行う。反応は、グルタミン酸塩脱水素酵素の作用下でのグルタミン酸塩の２−オキソグルタル酸塩への酸化に基づき、これはＮａＤＨ２を生じ、光細菌の化学発光反応を用いることにより評価される。
【００２５】
既知の体積の試料を、トリス緩衝液（１２０ｍＭ、ｐＨ７．２）中の２５０μｌのサッカロース（１２０ｍＭ）と、５０μｌのＮＡＤ、ＤＭＮ、ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素、ルシフェラーゼおよびＧＤＨの酵素混合物と、５μｌのｎ−デシルアルデヒドとを含有する反応媒質に添加することによりＣＳＦ試料を試験する。
【００２６】
Ｌ−グルタミン酸塩の酸化とＮＡＤＨの生産とに連続する発光反応により放射される光を、光電子倍増管装置により検出し、記録し、それを標準グルタミン酸塩により放射される光と比較することにより検定する。
【００２７】
不対の(unpaired)試料についてスチューデントのｔ検定を用いることにより、データの統計的解析を行う。値を平均値＋／−ＳＥＭで表し、ｎは動物または行った実験の数である。
【００２８】
データはｐ<０．０５において対照に対して有意差があると考えられる。
【００２９】
メチルセルロース担体を１５日間投与されてきた対照ラット（群Ｉ）は、２２．１＋／−６．３ｎｍｏｌ・ｍｌ^−１の平均値（ｎ＝８）を伴って、１６〜３４ｎｍｏｌ・ｍｌ^−１のＣＳＦグルタミン酸塩含有量を有する。
【００３０】
１０または１００ｍｇ／ｋｇのナフタゾン用量を用いる１５日間のラット（群ＩＩおよびＩＩＩ）の毎日の処理により、ラットの両方の群のＣＳＦグルタミン酸塩含有量がそれぞれ８．１＋／−１．８（ｎ＝５）および１０．８＋／−３．３ｍｌ^−１（ｎ＝５）であることが示される。
【００３１】
これらの結果により、両方のナフタゾン用量で処理したラットのＣＳＦ中のグルタミン酸塩含有量が、対照と比較して顕著に減少する（それぞれｐ＝０．００１およびｐ＝０．００４）ことが示される。
【００３２】
更に、ナフタゾンで処理したラットの両方の群の間に、ＣＳＦグルタミン酸塩含有量の顕著な違いが見られず、このことは、薬剤の効果が用量相関性でないことを示す。
【００３３】
Ｂ：マウスの脳のシナプトソームからのグルタミン酸塩の放出に対するナフタゾンおよびそのグルクロニド誘導体の効果の検討
苔状繊維のシナプトソームを調製するために、スイス−ウェブスターラットを断頭し、小脳を迅速に除去する。組織の小片（１〜２ｍｍ^３）を、下記のもの（ｍＭ）を含有する１００ｍｌの哺乳類塩類標準溶液中で洗浄する：ＮａＣｌ、１３６；ＫＣｌ、５．６；ＭｇＣｌ_２、１．２；ＣａＣｌ_２、２．２；グルコース、５．５；ＮａＨＣＯ_３、７．５；ＮａＨＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液、１．２。
【００３４】
酸素流をこれらに１０分間通じる。
【００３５】
片を解離するために、これらを１ｍｌのピペットを用いて逆方向の動きで吸い上げる。
【００３６】
得られるホモジネートを３ｍｌの哺乳類クレブス(Krebs’s)溶液中で希釈し、ナイロン（登録商標）組織（メッシュ５０μｍ）で濾過する。
【００３７】
濾液を集め、重力により３０〜４５分間沈降させる。
【００３８】
グルタミン酸塩の(glutamatergic)苔状繊維に由来するシナプトソームは、核フラクションについてのその大きなサイズのために沈降する。上清を捨て、沈降物を１ｍｌの標準溶液に再懸濁する。シナプトソームからのグルタミン酸塩の放出を、ＣＳＦ中でこれを評価するために使用される技術に従って検出する。
【００３９】
図２Ａおよび２Ｂは、グルタミン酸塩の自発的な放出（曲線―○―）および減極(depolarization)により誘発される放出（曲線―●―）に対するナフタゾン（濃度０．５〜５０μＭ）およびそのグルクロン酸結合された誘導体の効果をそれぞれ示す。
【００４０】
ＡおよびＢ中の各点は、三つ組で行われる３回の測定のＩＳＥＭ平均を示す。Ａにおいて、自発的に放出されたグルタミン酸塩は、試験される薬剤に１時間晒される間に連続的に測定され、対照と比較される。減極によるグルタミン酸塩の放出は、試験される薬剤に１時間晒した後に決定され、対照と比較される。
【００４１】
薬剤を、測定前に、シナプトソームアリコートを用いて１時間加温放置する。
【００４２】
高いＫ^＋含有量（３０ｍＭ）を有し、Ｃａ^２＋（５ｍＭ）を含有する媒質により誘発される減極に応答するグルタミン酸塩の放出は、検討した濃度値ではナフタゾンに顕著に影響されない。
【００４３】
しかしながら、図２Ａに示すように、ナフタゾンは、シナプトソームからのグルタミン酸塩の自発的な放出を減少させる。グルタミン酸塩の自発的な放出に対するナフタゾンの抑制効果は、使用される薬剤の最低の濃度（０．５μＭ）で既に観察される。この効果は２５μＭの濃度で最大である。
【００４４】
より高い濃度は、抑制効果を更に増大させないようである。
【００４５】
自発的な放出およびＫ^＋により引き起こされる放出に対する、グルクロン酸結合された誘導体の効果を評価するとき、薬剤が、使用される濃度の範囲でグルタミン酸塩の自発的な放出を減少させないことがわかる。
【００４６】
しかしながら、図２Ｂに示すように、グルクロン酸結合された誘導体は、用量に相関して、高いＫ^＋含有量（２０ｍＭ）を有し、Ｃａ^２＋（５ｍＭ）を含有する媒質により誘発される放出を減少させる。
【００４７】
最大の減少（約６０％）は、試験される薬剤の最高の濃度（３２μＭ）で観察される。
【００４８】
実施例２：医薬組成物の調製
従来技術に従って操作することにより、下記のものを含有する錠剤：
−ナフタゾン：１０ｍｇ
−１００ｍｇにするための賦形剤
または下記のものを含有する、注入できる溶質を製造する：
−ナフタゾン：５ｍｇ
−２ｍｌにするための滅菌水。
【図面の簡単な説明】
【図１】 化学発光の測定手法を例証するダイアグラムである。
【図２】 ナフタゾン（図２Ａ）またはそのグルクロン酸結合された誘導体（図２Ｂ）の濃度に対するグルタミン酸塩の自発的な放出および誘発された放出を表わすグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel use of a beta-naphthoquinone derivative and salts thereof for producing a drug exhibiting an inhibitory effect on glutamate release in the brain.
[0002]
[Prior art and problems to be solved]
Glutamate is a major neurotransmitter in the mammalian central nervous system.
[0003]
However, its excessive accumulation in the extracellular space of the brain is toxic to neurons, which means that excessive accumulation of glutamate is released as a result of traumatic blood vessels or other brain incidents. Has led to the notion that it is a causative factor for a number of neurological diseases such as epilepsy, amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, Huntington's chorea, and various seizures related to the harmful effects of.
[0004]
Research by the inventors of certain beta-naphthoquinone compounds known as vasoprotective drugs has shown that these compounds surprisingly have an inhibitory effect on glutamate release. .
[0005]
[Means for Solving the Problems]
Accordingly, the present invention is a novel use of beta-naphthoquinone derivatives for the manufacture of a medicament having an inhibitory effect on the release of glutamate by the brain, wherein these derivatives have the formula (I)
[Formula 4]

(Wherein R represents —NH—CO—NH ₂ , —NH—CO—CH ₃ or —OH group), formula (II)
[Chemical formula 5]

For the corresponding glucuronic acid linked derivatives or their addition salts with pharmaceutically acceptable acids.
[0006]
Most particularly, the present invention relates to 1,2-naphthoquinone-2-semicarbazole, according to the international common name of formulas (III) and (IV), respectively, in addition to its corresponding glucuronic acid. It is directed to the use of the coupled derivative, 1- (1-hydroxy, 2-naphthyl) semicarbazide-1-β-O-glucopyranoside uronic acid.
[0007]
[Chemical 6]

[0008]
Addition salts of these compounds with acids include salts formed with mineral acids or organic acids.
[0009]
Examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, as well as formic acid, benzoic acid, maleic acid, tartaric acid, citric acid, oxalic acid, aspartic acid and alkanesulfonic acid.
[0010]
The preparation of the compounds used according to the present invention has been extensively described in the literature, for example BSM924M or patent FR2103504.
[0011]
The inhibitory properties of these compounds, described in the examples below, make them particularly suitable for treating neurological diseases and seizures related to the detrimental effects of excessively released glutamate.
[0012]
For example, treatment of epilepsy, amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, Huntington's chorea, adverse effects with excess glutamate released as a result of traumatic or other vascular-derived accidental brain events .
[0013]
These agents are administered in particular via oral administration and injectable channels. Advantageously, these agents are in the form of tablets, sugar-coated tablets, hard gelatin capsules, capsules, granules for oral administration, or solutions or suspensions for administration via injectable channels It is.
[0014]
The dose is adapted according to the patient to be treated and the medical condition, for example 1 mg to 100 mg / day.
[0015]
Other features and advantages of the present invention are listed in the following examples, which refer now to FIGS. 1 and 2, respectively:
FIG. 1 represents a diagram illustrating a chemiluminescent measurement technique;
FIG. 2 represents the spontaneous and induced release of glutamate versus the concentration of naphthazone (FIG. 2A) or its glucuronidated derivative (FIG. 2B).
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Example 1: Examination of the inhibitory effect on glutamate by naphthazone and its glucuronic acid-conjugated derivatives A: Examination of the effect of 15 days of continuous treatment with naphthazone on the glutamate level in CSF (cerebrospinal fluid) of normal rats Sprague-Dawley rats and bisexual Swiss-Webster mice, 4-8 weeks old, weighing 200-220 g are used.
[0017]
Animals are kept in well-ventilated room cages at 23-24 ° C with a 12 hour light / dark cycle.
[0018]
To examine CSF glutamate levels in controls or after treatment with naphthazone, male rats are divided into three groups:
-Group I (n = 8) is used as a control. This group of rats is given the same carrier used to solubilize naphthazone for 15 days per os, ie 1% methylcellulose (Sigma).
-Groups II (n = 5) and III (n = 5) animals are given as a single pill for 15 days per mouth, giving 10 mg and 100 mg of naphthazone per kg, per day, respectively.
[0019]
The CSF of rats anesthetized with 6% pentobarbital (ip) is collected by manipulating according to normal methods.
[0020]
The animal is then decapitated. The CSF sample is centrifuged at 6000 g for 10 minutes at 10 ° C.
[0021]
The supernatant is extracted and the sediment containing blood precipitate is removed.
[0022]
Samples are kept in 2.5% trichloroacetic acid and kept at -80 ° C.
[0023]
Use ether to wash away trichloroacetic acid from the sample.
[0024]
In order to determine the glutamate level in the CSF, chemiluminescence measurements are performed according to the method described in the diagram of FIG. The reaction is based on the oxidation of glutamate to 2-oxoglutarate under the action of glutamate dehydrogenase, which yields NaDH2 and is evaluated by using a photobacterial chemiluminescent reaction.
[0025]
A known volume of sample was added to 250 μl saccharose (120 mM) in Tris buffer (120 mM, pH 7.2), 50 μl NAD, DMN, NADH-FMN oxidoreductase, luciferase and GDH enzyme mixture and 5 μl. CSF samples are tested by adding to a reaction medium containing n-decylaldehyde.
[0026]
The light emitted by the continuous luminescence reaction during the oxidation of L-glutamate and the production of NADH is detected by a photomultiplier tube device, recorded and assayed by comparing it with the light emitted by standard glutamate. To do.
[0027]
Statistical analysis of the data is performed by using Student's t-test on unpaired samples. Values are expressed as mean +/− SEM, where n is the number of animals or experiments performed.
[0028]
Data are considered significantly different from controls at p <0.05.
[0029]
Control rats which have been administered methylcellulose carrier 15 days (group I) is 22.1 +/- average of 6.3nmol · ^{ml -1} with a (n = 8), CSF of 16~34nmol · ^{ml -1} Has a glutamate content.
[0030]
Daily treatment of rats (groups II and III) for 15 days with naphthazone doses of 10 or 100 mg / kg resulted in a CSF glutamate content of both groups of rats of 8.1 +/− 1.8 (n = 5) and 10.8 +/− 3.3 ml ⁻¹ (n = 5).
[0031]
These results indicate that the glutamate content in the CSF of rats treated with both naphthazone doses is significantly reduced compared to the controls (p = 0.001 and p = 0.004, respectively). .
[0032]
Furthermore, no significant difference in CSF glutamate content was seen between both groups of rats treated with naphthazone, indicating that the effect of the drug is not dose-related.
[0033]
B: Examination of the effect of naphthazone and its glucuronide derivatives on glutamate release from mouse brain synaptosomes To prepare mossy fiber synaptosomes, Swiss-Webster rats are decapitated and the cerebellum is rapidly removed. Small pieces of tissue (1-2 mm ³ ) are washed in 100 ml mammalian salt standard solution containing the following (mM): NaCl, 136; KCl, 5.6; MgCl ₂ , 1.2; CaCl ₂ 2.2; Glucose, 5.5; NaHCO ₃ , 7.5; NaHPO ₄ / Na ₂ HPO ₄ buffer, 1.2.
[0034]
A stream of oxygen is passed through them for 10 minutes.
[0035]
In order to dissociate the pieces, they are sucked up in a reverse motion using a 1 ml pipette.
[0036]
The resulting homogenate is diluted in 3 ml of mammalian Krebs's solution and filtered through nylon® tissue (mesh 50 μm).
[0037]
The filtrate is collected and allowed to settle by gravity for 30-45 minutes.
[0038]
Synaptosomes derived from glutamatergic mossy fibers settle due to their large size for the nuclear fraction. Discard the supernatant and resuspend the sediment in 1 ml standard solution. The release of glutamate from synaptosomes is detected according to the technique used to assess this in CSF.
[0039]
FIGS. 2A and 2B show naphthazone (concentration 0.5-50 μM) and its glucuronic acid for spontaneous release of glutamate (curve— ◯ —) and release induced by depolarization (curve— ● —). Each shows the effect of the bound derivative.
[0040]
Each point in A and B represents the ISEM average of 3 measurements made in triplicate. In A, spontaneously released glutamate is measured continuously during 1 hour exposure to the drug being tested and compared to a control. Glutamate release by depolarization is determined after 1 hour exposure to the drug being tested and compared to a control.
[0041]
Drugs are incubated with synaptosome aliquots for 1 hour prior to measurement.
[0042]
The release of glutamate in response to depolarization induced by a medium with a high K ⁺ content (30 mM) and containing Ca ²⁺ (5 mM) is not significantly affected by naphthazone at the concentration values studied.
[0043]
However, as shown in FIG. 2A, naphthazone reduces spontaneous release of glutamate from synaptosomes. The inhibitory effect of naphthazone on the spontaneous release of glutamate is already observed at the lowest concentration of drug used (0.5 μM). This effect is greatest at a concentration of 25 μM.
[0044]
Higher concentrations do not appear to further increase the suppression effect.
[0045]
When assessing the effect of glucuronidated derivatives on spontaneous release and release caused by K ^+, it can be seen that the drug does not reduce the spontaneous release of glutamate in the range of concentrations used.
[0046]
However, as shown in FIG. 2B, glucuronidated derivatives have a high K ⁺ content (20 mM) and dose-related release induced by a medium containing Ca ²⁺ (5 mM). Decrease.
[0047]
The greatest decrease (about 60%) is observed at the highest concentration of drug tested (32 μM).
[0048]
Example 2: Preparation of a pharmaceutical composition Tablets containing the following by operating according to the prior art:
-Naphthazone: 10mg
Produces an injectable solute containing excipients to 100 mg or the following:
-Naphthazone: 5mg
-Sterile water to make -2 ml.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating a chemiluminescence measurement technique.
FIG. 2 is a graph representing spontaneous and induced release of glutamate versus concentration of naphthazone (FIG. 2A) or its glucuronidated derivative (FIG. 2B).

Claims (4)

To produce drugs to treat epilepsy, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, and detrimental effects of excess glutamate released as a result of traumatic blood vessel-derived brain accidents Of the derivatives of beta-naphthoquinone of formula (I), wherein these compounds have the formula (I)

(Wherein R represents —NH—CO—NH ₂ , —NH—CO—CH ₃ or —OH group),
Formula (II)

A glucuronic acid linked derivative, which is a corresponding compound having
Alternatively, the use of these addition salts with pharmaceutically acceptable acids. Formulas (III) and (IV)

Using 1,2-naphthoquinone-2-semicarbazole or its corresponding glucuronic acid linked 1- (1-hydroxy, 2-naphthyl) semicarbazide-1-β-O-glucopyranoside uronic acid each having The use according to claim 1.   Use according to claim 1 or 2, comprising using a salt produced by a mineral or organic acid. 4. Use according to any one of claims 1 to 3 , characterized in that the medicament is administered orally or by injection.

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