JP4870976B2 - Inspection method of autoimmune diseases using whole blood - Google Patents

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本発明は、被検者由来の試料、特に全血を用いて自己免疫疾患、特に若年性特発性関節炎を検査する方法、そのためのマーカー遺伝子およびキットに関する。 The present invention is a sample derived from a subject, a method of inspecting an autoimmune disease, particularly juvenile idiopathic arthritis particularly with whole blood, to a marker gene and a kit therefor.

自己免疫疾患は、生体防御機構である免疫系が自己の細胞を攻撃してしまう現象である。 Autoimmune disease is a phenomenon in which the immune system is a biological defense mechanism ends up attacking its own cells. 自己抗原と反応する抗体やリンパ球が誘導され、その結果組織障害や病変が生じる。 Antibody or lymphocyte which reacts with autoantigen is induced, resulting tissue damage or lesions caused. 自己免疫疾患は、臓器特異性のない疾患と、特異性のある疾患の2つに大別される。 Autoimmune diseases, and no organ-specific diseases, are divided into two with a specific disease. 自己免疫の関与が示唆されているものの原因が明らかでないものも多く、それらの発症機序を含め、診断方法等、解決すべき課題は多い。 What the cause of those autoimmune involvement has been suggested not clear many, including their pathogenesis, diagnosis method and the like, problems to be solved are many. 自己免疫疾患には、その原因が明らかにされていない疾患の一つとして、若年性特発性関節炎(JIA)がある。 Autoimmune diseases, as one of diseases that cause is not clarified, it is juvenile idiopathic arthritis (JIA).

若年性特発性関節炎(JIA)は、リウマチ性疾患の1種であり、小児のリウマチ性疾患の中で最も頻度の高い疾患である。 Juvenile idiopathic arthritis (JIA) is a type of rheumatic diseases, the most frequent diseases in rheumatic diseases in children. 若年性特発性関節炎はいくつかのサブタイプに分類され、重症度とその予後が大きく異なる。 Juvenile idiopathic arthritis is classified into several subtypes, severity and prognosis differ greatly. 大別すると、熱や皮疹、心膜炎などの全身症状が間欠的に現れるもの(全身型)と、いくつかの関節に症状がでるもの(少関節型、多関節型)とに分類できる。 When roughly classified into heat and rash, systemic symptoms such as pericarditis what appears intermittently and (Systemic), several joints to those symptoms out (low articulated, articulated) and. 特に全身型若年性特発性関節炎は全身の強い炎症反応を伴い生命予後も不良である。 In particular, systemic-onset juvenile idiopathic arthritis is poor also prognosis accompanied by a strong inflammatory response throughout the body. 一方、多関節型若年性特発性関節炎は生命に直接は影響しないが、多関節の変形をきたし、QOLが低下する。 On the other hand, articulated juvenile idiopathic arthritis does not affect directly the life, Kitaichi deformation of the articulated, QOL is reduced. 両者はともに関節炎を有するが、予後が大きく異なるためその判別は非常に重要である。 Both Although both have arthritis, the determination for prognosis varies greatly is very important.

しかし、従来JIA診断はすべて臨床的所見によって行われており(非特許文献1〜4)両者を判別するための有効な方法は、知られていない。 However, an effective method for determining the done and (Non-Patent Documents 1 to 4) both by all conventional JIA diagnostic clinical findings is not known. 従って、若年性特発性関節炎を検査する方法、およびそのサブタイプを判別する方法が望まれていた。 Therefore, a method of inspecting a juvenile idiopathic arthritis, and a method of determining the subtype has been desired.

近年免疫疾患に対する分子生物学的な研究は活発に進められておりサイトカインやその受容体、さらにはシグナルを受け取ってからの細胞内シグナル伝達機構等の研究が進んでいる。 Molecular biological studies are cytokines and are actively underway its receptor for recently immune disease, yet have progressed the study of intracellular signal transduction mechanism and the like from the received signal. しかし、ここに働く個々の遺伝子に注目するだけでは、免疫疾患の特性を表現するには不十分である。 However, only focus on individual genes acting here is insufficient to represent the characteristics of immune disorders. このためDNAマイクロアレイなどを用いることにより、一度に極めて多数の遺伝子の発現情報を得る試みがなされている。 Therefore by the like DNA microarray, attempts to obtain expression information of a very large number of genes have been at one time.

DNAマイクロアレイの測定で得られる大量の遺伝子発現データを統計学的に処理することで、疾患の情報を導き出す方法がこれまでに検討されてきている。 By statistically processing a large amount of gene expression data obtained by the measurement of DNA microarray, a method to derive the information of the disease have been studied so far.

Golubらは、急性リンパ性白血病(ALL)と急性骨髄性白血病(AML)とは、「predictor」遺伝子群の発現パターンによって判別が可能であることを示した(非特許文献5)。 Golub et al., Acute lymphocytic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML), showed that it is possible to determine the expression pattern of "predictor" genes (Non-Patent Document 5). 現在の病理学診断を用いればALLとAMLを形態学的に区別することは、それほど困難なことではないが、この論文は、発現プロファイルによる血液細胞の分類の可能性を示した最初の報告であり、これ以降の同様の論文に最も大きな影響を与え、その考え方の基本になっている。 That current distinguish the use of the pathological diagnosis of ALL and AML Morphologically is not be too difficult, in this paper, the first report showing the possibility of classification of blood cells by expression profile Yes, the most impact on subsequent similar paper, has become the basis for the idea.

Alizadehらは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者の末梢血から分取したBリンパ球をサンプルとしてDNAマイクロアレイによる測定を行い、得られた遺伝子発現データの階層的クラスタリングを行うことにより、同病患者の末梢血Bリンパ球は、リンパ組織の胚中心に存在するB細胞に類似した遺伝子発現パターンを示す場合と、in vitroで活性化したB細胞に類似した遺伝子発現パターンを示す場合の2つの場合があることを見出した(非特許文献6)。 Alizadeh et al., Was measured by DNA microarray The separated B lymphocytes from peripheral blood of diffuse large B-cell lymphoma patient as a sample, by performing a hierarchical clustering of the resulting gene expression data, same disease peripheral blood B lymphocytes of a patient, the lymphoid tissue in the case shown a similar gene expression pattern in B cells present in germinal centers, two in the case shown a similar gene expression pattern in B cells were activated in vitro If it was found that there (non-Patent Document 6). 両者の生存率をKaplan-Meierプロットで調べた結果、後者の発現パターンを示すB細胞を持つ患者は、前者の発現パターンを示すB細胞をもつ患者と比べて予後が悪いことが明らかとなった。 Result of examining the viability of both in Kaplan-Meier plot, patients with B cells displaying latter expression pattern was found to be poor prognosis compared to patients with B cells displaying the former expression pattern . 加えて、従来からの病理学的診断にも続く予後予測に従うよりも、著者らの行った遺伝子発現情報のクラスタリングで得られた結果の方が、予後との相関性が高いことも明らかとなった。 Additionally, than according to the well followed prognosis pathological diagnosis from a conventional, who results obtained with the clustering of gene expression information made by the authors, a also clear that high correlation with prognosis It was.

Alizadehらの研究結果は、遺伝子発現情報から臨床的に利用可能な法則性を導き出せたという点で、意義があるものといえる。 Findings of Alizadeh et al., In that the derivable clinically available regularity from the gene expression data, it can be said that there is significant. しかし、当該結果は、限られたB細胞リンパ腫についてのみ検証されたに過ぎず、その法則がまったく新たな臨床例についても適用できるかどうかについての検証はなされていない。 However, the result is only being validated only for a limited B-cell lymphoma, the verification is not made as to whether the rule is applicable also new clinical cases at all.

本発明は、自己免疫疾患の診断および病態予測のための新しい指標および検査方法を提供することを目的とする。 The present invention aims at providing a new index and test method for the diagnosis and condition prediction of autoimmune diseases.

従来、自己免疫疾患の検査においては、全血から血液細胞像に関する所見や、特にリンパ球等の白血球を分離して調製した細胞抽出物や血清血中のサイトカイン等の免疫関連活性物質の測定が主に用いられてきた。 Conventionally, in the inspection of autoimmune disease, and finding a blood cell image from whole blood, especially the measurement of immune related active substances, such as cytokines such as lymphocytes in cell extracts leukocytes was prepared by separation and serum blood It has been mainly used. しかし、本発明者らは、いずれの成分も分離していない全血から抽出した全RNAを用いて、末梢血細胞で発現している遺伝子の発現量を測定することにより、自己免疫疾患を検査できることを見出した。 However, the present inventors have used total RNA extracted from whole blood without also separating any component, by measuring the expression level of genes that are expressed in peripheral blood cells, that can be inspected autoimmune diseases It was heading. さらに、このために本発明者らは、自己免疫疾患に罹患した患者由来の試料と健常者由来の試料との間で発現量が著しく変動している遺伝子、および自己免疫疾患に罹患した患者においてその病態により発現量が著しく変動している遺伝子を見出した。 Furthermore, the present inventors to achieve this, gene expression levels between the sample from the sample and healthy person from a patient suffering from autoimmune disease is significantly vary, and in patients with autoimmune diseases its expression level by pathology found genes that vary significantly.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1)末梢血細胞で発現している遺伝子の発現を検出することにより自己免疫疾患を検査する方法であって、 (1) A method of inspecting an autoimmune disease by detecting the expression of genes that are expressed in peripheral blood cells,
被検者の全血から全RNAを抽出する工程、および 該全RNAにおける該遺伝子の発現量を測定する工程を含む、 A step of extracting total RNA from whole blood of the subject, and the step of measuring the expression level of the gene in 該全 RNA,
前記方法。 Said method.
(2)自己免疫疾患が若年性特発性関節炎である、(1)記載の方法。 (2) the autoimmune disease is juvenile idiopathic arthritis, (1) The method according.
(3)被検者由来の試料中において、下記(i)〜(v)の工程により決定された遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することを含む、自己免疫疾患を検査する方法: (3) a method in a sample of from a subject, comprising detecting the expression of genes included in the gene set determined by the following processes (i) ~ (v), checking the autoimmune disease:
(i)自己免疫疾患特異的に発現した遺伝子群の発現データを標準化する; (I) to normalize the expression data of autoimmune diseases specifically expressed genes;
(ii)高判別能遺伝子の順位付けを行い、高判別能遺伝子リストを作成する; (Ii) performs the ranking of high discrimination ability genes, creating a high discrimination ability gene list;
(iii)高判別能遺伝子リストから遺伝子セットを選択する; And (iii) selecting a set of genes from a high ability to discriminate gene list;
(iv)工程(iii)の遺伝子セットの判別能力評価を行う; (Iv) determine performance evaluation of a set of genes step (iii) performing;
(v)判別能力を有する遺伝子セットを決定する。 (V) determining a set of genes having a discrimination performance.
(4)被検者由来の試料中において、配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットであって、該遺伝子セットの自己免疫疾患の判別率が50%以上である遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することを含む、自己免疫疾患を検査する方法。 (4) in a sample of from a subject, including a gene selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100 a gene set, a method of discriminating rate of autoimmune diseases of the gene set comprises detecting the expression of genes included in the gene set is 50% or more, to inspect the autoimmune disease.
(5)自己免疫疾患が若年性特発性関節炎である、(4)記載の方法。 (5) the autoimmune disease is juvenile idiopathic arthritis, (4) The method according.

(6)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目までの遺伝子を含む、(4)または(5)記載の方法。 (6) gene set comprises genes from at least the first high discrimination ability gene list until 5 th, (4) or (5) The method according.
(7)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの1番目から20番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子を含む、(4)または(5)記載の方法。 (7) gene set comprises at least 5 genes selected from the genes from the first high discrimination ability gene list until 20 th, (4) or (5) The method according.
(8)被検者由来の試料中において、下記(i)〜(v)の工程により決定された遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することを含む、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別する方法: (8) from the subject sample, the following (i) ~ (v) of the process comprises detecting the expression of genes included in the gene set determined by, systemic juvenile idiopathic arthritis and multi how to determine the articulated juvenile idiopathic arthritis:
(i)全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の間で特異的に発現した遺伝子群の発現データを標準化する; (I) to standardize expression data specifically expressed genes between systemic juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis;
(ii)高判別能遺伝子の順位付けを行い、高判別能遺伝子リストを作成する; (Ii) performs the ranking of high discrimination ability genes, creating a high discrimination ability gene list;
(iii)高判別能遺伝子リストから遺伝子セットを選択する; And (iii) selecting a set of genes from a high ability to discriminate gene list;
(iv)工程(iii)の遺伝子セットの判別能力評価を行う; (Iv) determine performance evaluation of a set of genes step (iii) performing;
(v)判別能力を有する遺伝子セットを決定する。 (V) determining a set of genes having a discrimination performance.
(9)被検者由来の試料中において、配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットであって、該遺伝子セットの全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率が50%以上である遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することを含む、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別する方法。 (9) in a sample of from a subject, including a gene selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 200 a gene set comprises detecting the expression of a gene systemic juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis discrimination rate of said gene set is included in the set of genes is 50% or more, how to determine the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis.
(10)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目までの遺伝子を含む、(9)記載の方法。 (10) gene set comprises genes from at least the first high discrimination ability gene list until 5 th, (9) The method according.

(11)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの1番目から15番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子を含む、(9)記載の方法。 (11) gene set comprises at least 5 genes selected from the genes from the first high discrimination ability gene list until 15 th, (9) The method according.
(12)遺伝子の発現を検出することが、 (12) detecting the expression of a gene,
被検者由来の試料から全RNAを抽出する工程、および 該全RNAにおける該遺伝子の発現量を測定する工程を含む、 A step of extracting total RNA from a sample derived from a subject, and comprising the step of measuring the expression level of the gene in 該全 RNA,
(3)〜(11)のいずれかに記載の方法。 (3) The method according to any one of - (11).
(13)配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットにおいて、各遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長の連続したプライマー、または各遺伝子を検出するための20〜1500塩基長の連続したプローブを含み、該遺伝子セットの自己免疫疾患の判別率が50%以上である、自己免疫疾患を判別するためのキット。 (13) in a set of genes including a gene selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100, specifically the gene successive primers 15-30 bases in length to amplify or include each gene successive probes 20-1500 bases in length for detecting, the discrimination rate of autoimmune diseases of the gene set is more than 50% in the there, a kit for determining the autoimmune disease.
(14)自己免疫疾患が若年性特発性関節炎である、(13)記載のキット。 (14) autoimmune disease is juvenile idiopathic arthritis, (13) The kit according.
(15)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目の遺伝子を含む、(13)または(14)記載のキット。 (15) gene set comprises fifth gene from at least the first high discrimination ability gene list (13) or (14) The kit according.

(16)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの1番目から20番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子を含む、(13)または(14)記載のキット。 (16) gene set comprises at least 5 genes selected from the genes from the first high discrimination ability gene list until 20 th, (13) or (14) The kit according.
(17)配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットにおいて、各遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長の連続したプライマー、または各遺伝子を検出するための20〜1500塩基長の連続したプローブを含み、該遺伝子セットの全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率が50%以上である、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するためのキット。 (17) in a set of genes including a gene selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 200, specifically the gene 15-30 bases long contiguous primer or the gene comprises a continuous probe 20-1500 bases in length for detecting, systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated the gene set, for amplifying the discrimination rate of juvenile idiopathic arthritis is 50% or more, a kit for determining the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis.
(18)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目の遺伝子を含む、(17)記載のキット。 (18) gene set comprises fifth gene from at least the first high discrimination ability gene list (17) The kit according.
(19)遺伝子セットが、高判別能遺伝子リストの1番目から15番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子を含む、(17)記載のキット。 (19) gene set comprises at least 5 genes selected from the genes from the first high discrimination ability gene list until 15 th, (17) The kit according.
(20)配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットであって、該遺伝子セットの自己免疫疾患の判別率が50%以上である、自己免疫疾患を検査するためのマーカー遺伝子セット。 (20) A gene set comprising a gene that is selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100, the set of genes the discrimination rate of autoimmune diseases is 50% or more, the marker gene set for testing autoimmune diseases.
(21)配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットであって、該遺伝子セットの全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率が50%以上である、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するためのマーカー遺伝子セット。 (21) A gene set comprising a gene that is selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 200, the set of genes marker gene for systemic juvenile idiopathic arthritis and discrimination rate articulated juvenile idiopathic arthritis is to determine the 50% or more, systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis set.

本発明により、自己免疫疾患、特に若年性特発性関節炎の診断および病態予測のための新しい指標および検査方法が提供される。 The present invention, new indicators and test methods for the diagnosis and condition prediction of autoimmune diseases, in particular juvenile idiopathic arthritis is provided.

本発明者らは、被検者のリンパ球等を分離していないそのままの全血から全RNAを抽出して得られる全RNAにおいて、末梢血細胞で発現している遺伝子の発現量を測定することにより自己免疫疾患を検査できることを見出した。 The present inventors have found that in total RNA obtained by extracting total RNA from whole blood as it is not separated lymphocytes, etc. of the subject, measuring the expression level of genes that are expressed in peripheral blood cells It was found to be able to inspect the autoimmune disease by.

すなわち、一実施形態において本発明は、末梢血細胞で発現している遺伝子の発現量を測定することにより自己免疫疾患を検査する方法であって、被検者の全血から全RNAを抽出する工程、および該全RNAにおける該遺伝子の発現量を測定する工程を含む、前記方法に関する。 That is, the present invention in one embodiment is a method for inspecting an autoimmune disease by measuring the expression level of genes that are expressed in peripheral blood cells, a step of extracting total RNA from whole blood of subjects and a step of measuring the expression level of the gene in 該全 RNA, relates to the aforementioned method. 本明細書において、検査には、疾患の有無の検査、疾患の程度の検査および疾患の病態の検査、例えば疾患のサブタイプの検査、疾患の予後の判定が含まれる。 In this specification the inspection, the inspection of the presence or absence of disease, the extent of inspection and testing of the condition of the disease of the disease, for example, inspection of subtypes of disease, a determination of the prognosis of the disease.

従来、自己免疫疾患の診断のために被検者由来の試料として用いる診断においては、全血をそのまま分子生物学的検査の対象に用いることは行われてこなかった。 Conventionally, in the diagnosis using a sample derived from the test person for the diagnosis of autoimmune diseases, the use of whole blood as it is subject to molecular biological examination has not been performed. これは、全血は様々な細胞を含むので、そのまま用いても疾患の判断となるデータは得られないだろうと考えられていたからである。 This whole blood since includes various cells, because it was thought would not data obtained as a determination of the disorder be used as it is. しかし本発明者らは、全血をそのまま用いて全RNA抽出を行い、該全RNAにおいて、末梢血細胞で発現している遺伝子の発現を検出することにより、自己免疫疾患を十分有効に、リンパ球を分離した試料を用いた場合と変わりなく検査できることを見出した。 However, the present inventors have conducted total RNA extracted directly using whole blood, in 該全 RNA, by detecting the expression of genes that are expressed in peripheral blood cells, sufficiently effectively the autoimmune disease, lymphocytes It found that can be inspected without change to the case of using a sample separated.

全血とは、被検者から採取したままの血液をさす。 The whole blood, refers to the remains of the blood collected from a subject. 全血は、通常、厳格な無菌的処置で採取される。 Whole blood is usually collected in a strict aseptic treatment. 抗凝固薬としてクエン酸イオンまたはヘパリンを含む場合もある。 Which may include citrate ions or heparin as an anticoagulant.

全血からの全RNAの抽出は、当業者に公知の方法により実施でき、特に限定されない。 Extraction of total RNA from whole blood can be carried by methods known to those skilled in the art, it is not particularly limited. 例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987))等を採用することができる。 For example, guanidine thiocyanate-cesium chloride ultracentrifugation method, a guanidine thiocyanate-hot phenol method, guanidine hydrochloride method, the acidic guanidine thiocyanate-phenol-chloroform method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162 , it is possible to adopt the 156-159 (1987)), and the like. なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。 Of these, acidic guanidine thiocyanate-phenol-chloroform method is preferable.

全血から抽出された全RNAにおける遺伝子の発現量の測定は、該試料における対象遺伝子のmRNA量を測定することを包含する。 Measurement of the expression level of genes in total RNA extracted from whole blood comprises measuring the amount of mRNA of the target gene in said sample. このために対象遺伝子のmRNAから、それと塩基配列が対応するcRNA、cDNAまたはaRNA等を調製し、DNAマイクロアレイ(DNAチップ)などを用いて測定するのが通常である。 From mRNA of the target gene for this, the same cRNA the nucleotide sequence corresponds, to prepare a cDNA or aRNA like, it is usual to measure by using a DNA microarray (DNA chip). また、mRNAの測定には後述のごとくPCRまたはその変法や、質量分析法、SAGE法、競合PCR法などを用いることもできる。 Also, the measurement of the mRNA can be used PCR or and variations thereof as described later, mass spectrometry, SAGE method, and competitive PCR method.

自己免疫疾患は、自己抗体または自己抗原感作リンパ球によって引き起こされる疾患であり、自己抗体と対応抗原との結合物によって起こる疾患である免疫複合体病も包含される。 Autoimmune diseases are diseases caused by autoantibodies or self antigen sensitization lymphocytes, immune complex disease, a disease caused by the binding of the autoantibodies and the corresponding antigen are also encompassed. 自己免疫疾患の具体例としては、膠原病、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎(JIA)、悪性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症(全身性硬化症)、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群(乾燥症候群)、乾癬性関節炎、ウエゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病(MCTD)、リウマチ性多発筋痛症、痛風、偽痛風、多発性動脈炎、血管炎、成人発症スティル病、ベーチェット病、変形性関節症、抗リン脂質抗体症候群、ライター症候群、強直性脊椎炎、腸炎に伴う関節疾患、リウマチ熱、骨粗鬆症などが挙げられる。 Specific examples of autoimmune diseases, collagen diseases, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis (JIA), malignant rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, scleroderma (systemic sclerosis), multiple myositis, dermatomyositis, Sjogren's syndrome (sicca syndrome), psoriatic arthritis, Uegena granulomatosis, mixed connective tissue disease (MCTD), polymyalgia rheumatica, gout, pseudogout, multiple arteritis, vasculitis, adult-onset Still's disease, Behcet's disease, osteoarthritis, antiphospholipid antibody syndrome, Reiter's syndrome, ankylosing spondylitis, rheumatoid diseases associated with intestinal inflammation, rheumatic fever, such as osteoporosis and the like. 本発明の方法は、リウマチ性疾患、特に若年性特発性関節炎(JIA)の検査に好適である。 The method of the present invention is suitable for inspection of rheumatic diseases, especially juvenile idiopathic arthritis (JIA).

若年性特発性関節炎(JIA)は、持続する関節の炎症を特徴とする慢性疾患で、関節炎の定型的な症状として疼痛、腫脹、運動制限が挙げられ、若年者に発症するものをさす。 Juvenile idiopathic arthritis (JIA) is a chronic disease characterized by inflammation of persistent joint pain as routine symptoms of arthritis, swelling, include restricted movement, refers to those that occur in young people. 通常、6週間以上関節炎が持続し、関節炎を起こす可能性のある他の全疾患を除外することができ、その原因が不明である場合、医師により若年性特発性関節炎であると診断される。 Usually, arthritis persists more than 6 weeks, it can be excluded all other diseases that can cause arthritis, if the cause is unknown, is diagnosed with juvenile idiopathic arthritis by a physician.

若年性特発性関節炎にはいくつかの異なるサブタイプがあり、大別すると、熱、皮疹、心膜炎などの全身症状が間欠的に現れるもの(全身型)と、いくつかの関節に症状がでるもの(少関節型、多関節型)とに分けられる。 The juvenile idiopathic arthritis has several different subtypes, are roughly classified into heat, rash, systemic symptoms such as pericarditis what appears intermittently and (Systemic), symptoms in several joints out those (few articulated, articulated) is divided into a. 全身型若年性特発性関節炎は、関節炎とともに全身症状が現れることが特徴で、主徴は、高いスパイク熱と解熱の反復、熱に伴うサーモンピンク色様の皮疹である。 Systemic juvenile idiopathic arthritis is a feature that systemic symptoms appear with arthritis, the main symptom is repeated antipyretic high spike heat, a salmon pink color like rash caused by heat. 他の症状として、筋肉痛、肝脾腫、リンパ節腫脹、心膜炎、胸膜炎などがある。 As other symptoms, muscle pain, liver splenomegaly, lymphadenopathy, pericarditis, and the like pleurisy. 多関節型若年性特発性関節炎は、発症して最初の6ヶ月間に全身症状はそれほどなく、5カ所以上の関節症状が認められる。 Articulated juvenile idiopathic arthritis, systemic symptoms is so not in the first six months to develop, is observed more than five places of joint symptoms. リウマトイド因子と呼ばれる血中の自己抗体が存在するか否かでリウマトイド因子陽性型とリウマトイド因子陰性型に分けられる。 Autoantibodies in the blood called rheumatoid factor are divided into rheumatoid factor positive type and rheumatoid factor-negative type in presence or absence.

発現量を測定する際には、自己免疫疾患に罹患した患者由来の試料と健常者由来の試料との間で発現量が著しく変動している遺伝子もしくは遺伝子セット、または自己免疫疾患に罹患した患者においてその病態により発現量が著しく変動している遺伝子もしくは遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現量を測定するのが望ましい。 Patients when measuring the expression amount of suffering gene or gene set expression level is significantly varied between the sample from the sample and healthy person from a patient suffering from an autoimmune disease or autoimmune disease, in is desirable to measure the expression level of genes included in the gene or gene set expression level is significantly varied by its disease. このために高判別能遺伝子リストを作成し、そのリストから選ばれる複数の遺伝子を含む遺伝子セットを選び、該遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出する。 This creates a high discrimination ability gene list to, select the gene set comprising a plurality of genes selected from the list, to detect the expression of genes included in the gene set. 高判別能遺伝子リストの作成、遺伝子セットの選択、および判別方法については、後記のとおりである。 Creating high discrimination ability gene lists, selection of the gene sets, and determination methods are described below.

遺伝子セットの決定方法 The method of determining the set of genes
一実施形態において本発明は、下記(i)〜(v)の工程により決定された遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することを含む、自己免疫疾患を検査する方法に関する: In one embodiment, the invention comprises detecting the expression of genes included in the gene set determined by the following processes (i) ~ (v), relates to a method for inspecting an autoimmune disease:
(i)自己免疫疾患特異的に発現した遺伝子群の発現データを標準化する; (I) to normalize the expression data of autoimmune diseases specifically expressed genes;
(ii)高判別能遺伝子の順位付けを行い、高判別能遺伝子リストを作成する; (Ii) performs the ranking of high discrimination ability genes, creating a high discrimination ability gene list;
(iii)高判別能遺伝子リストから遺伝子セットを選択する; And (iii) selecting a set of genes from a high ability to discriminate gene list;
(iv)工程(iii)の遺伝子セットの判別能力評価を行う; (Iv) determine performance evaluation of a set of genes step (iii) performing;
(v)判別能力を有する遺伝子セットを決定する。 (V) determining a set of genes having a discrimination performance.

ここで自己免疫疾患特異的に発現した遺伝子とは、被検者由来の試料において測定された各遺伝子の発現量を対照と比較し、その発現量が有意に上昇している遺伝子および有意に減少している遺伝子の双方を包含する。 Here, the autoimmune disease-specific expressed genes, compared to a control expression level of each gene was measured in a sample from a subject, elevated to that gene and significantly reduced the expression level is significantly It encompasses both of the gene you are.

以下、遺伝子判別分析手法により自己免疫疾患を判別するための遺伝子セットを決定する方法の一実施形態について説明する。 The following describes one embodiment of a method for determining a gene set for discriminating an autoimmune disease by gene discriminant analysis method.

遺伝子の発現検出は、試料における対象遺伝子のmRNA量を測定することにより実施できる。 Expression detection of gene can be performed by measuring the amount of mRNA of the target gene in the sample. このために対象遺伝子のmRNAから、それと塩基配列が対応するcDNAまたはaRNA等の被検ポリヌクレオチドを調製し、DNAマイクロアレイ(DNAチップ)などを用いて測定するのが通常である。 From mRNA of the target gene for this, the same base sequence was prepared a test polynucleotide such as the corresponding cDNA or aRNA, it is usual to measure by using a DNA microarray (DNA chip).

被検ポリヌクレオチドとマイクロアレイ上の特定の遺伝子に対するプローブとのハイブリダイゼーションを検出するために、これらを標識する。 To detect the hybridization with a probe for a particular gene on the test polynucleotide microarrays, these are labeled. 例えば、放射性同位元素、化学発光化合物、重金属原子、分光学的マーカー、磁気マーカー、関連酵素、蛍光標識などで標識できる。 For example, radioisotopes, chemiluminescent compounds, heavy metal atoms, spectroscopic markers, magnetic markers, related enzymes, can be labeled with a fluorescent label. それぞれの標識対象分子に応じた好適な標識方法は、当業者であれば適宜選択できる。 Suitable labeling methods according to each of the labeled target molecule can be appropriately selected by those skilled in the art. 蛍光標識が最も好ましく、蛍光標識には、例えば、フルオレセイン、ジクロロ−フルオレセイン、BODITY(商標)、ROX、ローダミン、Cy2、Cy3、Cy5、IRD40など種々のものが公知であり、いずれを用いてもよいが、Cy3、Cy5が特に好ましい。 Most preferred fluorescent label, a fluorescent label, such as fluorescein, dichloro - fluorescein, BODITY (TM), ROX, rhodamine, Cy2, Cy3, Cy5, IRD40 are known various ones such as, it may be either There, Cy3, Cy5 are particularly preferred. Cy3またはCy5等による標識のためには、cDNAおよびaRNAのいずれの場合にも、合成の際にアミノアリルdUTPを取り込ませる。 For labeling with Cy3 or Cy5, etc. in the case of any of the cDNA and aRNA are also incorporated aminoallyl dUTP in the synthesis.

このようにして得られたcDNAやaRNA試料を、上記被検ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブが固定されたマイクロアレイの上にのせてハイブリダイズさせる(Brown, PO et al., Nature genet. 21, suppliment, 33-37 (1999))。 Thus the cDNA or aRNA samples obtained, the test polynucleotide that specifically hybridizes to the probe to hybridize put on a fixed microarrays (Brown, PO et al., Nature genet. 21, suppliment, 33-37 (1999)).

DNAチップは、市販のもの(例えば、日立ソフトウェアインジニアリング社製、AceGene(登録商標) Human Oligo Chip 30K)を用いてもよいし、公知の方法(Lipshutz, RJ etal., Nature genet. 21, suppliment, 20-24 (1999))に基づき作製してもよい。 DNA chip, commercially available (e.g., Hitachi Software indicator engineering Co., AceGene (registered trademark) Human Oligo Chip 30K) may be used, a known method (Lipshutz, RJ etal., Nature genet. 21, suppliment it may be made based on 20-24 (1999)). 固定化するDNAとしては、ヒトのESTデータベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やPCRを実施することによりクローン化されたものや遺伝子の配列情報により化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いる。 The DNA to be immobilized, were chemically synthesized by the sequence information of the cloned objects or genes by performing a reverse transcriptase reaction and PCR with primers prepared on the basis of sequence information, such as a human EST database oligo using the nucleotide and the like.

ハイブリダイゼーションの条件および方法等は、当業者によく知られている。 Hybridization conditions and methods, etc. are well known to those skilled in the art. 例えば、ハイブリダイゼーションバッファーは、5×SSC、0.5%SDS、4×Denhardt's solutionなどでよい。 For example, the hybridization buffer, 5 × SSC, good, etc. 0.5% SDS, 4 × Denhardt's solution. ハイブリダイゼーションは、35〜60℃、好ましくは42〜50℃、さらに好ましくは45℃で、2時間以上、好ましくは一晩以上行うとよい。 Hybridization, 35 to 60 ° C., preferably at 42-50 ° C., more preferably 45 ° C., 2 hours or more, preferably performed overnight or longer. ハイブリダイゼーション条件は、標識分子の量または検出感度等を含む種々の要因に応じて、当業者が適宜設定することができる。 Hybridization conditions, depending on various factors including the amount or sensitivity, etc. of the labeled molecule, a person skilled in the art can appropriately set. ハイブリダイゼーション後、アレイを洗浄して、標識分子を読み取り、シグナルを可視化し、定量化する。 After hybridization, the arrays were washed, read the label molecules, the signals were visualized and quantified.

シグナル強度の測定には当技術分野で公知のいずれの方法も使用できる。 Any method known in the art for the measurement of signal strength can also be used. 例えば、標識として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。 For example, in the case of using a radioactive isotope as the label, it is possible to measure the radioactivity, for example, liquid scintillation counter, and the like γ- counter. また標識として蛍光物質を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光スキャナーなどを用いて検出することができる。 In the case of using a fluorescent substance as the label, it can detect the fluorescence with a fluorescent microscope, fluorescent plate reader, a fluorescent scanner.

定量化された全プローブについて、標識分子由来のシグナル強度をテキスト形式の数値データとして得る。 For all probes quantified to obtain the signal strength from the labeled molecules as numeric data in text format. シグナル強度の低い部分は、バックグラウンドの影響を大きく受けるので、例えばCy3とCy5の蛍光強度が1000を超えているなどのカットオフを設けることにより、蛍光強度がカットオフを超えるデータのみを残し、蛍光強度の低いデータを棄却する。 Portion of low signal strength, so greatly affected by the background, for example, by fluorescence intensity of Cy3 and Cy5 is provided a cut-off, such as exceeds 1000, the fluorescence intensity leaving only the data exceeding the cutoff, to reject the low fluorescence intensity data. 例えば、Cy3およびCy5それぞれについて、蛍光強度の値がバックグラウンド値に2標準偏差分だけ足した値よりも大きなプローブについてのデータを利用する。 For example, for each of Cy3 and Cy5, the value of the fluorescence intensity using data for larger probes than the value obtained by adding only 2 standard deviations to background values. 各プローブのCy3とCy5の蛍光強度値の比を算出し、検出感度の補正を行った標準化数値データを得る。 Calculating a ratio of intensity of fluorescence Cy3 and Cy5 of each probe, to obtain a normalized numerical data subjected to correction of the detection sensitivity.

データ中に存在する欠測値は、解析方法によっては何らかの方法で補間して、以降の解析に使用してもよい。 Missing values ​​present in the data, by analysis method by interpolating in some way, may be used for subsequent analysis. 補間の方法としてはさまざまなものが適用可能であるが、例えば補間する欠測値を含む症例についての全データの平均値に、その欠測値を含む遺伝子の全症例についてのデータの平均値を加えた値から、全症例についての全遺伝子のデータの平均値を引いた値をもって補間する方法がある。 Although the method of interpolation is different things can be applied, for example, the average value of all data for cases containing missing values ​​for interpolating the mean value of the data for all cases of genes containing the missing value from the added value, there is a method of interpolated with a value obtained by subtracting the average value of data of all genes for all cases. 他には、Troyanskayaらの報告(Bioinformatics, vol. 17, 520-525, 2001)において3種類の補間方法、すなわちK-Nearest Neighbors(KNN)method、Singular Value Decomposition(SVD)based methodおよびrow average methodによる補間などが挙げられる。 Other, Troyanskaya et al report (Bioinformatics, vol. 17, 520-525, 2001) 3 kinds of interpolation methods in, that K-Nearest Neighbors (KNN) method, Singular Value Decomposition (SVD) based method and row average method such as interpolation by, and the like. これらのうちのいずれかの方法を適用することにより、すべての欠測値を補間することが可能である。 By applying any of these methods, it is possible to interpolate all missing values. 場合により、欠測値の補間は実施しなくともよい。 Optionally, interpolation of missing values ​​may not be performed.

かくして選択される標準化数値データ(以下「標準化遺伝子発現データ」と称することもある)は、バックグラウンドの影響を受けておらず、かつ、健常者由来のサンプルとの比較における自己免疫疾患患者由来の試料における遺伝子発現の変動幅が個人差に起因する遺伝子発現変動幅を超えている遺伝子の発現情報を有しており、以降の統計解析の信頼性を確保することができるものである。 Thus standardized numerical data selected (hereinafter also referred to as "normalized gene expression data") is free from influence of the background, and, from autoimmune disease patients in comparison to samples from healthy individuals fluctuation width of gene expression in the sample has the gene expression information exceeding the gene expression variation range due to individual differences and is able to ensure the reliability of the subsequent statistical analysis.
上記のようにして得られた標準化遺伝子発現データを多変量解析することによって、統計学的処理を行い、遺伝子セットを選択する。 By multivariate analysis to standardize the gene expression data obtained as described above, it performs statistical processing to select a set of genes.

以下、図1を参照することにより、遺伝子セットの決定手法の概略について説明する。 Hereinafter, by referring to FIG. 1, it will be outlined in the method of determining the set of genes.
手順101: Step 101:
上記標準化遺伝子発現データ中の数値のそれぞれに対応するDNAマイクロアレイ上のプローブ番号のリストと症例番号のリストからなる標準化データマトリックスを用意する。 Providing a standardized data matrix consisting of a list of the list and case number of the probe number on DNA microarray corresponding to each of the numerical values ​​in the normalized gene expression data.
手順102: Step 102:
テスト用のデータとして、標準化データマトリックスから1サンプル除去する。 As data for testing, one sample is removed from the standardized data matrix.
手順103: Step 103:
後述の高判別能遺伝子の順位付け処理によって、高い判別能力を持つ順番に遺伝子を並べたリスト(高判別能遺伝子リスト)を生成する。 The ranking process of high discrimination ability gene described later, it generates an ordered list of genes in order to have a high discrimination performance (high discrimination ability Gene List).
手順104: Step 104:
手順103によって作成された高判別能遺伝子リストの上位から順番に遺伝子を抜き取ることにより遺伝子セットを選択し、手順102において除去しておいたテスト用サンプルが自己免疫疾患であるかどうか判別を行う。 Select gene set by extracting the gene in order from the upper high discrimination ability gene list created by the procedure 103, the test sample that had been removed in step 102 discriminates whether the autoimmune disease. 判別の方法は、後述の手順301〜手順306に従う。 The method of determination is according to the procedure 301 to procedure 306 described later.

手順105: Step 105:
テスト用に除去していたサンプルを元に戻す。 Back to the original sample that had been removed for the test.
手順106: Step 106:
解析の途中、サンプルは1度だけ除去される。 During the analysis, the sample is removed only once. 1度も除去されていないサンプルが存在した場合、手順102に戻り、そのサンプルをテスト用サンプルとして除去して解析を進める。 If the sample is also once not been removed is present, it returns to step 102 advances the analysis by removing the sample as a test sample.
手順107: Step 107:
解析したすべての結果を総合し、遺伝子セットの判別率が評価基準以上であるならば、得られたその遺伝子セットを採択し、判別率が評価基準以下である場合、その遺伝子セットは採用せず、処理を終了する。 Totaling the results of the analysis, if discrimination rate of gene sets is criteria above, resulting adopted the gene set, when judgment of not more than criteria, the set of genes without adopting , the process is terminated. 以上の手順を繰りかえすことによって、遺伝子セットを決定する。 By repeating the above procedure to determine the set of genes.

図1における手順103の高判別能遺伝子の順位付け処理は、手順201〜205にしたがって実施される(図2)。 Ranking process high discrimination ability gene steps 103 in FIG. 1 is carried out according to the procedure 201-205 (Figure 2). 本処理は、Golubらの方法(Science. vol. 286, 531-537, 1999)に従って実施できる。 This process, Golub et al. Method (Science. Vol. 286, 531-537, 1999) can be carried out according to. 処理は、標準化データマトリックス中に含まれる遺伝子を1つ1つ順に処理する。 Process, processes the gene contained in the normalized data matrix into one single order.

手順201: Step 201:
ある遺伝子Nを処理対象とした際、サンプルは、自己免疫疾患の患者由来のサンプルか、健常者由来のサンプルであるか、ラベルがつけられている。 Upon a certain gene N processed, samples or samples from the patients with autoimmune diseases, or a sample from a healthy person, the label is attached. それぞれのラベルを基に以下の式1を用いて、その遺伝子が自己免疫疾患の判別分析にどの程度有用であるかを示す指標としてSignal To Noise Ratio値を計算する。 Using Equation 1 below each label based on the gene is to calculate the Signal the To Noise Ratio value as an index indicating how useful degree discriminant analysis of autoimmune diseases.

式1中のμ Iは自己免疫疾患サンプルの遺伝子発現比率の平均値、μ IIは健常者サンプルの遺伝子発現比率の平均値、σ は自己免疫疾患サンプルの遺伝子発現比率の標準偏差、σ IIは健常者サンプルの遺伝子発現比率の標準偏差を表す。 The average value of mu I is an autoimmune disease sample gene expression ratio in Formula 1, mu II the average value of the gene expression ratio of healthy subjects sample, sigma I standard deviation of gene expression ratio of autoimmune diseases samples, sigma II represents the standard deviation of the healthy subject sample gene expression ratios.

手順202: Step 202:
各サンプルにつけられているラベルをランダムに入れ替えて、式1を用いて再度Signal to Noise Ratioの値を計算する。 The labels are attached to each sample interchanged randomly to calculate again the value of the Signal to Noise Ratio using Equation 1.
手順203: Step 203:
手順202の処理を所定の回数繰り返す。 Processing steps 202 are repeated a predetermined number of times. なお、Golubらは400回で行っていたが、本発明の実施例では手順202を1000回繰り返した。 Incidentally, Golub et al had done at 400 times, the procedure was repeated 202 1000 times in the embodiment of the present invention.
手順204: Step 204:
手順201、202によって計算された数値を元に、手順201において計算されたSignal To Noise Ratio値のpValueを計算し、pValueが一定値以上(p>=0.01)の遺伝子を除去する。 Based on values ​​calculated by the procedure 201, the pValue the calculated Signal the To Noise Ratio value is calculated in step 201, to remove the gene pValue is more than a predetermined value (p> = 0.01).
手順205: Step 205:
標準化データマトリックスを手順202で計算されたSignal to Noise Ratioの順に並び替える。 Rearranging the normalized data matrix in the order of the calculated Signal to Noise Ratio in step 202.

図1における手順104の遺伝子セットの判別能力評価は、手順103によって作成された、順位付け処理された高判別能遺伝子リストから選択した遺伝子セットについて実施される。 Discrimination performance evaluation of gene set of procedures 104 in FIG. 1 was prepared by the procedure 103 is performed for the set of genes selected from the high discrimination ability gene list ranked processing. 本処理は、Golubらの方法(Science,前掲)に従って実施できる(図3)。 This treatment can be carried out according to Golub et al. Method (Science, supra) (Fig. 3). 手順103によって作成された、高判別能遺伝子リストを上位から一定個数ずつ抜き取って遺伝子セットを選択し、手順102で除去されたサンプルが自己免疫疾患であるかどうかを判別する。 Created by the procedure 103, the high discrimination ability gene list withdrawn from the upper one by a certain number of selected sets of genes, samples removed in step 102 to determine whether an autoimmune disease.

手順301: Step 301:
手順102において、順位付けされた遺伝子リストの上位1〜N番目の遺伝子を抜き出した遺伝子セットを選択する。 In Step 102, selects a set of genes extracted upper 1~N th gene ranking genes listed.
手順302: Step 302:
手順301によって、抜き出された遺伝子セットを利用して、手順102によって除去されている1サンプルが、自己免疫疾患か、健常者かを判別するために、以下の式2を利用して、重み付投票値Vを計算する。 By the procedure 301, using the gene set withdrawn, one sample being removed by the procedure 102, or autoimmune disease, in order to determine whether a healthy person, by utilizing the following Equation 2, the weight to calculate the urging vote value V.

遺伝子iに関して、式2中のμ Iは、自己免疫疾患サンプルの遺伝子発現比率の平均値、μ IIは健常者のサンプルの遺伝子発現比率の平均値、x iは判別したいサンプル中に含まれる遺伝子iの発現率の値、p(g,c)がSignal To Noise Ratioの値を表す。 For genes i, gene mu I in Formula 2, the average value of the gene expression ratio of autoimmune diseases samples, mu II the average value of the gene expression ratio of a sample of a healthy person, x i is contained in the sample to be determined the incidence of the values ​​of i, p (g, c) represents the value of the Signal to Noise ratio.
x iの値がμ Iに近いかμ IIに近いかによって、投票の方向を決定し、投票値としてV iを利用する。 depending whether the value of x i is close to or close mu II in mu I, to determine the direction of the vote, utilize V i as voting value.

手順303: Step 303:
手順301によって抜き出された遺伝子セットに含まれる遺伝子すべてに対して、上記式2を利用して投票を行い、最終的に投票値の絶対値が大きいほうを、その遺伝子セットによって、決定された判別値とする。 For all genes included in the gene set withdrawn by the procedure 301 performs voting using the above equation 2, the more the absolute value of the final vote value is greater, by the gene set was determined and discrimination value.
手順304: Step 304:
なお、手順302で得られた投票値を用いて、その予測がどの程度確からしいかをPrediction Scoreとして、以下の式3を用いて計算を行う。 Incidentally, by using the voting value obtained in step 302, whether the likely extent certainly its prediction as Prediction Score, the calculation is performed using Equation 3 below.
Prediction Score: Prediction Score:

V winは、勝った方に投票した投票値の総数であり、V looseは負けた方に投票した投票値の総数である。 V win is the total number of voting values voted for who won, V loose is the total number of voting value who voted for those who lost.

手順305: Step 305:
手順102において除去されたサンプルは、事前に自己免疫疾患であるかどうかはわかっているので、今回予測された結果と比べて分析が当たっていたかどうかを調べる。 Samples removed in step 102, since the pre and whether it is an autoimmune disease known to, determine whether analysis had hit than currently predicted result.
手順306: Step 306:
Golubらの方法(Science,前掲)に従い、手順304で計算されたPrediction Scoreが、使用遺伝子数のルート1/2以下の場合、その判別結果は判定不能とする。 Golub et al. Method (Science, supra) in accordance with, the Prediction Score calculated in step 304, if the following routes half of the number of used gene, the determination result is impossible determination.

図1の手順107においては、手順106までの処理において順位付けされた高判別能遺伝子リストの上位から順番に抜き出した遺伝子セットの判別率(正解数/(正解数+誤答数))を計算することによって当該遺伝子セットの判別能力評価を行う。 In Step 107 in FIG. 1, calculated discrimination rate of ranked gene set extracted in order from the upper high discrimination ability gene list in the processing up to Step 106 (the number of correct answers / (number of correct answers + number of wrong answers)) discriminating capability evaluation of the gene set by. 通常、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは85%以上の判別率(判別能力)を有する遺伝子セットを、高判別能遺伝子セットとして決定する(図4)。 Usually, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably a set of genes with more than 85% of the discrimination rate (discrimination performance) is determined as a high ability to discriminate gene set (Fig. 4).

そして、未知のサンプルにおける、決定された遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出し、得られた発現情報を手順301〜306に準じて統計処理すること、自己免疫疾患を検査することができる(図3および図5)。 Then, in an unknown sample, and detecting the expression of genes included in the determined set of genes to statistical processing in accordance with the obtained expression information in steps 301 to 306, it is possible to inspect the autoimmune disease ( FIGS. 3 and 5).

別の実施形態において本発明は、下記(i)〜(v)の工程により決定された遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することを含む、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別する方法に関する: The present invention In another embodiment, the following (i) comprising detecting the expression of genes included in the gene set determined by the steps of ~ (v), systemic juvenile idiopathic arthritis and articulated Young to a method of determining the sex idiopathic arthritis:
(i)全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の間で特異的に発現した遺伝子群の発現データを標準化する; (I) to standardize expression data specifically expressed genes between systemic juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis;
(ii)高判別能遺伝子の順位付けを行い、高判別能遺伝子リストを作成する; (Ii) performs the ranking of high discrimination ability genes, creating a high discrimination ability gene list;
(iii)高判別能遺伝子リストから遺伝子セットを選択する; And (iii) selecting a set of genes from a high ability to discriminate gene list;
(iv)工程(iii)の遺伝子セットの判別能力評価を行う; (Iv) determine performance evaluation of a set of genes step (iii) performing;
(v)判別能力を有する遺伝子セットを決定する。 (V) determining a set of genes having a discrimination performance.

ここで全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の間で特異的に発現した遺伝子とは、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎とで測定された各遺伝子の発現量が有意に異なる遺伝子をさす。 Here between the differentially expressed genes between systemic juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis, as measured by the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis expression level of each gene refers to a different gene significantly.

遺伝子リストの決定方法については上記と同様であり、全身型若年性特発性関節炎の患者由来のサンプルか、全身型若年性特発性関節炎の患者由来のサンプルであるか、ラベルを付したサンプルを用いて、高判別能遺伝子リストを作成し、遺伝子セットを選択し、判別能力評価および判別を実施できる。 For the method of determining the gene lists are as defined above, or samples from patients with systemic juvenile idiopathic arthritis, or a sample from patients with systemic juvenile idiopathic arthritis, using samples subjected label Te, creating a high discrimination ability gene list, select a set of genes can be carried out discrimination performance evaluation and determination.

遺伝子リスト Gene list
一実施形態において、自己免疫疾患を検査するための高判別能遺伝子リストは、好ましくは、配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストである(表1)。 In one embodiment, high discrimination ability gene lists for testing autoimmune diseases, high preferably were ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100 a determination capability gene list (Table 1).

表1において、DNAチップID番号とは、日立ソフトウエアエンジニアリング社製、AceGene(登録商標) Human Oligo Chip 30KにおけるID番号をさし、http://bio.hitachi-sk.co.jp/acegene/human30k/search_30k/search_human30k.htmlにおいて該ID番号を入力することにより、該DNAチップ上のプローブが対象とする遺伝子を検索することもできる。 In Table 1, the DNA chip ID number, refers to Hitachi Software Engineering Co., AceGene (registered trademark) Human Oligo Chip 30K in ID number, http: //bio.hitachi-sk.co.jp/acegene/ by inputting the ID number in human30k / search_30k / search_human30k.html, it is also possible to probe on the DNA chip to search for genes of interest. また、「+」は、自己免疫疾患、特に若年性特発性関節炎の患者においてその発現量が増加している遺伝子をさし、「−」は自己免疫疾患、特に若年性特発性関節炎の患者においてその発現量が減少している遺伝子をさす。 Also, "+" refers to genes whose expression levels in patients with autoimmune diseases, in particular juvenile idiopathic arthritis has increased, "-" is an autoimmune disease, particularly in patients with juvenile idiopathic arthritis It refers to a gene whose expression level is decreased.

一実施形態において、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するための高判別能遺伝子リストは、配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストである(表2)。 In one embodiment, high discrimination ability gene list to determine systemic onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis, the gene specified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 200 in the order of the result sequence number which is ranked high ability to discriminate gene list (Table 2).

表2において、また、「+」は、全身型若年性特発性関節炎の患者においてその発現量が増加している遺伝子をさし、「−」は全身型若年性特発性関節炎の患者においてその発現量が減少している遺伝子をさす。 In Table 2, also "+" refers to genes whose expression levels in patients with systemic juvenile idiopathic arthritis is increasing, "-" is its expression in patients with systemic juvenile idiopathic arthritis It refers to a gene that amount has been reduced.
上記表1および表2の遺伝子リストにおいて、ID番号は、GenBankに登録されているアクセッション番号をさす。 In gene lists of Table 1 and Table 2, ID number refers to the accession number registered in the GenBank.

各遺伝子リストに含まれる各塩基配列で特定される遺伝子には、各塩基配列からなる遺伝子、ならびに該遺伝子と機能的に同等な遺伝子が包含される。 The genes identified in the nucleotide sequence contained in each gene list, the gene consisting of the nucleotide sequence, as well as functionally equivalent gene and the gene are included. ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によってコードされるポリペプチドが、各塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することをさす。 Here, the phrase "functionally equivalent", polypeptides encoded by the gene of interest, the polypeptide equivalent biological functions encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence, that has a biochemical function the refers.

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードする遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989)を利用する方法が挙げられる。 The methods well known to those skilled in the art for preparing a gene encoding the polypeptides functionally equivalent polypeptides, hybridization techniques (Sambrook, J.et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 , Cold Spring Harbor Lab.press, and a method of use of 1989). なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、DNAおよびRNAが包含され、ゲノムDNAのみならず、mRNA、cDNA、aRNAおよびcRNAも含むものとする。 In this specification, the term "gene" is encompassed are DNA and RNA, not genomic DNA only, it is assumed that mRNA, cDNA, also aRNA and cRNA including. また、全長遺伝子のみならずESTも含むものとする。 In addition, it is also intended to include EST as well as the full-length gene only.

各塩基配列で特定される遺伝子には、各塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。 The genes identified in the nucleotide sequence, include hybridizing gene with the gene under stringent conditions comprising a nucleotide sequence complementary to the respective nucleotide sequence. ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各塩基配列に対し高い相同性(相同性または同一性が60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)を有する遺伝子がハイブリダイズする条件をいう。 The stringent conditions, a specific hybrid is formed, it means a non-specific hybrid is not formed, i.e., high homology to each nucleotide sequence (homology or identity of 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably refers to conditions under which the gene having 95% or more) will hybridize. より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて、具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(Saline Sodium Citrate;150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)溶液を用い、65℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。 More specifically, such conditions, well known conventional techniques in the art, for example, colony hybridization, plaque hybridization, such as in microarray or Southern blot hybridization method, specifically, a polynucleotide using immobilized membrane and the presence of NaCl 0.7 to 1.0 M, after hybridization at 65 ° C., 0.1 to 2-fold concentration of SSC (Saline sodium citrate; 150mM sodium chloride, sodium 15mM citrate) solution the use may be accomplished by washing the membrane with 65 ° C..

また、塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、LAMP法などを利用して、各遺伝子と機能的に同等な遺伝子を単離することも可能である。 Moreover, gene amplification methods using primers synthesized based on the nucleotide sequence information, for example, polymerase chain reaction (PCR), using a like LAMP method, also be isolated each gene functionally equivalent gene possible it is.

また、機能的に同等の遺伝子は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性または同一性を有する。 Furthermore, functionally equivalent genes, normally have a high homology or identity in amino acid sequence level. 高い相同性または同一性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50%以上、好ましくは75%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性または同一性をさす。 The high homology or identity at the amino acid level, usually at least 50% or more, preferably 75% or more, more preferably 85% or more, more preferably refers to homology or identity more than 95%. アミノ酸配列や塩基配列の相同性または同一性は、アルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993))によって決定することができる。 Homology or identity of amino acid sequences or nucleotide sequences may be determined using algorithm BLAST: can be determined by (Proc Natl Acad Sci USA 90.... 5873-5877 (1993)). このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))。 On the basis of this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al, J. Mol Biol 215:... 403-410 (1990)). これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。 Specific procedures for these analytical methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

遺伝子セット Gene set
本発明における自己免疫疾患を判別するための好適な遺伝子セットは、配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットであって、その自己免疫疾患判別率が50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは85%以上の遺伝子セットである。 Suitable gene set for discriminating an autoimmune disease in the present invention, selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100 a gene set comprising a gene that is, the autoimmune disease determination of 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 85% or more of the gene set. ここで、自己免疫疾患判別率は上記の方法により決定されるものである。 Here, autoimmune diseases discrimination rate is to be determined by the method described above. 該遺伝子セットは、表1の遺伝子リストから選択される少なくとも5遺伝子、好ましくは5〜50遺伝子、より好ましくは10〜40遺伝子、さらに好ましくは10〜30遺伝子を含む。 The gene set is at least 5 gene selected from the genes listed in Table 1, preferably from 5 to 50 genes, more preferably 10 to 40 genes, even more preferably from 10 to 30 genes.

より具体的には、本発明における自己免疫疾患を判別するための好適な遺伝子セットは、配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目までの遺伝子、好ましくは少なくとも1番目から10番目までの遺伝子、より好ましくは少なくとも1番目から15番目までの遺伝子、さらに好ましくは少なくとも1番目から20番目までの遺伝子を含む。 High More specifically, suitable gene set for discriminating an autoimmune disease in the present invention has been ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100 genes from at least the first determination capability gene lists to the fifth, gene preferably at least 1 second to 10 th, gene more preferably at least 1 second to 15 th, more preferably at least 1 second to 20 th including the gene.

ここで例えば、「遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目までの遺伝子を含む遺伝子セット」とは、1番目から5番目までの遺伝子以外の遺伝子を含んでいてもよいことを意味し、好ましくは配列番号1〜100のいずれかで表される塩基配列で特定される遺伝子からなる上記遺伝子リストに含まれるその他の遺伝子を含む。 Here, for example, the "set of genes including genes from at least the first gene list until the 5th" means that may contain genes other than genes from first to fifth, preferably SEQ It includes other genes included in the gene list of genes that are identified by the nucleotide sequence shown in any of numbers 1 to 100.

また、好適な遺伝子セットの別の具体例としては、遺伝子リストの1番目から20番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子、好ましくは少なくとも10の遺伝子を含む遺伝子セットが挙げられる。 In addition, as another specific example of a suitable gene set, at least 5 of the genes selected from the genes from the first gene list until 20 th, and the like, preferably a gene set comprising at least 10 genes.

ここで例えば、「上記遺伝子リストの1番目から20番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子を含む遺伝子セット」とは、上記と同様に、1番目から20番目までの遺伝子以外の遺伝子を含んでいてもよいことを意味し、好ましくは配列番号1〜100のいずれかで表される塩基配列で特定される遺伝子からなる上記遺伝子リストに含まれるその他の遺伝子を含む。 Here, for example, a "gene set comprising at least 5 of the genes selected from genes from the first the gene list until 20 th", in the same manner as mentioned above, a gene other than the gene from first to 20 th including means that may preferably include other genes included in the gene list of genes that are identified by the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NO: 1-100.

遺伝子セットに含まれる遺伝子のうちの、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の遺伝子が、配列番号1〜100のいずれかで表される塩基配列で特定される遺伝子からなる遺伝子リストに含まれる遺伝子であることが好ましい。 Of the genes included in the gene set, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more genes of SEQ ID NO: 1 to 100 it is preferably a gene contained in the list of genes consisting of the genes identified in the nucleotide sequence shown in any.

未知サンプルにおいて、これらの遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することにより、自己免疫疾患を高い判別率で、確実に判別することができる。 In an unknown sample, by detecting the expression of genes included in these gene sets, autoimmune disease with a high discrimination ratio, can be reliably discriminated.

本発明における全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するための好適な遺伝子セットは、配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットであって、その全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率が50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは85%以上の遺伝子セットである。 Suitable gene set for discriminating the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis in the present invention, SEQ ID NO made from genes identified by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 101 to 200 order to a set of genes comprising a gene that is selected from the ranked high ability to discriminate gene list, the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis determination of 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 85% or more of the genes set. ここで、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率は上記の方法により決定されるものである。 Here, discrimination rate of systemic onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis is to be determined by the method described above. 該遺伝子セットは、表2の遺伝子リストから選択される少なくとも5遺伝子、好ましくは5〜50遺伝子、より好ましくは10〜40遺伝子、さらに好ましくは10〜30遺伝子を含む。 The gene set is at least 5 gene selected from the genes listed in Table 2, preferably from 5 to 50 genes, more preferably 10 to 40 genes, even more preferably from 10 to 30 genes.

より具体的には、本発明における全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するための好適な遺伝子セットは、配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目までの遺伝子、好ましくは少なくとも1番目から10番目までの遺伝子、さらに好ましくは少なくとも1番目から15番目までの遺伝子を含む。 More specifically, suitable gene set for discriminating the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis in the present invention is identified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 200 genes from at least the first high discrimination ability gene lists to the fifth, which is ranked in order of SEQ ID NO made that gene, preferably a gene from the at least first to tenth, more preferably at least 1 second to 15 th including the gene.

ここで例えば、「遺伝子リストの少なくとも1番目から5番目までの遺伝子を含む遺伝子セット」とは、1番目から5番目までの遺伝子以外の遺伝子を含んでいてもよいことを意味し、好ましくは配列番号101〜200のいずれかで表される塩基配列で特定される遺伝子からなる上記遺伝子リストに含まれるその他の遺伝子を含む。 Here, for example, the "set of genes including genes from at least the first gene list until the 5th" means that may contain genes other than genes from first to fifth, preferably SEQ It includes other genes included in the gene list of genes that are identified by the nucleotide sequence shown in any of numbers 101 to 200.

また、好適な遺伝子セットの別の具体例としては、遺伝子リストの1番目から15番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子、好ましくは少なくとも10の遺伝子を含む遺伝子セットが挙げられる。 In addition, as another specific example of a suitable gene set, at least 5 of the genes selected from the genes from the first gene list until 15 th, and the like, preferably a gene set comprising at least 10 genes.

ここで例えば、「上記遺伝子リストの1番目から15番目までの遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子を含む遺伝子セット」とは、上記と同様に、1番目から15番目までの遺伝子以外の遺伝子を含んでいてもよいことを意味し、好ましくは配列番号101〜200のいずれかで表される塩基配列で特定される遺伝子からなる上記遺伝子リストに含まれるその他の遺伝子を含む。 Here, for example, "at least a set of genes including the 5 genes selected from the genes from the first the gene lists first 15", in the same manner as mentioned above, a gene other than the gene from first to 15 th including means that may preferably include other genes included in the gene list of genes that are identified by the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NO: 101 to 200.

遺伝子セットに含まれる遺伝子のうちの、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の遺伝子が、配列番号101〜200のいずれかで表される塩基配列で特定される遺伝子からなる遺伝子リストに含まれる遺伝子であることが好ましい。 Of the genes included in the gene set, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more genes of SEQ ID NO: 101 to 200 it is preferably a gene contained in the list of genes consisting of the genes identified in the nucleotide sequence shown in any.

未知サンプルにおいて、これらの遺伝子セットに含まれる遺伝子の発現を検出することにより、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を高い判別率で、確実に判別することができる。 In an unknown sample, by detecting the expression of genes included in these gene sets, systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis at a high discrimination ratio, it can be reliably discriminated.

遺伝子発現量の測定 Measurement of gene expression levels
被検者由来の試料中の、各遺伝子の発現を検出する方法、より詳しくは各遺伝子の発現量を測定する方法としては、被検者由来の試料中の各塩基配列で特定される遺伝子のmRNAを測定する方法が挙げられる。 In a sample from a subject, a method of detecting expression of each gene, as a method for more particularly measuring the expression level of each gene, the gene specified by the nucleotide sequence in a sample from a subject methods of measuring the mRNA and the like.

以下、被検者由来の試料中の各塩基配列で特定される遺伝子のmRNAを測定する方法について説明する。 Hereinafter, a method for measuring mRNA of a gene identified by the nucleotide sequence in a sample derived from a subject. ここで、各遺伝子のmRNAの測定には、該mRNAから調製されたcRNA、cDNAまたはaRNAを測定することも包含される。 Here, the measurement of mRNA of each gene, cRNA prepared from the mRNA, it is also included to measure the cDNA or aRNA.

当該方法は、被検者由来の試料、特に全血から全RNAを抽出する工程、および該全RNAにおける対象遺伝子、すなわち各塩基配列で特定される遺伝子の発現量を測定する工程を含む。 The method comprises the step of measuring a sample from a subject, a step of extracting total RNA particularly from whole blood, and the target genes in 該全 RNA, i.e. the expression level of a gene identified in the nucleotide sequence.

被検体由来の試料から全RNAを抽出する方法は、特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159)等を採用することができる。 Method for extracting total RNA from a sample derived from the subject is not particularly limited, for example, guanidine thiocyanate-cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate-hot phenol method, guanidine hydrochloride method, a guanidine-phenol-acidic thiocyanate chloroform method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159) can be employed, and the like. なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。 Of these, acidic guanidine thiocyanate-phenol-chloroform method is preferable.

対照として用いられる自己免疫疾患に罹患していない健常者試料由来の全RNAは、上記と同様に抽出、精製して調製することも可能であるが、市販のものを用いてもよい。 Total RNA from healthy individuals sample not suffering from an autoimmune disease used as controls, are extracted in the same manner as described above, it is also possible to prepare purified, it may be commercially available.

続いて、上記で得られた全RNAよりcRNA、cDNAまたはaRNAなどの被検ポリヌクレオチドを調製し、これを放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの適当な標識でラベルすることにより、そのシグナル強度を検出する。 Subsequently, cRNA from total RNA obtained in the above, to prepare a test polynucleotide such as cDNA or aRNA, radioisotope this fluorescent substance, by labeling with a suitable label such as a light emitting substance, that signal strength to detect. 放射性同位体としては、 32 P、 125 I、 35 Sなどを用いることができる。 Radioisotopes, or the like can be used 32 P, 125 I, 35 S . また蛍光物質としては、例えば、CyDye、フルオレセン(FITC)、スルホローダミン(SR)、テトラメチルローダミン(TRITC)などを用いることができる。 As the fluorescent substance, for example, CyDye, fluorescein (FITC), sulforhodamine (SR), and the like can be used tetramethylrhodamine (TRITC). また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。 As the luminescent substance can be used as luciferin.

シグナル強度の検出は、標識を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法の使用できる。 Detection of the signal intensity can be used in any method as long as it is a known method in the art for detecting the label. 例えば、標識として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。 For example, in the case of using a radioactive isotope as the label, it is possible to measure the radioactivity, for example, liquid scintillation counter, and the like γ- counter. また標識として蛍光物質を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光スキャナーなどを用いて検出することができる。 In the case of using a fluorescent substance as the label, it can detect the fluorescence with a fluorescent microscope, fluorescent plate reader, a fluorescent scanner.

具体的には、上記被検ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブが固定された担体に前記被検ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより測定できる(Brown, PO et al., Nature genet. 21, suppliment, 33-37 (1999))。 Specifically, can be measured by hybridizing the test polynucleotide to a carrier for a probe that specifically hybridizes to the test polynucleotide is fixed (Brown, PO et al., Nature genet. 21, suppliment, 33-37 (1999)). 例えば、抽出した全RNAから逆転写酵素反応でcDNAを作製し、該cDNAからT7酵素反応でaRNAを作製する際にアミノアリル-UTP等を加え、蛍光標識(例えば、Cy3、Cy5等)で間接標識し、固定化されたプローブとハイブリダイゼーションを行い、標識に由来する蛍光シグナルを検出、解析する。 For example, extraction cDNA was prepared by reverse transcriptase reaction from total RNA, added aminoallyl -UTP etc. in making aRNA with T7 enzyme reaction from the cDNA, indirectly labeled with a fluorescent label (e.g., Cy3, Cy5, etc.) and performs immobilized probe hybridized, the fluorescent signal derived from the labeled detection and analysis.

プローブが固定化された担体としては、例えば、DNAマイクロアレイ(DNAチップ)を用いることができる。 Carriers which probe is immobilized, for example, may be used DNA microarray (DNA chip). DNAチップは、データベース上のEST配列、または全RNA配列を基に合成したDNAを固定化したものが好ましい。 DNA chip, it is preferable that immobilized DNA synthesized based on the EST sequence, or total RNA sequences in the database. 該DNAチップは、市販のもの(例えば、日立ソフトウエアエンジニアリング社製、AceGene(登録商標) Human Oligo Chip 30K)を用いてもよいし、公知の方法(Lipshutz, RJ etal., Nature genet. 21, suppliment, 20-24 (1999))に基づき作製してもよい。 The DNA chip is commercially available (e.g., Hitachi Software Engineering Co., AceGene (registered trademark) Human Oligo Chip 30K) may be used, a known method (Lipshutz, RJ etal., Nature genet. 21, suppliment, may be made based on 20-24 (1999)).

また、プライマーを用いて被検ポリヌクレオチドを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、被検者由来の試料中の遺伝子の発現量を測定することもできる。 Also performs amplification reaction the test polynucleotide as a template with primers, by detecting the specific amplification reaction, it is possible to measure the expression level of a gene in a sample derived from a subject.

増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の原理を利用した公知の方法、例えば、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、ATAC-PCR法等が挙げられる。 As amplification techniques include, but are not limited to, known methods utilizing the principle of polymerase chain reaction (PCR) method, for example, PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, and ATAC-PCR method. その他の増幅手法としては、LAMP法、ICAN法、RCA法、LCR法、SDA法などを挙げることができる。 Other amplification techniques, mention may be made of LAMP method, ICAN method, RCA method, LCR method, SDA method, or the like. 増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。 Amplification is carried out until the amplification product is detectable level.

上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。 In order to detect whether or not occurred specific amplification reaction after the amplification reaction may be a known means capable of specifically recognizing the amplification products obtained by the amplification reaction. 例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。 For example, by using agarose gel electrophoresis and the like, by checking whether the amplified fragments of a specific size has been amplified, it is possible to detect the specific amplification reaction.

あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPやdUTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識を作用させ、この標識を検出することができる。 Alternatively, the dNTP and dUTP incorporated in the course of the amplification reaction, a radioisotope, a fluorescent substance, by applying a label, such as a light emitting material, it is possible to detect the label. これら標識の種類や標識の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。 For the introduction method, etc. These labels type and labeling are not particularly limited, it is possible to use various conventionally known means. 以上のようにして特異的な増幅反応の増減により、被検者由来の試料において各遺伝子の発現量を測定できる。 The increase or decrease of specific amplification reaction as described above, can measure the expression level of each gene in a sample from a subject.

その他の遺伝子発現量の測定方法としては、例えば、サブトラクション法(Sive, HL and John, T. St., Nucleic Acids Research 16, 10937 (1988)、Wang, Z., and Brown, DD, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11505-11509 (1991))、ディファレンシャル・ディスプレイ法(Liang, P., and Pardee, AB, Science 257, 967-971 (1992)、Liang, P., Averboukh, L.,Keyomarsi, K., Sager, R., and Pardee, AB, Cancer Research 52, 6966-6968 (1992))、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法(John, T. St., and Davis, RW Cell, 16, 443-452 (1979))、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis, T., Fritsch, EF, Sambrook, J., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982))等を挙げることができる。 As a measuring method other gene expression, for example, subtraction method (Sive, HL and John, T. St., Nucleic Acids Research 16, 10937 (1988), Wang, Z., and Brown, DD, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 88, 11505-11509 (1991)), differential display method (Liang, P., and Pardee, AB, Science 257, 967-971 (1992), Liang, P., Averboukh, L. , Keyomarsi, K., Sager, R., and Pardee, AB, Cancer Research 52, 6966-6968 (1992)), differential hybridization method (John, T. St., and Davis, RW Cell, 16, 443 -452 (1979)), also cross-hybridization using an appropriate probe (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis, T., Fritsch, EF, Sambrook, J., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)) and the like can be given.

上記方法において、被検者由来の試料は、被検者や臨床献体等から単離された、血液、体液、組織または排泄物等の試料を意味するが、血液に由来する試料、例えば、全血、血液細胞抽出物(例えば、リンパ球などの白血球の抽出物)、血清を用いるのが好ましく、特に全血を用いるのが好ましい。 In the above method, a sample from a subject, was isolated from a subject and clinical give body for medical research, etc., blood, body fluids, means a sample, such as tissue or excreta, a sample derived from blood such as whole blood, blood cell extracts (e.g., extracts of leukocytes such as lymphocytes), it is preferable to use serum, preferably especially whole blood is used.

キット kit
本発明はまた、配列番号1〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットにおいて、(a)各遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長の連続したプライマー、または(b)各遺伝子を検出するための20〜1500塩基長の連続したプローブを含み、該遺伝子セットの自己免疫疾患の判別率が50%以上である、自己免疫疾患を判別するためのキットに関する。 The present invention also provides a set of genes comprising a gene that is selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 100, (a) successive primers 15-30 bases in length for specifically amplifying each gene or (b) comprises a continuous probe 20-1500 bases in length for detecting each gene, autoimmune diseases of the gene set, the discrimination rate is 50% or more, a kit for determining the autoimmune disease.

本発明はまた、配列番号101〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子からなり配列番号の順に順位付けされた高判別能遺伝子リストから選択される遺伝子を含む遺伝子セットにおいて、(a)各遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長の連続したプライマー、または(b)各遺伝子を検出するための20〜1500塩基長の連続したプローブを含み、該遺伝子セットの全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率が50%以上である、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するためのキットに関する。 The present invention also provides a set of genes comprising a gene that is selected from high discrimination ability gene list are ranked in order of SEQ ID consists genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 200, (a) wherein each gene specific continuous primer 15-30 bases in length to amplify or (b) a continuous probe 20-1500 bases in length for detecting each gene, systemic onset juvenile of the gene set sex idiopathic arthritis and discrimination rate articulated juvenile idiopathic arthritis is 50% or more, a kit for determining the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis.

前記(a)記載のプライマーは、各塩基配列に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。 Wherein (a) primers described, based on each nucleotide sequence, such as using a commercially available primer design software, by a conventional method and readily designed, can be amplified. 利用可能なソフトとしては、例えばOligo TM (National Bioscience Inc.)、GENETYX(ソフトウェア開発(株))などが挙げられる。 The available software, for example, Oligo TM (National Bioscience Inc.) , GENETYX ( Software Development Co., Ltd.) and the like. プライマーとして実質的な機能を有する長さは、通常15〜30塩基であり、さらに好ましくは18〜20塩基である。 Length with a substantial function as a primer is generally 15 to 30 bases, more preferably from 18 to 20 bases.

前記(b)記載のプローブは、各塩基配列で特定される遺伝子のmRNAから調製されるcDNA、cRNAまたはaRNA等の被検ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、20〜1500塩基長程度のものが好ましい。 Wherein (b) probes described is a test polynucleotide that specifically hybridizes to a polynucleotide of cDNA, etc. cRNA or aRNA prepared from mRNA of a gene identified by the nucleotide sequence, 20-1500 of about bases long it is preferred. 具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、20塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドか2本鎖DNAが好適に用いられる。 More specifically, if the Northern hybridization, single-stranded oligonucleotide or double-stranded DNA of about 20 bases in length are preferably used. また、DNAチップであれば、100〜1500塩基長程度の2本鎖DNA、または20〜100塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。 Furthermore, if a DNA chip, double-stranded DNA of about 100 to 1500 bases in length or 20 to 100 bases in length of about 1-stranded oligonucleotides, are preferably used.

該プローブは、ガラス板、プラスチック基板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の担体に固定されていてもよく、このような固定化担体とその作製方法については、既に説明したが、例えば、DNAチップを挙げることができる。 The probe, a glass plate, a plastic substrate, a nylon membrane, micro beads may be immobilized on a support such as a silicon chip, a manufacturing method as such immobilization pellets has been previously described, e.g., DNA mention may be made of the chip.

これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル(例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等)されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。 These primers and probes may be labeled with a suitable label (e.g., an enzyme label, radioactive label, fluorescent label, etc.) may be also biotin, phosphate, it may be modified by an amine or the like. また、プライマーやプローブの設計の際には、融解温度(Tm)やGC含量などを考慮することが好ましい。 Further, in the design of primers and probes, it is preferable to consider such melting temperature (Tm) and GC content.

本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明にかかる自己免疫疾患の検査に必要な試薬等を適宜含んでいてもよい。 Kits of the present invention other components described above, if necessary, hybridization, labeling of the probe, detection of the label body, also include inspection appropriate reagents necessary for autoimmune diseases according to the present invention good.

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。 Hereinafter, the present invention is described with reference examples, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.

ヒト約30,000遺伝子からデザインしたオリゴDNAを搭載したDNAチップ(AceGene(登録商標) Human Oligo Chip Human 30K)を用い、末梢血細胞中に発現している遺伝子について、被検者の末梢血全血より抽出された全RNAを対照として、遺伝子の発現量を測定した。 Using a DNA chip mounted oligo DNA was designed from human about 30,000 genes (AceGene (registered trademark) Human Oligo Chip Human 30K), the genes expressed in peripheral blood cells, extracted from peripheral blood whole blood of the subject as a control the total RNA was measured the expression level of the gene.

具体的には、末梢血細胞中から抽出した全RNAを使用してアミノアリル増幅aRNAを調製し、そのaRNAを各々蛍光色素Cy3、Cy5で間接標識(ポストラベル)してDNAチップ (AceGene(登録商標) Human Oligo Chip Human 30K) にてハイブリダイゼーションを行い、蛍光スキャナーで末梢血細胞中に発現している遺伝子の発現量の変化を測定した。 Specifically, by using the total RNA extracted from peripheral blood cells were prepared aminoallyl amplified aRNA, indirect labeling (post label) each with a fluorescent dye Cy3, Cy5 and the aRNA to DNA chips (AceGene (R) Human Oligo Chip Human 30K) hybridization is performed at, and measuring a change in the expression level of genes that are expressed in peripheral blood cells with a fluorescence scanner.

測定試料として以下を用いた: As a measurement sample using the following:
全身型若年性特発性関節炎(soJIA)患者の末梢血細胞より抽出された全RNA:51症例 多関節型若年性特発性関節炎(polyJIA)患者の末梢血細胞より抽出された全RNA:5症例 健常子供の末梢血細胞より抽出された全RNA:8症例 健常成人の末梢血細胞より抽出された全RNA(Reference作成のため):45症例 測定試料は室温で保存し、全RNAの抽出後から測定終了時までの期間は、超低温槽(SANYO社製)中、-60℃以下で保存した。 Systemic-onset juvenile idiopathic arthritis (soJIA) total RNA extracted from a patient's peripheral blood cells: 51 cases articulated juvenile idiopathic arthritis (polyJIA) total RNA extracted from a patient's peripheral blood cells: the five cases healthy children total RNA was extracted from peripheral blood cells: 8 cases healthy adults (for Reference creation) total RNA extracted from peripheral blood cells: 45 cases measurement sample stored at room temperature, until at the end of measurement after extraction of total RNA period during cryogenic bath (SANYO Co.), and stored at -60 ° C. or less.

実施例1 全RNAの抽出 Extraction of Example 1 Total RNA
PAXgene真空採血管(PreAnalytiX)を用いて採られた末梢血より、PAXgene RNA Blood RNA Kit(PreAnalytiX)を用いて全RNAを抽出した。 From peripheral blood taken with PAXgene vacuum blood collection tube (PreAnalytiX), total RNA was extracted using the PAXgene RNA Blood RNA Kit (PreAnalytiX). 詳細は以下のとおりである。 The details are as follows.

4℃で保存(一日以上)してある採血管を、RNA抽出前に30分間室温で静置した。 The 4 ° C. in storage (more than one day) and blood collection tubes are allowed to stand at room temperature for 30 min prior to RNA extraction. 4000Gで10分間室温で遠心した。 And centrifuged at room temperature for 10 minutes at 4000 G. デカントで上澄みを除去し、ペレットにRNAse free H 2 Oを5ml加え、ボルテックスした。 The supernatant was removed by decantation, RNAse free H 2 O was added 5ml into pellets and vortexed. 4000Gで10分間室温で遠心した。 And centrifuged at room temperature for 10 minutes at 4000 G. デカントで上澄みを除去し、Buffer BR1 360μlを添加し、ボルテックス後1.5mlチューブにピペッティングで移した。 The supernatant was removed by decantation, addition of Buffer BR1 360 [mu] l, was transferred by pipetting vortexing after 1.5ml tube. Buffer BR2 300μl、Proteinase K 40μlを添加し、ボルテックスした。 Buffer BR2 300μl, the addition of Proteinase K 40μl, was vortex. 55℃で10分間インキュベートし、途中に2〜3回 ボルテックスした。 And incubated 55 ° C. for 10 minutes and 2-3 times vortexed halfway. 15000 Gで3分間室温で遠心後、上清を1.5mlチューブ にピペッティングで移した。 After centrifugation at room temperature for 3 minutes at 15000 G, and transferred by pipetting the supernatant to 1.5ml tube. 99.5% EtOH 350μlを添加し、ボルテックスした。 It was added 99.5% EtOH 350 [mu] l, and vortexed. 試料700μlをPAXgeneカラムに添加し、15000Gで1分間室温で遠心した。 Was added to the samples 700μl in PAXgene column, and centrifuged at room temperature for 1 minute at 15000 G. 残りの試料をPAXgeneカラムに添加し、15000Gで1分間室温で遠心した。 Adding the remainder of the sample PAXgene column, and centrifuged at room temperature for 1 minute at 15000 G.

カラムを新しいコレクションチューブに置き、Buffer BR3 350μlを添加し、15000 Gで1分間室温で遠心した。 Place the column into a new collection tube, adding a Buffer BR3 350 [mu] l, and centrifuged at room temperature for 1 minute at 15000 G. カラムを新しいコレクションチューブに置き、DNAse I(DNAse:10 RDD:70μl)80μlを添加し、15分間静置した。 Place the column in a new collection tube, DNAse I (DNAse: 10 RDD: 70μl) was added to 80μl, it was allowed to stand for 15 minutes. 静置したカラムに、Buffer BR3 350μl μlを添加し、15000rpmで1分間室温で遠心した。 A standing column, the addition of Buffer BR3 350 [mu] l [mu] l, and centrifuged at room temperature for 1 min at 15000 rpm. カラムを新しいコレクションチューブに置き、Buffer BR4 500μlを添加し15000 Gで1分間室温で遠心した。 Place the column into a new collection tube and centrifuged for 1 minute at room temperature with the addition of Buffer BR4 500μl 15000 G. カラムを新しいコレクションチューブに置き、Buffer BR4 500μlを添加し15000 Gで3分間室温で遠心した。 Place the column into a new collection tube and centrifuged at room temperature for 3 minutes by adding Buffer BR4 500μl 15000 G. カラムを新しいコレクションチューブに置き、15000 Gで1分間室温で遠心しEtOHを除いた。 Place the column into a new collection tube was removed by centrifugation EtOH at room temperature for 1 minute at 15000 G. カラムを溶出チューブにセットし、Buffer BR5 50μlをメンブレン全体を湿らすように添加し、5分間静置した後15000 Gで1分間室温で遠心した。 Set the column elution tube, was added Buffer BR5 50 [mu] l to moisten the entire membrane, and centrifuged at room temperature for 1 minute at 15000 G After standing 5 minutes. 溶出液を再度カラム上に添加し、5分静置した後、15000 Gで1分間室温で遠心した。 The eluate was again added onto the column, it was left to stand for 5 minutes, and centrifuged at room temperature for 1 minute at 15000 G. 得られた全RNAを‐60℃以下で保存した。 Total RNA obtained was stored at -60 ℃ below.

全RNA 1μlを使用してNanoDrop(登録商標)(NanoDrop(登録商標) Technologies Inc.)で濃度測定した。 And the concentration measured by NanoDrop using the total RNA 1μl (registered trademark) (NanoDrop (TM) Technologies Inc.). また、全RNA 1μlを使用してAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies Inc.)で品質をチェックした(18S rRNA:28S rRNAの存在比が約1:2であることが望ましい)。 Was also checked quality Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.) using whole RNA 1 [mu] l (18S rRNA: it is desirable that the 2: abundance ratio of 28S rRNA is about 1).
NanoDrop(登録商標)で算出された濃度を基に各全RNAを1μgずつ小分けしたものを3本調製し、残試料と共に-60℃以下の温度で保存した。 NanoDrop (TM) each total RNA 3 present and prepared those aliquots 1μg based on the calculated concentration, and stored at -60 ° C. temperature below along with residual samples.

実施例2 aRNAの増幅 Amplification of Example 2 aRNA
末梢血細胞由来全RNAをAmino Allyl Message Amp TM aRNA kit(#1752:Ambion)を用いて各々aRNA増幅し、アミノアリル標識aRNAを調製した。 Peripheral blood cells from total RNA Amino Allyl Message Amp TM aRNA kit (# 1752: Ambion) was aRNA amplified each was used to prepare amino allyl labeled aRNA. 詳細は以下の1)〜6)のとおりである。 The details are as follows: 1) to 6).

1)First Strand cDNA の調製 1) Preparation of First Strand cDNA
(1)以下の試薬を混合し、70℃のヒートブロックで10分間インキュベートした。 (1) The following reagents were mixed and incubated with a heat block at 70 ° C. 10 min.
全RNA 2μg Total RNA 2μg
T7 Oligo(dT)Primer 1μl T7 Oligo (dT) Primer 1μl
Nuclease free DW up to 12μl Nuclease free DW up to 12μl
(2)以下の組成(1サンプルあたり)でプレミックスを調製した。 (2) A premix was prepared with the following composition (per sample).
10 × First Strand Buffer 2μl 10 × First Strand Buffer 2μl
Ribonuclease Inhibitor 1μl Ribonuclease Inhibitor 1μl
dNTP Mix 4μl dNTP Mix 4μl
Reverse Transcriptase 1μl Reverse Transcriptase 1μl
(3)(1)の反応液に(2)のプレミックスを加え、数回ピペッティングして液を混合した後、42℃のヒートブロック中で2時間インキュベートした。 (3) (1) to the reaction solution a premix of (2) was added, after mixing the solution with pipetting several times and incubated for 2 hours in a heat block at 42 ° C.. サンプルを氷上に移し冷却した。 Samples were on ice for transferring cooling.

2)Second Strand cDNAの合成 上記のサンプルに以下の試薬を加え、数回ピペッティングして混合し、16℃で2時間インキュベートした。 2) Second Strand The following reagents Synthesis of a sample of the cDNA is added, and mixed by pipetting several times and incubated for 2 hours at 16 ° C..
Nuclease free DW 63μl Nuclease free DW 63μl
10×second Strand Buffer 10μl 10 × second Strand Buffer 10μl
dNTP Mix 4μl dNTP Mix 4μl
DNA Polymerase 2μl DNA Polymerase 2μl
RNAse H 1μl RNAse H 1μl

3)cDNAの精製 キットに添付のフィルターカートリッジをウォッシュチューブにセットし、cDNA binding buffer 50μlでフィルターを湿らせた。 3) the filter cartridge attached to purification kit cDNA was set in the wash tube, moistened filter with cDNA binding buffer 50 [mu] l. そのまま室温で5分間インキュベートした。 It was incubated for 5 minutes at room temperature. 合成したcDNAサンプル溶液に、cDNA binding buffer 250μlを加え、数回ピペッティングして混合した後、上記フィルターカートリッジに移した。 The synthesized cDNA sample solution, the cDNA binding buffer 250 [mu] l was added and after mixing by pipetting several times, and transferred to the filter cartridge. 溶液がフィルターを通過し終わるまで10000Gで1分間遠心した。 The solution was centrifuged 1 minute at 10000G until it has passed through the filter. ウォッシュチューブ内の液を捨て、フィルターカートリッジを戻した。 Discard the liquid in the wash tube, and replace the filter cartridge. cDNA wash buffer 650μlをフィルターに入れた。 The cDNA wash buffer 650μl were placed in a filter. 溶液がフィルターを通過し終わるまで10000Gで1分間遠心した。 The solution was centrifuged 1 minute at 10000G until it has passed through the filter. ウォッシュチューブ内の液を捨て、フィルターカートリッジを戻し、再度10000Gで1分間遠心してフィルターに残ったwash buffer を完全に振り落とした。 Discard the liquid in the wash tube, and replace the filter cartridge, shaken off the complete wash buffer remaining on the filter was centrifuged for 1 minute again 10000 G. フィルターカートリッジを新しいチューブにセットし、あらかじめ50℃に暖めておいたnuclease free DW 9μlをフィルターに入れた。 Set the filter cartridge to a new tube, was charged with nuclease free DW 9μl which had been warmed in advance to 50 ℃ in the filter. この時、なるべくフィルターの中央部分にDWを入れるようにした。 This time, was to put the DW as much as possible in the central portion of the filter. 室温で2分間インキュベートした後、10,000Gで1分間遠心した。 After incubation for 2 minutes at room temperature and centrifuged 1 min at 10,000 G. 上記のnuclease free DW 9μlをフィルターに入れ、室温で2分間インキュベートし、10,000Gで1分間遠心する操作を繰り返し、14μlのcDNAサンプル溶液を回収した。 Put the above nuclease free DW 9 [mu] l to the filter, and incubated for 2 min at room temperature, centrifuged repeatedly for 1 min at 10,000 G, was recovered cDNA sample solution 14 .mu.l.

4)アミノアリル標識aRNA の合成 上記1)〜3)の操作で得られたcDNAサンプル溶液14μlを0.2ml遠心チューブに取り、以下の試薬を加えた。 4) aminoallyl synthesis of labeled aRNA above 1) takes a cDNA sample solution 14μl obtained in operation and 3) to 0.2ml centrifuge tube was added the following reagents.
aaUTP Solution (50 mM) 3μl aaUTP Solution (50 mM) 3μl
ATP, CTP, GTP mix (25 mM) 12μl ATP, CTP, GTP mix (25 mM) 12μl
UTP Solution (50 mM) 3μl UTP Solution (50 mM) 3μl
T7 10×Reaction Buffer 4μl T7 10 × Reaction Buffer 4μl
T7 Enzyme Mix 4μl T7 Enzyme Mix 4μl
数回ピペッティングして液を混合した後、37℃のサーマルサイクラーで14時間インキュベートした。 After mixing the solution by pipetting several times, and incubated 14 hours in a thermal cycler 37 ° C.. インキュベート終了後、サーマルサイクラーは自動で4℃に設定された。 After completion of the incubation, the thermal cycler was set to 4 ° C. automatically. DNAse 2μlを加えてピペッティングで混合し、37℃のサーマルサイクラーで30分間インキュベートした。 Mixed by pipetting added DNAse 2 [mu] l, it was incubated in a thermal cycler 37 ° C. 30 min.

5)アミノアリル標識aRNAの精製 5) Purification of amino allyl labeling aRNA
Amino Allyl Message Amp TM aRNA kit (Ambion)に添付されたaRNAコレクションチューブとフィルターカートリッジをセットした。 Amino Allyl Message Amp TM aRNA was set aRNA collection tube and a filter cartridge that is attached to the kit (Ambion). 4)で得られたサンプル溶液を1.5mlの遠心チューブに移し、58μlのnuclease free DW、aRNA binding buffer 350μl、100% EtOH 250μlを加え、数回ピペッティングして溶液を混合した後、aRNAコレクションチューブに入れ、10000Gで1分間遠心した。 The sample solution obtained in 4) was transferred to a 1.5ml centrifuge tube, nuclease free DW of 58μl, aRNA binding buffer 350μl, a 100% EtOH 250 [mu] l was added and the solution was mixed by pipetting several times, aRNA Collection Tube put in, followed by centrifugation for 1 minute at 10000G. フィルターカートリッジをはずして遠心チューブ内の液を捨て、フィルターを戻した。 Discard the liquid in the centrifuge tube and remove the filter cartridge and replace the filter. aRNA wash buffer 650μlをフィルターに入れ、10000Gで1分間遠心した。 Put aRNA wash buffer 650μl filter and centrifuged for 1 minute at 10000 G. チューブ内の液を捨て、フィルターカートリッジを戻し、再度1000Gで1分間程度遠心してフィルターに残ったwash bufferを完全に振り落とした。 Discard the liquid in the tube, replace the filter cartridge, shaken off the complete wash buffer remaining on the filter was centrifuged for about 1 minute again 1000 G. フィルターカートリッジを新しいチューブにセットし、あらかじめ50℃に暖めておいたnuclease free DW 50μlをフィルターに入れた。 Set the filter cartridge to a new tube, was charged with nuclease free DW 50μl which had been warmed in advance to 50 ℃ in the filter. この時、なるべくフィルターの中央部分にDWを入れるようにした。 This time, was to put the DW as much as possible in the central portion of the filter. 室温で2分間インキュベートした後、10,000Gで2分間遠心した。 After incubation for 2 minutes at room temperature and centrifuged for 2 min at 10,000 G. 上記のnuclease free DW 50μlをフィルターに入れ、室温で2分間インキュベートし、10,000Gで2分間遠心する操作を繰り返し、100μlのアミノアリル標識aRNAサンプルを回収した。 Put the above nuclease free DW 50 [mu] l to the filter and incubated at room temperature for 2 minutes, repeated operation of centrifuge 2 minutes at 10,000 G, to recover the amino allyl labeled aRNA samples 100 [mu] l.

6)アミノアリル標識aRNAの濃度測定と保存 5)で得られたアミノアリル標識aRNAサンプル溶液から1μlを取り、RNA 6000 Nano LabChip(登録商標)kit(Agilent Technologies)を用いて、Bioanalyzer(登録商標)(Agilent Technologies)による電気泳動を行った。 6) aminoallyl takes concentration measurement of labeled aRNA with a 1μl from amino allyl labeled aRNA sample solution obtained in storage 5), using RNA 6000 Nano LabChip (TM) kit and (Agilent Technologies), Bioanalyzer (R) (Agilent electrophoresis was performed by the Technologies). これにより正常にaRNA増幅が行われているかを確認した。 Thus it was confirmed whether has been performed successfully aRNA amplification. 同アミノアリル標識aRNAサンプル溶液から1μlを使用し、NanoDrop(登録商標)(NanoDrop(登録商標) Technologies Inc.)で濃度測定した。 Using 1μl from the amino allyl labeled aRNA sample solution was concentration measured by NanoDrop (TM) (NanoDrop (TM) Technologies Inc.). aRNA溶液は1回反応使用分(5μg)に分注し、下記の方法でEtOH沈殿を行い、-20℃以下にて保存した。 aRNA solution dispensed into the reaction using component once (5 [mu] g), performed EtOH precipitation in the following manner, and stored at -20 ° C. or less.

実施例3 カップリング反応およびフラグメンテーション Example 3 Coupling reaction and fragmentation
実施例2で得られたペレットをカップリングバッファーに溶解し、各々aRNAに蛍光色素Cy3またはCy5を結合させて標識化した。 The pellets obtained in Example 2 was dissolved in coupling buffer, it was labeled with each bound fluorescence dye Cy3 or Cy5 in aRNA. 詳細は以下のとおりである。 The details are as follows.
DMSOに溶解したCyDye(Amersham Bioscience)をaRNA溶液に加え、40℃に設定されたヒートブロック中で1時間反応させた。 CyDye dissolved in DMSO to (Amersham Bioscience) was added to the aRNA solution was reacted at a heat block set to 40 ° C.. 未反応のCyDyeをゲルろ過カラム(Micro Bio-Spin(登録商標) P-30)で除去した。 It was removed by the CyDye unreacted gel filtration column (Micro Bio-Spin (R) P-30). CyDye化されたaRNAは限外ろ過膜(Microcon(登録商標) YM-30)で精製・濃縮した。 CyDye reduction has been aRNA was purified and concentrated by ultrafiltration membrane (Microcon (R) YM-30).

得られた溶液に5×fragmentation bufferを混合した。 The resulting solution was mixed 5 × fragmentation buffer. 94℃に設定されたヒートブロック中で15分加温後、クラッシュアイスで急冷した。 After 15 minutes warmed in a heat block which had been set to 94 ° C., and quenched with crushed ice. 3%アガロースゲル電気泳動法で、フラグメント化を確認した。 A 3% agarose gel electrophoresis, to confirm the fragmentation. 得られた溶液を限外ろ過膜(Microcon(登録商標) YM-10)で精製・濃縮した。 The resulting solution was purified and concentrated by ultrafiltration membrane (Microcon (R) YM-10) to.

実施例4 ハイブリダイゼーション Example 4 Hybridization
ハイブリダイゼーション溶液、salmon sperm DNA等を加え、ターゲット溶液を作製した。 Hybridization solution, the salmon sperm DNA, etc. was added to prepare a target solution. ハイブリダイゼーション溶液は、塩化テトラメチルアンモニウム(Aldrich、T1、952-6、98+%)109.60gを約100mlの滅菌蒸留水に溶解し、更に滅菌蒸留水を加えて200mlにメスアップした後、0.2mm径のフィルターで濾過し、50mlのプラスチック製遠心チューブに分注して、室温(15℃〜27℃)にて保存することにより作製した。 Hybridization solution, tetramethyl ammonium chloride (Aldrich, T1,952-6,98 +%) 109.60g was dissolved in sterile distilled water to about 100 ml, it was filled up to 200ml by adding further sterile distilled water, 0.2 was filtered through a filter of mm diameter, was dispensed into 50ml plastic centrifuge tube was produced by storing at room temperature (15 ℃ ~27 ℃).

ターゲット溶液を95℃に設定されたヒートブロック中にて2分熱変性後、クラッシュアイスで急冷した。 After 2 minutes heat denature the target solution at a heat block which had been set to 95 ° C., and quenched with crushed ice. ホルムアミドを加え、ハイブリダイゼーション液を作製した。 Formamide was added to prepare a hybridization solution. 自動ハイブリ装置(HS400 TECAN)を用いてハイブリダイゼーションを行った。 Hybridization was performed using an automated hybridization device (HS400 TECAN).

2×SSC-0.1%SDS溶液中で5分間(30℃)洗浄し、2×SSC-0.1%SDS溶液で5分間(30℃)洗浄し、2×SSC 溶液で5分間(30℃)洗浄し、1×SSC 溶液で5分間(30℃)洗浄した。 2 × SSC-0.1% SDS solution for 5 minutes (30 ° C.) and washed, 2 × SSC-0.1% SDS solution for 5 minutes (30 ° C.) and washed, 2 × SSC solution for 5 minutes (30 ° C.) and washed , 1 × SSC solution for 5 minutes (30 ° C.) and washed.

読取装置(ScanArray(登録商標)Lite)(Packard Biochip Technologies)を用いてDNAチップ上の各スポットのCy3およびCy5の蛍光強度を測定した。 The fluorescence intensity of the reading device (ScanArray (R) Lite) for each spot on (Packard Biochip Technologies) using a DNA chip Cy3 and Cy5 were determined. 画像データーの数値化はDNASISArray(登録商標)を用いて行い、得られた数値データをExcel (Microsoft)上で標準化した。 Digitizing images data is performed with DNASISArray (registered trademark), were normalized numerical data obtained on Excel (Microsoft).
上記実施例で用いた試薬の詳細は以下のとおりである。 The details of the reagent used in the above examples are as follows.

かくして選択された標準化数値データは、バックグラウンドの影響を受けておらず、Cy3とCy5の検出感度の違いによる誤差も含まず、解析した症例の大半においてデータが取得されており、かつ、健常者との比較における若年性特発性関節炎の遺伝子発現の変動幅、または全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎との比較における遺伝子発現の変動幅が、個人差に起因する遺伝子発現変動幅を超えている遺伝子の発現情報を有しており、以降の統計解析の信頼性を確保することができるものであった。 Thus standardized numerical data selected is not influenced by the background, not include error due to the difference of detection sensitivity of Cy3 and Cy5, and the data is acquired in most cases analyzed, and healthy subjects gene variation width of gene expression in comparison to the juvenile variation range of gene expression idiopathic arthritis or systemic juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis, is, due to individual differences in comparison to has the expression information of genes that exceed the expression variation width was achieved, it is possible to ensure the reliability of the subsequent statistical analysis.

上記標準化遺伝子発現データに基づき、Golubらの方法(Science,前掲)に従い、上記手順101〜107、手順201〜205、および手順301〜306により、高判別能遺伝子リストの作成および遺伝子セットの決定を実施した。 Based on the above normalization gene expression data, in accordance Golub et al. Method (Science, supra), the procedure 101 to 107, steps 201 to 205, and the procedures 301 to 306, the creation and decision of the gene set high discrimination ability Gene List Carried out.

本実施例で作成された若年性特発性関節炎を検査するための高判別能遺伝子リストは、上記表1に記載した配列番号1〜100のいずれかで特定される遺伝子からなる配列番号の順に順位付けされた遺伝子リストである。 High ability to discriminate gene list for checking the juvenile idiopathic arthritis created in this example, ranking in order of SEQ ID NO: consisting of the genes identified in any of SEQ ID 1-100 described in Table 1 is attached gene list. 該遺伝子リストにおける1番目からN番目(Nは1〜100)までの遺伝子を含む遺伝子セットの若年性特発性関節炎の判別率を以下の表4に示す。 N-th from the first in the gene list (N is 1 to 100) shows the discrimination rate of juvenile idiopathic arthritis gene set containing the gene to in Table 4 below.

表1に記載の遺伝子リストから選択される遺伝子を含む上記いずれの遺伝子セットを用いた場合も、0.9以上の判別率で若年性特発性関節炎を判別できることが示された。 Even when using any of the above-mentioned gene set comprising a gene selected from the gene lists according to Table 1, was shown to be capable of determining the juvenile idiopathic arthritis in 0.9 above discrimination rate.

本実施例で作成された全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するための高判別能遺伝子リストは、上記表2に記載した配列番号101〜200のいずれかで特定される遺伝子からなる配列番号の順に順位付けされた遺伝子リストである。 High ability to discriminate gene list to determine systemic onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis created in this embodiment, in any of SEQ ID NO: 101 to 200 set forth in Table 2 it is ranked genes listed in order of SEQ ID NO: consisting of the genes identified.

該遺伝子リストにおける1番目からN番目(Nは1〜100)までの遺伝子を含む遺伝子セットの全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎の判別率を表5に示す。 N-th from the first in the gene list (N is 1 to 100) shows a systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and discrimination rate articulated juvenile idiopathic arthritis gene set containing the gene to Table 5.

表2に記載の遺伝子リストから選択される遺伝子を含む上記いずれの遺伝子セットを用いた場合も、0.9以上の判別率で全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別できることが示された。 Even when using any of the above-mentioned gene set comprising a gene selected from the gene lists according to Table 2, it can determine systemic onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis in 0.9 or more determined rate It has been shown.

遺伝子セットの決定手法の概略を示す。 It shows a schematic of a method of determining gene set. 高判別能遺伝子の順位付け処理の概要を示す。 It shows an outline of ranking process high discrimination ability gene. 遺伝子セットの判別能力評価の概要を示す。 It shows an overview of the discrimination performance evaluation of the gene set. 遺伝子セット決定方法の概要を示す。 It shows an overview of gene sets determination method. 未知遺伝子サンプル判別法の概要を示す。 It shows the outline of an unknown gene sample discrimination method.

Claims (15)

  1. 被検者由来の試料中において、配列番号1〜 5で表される塩基配列で特定される遺伝子含む遺伝子セット遺伝子の発現を検出することを含配列番号1で表される塩基配列で特定される遺伝子の発現量が減少し、配列番号2〜4で表される塩基配列で特定される遺伝子の発現量が増加していることは、若年性特発性関節炎を示す、若年性特発性関節炎を検査するために遺伝子の発現を検出する方法。 In a sample of from a subject, see contains detecting the expression of genes of the gene set comprising a gene that is identified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 5 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in decreased expression level of the gene is identified, that the expression level of the gene identified by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2-4 is increasing, indicating a juvenile idiopathic arthritis, juvenile idiopathic method for detecting the expression of genes to examine the gender arthritis.
  2. 遺伝子セットが、 配列番号6〜20で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の方法。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 to 20 A method according to claim 1.
  3. 遺伝子セットが、 配列番号6〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の方法。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6-100, The method of claim 1.
  4. 被検者由来の試料中において、配列番号101〜 105で表される塩基配列で特定される遺伝子含む遺伝子セット遺伝子の発現を検出することを含配列番号101〜105で表される塩基配列で特定される遺伝子の発現量が減少していることは全身型若年性特発性関節炎を示す、全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するために遺伝子の発現を検出する方法。 In a sample of from a subject, see contains detecting the expression of genes of the gene set comprising a gene that is identified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101-105, SEQ ID NO: 101 to 105 the expression level of the gene identified by the nucleotide sequence is decreasing indicating systemic juvenile idiopathic arthritis, the gene to determine the systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis a method for detecting the expression.
  5. 遺伝子セットが、 配列番号106〜115で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項4に記載の方法。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 106 to 115 The method of claim 4.
  6. 遺伝子セットが、 配列番号106〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項4に記載の方法。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 106 to 200 The method of claim 4.
  7. 遺伝子の発現を検出することが、 Be used to detect expression of a gene,
    被検者由来の試料から全RNAを抽出する工程、および 該全RNAにおける該遺伝子の発現量を測定する工程を含む、 A step of extracting total RNA from a sample derived from a subject, and comprising the step of measuring the expression level of the gene in 該全 RNA,
    請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。 Any one method of claims 1-6.
  8. 配列番号1〜 5で表される塩基配列で特定される遺伝子含む遺伝子セット各遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長の連続したプライマー、または各遺伝子を検出するための20〜1500塩基長の連続したプローブを含若年性特発性関節炎を判別するためのキット。 20 for detecting a 15-30 bases long contiguous primer or each gene, for specifically amplifying each gene of a set of genes including the gene identified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1-5 1500 bases long contiguous probe including, a kit for determining the juvenile idiopathic arthritis.
  9. 遺伝子セットが、 配列番号6〜20で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項8に記載のキット。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 to 20 A kit according to claim 8.
  10. 遺伝子セットが、 配列番号6〜100で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項8に記載のキット。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6-100, kit of claim 8.
  11. 配列番号101〜 105で表される塩基配列で特定される遺伝子含む遺伝子セット各遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長の連続したプライマー、または各遺伝子を検出するための20〜1500塩基長の連続したプローブを含身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するためのキット。 20 for detecting a 15-30 bases long contiguous primer or each gene, for specifically amplifying each gene of a set of genes including the gene identified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101 to 105 1500 bases long contiguous including probes, kits for determining the total body juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis.
  12. 遺伝子セットが、 配列番号106〜115で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項11に記載のキット。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 106-115, kit of claim 11.
  13. 遺伝子セットが、 配列番号106〜200で表される塩基配列で特定される遺伝子から選択される少なくとも5の遺伝子をさらに含む、請求項11に記載のキット。 Gene set further comprises at least 5 of the genes selected from the genes identified in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 106-200, kit of claim 11.
  14. 配列番号1〜 5で表される塩基配列で特定される遺伝子含む、若年性特発性関節炎を検査するためのマーカー遺伝子セット。 Comprising a gene identified by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to 5 marker gene set for testing the juvenile idiopathic arthritis.
  15. 配列番号101〜 105で表される塩基配列で特定される遺伝子含む全身型若年性特発性関節炎と多関節型若年性特発性関節炎を判別するためのマーカー遺伝子セット。 Marker gene set for discriminating SEQ ID NO: 101 to contain a gene identified by the nucleotide sequence represented by 105, systemic-onset juvenile idiopathic arthritis and articulated juvenile idiopathic arthritis.
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