JP4866983B2 - 環境汚染物質の人体曝露評価方法 - Google Patents
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これらは皮膚・肺・胃腸管を経由して体内に吸収され、人体に発がん性や内分泌かく乱作用などを示すとされている。
DEP抽出物のサルモネラ菌YG1024株に対する直接変異原性の3割以上を1,3−DNP(1,3−ジニトロピレン),1,6−DNP(1,6−ジニトロピレン),1,8−DNP(1,8−ジニトロピレン),1−NP(1−ニトロピレン)の4種類が占めることが確認されているほか、IARCによる人発ガンリスクでは、1−NP,6−NC(6−ニトロクリセン)等をクラス2Bに指定している。
そのため1−NPは含有量の多いディーゼル排ガス曝露の指標物の一つとして使用されるようになってきた。
しかしながら、この方法では代謝能・障害による修復能の個人差、他の曝露源に含まれるNPAHsの影響等を考慮することができない。
これらの問題を解決するため血中1−NPヘモグロビン付加体の測定による生体試料をバイオマーカーとして用いる方法が報告された(非特許文献1)。
一方、NPAHsをラット等に経口投与し、その尿中よりNPAHsの代謝物を検出した報告(非特許文献2)があるが、ヒト尿中に存在するこれら代謝物濃度は極めて低いと推測され、これを検出した例はない。
OHNPsはニトロ還元酵素(Nitroreductase)及びN−アセチル化酵素(N-acetyltransferase)によりヒドロキシ−N−アセチル−1−アミノピレン(OHNAAPs:Hydroxy-N-acetyl-1-aminopyrenes)に代謝される。
また、1−ニトロピレンはニトロ還元酵素により1−アミノピレン(1−AP:1-Aminopyrene)さらにNアセチル化酵素によりN−アセチル−1−アミノピレン(1−NAAP:N-Acetyl-1-aminopyrene)に代謝される。
このことからこれらの代謝物の同定を検討した。
代謝物の同定にあたり、OHNAAPs及びOHNPsは3位、6位、8位のヒドロキシ体に着目した。
その結果を図1及び図2に示す。
先に合成した標準物質(Standard)と尿中(Urine)の代謝物のクロマトグラフの保持時間及びMRMモードEPIスペクトルのフラグメンテーションの一致からOHNAAPs及びOHNPsに対して非常に正確に同定できた。
図3にOHNAAPs,OHNPsの3位、6位、8位ヒドロキシ体の割合を示す。
尿中の代謝物が正確に同定できたことにより、被検体の重水素化体を内部標準物質として用いることで定量分析が可能になった。
人の尿(Urine)をサンプリングする。
HClおよびリン酸緩衝液を添加してpH5に調整する。
これにβ−グルクロニダーゼ/アリルスルファターゼ溶液(β-glucuronidase / aryl sulfatase)を加えて、37℃インキュベートする。
これによりグルクロン酸抱合体あるいは硫酸抱合体は加水分解し、脱抱合化される。
次に、ブルーレーヨン(Blue rayon)を入れて室温、約1時間インキュベートする。
これによりブルーレーヨンに分析対象物が吸着する。
ブルーレーヨンを取り出し、水にて洗浄後にメタノール/アンモニア(methanol / ammonia)50:1混合溶媒に対象物を溶出し、この溶出液を乾固する。
この乾固して得られた固形分をメタノール/酢酸エチル(methanol / ethyl acetate)1:1混合溶媒に再溶解し、この溶液を酸性アルミナ固相抽出カートリッジに通液して夾雑物を除去してから乾固する。
この固形分を再溶解と乾固を繰り返すことで最終的には所定容量のメタノール溶液にする。
これから5μLをサンプリングし、LC−MS/MS分析装置(アプライドバイオシステムズ社製、4000 Q TRAP LC-MS/MSシステム)にかけた結果が図1及び図2に示すチャートである。
これにより1−ニトロピレン代謝物の定量が正確であることを確認した。
これにより、大気中及びディーゼル排ガス中の1−ニトロピレン曝露を評価できるバイオマーカーであることを確認した。
Claims (1)
- 環境汚染物質の1つであるニトロ多環芳香族炭化水素類(NPAHs:Nitropolycyclic aromatic hydrocarbons)が体内に取り込まれた生体指標として、LC−MS/MS(Liquid Chromatography - Mass Spectrometry / Mass Spectrometry)分析法を用いて尿中の1−ニトロピレン(1-Nitropyrene)の代謝物濃度を測定する環境汚染物質の人体曝露評価方法であって、サンプリングした尿を酵素を用いて脱抱合化処理するステップと、当該脱抱合化処理した試料中にブルーレーヨンを入れることで当該ブルーレーヨンに分析対象化合物を吸着及びその後に溶出するステップと、酸性アルミナ固相カートリッジを用いて夾雑物を除去するステップを経た後に、LC−MS/MS分析法を用いて尿中の1−ニトロピレン代謝物としてヒドロキシ−1−ニトロピレン又はヒドロキシ−N−アセチル−1−アミノピレンの濃度を測定することを特徴とする環境汚染物質の人体曝露評価方法。
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