JP4857882B2 - Stirring method in the sample solution - Google Patents

Stirring method in the sample solution

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JP4857882B2
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真紀子 市川
有樹 瀧井
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東レ株式会社
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Description

本発明は、選択結合性物質固定化担体と被検物質が含まれる溶液とを反応させる際に該溶液を撹拌する方法に関し、詳しくは、検体と選択的に結合する物質(本明細書において「選択結合性物質」という。)が固定化され、検体と選択結合性物質の反応による分析を行う際の検体溶液の撹拌方法に関する。 The present invention relates to a method of stirring the solution at the time of the reaction between the solution containing the selective binding substance-immobilized carrier and a test substance, particularly, the analyte selectively binding to substances (herein " selective binding substance "hereinafter.) is immobilized to a stirred method in the sample solution when performing analysis by the reaction of the analyte with the selective binding substance.

各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。 Research has been the beginning of the genetic information analysis of various organisms. ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。 Starting with the human gene, is being a number of genes and their nucleotide sequence, also proteins and information quickly revealed regarding sugar chains made from these proteins secondarily encoded by the gene sequence. 配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。 Clearly the gene sequences, proteins, functional polymer material such as sugar, can be examined by various methods. 主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのように、各種の核酸/核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。 The main thing, nucleic acid, as northern blotting or Southern blotting, the method utilizing the complementarity between the various nucleic acid / nucleic acid, it is possible to examine the relationship between the various genes and their biological functional expression. 一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質/蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。 On the other hand, protein, utilizing the reaction between proteins / protein represented by western blotting can be tested for functionality and expression of the protein.

近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、DNAマイクロアレイ法(DNAチップ法)と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。 Recently, as a technique for analyzing a time a number of gene expression, new analysis method called DNA microarray method (DNA chip method) has been developed and has received attention. これらの方法は、いずれも、核酸/核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。 These methods are both in principle in that a nucleic acid detection and quantification methods based on nucleic acid / nucleic acid hybridizations reactions are the same as the conventional method. これらの方法は、蛋白質/蛋白質間あるいは糖鎖/糖鎖間や糖鎖/蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。 These methods can be protein / protein-protein or sugar / sugar chains or between sugar / protein based on the specific reaction between proteins and sugar chains detection and quantification applications are. これらの技術は、マイクロアレイ又はDNAチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のDNA断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。 These techniques, on a piece flat substrate of glass, called a microarray or DNA chip, a large number of DNA fragments and proteins, there is a great feature that sugar chains are used those aligned immobilized at high density. DNAチップの具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸(DNAあるいはRNA)同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置(スキャナー)で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。 Specific use of DNA chips, for example, a sample of expressed genes like labeled with a fluorescent dye or the like under study cells were hybridized with piece flat substrate, to bind the complementary nucleic acid (DNA or RNA) to each other to each other , and how to read at high speed and the position at a high resolution detector (scanner), a method of detecting the like responding current value or the like based on an electrochemical reaction. このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。 Thus to the respective gene dosage in the sample can be quickly estimated. また、DNAチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換(SNP)を検出する手段としても大きく期待されている。 Also, applications of DNA chips, not gene expression analysis to estimate the amount of expressed gene only, are largely expected as means for detecting single base substitution (SNP) genes.

DNAチップによる検出の際は、調製したDNAを含む溶液(DNA溶液)を、DNAチップ上の選択結合性物質と反応させることが必要であるが、このような反応をビーズを用いて促進させる方法も開発されている(例えば、特許文献1、特許文献2など)。 Method upon detection by DNA chip, a solution containing the prepared DNA with (DNA solution), it is necessary to react with the selective binding substance on the DNA chip, to such reactions promoted with beads It has also been developed (e.g., Patent Document 1, Patent Document 2). しかしながら、いずれの方法もビーズが沈殿や偏りを起こしやすく、また、ビーズがDNAを破損する危険がある、などといった問題点があり、反応を十分に促進させるものではなかった。 However, both methods prone to bead precipitation or bias, also, there is a risk that the beads will damage the DNA, there are problems such as, did not sufficiently promote the reaction.

特許第3557419号公報 Patent No. 3557419 Publication 特開2003−248008号公報 JP 2003-248008 JP

本発明は、前記課題を解決するもので、選択結合性物質を密接してスポットした担体を用いた場合にも、被験物質を選択結合性物質に効率よく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うための手段を提供することを目的とする。 The present invention is intended to solve the above problems, even when using the spotted carrier closely the selective binding substance can be contacted efficiently test substance selective binding substance, and the test substance and to provide a means for performing simply and stably the selective reaction of the immobilized selective binding substance.

上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を重ねた。 To solve the above problems, the present inventors have conducted extensive study. その過程で、特開2004−264289号公報に記載されている、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部に固定化される基板において、凹部に微粒子を移動可能に格納させ、これを揺動、鉛直面内で回転等させ、選択結合性物質が固定化された面に微粒子が接触することなく、重力により微粒子などを移動させることにより被検物質を含む溶液を撹拌させ、固定化された選択結合性物質との選択的な反応を促進できることに着目した(国際公開第2005/090997号パンフレット)。 In the process, are described in JP 2004-264289, the substrate selective binding substance is immobilized to a plurality of convex portions of the concavo-convex portion, the concave portion particulate movably to store in, this rocking dynamic, rotated, etc. in a vertical plane, without selective binding substance is fine particles is brought into contact with the immobilized surface, allowed to stir a solution containing a test substance by moving the like particles by gravity, it is immobilized It was focused on being able to promote selective reaction with the selective binding substance (WO 2005/090997 pamphlet).

しかし、上記特開2004−264289号公報の基板において、凸部を等間隔に形成すると、凸部を密接して多数形成させる場合には、凹部のスペースを十分に取ることができず、その結果、非常に小さな微粒子しか用いることができず、撹拌を十分に行うことができなかった。 However, the substrate of JP-A-2004-264289, by forming the protrusions at regular intervals, in the case of a large number closely protrusions can not take up space in the recess well, as a result , can not be used only very small particles, it could not be carried out stirring sufficiently.

そこで、本発明者らは、反応を促進することのできる撹拌方法を検討した結果、担体を公転運動させると、凸部を多数形成した担体に、小さなビーズを組み合わせて用いた場合でも、問題なく撹拌効率の向上を図り安定した反応が実現できることを見出し、本発明に到達した。 Accordingly, the present inventors have made study agitation method capable of promoting the reaction, the revolving movement of the carrier, the number formed by the carrier projections, even when used in combination small beads, no problem It found that stirring was stabilized aims to improve the efficiency reaction can be realized, thereby achieving the present invention.

本発明によれば、下記のものが提供される: According to the present invention, there is provided the following:
〔1〕 担体上に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部を構成する複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化されている担体に接触させた被検物質を含む溶液を撹拌するにあたり、前記被検物質を含む溶液に撹拌子を添加し、かつ、前記担体を略水平方向に公転させ前記撹拌子を移動させて溶液を撹拌することを特徴とする、溶液の撹拌方法。 [1] has an uneven portion formed of concave and convex portions on the carrier, the test substance in which a plurality of selective binding substance on the upper surface of the convex portion is brought into contact with a carrier which is immobilized constituting the uneven portion Upon the solution is stirred for containing said added stirrer in a solution containing a test substance, and is characterized in that the solution is stirred by moving the stir bar generally to revolve in a horizontal direction said carrier, solution the method of stirring.
〔2〕 前記撹拌子が、微粒子またはマイクロロッドであることを特徴とする上記〔1〕記載の溶液の撹拌方法。 [2] The stirrer is solution stirred method described in [1], which is a particulate or micro rod.
〔3〕 前記公転の回転数が、100rpmから500rpmである上記〔1〕または〔2〕に記載の溶液の撹拌方法。 [3] the rotational speed of the revolution is stirred method solution according to [1] or [2] is 500rpm from 100 rpm.
〔4〕 担体上の凹凸部が、凸部がマトリクス状に形成された複数のサブブロック領域からなることを特徴とする上記〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 [4] uneven portion on the support, stirring protrusions is a solution according to any one of [1] to [3] above, characterized in that it consists of a plurality of sub-block regions formed in a matrix Method.
〔5〕 前記凹凸部において、隣接するサブブロック領域間の凹部の幅が、サブブロック領域内の凹部の幅よりも広いことを特徴とする上記〔4〕に記載の溶液の撹拌方法。 [5] In the uneven portion, the width of the recesses between the sub-block areas adjacent, stirred method solution according to [4], wherein the wider than the width of the recess of the sub-block area.
〔6〕 サブブロック領域間の凹部の幅が、200μm以上であることを特徴とする上記〔4〕または〔5〕に記載の溶液の撹拌方法。 [6] the width of the recesses between the sub-block regions are stirred method solution according to the above [4] or [5], wherein the at 200μm or more.
〔7〕 前記凹凸部において、複数の凹部の深さを有することを特徴とする上記〔4〕〜〔6〕のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 [7] In the uneven portion, the solution stirred method according to any one of the above [4] to [6] above, wherein a depth of the plurality of recesses.
〔8〕 前記凹凸部において、隣接するサブブロック領域間の凹部の深さが、サブブロック領域内の凹部の深さよりもよりも深いことを特徴とする上記〔4〕〜〔7〕のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 [8] In the uneven portion, the depth of the recesses between adjacent sub block region, any of the above, wherein the deeper than than the depth of the recess of the sub-block area [4] to [7] stirring method of the solution according to an item.
〔9〕 サブブロック領域間の凹部の深さが、凸部上面から凹部底面までの深さで100μm以上であることを特徴とする上記〔4〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 [9] the depth of the recesses between the sub-block regions, a convex upper surface according to any one of the above [4] to [8], wherein the at 100μm or more in depth to the bottom surface of the recess stirring method of solution.
〔10〕 前記選択結合性物質固定化担体の凹凸部を有する表面に、平坦部が設けられてなることを特徴とする上記〔4〕〜〔9〕のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 [10] on the surface having an uneven portion of the selective binding substance-immobilized carrier, agitation of the solution according to any one of the above [4] to [9] above, characterized in that a flat portion is provided Method.
〔11〕 前記担体を略水平方向に公転させる前に、カバー部材を前記担体の凹凸部を含む表面を覆いかつ前記担体と前記カバー部材との間に空隙を有するように接着することを特徴とする上記〔1〕〜〔10〕のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 [11] prior to revolve the support substantially in the horizontal direction, and characterized in that the adhesive so as to have an air gap between the cover member covers the surface including an uneven portion of the carrier and said carrier and said cover member stirring method of the solution according to any one of [1] to [10] above.
〔12〕 上記〔1〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の撹拌方法を利用して、前記担体に被検物質を選択的に結合させ、前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする被検物質の分析方法。 [12] using the stirring method according to any one of [1] to [11], wherein the carrier selectively to bind the test substance, via the selective binding substance on the carrier method for analyzing a test substance, characterized by measuring said analyte amount bound Te.

本発明によれば、核酸等のハイブリダイゼーションに代表される、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応において、選択結合性物質を密接してスポットした場合にも、被験物質を選択結合性物質固定化担体上の選択結合性物質と効率よく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる。 According to the present invention, typified by hybridization of nucleic acids such as, in selective reaction with selective binding substance immobilized to the test substance, even when the spot closely the selective binding substance, test substance can be contacted good selective binding substance and efficiency on selective binding substance-immobilized carrier, and easily and stably selective reaction with the selective binding substance immobilized to the test substance It can be carried out.

本発明の撹拌方法は、担体上に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部を構成する複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化された担体と被検物質が含まれる溶液(検体溶液)を撹拌するにあたり、前記被検物質を含む溶液に撹拌子を添加し、かつ、前記担体を略水平方向に公転させ、添加した撹拌子を溶液中を移動させる。 Stirring method of the present invention has an uneven portion formed of concave and convex portions on the support, the upper surface to the selective binding substance of a plurality of convex portions constituting the uneven portion is immobilized carrier and the test substance Upon stirring the solution (sample solution) contained the added stirrer in a solution containing a test substance, and said carrier substantially to revolve horizontally moves the solution was added a stir bar. すなわち、担体と検体溶液とを接触させ、その溶液に微粒子(ビーズ)、マイクロロッドに代表される撹拌子を添加し、担体を略水平方向に公転させ、添加した撹拌子を公転の加速度、遠心力等により撹拌子を移動することが必要である。 That is, contacting the support with the sample solution, fine particles (beads) to the solution was added stirrer typified by micro-rod, a carrier substantially to revolve horizontally, revolving was added stirrer acceleration, centrifugal it is necessary to move the stirrer by such force. このように担体を特定の方向に回転させることにより、これ以外の方法、例えば、担体を往復運動させたり、8の字運動をさせ撹拌子を移動する、重力により撹拌子を落下させる、振動により撹拌子を動かす等の方法にて溶液を撹拌する場合に比べ、非常に効率よく溶液の撹拌が達成でき、より精密な分析を行うことができる。 By thus rotating the support in a particular direction, other methods, for example, or is reciprocated carrier, to move the stir bar is a shaped movement of 8, dropping the stirring bar by gravity, by the vibration compared with the case where the solution is stirred for by a method such as moving a stirrer, very efficiently solution stirred can be achieved, it is possible to perform a more precise analysis. この理由は、1)往復運動・8の字運動・振動を担体に与えた場合は、撹拌子がほぼ一定の場所で往復運動するのみであり、溶液の撹拌が不十分である。 This is because, 1) if the character movement and vibration of the reciprocating-8 gave carrier, stirring bar is only reciprocates substantially fixed places, agitation of the solution is insufficient. 2)重力により撹拌子を移動させても、担体に対する相対的な加速度の向きを素早く切り替えることができない上、十分な速度で撹拌子が移動させることができず、溶液の撹拌が不十分であるためである。 2) be moved stirrer by gravity, since it is impossible to quickly switch the relative acceleration orientation relative to the carrier, it is impossible to move stirrer at a sufficient rate, agitation of the solution is insufficient This is because. これに対し、本発明のように担体を公転させると、撹拌子がそれ同士や担体の凸部と衝突し、複雑な運動を行なうので、十分な溶液の撹拌が達成される。 In contrast, when the revolving carrier as in the present invention, since the stirrer collide with the convex portion of it between or carrier, performing complex movements, agitation sufficient solution is achieved.

また、振動や往復運動、8の字運動、振動を担体に与えた場合は、担体を設置した水平面のわずかな傾きにより、時間と共に撹拌子が担体の反応領域の片側に寄ってしまい反応ムラの原因となる。 Further, vibration or reciprocation, figure eight motion, if the vibration given to the carrier, a slight inclination of the horizontal plane set up carrier, the reaction unevenness causes by the stirrer with time on one side of the reaction region of the carrier cause. しかし、本発明のように担体を公転させその加速度や遠心力により撹拌子を移動させた場合、多少の傾きでも撹拌子が一方に寄ってしまうことがなく、反応ムラを低減できる。 However, if the carrier moving the stirring bar by the acceleration or centrifugal forces to revolve as in the present invention, without thereby closer to one of stirrer at some inclination, it is possible to reduce the reaction uneven. また本発明のように担体を公転させた場合に撹拌子が片方に偏らない理由も、撹拌子がそれ同士や担体の凸部と衝突し、複雑な運動を行うためである。 The reason why the stirrer when obtained by revolving the support is not biased to one as in the present invention also, stirrer collide with the convex portion of it together and support, in order to perform complex motions.

本発明の撹拌方法では、凹凸部を有する担体に接触させた被検物質を含む溶液を、略水平方向に公転させる。 The stirring method of the present invention, the solution containing the test substance in contact with the carrier having the uneven portion, revolving in a substantially horizontal direction. 略水平方向とは、担体の凹凸部の存在する表面に向かって水平か或いは水平に近い方向を意味する。 The substantially horizontal direction, means horizontal or direction close to horizontal toward the surface in the presence of irregularities of the carrier. 水平に近い方向とは、担体を回転させた場合に撹拌子が担体の片側に寄らない程度の傾きを持たせた方向を意味し、例えば、水平面を基準として0度から3度の間が好ましい。 The near horizontal direction means the direction in which child stirring when rotating the carrier is to have a tilt to the extent that does not depend on one side of the carrier, for example, it is preferably between 3 ° from 0 ° horizontal plane .

公転とは、担体が任意の回転軸を基準としてその周囲を回転することを意味する。 Revolution is meant that the carrier is rotated around a reference to an arbitrary axis of rotation. 本発明においては、任意の回転軸の周囲を担体上の凹凸部が円軌道を描くように回転することが好ましい。 In the present invention, it is preferable to rotate around any axis of rotation as the concave-convex portion on the carrier draws a circular orbit. 担体自体は回転してもしなくてもよいが、回転しない方が、装置が簡便であり、撹拌子に大きな加速度や遠心力がかかることから撹拌効率が向上するので好ましい。 Carrier itself may or may not be rotated, but who does not rotate, the device is simple, preferably improved the stirring efficiency from a large the acceleration and centrifugal force is applied to the stirrer. 公転の回転方向は特に限定されず、連続して一方向に連続して公転するのであっても良いし、1回又は2回以上の等周期或いはランダムな周期で正方向と逆方向に切り替えるようなパターンで公転とすることも可能である。 Rotation direction of revolution is not particularly limited, and may be for revolving continuously in one direction continuously, once or twice or more at equal periodic or random periodic to switch to forward and backward directions it is also possible to revolve a pattern.

担体を公転させる際の回転数としては、100rpmから500rpmが好ましい。 The rotational speed at the time of revolving the carrier, preferably 500rpm from 100 rpm. 100rpm未満であると十分な攪拌が行われない場合があるし、500rpmを超えると、後述する担体に貼り付けてあるカバーが遠心力によって剥がれてしまうなどの問題がある。 It is sometimes sufficient agitation is less than 100rpm not performed, when it exceeds 500 rpm, there is a problem such as a cover that is affixed to a carrier to be described later peels by centrifugal force. 特に好ましくは、200rpmから300rpmである。 Particularly preferred are 300rpm from 200 rpm. また、公転の回転数は撹拌処理時間を通じて一定であっても良いし、周期的またはランダムに変化させても良い。 The rotational speed of the revolution may be the constant throughout stirred processing time may be changed periodically or randomly. 公転の際担体の凹凸部が描く円軌道の半径としては、担体の凹凸部の中心部が描く円軌道として、半径2cmから5cmであることが好ましい。 The radius of the circular path uneven portion of the carrier when the revolution drawn as circular orbit drawn by the center of the concave-convex portion of the support is preferably 5cm from radius 2 cm. 半径が2cm未満であると、十分な撹拌が行われない場合があるし、5cmを超えると、担体に必要に応じて貼り付けてあることのできるカバーが遠心力によって剥がれてしまう場合がある。 The radius is less than 2 cm, to sometimes sufficient stirring is not performed, when it exceeds 5 cm, there is a case where a cover that can are adhered as needed to the carrier peels off by centrifugal force. 尚、この円軌道は正円に限定されず、多少ゆがみが含まれていてもよく、例えば楕円であっても良い。 Note that this circular path is not limited to the round, it may be contained some distortion may be for example elliptical.

公転時間は、選択結合性物質に被検物質が相互作用するために十分な範囲で適宜決定することができる。 Revolution time can test substance selective binding substance is appropriately determined in a range sufficient to interact. ハイブリダイゼーションの間を通じて連続して公転させていても良いし、その一部の時間のみ回転させたり、断続的に回転させたりしても良い。 It may be continuous to revolve through during hybridization, or rotate only a part of the time may be or is intermittently rotated. 公転させる時間の好ましい範囲は、特には限定されないが、延べ4時間以上回転させることが好ましく、ハイブリダイゼーションの間を通じて連続して公転させておくことが最も好ましい。 A preferred range of time for revolution is particularly not limited, it is preferable to rotate total 4 hours or more, and most preferably allowed to revolve continuously throughout the hybridization. なお、公転による遠心力の好ましい範囲としては、0.3〜50m/s 2であり、特に好ましくは、10〜30m/s 2である。 As the preferable range of the centrifugal force due to revolution, a 0.3~50m / s 2, particularly preferably 10 to 30 m / s 2.

本発明における被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 The analyte in the present invention, the nucleic acid to be determined, for example, genes such as pathogenic bacteria and viruses, causative genes like as well as a portion of the genetic disease, various biological components having antigenic and antibody against pathogenic bacteria and viruses, etc. it can be exemplified, but not limited thereto. また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。 As the specimen containing these analytes, blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, and body fluids of various tissue fluid or the like, various food and may be mentioned those dilutions such but it is not limited thereto. また、検体となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、PCR等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。 Further, nucleic acid as a specimen may be labeled nucleic acid extracted by a conventional method from blood or cells, the nucleic acid as a template, or may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR. 後者の場合には、本発明の撹拌方法を行った後の測定感度を大幅に向上させることが可能である。 In the latter case, it is possible to greatly improve the measurement sensitivity after the stirring process of the present invention. 核酸増幅産物を検体とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。 When the nucleic acid amplification product with the analyte, by performing amplification in the presence of labeled nucleoside triphosphate with a fluorescent substance or the like, it is possible to label the amplified nucleic acid. また、検体が抗原又は抗体の場合には、検体である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、検体である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。 Also, when the analyte is an antigen or antibody may be directly labeled by a conventional method the antigen and antibody is the analyte, after binding the antigen or antibody selective binding substance is a sample, washing the carrier and, reacting the labeled antibody or antigen react the antigen or antibody and antigen-antibody, can also measure the label bound to the support.

本発明の撹拌方法においては、上述のような標識、増幅等を施した検体を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させて被検物質を含む溶液(検体溶液)とする。 In the stirring method of the present invention, labeled as described above, the sample subjected to amplification and the like is dissolved in an aqueous solution or an appropriate buffer solution and the solution (sample solution) containing the test substance.

上記被検物質を含む溶液の担体への接触(アプライ)は、ピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。 Contact to a solution of the carrier containing the test substance (applied) can be performed by injecting a normal instrument such as a pipette.

本発明においては、上述の被検物質を含む溶液に撹拌子を添加する。 In the present invention, the addition of stirrer in a solution containing the test substance described above. 撹拌子としては、微粒子(ビーズ)、マイクロロッド等が挙げられ、特に微粒子が好ましい。 The stirring bar, microparticles (beads), micro rod, and the like, particularly fine particles are preferable. 微粒子やマイクロロッドの形状は、特に限定されず、微粒子の場合、球状の形状以外に、多角形でも良く、マイクロロッドの場合、円筒形、角柱形など任意の形状とすることができるが、球状のものが最も好ましい。 The shape of particles or micro rod is not particularly limited, if the fine particles, in addition to a spherical shape may be polygonal, for micro rod, cylindrical, but can be any shape such as prismatic, spherical is the most preferred ones. また、微粒子のサイズも特に限定されないが、例えば球状の微粒子の場合、0.1〜300μmの範囲とすることができ、撹拌効率を鑑みると、より好ましくは、50μmから200μmの範囲が特に好ましい。 Although not particularly limited also the size of the fine particles, for example, in the case of spherical particles, it can be in the range of 0.1 to 300, in view of the stirring efficiency, and more preferably, is particularly preferred range of from 50μm to 200 [mu] m. 更に、マイクロロッドの場合、長さ50〜5000μm、底面直径10〜300μmの範囲とすることができる。 Furthermore, in the case of micro rod can be the length 50~5000Myuemu, the range of base diameter 10 to 300 [mu] m. 微粒子やマイクロロッドは、撹拌効率などの面から、1種類を選択して用いることもできる他、2種類以上を組み合わせて用いることができる。 Fine particles or micro-rod, from the standpoint of stirring efficiency, addition can be used to select one type may be used in combination of two or more.

前記微粒子やマイクロロッドの材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック(例えばイットリウム部分安定化ジルコニア)、金属(例えば金、白金、ステンレス)、プラスチック(例えばナイロンやポリスチレン)等を用いることができる。 Also, a material of the fine particles and micro rods, but are not limited to, glass, ceramics (e.g., yttrium partially-stabilized zirconia), metal (such as gold, platinum, stainless steel), plastic (e.g., nylon, polystyrene) and the like. 特に微粒子の材質としては、撹拌効率の点から比重が重いことが好ましく、具体的には3g/cm 3以上が好ましい。 Particularly the material of the fine particles, the point is preferably specific gravity from the stirring efficiency, specifically 3 g / cm 3 or more. この比重よりも大きく、容易に入手可能であると言うことから、ジルコニア系の微粒子を好ましく用いることができる。 Since it says the greater than the specific gravity, it is readily available, can be preferably used fine particles of zirconia. マイクロロッドの材料としては、特に限定されるものではないが、加工の容易さの点から、金属(例えば、ステンレス、白金、金)が好ましく用いられる。 As the material of the micro-rod, but are not particularly limited, in terms of ease of processing, metal (e.g., stainless steel, platinum, gold) is preferably used. 微粒子やマイクロロッドは、撹拌効率などの面から、1種類を選択して用いることもできる他、2種類以上を組み合わせて用いることができる。 Fine particles or micro-rod, from the standpoint of stirring efficiency, addition can be used to select one type may be used in combination of two or more.

上述の微粒子等を被検物質を含む溶液に添加する時期は、担体を公転させる前であればよい。 The time of adding the above-mentioned fine particles to the solution containing the test substance may be any prior revolving carrier. 例えば、担体に予め格納した態様とすることができる他、被検物質が含まれる溶液に微粒子を混入させて該溶液のアプライと同時に微粒子を格納してもよく、または被検物質が含まれる溶液のアプライの前又は後に、微粒子を別途格納してもよい。 For example, in addition to be a mode that is previously stored in the carrier, a solution containing the well or test substance, be stored at the same time particles and apply the solution by mixing fine particles in a solution containing the test substance before or after applied to the microparticles may be separately stored.

撹拌子の溶液への添加量は、溶液を撹拌することにより、溶液中の被検物質が選択結合性物質と十分に相互作用する程度の量とすれば良い。 The addition amount of the solution of the stirrer, by stirring the solution may be an amount enough to sufficiently interact substance to be tested and selective binding substance in the solution. 具体的には、1mgから300mgの範囲が好ましく、特に好ましくは、20mgから300mgの範囲である。 Specifically, the range of 300mg is preferably from 1 mg, particularly preferably in the range from 20mg to 300mg.

本発明の撹拌方法で用いられる選択結合性物質固定化担体は、その上に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部を構成する複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化される担体である。 Selective binding substance-immobilized carrier used in the stirring method of the present invention has an uneven portion formed of concave and convex portions thereon, the upper surface to the selective binding substance of a plurality of convex portions constituting the uneven portion is the carrier of immobilized.

本発明が対象とする選択結合性物質固定化担体は、その表面に、凹部及び凸部からなる凹凸部を有することが必要である。 Selective binding substance-immobilized carrier to which the present invention is directed, on its surface, it is necessary to have an uneven portion formed of concave and convex portions. このような構造をとる担体を被検物質の分析に用いることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりS/Nが良好な結果を得ることができる。 By using a carrier having such a structure analysis of the test substance, in detection, since there is no possible to detect the test substance nonspecifically adsorbed, noise is small, resulting in more S / N ratio it is possible to obtain good results. ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。 Specific reason that noise is reduced is as follows. すなわち、凸部上端面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上端面にレーザー光の焦点が合っていることから、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光(ノイズ)を検出しがたいという効果があるためである。 That is, when the scanning with the immobilized carrier selective binding substance to the convex top end surface apparatus called a scanner, since in focus of the laser beam to the convex top end surface of the concave-convex portion, the concave portion, a laser blurred light, because there is an effect that difficult to detect fluorescence (noise) undesired non-specific adsorbed analytes in the recess.

凹凸部を有する担体の具体例を図1及び図2に例示する。 Specific examples of the carrier having a concavo-convex portion illustrated in FIGS. 図1は、凹凸部を有する担体の一例を模式的に示す斜視図であり、図2は、図1の担体の矢印A1に沿った面で切断した横断面図である。 Figure 1 is a perspective view schematically showing an example of a carrier having a concavo-convex portion, FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the plane along the arrow A1 of the carrier of Figure 1. 図1及び図2に示す例においては担体表面に複数の凸部11及び凹部10を含む凹凸部12が形成され、その周りに平坦部13が設けられている。 In the example shown in FIG. 1 and FIG. 2 is uneven portion 12 including a plurality of protrusions 11 and recesses 10 on the support surface is formed, the flat portion 13 is provided therearound. 凸部11の上面には、選択結合性物質(例えば核酸)が固定化されている。 On the upper surface of the convex portion 11, the selective binding substance (e.g., nucleic acid) is immobilized. この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。 With this flat portion, it becomes possible to easily focus the beam of light for the measurement, such as excitation light scanner on the upper surface of the convex portion.

上記凹凸部において、凸部は、マトリクス状に、すなわち、行方向及び列方向に配置されることが好ましい。 In the uneven portion, the convex portion is in the form of a matrix, i.e. are preferably arranged in rows and columns. 凸部がマトリクス状に配置されることにより、凸部の間隙を構成する凹部がXY方向に通路状に形成されることとなる。 The convex portions are arranged in a matrix form, so that the recess constitutes the gap of the protrusions is formed in the passage shape in the XY direction. このような構成により、凹部に微粒子やマイクロロッドを格納した場合に、微粒子やマイクロロッドを移動可能な状態でかつ選択的結合性物質に接触させずに保持することができる。 With this configuration, it is possible to hold without contact when storing the fine particles or micro-rod in the recess, the fine particles or micro-rod in a state and selective binding substance movable. 例えば、図3に示す具体例で説明すると、凸部11の列に挟まれた部分、或いは凹凸部12と後述の平坦部13との境界部分に凹部の列が形成され、凹部の列に格納された微粒子やマイクロロッドが前後左右方向に移動可能となる。 For example, when explained in a specific example shown in FIG. 3, portions sandwiched between the rows of projections 11, or a row of recesses in the boundary portion between the concave-convex portion 12 and the flat portion 13 to be described later are formed, stored in the column of the recess particulate or micro-rod is movable in the longitudinal and lateral directions. なお、凸部の形状は、担体表面に凹凸部が形成される程度であれば良いが、特に円柱、角柱等の柱状であることが好ましく、特に円柱状であることが好ましい。 The shape of the convex portion may be an extent that the uneven portion on the surface of the carrier is formed, but in particular cylindrical, is preferably a columnar prism like, and more preferably form cylindrical.

本発明において、このような凹凸部は、上述のようにマトリクス状に形成された凸部が、複数のサブブロック領域からなることが好ましい。 In the present invention, such uneven portions, convex portions formed in a matrix as described above it is preferably formed of a plurality of sub-block regions. すなわち、凹凸部においては、マトリックス状に形成されてなる凸部がエリア別に分割され、それぞれがサブブロック領域を構成していることが好ましい。 That is, in the uneven portion, a convex portion formed by formed in a matrix is ​​divided by the area, it is preferable that each constitute a sub-block regions.
例えば、図3の例では、複数の凸部11と、凹部10間の凹部からなる凹凸部12が複数のサブブロック領域S1、S2、S3・・・ ・・・S32に分割されており、各サブブロック領域内において凸部11はマトリックス状にXY方向に形成されている。 For example, in the example of FIG. 3, a plurality of projections 11, concavo-convex portion 12 made concave between the recess 10 is divided into a plurality of sub-block regions S1, S2, S3 ··· ··· S32, each protrusions 11 are formed in the XY direction in a matrix in the sub-block area. サブブロック領域のサイズは、凹凸部に設ける凸部の数、微粒子、マイクロロッドのサイズ等に応じて定めることができる。 The size of the sub-block region, the number of convex portions provided on the uneven portion, microparticles can be determined according to the size, etc. of the micro-rods. サブブロックの領域のサイズとしては、そのピッチが384マイクロタイタープレートのウェルの間隔に相当する4.5mmを好ましく用いることができるが、これに制限されるものではない。 The size of the area of ​​the sub-blocks, may be preferably used 4.5mm for the pitch corresponds to the spacing of 384 microtiter plate wells, but is not limited thereto.

凹凸部における凹部の幅は、担体上に設ける凸部の数、および、凸部の大きさによってほぼ決まるが、通常10〜800μm、好ましくは、50〜200μmとすることができる。 Width of the recess in the concave-convex portion, the number of convex portions provided on the support, and, although substantially determined by the size of the convex portion, typically 10 to 800 m, preferably, may be 50 to 200 [mu] m. また、凸部を円柱状とする場合には、隣接する凸部の中心軸間の距離で50〜1000μm、好ましくは、100〜500μmの範囲で適宜定めることができる。 Further, in the case of the convex portion and the cylindrical can 50 to 1000 [mu] m in distance between the central axes of the adjacent convex portion, preferably, may be appropriately determined in the range of 100 to 500 [mu] m. 特に、サブブロック領域内外で凹部の幅を変更することが好ましく、中でも、隣接するサブブロック領域間の凹部の幅が、サブブロック領域内の凹部の幅よりも広くなるようにすると、微粒子の大きさやマイクロロッドの直径が制限されず、効率の良い撹拌が可能となるので好ましい。 In particular, it is preferable to change the width of the recess in the sub-block area out, inter alia, when the width of the recesses between adjacent sub block area is set to be wider than the width of the recess of the sub-block area, the particle size not limited diameter of the sheath micro rod, since efficient stirring can be achieved preferably. 例えば、微粒子やマイクロロッドを移動させて溶液を撹拌する場合については、撹拌効率は、微粒子・マイクロロッドの直径が100μm以上の場合が好ましい。 For example, the case where the solution is stirred by moving the fine particles or micro-rod, stirring efficiency, the diameter of the fine particles micro rods preferably not less than 100 [mu] m. よって、サブブロック領域間の凹部の幅は、100μmの微粒子・マイクロロッドが詰まらない程度の幅を持つことが好ましく、具体的にはその幅を、200μm以上、好ましくは200〜800μm、特に250μm〜600μmとすることが好ましい。 Therefore, the width of the recesses between the sub-block area is preferably having a width as not to clog is 100μm particles micro rods, specifically its width, 200 [mu] m or more, preferably 200~800Myuemu, especially 250μm~ it is preferable that the 600μm. 一方、サブブロック領域内の凹部の幅は、基板上に設ける凸部の数によって決まるが、50〜400μm、好ましくは50〜180μmとすることができる。 On the other hand, the width of the recess of the sub-block area is determined by the number of convex portions provided on the substrate, 50 to 400 [mu] m, preferably, to 50~180Myuemu.

一方、凹凸部における凹部の深さ、すなわち、凸部の上面から凹部の底面までの距離(高さの差)は、微粒子、マイクロロッドが円滑に移動可能な状態となるサイズを適宜設定することができるが、通常は、10μm以上、500μm以下が好ましく、50μm以上、300μm以下が特に好ましい。 On the other hand, the depth of the recess of the concavo-convex part, namely, (difference in height) distance from the upper surface of the convex portion to the bottom surface of the recess, the microparticles, by appropriately setting the size of micro-rod is smoothly movable in Although it is normally, 10 [mu] m or more, preferably 500μm or less, 50 [mu] m or more, particularly preferably 300μm or less. 凸部の高さが10μmより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にS/Nが悪くなることがあるため好ましくない。 If the height of the protrusions is lower than 10 [mu] m, it may result in detecting an analyte sample nonspecifically adsorbed in the portion other than the spot, resulting in undesirable because it may S / N is deteriorated. また、凸部の高さが500μmより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。 Also, the height of the protrusions is higher than 500 [mu] m, may have problems such as the convex portion is easily broken broken occurs undesirably.

本発明においては、凹部の幅を特に、サブブロック領域内外で変更することが好ましい。 In the present invention, the width of the recess in particular, it is preferable to change the sub-block area out. 特に、凹凸部内で複数の深さの凹部を設けること、すなわち、凹部の深さを一定とせずに、凹部ごとに異なる深さとすることもでき、この場合、隣接するサブブロック領域間の凹部の深さを、サブブロック領域内の凹部の深さよりも深くすることにより、微粒子の大きさ、マイクロロッドの直径が制限されず、効率の良い撹拌が可能となるので好ましい。 In particular, the provision of the recess of the plurality of depths in the uneven portion, i.e., without the depth of the recess is constant, can also be at different depths for each recess, in this case, the recesses between adjacent sub block area depth, by greater than the depth of the recess of the sub-block area, the size of the particles is not limited diameter of the micro-rod, because efficient stirring can be achieved preferably. またこの場合は、凸部上面に選択結合性物質を固定化した効果を失わない範囲で、サブブロック領域内の凹部の深さを浅くすることが可能となるので、必要な被検物資が含まれる溶液(以下、検体溶液という。)の量を減らすことが可能となることからも好ましい。 In this case also, within a range which does not impair the effect of immobilized selective binding substance on the protrusion upper surface, it becomes possible to reduce the depth of the recess of the sub-block area, it includes a test necessary supplies the solution preferred since it is possible to reduce the amount of (hereinafter referred to as the sample solution.). 検体溶液の量を減らすことが可能となると、後述する検体自体の量を減らすこと、または、検体溶液中の検体の濃度を濃くすることが可能となる。 If it is possible to reduce the amount of sample solution, reducing the amount of analyte itself which will be described later, or, it is possible to thicken the concentration of the analyte in the sample solution. 特に、検体溶液中の検体濃度を濃くすれば、担体に固定化された選択性結合物質と検体との反応効率を上げることができ、結果的にシグナル強度が強くなる。 In particular, if darker analyte concentration in the sample solution, it is possible to increase the reaction efficiency of the immobilized selective binding substance and the analyte in a carrier, resulting in signal intensity increases. 具体的には例えば、サブブロック領域間の凹部の深さを、凸部上面から凹部底面までの深さで100μm以上、好ましくは100〜500μm、特に100〜300μmとすることができ、一方、サブブロック領域内の凹部の深さを20〜200μm、好ましくは30〜150μm、特に30〜100μmとすることができる。 Specifically, for example, the depth of the recesses between the sub-block regions, 100 [mu] m or more in depth from the protrusion top surface to bottom surface of the recess, and preferably, to 100 to 500 [mu] m, in particular 100 to 300 [mu] m, whereas, sub the depth of the recess in the block area 20 to 200 [mu] m, preferably to a 30 to 150 [mu] m, in particular 30 to 100 [mu] m.

凹凸部の凸部の上面の高さに関しては、それぞれの凸部の上端面の高さが略同一であるであることが好ましい。 Regarding the height of the upper surface of the convex portion of the uneven portion, it is preferable that the height of the upper end face of each protrusion is located at substantially the same. ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の上端面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。 Here, substantially the same height, the selective binding substance is immobilized on the upper end surface of the projection of different slightly height, by reacting this with a fluorescent-labeled analyte, and, when scanned with a scanner, the It refers to a height at which the intensity difference between the signal level is not an issue. 具体的に高さが略同一とは、高さの差が50μm以下であることをいう。 The substantially identical specific height refers to the height difference is 50μm or less. 高さの差は30μm以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。 More preferably the difference in height is 30μm or less, further preferred if the same height. なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。 Note that the same height as referred to herein, is intended to include errors due to variations occurring in the production or the like. 最も高い凸部上端面の高さと、最も低い凸部上端面の高さの差が50μmより大きいと、高さのずれた凸部上端面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上端面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。 The height of the highest protrusion upper end surface, and 50μm greater than the difference between lowest protrusion upper surface height will blurred height-shifted laser light at the convex top end surface, the convex portion upper surface signal strength from the reacted sample with the immobilized selective binding substance is not preferred because it may be weakened.
また、凸部分の上端面は、実質的に平坦であることが好ましい。 The upper end face of the convex portion is preferably substantially flat. ここで凸部上端面が実質的に平坦とは、20μm以上の凹凸がないことを意味する。 Here the convex top end surface and is substantially flat, meaning that there are no more irregularities 20 [mu] m.

本発明においては、上述した凹凸部のうち凸部の上面(上端面)に選択結合性物質(プローブ)が固定化される。 In the present invention, selective binding substance on the upper surface (upper end surface) of the convex portion of the concavo-convex part described above (probe) is immobilized. 選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良く、また、選択結合性物質を固定化しないで担体のみを用意しておき、検体の分析の際に所望の検体に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。 Immobilization of the selective binding substance may be one made previously, also is prepared only carrier without immobilized selective binding substance, according to the desired analyte when sample analysis it is also possible to select the selective binding substance appropriately fixed.
凸部の上面に固定化できる選択結合性物質(例えば核酸)は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。 Selective binding substance can be immobilized on the upper surface of the convex portion (e.g., nucleic acid) can be selected as appropriate necessary as data, it may be a mere dummy selective binding substance. また、すべての凸部表面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部を有していても良い。 Moreover, the need to combine all of the selective binding substance on the surface of the protrusion without or anything have a convex portion which is not fixed.

本発明において、選択結合性物質とは、検体と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。 In the present invention, the selective binding substance, either directly or indirectly analyte, means the various materials that can selectively bind. 担体の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。 Representative examples of selective binding substance capable of binding to the surface of the carrier can include nucleic acids, proteins, peptides, saccharides, lipids.
核酸としては、DNAやRNAでも良く、またPNAでも良い。 The nucleic acid may be DNA or RNA, also it may be PNA. 特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。 The single-stranded nucleic acid having a specific base sequence, because it binds selectively hybridized with single-stranded nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the base sequence or a portion thereof, referred to in the present invention, "selective binding corresponding to the sexual material ".
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。 Nucleic acid may be derived from living cells such as natural products, or may be synthesized by a nucleic acid synthesizer. 生細胞からのDNA又はRNAの調製は、公知の方法、例えばDNAの抽出については、Blinらの方法(Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976))等により、また、RNAの抽出については、Favaloroらの方法(Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980))等により行うことができる。 Preparation of DNA or RNA from live cells may be carried out by known methods, for extracting example of DNA, Blin et al method (Blin et al, Nucleic Acids Res 3:.. 2303 (1976)) by, etc., and, of RNA for extraction, Favaloro et al method (Favaloro et al, methods Enzymol.65:. 718 (1980)) can be performed by, and the like. 固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドDNAや染色体DNA、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したDNA断片、試験管内で酵素等により合成されたDNA、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。 The nucleic acid to be immobilized, further, chain or cyclic plasmid DNA or chromosomal DNA, and these restriction enzymes by or chemically cleaved DNA fragments, DNA was synthesized by an enzyme or the like in vitro, or chemical synthetic oligonucleotides it is also possible to use the nucleotide or the like.

また、蛋白質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab´)2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。 As the proteins, such as antibodies and Fab fragments and F (ab ') 2 fragments, it can be mentioned an antigen-binding fragment of an antibody, as well as various antigens. 抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。 Antibody or antigen-binding fragment thereof selectively binds to the corresponding antigen, the antigen is so selectively binds to the corresponding antibody, corresponds to the "selective binding substances".
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。 The sugars, in addition to the various monosaccharides, mention may be made of sugar chains such as oligosaccharides and polysaccharides.
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。 The lipid, in addition to the simple lipids, may be a composite lipid.
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。 It is also possible to immobilize the nucleic acids, proteins, saccharides, substances having antigenicity other than lipids. また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。 Also, as the selective binding substance, the cells may be immobilized on the surface of the carrier.
これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、DNA、RNA、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質を挙げることができる。 As particularly preferable among these selective binding substance include DNA, RNA, proteins, peptides, sugars, sugar chains or lipids.

本発明で用いられる担体の凸部の上面の面積は、略同一であることが好ましい。 The area of ​​the upper surface of the convex portion of the carrier used in the present invention are preferably substantially the same. 凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。 By area of ​​the upper surface of the projecting portion are substantially the same, it is possible to the area of ​​the portion where a variety of selective binding substances are immobilized on the same, which is advantageous for later analysis. ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上端面積を、最も小さい上端面積で割った値が1.2以下であることを言う。 Here, the area of ​​the upper substantially the same protrusion, the largest upper area in the convex portion, is divided by the smallest upper surface area refers to 1.2 or less.

選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、1mm 2以下、10μm 2以上が好ましい。 The area of the upper surface of the selective binding substance is immobilized projections, but are not particularly limited, for ease of points and handling it is possible to reduce the amount of selective binding substance, 1 mm 2 below, 10μm 2 or more is preferable. また、凸部の数は、凸部の形状やサイズ、凹凸部の面積、凹部の幅、サブブロック領域、微粒子やマイクロロッドのサイズ等により適宜定めることができる。 The number of the projections, the shape and size of the projections, the area of ​​the concave-convex portion, the concave portion of the width, the sub-block area, the size or the like of the fine particles and micro rod can be appropriately determined. 凸部の数の好ましい範囲は、本発明の効果を発揮できる点から鑑みると、1000個から50000個である。 The number of preferred ranges of the projections, in view from the viewpoint of exhibiting the effects of the present invention is 50,000 from 1000. より好ましい範囲は、3000個から50000個であり、特に好ましくは、5000個から50000個である。 More preferred range is 50,000 to 3000, particularly preferably from 50,000 from 5000. 凸部の密度としては、5個/mm 2から50個/mm 2の間が好ましい範囲である。 The density of the protrusions, between 5 / mm 2 of 50 / mm 2 is the preferred range.

本発明で用いられる担体において、さらに好ましくは、凹凸部を有する面に、さらに平坦部が設けられていることが好ましい。 In carriers used in the present invention, more preferably, the surface having an uneven portion, it is preferable to further the flat portion. このような構造とすることにより、凹凸部に検体溶液をアプライすることが容易となる。 With such a structure, it becomes easy to apply the sample solution to the uneven portion.
凹凸部の凸部の上端面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。 Height and the height of the flat portion of the upper end surface of the convex portion of the concavo-convex portion is preferably substantially the same. すなわち、平坦部の高さと凸部上端面の高さの差は、50μm以下であることが好ましい。 That is, the difference in height between the convex portion upper face of the flat portion is preferably 50μm or less. 凸部上端面の高さと平坦部の高さの差が50μmを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。 When the difference in height and the flat portion of the height of the convex portion upper surface is greater than 50 [mu] m, which is not preferable if the fluorescence intensity is weak to be detected. 平坦部の高さと凸部上端面の高さの差は、より好ましくは30μm以下であり、さらに好ましくは、10μm以下である。 Difference in height between the convex portion upper face of the flat portion is more preferably 30μm or less, and more preferably 10μm or less. 最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。 Most preferably, the height of the height and the convex portion of the flat portion is the same.

本発明で用いる選択結合性物質固定化担体の具体例を図3、図4及び図5を基に説明する。 Specific examples of the selective binding substance-immobilized carrier used in the present invention FIG. 3 will be described with reference to FIGS. 図3は、選択結合性物質固定化担体の表面上方からみた模式図であり、図4及び図5は、いずれも図3に示す選択結合性物質固定化担体をC1面で切断した部分断面図である。 Figure 3 is a schematic view from above the surface of the selective binding substance-immobilized carrier, 4 and 5, partial cross-sectional view both cut with C1 surface for selective binding substance-immobilized carrier shown in FIG. 3 it is.
図3に示す例において、選択結合性物質固定化担体1の表面には、複数の凸部11を含む凹凸部12により構成されており、その周りに平坦部13が設けられている。 In the example shown in FIG. 3, the surface of the selective binding substance-immobilized carrier 1, is constituted by concavo-convex portion 12 including a plurality of convex portions 11, the flat portion 13 is provided therearound. 凸部11の上面には、選択結合性物質(例えば核酸)が固定化される。 On the upper surface of the convex portion 11, selective binding substance (e.g., nucleic acid) is immobilized.

図4の例では、サブブロック領域Skと隣接するサブブロック領域Sk+1間の凹部10Aの幅WAが、サブブロック領域内の凹部10Bの幅WBよりも広くなっている。 In the example of FIG. 4, the width WA of the recess 10A between the sub-block area Sk + 1 adjacent to the sub-block area Sk is wider than the width WB of the recess 10B of the sub-block area. よって、サブブロック領域内の凹部のみにビーズを入れる場合に比較し、サブブロック領域と隣接するサブブロック領域の間の凹部により大きなビーズを入れることが可能となる。 Therefore, compared with the case of placing the beads only in the recesses of the sub-block area, it is possible to put a large bead by the recess between the sub-block regions adjacent to the sub-block area. よって、これを移動させることにより効率的に溶液の撹拌が可能となる。 Therefore, it is possible to stir the efficient solution by moving them.
また、図5の例では、図4と同様サブブロック領域Skと隣接するサブブロック領域Sk+1間の凹部10Aの幅WAが、サブブロック領域内の凹部10Bの幅WBよりも広くなっていると共に、サブブロック領域Skと隣接するサブブロック領域Sk+1間の凹部10Aの深さDAが、サブブロック領域内の凹部10Bの深さDBよりも深くなっている。 Further, in the example of FIG. 5, the width WA of the recess 10A between the sub-block area Sk + 1 adjacent to the same sub-block area Sk and 4, together with is wider than the width WB of the recess 10B of the sub-block area, depth DA of the recess 10A between the sub-block area Sk + 1 adjacent to the sub-block area Sk is deeper than the depth DB of the recess 10B of the sub-block area. 尚、図5の例では、平坦部13とサブブロックSkとの間にサブブロック領域内の凹部10Bと同じ深さであるが凸部を有しない凹部10Cが設けられている。 In the example of FIG. 5, which is the same depth as the recessed portion 10B of the sub-block area having no recess 10C is provided with a convex portion between the flat portion 13 and the sub-blocks Sk. この場合は、図4の場合と比較し、さらに大きなビーズをサブブロック領域と隣接するサブブロック領域との間の凹部に入れることが可能となるのでより好ましい。 In this case, compared with the case of FIG. 4 it is more preferable because it is possible to further add a large beads in the recesses between the sub-block regions adjacent to the sub-block area.

また、図3、図4及び図5の例では、平坦部13を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部11の上端面に合わせることが可能となる。 Further, FIG. 3, in the example of FIG. 4 and FIG. 5, with the flat portion 13, it becomes possible to easily focus the beam of light for the measurement, such as excitation light scanner on the upper end surface of the projection 11. より具体的に説明すると、担体の表面に測定用のレーザー等の照射光(実線の矢印)を照射するにあたり焦点を合わせる際には、図6に示すように、バネ40で付勢して治具41に選択結合性物質固定化担体1を突き当て、この治具の突き当て面42の高さにレーザー光44が合焦するようレンズ43等により予め焦点を調整しておくことが多い。 More specifically described, when focusing Upon irradiating irradiation light such as a laser for measurement on the surface of the carrier (solid arrow), as shown in FIG. 6, and urged by a spring 40 Osamu the abutting selective binding substance-immobilized carrier 1 immediately 41, often previously adjusted in advance focus by the lens 43 and the like so that the laser beam 44 to the height of the abutment surface 42 of the jig is focused. 担体の平坦部を治具の面42に突き当てることにより、容易に担体の凸部上端面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。 By abutting the flat portions of the carrier surface 42 of the jig, it becomes possible to easily focus the scanner laser beam to the convex top end surface of the carrier. なお、図6の例においては、選択結合性物質固定化担体1は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。 In the example of FIG. 6, selective binding substance-immobilized carrier 1, the surface of the selective binding substance is immobilized is fixed so as to be lower.

本発明で用いる担体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。 The material of the carrier used in the present invention is not particularly limited, mention may be made of glass, ceramics, inorganic materials such as silicon, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, and the like polymers such as silicone rubber. この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマー、ガラス及びシリコンを特に好ましく用いることができる。 Among these, polymethyl methacrylate, polystyrene, polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer, can be particularly preferably used glass and silicon.

本発明で用いる担体は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。 Carrier used in the present invention preferably is at least partially black. このようにすることにより、担体からの自家蛍光を低減することができる。 In this way, it is possible to reduce the autofluorescence from the carrier. 担体の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた担体の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。 The portion on a black support, may be in the body of the carrier uneven portion is provided, the side surface of the protrusion may be a hydrophobic material or insulating layer provided in the recess, it may be all of these.

ここで、担体が黒色であるとは、可視光(波長400nm〜800nm)において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン(特定のピークなど)を持たず、一様に低い値であり、かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることを意味する。 Here, the carrier is black in the visible light (wavelength 400 nm to 800 nm), the spectral reflectance of the black portion of the carrier does not have a specific spectral pattern (such as specific peaks), with uniformly low value There, and the spectral transmittance of the black portion of the carrier also means that no specific spectral pattern, a uniformly low value.
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光(波長400nm〜800nm)の範囲の分光反射率が7%以下であり、同波長範囲での分光透過率が2%以下であることが好ましい。 The spectral reflectance, the value of spectral transmittance, and the spectral reflectance in the range of visible light (wavelength 400 nm to 800 nm) is 7% or less, that the spectral transmittance in the wavelength range is not more than 2% preferable. 尚、ここで言う分光反射率は、JIS Z 8722の条件Cに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を言う。 Note that the spectral reflectance referred to herein is adapted to the condition C of JIS Z 8722, with lighting and light-receiving optical system, it refers to the spectral reflectance when taken regularly reflected light from the carrier.

黒色にする手段としては、担体に黒色物質を含有させることにより達成しうる。 As a means for black, it can be achieved by containing a black material to the carrier. この黒色物質は、光を反射したり透過し難いものであれば、特に制限はないが、好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co、およびCuの酸化物、Si、Ti、Ta、ZrおよびCrの炭化物などの黒色物質が使用できる。 This black substance is not particularly limited as long as it hardly reflects light or transmitted, it is not particularly limited, taking the preferred, carbon black, graphite, titanium black, aniline black, Ru, Mn, Ni, Cr, Fe , Co, and an oxide of Cu, Si, Ti, Ta, a black substance such as carbides of Zr and Cr can be used.

これらの黒色物質は単独で含有させる他、2種類以上を混合して含有させることもできる。 These black substances other to be contained singly, may contain a mixture of two or more. 例えば、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン樹脂などのポリマーの場合は、この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。 For example, in the case of polymers such as polyethylene terephthalate, silicone resins, among the black substance in the carbon black, graphite, titanium black, it can be preferably contained aniline black, in particular can be preferably used carbon black. ガラス、セラミックの無機材料の場合は、Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co、およびCuの酸化物、Si、Ti、Ta、ZrおよびCrの炭化物を好ましく含有させることができる。 Glass, in the case of the ceramic inorganic materials, can be Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Co, and an oxide of Cu, Si, Ti, Ta, is contained preferably carbides Zr and Cr.

また、本発明で用いる担体は、担体の形状については、担体表面に、上述したような凹部および凸部からなる凹凸部を有するものであればよく、各種製法にて製造することができる。 Further, the carrier used in the present invention, the shape of the carrier, the carrier surface, as long as it has an uneven portion composed of concave and convex portions as described above, can be produced by various processes. 例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。 For example, when the material is a polymer such as injection molding, it can be molded by a hot embossing method, a method of polymerizing in a mold or the like. また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。 The material may inorganic glass or ceramic, in the case of sandblasting, the silicon can be molded in such a known semiconductor process.
成型した担体は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。 Molding the carrier prior to immobilize selective binding substance on the surface thereof may be subjected to various surface treatments as needed. かかる表面処理としては、具体的には例えば特開2004−264289号公報に記載されるものなどを挙げることができる。 Such surface treatment can be specifically mentioned such as those described, for example, in JP-2004-264289.

本発明の撹拌方法は、このような凹部および凸部からなる凹凸部を有する担体にカバー部材を組み合わせた分析用チップに適用することもできる。 Stirring method of the present invention can also be applied to such recesses and analysis chip that combines the cover member to the carrier having the uneven portion composed of convex portions.
本発明において、分析用チップとは、被検物質が含まれる溶液(検体溶液)を当該チップにアプライし、検体の存在の有無や、検体の量や、検体の性状等を測定するために用いるチップをいう。 In the present invention, the analysis chip is used to measure the solution (sample solution) containing the test substance was applied to the chip, and the presence or absence of the analyte, and the amount of analyte, the nature of the sample, such as It refers to the chip. 具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。 Specifically, by reaction with the immobilized selective binding substance and the analyte on the carrier surface, and the amount of analyte, biochips and the like to measure the presence or absence of an analyte. より具体的には、核酸を担体表面に固定化したDNAチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び細胞を担体表面に固定化した細胞チップ等が挙げられる。 More specifically, nucleic acids immobilized DNA chip carrier surface, protein chip proteins typified by antibody was immobilized on a carrier surface, glycochips sugar chain was immobilized on a carrier surface, and cell carrier immobilized cell chip or the like on the surface thereof.

本発明の撹拌方法を該選択結合性物質固定化担体の表面を覆い前記選択結合性物質固定化担体と接着されたカバー部材を更に備える分析用チップに適用する場合、検体溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、検体と、担体の領域(例えば図1〜図5中の12)に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。 When applying the stirring method of the present invention to the analysis chip further comprising a cover member that is bonded to the selective binding substance-immobilized carrier covers the surface of the selective binding substance-immobilized carrier, conveniently sealed holding the sample solution it can be, as a result, the specimen, the reaction of the immobilized selective binding substance to a region (e.g., 12 in FIGS. 1 to 5) of the carrier can be carried out stably. また、特に分析用担体とカバー部材とが接着され一体となっていることにより、微粒子やマイクロロッドを予め封入しておくことができ、検体溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。 Further, by which together in particular glued and analytical support and the cover member, it is possible to advance encapsulating fine particles and micro rods, it is possible to easily perform the task of applied the sample solution . そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。 Then, since no tape or sealant is in contact with the sample solution even work for closing the through-hole after applied the sample solution, there is an advantage that the background noise does not increase.

図7は、前記選択結合性物質固定化担体に加え、更にカバー部材、接着層、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する分析用チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図8は図7の分析用チップを矢印A1に沿った面で切断した断面図である。 7, in addition to the selective binding substance-immobilized carrier is a perspective view showing further the cover member, the adhesive layer, an example of a schematic embodiment of the analysis chip having through-holes and liquid level parking sealing chamber, Figure 8 is a cross-sectional view taken along a plane along the arrow A1 the analysis chip of FIG. 図7及び図8に示す例においては、選択結合性物質固定化担体1が、接着層30を介してカバー部材3で覆われ、選択結合性物質が固定化された領域12を含む空隙31を形成している。 In the example shown in FIGS. 7 and 8, the selective binding substance-immobilized carrier 1 is covered with a cover member 3 via the adhesive layer 30, a gap 31 including the region 12 where the selective binding substance is immobilized It is formed. 空隙31は、複数の貫通孔32を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間である。 Void 31, in addition to communicating with the outside through a plurality of through-holes 32 are closed space not outside communication.

前記カバー部材は、前記選択結合性物質固定化担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。 The cover member covers at least a portion of one surface of the surface of the selective binding substance-immobilized carrier can be glued to have an air gap between a carrier and a cover member. そして、担体は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。 The support preferably has an immobilized selective binding substance on a region located within the gap a surface thereof. 即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記選択結合性物質固定化担体に接着される。 That is, preferably, a region in which the selective binding substance is immobilized, to lie within the gap, the cover member is bonded to the selective binding substance-immobilized carrier. 前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着される。 It said cover member, as long as the gap is formed, any may be bonded in a manner, and is preferably bonded via a double-sided tape, an adhesive layer such as a resin composition.

前記カバー部材は、前記空隙に連通する1つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。 The cover member can be made with one or more through holes communicating with the void, it is preferable to have a plurality of through-holes. より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも3個から6個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。 More specifically, the through hole is preferably in a plurality for one gap, by inter alia from 3 and 6, particularly preferred since it is easy to fill in the sample solution. なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは3〜6個の貫通孔を有することが好ましい。 As described below, voids, if divided into a plurality of spaces that do not communicate with each other, a plurality, and more preferably has 3 to 6 penetrating holes preferred per each space. カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び検体溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。 If the cover member has a plurality of through-holes, their pore size, may be the same or different, one of a plurality of through-holes and apply port, functions other through hole as vents for air case of, in terms of sealing retention of the ease and the sample solution applied in the sample solution, only apply mouth and a wide pore diameter required to apply it to a more narrow pore size and other through-holes, preferably. 具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは直径0.01から2.0mmの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を0.01〜1.0mmとすることが好ましい。 Specifically, the through-pore size of the applied opening is in a range of diameter 0.01 to 2.0 mm, it is preferable that the 0.01~1.0mm the diameter of the other through holes.

貫通孔32は、その少なくとも1つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバー33を備えるものとしても良い。 Through holes 32, at least one of which, by changing its diameter, wide portion of the diameter at the upper end, or as comprising a so-called liquid level parking sealing chamber 33. 液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔32からアプライされ空隙31に充填された検体溶液の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材34で封止する際の封止を容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、検体溶液の中に多数の気泡が入ったり、検体溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。 By providing the liquid level parking sealing chamber, suppress the rise of the liquid surface of the filled sample solution in the voids 31 is applied from the through-hole 32, facilitating the sealing of the time of sealing with a sealing member 34 through hole and securely with it is possible to perform a large number of air bubbles or contained within the sample solution, it is possible to prevent the outflow of the sample solution preferred. 液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。 Shape of the liquid surface parking sealing chamber is not limited in particular, cylindrical, prismatic, conical, can be pyramidal, hemispherical, or which approximate shape. これらのうち、製造の容易さ及び検体溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。 Among these, in view of height, etc. of the effect of suppressing the increase in the ease of manufacturing and the sample solution, cylindrical is particularly preferred.

貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、図8に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔32及び液面駐止用チャンバー33との組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔32の孔径サイズ(直径)は、0.01から2.0mmが好ましく、0.3から1.0mmがより好ましい。 But is not particularly limited pore size the size of the through-holes, taking as an example the case of a combination of a longitudinal section through the cylindrical shape holes 32 and liquid level parking sealing chamber 33 shown in FIG. 8, through pore diameter size of the holes 32 (diameter) is preferably 2.0mm from 0.01, more preferably 1.0mm 0.3. 孔径を0.01mm以上とすることにより、検体溶液のアプライを容易に行うことができる。 By the pore diameter or more 0.01 mm, it is possible to perform an Apply the specimen solution easily. 一方、貫通孔32の直径を1.5mm以下とすることにより、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。 On the other hand, the diameter of the through hole 32 by a 1.5mm or less, it is possible to more effectively suppress such evaporation Apply after sealing before the sample solution. 液面駐止用チャンバー33の孔径サイズ(直径)については、1.0mm以上が好ましい。 The aperture size of the liquid level parking sealing chamber 33 (diameter), more preferably 1.0 mm. 1.0mm以上とすることにより、貫通孔32とのサイズの差を十分に得ることができ、十分な液面駐止効果が得られ好ましい。 With 1.0mm or more, the difference in size between the through holes 32 can be sufficiently obtained, preferably provide a sufficient liquid level parking stop effect. 液面駐止用チャンバー33の直径の上限は、特に限定されないが、10mm以下とすることができる。 The upper limit of the diameter of the liquid level parking sealing chamber 33 is not particularly limited, it can be set to 10mm or less. また、液面駐止用チャンバー33の深さは、特に限定されないが、0.1〜5mmの範囲内とすることができる。 The depth of the liquid level parking sealing chamber 33 is not particularly limited, and may be in the range of 0.1 to 5 mm.

このようなカバー部材は、前述の選択結合性物質固定化担体に、脱離可能に接着されていることが好ましい。 The cover member has a selective binding substance-immobilized carrier of the above, it is preferably bonded detachably. 分析用チップをDNAチップとして用いる場合、通常、DNAチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。 When using the analysis chip as DNA chip, usually, it is necessary to read the DNA chip in a dedicated scanner, in a state in which the cover member is bonded, it is difficult to set a dedicated scanner, scanning even set cover member and a scanner optical components when carrying out the operation in contact, which may cause a malfunction. また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。 Also, be capable of reading through the cover member, read values ​​may be inaccurate. そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。 Therefore, to removal of the cover member in the reading process, it is preferable that the cover member can be desorbed.

カバー部材を選択結合性物質固定化担体に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と担体が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。 Aspects of adhering detachably the cover member to the selective binding substance-immobilized carrier is not particularly limited, aspect cover member and the carrier can be eliminated without being damaged are preferable. 例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着することができる。 For example, it can be bonded via the double-sided tape, adhesive layer of the resin composition and the like.

接着層として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、該両面テープの接着力の弱い面を担体側に接着し、接着力の強い面をカバー部材側に接着することが好ましい。 When using a double-sided tape as the adhesive layer, it is preferable to use a different double-sided tape having adhesive strength on both sides, in particular, the weak planes of adhesion double-sided tape adhered to the carrier side, a strong surface of adhesion it is preferable to adhere to the cover member side. このような態様とすることにより、カバー部材を剥離する際に、両面テープがカバー部材に接着した状態で同時に担体より脱離し易く、それにより、担体上への接着層の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。 In such a manner, upon the release of the cover member, easily simultaneously separated from the de-carriers in a state where the double-sided tape is adhered to the cover member, thereby, in the reading process due to the residual of the adhesive layer onto the support it is possible to avoid the inconvenience. このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号No. As such a double-sided tape, Nitto Denko Co., Ltd., product number No. 535A、住友スリーエム株式会社製の製品番号9415PC及び4591HL、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号No. 535A, Sumitomo product number Co., Ltd. 9415PC and 4591HL, as well as the Corporation Teraoka Seisakusho Co. of Product No. No. 7691等が挙げられる。 7691, and the like.

接着層として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。 When using the resin composition as an adhesive layer, as is the resin composition, there can be used an acrylic polymer, silicone polymer, and a resin composition or the like containing a polymer selected from the group consisting of mixtures. これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。 By utilizing these resin compositions, it becomes possible to enhance the sealing properties as compared with the double-sided tape, because in comparison with the double-sided tape, is stable to prolonged incubation, such length particularly preferred in the incubation period analysis system necessary. 特に、接着層としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。 In particular, the use of elastomeric silicone as an adhesive layer, sealability is good, moreover, can be bonded to the cover in a readily desorption conditions. このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード(シルガードはダウコーニング社の登録商標)や、信越化学工業社製の二液型RTVゴム(型取り用)を挙げることができる。 Such elastomers, specifically, Sylgard (Sylgard is a registered trademark of Dow Corning Corporation) or can include Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. of a two-component RTV rubbers (for mold removal).

上記カバー部材の形状は、前記選択結合性物質固定化担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、担体に近い部分より担体に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。 The shape of the cover member covers at least a portion of one surface of the surface of the selective binding substance-immobilized carrier, the carrier is not particularly limited as long as it can be bonded to have a gap between the cover member , the outer peripheral portion thereof, can be made structure having a portion protruding in the portion distant to the support than the portion close to the carrier, namely the overhang structure is provided. オーバーハング構造を設けることにより、担体を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。 By providing the overhang structure, since it is easy to desorb the cover member without damaging the carrier, preferred.

また、前記担体にカバー部材を接着するにあたっては、カバー部材が前記担体の凹凸部を含む表面を覆い、かつ、担体とカバー部材と任意に接着層を含む構造により規定される空隙を有するように接着することができる。 Further, when bonding the cover member to the carrier, covering the surface cover member comprises an uneven part of the carrier, and so as to have a gap defined by the structure comprising an adhesive layer on the carrier and the cover member and optionally it can be bonded. 当該空隙は、1つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。 The gap may be a single space or may be a plurality of partitioned spaces. また、カバー部材の数は、一枚の担体あたり一枚であってもよく、二枚以上であってもよい。 The number of the cover member may be a one per single carrier, or may be two or more.

カバー部材の材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。 As the material of the cover member, it is not particularly limited, when was applied the sample solution, to allow observation of the state of the solution, a transparent material is preferred. そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。 Such materials include glass or plastic. 特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。 In particular, from the viewpoint can be easily manufactured structure such as a through-hole or the liquid level parking stop chamber, polystyrene, polymethyl methacrylate, is preferably used a transparent resin such as polycarbonate. カバーの作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。 The method for manufacturing a cover is not particularly limited, it can be processed by cutting or injection molding. 大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。 From the viewpoint can be mass-produced, it can be preferably used injection molding method.

本発明で用いることのできる分析用チップにおける、凹凸部、カバー部材及び微粒子もしくはマイクロロッドの関係の好ましい例を、図8を参照して説明する。 In analytical chip which can be used in the present invention, the concave-convex portion, a preferred example of the relationship between the cover member and particles or micro rod, it will be described with reference to FIG. 図8に示した例では、DNA等の選択結合性物質45は、分析用担体1の凸部上面11上に固定化されている。 In the example shown in FIG. 8, the selective binding substance 45 such as DNA is immobilized on the convex upper surface 11 of the analytical carrier 1. そして、微粒子(マイクロロッド)2は、分析用担体1の凹部10Aおよび10Bの空隙内に載置されている。 Then, fine particles (micro rod) 2 is mounted in the void of the recessed portion 10A and 10B of the analytical carrier 1. 特に、微粒子(マイクロロッド)は、サブブロック領域間の凹部10Aに格納されるので、微粒子の大きさやマイクロロッドの直径に関わらず効率よく撹拌することが可能となる。 In particular, fine particles (micro rods), since stored in the recess 10A between the sub-block regions, it becomes possible to stir efficiently regardless diameter of the fine particles of the size and micro rod. 選択結合性物質45及び微粒子(マイクロロッド)2は、DNAが含まれる検体溶液(図示せず)に触れることになる。 Selective binding substance 45 and particulates (micro rod) 2 would touch the specimen solution containing the DNA (not shown). 検体溶液は、分析用担体1、接着層30及びカバー部材3により規定される空隙内で保持されることになる。 Sample solution is analyzed for carrier 1, it will be retained in the void defined by the adhesive layer 30 and the cover member 3. 図8の例においては、分析用担体の凸部上面11とカバー部材3との間隔の最短距離が、微粒子(マイクロロッド)2の直径(マイクロロッドの場合底面直径)未満となっている。 In the example of FIG. 8, the shortest distance interval between the convex upper surface 11 and the cover member 3 of the analytical carrier has become less than microparticles (micro rod) 2 diameter (if the bottom diameter of the micro-rod). それにより、微粒子等が凸部上端面11に接触できなくなり、凸部上面11上の選択結合性物質45を傷つけることを防ぐことができる。 Thereby, it is possible to prevent the fine particles will not be able to contact the protrusion upper surface 11, hurt selective binding substance 45 on the convex upper surface 11. 微粒子の形状やマイクロロッドの底面が、例えば楕円形、多角形等の非球状の形状である場合は、凸部上面とカバー部材3との間隔の最短距離が底面最小径未満であれば、同様に凸部上面11と微粒子(マイクロロッド)との接触を防ぎ、選択結合性物質45の損傷を防ぐことが可能となる。 Bottom shape and micro rod fine particles, for example elliptical, if a non-spherical shape such as a polygon, the shortest distance interval between the convex upper surface and the cover member 3 is less than the bottom surface minimum diameter, similar prevent contact between the protrusion upper surface 11 and the fine particles (micro rods), it becomes possible to prevent damage to the selective binding substance 45.

本発明の撹拌方法を、担体にカバー部材を組み合わせた分析用チップを利用して行う場合の担体への被検物質を含む溶液の接触は、前記カバー部材の貫通孔から検体溶液をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させることができる。 Stirring method of the present invention, the contact of the solution containing the analyte to the carrier when carried out using the analysis chip that combines the cover member to the carrier, was applied the sample solution from the through hole of the cover member, It said cover member by attaching a sealing member to seal the through hole, the test substance can be selectively bound to the carrier constituting the analysis chip.
貫通孔からの検体のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。 Apply the sample from the through hole, for example, it can be performed by injecting a normal instrument such as a pipette from the through hole.

カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。 Sticking of the sealing member to the cover member, a part or all of the through hole can preferably be performed in a manner that seals everything. 前記封止部材としては、例えばカプトン(商標、ポリイミドフィルム、東レ・デュポン社製)、ポリエステル、セロハン、又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできるが、液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。 As the sealing member, for example, Kapton (trademark, a polyimide film, manufactured by Du Pont-Toray Co., Ltd.), polyester, cellophane, or can be preferably exemplified flexibility of the tape of the adhesive tape made of vinyl chloride, in which limited not, can also be used a plate-shaped bondable any member of a non-flexible, but can also be used atypical sealants the effects of the present invention by the liquid level parking sealing chamber better from the viewpoint of obtaining, preferably tape and plate-like member of flexible, from the viewpoint of ease of operation, flexibility of the tape it is more preferred. 封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。 When using a tape or a plate-like member as the sealing member, the number of used sheets is optional. 具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。 Specifically, it may be sealed all the holes on the cover member by a single sealing member, sealing a portion of the plurality of through holes each with a plurality of sealing members it may be. また、前記の通り一枚の担体上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。 When a plurality of cover members are provided on the support piece as a, it may be used on separate sealing member of the cover member, together through holes in the plurality of cover members one it may be sealed by pieces of the sealing member. 通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。 Normally, the use of a single sealing member per one cover member is preferred since it can achieve a simple and reliable seal.

封止の具体例を、再び図8を参照して説明する。 Specific examples of sealing will be described with reference again to FIG. 図8の例では、検体溶液(図示せず)を貫通孔32よりアプライした後、可とう性の粘着テープ34を、液面駐止用チャンバー33の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。 In the example of FIG. 8, after it applied from the through-hole 32 of the sample solution (not shown), the adhesive tape 34 of the flexible, attached so as to cover the entire surface of the liquid level parking sealing chamber 33, the through hole It is sealed. このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。 Such embodiments may achieve sealing without incurring leakage and measurement error of convenient and sample solution.

このような本発明の撹拌方法は、各種検体の分析に利用することができる。 Stirring method of the present invention can be utilized for the analysis of various analytes.
すなわち、前記本発明の撹拌方法を利用して、担体に被検物質を選択的に結合させ、前記担体上に選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することにより、検体を分析することができる。 That is, the utilizing agitation method of the present invention, by the carrier selective to bind the test substance, to measure the analyte amount bound via a selective binding substance on the carrier, the sample it can be analyzed.

本発明の被検物質の分析方法においては、まず、前記本発明の撹拌方法に従い、選択結合性物質固定化担体に被検物質を接触させて撹拌し、選択的に結合させる。 In the analytical method of the test substance of the present invention, first, the accordance agitation method of the present invention, and stirred by contacting a test substance to the selective binding substance-immobilized carrier, is selectively bind. すなわち、本発明の選択結合性物質固定化担体に上述のような標識、増幅等を施した検体を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた検体溶液とし、これに撹拌子を添加した上で担体に接触させ所定方向に公転させれば良い。 That is, the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention labeled as described above, such as a sample solution obtained by dissolving the specimen solution or an appropriate buffer solution subjected to amplification, adding a stirrer to contacting the support it is sufficient to revolve in a predetermined direction.

本発明の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と被検物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記選択結合性物質固定化担体に結合させることを意味する。 In the analysis method of the present invention, the selective binding, by interaction with the selective binding substance and a test substance, the test substance to the selective binding substance-immobilized carrier via the selective binding substance meaning to attach. すなわち、本発明の撹拌方法に従い担体を回転させることにより、加速度、遠心力等によって撹拌子が検体溶液中を移動するので、選択的結合が効率よく進められる。 That is, by rotating the carrier in accordance with agitation method of the present invention, the acceleration, the stirrer by centrifugal force or the like to move the sample solution, proceeds well selective coupling efficiency.
選択的結合の際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる検体の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び/又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、40℃〜70℃程度で1分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜40℃程度で1分間〜数時間程度である。 The reaction temperature and time during the selective binding of nucleic acids of the sample to be hybridized chain length and is appropriately selected according to the type of antigen and / or antibody involved in the immune reaction, nucleic acid hybridization If, usually 1 minute to ten hours at about 40 ° C. to 70 ° C., in the case of the immune response is usually 1 minute to several hours at about room temperature to 40 ° C.. なお、本発明の撹拌方法による撹拌は、この選択的結合における反応時間を通して行っても良いし、その一部だけとしても良い。 Incidentally, agitation by stirring method of the present invention may be performed throughout the reaction time in this selective binding may be only a part thereof.
選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。 After the selective binding has been completed, usually after desorbing cover member, it can be subjected to the next step.

本発明の分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記選択結合性物質固定化担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する。 In the analysis method of the present invention, after the selective binding described above, measuring the analyte amount bound via the selective binding substance to said selective binding substance immobilized on a carrier. この測定も、従来の分析用チップにおける操作と全く同様に行うことができる。 This measurement can also be carried out in exactly the same manner as the operation of the conventional analysis chip. 例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した被検物質の質量について、公知のスキャナ等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。 For example, the appropriate fluorescent labels can be measured for the mass of the test substance bound to the selective binding substance, by a known scanner or the like, by reading the fluorescence amount.

本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。 In the analysis method of the present invention, in case of fixing the nucleic acid as a selective binding substance is capable of measuring the nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid or a portion thereof. また、選択結合性物質として抗体又は抗原等の蛋白質を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫的に反応する抗原又は抗体を測定することができる。 Further, in the case of immobilizing proteins such as antibodies or antigen as the selective binding substance is capable of measuring the antigen or antibody reactive antibody or antigen immunologically. なお、本明細書でいう「測定」には、検出と定量の両者の意味が含まれる。 The "measurement" used herein includes the meaning of both detection and quantification.

本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。 Described in more detail by the following examples of the present invention. もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 However, the present invention is not limited to the following examples.

参考例1(基板の作製) Reference Example 1 (Production of substrate)
公知の技術であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)法により、カーボンブラックを含有したポリメチルメタクリレート(PMMA)製の成形板を2種類作製した。 The LIGA (Lithographie Galvanoformung Abformung) method is a known technique, and the polymethylmethacrylate (PMMA) manufactured by molding plates containing carbon black and two produced.

基板1 Substrate 1
図3、図5に示す基板を作製した。 3, to prepare a substrate shown in FIG. すなわち、基板の外形は75×25×1mmであり、その中心部には凸部の集団からなる32個のサブブロックが存在する。 In other words, the outer shape of the substrate is 75 × 25 × 1mm, 32 sub-blocks comprised of a population of the convex portion is present at the center thereof. そのサブブロック中には、直径0.1mmの凸部がピッチ0.245mmで、17×17の格子状に配置されている。 During the sub-block, the convex portion of diameter 0.1mm is at a pitch 0.245 mm, are arranged in a grid pattern of 17 × 17. 基板全体には17×17×32=9248個の凸部が設けられている。 The entire substrate 17 × 17 × 32 = 9248 pieces of convex portions are provided. また、サブブロック間は0.48mmのスペースが設けられている。 Further, between the sub-blocks space 0.48mm it is provided. また、サブブロック内における凸部上面と底面との距離(深さ)は0.1mmであり、一方それ以外の基板の堀込まれている部分(サブブロック間、および、平坦部とサブブロックの間)の深さは0.15mmとなっている。 The distance between the convex upper surface and a bottom surface of the sub-block (depth) is 0.1 mm, whereas between the other moat filled-in is part of the substrate (sub-block, and, between the flat portion and the sub-block the depth of the) has become a 0.15mm.

基板2 Substrate 2
基板の堀込まれている部分の深さを0.1mmと一種類とした以外は、基板1と同様なデザインの基板を作製した。 Except that the depth of the moat filled-in is part of the substrate and 0.1mm and one type has to produce a substrate having the same design as the substrate 1.

参考例2(プローブDNAの固定化) Reference Example 2 (immobilized probe DNA)
上記の基板を10Nの水酸化ナトリウム水溶液に65℃で12時間浸漬した。 The above substrate was immersed for 12 hours at 65 ° C. in aqueous sodium hydroxide 10 N. 次いで、純水、0.1N HCl水溶液、純水の順で洗浄した。 Then washed pure water, 0.1 N HCl aqueous solution, and deionized water. このようにして、板表面のPMMAの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。 In this manner, the side chain of the PMMA plate surface by hydrolysis, to produce a carboxyl group.
配列番号1(60塩基、5'末端アミノ化)で表される塩基配列を有するDNA(以下、配列番号1のDNAと記載することがある)を合成した。 SEQ ID NO: 1 (60 bases, 5 'terminally aminated) DNA having the nucleotide sequence represented by (hereinafter, may be referred to as the DNA of SEQ ID NO: 1) was synthesized. 配列番号1のDNAは5'末端がアミノ化されている。 DNA of SEQ ID NO: 1 is the 5 'end is aminated.

これらのDNAを、純水に0.27nmol/μlの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。 These DNA, dissolved at a concentration of 0.27nmol / μl in pure water, and a stock solution. 基板に点着する際は、PBS(NaClを8g、Na 2 HPO 4・12H 2 Oを2.9g、KClを0.2g、KH 2 PO 4を0.2g純水に溶かし1lにメスアップしたものにpH調整用の塩酸を加えたもの、pH5.5)でプローブの終濃度を0.027nmol/μlとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブDNAの末端のアミノ基とを縮合させるため、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を加え、この終濃度を50mg/mlとした。 When spotted on the substrate was measured up to PBS (NaCl 8g, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O and 2.9 g, the KCl 0.2g, a KH 2 PO 4 in 1l dissolved in 0.2g deionized water plus hydrochloric acid for pH adjustment to those, pH 5.5) and 0.027nmol / μl final concentration of the probe in and for condensation of the terminal amino group of the carboxylic acid with the probe DNA of the support surface, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added, the final concentration of 50 mg / ml. そして、これらの混合溶液をおよそ40μl取り出して、スポッティング用ロボット(日本レーザー電子(株)、GTMAS Stamp−2)を用い、図3で示すS12、S13、S20、S21サブブロック全ての凸部上面にDNAのスポットを行った。 Then, these mixed solution approximately 40μl extraction, spotting robot (Nippon Laser Electronics (Ltd.), GTMAS Stamp-2) used, in S12, S13, S20, S21 subblock all convex upper surface shown in FIG. 3 the DNA of the spot were carried out. 次いで、基板を密閉したプラスチック容器入れて、37℃、湿度100%の条件で20時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。 Then placed a plastic sealed containers substrate, 37 ° C., and incubated for 20 hours approximately at a humidity of 100% and then washed with pure water.

参考例3(検体DNAの調製) Reference Example 3 (Preparation of specimens DNA)
検体DNAとして、上記DNA固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号4のDNA(968塩基)を用いた。 As sample DNA, using DNA (968 bases) of SEQ ID NO: 4 with the DNA-immobilized substrate capable of hybridizing nucleotide sequence. 調製方法を以下に示す。 The preparation method described below. 配列番号2と配列番号3のDNAを合成した。 Were synthesized DNA of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. これを純水にとかして濃度を100μMとした。 This is a concentration of 100μM and dissolved in pure water. 次いで、pKF3 プラスミドDNA(タカラバイオ(株)製品番号;3100)(配列番号5で表される塩基配列を有するDNA:2264塩基)を用意して、これをテンプレートとし、配列番号2および配列番号3のDNAをプライマーとして、PCR反応(Polymerase Chain Reaction)により増幅を行った。 Then, pKF3 plasmid DNA (Takara Bio Inc. product number; 3100) (DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 5: 2264 bases) are prepared, which was a template, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 of DNA as a primer, it was amplified by PCR reaction (Polymerase Chain reaction).

PCRの条件は以下の通りである。 The PCR conditions are as follows. すなわち、ExTaq 2μl、10×ExBuffer 40μl、dNTP Mix 32μl(以上はタカラバイオ(株)製 製品番号RR001Aに付属)、配列番号2で表される塩基配列を有するDNAの溶液を2μl、配列番号3で表される塩基配列を有するDNAの溶液を2μl、テンプレート(配列番号5で表される塩基配列を有するDNA)を0.2μlを加え、純水によりトータル400μlにメスアップした。 That, ExTaq 2μl, 10 × ExBuffer 40μl, dNTP Mix 32μl (or more supplied with the Takara Bio Co., Ltd. Product No. RR001A), a solution of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 2 [mu] l, SEQ ID NO: 3 2μl of a solution of DNA having the nucleotide sequence represented, template (DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5) was added to 0.2 [mu] l, was filled up to a total 400μl with pure water. これらの混合液を、4つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてPCR反応を行った。 These mixtures were divided into four micro tubes, PCR was carried out using a thermal cycler. これを、エタノール沈殿により精製し、40μlの純水に溶解した。 This was purified by ethanol precipitation, and dissolved in pure water 40 [mu] l. PCR反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したDNAの塩基長は、およそ960塩基であり配列番号4のDNA(968塩基)が増幅されていることを確認した。 Was confirmed by electrophoresis A part of the solution after the PCR reaction, the base length of the amplified DNA was confirmed that approximately 960 bases at and in SEQ ID NO: 4 DNA (968 bases) are amplified.

次いで、9塩基のランダムプライマー(タカラバイオ(株)製;製品番号3802)を6mg/mlの濃度に溶かし、上記のPCR反応後精製したDNA溶液に2μl加えた。 Then, 9 base random primers (manufactured by Takara Bio Inc., product number 3802) was dissolved in a concentration of 6 mg / ml, was added 2μl the DNA solution purified after the above PCR reaction. この溶液を100℃に加熱した後、氷上で急冷した。 The solution was heated to 100 ° C., and quenched on ice. これらにKlenow Fragment(タカラバイオ(株)製;製品番号2140AK)付属のバッファーを5μl、dNTP混合物(dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ2.5mM、dCTPの濃度は400μM)を2.5μl加えた。 These Klenow Fragment (manufactured by Takara Bio Inc., product number 2140AK) 5 [mu] l the included buffer, dNTPs mixture (dATP, dTTP, each concentration of dGTP is 2.5 mM, the concentration of dCTP is 400 [mu] M) was added 2.5μl the . さらに、Cy3−dCTP(アマシャムファルマシアバイオテク製;製品番号PA53021)を2μl加えた。 Furthermore, Cy3-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., product number PA53021) was added 2μl of. この溶液に10UのKlenow Fragmentを加え、37℃で20時間インキュベートし、Cy3で標識された検体DNAを得た。 The solution Klenow Fragment of 10U addition, incubated for 20 h at 37 ° C., to obtain a sample DNA labeled with Cy3. なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体DNAの長さには、ばらつきがある。 Note that the length of the sample DNA so using random primers during labeling, there are variations. 最も長い検体DNAは配列番号4のDNA(968塩基)となる。 The longest analyte DNA becomes DNA (968 bases) of SEQ ID NO: 4. なお、検体DNAの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、960塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。 Note that the solution is removed specimen DNA, was confirmed by electrophoresis, the strongest band in the vicinity corresponding to 960 base appeared, it was in a state in which took thin smear in the region corresponding shorter bases in length thereto. そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。 Then, which was purified by ethanol precipitation, and dried.

この標識化された検体DNAを、1重量%BSA(ウシ血清アルブミン)、5×SSC(5×SSCとはNaClを43.8g、クエン酸3ナトリウム水和物を22.1gの純水にとかし、200mlにメスアップしたもの。またNaClを43.8g、クエン酸3ナトリウム水和物を22.1g純水にとかし、1lにメスアップしたものを1×SSCと表記し、これの10倍濃縮液を10×SSC、5倍希釈液を0.2×SSCと表記する。)、0.1重量%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.01重量%サケ精子DNAの溶液(各濃度はいずれも終濃度)、800μlに溶解し、ハイブリダイゼーション用の検体溶液とした。 The labeled analyte DNA, dissolved 1 wt% BSA (bovine serum albumin), 5 × SSC (5 × SSC and 43.8g of NaCl is trisodium citrate hydrate in pure water 22.1g , those that have been measured up to 200 ml. the 43.8g of NaCl, was dissolved trisodium citrate hydrate 22.1g deionized water, those measured up to 1l denoted as 1 × SSC, which the 10-fold concentrated liquid a 10 × SSC, 5-fold dilutions referred to as 0.2 × SSC.), 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulphate), none of the solution (each concentration of 0.01 wt% salmon sperm DNA final concentration), was dissolved in 800 [mu] l, and a sample solution for hybridization.

実施例1 Example 1
基板1に図8で示すPMMAのカバーを両面テープ(日東電工製、No.535A)で貼り付けた。 The cover of PMMA shown in the substrate 1 in FIG. 8 double-sided tape (Nitto Denko, No.535A) was affixed by. その結果、凸部上面とカバー下面との間のスペースは100μm程度となった。 As a result, the space between the protrusion upper surface and cover the lower surface was approximately 100 [mu] m.

次いで、直径180μmのジルコニア製ビーズ(東レ製)をカバーの穴から入れたところ特に問題なく入れることが可能であり、このビーズはブロック領域の間に充填することが可能であった。 Then, it is possible to put without any particular problem was put zirconia beads having a diameter of 180μm (manufactured by Toray) from the hole of the cover, the bead was able to fill between the block area. このビーズを80mg充填した。 The beads were 80mg filling. 次いで、検体溶液180μLをカバーの穴から、マイクロピペットを用いて注意深く注入した。 Then, through a hole in the cover sample solution 180 [mu] L, it was injected carefully using a micropipette. さらに検体溶液の蒸発などを防ぐため、粘着テープによりカバーの穴を塞いだ。 To further prevent such evaporation of the sample solution, it closes the hole in the cover by adhesive tape. カバーに液面駐止チャンバーがあるために、毛細管現象などによる不具合が起きることなく、検体溶液のシーリングが可能であった。 Because of the liquid level parking stop chamber cover, without trouble occurs due to the capillary phenomenon, it was possible to seal in the sample solution.

次いで、この基板をハイブリダイゼーション用のチャンバー((株)カケンジェネティック製)に入れ、このチャンバーを振とう機(アズワン製、SRR−3、公転時の半径3cm)に貼り付け、250rpmで回転振とうをしつつ、42℃で16時間インキュベートした。 Then, put this substrate into the chamber for hybridization (Co. family constitution Ltd. Genetics), this chamber a shaker affixed to a (AS ONE manufactured, SRR-3, the radius 3cm during revolution), rotary shaking at 250rpm It was while and incubated for 16 hours at 42 ° C.. インキュベート後カバーを取り除き、洗浄を行った後、DNAチップ用のスキャナー(Axon Instruments社のGenePix 4000B)に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力33%、フォトマルチプライヤーの電圧設定を500にした状態で測定を行った。 Remove the incubation rear cover, after washing, to set the carrier after the treatment to the scanner (Axon Instruments, Inc. of GenePix 4000B) for a DNA chip, and a laser output of 33%, the voltage setting of the photomultiplier 500 It was measured in the state. 各スポットのシグナル値を平均したものと、それらのCV値とを表1に示す。 To that average signal value for each spot, and their CV values ​​shown in Table 1.

実施例2 Example 2
振とう機をEYELA製、MULTI SHAKER MMS(公転時の半径2.5cm)とし、250rpmで回転振とうをした以外は、実施例1と同様の操作を行った。 Shaker EYELA made, the MULTI SHAKER MMS (radius 2.5cm at revolution), except that the shaking rotation at 250 rpm, was carried out in the same manner as in Example 1. その結果を表1に示す。 The results are shown in Table 1.

実施例3 Example 3
基板2を使用した以外は実施例1と同様な操作を行った。 Except for using the substrate 2 was subjected to the same procedure as in Example 1. ただし、この場合は、カバーと基板との間に直径180μmのビーズが引っかかることがあり、実施例1に比較しビーズの動きが悪かったが、ブロック領域の間にビーズを充填することは可能であった。 However, in this case, may beads having a diameter of 180μm between the cover and the substrate are caught, but was bad motion compared to Example 1 beads, it is possible to fill the beads between the block region there were.
実施例1と同様にハイブリダイゼーションを行い、シグナル強度とCV値とを測定した結果を表1に示す。 Similarly Hybridizations are carried out as in Example 1, shows the results of measuring the signal intensity and the CV value in Table 1.

比較例1 Comparative Example 1
実施例1の振とう機の振とうモードを切り替え、往復振とう、8の字振とうとした以外は、実施例1と同様の操作を行った。 Switch the shaking mode shaker in Example 1, reciprocal shaking, except for using shaking figure eight, it was subjected to the same procedure as in Example 1. その結果を表2に示す。 The results are shown in Table 2. また、作製したチップをローテーターに貼り付け、鉛直面内で回転させるようにし、重力によりビーズを移動させた場合の結果、および、溶液の撹拌を行わなかった場合の結果も表2に示す。 Also, paste chip prepared in a rotator, so as to rotate in a vertical plane, the result of the case of moving the beads by gravity, and also results in the case where not performed stirred solution shown in Table 2.

図1は、凹凸部を有する担体の一例を模式的に示す斜視図である。 Figure 1 is a perspective view schematically showing an example of a carrier having a concavo-convex portion. 図2は、図1の担体の矢印A1に沿った面で切断した横断面図である。 Figure 2 is a cross-sectional view taken along the plane along the arrow A1 of the carrier of Figure 1. 図3は、複数のサブブロック領域からなる担体の一例を表面上方より見た概略図である。 Figure 3 is a schematic view as seen from above the surface of an example of a carrier comprising a plurality of sub-block regions. 図4は、図3に例示される選択結合性物質固定化担体の縦断面図である。 Figure 4 is a longitudinal sectional view of a selective binding substance-immobilized carrier illustrated in FIG. 図5は、図3に例示される選択結合性物質固定化担体の縦断面図である。 Figure 5 is a longitudinal sectional view of a selective binding substance-immobilized carrier illustrated in FIG. 図6は、本発明の選択結合性物質固定化担体を用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概略的に示す縦断面図である。 Figure 6 is a longitudinal sectional view schematically showing an example of a jig and a scanner reads the result of the reaction using a selective binding substance-immobilized carrier of the present invention. 図7は、分析用チップの一例を概略的に示す斜視図である。 Figure 7 is an example of the analysis chip is a perspective view schematically showing. 図8は、図7の分析用チップの縦断面図である。 Figure 8 is a longitudinal sectional view of the analysis chip of FIG.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1 担体10 凹部10A サブブロック領域間の凹部10B サブブロック領域内の凹部11 凸部12 選択結合性物質が固定化された領域(凹凸部) 1 carrier 10 recess 10A recess 11 protrusion 12 selective binding substance recess 10B sub-block area between the sub-block regions are immobilized region (uneven portion)
13 平坦部2 微粒子またはマイクロロッド3 カバー部材30 接着層31 空隙(空間) 13 flats 2 microparticles or rod 3 cover member 30 adhesive layer 31 void (space)
32 貫通孔33 液面駐止用チャンバー34 封止部材(テープ) 32 through-hole 33 liquid level parking sealing chamber 34 sealing member (tape)
35 担体とカバー部材との隙間40 マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ41 治具42 治具突き当て面43 対物レンズ44 レーザー励起光45 担体に固定化された選択結合性物質(DNA) 35 carrier and the spring 41 the jig 42 jig abutting surface 43 fixed to the objective lens 44 the laser excitation light 45 carriers for abutting the gap 40 microarrays jig and the cover member selective binding substance (DNA)
S1〜32、Sk、Sk+1 サブブロック領域 S1~32, Sk, Sk + 1 sub-block region

Claims (11)

  1. 担体上に、凹部及び凸部からなり複数の凸部がマトリクス状に配置された複数のサブブロック領域からなる凹凸部を有し、 隣接するサブブロック領域間の凹部の幅がサブブロック領域内の凹部の幅よりも広く、前記凹凸部のうち複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化されている担体を用いて、該担体に接触させた被検物質を含む溶液を撹拌するにあたり、前記被検物質を含む溶液に撹拌子を添加し、 該撹拌子は担体の前記凹部に移動可能に格納され、かつ、前記担体を略水平方向に公転させ前記撹拌子を前記凹部において移動させて溶液を撹拌させて、前記凸部の上面に固定化された選択結合性物質と被験物質とを相互作用させることを特徴とする、溶液の撹拌方法。 On a carrier, has an uneven portion in which a plurality of convex portions made from the concave portion and the convex portion includes a plurality of sub-block regions arranged in a matrix, the width of the recess between the adjacent sub-block area of the sub-block area wider than the width of the recess, when the selective binding substance on the upper surface of the plurality of convex portions of the concavo-convex portion with a carrier which is immobilized, is stirred a solution containing the test substance in contact with the carrier the added stirrer into a solution containing the test substance, the stirrer is movably stored in the recess of the carrier and moves in the recess of the stirrer substantially to revolve in a horizontal direction said carrier Te solution was stirred and characterized Rukoto to interact with the immobilized selective binding substance and a test substance on the top surface of the convex portion, the solution stirred for methods.
  2. 前記撹拌子が、微粒子またはマイクロロッドであることを特徴とする請求項1記載の溶液の撹拌方法。 The solution stirred method of claim 1, wherein the stirrer is a particulate or micro rod.
  3. 前記公転の回転数が、100rpmから500rpmである請求項1または2に記載の溶液の撹拌方法。 The rotational speed of the revolution, stirring method solution according to claim 1 or 2 which is 500rpm from 100 rpm.
  4. サブブロック領域間の凹部の幅が、200μm以上であることを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 Width of the recess between the sub-block regions are stirred method solution according to any one of claims 1 to 3, characterized in that at 200μm or more.
  5. サブブロック領域内の凹部の幅が50〜400μmであって、サブブロック領域間の凹部の幅よりも狭いことを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 A width of the recess of the sub-block area is 50 to 400 [mu] m, stirring method solution according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the narrower than the width of the recesses between the sub-block regions.
  6. 前記凹凸部において、複数の凹部の深さを有することを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 In the uneven portion, stirred process solution according to any one of claims 1-5, characterized in that it has a depth of the plurality of recesses.
  7. 前記凹凸部において、隣接するサブブロック領域間の凹部の深さが、サブブロック領域内の凹部の深さよりもよりも深いことを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 In the uneven portion, a solution according to any one of claims 1 to 6, the depth of the recesses between adjacent sub block area, characterized in deeper than than the depth of the recess of the sub-block area the method of stirring.
  8. サブブロック領域間の凹部の深さが、凸部上面から凹部底面までの深さで100μm以上であることを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 Stirring method solution according to any one of claims 1 to 7, wherein the depth of the recesses between the sub-blocks area is 100μm or more in depth from the protrusion top surface to bottom surface of the recess.
  9. 前記選択結合性物質固定化担体の凹凸部を有する表面に、平坦部が設けられてなることを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 Stirring method solution according to any one of claims 1 to 8, wherein the surface having the concavo-convex portion of the selective binding substance-immobilized carrier, characterized by comprising a flat portion is provided.
  10. 前記担体を略水平方向に公転させる前に、カバー部材を前記担体の凹凸部を含む表面を覆いかつ前記担体と前記カバー部材との間に空隙を有するように接着することを特徴とする請求項1〜 のいずれか一項に記載の溶液の撹拌方法。 Claims, characterized in that the carrier prior to revolve substantially horizontal direction and bonded so as to have an air gap between the cover member covers the surface including an uneven portion of the carrier and said carrier and said cover member stirring method of the solution of any one of 1-9.
  11. 請求項1〜 10のいずれか一項に記載の撹拌方法を利用して、前記担体に被検物質を選択的に結合させ、前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする被検物質の分析方法。 Utilizing the stirring method according to any one of claims 1 to 10, wherein the carrier selectively to bind the test substance, the test bonded via the selective binding substance on the carrier method for analyzing a test substance, characterized by measuring the amount of substance.
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