JP4791867B2 - Detection method for analyte using noble metal-coated magnetic particles - Google Patents

Detection method for analyte using noble metal-coated magnetic particles

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JP4791867B2
JP4791867B2 JP2006085759A JP2006085759A JP4791867B2 JP 4791867 B2 JP4791867 B2 JP 4791867B2 JP 2006085759 A JP2006085759 A JP 2006085759A JP 2006085759 A JP2006085759 A JP 2006085759A JP 4791867 B2 JP4791867 B2 JP 4791867B2
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英夫 大門
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本発明は、貴金属コート磁性粒子を用いた被検物質の検出方法に関する。 The present invention is method of detecting an analyte about using noble metal-coated magnetic particles. より詳細には、 In more detail,
被検物質に結合可能な物質が固定化された貴金属コート磁性粒子を用いて、試料中の被検物質を検出する方法に関している。 Using noble metal-coated magnetic particles capable of binding substance is immobilized on the test substance is concerned with a method for detecting an analyte in a sample. また、本発明は、かかる検出方法に用いる検出キットにも関している。 The present invention also relates to a detection kit used in such detection methods.

抗体と抗原との組合せ又は生体レセプターとリガンドとの組合せ等の特異的相互作用を利用することによって、試料中に含まれる微量の被検物質を定量分析する方法は数多く知られている。 By utilizing specific interaction such as the combination of the combination or biological receptor and ligand antibody and antigen, a method for quantitatively analyzing an analyte traces contained in the sample are known numerous.

その中でも特に、抗原と抗体とが特異的に相互作用する「抗原抗体反応」を利用した免疫学的測定方法が広く利用されている。 Among them, an antigen and an antibody and is specifically interact immunological measurement method using "antigen-antibody reaction" is widely used. かかる免疫学的測定方法の1つに、Enzyme-linked immunosorbent assay法、即ちELISA法(「酵素免疫測定法」とも呼ばれる)がある。 One such immunoassay, Enzyme-linked immunosorbent assay method, i.e., (also called "Enzyme Immunoassay") ELISA method is. この手法は、被検物質を抗体で特異的・選択的に捕捉する手法であり、粗抽出のみで分析を行うことができる。 This technique is a technique that captures specifically, selectively a test substance with an antibody can be analyzed in crude extracts only. 従って、試料の精製に際して複雑な多くのステップを経る必要がなく、また、微量な被検物質であっても、ほとんどの場合、水、リン酸バッファーまたはメタノール等で抽出することができ、培養液を試料として直接用いることができる。 Therefore, it is not necessary to go through a complex number of steps during the purification of the sample, also be a small amount of test substance, in most cases, can be extracted with water, phosphate buffer or methanol and the like, the culture liquid it can be used directly as a sample. ELISA法は、その簡便さゆえに、臨床診断の分野で最も用いられており、昨今注目を浴びているPCR法やDNAチップを用いた分析よりも長い歴史と数多くの実績を有している。 ELISA method is its simplicity because has most used is in the field of clinical diagnosis, and a large number of achievements and long history than analysis using the PCR method, DNA chip has attracted a recent attention.

かかるELISA法の1つにサンドイッチELIZA法がある。 One such ELISA method there is a sandwich ELIZA method. サンドイッチELIZA法では、プレート上に固定化された抗体aと、試料中の抗原と、酵素を予め結合させた別の抗体b(「抗体b」を「抗体酵素複合体」とも呼ぶ)とによって、固定化抗体a−抗原−抗体bから成るサンドイッチ構造を構築している。 By a sandwich ELIZA method, the antibody a immobilized on the plate, and the antigen in the sample, and another antibody which is pre-bound enzyme b ( "antibody b" also referred to as "antibody-enzyme complex"), immobilized antibody a- antigen - are building a sandwich structure consisting of an antibody b. ここで、試料中に抗原が含まれていない場合、抗体bは捕捉・結合すべき抗原がないために残存し、プレートの洗浄によって、抗体bがプレート上から除去されることになる。 Here, if the sample contains no antigen, antibody b is remained due to the lack of antigen to be captured and bound, by washing of the plates, so that the antibody b is removed from the plate. 即ち、試料中に抗原が存在すれば、固定化抗体a−抗原−抗体bから成るサンドイッチ構造が構築される一方、試料中に抗原がなければ、抗体bが残存し、かかる抗体bがプレートから除去されることになる。 That is, if there is antigen in the sample, the immobilized antibody a- antigen - While the sandwich structure is constructed consisting of an antibody b, if there is no antigen in the sample, the antibody b is left, such antibodies b from the plate It will be removed. このような原理を利用すると、試料中の抗原量の違いによって、プレート上に留まる酵素量(即ち、「抗体bに結合している酵素の量」)に差が生じることになる。 Utilizing this principle, the difference amount of antigen in the sample, the amount of enzyme to remain on the plate (i.e., "the amount of enzyme bound to the antibody b") so that the difference in results. 従って、最終的には、プレート上に留まった酵素を発色させると、抗原の有無を判別したり、抗原量を求めたりすることができる。 Therefore, in the end, when the color is developed an enzyme remained on the plate, or to determine the presence or absence of an antigen or can be obtained the amount of antigen.

しかしながら、かかるサンドイッチELIZA法では、通常用いられる酵素が無色であるために、酵素のみでは呈色を確認することができず、酵素を発色させるべく発色基質が別途必要となってくる。 However, in such sandwich ELIZA method for enzymes conventionally used is colorless, the only enzyme can not confirm the color, chromogenic substrate in order to develop the enzyme becomes separately needed.

サンドイッチELIZA法の類似法として、金コロイドを用いたサンドイッチイムノアッセイ法がある。 As a similar method sandwich ELIZA method, a sandwich immunoassay method using a gold colloid. かかるサンドイッチイムノアッセイ法は、上述の酵素の代わりに金コロイドを用いている。 Such sandwich immunoassay uses a gold colloid instead of the above enzyme. つまり、サンドイッチELIZA法の抗体酵素複合体(即ち「抗体b」)の代わりに、「抗体金コロイド複合体」を用いている。 That is, instead of the antibody-enzyme conjugate sandwich ELIZA method (i.e. "antibody b"), is used to "antibody gold colloidal complex". この場合、プレート上に固定化された抗体a'と、試料中の抗原と、金コロイドを予め結合した別の抗体b'(「抗体b'」を「抗体金コロイド複合体」)とが、固定化抗体a'−抗原−抗体b'のサンドイッチ構造を構築することになる。 In this case, 'and, the antigen in the sample, the gold colloid another antibody b previously bound to' antibodies a immobilized on the plate ( "antibody b '" and "antibody gold colloidal complex"). However, immobilized antibody a'- antigen - will build a sandwich structure of an antibody b '. サンドイッチELIZA法と同様に、試料中に抗原が存在すれば固定化抗体a'−抗原−抗体b'から成るサンドイッチ構造が構築される一方、試料中に抗原がなければ、抗体b'が残存し、かかる抗体b'がプレートから除去されることになる。 Like the sandwich ELIZA method, the immobilized antibody a'- antigen if present antigen in the sample - 'While sandwich structure consisting of is constructed, if there is no antigen in a sample, antibody b' antibody b remained in , so that such antibodies b 'is removed from the plate. 従って、試料中の抗原量の違いに応じて、プレート上に留まる金コロイド量(即ち、「抗体b'に結合している金コロイドの量」)に差が生じることになる。 Therefore, depending on a difference amount of antigen in the sample, the colloidal gold amount to remain on the plate (i.e., "the amount of colloidal gold bound to the antibody b '") so that the difference in results. 上述のサンドイッチELIZA法の場合は、最後に発色基質を加え、酵素量に応じた発色によって試料中の抗原量を定量するが、サンドイッチイムノアッセイ法の場合は、発色基質を加えずに、プレート上に留まる金コロイドの量に応じた金自体の呈色の違いで、試料中の抗原量を定量することができる。 For the above-mentioned sandwich ELIZA method, finally the chromogenic substrate is added, but to determine the antigen amount in the sample by color corresponding to the amount of enzyme, in the case of a sandwich immunoassay, without the addition of chromogenic substrate, on the plate in color difference gold itself in accordance with the amount of gold colloid to stay, it is possible to determine the antigen amount in the sample. 従って、金コロイドを用いたサンドイッチイムノアッセイ法は、発色基質の添加操作を省ける点でサンドイッチELIZA法よりも簡便な方法といえる。 Thus, a sandwich immunoassay method using a gold colloid, it can be said that a simpler method than a sandwich ELIZA method in that Habukeru the addition operation of a chromogenic substrate.

サンドイッチイムノアッセイ法では、金コロイドの大きさに応じて、紫色、茶褐色といった可視領域の呈色を金コロイド自体から確認することができる。 In a sandwich immunoassay, in accordance with the size of colloidal gold, purple, the color of the visible region such brown can be confirmed from the colloidal gold itself. 金コロイドが抗体を結合する担体として用いられている別の理由は、金コロイドでは、抗体金コロイド複合体を容易に調製できるからである。 Another reason for the gold colloid is used as a carrier to bind the antibody, the colloidal gold, because the antibody gold colloidal complex can be readily prepared. 金と硫黄原子との間では、金属−硫黄結合に起因して、硫黄原子が金に化学吸着する性質がある。 Between the gold and sulfur atom, a metal - due to sulfur bond, a sulfur atom the property of chemically adsorbed gold. そのため、抗体の硫黄原子と金との結合に起因して、抗体金コロイド複合体を容易に構築することが可能である。 Therefore, due to the binding of the sulfur atom and gold antibody, it is possible to easily construct the antibody gold colloidal complex. なお、抗体が硫黄原子を含んでいない場合には、チオールやチオエーテルで抗体を修飾することによって、抗体に硫黄原子を導入することができる。 In the case where the antibody does not contain a sulfur atom, by modifying the antibody with a thiol or thioether, it can be introduced sulfur atom to the antibody.

このように金コロイドを用いた方法は利点があるものの、サンドイッチイムノアッセイ法で用いられる金コロイドは非磁性であるために、「抗体金コロイド複合体」を調製する点で必ずしも好都合であるとは言えなかった。 Although this way the method using gold colloid is advantageous, since gold colloid used in a sandwich immunoassay method is non-magnetic, said to be necessarily advantageous in terms of preparing the "antibody gold colloidal complex" There was no. 具体的には、金コロイドと抗体とを結合させる工程の後に、金コロイドに結合しなかった余分な抗体を除去する精製操作が必要となるが、かかる精製操作を遠心分離操作やフィルター操作で行っており、それらの操作自体が工程全体を自動化する上で好ましくなかった(特許文献1参照)。 Specifically, after the step of bonding the gold colloid antibody, purification procedures to remove excess antibody not bound to colloidal gold but is required, subjected to such a purification by centrifugation and filtering and which was not preferable in terms of their operation itself is to automate the entire process (see Patent Document 1).

その一方で、金コロイドの代わりに磁性微粒子を用いる手法も提案されている(特許文献2参照)。 On the other hand, methods using magnetic particles instead of the colloidal gold has also been proposed (see Patent Document 2). 提案されている手法では、磁場を加えて磁性微粒子を移動させることを通じて、試料中の被検物質を定量している。 In the proposed technique, through moving the magnetic particles by adding a magnetic field, and quantify the analyte in the sample. しかしながら、かかる手法では、高分子物質で被覆された磁性微粒子の表面に対して、被検物質に特異的に結合可能な物質(以下「特異的結合物質」とも呼ぶ)を固定化している。 However, in such method, to the surface of the magnetic fine particles coated with a polymer material, it is immobilized specifically bindable substance to the test substance (hereinafter also referred to as "specific binding substance"). そのため、疎水性の抗体等の特定の特異的結合物質は磁性微粒子に容易に固定化できるものの、それ以外のほとんどの特異的結合物質は磁性微粒子に直接固定化させることが難しい。 Therefore, although certain specific binding substance such as a hydrophobic antibody can readily be immobilized to magnetic particles, most of the specific binding substances other than it is difficult to directly immobilized on magnetic microparticles. なぜなら、そのような特異的結合物質には、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基又はそのような官能基の誘導体が含まれており、それらを磁性微粒子に直接結合させることができないからである。 This is because, such a specific binding substance, a thiol group, contains sulfide functional groups or derivatives of such functional groups such as a thioether group or disulfide group, it is bonded them directly to magnetic microparticles it can not be. この場合、磁性粒子表面を官能基で修飾する必要があり、そのような官能基または架橋試薬を選択する点で煩雑な作業を伴っていた。 In this case, it is necessary to modify the surface of the magnetic particle with a functional group, was accompanied by such a functional group or complicated operations in terms of selecting a crosslinking reagent. また、磁性微粒子表面を、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基で修飾する場合、磁性粒子を被覆している高分子物質の点で制約を受け、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基以外の官能基などを有した架橋試薬が必要となる場合がある。 Furthermore, the magnetic microparticle surface, a thiol group, when modified with sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, constrained in terms of polymer material covering the magnetic particles, a thiol group, a thioether group or disulfide there are cases where the crosslinking reagent having a functional group, etc. other than sulfide functional group such as is required.
特許第3108115号公報 Patent No. 3108115 Publication 特開平9−229936号公報 JP-9-229936 discloses

本発明は、上記事情に鑑みて為されたものである。 The present invention has been made in view of the above circumstances. つまり、本発明の課題は、比較的短い時間で実施できる簡易な被検物質の検出方法を提供することである。 That is, an object of the present invention is to provide a method for detecting a simple test substance that can be implemented in a relatively short time.

上記課題を解決するため、試料中に含まれる被検物質を検出する方法であって、 To solve the above problems, a method of detecting an analyte contained in the sample,
(i)中央領域(コア領域)が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、被検物質に結合することが可能な物質aが外殻領域に固定化された磁性粒子を用意すると共に、被検物質に結合することが可能な物質bが固定化された部材、および、被検物質を含んで成る試料を用意する工程、 (I) a central region (core region) is formed of a magnetic material, a magnetic particle shell region is formed from a noble metal material, the material a outer shell region capable of binding to the analyte together to prepare an immobilized magnetic particles, member material b that is capable of binding to the analyte is immobilized, and a step of preparing a sample comprising an analyte,
(ii)磁性粒子および試料を部材に供給し、磁性粒子の物質aと部材の物質bとが被検物質を介して結合して形成された複合体を部材において得る工程、 (Ii) the magnetic particles and the sample was supplied to the member, and material b of the material a and the member of magnetic particles obtained in member complexes formed coupled to via the analyte process,
(iii)部材にて物質bが固定化されている領域の状態を測定する工程、ならびに (iv)測定した結果に基づいて、被検物質の有無または量を判断する工程を含んで成り、 Step in (iii) member material b to measure the state of the area being fixed, and based on (iv) the measured results, comprises the step of determining the presence, absence or amount of analyte,
工程(ii)の複合体の形成を磁場(または磁界)の影響下で行うことを特徴とする方法を提供する。 The complex formation step (ii) to provide a method and performing under the influence of a magnetic field (or magnetic field).

本発明の方法に用いられる磁性粒子は、中央領域が磁性材料から形成されると共に、外殻領域が貴金属材料から形成されている。 Magnetic particles used in the method of the present invention, together with the central region is formed of a magnetic material, the shell region is formed from a noble metal material. 従って、かかる磁性粒子は、貴金属材料が磁性材料を被覆した形態を有しているので、本明細書では磁性粒子を「貴金属コート磁性粒子」とも呼ぶ。 Therefore, such magnetic particles, because the noble metal material has a form coated with a magnetic material, referred to herein as magnetic particles as "noble-metal-coated magnetic particles." また、物質aおよび物質bは、被検物質に対して親和性を有する物質であり、被検物質と特異的に相互作用して結合する物質である。 Also, materials a and material b is a material having an affinity for the analyte is a substance that binds specifically interact with the analyte. 従って、本明細書では、物質aおよび物質bを「特異的結合物質」とも呼ぶ。 Accordingly, in the present specification, the material a and material b is also referred to as a "specific binding substance".

本明細書において「被検物質を検出する」とは、試料中に含まれる被検物質の有無を判断することのみならず、かかる被検物質の量を求めることも意味している。 As used herein, "detecting an analyte" includes not only determining the presence or absence of the test substance in the sample, and also means to determine the amount of such analyte. 本発明の方法では、工程(ii)で形成される複合体の量が、試料中に含まれる被検物質の量に実質的に対応または比例するため、かかる複合体の存否またはその量に基づいて、被検物質の有無または量を調べることができる。 In the method of the present invention, the amount of complex formed in step (ii) is, for substantially corresponding or proportional to the amount of analyte contained in a sample, based on the presence or amount of such complexes Te, it is possible to determine the presence or amount of analyte. 具体的には、部材において物質bが固定化されている領域の状態を測定する。 Specifically, to measure the state of the area material b is immobilized in member. つまり、複合体の存否または複合体の量に起因して、かかる領域の状態が変化するので(例えば「物質bが固定化されている領域の色が変化する」)、その状態を測定すると被検物質の有無または量を調べることができる。 That is, due to the presence or amount of the complex of the complex, and the state of such region is changed (e.g., "color areas material b is immobilized changes"), when measuring the state to be You can examine the presence or amount of analyte. なお、本明細書において「測定」とは、目視確認による測定のみならず、一般的な測定機器による測定をも意味している。 Note that the "measurement" in the present specification includes not only the measurement by visual observation, also means the measurement by common measuring device.

例えば、試料に含まれる被検物質が抗原(または抗体)であり、磁性粒子の物質aおよび部材の物質bが、その抗原に特異的に結合する抗体(または抗原)である場合には、いわゆる「抗原抗体反応」によって複合体が形成される。 For example, the test substance contained in the sample is an antigen (or antibody), material b substances a and member of magnetic particles, when an antibody (or antigen) which specifically binds to the antigen, so-called complex is formed by the "antigen-antibody reaction". このような「抗原抗体反応」を利用して複合体を形成する場合、本発明の被検物質の検出方法を特に「イムノアッセイ法」と呼ぶことができることを理解されよう。 When forming such complexes using "antigen-antibody reaction", it will be understood that it is possible to a method for detecting analyte present invention is particularly called as "immunoassay".

なお、本明細書において「固定化」とは、一般的に、磁性粒子または部材の表面付近に「被検物質に結合することが可能な物質a」または「被検物質に結合することが可能な物質b」が存在している態様を意味しており、必ずしも物質aが磁性粒子の表面に直接取り付けられている態様のみ、または、物質bが部材に直接取り付けられている態様のみを意味するものではない。 Note that "fixed" as used herein, generally, "material a capable of binding to a test substance" in the vicinity of the surface of the magnetic particles or members or "capable of binding to the analyte means a manner material b "exists such necessarily only aspects material a is attached directly to the surface of the magnetic particle, or refers only aspects material b is attached directly to the member not. また、本明細書において「磁性粒子の物質aと部材の物質bとが被検物質を介して結合して形成された」とは、磁性粒子の物質aおよび部材の物質bの両者が被検物質に結合していることを意味しており、磁性粒子(物質a)−被検物質−部材(物質b)から成るサンドイッチ構造が構築されることを実質的に意味している。 Further, in the present specification, "a substance b substances a and member of the magnetic particles are formed by bonding through a test substance", both substances b substances a and member of magnetic particles test it indicates that it is bound to a substance, magnetic particles (material a) - is substantially means that a sandwich structure comprising a member (material b) is constructed - analyte.

本発明の1つの特徴は、工程(i)で用いる磁性粒子が、その中央領域に磁性材料を含んでおり、磁性を帯びていることである。 One feature of the present invention, the magnetic particles used in step (i) is, includes a magnetic material in its central region, it is that they magnetized. 従って、工程(ii)で磁場を印加すると、磁性粒子の移動が促進され、より短い時間で複合体を形成することができる。 Therefore, when a magnetic field is applied in step (ii), the movement of the magnetic particles is promoted, it is possible to form a complex in a shorter time. 具体的には、部材の物質bが固定化されている領域の近傍に磁石を配置することによって、又は、そのような近傍に配置された電磁石に電流を流すことによって、「物質bが固定化されている領域」へと向かう磁性粒子の移動を促進させる。 Specifically, by placing a magnet in the vicinity of the region where the material b of the member is fixed, or by supplying a current to such an arrangement electromagnets in the vicinity, "substances b is fixed It is to promote the movement of the magnetic particles towards the in that region ".

本発明の別の特徴は、工程(i)で用いる磁性粒子が貴金属コートを有しているため、本発明の方法で用いる磁性粒子を容易に調製できることである。 Another feature of the present invention, since the magnetic particles used in step (i) has a noble metal coating is that the magnetic particles used in the methods of the present invention can be readily prepared. 具体的には、例えば物質aが硫黄原子を含んで成る抗体または抗原であると、その硫黄原子と磁性粒子(物質aが固定化されていない磁性粒子)の貴金属コートとが相互に容易に結合するので、工程(i)で用いる磁性粒子を比較的容易に調製することができる。 Specifically, the material a is an antibody or an antigen comprising a sulfur atom, and a noble metal coating is easily coupled to each other of the sulfur atoms and the magnetic particles (magnetic particles material a is not immobilized) since, it is relatively easy to prepare magnetic particles used in step (i).

また、この調製に際しては、磁性粒子が磁性を帯びているために、磁気分離操作で磁性粒子を比較的容易に回収することができることも本発明の特徴の1つである。 Also, in this preparation, since the magnetic particles are magnetized, it is also one of features of the present invention can be relatively easily recovered magnetic particles in the magnetic separation.

本発明の方法で用いる磁性粒子は、磁性を帯びているために、磁場の影響下で複合体の形成を実施すると、比較的短い時間で複合体を得ることができる。 Magnetic particles used in the methods of the invention, in order to have magnetized, when carrying out the formation of the complex under the influence of a magnetic field, it is possible to obtain the complex in a relatively short time. 従って、本発明の方法は、比較的短い時間で被検物質を検出することが可能である。 Thus, the method of the present invention, it is possible to detect an analyte in a relatively short time. また、本発明の方法で用いられる磁性粒子は、貴金属コートを有するために、検出に先立って行われる磁性粒子の調製が比較的容易である。 The magnetic particles used in the method of the present invention, in order to have a noble-metal-coated, the preparation of magnetic particles takes place prior to detection is relatively easy.

更に、本発明の方法では、磁性粒子の調製および被検物質の検出に際して、遠心分離操作やフィルター操作を行っていないため、全工程を自動化しやすい。 Further, in the method of the present invention, in the preparation and detection of analyte in the magnetic particles, because it does not go to centrifugal separation or filtering, easy to automate the entire process.

発明を実施するための形態 DESCRIPTION OF THE INVENTION

以下にて、本発明の被検物質の検出方法を詳細に説明する。 Below in, for explaining the method of detecting analyte present invention in detail. 図1Aに本発明の検出方法のフローチャートを示す。 It shows a flowchart of a detection method of the present invention in FIG. 1A.

まず、工程(i)においては、図1Bに示すように、中央領域2が磁性材料から形成され、外殻領域3が貴金属材料から形成されている磁性粒子1であって、被検物質7に結合することが可能な物質a(符号4)が外殻領域3に固定化された磁性粒子1を用意する。 First, in the step (i), as shown in FIG. 1B, the central region 2 is formed of a magnetic material, the shell region 3 a magnetic particle 1 is formed from a noble metal material, the test substance 7 capable substance binding to a (reference numeral 4) is prepared magnetic particles 1 immobilized to the outer shell region 3. また、被検物質7を含んで成る試料7'を用意すると共に、被検物質7に結合することが可能な物質b(符号5)が固定化された部材6も用意する。 Further, the prepared samples 7 'comprising the test substance 7, substances capable of binding to a test substance 7 b (reference numeral 5) is also prepared member 6 immobilized.

《磁性粒子について》 "For the magnetic particles"
工程(i)で用意される磁性粒子は、中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている。 Magnetic particles prepared in step (i), the central region is formed of a magnetic material, the shell region is formed from a noble metal material. 中央領域の磁性材料は、磁性を有する材料であれば、いずれの種類の材料でもよい。 Magnetic material in the central region, as long as the material has a magnetic, may be any type of material. 磁性材料としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の金属、または、そのような金属を少なくとも含む合金を挙げることができる他、酸化鉄およびイットリウム鉄ガーネット等も挙げることができる。 The magnetic material such as iron, cobalt, nickel, etc., or other that may be mentioned at least an alloy containing such metals, may also be mentioned iron oxide and yttrium iron garnet. 磁性粒子が強磁性体から成ると、飽和磁化が大きく磁気分離操作において捕集性に優れる利点がもたらされる。 When the magnetic particles comprise a ferromagnetic material, which provides the advantage of excellent scavenging in the saturation magnetization is large magnetic separation. また、磁性粒子が超常磁性体から成ると、強磁性体ほど飽和磁化が大きくないが、磁場のない状態では磁化がなく、磁性粒子が凝集しにくい利点がもたらされる。 Further, when the magnetic particles comprise superparamagnetic, but not large saturation magnetization as ferromagnetic, no magnetization in the absence of magnetic field, the magnetic particles results in advantages not easily aggregate. 従って、本発明では、強磁性体または超常磁性体から成る磁性材料で中央領域が形成されていることが好ましい。 Accordingly, in the present invention, it is preferable that the central area of ​​a magnetic material made of a ferromagnetic material or superparamagnetic material is formed. 強磁性体としては、例えばマグヘマイト(γ-酸化鉄)、マグネタイト、ニッケル亜鉛フェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等を挙げることができ、超常磁性体としては、例えばマグヘマイト(γ-酸化鉄)、マグネタイト、ニッケル亜鉛フェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等の超微粒子を挙げることができる。 The ferromagnetic, for example maghemite (.gamma.-iron oxide), magnetite, can be mentioned nickel zinc ferrite or manganese zinc ferrite, as the superparamagnetic, for example maghemite (.gamma.-iron oxide), magnetite, nickel-zinc mention may be made of ferrite or ultra-fine particles such as manganese zinc ferrite.

磁性粒子に外殻領域に含まれる貴金属材料は、一般的な貴金属材料であれば特に制限はないが、金、白金、銀、または、これらの合金などが好ましく、それらの混合物であってもよい。 Noble metal material included in the shell region to the magnetic particles is not particularly limited as long as it is a common noble metal material, gold, platinum, silver, or the like are preferable alloys, or may be a mixture thereof .

工程(i)で用いる磁性粒子は、好ましくは5nm〜100μmの平均粒径を有していることが好ましい。 Magnetic particles used in step (i), it preferably has an average particle size of 5Nm~100myuemu. なぜなら、磁性粒子の平均粒径が5nmよりも小さくなると磁性粒子の集磁性が悪くなる一方、磁性粒子の平均粒径が100μmよりも大きくなると磁性粒子の分散性が悪くなるからである。 This is because, while the average particle diameter of the magnetic particles is poor current magnetism of smaller becomes the magnetic particles than 5 nm, since dispersibility of the magnetic particles the average particle diameter of the magnetic particles is larger than 100μm is deteriorated. 特に20nm〜10μmの平均粒径が好ましい。 In particular an average particle size of 20nm~10μm is preferred. ここでいう「平均粒径」は、物質aが固定化されていない状態の磁性粒子の直径を意味している。 Here, the "average particle diameter" means the diameter of the magnetic particles in a state in which material a is not immobilized. また、本明細書において「平均粒径」とは、例えば、電子顕微鏡や光学顕微鏡等で拡大した画像から100個の粒子を無作為に選択し、それぞれの粒子について直径を読み取り、これらを平均することによって求めた場合の粒径をいう。 Further, the "average particle diameter" in the present specification, for example, a hundred particles magnified images under an electron microscope or an optical microscope or the like randomly selected, reads the diameter for each particle and averaging them It refers to the particle size of the case, which was determined by. ただし、直径が均一でない場合には、最大径と最小径を求めて平均したものを、各粒子の直径とする。 However, when the diameter is not uniform, the one obtained by averaging seeking maximum diameter and the minimum diameter, the diameter of each particle. なお、かかる磁性粒子の好ましい粒径は、被検物質または磁性粒子自体の形状および種類などに応じて変わり得ることを理解されよう。 A preferable particle size of such magnetic particles, it will be understood that may vary depending on the analyte or magnetic particles themselves shape and type.

工程(i)で用いる磁性粒子の磁気特性としては、保磁力が0kA/m〜280kA/m(0エルステッド〜3500エルステッド)の範囲を有し、飽和磁化が0.5A・m /kg〜100A・m /kg(0.5emu/g〜100emu/g)の範囲を有するものが好ましい。 Step The magnetic characteristics of the magnetic particles used in (i), the coercive force has a range of 0kA / m~280kA / m (0 Oe to 3500 Oe), saturation magnetization 0.5A · m 2 / kg~100A · m having a range of 2 /kg(0.5emu/g~100emu/g) are preferred. これにより、磁場(または磁界)に対する磁性粒子の応答性が実用上十分となる。 Thus, the response of the magnetic particles becomes practically sufficiently to the magnetic field (or magnetic field). 但し、磁性粒子の中央領域の磁性材料が金属鉄である場合には、保磁力が8.0kA/m〜71.7kA/m(100エルステッド〜900エルステッド)の範囲を有し、飽和磁化が60A・m /kg〜160A・m /kg(60emu/g〜160emu/g)の範囲を有するものが実用上好ましい。 However, if the magnetic material in the central region of the magnetic particles are metallic iron, the coercive force has a range of 8.0kA / m~71.7kA / m (100 Oe to 900 Oe), saturation magnetization 60A · m having a range of 2 / kg~160A · m 2 / kg (60emu / g~160emu / g) is preferable for practical use. なお、保磁力は大きすぎると磁性粒子の凝集性が必要以上に大きくなり、複合体の均一な形成に影響を及ぼす一方、保磁力が小さすぎると磁性粒子が磁場の影響を受けなくなるので、より好ましい保磁力は0kA/m〜71.7kA/mであり、更に好ましい保磁力は0.8kA/m〜15.92kA/mである。 Incidentally, the coercive force is increased to more than necessary cohesiveness of too large magnetic particles, whereas affect uniform formation of the complex, since the magnetic particles if the coercive force is too small is not affected by the magnetic field, and more preferred coercivity is 0kA / m~71.7kA / m, more preferred coercivity is 0.8kA / m~15.92kA / m.

磁性粒子に固定化されている物質aは、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることが好ましい。 Material a that is immobilized to the magnetic particles is preferably mutually at one of the antibodies and antigen having specific binding. 物質aは、相互に特異的結合性を有する生体レセプターおよびリガンドのいずれか一方であってもよい。 Material a are mutually may be either one of the bio-receptors and ligands having specific binding. また、被検物質がヌクレオチド鎖の場合には、物質aが、そのヌクレオチド鎖と相補的なヌクレオチド鎖であってもよい。 Further, when the analyte is a nucleotide chain, material a may be a complementary nucleotide strand and its nucleotide chain.

例えば、被検物質が抗原の場合には物質aは抗体となり、被検物質が抗体の場合には物質aは抗原となる。 For example, material a becomes antibody when the analyte is an antigen, material a if the test substance is an antibody is an antigen. 同様に、被検物質が生体レセプターである場合には物質aはリガンドとなり、被検物質がリガンドの場合には物質aが生体レセプターとなる。 Similarly, material a if the test substance is a biological receptor becomes a ligand, material a if the test substance is a ligand is a biological receptor. 物質aに用いる代表的な抗体または抗原としては、例えば抗インフルエンザウィルス抗体、インフルエンザウィルス抗原、心筋トロポニンT、抗心筋トロポニンT抗体等を挙げることができる。 Representative antibody or antigen used in the materials a, it may be mentioned for example anti-influenza virus antibody, an influenza virus antigen, cardiac troponin T, the anti-cardiac troponin T antibody or the like. また、物質aに用いる代表的な生体レセプターまたはリガンドとしては、例えばLDL、LDLレセプター、インスリン、インスリンレセプター等を挙げることができる。 Further, typical bio-receptors or ligands used for materials a, can be, for example, LDL, LDL receptor, insulin, insulin receptor, and the like. なお、「抗体・抗原」および「生体レセプター・リガンド」という用語は、あくまでも相互に特異的に結合する物質の組合せを実質的に意味しているので、物質によっては「抗体・抗原の組合せ」に属するだけでなく「生体レセプター・リガンドの組合せ」にも属するものがあり得ることに留意されたい。 Incidentally, the term "antibody-antigen" and "biological receptor ligand", merely because another is substantially means a combination of substances which specifically bind, by material "combination antibody-antigen" it should be noted that there may be things that also belong to the "combination of biological receptor-ligand" not only belongs.

工程(i)で用意する磁性粒子には上述の物質aが固定化されているが、かかる固定化には公知の物理的吸着法または化学的吸着法を利用することができる。 Although the magnetic particles prepared in step (i) above material a is immobilized, for such immobilization can be a known physical adsorption or chemical adsorption. 例えば、物質aが依然固定化されていない貴金属コート磁性粒子(以下「磁性粒子p」と呼ぶ)と物質aとを緩衝液等の溶液中または有機溶剤中で数秒〜数日ほど混合させると、物質aと磁性粒子pとが吸着反応を起こすので、物質aを磁性粒子pに固定化させることができる。 For example, when mixing a few seconds to several days in the noble metal-coated magnetic particles material a is not still immobilized (hereinafter referred to as "magnetic particle p") and a solution such as a buffer solution and a material a or in an organic solvent, since the material a and the magnetic particles p causes an adsorption reaction, thereby fixing the material a magnetic particle p. 用いる緩衝液または有機溶剤としては、例えばPBS緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトン、ピリジン、トルエン、酢酸エチル、ヘキサン、エタノール、メタノール、クロロホルムまたはフェノールなどが挙げられる。 As the buffer solution or an organic solvent is used, for example, PBS buffer, HEPES buffer, phosphate buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, acetone, pyridine, toluene, ethyl acetate, hexane, ethanol, methanol, chloroform or phenol. また、例えば、コアセルべーション法のように、緩衝液等の溶液中または有機溶剤中で物質aと磁性粒子pとを接触させると、磁性粒子pの表面に物質aが析出するので、物質aを磁性粒子pに固定化することができる。 Further, for example, as coacervation method, when contacted to the material a magnetic particle p solution such as a buffer solution or in an organic solvent, since material a is deposited on the surface of the magnetic particles p, material a it can be immobilized on magnetic particles p.

なお、多くの抗体は(例えば蛋白質)は、その分子中にチオール基、チオエーテル基またはジスルフィド基等の硫化物官能基を有している。 Incidentally, many of the antibodies (e.g., protein) thiol group, and a sulfide functional groups such as a thioether group or a disulfide group in its molecule. 抗体の硫黄原子と貴金属材料とは結合し易いので、磁性粒子pに特別な前処理を施すことなく、磁性粒子pと抗体とを接触させることによって、抗体を磁性粒子pに直接固定化させることができる。 Since easily bonded to a sulfur atom and the noble metal material of the antibody, without performing any special pre-treatment to the magnetic particle p, by contacting the magnetic particles p and antibodies, be directly immobilized antibody magnetic particle p can.

物質aが固定化された磁性粒子は、緩衝液等の溶液中または有機溶剤中に存在した状態で得られるが、かかる溶液中または溶剤中には、固定化しなかった物質a等の余分な物質または成分が含まれ得る。 Magnetic particles material a is immobilized is obtained in a state of being present in solution or in an organic solvent such as a buffer solution, according to the solution or in a solvent, excess of material a such not immobilized substance or it may contain ingredients. 従って、後記で詳細に説明するが、磁気分離操作を用いて、「物質aが固定化された磁性粒子」を精製する。 Thus, although described in detail below, using a magnetic separation operation to purify the "magnetic particles material a is immobilized."

このようにして本発明の検出方法で用いる磁性粒子を得ることができるが、得られた磁性粒子は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等の溶媒中に分散させた状態で使用されることが好ましい。 This way it is possible to obtain the magnetic particles used in the detection method of the present invention, the resulting magnetic particles, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, PBS buffer, HEPES buffer, buffers such as MOPS buffer or TBS buffer, saline, deionized water, is preferably used in a dispersed state in a solvent such as sterile water or ultrapure water.

《部材について》 "For members"
工程(i)で用意される部材には、物質bが固定化されている。 The member is prepared in step (i), material b is immobilized. 部材自体は、物質bを固定化できるものであれば、いずれの形状および構造でもよく、また、部材の材質も特に制限はない。 Member itself, as long as it can immobilize the material b, may be of any shape and structure, also, is not particularly limited material of member.

好ましい部材の1つの例は、プレート部材または容器である。 One example of a preferred member, a plate member or the container. かかる部材としては、例えばウェル、板状部材または球状部材等を挙げることができる。 Such member may include, for example, wells, the plate-like member or spherical member, and the like. このような場合、部材の材質は、ガラス、石英、酸化チタン、ITO、金、白金、銀等の無機材料、カーボンブラック、グラッシーカーボン、カーボンナノチューブ、フラーレン等の炭素材料、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、ニトロセルロース等の高分子材料等であることが好ましい。 In this case, the material of the member is a glass, quartz, titanium oxide, ITO, gold, platinum, an inorganic material such as silver, carbon black, glassy carbon, carbon nanotube, a carbon material such as fullerene, polystyrene, polyvinyl chloride, polyacrylate, polypropylene, nylon, polyester, polycarbonate, polymethacrylate, polyvinylidene fluoride, cellulose is preferably a polymeric material such as nitrocellulose. 部材がプレート部材または容器であると、部材の表面に物質bを固定化させることができる。 If member is a plate member or the container, it can be immobilized material b on the surface of the member.

また、好ましい部材の別の例は、多孔質または繊維質から成る部材である。 Another example of a preferred member is a member made of porous or fibrous. かかる部材としては、例えば、不織布、濾紙、高分子膜、多孔質膜またはプレート等を挙げることができる。 Such members include, for example, a nonwoven fabric, filter paper, polymer film, a porous membrane or a plate or the like. このような場合、多孔質または繊維質は、シリカ、アルミナ、ガラスウール、デキストラン、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、ニトロセルロース等の材料から形成されていることが好ましい。 In this case, porous or fibrous, silica, alumina, glass wool, dextran, polyvinylidene fluoride, cellulose, that are formed of a material such as nitrocellulose preferred. 多孔質または繊維質から成る部材では、部材自体が空隙を有する構造であるので、部材の内部領域に物質bを固定化させることができる。 The member consisting of a porous or fibrous, the member itself is a structure having voids, it can be immobilized material b the interior region of the member.

工程(i)で用意する部材には、部材の表面または内部領域に磁性粒子(具体的には「溶媒に分散した状態で存在する磁性粒子」)および/または液状の試料が流れる流路が設けられていることが好ましい。 The members provided in process step (i), a flow path through which sample and / or liquid is provided ( "magnetic particles are present in a state of being dispersed in a solvent" in particular) on the surface or the interior region of the member the magnetic particles it is preferable to have been.

本発明では、部材の一部の表面または一部の内部領域にだけ物質bが固定化されたものが好ましい。 In the present invention, preference is given to those only material b is immobilized on a part of the surface or a portion of the interior region of the member. なぜなら、物質bが固定化された表面または内部領域の像と、物質bが固定化されていない表面または内部領域の像とを比較することができるからである。 This is because it is possible to compare the image of the surface or interior region material b is immobilized, and an image of the surface or interior region material b is not immobilized. これにより、「陽性」と「陰性」との判別、即ち、試料中の被検物質の有無の判断が容易となる。 Thus, discrimination between the "positive", "negative", i.e., it is easy to determine the presence or absence of the analyte in the sample.

部材に固定化されている物質bは、物質aと同様、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることが好ましい。 Material b that is immobilized member, like the material a, is preferably mutually at one of the antibodies and antigen having specific binding. 物質bは、物質aと同様、相互に特異的結合性を有する生体レセプターおよびリガンドのいずれか一方であってもよい。 Material b, like substances a, another may be either one of the bio-receptors and ligands having specific binding. 更には、被検物質がヌクレオチド鎖の場合には、物質bが、そのヌクレオチド鎖と相補的なヌクレオチド鎖であってもよい。 Furthermore, when the analyte is a nucleotide chain, material b may be a complementary nucleotide strand and its nucleotide chain.

物質aと同様、例えば、被検物質が抗原の場合には物質bは抗体となり、被検物質が抗体の場合には物質bは抗原となる。 As with materials a, for example, material b becomes antibody when the analyte is an antigen, substances b. If the test substance is an antibody is an antigen. 同様に、被検物質が生体レセプターである場合には物質bはリガンドとなり、被検物質がリガンドの場合には物質bが生体レセプターとなる。 Similarly, material b if the analyte is a biological receptor becomes a ligand, substance b if the test substance is a ligand is a biological receptor. 物質bに用いる代表的な抗体または抗原としては、例えば抗インフルエンザウィルス抗体、インフルエンザウィルス抗原、心筋トロポニンT、抗心筋トロポニンT抗体等を挙げることができる。 Representative antibody or antigen used in the material b, may include, for example anti-influenza virus antibody, an influenza virus antigen, cardiac troponin T, the anti-cardiac troponin T antibody or the like. また、物質bに用いる代表的な生体レセプターまたはリガンドとしては、例えばLDL、LDLレセプター、インスリン、インスリンレセプター等を挙げることができる。 Further, typical bio-receptors or ligands used for substance b, may include, for example, LDL, LDL receptor, insulin, insulin receptor, and the like. なお、物質aと物質bとは、同一の物質であってもよいし、別の物質であってもよいことに留意されたい。 Note that the material a and the material b, may be the same material, it should be noted that it may be another substance.

工程(i)で用意する部材には上述の物質bが固定化されているが、かかる固定化には公知の物理的吸着法、化学的吸着法、架橋試薬による化学的結合法、または、これらの手法の組合せを等も利用することができる。 Although the members prepared in step (i) above materials b is immobilized, known physical adsorption method for such immobilization, chemical adsorption method, a chemical binding method using a crosslinking agent, an or they such as a combination of techniques can be utilized.

例えば、物質bが依然固定化されていない部材(以下「未固定化部材」と呼ぶ)および物質bを緩衝液等の溶液中または有機溶剤中で数秒〜数日ほど浸すと、物質bと未固定化部材とが吸着反応を起こすので、物質bを未固定化部材に固定化させることができる。 For example, the material b is immersed as still (hereinafter referred to as "non-fixing member") member that is not immobilized and a solution of a substance b buffers and the like, or a few seconds to several days in an organic solvent, non-a substance b since the fixing member causes the adsorption reaction, it can be immobilized in the non-fixing member material b. 固定化後は、PBS緩衝液、リン酸緩衝液、アセトンもしくはエタノールなどの緩衝液または有機溶剤等で部材bを洗浄することが好ましい。 After immobilization, PBS buffer, phosphate buffer, it is preferred to wash the member b in buffer or organic solvents such as acetone or ethanol.

なお、「一部の表面または一部の内部領域にだけ物質bが固定化された部材」は、溶液、懸濁または分散させた物質bをスポッター等を用いてを部材に滴下することによって得ることができる。 Incidentally, "part of the surface or a portion of only the inner region material b is immobilized member" solution by the dropwise members by using a spotter or the like material b suspended or dispersed it is possible to obtain.

以下では、具体的な物質・官能基を挙げて、「未固定化部材に対する物質bの固定化」について詳細に説明する。 Hereinafter, by way of specific substances and functional groups will be described in detail "immobilized substance b for non immobilized member".

〈ヘテロ二価性架橋試薬を用いた固定化〉 <Immobilized using heterobifunctional cross-linking reagents>
ヘテロ二価性架橋試薬を用いることによって、化学的結合法で物質bを未固定化部材に固定化することができる。 By using a heterobifunctional cross-linking reagents can be immobilized in the non-fixing member material b in a chemical binding method. 「ヘテロ二価性架橋試薬」としては、 Examples of the "hetero-bifunctional crosslinking reagent"
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物と、 Thiol group, sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, iodoacetyl groups, acid chloride, a functional group or a functional group derivative or inorganic substances such as double bonds,
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物との組合せから成るヘテロ二価性架橋試薬が挙げられる。 Thiol group, sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, iodoacetyl groups, acid chlorides include heterobifunctional crosslinking reagents comprising a combination of a functional group or functional group derivative or inorganic substance such as a double bond.
なお、このようなヘテロ二価性架橋試薬を用いて、物質bを未固定化部材に固定化するには、「未固定化部材」自体が、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物質を有していることが好ましい。 Incidentally, with such a heterobifunctional crosslinking reagent, to immobilized Not fixing member material b is "not immobilized member" itself, a thiol group, a sulfide such as a thioether group or disulfide group functional group, an aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, a carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group , iodoacetyl groups, acid chlorides, preferably has a functional group or functional group derivatives or inorganic materials such as double bonds.
同様に、「物質b」には、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物質が含まれていることが好ましい。 Similarly, the "substance b", a thiol group, a sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, a carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, iodoacetyl groups, acid chlorides, contain functional groups or functional group derivatives or inorganic materials such as double bonds it is preferable to have.

上記のような未固定化部材および物質bをヘテロ二価性架橋試薬と接触・混合させることによって、ヘテロ二価性架橋試薬を介して、物質bを未固定化部材に固定化できる。 The non-immobilized member and material b as described above by contacting and mixing with the heterobifunctional cross-linking reagents, via a heterobifunctional crosslinking reagents can be immobilized in the non-fixing member material b. 例えば、まず、ヘテロ二価性架橋試薬と上記の未固定化部材とを緩衝液等の溶液中または有機溶媒中に浸すことにより、ヘテロ二価性架橋試薬と未固定化部材との反応により、未固定化部材にヘテロ二価性架橋試薬を結合させる。 For example, first, by immersing a heterobifunctional crosslinking reagent and the non fixed member in solution or in an organic solvent such as a buffer solution, by reaction with a heterobifunctional cross-linking reagents and non-immobilized member, coupling the heterobifunctional crosslinking reagents to the non-immobilized member. 次いで、物質bを加える。 Then added material b. これによって、ヘテロ二価性架橋試薬と物質bとの反応により、ヘテロ二価性架橋試薬を介して物質bが未固定化部材に固定化されることになる。 Thus, by reaction with a heterobifunctional cross-linking reagents and materials b, material b is to be immobilized in the non-fixing member via a heterobifunctional crosslinking reagent. 最終的には、物質bが固定化された部材を緩衝液または有機溶剤等で洗浄すればよい。 Finally, it may be cleaned member material b is immobilized buffer or an organic solvent or the like.

〈ホモ二価性架橋試薬を用いた固定化〉 <Immobilized using homo bifunctional crosslinking reagent>
ヘテロ二価性架橋試薬と同様、ホモ二価性架橋試薬を用いることによっても、化学的結合法で物質bを未固定化部材に固定化することができる。 As with heterobifunctional cross-linking reagents, by using a homo bifunctional crosslinking reagents can be immobilized in the non-fixing member material b in a chemical binding method. 「ホモ二価性架橋試薬」としては、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物または二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物から成るホモ二価性架橋試薬が挙げられる。 The "homo bifunctional crosslinking reagent", a thiol group, a sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, a hydrazide group, a primary amino group , secondary amino group, tertiary amino group, a carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, homodimer consisting of functional groups or functional group derivative or inorganic iodoacetyl groups, acid chloride or double bonds, and the like It includes the value of cross-linking reagents. 「未固定化部材」および「物質b」は、ヘテロ二価性架橋試薬の場合と同様である。 "Not fixing member" and "substance b" are the same as those of the heterobifunctional crosslinking reagents. また、ホモ二価性架橋試薬を用いて未固定化部材に物質bを固定化する方法も、上述のヘテロ二価性架橋試薬と同様である。 Further, a method of immobilizing a substance b in the non-fixing member with a homo bifunctional crosslinking reagent is also similar to the heterobifunctional crosslinking reagents discussed above. つまり、ホモ二価性架橋試薬と上記の未固定化部材とを緩衝液等の溶液中または有機溶媒中に浸すことにより、未固定化部材にホモ二価性架橋試薬を結合させる。 In other words, by immersing a homo bifunctional crosslinking reagent and the non fixed member in solution or in an organic solvent such as a buffer solution, to bind the homo bifunctional crosslinking reagent to the non-immobilized member. 次いで、物質bを加えて、ホモ二価性架橋試薬を介して物質bを未固定化部材に固定化させる。 Then added material b, is fixed to the non-immobilized member the material b via a homo bifunctional crosslinking reagent. 最終的には、物質bが固定化された部材を緩衝液または有機溶剤等で洗浄する。 Finally, wash the member material b is immobilized buffer or an organic solvent or the like.

なお、上記の「ヘテロ二価性架橋試薬を用いた固定化」および「ホモ二価性架橋試薬を用いた固定化」では、必要に応じて、部材への非特異的反応を抑制することが好ましい。 In "immobilized using bifunctional crosslinking reagent hetero" and "immobilized with a bivalent cross-linking reagents homo" above, as required, to suppress the non-specific reaction to member preferable. 従って、正常血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳などを部材に接触させること等の公知の手法によって、部材への非特異的吸着を抑えるブロッキングを行ってもよい。 Therefore, normal serum, bovine serum albumin, human serum albumin, casein, by a known method such as contacting the like to the member skim milk may be subjected to blocking of suppressing non-specific adsorption to member.

《試料について》 "For sample"
工程(i)で用意される試料には、被検物質が含まれている。 The sample is prepared in step (i), it contains the test substance. 試料としては、検出すべき被検物質が存在している可能性があるものであれば、いずれも種類の試料であってもかまわない。 As a sample, as long as there is a possibility that the analyte to be detected is present, but may be any of the type of sample. 例えば、ヒトもしくは動物の尿、血液、血清、血漿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液;ヒトもしくは動物の臓器、毛髪、皮膚、爪、骨、筋肉もしくは神経組織等の懸濁液または抽出液;便懸濁液;培養細胞もしくは培養組織の懸濁液または抽出液;ウィルスの懸濁液または抽出液;菌体の培養液;土壌懸濁液または抽出液;植物の懸濁液または抽出液;食品・加工食品の懸濁液または抽出液;排水などを試料として挙げることができる。 For example, of the human or animal urine, blood, serum, plasma, semen, saliva, sweat, tears, ascites, body fluids of the amniotic fluid and the like; suspension of human or animal organs, hair, skin, nails, bone, muscle or nerve tissue, etc. Nigoeki or extract; stool suspension; suspension cultured cells or cultured tissues or extracts; culture of the bacterial cell; suspension or extract viruses soil suspension or extract; suspension of the plant Nigoeki or extract; suspension or extract of food and processed food; draining, and the like as a sample.

試料は、検出に影響を与えない液体で希釈してもよい。 The sample may be diluted with a liquid which does not influence the detection. 例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液等の緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等を用いて試料を希釈してもよい。 For example, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, PBS buffer, HEPES buffer, MOPS buffer or TBS buffer buffer such as physiological saline, deionized water, sterile water or ultrapure water and the like sample may be diluted with.

試料中に含まれる被検物質は、例えば、蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、核酸、糖、脂質、糖脂質、高分子化合物、低分子化合物、錯体、無機物、ベクター、細菌、真菌、酵母、ウィルスおよび細胞のような生体関連物質、食品関連物質または環境関連物質などである。 Analyte contained in the sample, for example, proteins, glycoproteins, peptides, nucleic acids, sugars, lipids, glycolipids, high molecular compound, a low molecular compound, complex, inorganic, vector, bacteria, fungi, yeasts, viruses and biological substances such as cells, food-related material or environment-related substances, and the like.

より具体的な被検物質としては、以下の物質を挙げることができる: More specific examples of the test substance, mention may be made of the following materials:
HA抗体、IgG型HA抗体、IgM型HA抗体、HBc抗体、HBe抗原、HBe抗体、HBs抗原、HBs抗体、HCVコア抗原、HCVコア抗体、HCV抗原、HCV抗体、HIV I抗原、HIV I抗体、HIV II抗原、HIV II抗体、インフルエンザウィルス抗原、インフルエンザA型抗体、インフルエンザB型抗体、風疹ウィルス抗体、単純ヘルペスI型抗体もしくは単純ヘルペスII型抗体等のウィルス関連の抗原または抗体; HA antibodies, IgG-type HA antibody, IgM-type HA antibody, HBc antibody, HBe antigen, HBe antibody, HBs antigen, HBs antibody, HCV core antigen, HCV core antibody, HCV antigen, HCV antibody, HIV I antigens, HIV I antibody, HIV II antigen, HIV II antibodies, influenza virus antigens, influenza a antibodies, influenza B antibodies, rubella virus antibodies, such as herpes simplex type I antibody or herpes simplex type II antibodies virus-related antigens or antibodies;
マイコプラズマ抗原、抗マイコプラズマ抗体、結核菌抗原、抗結核菌抗体、クロストリジウム・ディフィシル抗原、アスペルギルス抗原、アスペルギルス抗体、ASO、カンジダ抗原、抗カンジダ抗体、オーム病抗体、クラミジア・トラコーマチス抗体IgA、クラミジア・トラコーマチス抗体IgM、クラミジア・トラコーマチス抗体IgG、クラミジア・ニューモニエ抗体IgA、クラミジア・ニューモニエ抗体IgG、抗抗酸菌抗体、抗ストレプトキナーゼ抗体、エンドトキシン、抗エンドトキシン抗体、レジオネラ抗原、百日咳菌抗体、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗体、梅毒トレポネーマ抗原、梅毒トレポネーマ抗体、淋菌抗原、抗淋菌抗体、レプトスピラ抗原、抗レプトスピラ抗体等の細菌関連の抗原または抗体; Mycoplasma antigen, anti-mycoplasma antibodies, Mycobacterium tuberculosis antigen, anti-tuberculosis antibody, Clostridium difficile antigens, Aspergillus antigens, Aspergillus antibodies, ASO, Candida antigens, anti-Candida antibody, Ohm's disease antibody, Chlamydia trachomatis lactis antibodies IgA, Chlamydia trachomatis Chis antibody IgM, Chlamydia trachomatis lactis antibody IgG, Chlamydia pneumoniae antibodies IgA, Chlamydia pneumoniae antibody IgG, anti-mycobacteria antibodies, anti-streptokinase antibodies, endotoxins, anti endotoxin antibodies, Legionella antigen, pertussis antibodies, Helicobacter pylori antigen, Helicobacter pylori antibody, Treponema pallidum antigen, Treponema pallidum antibody, Neisseria gonorrhoeae antigen, anti-gonococcus antibody, Leptospira antigens, bacterial-related antigen or antibodies such as anti-Leptospira antibodies;
ツツガ虫Gilliam IgG、ツツガ虫Gilliam IgM、ツツガ虫Karp IgG、ツツガ虫Karp IgM、ツツガ虫Kato IgG、ツツガ虫Kato IgM、トキソプラズマ抗体、トキソプラズマ抗体IgGもしくはトキソプラズマ抗体IgM等の微生物関連の抗原または抗体; Tsutsuga insect Gilliam IgG, Tsutsuga insect Gilliam IgM, Tsutsuga insect Karp IgG, Tsutsuga insect Karp IgM, Tsutsuga insect Kato IgG, Tsutsuga insect Kato IgM, Toxoplasma antibody, microorganism-associated antigen or antibodies such as Toxoplasma antibody IgG or Toxoplasma antibody IgM;
A抗原、抗A抗体、B抗原、抗B抗体、RhoD抗原、抗RhoD抗体もしくは不規則抗体等の血液型関連の抗原または抗体; A antigen, anti-A antibody, B antigen, anti-B antibodies, Rhod antigen, blood group-related antigens or antibodies such as anti-Rhod antibody or irregular antibodies;
免疫グロブリンA(IgA)、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)、免疫グロブリンD(IgD)もしくは免疫グロブリンE(IgE)等の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンスーパーファミリー; Immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin M (IgM), immunoglobulin or immunoglobulin superfamily, such as immunoglobulins D (IgD) or immunoglobulin E (IgE);
顆粒球エラスターゼ、好酸球塩基性蛋白、CRP、フェリチン、コルチコトロピン放出因子、α1アシドグリコプロテイン、α1マイクログロブリン、α2マイクログロブリン、β2マイクログロブリン、α1アンチトリプシン、IV型コラーゲン、アミロイドA、アルブミン、心筋トロポニンT、心室筋ミオシン軽鎖I、肺サーファクタントプロテインD、ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白、プロコラーゲンIIIペプチド、ミオグロビン、IgG型リウマチ因子、LE因子、リウマトイド因子、血小板表面IgG、抗DNA抗体、抗dsDNA抗体IgG、抗dsDNA抗体IgM、抗Jo-1抗体、抗LKM-1抗体、抗RNP抗体、抗Scl-70抗体、抗Sm抗体、抗SS-A抗体、抗ssDNA抗体IgG、抗ssDNA抗体IgM、抗アセチルコリンレセプター結合抗体、抗アセチルコリンレセプター阻止抗体、抗胃壁細胞抗体、抗核抗体群、抗ガラクトース Granulocyte elastase, eosinophilic basic protein, CRP, ferritin, corticotropin releasing factor, [alpha] 1 A glucoside glycoprotein, [alpha] 1-microglobulin, [alpha] 2-microglobulin, .beta.2-microglobulin, [alpha] 1-antitrypsin, IV collagen, amyloid A, albumin, myocardial troponin T, ventricular myosin light chain I, the pulmonary surfactant protein D, human heart type fatty acid binding protein, procollagen III peptide, myoglobin, IgG type rheumatoid factor, LE factor, rheumatoid factor, platelet surface IgG, anti-DNA antibodies, anti-dsDNA antibodies IgG, anti-dsDNA antibody IgM, anti-Jo-1 antibody, anti-LKM-1 antibodies, anti-RNP antibodies, anti-Scl-70 antibody, anti-Sm antibodies, anti-SS-A antibody, anti-ssDNA antibody IgG, anti-ssDNA antibody IgM, anti acetylcholine receptor binding antibody, anti-acetylcholine receptor blocking antibodies, anti-gastric parietal cell antibodies, antinuclear antibody group, anti-galactose 欠損IgG抗体、抗カルジオリピンβ2GPI複合体抗体、抗カルジオリピン抗体、抗血小板抗体、抗好中球細胞質抗体、抗好中球細胞質ミエロペルオキシダーゼ抗体、抗糸球体基底膜抗体、抗セントロメア抗体、抗内因子抗体、抗副腎皮質抗体、抗平滑筋抗体、抗ミトコンドリアM2抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体、ミエリンベイシック蛋白、免疫複合体、抗C3d抗体、補体C3もしくは補体C4等の炎症・臨床検査マーカー;または Deficient IgG antibody, anticardiolipin β2GPI complex antibodies, anticardiolipin antibodies, anti-platelet antibodies, anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, anti-neutrophil cytoplasmic myeloperoxidase antibodies, anti-glomerular basement membrane antibody, anti-centromere antibodies, anti-intrinsic factor antibody , anti-adrenal cortex antibody, anti-smooth muscle antibodies, anti-mitochondrial M2 antibodies, anti-mitochondrial antibodies, anti-thyroglobulin antibodies, anti-microsome antibodies, myelin bay chic protein, immune complexes, anti-C3d antibodies, such as complement C3 or complement C4 inflammation and clinical examination marker; or
I型コラーゲン-C-テロペプチド、I型コラーゲン架橋N-テロペプチド、αフェトプロテイン、BCA225、CA15-3、CA19-9、CA54/61、CA72-4、CA125、CA130、CA602、DUPAN2、HER2、NCC-ST-439、PIVKA-II、PSA-ACT、PSA、SCC抗原、Span-1抗原、γ-セミノプロテイン、エラスターゼ1もしくは塩基性フェトプロテイン等の腫瘍マーカー。 Type I collagen -C- telopeptide, type I collagen cross-linked N- telopeptide, alpha-fetoprotein, BCA225, CA15-3, CA19-9, CA54 / 61, CA72-4, CA125, CA130, CA602, DUPAN2, HER2, NCC -ST-439, PIVKA-II, PSA-ACT, PSA, SCC antigen, Span-1 antigen, .gamma.-seminoprotein, tumor markers such as elastase 1 or basic fetoprotein.
その他にも、各種のホルモン;各種のアレルギー関連の抗原または抗体;各種の血液凝固系関連物質;各種のウィルスのDNAまたはRNA;各種の真菌・細菌のDNAまたはRNA;ヒト等の各種の動物もしくは植物のDNAまたはRNA;各種の微生物のDNAまたはRNA;各種の食物アレルゲン;各種の環境ホルモン等を挙げることができる他、 Besides, various hormones; various allergy-related antigens or antibodies; various blood coagulation system related substances; various viral DNA or RNA; various animal or such as human; various DNA or RNA of the fungus-bacteria another which may be mentioned various environmental hormones,; DNA or RNA of the plant; various microorganisms DNA or RNA; various food allergens
PRTR法規制物質、化審法規制物質、労働安全衛生法規制物質、消防法規制物質、毒物劇物取締法規制物質、高圧ガス取締法規制物質、火薬類取締法規制物質、大気汚染防止法規制物質、水質汚濁防止法規制物質、悪臭防止法規制物質、海洋汚染防止法規制物質、薬事法規制物質、麻薬取締法規制物質、危規則規制物質、航空法規制物質、港則法規制物質、化学兵器禁止法規制物質、農薬取締法規制物質、オゾン層保護法規制物質、廃掃法規制物質もしくは輸出入貿易管理令規制物質等の各種の規制物質; PRTR Law regulated substances, Chemical Substances Control Law regulated substances, occupational health and safety laws and regulations material, fire laws and regulations substance, Poisonous and Deleterious Substances Control Law regulated substances, high-pressure gas Control Law regulated substances, Explosives Control Law regulated substances, prevention laws and regulations air pollution substances, the water pollution Control Law regulated substances, offensive odor prevention method controlled substances, marine pollution prevention Act controlled substances, the pharmaceutical Affairs Law regulated substances, narcotics Control Law regulated substances, Dangerous Goods regulations controlled substances, aviation laws and regulations substance, Minatosoku laws and regulations substance, chemical weapons laws and regulations substance, agricultural Chemicals regulation Law regulated substances, ozone layer protection laws and regulations material, waste Disposal and Public Cleaning Law regulated substances or various controlled substances, such as import and export trade Control Order controlled substances;
各種のカーボン材料;各種の無機材料;各種の細胞;各種の増殖因子;各種のウィルス;各種の細菌;各種の古細菌;各種の真菌;各種の放線菌;各種の糸状菌;または各種の酵母等を被検物質として挙げることができる。 Various carbon materials; various inorganic materials; various cells; various growth factors; various viruses; various bacteria; various fungal; various Actinomycetes; various fungi; or various yeasts various archaea and the like as a test substance.

工程(i)にて、上記のような磁性粒子、部材および試料を用意した後、引き続いて、工程(ii)が実施される。 At step (i), was prepared magnetic particles, members and samples as described above, subsequently, step (ii) is carried out. 工程(ii)では、磁性粒子および試料を部材に供給する。 In step (ii), and supplies the magnetic particles and the sample member. 磁性粒子の物質aおよび部材の物質bが共に被検物質に対して結合性を有しているので、磁性粒子および試料が部材に接触すると、物質aと物質bとが試料の被検物質を介して結合した複合体(即ち、「磁性粒子の物質a−被検物質−部材の物質bから成るサンドイッチ構造」)が得られることになる。 Since substances b substances a and member of the magnetic particles have both binding to the test substance, the magnetic particles and the sample comes into contact with the member, and the material a and the material b the analyte sample complexes bound through (i.e., "the magnetic particulate material a- analyte - sandwich structure made of a material b of member") will be obtained. なお、複合体の形成に際しては、物質aまたは物質bが被検物質に直接結合する態様のみならず、リンカーを介して被検物質に結合する態様であってもよい。 Incidentally, in forming the complex not only aspects material a or substance b are coupled directly to the test substance may be performed in a mode of binding to analyte via a linker.

工程(ii)で供給される磁性粒子は、工程(i)に関する記載で上述したが、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等の溶媒中に分散させた状態で使用することが好ましい。 Magnetic particles fed in step (ii) has been described above in the description of step (i), tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, PBS buffer, HEPES buffer, MOPS buffer or buffers such as TBS buffer, saline, deionized water, is preferably used in a state of being dispersed in sterile water or in a solvent such as ultrapure water. 同様に、工程(ii)で供給される試料は、必要に応じて、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等で希釈した状態で使用することが好ましい。 Similarly, the sample supplied in step (ii), if necessary, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, PBS buffer, HEPES buffer, MOPS buffer or TBS buffer, etc. buffers, saline, deionized water, is preferably used in a state diluted with sterile water or ultrapure water or the like.

工程(ii)では、試料中に被検物質が存在すると、サンドイッチ構造の複合体が、部材の物質bが固定化された領域で形成されることになる一方、試料中に被検物質がないと、サンドイッチ構造の複合体は形成されない。 In step (ii), the test substance is present in the sample, a complex of sandwich structure, whereas that would substance b member is formed by a fixed region, there is no test substance in the sample When a complex of sandwich structure is not formed. このように、試料中に被検物質が存在すると、形成される複合体に起因して、物質bが固定化されている部材領域の状態が変化する。 Thus, when the test substance is present in the sample, due to the complex formed, substance b changes the state of the member area being immobilized. 従って、本発明では、複合体の形成に伴う磁性粒子の分布状態を、物理的特性または化学的特性の変化を利用して測定することによって、被検物質の有無または被検物質の量を判断することができる。 Accordingly, in the present invention, the distribution state of the magnetic particles with the formation of the complex, by measuring using a change in physical or chemical properties, determine the amount of presence or analyte test substance can do. 例えば、被検物質が存在すると、形成される複合体に起因して、物質bが固定化されている部材領域の色が、物質bが固定化されていない部材領域の色と異なることになる。 For example, when the analyte is present, due to the complex formed, the color of the member area where material b is immobilized, will differ from the color of the member area where material b is not immobilized . 従って、工程(iii)において、かかる領域を目視確認することによって、試料中の被検物質の有無を判断することができる(工程(iv))。 Thus, in step (iii), by visually confirming such regions, it is possible to determine the presence or absence of the analyte in the sample (step (iv)). なお、被検物質が存在する場合、物質bが固定化されている部材領域の色は、例えば、複合体を構成する磁性粒子の呈色に起因する。 Incidentally, if the analyte is present, the color of the member area where material b is immobilized, for example, due to the color of the magnetic particles constituting the complex.

試料中に含まれる被検物質の量(または濃度)を判断したい場合には、工程(iii)において、物質bが固定化されている部材領域における、色の変化、膜厚(または「厚み」)の変化、重量変化、導電性変化、磁性変化または光散乱特性変化などのパラメーター変化を測定すればよい。 If you want to determine the amount of analyte contained in the sample (or concentration), in step (iii), in the member area material b is immobilized, change in color, the film thickness (or "thickness" changes in), weight change, conductive changes, may be measured parameter changes, such as magnetic change or light scattering properties change. この場合は、かかるパラメーターの変化量と被検物質量との関係を表す検量線(つまり、「変化量と被検物質量との相関関係」)を予め得ておくことが好ましい。 In this case, calibration curve showing a relationship between the variation and a test substance amount of the parameter (i.e., "the correlation between the variation amount and the test substance amount") that you obtain a previously are preferred. これにより、工程(iv)において、検量線と工程(iii)で測定されたパラメーター変化量とに基づいて被検物質の量を求めることができる。 Thus, in step (iv), it is possible to determine the amount of analyte on the basis of the parameter change amount measured in the calibration curve and step (iii). なお、工程(iii)で上記のパラメーターの変化量が0の場合では、被検物質の量も0であるので、上記のパラメーター変化量の測定で被検物質の有無を判断することもできる。 In the case of changing the above parameters in step (iii) it is zero, since it is 0. amount of analyte may be determined whether a test substance in the measurement of the above parameters variation.

次に、本発明の種々の実施形態について、図面を参照しながら説明する。 Next, various embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. なお、同様の構成要素については同じ符号を付し説明を省略する場合がある。 Note that similar components may be omitted the description the same reference numerals.

(第1実施形態) (First Embodiment)
第1実施形態は、本発明の方法の原理を主に示すものである。 The first embodiment is mainly showing the principle of the method of the present invention. 図2に、第1実施形態に係る複合体の形成過程を示す。 Figure 2 shows the formation process of the complex according to the first embodiment. なお、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質aおよび物質bが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。 Incidentally, the test substance contained in the sample is an antigen, substances a and material b is, the case is such antigens capable of specifically binding an antibody for example.

まず、図2(a)に示すように、抗体5が固定化された部材6を用意する。 First, as shown in FIG. 2 (a), providing a member 6 which is an antibody 5 is immobilized. 次いで、被検物質7(即ち「抗原」)を含んだ試料を部材6に供給することによって、図2(b)に示すように、部材6の抗体5と被検物質7とを抗原抗体反応で相互に結合させる。 Then, by supplying the sample member 6 containing the test substance 7 (or "antigen"), as shown in FIG. 2 (b), the antibody 5 a test substance 7 members 6 antigen-antibody reaction in is bound to each other. 次いで、図2(c)に示すように、磁性粒子1を部材6に供給すると共に、部材6の裏面側から磁場を印加する。 Then, as shown in FIG. 2 (c), it supplies the magnetic particles 1 to member 6, a magnetic field is applied from the back side of the member 6. 具体的には、抗体5が固定化されている面の反対側の面の下方に磁石11を配置する。 Specifically, placing the magnet 11 below the surface opposite to the surface in which the antibody 5 is immobilized. これにより、磁性粒子1が磁場の影響下に置かれることになり、磁性粒子1が部材6の抗体5の方向へと移動することになる。 This makes it possible to the magnetic particles 1 is placed under the influence of a magnetic field, the magnetic particles 1 will move in the direction of the antibody 5 members 6. 最終的には、磁性粒子1の抗体8が被検物質7と結合することによって、図2(d)に示すようなサンドイッチ構造の複合体9が形成される。 Finally, antibody 8 of the magnetic particles 1 by binding to the test substance 7, complex 9 sandwich structure as shown in FIG. 2 (d) are formed. 複合体9が形成された後は、磁場の印加を停止し、抗体5が固定化されている部材面を洗浄することによって、複合体形成に寄与しなかった磁性粒子1を除去することが好ましい。 After the complex 9 were formed, to stop the application of a magnetic field, by the antibody 5 to clean the member surface that has been immobilized, it is preferable to remove the magnetic particles 1 did not contribute to complex formation .

このような本発明の方法では、試料中に被検物質7が存在すると、抗体5が固定化されている部材6の領域a(図2(a)参照)に複合体9が形成されるので、かかる複合体9に起因した領域aの状態変化から被検物質7の有無(即ち、「陽性」または「陰性」)を判断できる。 In the method of the present invention, the test substance 7 present in the sample, because antibody 5 complex 9 is formed in a region a of the member 6 which is fixed (see FIG. 2 (a)) can determine whether the test substance 7 from the state change of the region a due to such complex 9 (i.e., "positive" or "negative"). それだけでなく、領域aの状態変化を測定すると、被検物質7の量も求めることができる。 Not only that, when measuring the change of state of the region a, it is the amount of test substance 7 also determined.

また、本発明の方法では、複合体9の形成を磁場の影響下で行っているので、比較的短い時間で複合体9を形成することができ、結果的に、比較的短い時間で被検物質7を検出できる利点がある。 In the method of the present invention, since performing the formation of a complex 9 under the influence of a magnetic field, it is possible to form a complex 9 in a relatively short time, as a result, the subject in a relatively short time an advantage of detecting substances 7.

(第2実施形態) (Second Embodiment)
第2実施形態は、工程(i)で用意される部材がプレート部材または容器であって、その表面の少なくとも一部の表面aに物質bが固定化されている形態であり、工程(ii)において、試料を表面aに供給した後、表面a以外の部材の表面bに磁性粒子を供給し、表面aの近傍から磁場を印加する形態である。 The second embodiment is a member plate member or container is prepared in step (i), in the form of substance b is immobilized on at least a portion of the surface a of the surface, step (ii) in, after supplying the sample to the surface a, the magnetic particles are supplied to the surface b of the member other than the surface a, which is the form for applying a magnetic field from the vicinity of the surface a. 「表面aの近傍から磁場を印加する形態」は、例えば、表面aの近傍に磁石を配置する形態、または、表面aの近傍に予め配置された電磁石に電流を流す形態が考えられる。 "Forms for applying a magnetic field from the vicinity of the surface a", for example, the form to place the magnet near the surface a, or form passing a current to a pre-arranged electromagnets in the vicinity of the surface a is conceivable. 図3Aに、第2実施形態に係る複合体の形成過程を示す。 Figure 3A, shows the formation process of the composite body according to a second embodiment. 第1実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質aおよび物質bが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。 Similarly to the first embodiment, a test substance contained in the sample is an antigen, substances a and material b is explained taking the case of an antibody capable accordance antigen specifically bind.

まず、図3A(a)に示すように、プレート部材等の部材10の一部の表面aに抗体5を固定化する。 First, as shown in FIG. 3A (a), the antibody is immobilized 5 on a portion of the surface a of the member 10 such as a plate member. 次いで、被検物質7を含んだ試料を表面aに供給することによって、図3A(b)に示すように、部材10の抗体5と被検物質7とを抗原抗体反応で相互に結合させる。 Then, by supplying the sample containing the test substance 7 on the surface a, as shown in FIG. 3A (b), the antibody 5 a test substance 7 members 10 is coupled to each other by an antigen-antibody reaction. 次いで、図3A(c)に示すように、表面a以外の部材の表面bに磁性粒子1を供給する。 Then, as shown in FIG. 3A (c), supplies the magnetic particles 1 on the surface b of the member other than the surface a. そして、図3A(d)に示すように、表面aの近傍から磁場を印加して、磁性粒子1を磁場の影響下に置く。 Then, as shown in FIG. 3A (d), by applying a magnetic field from the vicinity of the surface a, put the magnetic particles 1 under the influence of a magnetic field. 具体的には、磁性粒子1が表面aを通過するように、供給された磁性粒子1と磁石11とが表面aを挟み込むように部材10の裏面または側面に磁石11を配置する。 Specifically, the magnetic particles 1 to pass through the surface a, the supplied magnetic particles 1 magnet 11 is disposed a magnet 11 on the back or side of the member 10 so as to sandwich the surface a. これにより、磁性粒子1が表面bから表面aの方向へと移動することになる。 As a result, the magnetic particles 1 are moved in the direction of the surface a from the surface b. 最終的には、磁性粒子1の抗体8が被検物質7と結合するので、図3A(e)に示すように、部材10の抗体5が固定化されている表面aにおいて複合体9が形成される。 Finally, since antibody 8 of the magnetic particles 1 are attached to the test substance 7, as shown in FIG. 3A (e), it is a complex 9 at the surface a where antibody 5 members 10 is immobilized form It is. 従って、複合体9に起因した領域aの状態変化から被検物質7の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質7の量を求めることができる。 Therefore, it is possible from the state change of area a due to the complex 9 together can determine the presence or absence of the test substance 7, determine the amount of analyte 7 from such variation. この実施形態でも、複合体9の形成を磁場の影響下で行っているために、磁性粒子1の移動が促進されており、比較的短い時間で複合体9を形成することができる。 In this embodiment, in order to doing the formation of a complex 9 under the influence of a magnetic field, and the movement of the magnetic particles 1 is promoted, it is possible to form a complex 9 in a relatively short time. 従って、比較的短い時間で被検物質7を検出することが可能である。 Therefore, it is possible to detect the analyte 7 in a relatively short time. なお、磁性粒子1が移動する部材10の領域に溝部を設けて、磁性粒子が移動し易くなるようにしてもよい。 Incidentally, by providing a groove in the region of the member 10 to magnetic particle 1 moves, the magnetic particles may be easily moved.

この実施形態から分かるように、本明細書では「表面aの近傍から磁場を印加する」とは、「磁性粒子の表面aへの移動が促進されるように磁場を印加する」ことを実質的に意味しており、表面aに近接する位置だけから磁場を印加する形態のみに限定されないことに留意されたい。 As can be seen from this embodiment, the herein "applying a magnetic field from the vicinity of the surface a" substantial that the "move to the surface a of the magnetic particles a magnetic field is applied so as to facilitate" It is meant to be noted that the invention is not limited only to form a magnetic field is applied from only a position close to the surface a. また、このような実施形態では、複合体形成に寄与しなかった磁性粒子は、最終的には、表面aを通過して磁石付近へと吸引されるので、余分な磁性粒子を除去する操作が省ける点でも利点がある。 Further, in such embodiments, the magnetic particles did not contribute to complex formation, in the end, since through the surface a is sucked into the vicinity of the magnet, the operation to remove excess magnetic particles also Habukeru point there is an advantage.

(第3実施形態) (Third Embodiment)
第3実施形態は、工程(i)で用意される部材がプレート部材または容器であって、その表面の少なくとも一部の表面aに物質bが固定化されている形態であり、工程(ii)において、表面a以外の部材の表面bに試料と磁性粒子とを供給した後、表面aの近傍から磁場を印加する形態である。 Third embodiment is a member plate member or container is prepared in step (i), in the form of substance b is immobilized on at least a portion of the surface a of the surface, step (ii) in, after supplying a sample and a magnetic particles to the surface b of the member other than the surface a, which is the form for applying a magnetic field from the vicinity of the surface a. 図3Bに、第3実施形態に係る複合体の形成過程を示す。 Figure 3B, shows the formation process of the complex according to the third embodiment. なお、第1実施形態および第2実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質aおよび物質bが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。 As in the first embodiment and the second embodiment, the analyte is an antigen contained in a sample, taking the case materials a and material b is a such antigens capable of specifically binding antibodies explain.

まず、図3B(a)に示すように、プレート部材等の部材10の一部の表面aに抗体5を固定化する。 First, as shown in FIG. 3B (a), the antibody is immobilized 5 on a portion of the surface a of the member 10 such as a plate member. 次いで、図3B(b)に示すように、表面a以外の部材の表面bに、被検物質7を含んだ試料を供給すると共に、磁性粒子1を供給する。 Then, as shown in FIG. 3B (b), the surface b of the member other than the surface a, supplies a sample containing the test substance 7, for supplying the magnetic particles 1. 次いで、図3B(c)に示すように、表面aの近傍から磁場を印加して、磁性粒子を磁場の影響下に置く。 Then, as shown in FIG. 3B (c), by applying a magnetic field from the vicinity of the surface a, put the magnetic particles under the influence of a magnetic field. 具体的には、磁性粒子が表面aを通過するように、供給された磁性粒子1と磁石11とが表面aを挟み込むように部材10の裏面または側面に磁石11を配置する。 Specifically, the magnetic particles to pass through the surface a, the supplied magnetic particles 1 magnet 11 is disposed a magnet 11 on the back or side of the member 10 so as to sandwich the surface a. これによって、図3B(c)に示すように、磁性粒子1が表面bから表面aの方向へと移動することになる。 Thus, as shown in FIG. 3B (c), the magnetic particles 1 will move in the direction of the surface a from the surface b. この際、磁性粒子1の抗体8と被検物質7との抗原抗体反応により磁性粒子1と被検物質7とが相互に結合する。 At this time, the magnetic particles 1 and the test substance 7 are bound to each other by an antigen-antibody reaction between an antibody 8 and a test substance 7 of the magnetic particles 1. 最終的には、被検物質7が部材10の抗体5と結合するので、図3B(d)に示すように、部材10の抗体5が固定化されている表面aに複合体9が形成されることになる。 Finally, since the test substance 7 is bound to the antibody 5 members 10, as shown in FIG. 3B (d), complex 9 is formed on the surface a of the antibody 5 of member 10 is fixed It becomes Rukoto. 従って、この複合体9に起因した領域aの状態変化から被検物質7の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質7の量も求めることができる。 Therefore, we determine the presence or absence of the test substance 7 from the state change of the resulting regions a to the complex 9 can also be determined amount of analyte 7 from such variation. この実施形態でも、複合体9の形成を磁場の影響下で行っているために、磁性粒子1の移動が促進されており、比較的短い時間で複合体9を形成することができる。 In this embodiment, in order to doing the formation of a complex 9 under the influence of a magnetic field, and the movement of the magnetic particles 1 is promoted, it is possible to form a complex 9 in a relatively short time. 従って、比較的短い時間で被検物質7を検出することが可能である。 Therefore, it is possible to detect the analyte 7 in a relatively short time. なお、第2実施形態と同様に、磁性粒子1が移動する部材10の領域に溝部を設けて、磁性粒子1が移動し易くなるようにしてもよい。 As in the second embodiment, by providing a groove in the region of the member 10 to magnetic particle 1 moves, the magnetic particles 1 may be easily moved.

(第4実施形態) (Fourth Embodiment)
第4実施形態は、工程(i)で用意される部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域aに物質bが固定化されている形態であり、工程(ii)において、内部領域a以外の部材の領域bに試料と磁性粒子とを供した後、内部領域aの近傍から磁場を印加する形態である(イムノクロマト法)。 The fourth embodiment, members that are provided in step (i) is a member made of porous or fibrous, in the form of material b in at least a portion of the inside area a of the interior region is immobilized There, in step (ii), after subjecting the sample and the magnetic particles in the region b than in the member inner region a, a form in which a magnetic field is applied from the vicinity of the inner area a (immunochromatography). 「内部領域aの近傍から磁場を印加する形態」は、例えば、内部領域aの近傍に磁石を配置する形態、または、内部領域aの近傍に予め配置された電磁石に電流を流す形態が考えられる。 "Forms for applying a magnetic field from the vicinity of the inner area a", for example, the form to place the magnet near the inner region a, or the form of electric current to the pre-arranged electromagnets in the vicinity of the inner area a conceivable . 図4Aに、第4実施形態に係る複合体の形成過程を示す。 Figure 4A, illustrates a process of forming a composite body according to the fourth embodiment. なお、第1実施形態〜第3実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質aおよび物質bが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。 As in the first embodiment to the third embodiment, the analyte is an antigen contained in a sample, taking the case materials a and material b is a such antigens capable of specifically binding antibodies explain.

まず、少なくとも一部の内部領域aに抗体5が固定化された部材12を用意して、その部材12の内部領域a以外の領域bに磁性粒子1および試料を供する。 First, prepare the member 12 antibody 5 is immobilized in at least a portion of the inside area a, subjecting the magnetic particles 1 and the sample in the region b than the inside area a of the member 12. 具体的には、図4A(a)に示すように、磁性粒子1の分散液を含浸させた磁性粒子含浸部材(例えば多孔質または繊維質から成る部材)13を領域bに配置すると共に、サンプルパッド(例えば多孔質または繊維質から成るサンプルパッド)14を領域bに配置して、かかるサンプルパッド14に試料を供給する。 Specifically, as shown in FIG. 4A (a), the magnetic particles impregnated member (e.g. made of porous or fibrous member) 13 which the dispersion was impregnated in the magnetic particles 1 as well as arranged in the region b, the sample pad (for example, a sample pad made of porous or fibrous) 14 arranged in the region b, and supplies the sample to such a sample pad 14. 磁性粒子含浸部材13とサンプルパッド14とは相互に一部が重なり合って配置されることが好ましい。 Preferably the magnetic particles impregnated member 13 and the sample pad 14 is disposed overlapping part with each other. 試料がサンプルパッド14に供給されると、図4A(b)に示すように、試料中に含まれる被検物質7がサンプルパッド14内に含まれた状態になる。 When the sample is supplied to the sample pad 14, as shown in FIG. 4A (b), a state where the test substance 7 is contained in the sample pad 14 contained in the sample. 次いで、試料中の被検物質7は、いわゆる毛管現象に起因して、サンプルパッド14内から磁性粒子含浸部材13内へと移動することになるので、図4A(c)に示すように、磁性粒子1の抗体8と被検物質7との抗原抗体反応で磁性粒子1と被検物質7とが相互に結合することになる。 Then, the test substance 7 in the sample, due to the so-called capillary phenomenon, since the sample pad within 14 will be moved into the magnetic particle impregnated member 13, as shown in FIG. 4A (c), the magnetic magnetic particles 1 and the test substance 7 will bind to each other in the antigen-antibody reaction between the antibody 8 and a test substance 7 of the particle 1. 次いで、図4A(d)に示すように、内部領域aの近傍から磁場を印加して、磁性粒子1を磁場の影響下に置く。 Then, as shown in FIG. 4A (d), by applying a magnetic field from the vicinity of the inner area a, put the magnetic particles 1 under the influence of a magnetic field. 具体的には、磁性粒子が内部領域aを通過するように、供された磁性粒子1と磁石11とが内部領域aを挟み込むように部材12の裏面または側面に磁石11を配置する。 Specifically, the magnetic particles so as to pass through the interior region a, have been subjected and the magnetic particles 1 and the magnet 11 is disposed a magnet 11 on the back or side of the member 12 so as to sandwich the inner region a. これによって、磁性粒子1が、被検物質7と共に、領域bから内部領域aに向かう方向に移動することになる。 Thus, the magnetic particles 1, with the test substance 7, will move in the direction from the region b in the inner region a. 最終的には、被検物質7と部材12の抗体5とが結合するので、図4A(e)に示すように、部材12の抗体5が固定化されている内部領域aにて複合体9が形成されることになる。 Finally, since the antibody 5 of a test substance 7 and the member 12 are attached as shown in FIG. 4A (e), the complex at an internal region a where antibody 5 members 12 are fixed 9 so that but is formed. 従って、この複合体9に起因した内部領域aの状態変化から被検物質7の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質7の量も求めることができる。 Therefore, we determine the presence or absence of the test substance 7 from the state change of the internal area a due to this complex 9 can also be determined amount of analyte 7 from such variation. この実施形態でも、複合体9の形成を磁場の影響下で行っており、比較的短い時間で複合体9を形成することができるので、結果的に、比較的短い時間で被検物質7を検出できる。 In this embodiment, which performs the formation of a complex 9 under the influence of a magnetic field, it is possible to form a complex 9 in a relatively short time, as a result, the test substance 7 in a relatively short time It can be detected. なお、第4実施形態では、磁場を印加しない場合であっても磁性粒子1および被検物質7は毛管現象に起因して部材12内を移動することができるが、磁場の影響下に置かれることによって、かかる移動が促進されていることに留意されたい。 In the fourth embodiment, even if no magnetic field was applied magnetic particles 1 and test substance 7 can be due to capillary action to move the member 12, it is placed under the influence of a magnetic field by Note that the mobile is promoted.

また、この実施形態から分かるように、本明細書では「内部領域aの近傍から磁場を印加する」とは、「磁性粒子の内部領域aへの移動が促進されるように磁場を印加する」ことを実質的に意味しており、内部領域aに近接する位置だけから磁場を印加する形態のみに限定されないことに留意されたい。 Moreover, as can be seen from this embodiment, in the present specification, "applying a magnetic field from the vicinity of the inner area a", "moved to the interior area a of the magnetic particles a magnetic field is applied so as to facilitate" want substantially are meant, it is noted that the invention is not limited only to form a magnetic field is applied from only the position close to the inner region a that. また、「少なくとも一部の内部領域aに抗体が固定化された部材」とは、抗体の全てが内部領域に固定化されている必要はなく、一部の抗体が表面に固体化されている形態であってもよいことにも留意されたい。 Furthermore, "antibody to at least a portion of the inner region a has been member immobilized", it is not necessary that all of the antibody is immobilized to the interior region, a portion of the antibody is solidified on the surface it is also noted that it may be in the form. このような実施形態でも、第2実施形態と同様、複合体形成に寄与しなかった磁性粒子は、最終的には、内部領域aを通過して磁石付近へと吸引されることになるので、余分な磁性粒子を除去する操作が省ける点で利点がある。 Even in such embodiment, similar to the second embodiment, the magnetic particles did not contribute to complex formation, in the end, it means being sucked into the vicinity of the magnet passes through the inner region a, there is an advantage in that Habukeru operation to remove the excess magnetic particles.

(第5実施形態) (Fifth Embodiment)
第5実施形態は、工程(i)で用意される部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域aに物質bが固定化されている形態であり、工程(ii)において、試料を内部領域aに供給した後、内部領域a以外の部材の領域bに磁性粒子を供し、次いで、内部領域aの近傍から磁場を印加する形態である。 The fifth embodiment, members that are provided in step (i) is a member made of porous or fibrous, in the form of material b in at least a portion of the inside area a of the interior region is immobilized There, in step (ii), after supplying the sample to the interior region a, subjecting the magnetic particles in the region b of the member other than the inner region a, then a form for applying a magnetic field from the vicinity of the inner area a. 図4Bに、第5実施形態に係る複合体の形成過程を示す。 Figure 4B, shows the formation process of the complex according to the fifth embodiment. なお、第1実施形態〜第4実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質aおよび物質bが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。 Incidentally, similarly to the first to fourth embodiments, the analyte is an antigen contained in a sample, taking the case materials a and material b is a such antigens capable of specifically binding antibodies explain.

まず、図4B(a)に示すように、少なくとも一部の内部領域aに抗体5が固定化された部材12を用意する。 First, as shown in FIG. 4B (a), providing a member 12 which antibody 5 is immobilized in at least a portion of the inside area a. 次いで、被検物質7を含んだ試料を内部領域aに供すことによって、図4B(b)に示すように、部材12の抗体5と被検物質7とを抗原抗体反応で相互に結合させる。 Then, by Kyosu the sample containing the test substance 7 in the inner region a, as shown in FIG. 4B (b), the antibody 5 a test substance 7 members 12 is coupled to each other by an antigen-antibody reaction. 次いで、図4B(c)に示すように、内部領域a以外の部材の領域bに磁性粒子1を供する。 Then, as shown in FIG. 4B (c), subjecting the magnetic particles 1 in the region b of the member other than the inner region a. この際、第4実施形態と同様に、磁性粒子1の分散液を含浸させた磁性粒子含浸部材(例えば多孔質または繊維質から成る部材)13を領域bに配置することが好ましい。 In this case, as in the fourth embodiment, it is preferable to dispose the magnetic particles impregnated member (eg member made of porous or fibrous) 13 impregnated with a dispersion of magnetic particles 1 in the region b. 次いで、図4B(d)に示すように、内部領域aの近傍から磁場を印加して、磁性粒子1を磁場の影響下に置く。 Then, as shown in FIG. 4B (d), by applying a magnetic field from the vicinity of the inner area a, put the magnetic particles 1 under the influence of a magnetic field. 具体的には、磁性粒子1が内部領域aを通過するように、供された磁性粒子1と磁石11とが内部領域aを挟み込むように部材12の裏面または側面に磁石11を配置する。 Specifically, the magnetic particles 1 so as to pass through the inner region a, the magnetic particles 1 and the magnet 11 being subjected to place the magnet 11 on the back or side of the member 12 so as to sandwich the inner region a. これにより、磁性粒子1が領域bから内部領域aの方向へと移動することになる。 This will lead to the magnetic particles 1 are moved in the direction of the inner area a from the region b. 最終的には、内部領域aの被検物質7と磁性粒子1の抗体8とが結合するので、内部領域aに複合体9が形成される。 Finally, since the test substance 7 in inner region a and antibody 8 of the magnetic particles 1 are attached complex 9 is formed in the inner region a. 従って、この複合体9に起因した領域aの状態変化から被検物質7の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質7の量も求めることができる。 Therefore, we determine the presence or absence of the test substance 7 from the state change of the resulting regions a to the complex 9 can also be determined amount of analyte 7 from such variation. この実施形態でも、複合体9の形成を磁場の影響下で行っているために、比較的短い時間で複合体9を形成することが可能であり、比較的短い時間で被検物質7を検出することができる。 In this embodiment, in order to doing the formation of a complex 9 under the influence of a magnetic field, it is possible to form a complex 9 in a relatively short time, detect the test substance 7 in a relatively short time can do. なお、この実施形態でも、第4実施形態と同様に、磁場を印加しない場合であっても磁性粒子1は毛管現象に起因して部材12内部を移動することができるが、磁場の影響下に置かれることによって、かかる移動が促進されていることに留意されたい。 Also in this embodiment, as in the fourth embodiment, the magnetic particles 1 even if no magnetic field was applied can move member 12 inside due to capillary action, under the influence of a magnetic field by being placed, it is noted that such movement is promoted.

(第6実施形態) (Sixth Embodiment)
第6実施形態は、工程(i)で用意される部材の一部の領域aに物質bが固定化されている形態であり、工程(ii)において、領域a以外の部材の領域bに試料および磁性粒子を供給し、領域bの近傍から領域aの近傍へと磁石を移動させる形態である。 Sixth embodiment is a form in which part of the region a to the material b of the member is prepared in step (i) is immobilized, in step (ii), the sample in the region b of the member other than the region a and the magnetic particles were supplied, in the form of moving the magnet to the region near a from the vicinity of the region b. 図5Aに、第6実施形態に係る複合体の形成過程を示す。 Figure 5A, shows the formation process of the complex according to the sixth embodiment. なお、第1実施形態〜第5実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質aおよび物質bが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。 Incidentally, similarly to the first to fifth embodiments, the analyte is an antigen contained in a sample, taking the case materials a and material b is a such antigens capable of specifically binding antibodies explain. また、部材の領域aおよび領域bを部材の表面aおよび表面bとして説明する。 Further, explaining the area a and the area b of the member as the surface a and the surface b of the member.

まず、図5A(a)に示すように、部材10の一部の表面aに抗体5を固定化する。 First, as shown in FIG. 5A (a), the antibody is immobilized 5 on a portion of the surface a of the member 10. 次いで、図5A(b)に示すように、表面a以外の部材の表面bに、被検物質7を含んだ試料を供給すると共に、磁性粒子1を供給する。 Then, as shown in FIG. 5A (b), the surface b of the member other than the surface a, supplies a sample containing the test substance 7, for supplying the magnetic particles 1. 次いで、図5A(c)に示すように、表面bの近傍から表面aの近傍へと矢印Aの方向に磁石11を移動させる。 Then, as shown in FIG. 5A (c), from the vicinity of the surface b to the vicinity of the surface a in the direction of arrow A to move the magnet 11. これによって、磁性粒子7が表面bから表面aの方向に向かって移動することになる。 This results in the magnetic particles 7 is moved toward the surface a from the surface b. この際、磁性粒子1の抗体8と被検物質7との抗原抗体反応により磁性粒子1と被検物質7とが相互に結合する。 At this time, the magnetic particles 1 and the test substance 7 are bound to each other by an antigen-antibody reaction between an antibody 8 and a test substance 7 of the magnetic particles 1. 最終的には、図5A(d)に示すように、部材10の抗体5が固定化されている表面aに複合体9が形成されることになる。 Finally, as shown in FIG. 5A (d), so that the antibody 5 members 10 complex 9 is formed on the surface a which is immobilized. 従って、この複合体9に起因した表面aの状態変化から被検物質7の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質7の量も求めることができる。 Therefore, we determine the presence or absence of the test substance 7 from the state change of the resulting surface a in this complex 9 can also be determined amount of analyte 7 from such variation. この実施形態でも、複合体9の形成を磁場の影響下で行っているために、磁性粒子1の移動が促進されており、比較的短い時間で複合体9を形成することが可能である。 In this embodiment, in order to doing the formation of a complex 9 under the influence of a magnetic field, and the movement of the magnetic particles 1 is promoted, it is possible to form a complex 9 in a relatively short time. 従って、結果的に比較的短い時間で被検物質7を検出することができる。 Therefore, it is possible to detect the analyte 7 resulting in a relatively short time. なお、第2実施形態または第3実施形態と同様に、磁性粒子1が移動する部材10の領域に溝部を設けて、磁性粒子1が移動し易くなるようにしてもよい。 As in the second embodiment or the third embodiment, by providing a groove in the region of the member 10 to magnetic particle 1 moves, the magnetic particles 1 may be easily moved.

第6実施形態では、試料を表面bに供給したが、第2実施形態(即ち、図3Aに示す形態)と同様に、試料を表面aに供給して、部材10の抗体5と予め結合させておく形態であってもよい(この形態を「第7実施形態」と呼ぶ)。 In the sixth embodiment has been supplying a sample to the surface b, a second embodiment (i.e., the form shown in FIG. 3A) in the same manner as, by supplying the sample to the surface a, is pre-bound to the antibody 5 members 10 and keep may be in the form (this embodiment is referred to as a "seventh embodiment"). この第7実施形態の場合は、図5Bに示すように、工程(i)で用意される部材の一部の領域a(図示する形態では「表面a」)に物質bが固定化されている形態であり、工程(ii)において、試料を領域aに供給した後、領域a以外の部材の領域b(図示する形態では「表面b」)に磁性粒子を供給し、次いで、領域bの近傍から領域aの近傍へと磁石を移動させる形態である。 The case of the seventh embodiment, as shown in FIG. 5B, (in the form of illustrated "surface a") a part of the region a of the member is prepared in step (i) substances b to is immobilized in the form, in step (ii), after supplying the sample to the region a, (in the form of illustrated "surface b") region b of the member other than the region a supply magnetic particles, then the vicinity of the region b in the form of moving the magnet to the region near a from. 第7実施形態の複合体の具体的な形成過程については、第2実施形態および第6実施形態と重複するので説明を行わない。 The specific process of forming the complex of the seventh embodiment is not performed so the description overlapped with the second and sixth embodiments.

第6実施形態および第7実施形態で用いられる部材は、第2実施形態または第3実施形態のようなプレート部材または容器のみならず、第4実施形態または第5実施形態のような多孔質または繊維質から成る部材であってもよい。 Member used in the sixth embodiment and the seventh embodiment, not only the plate member or container as in the second embodiment or the third embodiment, the porous, such as in the fourth embodiment or fifth embodiment or a member consisting of fibrous or. 部材が多孔質または繊維質から成る場合では、部材の内部領域の一部に物質bを固定化することになる。 Member in the case made of porous or fibrous, the immobilizing material b in a part of the inner area of ​​the member. 更に、第6実施形態および第7実施形態では、移動させる磁石が電磁石であってもよい。 Further, in the sixth and seventh embodiments, the magnet is moved may be an electromagnet. 電磁石を用いる場合には、領域bの近傍に予め電磁石を配置しておき、磁性粒子の供給後に電磁石に電流を流すと共に、領域aの方向へと電磁石を移動させることになる。 In the case of using the electromagnet, it should be placed in advance electromagnet in the vicinity of the region b, together with the electric current to the electromagnet after the supply of the magnetic particles, so that moving the electromagnet in the direction of the region a.

以上、本発明の検出方法に関する種々の形態を説明してきたが、本発明の検出方法はこれに限定されず、種々の改変が為され得ることを当業者は理解されよう。 Having thus described various forms for the detection method of the present invention, the detection method of the present invention is not limited thereto, those skilled in the art that various modifications may be made will be understood.

例えば、複合体の形成に、アビジン−ビオチン反応を利用してもよい。 For example, for formation of a complex, avidin - it may be utilized biotin reaction. この場合には、次のような態様になる。 In this case, the following aspects. ちなみに、アビジンとビオチンとは相互に結合しやすい性質を有している。 By the way, the avidin and biotin has a binding property of easily with each other. また、アビジンはストレプトアビジン、ニュートラビジンでもかまわない。 In addition, avidin may be a streptavidin, neutravidin.

(ケース1) (Case 1)
ケース1は図6Aを参照して説明する。 Case 1 will be described with reference to Figure 6A. まず、図6A(a)に示すように、特異的結合物質20(即ち「物質b」)を部材21に固定化する。 First, as shown in FIG. 6A (a), the specific binding agent 20 (i.e. "material b") immobilizing the member 21. 次に試料を供給して、図6A(b)に示すように、被検物質22を特異的結合物質20に結合させる。 The samples and supplies, as shown in FIG. 6A (b), to bind the analyte 22 to a specific binding substance 20. 次いで、図6Aの(c)および(d)に示すように、アビジン23で修飾した特異的結合物質24を被検物質22に結合させる。 Then, as shown in (c) and (d) in FIG. 6A, to bind the specific binding agent 24 modified with avidin 23 to analyte 22. 次いで、図6A(e)に示すように、ビオチン25を固定化した貴金属コート磁性粒子26を、アビジン−ビオチン反応を介して、上記アビジン23に結合させる。 Then, as shown in FIG. 6A (e), the noble-metal-coated magnetic particles 26 immobilized biotin 25, avidin - via the biotin reaction, it is bound to the avidin 23. これにより、図6A(f)に示すようなサンドイッチ構造の複合体27を得ることができる。 Thus, it is possible to obtain a composite body 27 of the sandwich structure shown in FIG. 6A (f).

(ケース2) (Case 2)
ケース2は図6Bを参照して説明する。 Case 2 will be described with reference to Figure 6B. まず、図6B(a)に示すように、特異的結合物質20(即ち「物質b」)を部材21に固定化する。 First, as shown in FIG. 6B (a), the specific binding agent 20 (i.e. "material b") immobilizing the member 21. 次に試料を供給して、図6B(b)に示すように、被検物質22を特異的結合物質20に結合させる。 The samples and supplies, as shown in FIG. 6B (b), to bind the analyte 22 to a specific binding substance 20. 次いで、図6Bの(c)および(d)に示すように、ビオチン25で修飾した特異的結合物質24を被検物質22に結合させる。 Then, as shown in (c) and (d) of FIG. 6B, to bind the specific binding agent 24 modified with biotin 25 to analyte 22. 次いで、図6B(e)に示すように、アビジン23を固定化した貴金属コート磁性粒子26を、アビジン−ビオチン反応を介して、上記ビオチン25に結合させる。 Then, as shown in FIG. 6B (e), the noble-metal-coated magnetic particles 26 immobilized avidin 23, avidin - via the biotin reaction, it is bound to the biotin 25. これにより、図6B(f)に示すようなサンドイッチ構造の複合体27を得ることができる。 Thus, it is possible to obtain a composite body 27 of the sandwich structure shown in FIG. 6B (f).

(ケース3) (Case 3)
ケース3は図6Cを参照して説明する。 Case 3 will be described with reference to FIG. 6C. まず、図6C(a)に示すように、特異的結合物質20(即ち「物質b」)を部材21に固定化する。 First, as shown in FIG. 6C (a), the specific binding agent 20 (i.e. "material b") immobilizing the member 21. 次に試料を供給して、図6C(b)に示すように、被検物質22を特異的結合物質20に結合させる。 The samples and supplies, as shown in FIG. 6C (b), to bind the analyte 22 to a specific binding substance 20. 次いで、図6C(c)に示すように、アビジン−ビオチン反応を介して、アビジン23で修飾した特異的結合物質24を、ビオチン25が固定化された貴金属コート磁性粒子26と予め結合させる。 Then, as shown in FIG. 6C (c), avidin - via the biotin reaction, the specific binding agent 24 modified with avidin 23 to advance combined with noble-metal-coated magnetic particles 26 which biotin 25 is immobilized. 次いで、特異的結合物質24を特異的結合物質20上の被検物質22へと結合させることによって、図6C(d)に示すようなサンドイッチ構造の複合体27を得ることができる。 Then, by binding to the analyte 22 specific binding substances 20 on the specific binding substance 24, it is possible to obtain a composite 27 of the sandwich structure shown in Fig. 6C (d).

(ケース4) (Case 4)
ケース4は図6Dを参照して説明する。 Case 4 will be described with reference to FIG. 6D. まず、図6D(a)に示すように、特異的結合物質20(即ち「物質b」)を部材21に固定化する。 First, as shown in FIG. 6D (a), the specific binding agent 20 (i.e. "material b") immobilizing the member 21. 次に試料を供給して、図6D(b)に示すように、被検物質22を特異的結合物質20に結合させる。 The samples and supplies, as shown in FIG. 6D (b), to bind the analyte 22 to a specific binding substance 20. 次いで、図6D(c)に示すように、アビジン−ビオチン反応を介して、ビオチン25で修飾した特異的結合物質24を、アビジン23が固定化された貴金属コート磁性粒子26と予め結合させる。 Then, as shown in FIG. 6D (c), avidin - via the biotin reaction, the specific binding agent 24 modified with biotin 25, avidin 23 to advance combined with noble-metal-coated magnetic particles 26 immobilized. 次いで、特異的結合物質24を特異的結合物質20上の被検物質22へと結合させることによって、図6D(d)に示すようなサンドイッチ構造の複合体27を得ることができる。 Then, by binding to the analyte 22 specific binding substances 20 on the specific binding substance 24, it is possible to obtain a composite 27 of the sandwich structure shown in Fig. 6D (d).

これまでの説明は、部材の物質b−被検出物質−磁性粒子の物質aから成る複合体を形成するサンドイッチ法に基づいているが、必ずしもこれに限定されない。 The preceding description, members substances b- object substance - are based on the sandwich method of forming a composite comprising a material a magnetic particle is not necessarily limited thereto. 例えば競合法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等において酵素と発色基質との組合せを用いる代わりに、本発明の工程(i)で用意される磁性粒子を用いると、好適に被検物質の検出を行うことができる。 Such as competitive method, immunoblotting, western blotting, Southern blotting, instead of using a combination of an enzyme and a chromogenic substrate in the Northern blot method or the like, the use of magnetic particles prepared by the process of the present invention (i), it can be detected suitably analyte. 更に、例えばラテックス凝集比濁法、ラテックス近赤外比濁法、粒子凝集法等においても、本発明の工程(i)で用意する磁性粒子を用いると、好適に被検物質の検出を行うことができる。 Furthermore, for example latex agglutination turbidimetry, latex near infrared turbidimetry, in particle agglutination method, the use of magnetic particles to be prepared in the process of the present invention (i), suitably possible to detect the test substance can.

次に、以下において、本発明の検出方法の工程(i)で用意される磁性粒子の調製方法について更に詳細に説明する。 Then, in the following, it will be described in more detail how the preparation of the magnetic particles prepared in the step detection process (i) of the present invention.

工程(i)で用いる磁性粒子は、以下の(1)〜(3)の工程を含んで成る方法で調製されることが好ましい: Magnetic particles used in step (i) is preferably prepared by the process comprising the following steps (1) to (3) Step:
(1)中央領域が磁性材料から形成され、かつ、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子p、および、被検物質に結合可能な物質aを用意する工程; (1) central region is formed of a magnetic material and magnetic particles p of the shell region is formed from a noble metal material, and a step of preparing a substance a binding to the test substance;
(2)磁性粒子pと物質aとを接触させ、物質aが固定化された磁性粒子p'(即ち、「工程(i)で用いる磁性粒子」)を含んで成る混合物を得る工程;ならびに (3)得られた混合物に磁場を印加して、混合物から磁性粒子p'を分離する工程(即ち「磁気分離工程」)。 (2) contacting the magnetic particles p and material a, material a magnetic particles immobilized p '(i.e., "step (i) magnetic particles used in") obtaining a mixture comprising; and ( 3) the resulting mixture by applying a magnetic field to the step of separating the magnetic particles p 'from the mixture (i.e. "magnetic separation step").

工程(2)および工程(3)は、緩衝液(例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS 衝液、HEPES緩衝液またはMOPS緩衝液)などの溶液中または有機溶媒中で実施することが好ましい。 Step (2) and the step (3) comprise buffers (e.g., tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, PBS 衝液, HEPES buffer or MOPS buffer) solution such as an organic solvent in is preferably performed.

このような調製方法では、磁場の影響下で磁性粒子p'を混合物から分離するため、比較的短い時間で、工程(i)で用いる磁性粒子を得ることができる。 In such a preparation method, for separating magnetic particles p 'under the influence of a magnetic field from the mixture, in a relatively short time, it is possible to obtain the magnetic particles used in step (i). また、磁性粒子p'の分離に際して遠心分離操作やフィルター操作を行っていないため、全工程を自動化し易い利点がある。 Further, since no subjected to centrifugal separation or filtering upon separation of the magnetic particles p ', there is likely an advantage to automate the entire process. 更に、物質aが硫黄原子を含んでいると、その硫黄原子と磁性粒子pの貴金属材料とが容易に結合するので、比較的容易に物質aを磁性粒子pに固定化できる。 Furthermore, the material a contains a sulfur atom, since the noble metal material for the sulfur atom and the magnetic particles p is easily coupled, relatively easy to immobilize the material a magnetic particle p.

工程(3)では、図7に示すように、磁場の印加によって、工程(2)で得られた混合物を磁性粒子p'がより多い相Aと磁性粒子p'がより少ない相Bとに分けた後、相Bを混合物から取り除くことが好ましい。 In step (3), as shown in FIG. 7, the application of a magnetic field, separated step (2) magnetic particles p 'is greater phase A and the magnetic particles p' resulting mixture is in the lower phase B after, it is preferable to remove the phase B from the mixture.

また、工程(2)では、「物質aと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカー」を磁性粒子pに結合させた後、そのリンカーに対して物質aを結合させることによって、磁性粒子p'を得てもよい。 Further, in the step (2), after the "linker comprising a material a and functional group capable of bonding and sulfur atom" it was bound to the magnetic particles p, by binding material a with respect to the linker, magnetic it may be obtained the particle p '. 同様に、工程(2)では、「物質aと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカー」を物質aに予め結合させた後、そのリンカーを磁性粒子pに結合させることによって、磁性粒子p'を得てもよい。 Similarly, in step (2), after the "linker comprising a material a and functional group capable of bonding and sulfur atom" prebound to the substance a, by coupling the linker to the magnetic particles p, magnetic it may be obtained the particle p '. なお、リンカーに硫黄原子が含まれる理由は、硫黄原子が磁性粒子pに含まれる貴金属と結合し易い性質があるからであり、その性質を利用して、リンカーを磁性粒子へと容易に結合させるためである。 The reason that contains a sulfur atom in the linker, sulfur atom is because there is a property of easily binding the noble metal contained in the magnetic particles p, by utilizing the nature, is readily coupled to the linker to magnetic particles This is because. 「物質aと結合可能な官能基」としては、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、二重結合等の官能基または該官能基誘導体などを挙げることができる。 The "substance a capable of binding functional group", a thiol group, a sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, a hydrazide group, amino group, carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, iodoacetyl groups, and the like functional group or functional group derivatives such as a double bond.

リンカーとしては、例えば「ヘテロ二価性架橋試薬」または「ホモ二価性架橋試薬」を用いることができる。 The linker can be used, for example a "heterobifunctional crosslinking reagents" or "homo bifunctional crosslinking reagent".
「ヘテロ二価性架橋試薬」は、例えば、 "Hetero-bifunctional crosslinking reagent" is, for example,
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基または該官能基誘導体と、 Thiol group, a sulfide functional group or functional group derivatives such as a thioether group or a disulfide group,
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物または二重結合等の官能基または該官能基誘導体との組み合わせから成るヘテロ二価性架橋試薬を挙げることができる。 Thiol group, sulfide functional groups such as a thioether group or disulfide group, aldehyde group, an epoxy group, a tosyl group, an azide group, a succinimide group, maleimide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, carboxyl group, ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, and a hetero-bifunctional cross-linking reagents comprising a combination of iodoacetyl groups, a functional group or functional group derivative of the acid chloride or double bonds, and the like.
また、「ホモ二価性架橋試薬」は、例えば、チオール、チオエーテル、ジスルフィド等の硫化物官能基または該官能基誘導体から成るホモ二価性架橋試薬を挙げることができる。 Further, "homo bifunctional crosslinking reagent" includes, for example, thiols, thioethers, homo bifunctional crosslinking reagent consisting of sulfide functional group or functional group derivatives such as disulfide.

一例として、「ヘテロ二価性架橋試薬」をリンカーとして用いる形態について説明する。 It is described as an example embodiment using a "heterobifunctional crosslinking reagents" as a linker. まず、緩衝液中または有機溶剤中で物質aとヘテロ二価性架橋試薬とを加えて、攪拌する。 First, the addition of the material a and the heterobifunctional cross-linking reagents in buffer or in an organic solvent and stirred. これによって、両者が反応して、物質aとヘテロ二価性架橋試薬との結合体が得られる。 Thus, it reacts, conjugates of material a and the heterobifunctional cross-linking reagents is obtained. 次いで、この結合体を抽出して、磁性粒子pと接触させることによって、ヘテロ二価性架橋試薬の介在により物質aが磁性粒子p'に固定化される。 Then, by extracting the conjugate, by contacting with the magnetic particles p, material a is immobilized to the magnetic particles p 'by the interposition of heterobifunctional crosslinking reagents. 最終的には、磁性粒子p'を磁気分離した後、緩衝液または有機溶剤などで洗浄することが好ましい。 Eventually, after magnetic separation of the magnetic particles p ', it is preferably washed, such as with a buffer or an organic solvent.

上記の「ヘテロ二価性架橋試薬」および「ホモ二価性架橋試薬」などのリンカーを用いて物質aを磁性粒子pに結合させる際、必要に応じて、磁性粒子pへの非特異的反応を抑制することが好ましい。 When coupling the material a magnetic particle p with a linker, such as "heterobifunctional crosslinking reagent" and "homo bifunctional crosslinking reagent" above, if necessary, non-specific reaction to the magnetic particles p preferably be suppressed. 従って、正常血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳などを磁性粒子pに接触させること等の公知の手法によって、磁性粒子pへの非特異的吸着を抑えるブロッキングを行ってもよい。 Therefore, normal serum, bovine serum albumin, human serum albumin, casein, by a known method such as contacting the like to the magnetic particles p skim milk may be subjected to a blocking of suppressing non-specific adsorption to the magnetic particles p .

以上、貴金属コート磁性粒子を用いた被検物質の検出方法、および、その貴金属コート磁性粒子の調製方法について説明してきた。 Above, the detection method of the analyte using the noble metal-coated magnetic particles, and has been described a method for preparation of the noble metal-coated magnetic particles. 本発明においては、かかる検出方法のみならず、その検出方法に用いることができる被検物質検出キットも提供される。 In the present invention, not only such a detection method only, analyte detection kit that can be used in the detection methods are also provided.

本発明の被検物質検出キットは、磁性粒子および部材を有して成る。 Analyte detection kit of the present invention comprises a magnetic particle and components. この「磁性粒子」および「部材」とは、それぞれ、上記の本発明の被検物質の工程(i)で用意される「中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、被検物質に結合することが可能な物質aが外殻領域に固定化された磁性粒子」および「被検物質に結合することが可能な物質bが固定化されている部材」のことを意味している。 This "magnetic particles" and "member", respectively, "the central region is provided in step (i) of the test substance of the invention described above is formed of a magnetic material, the shell region is formed from a noble metal and has a magnetic particle, material b capable of binding to the magnetic particles, "and" analyte substance a is fixed to the outer shell region capable of binding to the analyte is immobilized and that means that the member ". 従って、被検物質検出キットに含まれる「磁性粒子」および「部材」は、既に上記で詳細に説明してきたので、重複を避けるべく更なる説明は行わない。 Thus, and "magnetic particles" contained in the analyte detection kit "member" because already been described in detail above and will not be further described to avoid duplication. なお、本発明の検出キットには、磁場の印加に用いる磁石または電磁石を含めてもよい。 Incidentally, the detection kit of the present invention may include a magnet or electromagnet used in the application of a magnetic field.

本発明の検出方法の効果を確認すべく、以下の実施例1〜3および比較例1〜3を実施した。 In order to confirm the effect of the detection method of the present invention were carried out Examples 1-3 and Comparative Examples 1-3 below. 実施例1〜3は、貴金属コート磁性粒子を用いた例であり、比較例1〜3は、金コロイドを用いた例である。 Examples 1 to 3, an example of using the noble metal-coated magnetic particles, Comparative Examples 1 to 3 is an example of using the gold colloid.

《実施例1》 "Example 1"
(貴金属コート磁性粒子の製造および調製) (Manufacture and preparation of the noble metal-coated magnetic particles)
実施例1では、本発明の検出方法の工程(i)で用意される磁性粒子を製造・調製した。 In Example 1, the magnetic particles prepared in step (i) of the detection method of the present invention were manufactured and prepared. 磁性材料としてFe 50 Pt 50合金(以下では単に「Fe 50 Pt 50 」と呼ぶ)を用い、貴金属材料としてAuを用い、また、「被検物質に結合することが可能な物質a」として卵白アルブミン抗体を用いた。 Fe 50 Pt 50 alloy (simply referred to as in the following "Fe 50 Pt 50") used as the magnetic material, using Au as the noble metal material and ovalbumin as "substance a capable of binding to the analyte" antibody was used.

貴金属コート磁性粒子の製造では、中央領域の材料としてFe 50 Pt 50磁性粒子を使用し、その表面を置換メッキ法によりAu層で被覆した。 In the manufacture of noble metal-coated magnetic particles, using a Fe 50 Pt 50 magnetic particles as the material of the central region was covered with an Au layer by the surface displacement plating method. 得られた粒子をアクリル樹脂で包埋し、ミクロトームを用いて超薄切片を作製して電子顕微鏡で観察した。 The resulting particles were embedded in acrylic resin, was observed with an electron microscope to prepare an ultrathin section with a microtome. その結果、貴金属コート磁性粒子の直径が50nmであり、その外周を厚さ20nmのAuが被覆していることが分かった。 As a result, a 50nm diameter of the noble metal-coated magnetic particles, it was found that the outer periphery thereof Au having a thickness of 20nm is coated. また、試料振動型磁力計(東英工業製、型式VSM−5)を用いて、得られた粒子の磁気特性を測定した結果、飽和磁化が60emu/gであり、保磁力が800エルステッドであることが分かった。 Also, a vibrating sample magnetometer (manufactured by Toei Kogyo, Model VSM-5) with the result that the magnetic properties of the particles obtained was measured, the saturation magnetization is 60 emu / g, coercive force is 800 Oe it was found.

まず、卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度1mg/mlの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。 First, ovalbumin antibody was dissolved in PBS, and to prepare a solution having a concentration of 1mg / ml ovalbumin antibody. 次いで、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子をPBS緩衝液に分散させて、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子分散液を得た。 Then, an Au coating Fe 50 Pt 50 magnetic particles are dispersed in PBS buffer, to give a Au coating Fe 50 Pt 50 magnetic particle dispersion. 次いで、5mg/mlのAuコートFe 50 Pt 50磁性粒子分散液に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子分散液1ml当り10μgとなる割合で加えた後、その1mlに濃度10mg/mlのBSAを0.1ml加えた。 Then, with respect to Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particle dispersion of 5 mg / ml, ovalbumin antibodies by introducing a thiol group by S- acetyl acetic active ester solution, Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particle dispersion 1ml after added thereto so that the ratio of per 10 [mu] g, was added 0.1ml of BSA concentration 10mg / ml in the 1 ml. そして、図7に示すような磁気分離に付し、上澄み液を除去した。 Then, subjected to magnetic separation as shown in FIG. 7, the supernatant was removed. BSAを1mg/mlで含有するPBSを用いることによって、磁気分離操作により3回洗浄した。 By using PBS containing at 1mg / ml of BSA, and then washed 3 times by magnetic separation. 以上の操作によって、卵白アルブミン抗体が固定化されたAuコートFe 50 Pt 50磁性粒子の分散液を得た。 By the above operation, ovalbumin antibody was obtained a dispersion of immobilized Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles.

《比較例1》 "Comparative Example 1"
(金コロイドの製造および調製) (Manufacture and preparation of colloidal gold)
実施例1の「卵白アルブミン抗体が固定化されたAuコートFe 50 Pt 50磁性粒子」と比較するために、「卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイド」を製造・調製した。 For comparison with the "Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles ovalbumin antibody was immobilized" in Example 1, was manufactured and prepared "ovalbumin antibody colloidal gold immobilized".

まず、0.01重量%の塩化金水溶液200mlを沸騰させ、濃度1重量%のクエン酸ナトリウム水溶液を加え、溶液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わるまで加熱沸騰させることによって、金コロイド分散液を調製した(金コロイドの平均粒子径:0.04μm)。 First, boiled chloroauric solution 200ml of 0.01 wt%, was added a concentration of 1 wt% aqueous solution of sodium citrate, by heating boiling solution color from pale yellow to changes to purple or red, gold colloid dispersion solution was prepared (the average particle diameter of gold colloid: 0.04 .mu.m).

卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度1mg/mlの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。 Ovalbumin antibody was dissolved in PBS, and to prepare a solution having a concentration of 1mg / ml ovalbumin antibody. 次いで、5mg/mlの金コロイド分散液に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、金コロイド分散液1ml当り10μgとなる割合で加えた後、その1mlに濃度10mg/mlのBSAを0.1ml加えた。 Then, after added to the gold colloidal dispersion of 5 mg / ml, ovalbumin antibodies by introducing a thiol group by S- acetyl acetic active ester solution, so that the ratio of gold colloid dispersion 1ml per 10 [mu] g, the 1ml the BSA concentration 10mg / ml was added 0.1ml to. 次いで、遠心分離に付し、上澄み液を除去した。 Then, centrifuged, the supernatant was removed. BSAを1mg/mlで含有するPBSを用いることによって、遠心分離操作により3回洗浄した。 By using PBS containing at 1mg / ml of BSA, and then washed 3 times by centrifugation operation. 以上の操作によって、卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイドの分散液を得た。 By the above operation, ovalbumin antibodies to obtain a dispersion of the immobilized colloidal gold.

《実施例2》 "Example 2"
(貴金属コート磁性粒子を用いたイムノクロマト法による卵白アルブミンの検出) (Detection of ovalbumin by immunochromatography method using a noble-metal-coated magnetic particles)
図4Aに示すようなイムノクロマト法で本発明の検出方法を実施した。 The detection method of the present invention was carried out in immunochromatographic method as shown in Figure 4A. 貴金属コート磁性粒子としては、実施例1で得られた「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子の分散液」を用いた。 The noble-metal-coated magnetic particles, using "dispersion of Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles" obtained in Example 1. 被検物質は卵白アルブミンである。 The test substance is ovalbumin.

まず、卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度1mg/mlの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。 First, ovalbumin antibody was dissolved in PBS, and to prepare a solution having a concentration of 1mg / ml ovalbumin antibody. 次いで、5mg/mlの「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子の分散液」に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子分散液1ml当り10μgとなる割合で加えた後、その1mlに濃度10mg/mlのBSAを0.1ml加えた。 Then, for the "dispersion of Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles" of 5 mg / ml, ovalbumin antibodies by introducing a thiol group by S- acetyl acetic active ester solution, Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles after added thereto so that the ratio of dispersion 1ml per 10 [mu] g, was added 0.1ml of BSA concentration 10mg / ml in the 1ml. 次いで、磁気分離に付し、上澄み液を除去した。 Then, subjected to magnetic separation, the supernatant was removed. BSAを1mg/mlで含有するPBSを用いて磁気分離操作により3回洗浄した後、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子を上記PBS1mlに再分散させた。 After washing three times by magnetic separation with PBS containing BSA at 1 mg / ml, and the Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles redispersed in the 1 ml of PBS. 次いで、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子を不織布に含浸させて凍結乾燥に付すことによって、「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子標識抗体含有不織布」を調製した。 Then the Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles by subjecting the freeze-dried impregnated into the nonwoven fabric, to prepare a "Au coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles-labeled antibody-containing nonwoven fabric".

市販のニトロセルロース(ミリポア製)より10mm×50mmのクロマトグラフ・ストリップを裁断し、その端部aから2cmの位置にて展開方向と垂直方向に2μlの卵白アルブミン抗体の溶液を10mm長さで塗布した。 Cutting the chromatographic strip commercial 10mm × 50 mm than nitrocellulose (Millipore), applying a solution of 2μl of ovalbumin antibody development and vertical directions at the position of 2cm from the end portion a in 10mm length did.

10mm×80mmの粘着樹脂上にクロマトグラフ・ストリップの短辺の端部を揃えて重ね、更にその上に10mm×60mmの濾紙を重ね、固定した。 Again aligning the ends of the short side of the chromatographic strip on the adhesive resin 10 mm × 80 mm, further overlapping 10 mm × 60 mm filter paper thereon and fixed. クロマトグラフ・ストリップの端部aとは別の端部bの近傍領域に「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子標識抗体含有不織布」を配置した。 The end a of the chromatographic strip was placed "Au coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles-labeled antibody-containing nonwoven fabric" in the area near the other end b. 更に、その「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子標識抗体含有不織布」に重なるように10mm×20mmの不織布をサンプルパッドとして配置した。 Furthermore, to place the 10 mm × 20 mm of the nonwoven fabric so as to overlap the "Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles-labeled antibody-containing nonwoven fabric" as sample pad.

市販の卵白アルブミン(CALBIOCHEM製)を、BSAを1mg/mlで含有するPBS緩衝液で希釈して20ng/mlの卵白アルブミン試料を調製した。 Commercial ovalbumin (manufactured by CALBIOCHEM), BSA was prepared with PBS buffer solution was diluted with 20 ng / ml of ovalbumin samples containing at 1 mg / ml.

その卵白アルブミン試料の200μlをサンプルパッドに滴下し、展開させた。 Was added dropwise 200μl of ovalbumin sample to the sample pad, it was developed. 10分経過後、「卵白アルブミン抗体の溶液を塗布したクロマトグラフ・ストリップ領域」を観察した。 After 10 minutes, to observe the "chromatographic strip region solution was coated ovalbumin antibody". その結果、卵白アルブミンの存在を示すライン(即ち「色の変化」)を確認することができた。 As a result, it was possible to confirm the line (ie, "color change") that indicates the presence of ovalbumin.

次に、同様のイムノクロマト法を、図4Aに示すような位置に磁石を配置する態様で実施した。 Then, similar immunochromatography was carried out in a manner to place a magnet in the position shown in Figure 4A. つまり、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子を磁場の影響下おいた状態でイムノクロマト法を行った。 That were immunochromatographic the Au coating Fe 50 Pt 50 magnetic particles in a state affected had under the magnetic field. この場合でも、「卵白アルブミン抗体の溶液を塗布したクロマトグラフ・ストリップ領域」において、卵白アルブミンの存在を示すラインを確認することができた。 In this case, the "chromatographic strip region solution was coated ovalbumin antibody", it was possible to confirm the line indicating the presence of ovalbumin.

《比較例2》 "Comparative Example 2"
(金コロイドを用いたイムノクロマト法による卵白アルブミンの検出) (Detection of ovalbumin by immunochromatography using a gold colloid)
貴金属コート磁性粒子ではなく金コロイドを用いることによって、図4Aに示すようなイムノクロマト法を実施した。 By using colloidal gold instead of noble metal-coated magnetic particles, it was carried out immunochromatography, as shown in Figure 4A. 金コロイドとしては、比較例1で得られた金コロイドの分散液を用いた。 The gold colloid was used a dispersion of colloidal gold obtained in Comparative Example 1. 被検物質は、実施例2と同様、卵白アルブミンである。 Test substance, as described in Example 2, is ovalbumin.

まず、卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度1mg/mlの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。 First, ovalbumin antibody was dissolved in PBS, and to prepare a solution having a concentration of 1mg / ml ovalbumin antibody. 次いで、5mg/mlの金コロイドの分散液に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、金コロイド分散液1ml当り10μgとなる割合で加えた後、その1mlに濃度10mg/mlのBSAを0.1ml加えた。 Then, after adding the dispersion liquid of 5 mg / ml of colloidal gold, ovalbumin antibodies by introducing a thiol group by S- acetyl acetic active ester solution, so that the ratio of gold colloid dispersion 1ml per 10 [mu] g, the the BSA concentration 10mg / ml was added 0.1ml to 1 ml. 次いで、遠心分離に付し、上澄み液を除去した。 Then, centrifuged, the supernatant was removed. BSAを1mg/mlで含有するPBSを用いて遠心分離操作により3回洗浄した後、金コロイドを上記PBS1mlに再分散させた。 After washing three times by centrifugation manipulate BSA with PBS containing at 1 mg / ml, the gold colloid was re-dispersed in the 1 ml of PBS. 次いで、金コロイドを不職布に含浸させて凍結乾燥に付すことによって、「金コロイド標識抗体含有不織布」を調製した。 Then, by subjecting the freeze-dried gold colloid impregnated into nonwoven fabric, to prepare "colloidal gold-labeled antibody-containing nonwoven fabric".

市販ニトロセルロース(ミリポア製)より10mm×50mmのクロマトグラフ・ストリップを裁断し、その端部aから2cmの位置にて展開方向と垂直に2μlの卵白アルブミン抗体の溶液を10mmの長さで塗布した。 Commercially available nitrocellulose was cut chromatographic strips 10mm × 50 mm than (manufactured by Millipore), and the solution of the deployment direction perpendicular to 2μl of ovalbumin antibody at the position of 2cm from the end portion a is applied by the length of 10mm .

10mm×80mmの粘着樹脂上にクロマトグラフ・ストリップの短辺の端部を揃えて重ね、更にその上に10mm×60mmの濾紙を重ね、固定した。 Again aligning the ends of the short side of the chromatographic strip on the adhesive resin 10 mm × 80 mm, further overlapping 10 mm × 60 mm filter paper thereon and fixed. クロマトグラフ・ストリップの端部aとは別の端部bの近傍領域に「金コロイド標識抗体含有不織布」を配置した。 The end a of the chromatographic strip was placed "gold colloid-labeled antibody-containing nonwoven fabric" in the area near the other end b. 更に、その「金コロイド標識抗体含有不織布」に重なるように10mm×20mmの不織布をサンプルパッドとして配置した。 Furthermore, to place the the 10 mm × 20 mm so as to overlap the "gold colloid-labeled antibody-containing nonwoven fabric" nonwoven as a sample pad.

市販の卵白アルブミン(CALBIOCHEM製)を、BSAを1mg/mlで含有するPBS緩衝液で希釈して20ng/mlの卵白アルブミン試料を調製した。 Commercial ovalbumin (manufactured by CALBIOCHEM), BSA was prepared with PBS buffer solution was diluted with 20 ng / ml of ovalbumin samples containing at 1 mg / ml.

その卵白アルブミン試料の200μlをサンプルパッドに滴下し、展開させた。 Was added dropwise 200μl of ovalbumin sample to the sample pad, it was developed. 10分経過後、「卵白アルブミン抗体の溶液を塗布したクロマトグラフ・ストリップ領域」を観察した。 After 10 minutes, to observe the "chromatographic strip region solution was coated ovalbumin antibody". その結果、卵白アルブミンの存在を示すライン(即ち「色の変化」)を確認することができた。 As a result, it was possible to confirm the line (ie, "color change") that indicates the presence of ovalbumin.

《実施例3》 "Example 3"
(貴金属コート磁性粒子を磁気誘導させたサンドイッチイムノアッセイ法によるC反応性たんぱく質(CRP)の検出) (Detection of C-reactive protein by the sandwich immunoassay was magnetically guides the noble-metal-coated magnetic particles (CRP))
図3Aに示すような磁気誘導を用いたサンドイッチイムノアッセイ法で本発明の検出方法を実施した。 The detection method of the present invention was carried out in a sandwich immunoassay method using magnetic induction, as shown in Figure 3A. 貴金属コート磁性粒子としては、実施例1で得られた「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子の分散液」を用いた。 The noble-metal-coated magnetic particles, using "dispersion of Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles" obtained in Example 1. 被検物質はたんぱく質(CRP)である。 Analyte is a protein (CRP).

まず、CRP抗体をPBSに溶解させ、濃度1mg/mlのCRP抗体の溶液を調製した。 First, CRP antibody was dissolved in PBS, and to prepare a solution having a concentration of 1mg / ml of CRP antibodies. 5mg/mlの「AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子の分散液」に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入したCRP抗体の溶液を、AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子分散液1ml当り10μgとなる割合で加えた後、その1mlに濃度10mg/mlのBSAを0.1ml加えた。 Respect of 5 mg / ml "dispersion of Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles", the solution of the CRP antibody to introduce thiol groups to the S- acetyl acetic active ester, Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particle dispersion 1ml after added thereto so that the ratio of per 10 [mu] g, was added 0.1ml of BSA concentration 10mg / ml in the 1 ml. 次いで、磁気分離に付し、上澄み液を除去した。 Then, subjected to magnetic separation, the supernatant was removed. BSAを1mg/mlで含有するPBSを用いて、磁気分離操作により3回洗浄した。 The BSA with PBS containing at 1 mg / ml, and washed 3 times by magnetic separation. 以上の操作によって、CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子の分散液を得た。 By the above operation, to obtain a dispersion of noble metal-coated magnetic particles CRP antibody is immobilized.

市販のスライドガラス(松浪ガラス製)をシランカップリング処理し、スライドガラス表面をアミノ化した。 Commercially available slide glass (manufactured by Matsunami Glass) silane coupling treatment was aminated slide glass surface. 次いで、グルタルアルデヒドをスライドガラス表面に加え、反応させた後、洗浄した。 Then added glutaraldehyde slide glass surface and it reacted, and washed. 次いで、CRP抗体をPBS緩衝液に溶かした溶液をスライドガラス表面の一部分に塗布した後、一晩静置し、PBSで洗浄した。 Then, after coating the solution of CRP antibody in PBS buffer to a portion of the slide glass surface, allowed to stand overnight and washed with PBS. このような操作によって、表面の一部にCRP抗体が固定化されたプレート基板を得た。 Such operation, CRP antibodies to a portion of the surface to obtain a plate substrate immobilized. なお、CRP抗体が固定化されているプレート領域を「CRP抗体固定化部位」と呼び、CRP抗体が固定化されていないプレート領域を「CRP抗体非固定化部位」と呼ぶ。 Note that the plate area CRP antibody is immobilized is referred to as "CRP antibody-immobilized site", a plate area CRP antibody is not immobilized is referred to as "CRP antibody-immobilized site".

市販のCRP(CHEMICON製)を、BSAを1mg/mlで含有するPBS緩衝液で希釈して200ng/mlのCRP試料を調製した。 Commercial CRP (manufactured by CHEMICON), was prepared CRP samples 200 ng / ml diluted in PBS buffer containing BSA at 1 mg / ml.

そのCRP試料の200μlをプレート基板上に滴下、静置し、洗浄を行った後、更に、「CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子の分散液」を、CRP抗体非固定化部位に滴下した。 Dropwise 200μl of CRP sample plate substrate, and allowed to stand, after washing, further, a "dispersion of noble metal-coated magnetic particles CRP antibody is immobilized", added dropwise to CRP antibody-immobilized site did. 次いで、「CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子」がCRP抗体固定化部位を通過するように、供給された貴金属コート磁性粒子と磁石とがCRP抗体固定化部位を挟み込むようにプレート基板の側面に磁石を配置した。 Then, "noble-metal-coated magnetic particles CRP antibody is immobilized" is to pass through the CRP antibody-immobilized site, and supplied noble metal-coated magnetic particles and the magnet of the plate substrate so as to sandwich the CRP antibody-immobilized site It was placed a magnet on the side. これにより、「CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子」を磁場の影響下に置いて磁気誘導に付した。 Thus, it was subjected to magnetic induction at the "noble-metal-coated magnetic particles CRP antibody is immobilized" under the influence of a magnetic field. その後、CRP抗体固定化部位を観察した。 Then, to observe the CRP antibody-immobilized site. その結果、CRPの存在を示す色の変化を確認することができた。 As a result, it was possible to see a change in color indicating the presence of CRP.

《比較例3》 "Comparative Example 3"
(金コロイドを用いたサンドイッチイムノアッセイによるC反応性たんぱく質(CRP)の検出) (Detection of gold colloid C-reactive protein by a sandwich immunoassay using the (CRP))
貴金属コート磁性粒子ではなく金コロイドを用いることによってサンドイッチイムノアッセイ法を実施した。 It was performed sandwich immunoassay method by the use of colloidal gold instead of noble metal-coated magnetic particles. 金コロイドは、比較例1と同様に調製した。 Gold colloid was prepared in the same manner as in Comparative Example 1. 被検物質は、実施例3と同様にたんぱく質(CRP)である。 Analyte is a protein (CRP) in the same manner as in Example 3.

まず、比較例1で説明した方法で金コロイド分散液を調製した(金コロイドの平均粒子径:0.04μm)。 First, a gold colloidal dispersion was prepared by the method described in Comparative Example 1 (average particle diameter of the colloidal gold: 0.04 .mu.m).

次いで、CRP抗体をPBSに溶解させ、濃度1mg/mlのCRP抗体の溶液を調製した。 Then, the CRP antibody was dissolved in PBS, and to prepare a solution having a concentration of 1mg / ml of CRP antibodies. 次いで、5mg/mlの金コロイドに対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入したCRP抗体の溶液を、金コロイド分散液1ml当り10μgとなる割合で加えた後、その1mlに濃度10mg/mlのBSAを0.1ml加えた。 Then, after added to 5 mg / ml of gold colloid, a solution of CRP antibody was introduced thiol group by S- acetyl acetic active ester, in a ratio which is a gold colloid dispersion 1ml per 10 [mu] g, the concentration to the 1ml 10 mg / a ml BSA was added 0.1 ml. 次いで、遠心分離に付し、上澄み液を除去した。 Then, centrifuged, the supernatant was removed. BSAを1mg/mlで含有するPBSを用いることによって、遠心分離操作により3回洗浄した。 By using PBS containing at 1mg / ml of BSA, and then washed 3 times by centrifugation operation. 以上の操作によって、「CRP抗体が固定化された金コロイドの分散液」を得た。 By the above operation, to obtain a "dispersion of colloidal gold-CRP antibody is immobilized."

市販のスライドガラス(松浪ガラス製)をシランカップリング処理し、スライドガラス表面をアミノ化した。 Commercially available slide glass (manufactured by Matsunami Glass) silane coupling treatment was aminated slide glass surface. 次いで、グルタルアルデヒドをスライドガラス表面に加え、反応させた後、洗浄した。 Then added glutaraldehyde slide glass surface and it reacted, and washed. 次いで、CRP抗体をPBS緩衝液に溶かした溶液をスライドガラス表面の一部分に塗布した後、一晩静置し、更にPBSで洗浄した。 Then, after coating the solution of CRP antibody in PBS buffer to a portion of the slide glass surface, allowed to stand overnight, further washed with PBS. このような操作によって、表面の一部にCRP抗体が固定化されたプレート基板を得た。 Such operation, CRP antibodies to a portion of the surface to obtain a plate substrate immobilized. なお、実施例3と同様、CRP抗体が固定化されているプレート領域を「CRP抗体固定化部位」と呼び、CRP抗体が固定化されていないプレート領域を「CRP抗体非固定化部位」と呼ぶ。 Incidentally, similarly to Example 3, the plate area CRP antibody is immobilized is referred to as "CRP antibody-immobilized site", a plate area CRP antibody is not immobilized is referred to as "CRP antibody-immobilized site" .

市販のCRP(CHEMICON製)を、BSAを1mg/mlで含有するPBS緩衝液で希釈して200ng/mlのCRP試料を調製した。 Commercial CRP (manufactured by CHEMICON), was prepared CRP samples 200 ng / ml diluted in PBS buffer containing BSA at 1 mg / ml.

そのCRP試料の200μlをプレート基板上に滴下、静置し、洗浄を行った後、更に、「CRP抗体が固定化された金コロイドの分散液」を、基板上のCRP抗体非固定化部位に滴下した。 Dropwise 200μl of CRP sample plate substrate, and allowed to stand, after washing, further, a "dispersion of colloidal gold-CRP antibody is immobilized", the CRP antibody-immobilized sites on the substrate the dropped. 次いで、「CRP抗体が固定化された金コロイド」がCRP抗体固定化部位へと流れるようにプレート基板を傾けた。 Then, "gold colloid-CRP antibody is immobilized" is tilted plate substrate to flow into the CRP antibody-immobilized site. その後、CRP抗体固定化部位を観察した。 Then, to observe the CRP antibody-immobilized site. その結果、CRPの存在を示す色の変化を確認することができた。 As a result, it was possible to see a change in color indicating the presence of CRP.

(まとめ) (Summary)
(1)AuコートFe 50 Pt 50磁性粒子を調製した実施例1の場合と、金コロイドを調製した比較例1の場合とで洗浄時間を比較した。 (1) was compared with the case of Au-coated Fe 50 Pt 50 Example 1 The magnetic particles were prepared, the cleaning time in the case of Comparative Example 1 prepared gold colloid. 結果を表1に示す。 The results are shown in Table 1. 実施例1は磁気分離操作で精製した例であり、比較例は遠心分離操作で精製した例である。 Example 1 is an example in which purified by magnetic separation, Comparative Example is an example in which purified by centrifugation.

表1から分かるように、「卵白アルブミン抗体が固定化されたAuコートFe 50 Pt 50磁性粒子」の調製時間は、「卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイド」の調製時間よりも短くなっており、本発明の方法で用いる磁性粒子は比較的短時間で調製できることが分かった。 As can be seen from Table 1, the preparation time "ovalbumin antibody immobilized Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles", is shorter than the preparation time of the "gold colloid ovalbumin antibody was immobilized" cage, the magnetic particles used in the methods of the present invention has been found to be relatively short period of time in the preparation.

(2)「卵白アルブミン抗体が固定化されたAuコートFe 50 Pt 50磁性粒子」を用いて磁気輸送に付した実施例2の場合と、「卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイド」を用い、磁気輸送を行わなかった比較例2の場合とで、被検物質の検出時間を比較した。 (2) using in Example 2 was subjected to magnetic transport, the "gold colloid ovalbumin antibody was immobilized" using "ovalbumin antibody immobilized Au-coated Fe 50 Pt 50 magnetic particles" , in the case of Comparative example 2 was not performed magnetotransport were compared detection time of the test substance. 結果を表2に示す。 The results are shown in Table 2.

表2から分かるように、実施例2の検出時間は比較例2の検出時間よりも短く、本発明の検出方法が短時間で被検物質を検出できる方法であることが分かった。 As can be seen from Table 2, it was found that the detection time of the second embodiment is shorter than the detection time of Comparative Example 2, a method for the detection method of the present invention can detect the analyte in a short time.

本発明の被検物質の検出方法は、臨床検査分野等の生命科学分野、ならびに、食物アレルゲンやBSE検査等の食品安全性分野において有用であるだけでなく、土壌、水質汚染検査等の環境測定分野等においても有用である。 Detection method of a test substance of the present invention, life science fields such as clinical testing field, and not only useful in the food safety fields such as food allergens and BSE test, soil, environmental measurement such water pollution test it is also useful in the field and the like.

図1Aは、本発明の検出方法のフローチャートを示している。 Figure 1A shows a flow chart of a detection method of the present invention. 図1Bは、本発明の検出方法に用いる磁性粒子、部材および試料を模式的に表した断面図である。 Figure 1B is a cross-sectional view of a magnetic particle, a member and a sample schematically illustrating use in the detection method of the present invention. 図2は、第1実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 Figure 2 is a cross-sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the first embodiment. 図3Aは、第2実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 Figure 3A is a cross-sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the second embodiment. 図3Bは、第3実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 3B is a sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the third embodiment. 図4Aは、第4実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 Figure 4A is a cross-sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the fourth embodiment. 図4Bは、第5実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 Figure 4B is a cross-sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the fifth embodiment. 図5Aは、第6実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 Figure 5A is a cross-sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the sixth embodiment. 図5Bは、第7実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。 5B is a cross-sectional view schematically showing a detection method of the present invention according to the seventh embodiment. 図6Aは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である(ケース1)。 6A is avidin complex formation - is a cross-sectional view schematically showing the manner in which utilize biotin reaction (case 1). 図6Bは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である(ケース2)。 6B is avidin complex formation - is a cross-sectional view schematically showing the manner in which utilize biotin reaction (case 2). 図6Cは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である(ケース3)。 Figure 6C avidin complex formation - is a cross-sectional view schematically showing the manner in which utilize biotin reaction (case 3). 図6Dは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である(ケース4)。 Figure 6D avidin complex formation - is a cross-sectional view schematically showing the manner in which utilize biotin reaction (case 4). 図7は、磁性粒子の調製時の洗浄操作を模式的に示した断面図である。 Figure 7 is a cross-sectional view schematically showing the washing operation during the preparation of the magnetic particles.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1…物質aが固定化された貴金属コート磁性粒子、2…中央領域、3…外殻領域、4…物質a、5…部材に固定化された抗体、6…部材、7…被検物質、7'…試料、8…貴金属コート磁性粒子に固定化された抗体、9…複合体、10…部材(プレート部材または容器)、11…磁石または電磁石、12…部材(多孔質または繊維質から成る部材)、13…磁性粒子含浸部材、14…サンプルパッド、20…特異的結合物質(物質b)、21…部材、22…被検物質、23…アビジン、24…アビジンまたはビオチンで修飾した特異的結合物質、25…ビオチン、26…貴金属コート磁性粒子、27…複合体、30…磁性粒子p'、31…磁性粒子pに固定化されなかった物質a。 1 ... noble-metal-coated magnetic particles material a is fixed, 2 ... central region, 3 ... outer shell region, 4 ... material a, 5 ... immobilized antibody member, 6 ... member, 7 ... test substance, 7 '... sample, comprising 8 ... noble-metal-coated magnetic particles to the immobilized antibody, 9 ... complex, 10 ... member (plate member or container), 11 ... magnet or an electromagnet, 12 ... member (porous or fibrous members), 13 ... magnetic particles impregnated member, 14 ... sample pad, 20 ... specific binding substances (substance b), 21 ... member, 22 ... test substance, 23 ... avidin, specific modified with 24 ... avidin or biotin binding agent, 25 ... biotin, 26 ... noble-metal-coated magnetic particles, 27 ... complex, 30 ... magnetic particles p ', 31 ... material a that was not immobilized on magnetic particles p.

Claims (15)

  1. 試料中に含まれる被検物質を検出する方法であって、 A method for detecting an analyte contained in the sample,
    (i)中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、前記被検物質に結合することが可能な物質aが前記外殻領域に固定化された前記磁性粒子を用意すると共に、前記被検物質に結合することが可能な物質bが固定化された部材、および、前記被検物質を含んで成る試料を用意する工程、 (I) the central region is formed of a magnetic material, a magnetic particle shell region is formed from a noble metal material, wherein the substance a capable of binding to the analyte immobilized in the shell region while preparing the magnetic particles, the member material b that is capable of binding to the analyte is immobilized, and a step of preparing a sample comprising said analyte,
    (ii)前記磁性粒子および前記試料を前記部材に供給し、前記磁性粒子の前記物質aと前記部材の物質bとが前記被検物質を介して結合して形成された複合体を前記部材において得る工程、 (Ii) the magnetic particles and the sample was supplied to the member, in the material a and the member complexes in which the substance b are formed is bonded via said analyte of said members of said magnetic particles to obtain,
    (iii)前記部材にて前記物質bが固定化されている領域の状態を測定する工程、ならびに (iv)前記測定した結果に基づいて、前記被検物質の有無または量を判断する工程を含んで成り、 And (iii) based on the step material b measures the state of the area being immobilized, and (iv) As a result of the measurement by said member, comprising the step of determining the presence, absence or amount of the analyte made in,
    前記工程(ii)の前記複合体の形成を磁場の影響下で行い、 The formation of the complex of step (ii) is performed under the influence of a magnetic field,
    前記工程(i)で用意される前記部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域aに前記物質bが固定化されており、前記工程(ii)においては、前記内部領域a以外の前記部材の領域bに前記試料と前記磁性粒子とを供した後、前記内部領域aの近傍から前記磁場を印加する、あるいは、前記試料を前記内部領域aに供給した後、前記内部領域a以外の前記部材の領域bに前記磁性粒子を供し、前記内部領域aの近傍から前記磁場を印加する、ことを特徴とする方法。 A member wherein the member is prepared in the step (i) is made of porous or fibrous, the material b in at least a portion of the inside area a of the interior region is immobilized, wherein step (ii in), after subjecting the said sample and the magnetic particles in the region b of the member other than the inner region a, and applies the magnetic field from the vicinity of the inner region a, or the sample the interior region a after feeding, the method of the subjecting the magnetic particles in the region b of the members other than the internal region a, and applies the magnetic field from the vicinity of the inner region a, characterized in that.
  2. 前記磁場の印加は、前記表面aまたは前記内部領域aの近傍に磁石を配置すること、又は、前記表面aまたは前記内部領域aの近傍に配置された電磁石に電流を流すことによって実施することを特徴とする、請求項1に記載の方法。 Application of the magnetic field, placing the magnet in the vicinity of the surface a or the inner region a, or, to be carried out by supplying a current to said surface a or electromagnets placed in the vicinity of the inner area a It characterized the method of claim 1.
  3. 前記工程(i)で用意される前記磁性粒子の前記磁性材料が、強磁性体または超常磁性体であることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。 Wherein the magnetic material, characterized in that it is a ferromagnetic or superparamagnetic, The method according to claim 1 or 2 of the magnetic particles is prepared in the step (i).
  4. 前記工程(i)で用意される前記磁性粒子の前記貴金属材料が、金、白金、銀、および、これらの合金から成る群から選択される材料であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 Said noble metal material of the magnetic particles is prepared in the step (i) is a gold, platinum, silver, and characterized in that it is a material selected from the group consisting of an alloy according to claim 1 to 3 the method according to any one of.
  5. 前記工程(i)で用意される前記磁性粒子の平均粒径が5nm〜100μmであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 Wherein the average particle size of the magnetic particles is prepared in the step (i) is 5Nm~100myuemu, method according to any one of claims 1 to 4.
  6. 前記工程(i)で用意される前記磁性粒子の飽和磁化が0.5A・m /kg〜100A・m /kgであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 Wherein the saturation magnetization of the magnetic particles is prepared in the step (i) is 0.5A · m 2 / kg~100A · m 2 / kg, according to claim 1 Method.
  7. 前記磁性粒子の保磁力が0kA/m〜280kA/mであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 Wherein the coercive force of the magnetic particles is 0kA / m~280kA / m, method according to any one of claims 1 to 6.
  8. 前記物質aが、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 The material a is characterized by mutual it is either an antibody and antigen with a specific binding method according to any one of claims 1 to 7.
  9. 前記物質bが、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 Wherein the substance b, characterized in that mutually is either an antibody and antigen with a specific binding method according to claim 1.
  10. 前記工程(iii)の前記領域の状態は、前記領域の色の変化であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 The state of the region of step (iii), characterized in that it is a change in color of the area A method according to any of claims 1 to 9.
  11. 前記色が、前記複合体を構成する前記磁性粒子の呈色に起因することを特徴とする、請求項10に記載の方法。 The color, characterized in that due to the coloration of the magnetic particles constituting the complex method of claim 10.
  12. 前記工程(i)で用いる前記磁性粒子が、 The magnetic particles used in the step (i) is,
    (1)中央領域が前記磁性材料から形成され、かつ、外殻領域が前記貴金属材料から形成されている磁性粒子p、および、前記被検物質に結合可能な前記物質aを用意する工程、 (1) is formed from the central region the magnetic material and the magnetic particles p of the shell region is formed from the noble metal material, and a step of preparing the material a couplable said to analyte,
    (2)前記磁性粒子pと前記物質aとを接触させ、前記物質aが固定化された磁性粒子p'を含んで成る混合物を得る工程、ならびに (3)前記混合物に磁場を印加して、前記混合物から前記磁性粒子p'を分離する工程を含んで成る方法でもって調製されることを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。 (2) the said magnetic particles p contacting the material a, the material a to obtain a mixture comprising magnetic particles p 'immobilized step, and (3) by applying a magnetic field to the mixture, characterized in that it is prepared with a method comprising the step of separating the magnetic particles p 'from the mixture, the method of any of claims 1 to 11.
  13. 前記工程(3)では、前記磁場の印加によって、前記磁性粒子p'がより多い相Aと前記磁性粒子p'がより少ない相Bとに前記混合物を分けた後、前記相Bを前記混合物から取り除くことを特徴とする、請求項12に記載の方法。 In the step (3), by application of the magnetic field, after which the magnetic particle p 'wherein is a greater phase A magnetic particle p' is dividing the mixture into a lower phase B, the phase B from the mixture and wherein the removing method of claim 12.
  14. 前記工程(2)では、前記物質aと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカーを前記磁性粒子pに結合させた後、前記リンカーに対して前記物質aを結合させることによって、前記磁性粒子p'を得ることを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。 In the step (2), after the linker comprising said material a possible binding functional group and sulfur atom was bound to the magnetic particles p, by binding the material a to the linker, the wherein the obtained magnetic particles p ', the method of claim 12 or 13.
  15. 前記工程(2)では、前記物質aと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカーを前記物質aに結合させた後、前記リンカーを前記磁性粒子pに結合させることによって、前記磁性粒子p'を得ることを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。 In the step (2), after the linker comprising a bondable functional group and a sulfur atom and the material a was bound to the material a, by coupling the linker to the magnetic particles p, the magnetic particles characterized in that to obtain p ', the method of claim 12 or 13.
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