JP4740700B2 - Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these - Google Patents
Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these Download PDFInfo
- Publication number
- JP4740700B2 JP4740700B2 JP2005268092A JP2005268092A JP4740700B2 JP 4740700 B2 JP4740700 B2 JP 4740700B2 JP 2005268092 A JP2005268092 A JP 2005268092A JP 2005268092 A JP2005268092 A JP 2005268092A JP 4740700 B2 JP4740700 B2 JP 4740700B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biological material
- monomer
- residue
- chip
- capturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 C*(N[N+]([O-])O[N+](*)[O-])[N+]([O-])O[N+](*)[O-] Chemical compound C*(N[N+]([O-])O[N+](*)[O-])[N+]([O-])O[N+](*)[O-] 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は細胞ないし細胞集合体である組織で発現している遺伝子産物であるmRNAないしタンパク質を定量的に計測するための生体物質解析チップ、生体物質解析キットおよび方生体物質解析法に関する。 The present invention relates to a biological material analysis chip, a biological material analysis kit, and a method for analyzing biological material for quantitatively measuring mRNA or protein which is a gene product expressed in a cell or a cell aggregate tissue.
ゲノム計画の進展とともにDNAレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。遺伝子の発現状況を調べるには遺伝子の転写産物であるmRNAを調べる方法とmRNAから翻訳されるタンパク質を調べる方法がある。mRNAを調べる有力な方法として、固体表面上に数多くのDNAプローブを種類毎に区分けして固定したDNAプローブアレー、あるいはDNAプローブチップ(実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある)がある。DNAプローブアレーを用いるmRNA検査では、予め十分多量な細胞検体からRNA成分を抽出し、リバーストランスクリプターゼによる逆転写反応でcDNAを合成し、PCR増幅やcRNA合成により増幅を行う。また相補鎖合成時に標識dNTPを取り込ませて多量の標識DNA鎖を得る。最近ではアミノアリルdNTPを取り込ませて、その後にアミノ基に蛍光色素を反応させて蛍光標識DNA鎖を得る方法が主流となっている。このようにして得られた蛍光標識DNA鎖をいわゆるDNAプローブアレーとハイブリダイズさせて各種発現遺伝子の解析を行う。DNAプローブアレー上には通常数十から150μmφの微小スポット状に高密度にDNAプローブを固定して標的cDNA捕捉速度を高め、高感度検出ができるようにしている。 Along with the progress of the genome project, the movement to understand living organisms at the DNA level, to diagnose diseases and to understand life phenomena has become active. It is effective to investigate the expression status of genes in order to understand life phenomena and investigate the functions of genes. There are two methods for examining the gene expression status: a method of examining mRNA which is a transcription product of a gene and a method of examining a protein translated from the mRNA. A promising method for examining mRNA is a DNA probe array in which a large number of DNA probes are divided and fixed on a solid surface, or a DNA probe chip (because it is actually a derivative of an oligonucleotide. Sometimes called an oligo chip). In an mRNA test using a DNA probe array, RNA components are extracted from a sufficiently large amount of cell specimens in advance, cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction using reverse transcriptase, and amplified by PCR amplification or cRNA synthesis. In addition, a labeled dNTP is incorporated during complementary strand synthesis to obtain a large amount of labeled DNA strand. Recently, a method in which aminoallyl dNTP is incorporated and then a fluorescent dye is reacted with an amino group to obtain a fluorescently labeled DNA strand has become the mainstream. The fluorescently labeled DNA strand thus obtained is hybridized with a so-called DNA probe array to analyze various expressed genes. On the DNA probe array, DNA probes are usually fixed at a high density in the form of small spots of several tens to 150 μmφ so as to increase the target cDNA capture speed and enable high-sensitivity detection.
DNAチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法(非特許文献1:Science 251, 767-773(1991))、あるいはDNAプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法(非特許文献2:Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996))などがある。 In order to make a DNA chip, a method of synthesizing oligomers of sequences designed in a large number of partitioned cells one by one using photochemical reaction and lithography often used in the semiconductor industry (Non-patent Document 1: Science 251, 767-773 (1991)), or a method of implanting DNA probes and protein probes one by one in each compartment (Non-patent Document 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)) and so on.
これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面上に多数のプローブをアレイ状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。検出には、DNAチップの類では標識物に蛍光色素を用いるケースが圧倒的に多いが、電気化学発光を用いるケースやDedox(酸化還元)反応を用いて電気信号として検出する方法も実用化している。 Each of these chips has a structure in which a large number of probes are arranged in an array on a flat surface such as a slide glass. In general, which probe is located at which position is indexed only at a physical position where the probe is fixed. In the case of DNA chips, fluorescent dyes are predominantly used for labeling in the case of DNA chips. However, there are cases where electrochemiluminescence is used and a method for detecting an electrical signal using a Dedex (redox) reaction has been put into practical use. Yes.
DNAプローブのかわりに抗体や抗原を基板上にアレイ状に固定したプロテインチップの概念も実用化されている。基板上にアレルギーを起こす数十から数百の抗原(アレルゲン)を固定したデバイスに検体血清を反応させ、各抗原と抗原抗体反応を起こす血清中に存在するIgMを特異的に捕捉し、IgMに結合する酵素標識2次抗体を反応させ、酵素活性を化学発光と組み合わせることで測定して、アレルゲンを検出するアレルゲン検査用のシステムが医療検査用に実用化されている。プロテインチップにおいても、高感度検出を行うために固体表面に抗体や抗原を高密度に固定することで測定対象物質の捕捉速度を高めている。 A protein chip concept in which antibodies and antigens are immobilized on a substrate in an array instead of a DNA probe has been put into practical use. The sample serum is reacted with a device in which several tens to several hundreds of antigens (allergens) that cause allergies are immobilized on the substrate, and IgM present in the serum that causes an antigen-antibody reaction with each antigen is specifically captured, and IgM An allergen test system that detects an allergen by reacting a bound enzyme-labeled secondary antibody and measuring enzyme activity in combination with chemiluminescence has been put to practical use for medical tests. Also in protein chips, in order to perform high-sensitivity detection, the capture speed of the measurement target substance is increased by immobilizing antibodies and antigens on the solid surface at a high density.
プロテインチップ上に捕捉した測定対象物質の検出には、酵素標識物を用いて化学発光ないし生物発光の系で検出するケースが多い。そのほか、蛍光標識検出や、電気化学発光検出、質量分析器による分析を行うケースと多様な方法が実用化されている。 In many cases, a substance to be measured captured on a protein chip is detected by a chemiluminescence or bioluminescence system using an enzyme label. In addition, various methods such as fluorescent label detection, electrochemiluminescence detection, and mass spectrometer analysis have been put into practical use.
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる(非特許文献3:Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991))。電極表面ではルテニウムが酸化され、TPAのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。 In the electrochemiluminescence method, an antigen capturing antibody is present on the electrode surface. A ruthenium complex is used as the label for the sandwich antibody (Non-patent Document 3: Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)). Ruthenium is oxidized on the electrode surface, and emits light when the ruthenium electrons, which are excited when they are reduced by being coupled with the redox reaction of TPA, fall to the ground state.
本発明に関連するところでは、生体物質検出法の一つでプロテインチップと類似の技術であるサンドイッチイムノアッセイ法において、標識物に粒子を用いて測定対象物質を分子計数する方法が報告されている(非特許文献4:Analytical Biochemistry 202,120−125 (1992))。 In the context of the present invention, a sandwich immunoassay method, which is one of the biological material detection methods and a technique similar to protein chips, has reported a method of molecularly counting a measurement target substance using particles as a label ( Non-patent document 4: Analytical Biochemistry 202, 120-125 (1992)).
上記従来技術では、DNAプローブチップあるいはプロテインチップを用いる遺伝子転写産物であるmRNAや翻訳産物であるタンパク質の識別や検出法に関してはよく検討されており、何らかの方法で溶液状の試料が準備できていればそれなりに測定ができる。また、出願人の一人により特許出願されている特願2004−226361、特願2004−297194あるいは特願2004−318770に開示されているように、mRNAやDNAマイクロアレイの分野においてもナノ粒子を用いて解析する方法が提案されている。 In the above prior art, the identification and detection of mRNA, which is a gene transcription product using a DNA probe chip or protein chip, and the protein, which is a translation product, are well studied, and a solution sample can be prepared by any method. You can measure as it is. Further, as disclosed in Japanese Patent Application No. 2004-226361, Japanese Patent Application No. 2004-297194 or Japanese Patent Application No. 2004-318770 filed by one of the applicants, using nanoparticles in the field of mRNA and DNA microarray A method of analysis has been proposed.
しかしながら、生体物質を基板上に捕捉するための親和性プローブ(以下生体物質に結合して何らかの情報を得るために使われる物質の総称を親和性プローブと呼ぶことにする)はDNAプローブや抗体などの生体有機物であるので、これらの固定にはガラスやシリコンの基板と生体有機物を固定する上で下記の問題がある。すなわち、
1)親和性プローブを基板上に固定するために物理的な吸着や共有結合形成を用いるが、吸着反応と共有結合反応のいずれも基板表面の状態に依存するために均一な固定が困難であるケースが多い。
2)親和性プローブの基板上への固定の立体方向の制御ができない。すなわち、溶液中の測定対象生体物質を捕捉するための親和性部位を測定対象生体物質と反応する方角に向けて固定することが難しい。このため、親和性プローブ自身の立体障害で測定対象の捕捉量が低下する。
3)親和性プローブの密度がコントロールできない。一般的に、固定時の親和性プローブ濃度や固定時間をコントロールすることで任意の密度の親和性プローブを固定した基板が得られると思われがちであるが、実際には制御が難しいことが多い。非特許文献4では、親和性プローブの固定時にこれとは異なる生体物質を共存させて実際の親和性プローブ固定密度をコントロールしている。親和性プローブを希薄状態で基板表面に固定しようとすると、島状に密度の高いところと周りの密度の薄いところができてしまう。
4)あるいは、上記1)から3)の問題に関連するが、親和性プローブの固定エリアが狭くなると各エリアで親和性プローブの固定量が異なるようになり、定量的な測定に害を及ぼす可能性がある。さらに、親和性プローブの固定エリアが狭くなると蛍光法のように親和性プローブエリア全体の蛍光強度を測定し、その蛍光強度を基に試料中の目的生体物質の量を定量解析することができなくなる。このために、上記非特許文献4あるいは特許出願発明のように基板上に捕捉した目的生体物質にナノ粒子を結合させてこれを計数する方法を取るわけであるが、親和性プローブが均一についていないと、部位ごとに結合するナノ粒子の数が異なることになり、計数による定量検出精度が当然低下することになる。
However, affinity probes for capturing biological substances on a substrate (hereinafter generic names of substances used to bind biological substances to obtain some information are called affinity probes) are DNA probes, antibodies, etc. Therefore, there are the following problems in fixing the glass and silicon substrates and the biological organic matter. That is,
1) Physical adsorption or covalent bond formation is used to immobilize the affinity probe on the substrate, but since both the adsorption reaction and the covalent bond reaction depend on the state of the substrate surface, uniform immobilization is difficult. There are many cases.
2) The stereo direction of the affinity probe immobilized on the substrate cannot be controlled. That is, it is difficult to fix the affinity site for capturing the measurement target biological material in the solution toward the direction of reaction with the measurement target biological material. For this reason, the capture amount of a measuring object falls by the steric hindrance of an affinity probe itself.
3) The density of the affinity probe cannot be controlled. In general, it tends to be thought that a substrate on which an affinity probe of an arbitrary density is fixed can be obtained by controlling the affinity probe concentration and fixing time at the time of fixation, but in practice it is often difficult to control. . In
4) Or, related to the problems 1) to 3) above, if the affinity probe fixation area becomes narrow, the amount of affinity probe fixation varies in each area, which may harm quantitative measurement. There is sex. Furthermore, if the affinity probe fixing area becomes narrow, the fluorescence intensity of the entire affinity probe area can be measured as in the fluorescence method, and the amount of the target biological substance in the sample cannot be quantitatively analyzed based on the fluorescence intensity. . For this reason, as in the
基板に固定する親和性プローブ密度には最適条件が存在する。このために、親和性プローブ密度を任意にコントロールする必要性が出てくる。 There is an optimum condition for the density of the affinity probe immobilized on the substrate. For this reason, it becomes necessary to arbitrarily control the affinity probe density.
従来のプローブ固定法ではシランカップリング反応を用いて無機質であるガラスやシリコンウエハー表面に官能性残基を導入し、この官能性残基に親和性プローブを固定する方法が多用されている。しかしながらシランカップリング反応は、基板の表面状態に依存し、必ずしも均一に親和性プローブを固定する方法として最適なものではない。 In the conventional probe immobilization method, a method in which a functional residue is introduced onto the surface of an inorganic glass or silicon wafer by using a silane coupling reaction and an affinity probe is immobilized on the functional residue is often used. However, the silane coupling reaction depends on the surface state of the substrate and is not necessarily the optimum method for fixing the affinity probe uniformly.
本発明の目的は、親和性プローブを基板表面により均一な密度で固定することで微小な領域で、定量測定を行うことのできる生体物質解析チップとこれを用いる生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a biological material analysis chip capable of performing quantitative measurement in a minute region by fixing the affinity probe to the substrate surface at a uniform density, a biological material analysis kit using the same, and a biological material using these It is to provide a material analysis method.
本発明では、ガラスやシリコン基板表面のSi−OHないしSi=Oあるいは、金属表面のMe−OHやMe=O(Me:金属原子)のような残基に直接反応するようなシランカップリングを用いることはしない。このような表面に存在する−OHや=O残基は表面状態により存在する量が異なるので、本質的に均一な活性基を導入することが困難と考えたからである。そこで、基板表面の状態に依存せずに親和性プローブを固定する残基を導入する必要がある。これには、基板表面状態にかかわらず、ポリマー層を基板表面に導入し、このポリマー層が一定間隔で親和性プローブを固定するための官能基を持つように設計すればよい。このとき重要なのは、いかにして親和性プローブを固定するための官能基の間隔をそろえるかである。 In the present invention, Si—OH or Si═O on the surface of glass or silicon substrate, or silane coupling that reacts directly with residues such as Me—OH or Me═O (Me: metal atom) on the metal surface. Do not use. This is because it is considered that it is difficult to introduce an essentially uniform active group because the amount of —OH or ═O residue present on the surface varies depending on the surface state. Therefore, it is necessary to introduce a residue that fixes the affinity probe without depending on the state of the substrate surface. For this purpose, a polymer layer may be introduced to the substrate surface regardless of the substrate surface state, and the polymer layer may be designed to have a functional group for fixing the affinity probe at regular intervals. What is important at this time is how to align the spacing of the functional groups for immobilizing the affinity probe.
すなわち、2種類のモノマーを重合させて調製するポリマー層でできた重合生成薄膜を有するものを作成することとする。これは、前記ポリマー層が重合用の第1の官能基を2箇所に有する第1のモノマーと重合用の第2の官能基を2箇所に有する第2のモノマーを交互に配するように重合した構造で、前記第1のモノマーおよび前記第2のモノマーの片方に親和性プローブ結合残基を持つ構造をしている。具体的には、基板に第1のモノマーとしてジイソシアナート類と第2のモノマーとしてジアミン類を等モル比で反応させ重合させる。このケースでは、第1の官能基はイソシアナート基、第2の官能基はアミノ基ということになる。ジイソシアナートとしてはたとえばアルキルジイソシアナートやフェニレンジイソシアナート類を用いることができる。また、親和性プローブ結合用にはジイソシアナート類かジアミン類の側鎖に官能基を導入したモノマーを用いればよい。 That is, a film having a polymerized thin film made of a polymer layer prepared by polymerizing two kinds of monomers is prepared. The polymerization is performed so that the polymer layer alternately arranges a first monomer having two first functional groups for polymerization and a second monomer having two second functional groups for polymerization. In this structure, one of the first monomer and the second monomer has an affinity probe binding residue. Specifically, a diisocyanate as a first monomer and a diamine as a second monomer are reacted with each other at an equimolar ratio and polymerized on the substrate. In this case, the first functional group is an isocyanate group, and the second functional group is an amino group. As diisocyanates, for example, alkyl diisocyanates and phenylene diisocyanates can be used. For affinity probe binding, a monomer having a functional group introduced in the side chain of diisocyanate or diamine may be used.
例えば、ジアミン類の側鎖にカルボキシル基を導入したモノマーを用いる。これを基板表面で重合させると、ジイソシアナート類とジアミン類が交互に結合したポリマーが得られる。よってカルボキシル基はジイソシアナート類とジアミン類からなる周期のジアミン部分の側鎖に存在することになる。このため、ポリマー上に一定間隔で親和性プローブを固定することが可能となる。このときの重合生成薄膜はポリ尿素ということになる。重合上条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができるジイソシアナート類とジアミン類の主鎖の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも自在に官能基を持つ薄膜を形成することができる。 For example, the monomer which introduce | transduced the carboxyl group into the side chain of diamines is used. When this is polymerized on the substrate surface, a polymer in which diisocyanates and diamines are alternately bonded is obtained. Therefore, a carboxyl group exists in the side chain of the diamine part of the period which consists of diisocyanates and diamines. For this reason, it becomes possible to fix the affinity probe on the polymer at regular intervals. The polymerized thin film at this time is polyurea. Regarding the polymerization conditions, the distance between the carboxyl groups to be introduced can be adjusted by adjusting the lengths of the main chains of diisocyanates and diamines, which can use the existing vacuum deposition method. In addition, this makes it possible to freely form a thin film having a functional group on an electrode such as gold or platinum, which has conventionally been difficult to introduce a functional group on the surface.
基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の1,4−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に5’末端にアミノ基を有するDNAプローブ(スペーサー部:5’末端側10塩基プラスターゲットのcDNAと反応する部分:平均32塩基長)を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でDNAプローブが約9nm間隔で固定された基板が得られる。 A probe having an amino group as a residue for capturing a biological substance may be directly immobilized using a carbodiimide-based activator for the carboxyl group introduced onto the substrate. Alternatively, when this side chain carboxyl group is reacted with ethylenediamine in the presence of a dicyclohexylcarbodiimide-based activator, a primary amine residue can be introduced into the side chain carboxyl group in high yield. That is, primary amines are arranged on the substrate surface at almost regular intervals. Next, the primary amine is modified with 1,4-phenylenediisothiocyanate described in Nucleic Acids Research, 27, 1970-1977 (1999) and CHEMBIOCHEM2, 686-694 (2001), and isothiocyanate groups are introduced on the surface. . Finally, a DNA probe having an amino group at the 5 'end (spacer part: 10 bases on the 5' end side plus a part that reacts with the target cDNA: average length of 32 bases) is reacted. The reaction conditions are detailed in the above literature. By the above method, a substrate on which DNA probes are fixed at intervals of about 9 nm can be obtained.
カルボキシル基をもつポリ尿素を基板上に形成する例のほか、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであればいずれも利用することができる。たとえば、2種のモノマーの組み合わせが
や
(R1〜R3は任意の残基)の構造を有する酸無水物とNH2−R5−NH2(R5は任意の残基)の構造を有するジアミンモノマーで、R5にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。
In addition to the example of forming a polyurea having a carboxyl group on a substrate, any polymer that periodically has a residue capable of introducing a reactive group capable of immobilizing a polynucleotide or peptide as a probe on the side chain can be used. Can be used. For example, a combination of two monomers
And
An acid anhydride having a structure of (R 1 to R 3 is an arbitrary residue) and a diamine monomer having a structure of NH 2 —R 5 —NH 2 (R 5 is an arbitrary residue), wherein R 5 is a carboxyl group A diaminophenylacetic acid monomer having can be used. As the acid anhydride, one having a structure such as 4,4′-hexafluoroisopropylidenebisphthalic anhydride can be used.
このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえば長カルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは1,10−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724(1994)やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992)記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。 Such a polymer is polyimide. Polyimide generally uses such bisphthalic anhydride and a bisamino compound. Alternatively, vapor deposition polymerization of a monomer having a carboxylic acid residue at the aliphatic position of an aliphatic diamine such as diaminophenylacetic acid or 1,10-diaminodecane having a long carboxyl group and terephthaloyl dichloride as a diacid chloride monomer Thus, polyamide that forms a film on the substrate can be used. For the probe immobilization, various reactive residues may be introduced into the long-chain aliphatic diamine. Vapor deposition polymerization is carried out according to existing methods such as those described in Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724 (1994) and Thin Solid Films, 215, 94-97 (1992). What is necessary is just to consider vaporization conditions.
本発明により、細胞内発現しているmRNAやタンパク質を分子レベルで検出できるようになる。 According to the present invention, mRNA and protein expressed in cells can be detected at the molecular level.
(実施例1)
図1は本発明を実行するに好適な生体物質解析チップの1例を示す図である。図1(A)は実施例の生体物質解析チップを示す平面図、(B)は図1(A)のA−A位置で矢印方向に見た断面図である。
Example 1
FIG. 1 is a diagram showing an example of a biological material analysis chip suitable for carrying out the present invention. FIG. 1A is a plan view showing a biological material analysis chip of an example, and FIG. 1B is a cross-sectional view taken in the direction of the arrow at the position AA in FIG.
この生体物質解析チップ100は、ガラス基板1の上面に親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層21を作成する。ポリマー層21の上にはテフロン(登録商標)層22がプリントされている。したがって表面に出ているポリマー層21は図の23のような区画となっている。この区画は50×50μmで細胞1個を収納できる。ポリマー薄膜層21の上には親和性プローブとしてポリT(T30)を固定し、mRNAを網羅的に捕捉するようにすることができる。あるいは、上記「課題を解決するための手段」に記載したDNAプローブ(スペーサー部:5’末端側10塩基+ターゲットのmRNAないしcDNAと反応する部分:平均32塩基長)を固定することで特定のmRNAあるいはcDNAを捕捉するようなチップを得ることができる。もちろん通常のDNAチップのように複数のDNAプローブをスポットした構造とする。区画21の集合の周りには溶液を保持するための仕切り5が存在する。
The biological
まず、基板1の上面に形成する親和性官能基を固定するためのポリマー薄膜層について説明する。ポリマー薄膜層21は第1のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第2のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させる。すなわちポリマー薄膜としては尿素樹脂薄膜ということになる。アルキルジイソシアナートとしては、例えば、ヘキサメチレンジイソシアナートを用いることができる。また、生体物質捕捉用残基は第2のモノマーであるジアミノフェニル酢酸のカルボキシル基ということになる。重合条件に関しては、既存の真空蒸着法を用いることができる。
First, the polymer thin film layer for fixing the affinity functional group formed on the upper surface of the
このようにして基板上に形成したポリ尿素薄膜21はアルキルジイソシアナートとジアミノフェニル酢酸モノマーが交互に反応して形成する構造のため、側鎖のカルボン酸基が比較的そろった間隔で存在することになる。アルキル基の長さを調製することで導入するカルボキシル基の間隔を調製できる。また、これにより、従来は表面に官能基を導入することが困難であった金や白金などの電極上にも官能基を持つ薄膜を形成することができる。基板上に導入したカルボキシル基をカルボジイミド系の活性化剤を用いて生体物質捕捉用残基としてアミノ基を有するプローブを直接固定してもよい。あるいは、この側鎖カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド系の活性化剤存在下でエチレンジアミンを反応させると、高収率で側鎖カルボキシル基に一級アミン残基を導入することができる。すなわち基板表面には一級アミンがほぼ一定間隔で並んだ状態となる。
Since the polyurea
次にNucleic Acids Research,27,1970-1977(1999)およびCHEMBIOCHEM2, 686- 694(2001)記載の1,4−フェニレンヂイソチオシアナートで一級アミンを修飾し、表面にイソチオシアナート基を導入する。最後に5’末端にアミノ基を有するポリT(T30)を反応させる。この反応条件は上記文献に詳しい。上記方法でポリTが約9nm間隔で固定された基板が得られる。 Next, the primary amine is modified with 1,4-phenylenediisothiocyanate described in Nucleic Acids Research, 27, 1970-1977 (1999) and CHEMBIOCHEM2, 686-694 (2001), and isothiocyanate groups are introduced on the surface. . Finally, poly T (T30) having an amino group at the 5 'end is reacted. The reaction conditions are detailed in the above literature. By the above method, a substrate on which poly-T is fixed at intervals of about 9 nm is obtained.
実施例では、カルボキシル基をもつポリ尿素を基板1上に形成して用いたが、このほかにも、側鎖にプローブとなるポリヌクレオチドやペプチドなどを固定できるような反応基を導入できる残基を周期的に持つポリマーであれば利用することができる。たとえば、2種のモノマーの組み合わせが
の構造を有する酸無水物(R1〜R4は任意の残基)とNH2−R5−NH2の構造を有するジアミンモノマー(R5は任意の残基)で、R5にカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸モノマーを用いることができる。酸無水物としては、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフタル酸無水物のような構造のものを用いることができる。このようなポリマーは、すなわちポリイミドである。ポリイミドは一般的にこのようなビス無水フタル酸とビスアミノ化合物を用いる。あるいは、たとえばカルボキシル基を有するジアミノフェニル酢酸あるいは1,10−ジアミノデカンのような脂肪族ジアミンの脂肪族位置にカルボン酸残基を有するモノマーとジ酸クロリドモノマーであるテレフタロイルジクロリドを蒸着重合により基板上に膜形成を行うポリアミドを利用することができる。プローブ固定用には長鎖脂肪族ジアミンに各種反応性残基を導入しておけばよい。蒸着重合としては既存の方法、たとえば、Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724(1994)やThin Solid Films, 215, 94-97 (1992) 記載の方法に準じて、使用するモノマーの気化条件を考慮して行えばよい。
In the examples, polyurea having a carboxyl group was formed on the
An acid anhydride having a structure of (R 1 to R 4 is an arbitrary residue) and a diamine monomer having a structure of NH 2 —R 5 —NH 2 (R 5 is an arbitrary residue), wherein R 5 is a carboxyl group A diaminophenylacetic acid monomer having can be used. An acid anhydride having a structure such as 4,4′-hexafluoroisopropylidenebisphthalic anhydride can be used. Such a polymer is polyimide. Polyimide generally uses such bisphthalic anhydride and a bisamino compound. Alternatively, for example, a monomer having a carboxylic acid residue at the aliphatic position of an aliphatic diamine such as diaminophenylacetic acid or 1,10-diaminodecane having a carboxyl group and terephthaloyl dichloride, which is a diacid chloride monomer, are deposited by vapor deposition polymerization. Polyamide that forms a film on a substrate can be used. For the probe immobilization, various reactive residues may be introduced into the long-chain aliphatic diamine. Vapor deposition polymerization is carried out according to existing methods such as those described in Jpn. J. Appl. Phys. 33, L1721-L1724 (1994) and Thin Solid Films, 215, 94-97 (1992). What is necessary is just to consider vaporization conditions.
なお、図1において、5は樹脂製の壁であり、ポリ尿素薄膜21の周辺に設け、試料溶液の周辺への流出を防止するためのものである。必ず必要と言うものではない。
In FIG. 1,
図2(A)は、基板1の上面に蒸着重合で形成された第1のモノマーとしてアルキルジイソシアナートと第2のモノマーとしてジアミノフェニル酢酸を等モル比で反応させ重合させたポリマー薄膜層21の断面構造を示す模式図であり、図2(B)は、ポリマー薄膜層21の平面構造を示す模式図である。
FIG. 2A shows a polymer
ポリマー薄膜層21は、第1のモノマー部分22と第2のモノマー部分23が、第1のモノマー部分22の第1の官能基24と第2のモノマー部分23の第2の官能基25とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造となっている。第2のモノマー部分23には側鎖として第3の官能基26が存在する。ポリマー層薄膜21は基板表面との間での弱い結合27と、基板1のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子がごく一部分で共有結合した状態28でアンカリングしていると推定される。図2(B)を参照して分かるように、第1のモノマー部分22の第1の官能基24と第2のモノマー部分23の第2の官能基25とがお互いに連結し、交互に重合した二つのモノマーの連鎖構造は、全てが、平行に整然と並ぶわけではないので、第三の官能基26が、均等に、整然と配列されるわけではない。すなわち、図2(B)に示すように、反転したもの、傾いたものが混在する。しかし、第三の官能基26を有する第2のモノマー部分23は、第1のモノマー部分22を介在させて配列されることになるので、第三の官能基26が、むやみに集まったり、閑散と分布してしまったりすることは防止できる。
The polymer
図3は、基板1の表面に形成されたポリマー薄膜層21の第三の官能基26とDNAプローブ31の5’末端部分32の官能基33とが結合する様子を模式的に示す図である。ここで、ポリマー薄膜層21は、第1のモノマー22と第2のモノマー23が交互に重合しているので、分子レベルで見ると第2のモノマー23の側鎖である第3の官能基26の間隔はほぼ一定となり、したがって第3の官能基26に結合するDNAプローブ31もほぼ一定間隔となる。もちろんポリマー鎖同士の2次元的な広がりも考える必要があるが、側鎖のカルボキシル基(図2(A)では第3の官能基26に相当)のマイナス荷電の反発力により、図2(B)に示すように、異なる鎖の間隔もほぼ一定となることが期待できる。
FIG. 3 is a diagram schematically showing a state in which the third
図4は、図1−3に示す基板を用いて、mRNAを検出する工程を示す図である。図4(A)は基板1の上面のポリマー薄膜層21の上面に、例えば、細胞を破砕して得られた試料溶液41を配し、試料溶液41中にはmRNA43やタンパク質45が分散した様子を模視的に示す断面図である。溶液41はいわゆるPBSでEDTAは含まないものを使用する。基板1の上面のポリマー薄膜層21の表面にプローブ31が固定されている。ここではプローブ31はポリTからなるものを使用する。mRNAが測定対象であるので液滴中に細胞浸透性のRNaseインヒビターを予め入れておき、mRNAの分解を極力防ぐ。
FIG. 4 is a diagram showing a process of detecting mRNA using the substrate shown in FIG. 1-3. 4A shows a state in which, for example, a
図4(B)は、図4(A)の状態から時間が経過した状態を模視的に示す図である。時間が経過するのに応じて、mRNA43は基板上のポリTプローブ31にハイブリダイズする。mRNAのハイブリダイゼーションによる基板表面のポリAプローブへの捕捉には4時間程度を要する。
FIG. 4B is a diagram schematically showing a state in which time has elapsed from the state of FIG. As time passes,
図4(C)は、基板1の上面のポリマー薄膜層21の上面のポリTプローブ31に捕捉されたmRNA群43を識別する方法を説明する図である。まず、図4(B)に示すポリTプローブ31に捕捉されたmRNA群を有する基板1を0.5%SDSと0.1MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液pH7.4で洗浄し、基板1上のポリTプローブ31にハイブリダイズしなかった物を除去する。次いで、ポリTプローブ31にハイブリダイズしたmRNA群43は、種々の異なったものがあるので、これを識別するための標識プローブの混合溶液51を添加する。ここでは、標識プローブとしては異なる粒子径の金ナノ粒子に異なるDNA配列を持つDNAプローブを結合させたものを用いる。図では模式的に5nmの金ナノ粒子53で標識したDNAプローブ63、10nmの金ナノ粒子54で標識したDNAプローブ64、15nmの金ナノ粒子55で標識したDNAプローブ65の3種を含む溶液51を基板上に加えた状態を表す。金ナノ粒子標識DNAプローブの非特異的な吸着を防ぐために、溶液51は0.5%SDSと0.1MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液pH7.4の組成としている。
FIG. 4C is a diagram for explaining a method of identifying the
1時間45℃でインキュベーションした後、同一の緩衝液で洗浄後、さらに10mMのNaClを含むクエン酸緩衝液pH7で洗浄する。この状態で基板上には、ポリTプローブ31にハイブリダイズしたmRNA群とポリTプローブ31に捕捉された各mRNAにハイブリダイズした標識プローブ63,64,65が3体結合した状態になっている。標識プローブ63,64,65には、走査型電子顕微鏡や操作型原子間力顕微鏡で容易に識別できる粒子径の異なる金ナノ粒子標識物53、54、55が結合している。したがって、金ナノ粒子53、54、55を、粒子径を区別しながらカウントすることで、基板1上のポリTプローブ31に捕捉されたmRNAの種類と量を測定することができる。
After incubation at 45 ° C. for 1 hour, the cells are washed with the same buffer, and further washed with citrate buffer pH 7 containing 10 mM NaCl. In this state, three labeled
区画21は5×5μmと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとのプローブ固定量を一定に保とうとすると、基板表面の状態に固定量が依存するような方法は取ることができない。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ9nmに保つことができる。このため5×5μm程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のCV=30%程度から本発明によりCV=7%程度まで少なくすることができる。
(実施例2)
ここで、実施例による識別能力について評価すると以下のようである。
Since the
(Example 2)
Here, it is as follows when discriminating ability by an Example is evaluated.
基板1の上面のポリマー薄膜層21の表面にプローブ31が固定されるが、プローブ31としてポリTを用いることとし、通常のDNAチップの様に複数の配列のDNAプローブをポリマー薄膜層21の表面にスポットして用いる例を考える。すなわち、上述したようにして調製したイソチオシアナート残基がほぼ一定間隔になるように配された表面にインクジェット装置を用いて各プローブをスポットする。スポットの大きさは1μmφとし、各スポットが2μmピッチで並んでいるとする。
The
また、各スポットに3種類の捕捉用DNAプローブをミクスチャーとして固定し、各々捕捉用プローブに対応する検出用のDNAプローブに上述のように3種類の異なる粒子径のナノ粒子を標識したものを用いるとする。 In addition, three types of capture DNA probes are fixed to each spot as a mixture, and the detection DNA probe corresponding to each capture probe is labeled with nanoparticles of three different particle sizes as described above. And
図5(A)に本発明を用いる3種類のDNAプローブを同一スポット位置に固定し、スポットごとに異なるDNAプローブを固定したDNAマイクロアレイの例を断面図で示す。基板1の上には蒸着重合で作成した反応性残基がほぼ等間隔で並んだ層21の活性基を利用して3種のプローブ92−1,92−2,92−3のグループと、これらとは異なる3種のプローブ93−1,93−2,93−3がスポットエリア92と93に別個に固定されている。試料混合液91を添加して2時間50℃でインキュベーションする。試料混合液91は1本鎖状態のcDNA混合物で、たとえば白血球由来のmRNA混合物を逆転写して得たものである。溶媒は0.5%SDSを含む50mMのリン酸緩衝液(pH7.4)である。反応終了後、0.5%SDSを含む50mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄する。
FIG. 5A shows a cross-sectional view of an example of a DNA microarray in which three types of DNA probes using the present invention are fixed at the same spot position and different DNA probes are fixed for each spot. On the
図5(B)に基板上の層21の表面のプローブにcDNAが捕捉された状態を(示す。異なるcDNA102−1,102−2,102−3がスポットエリア92の対応するDNAプローブにハイブリダイズ、cDN103−2,103−3がスポットエリア93の対応するプローブにハイブリダイズしている。スポット93のプローブ93−1に対応しているcDNAは試料中に存在しないケースで、このためいずれのスポットエリアにもハイブリダイズした痕跡は見られない。
FIG. 5B shows a state in which cDNA is captured by the probe on the surface of the
図5(C)に、基板上の層21の表面のプローブに捕捉されたcDNAが3種の異なる粒子径5、10、15μmの金ナノ粒子を標識した第2のDNAプローブ112−1,112−2,112−3、113−1、113−2、112−3と反応させるためにリン酸緩衝液95を添加した状態を示す。第2のDNAプローブはそれぞれ1本鎖cDNA102−1,102−2,102−3,103−1,103−2,103−3に相補な配列を有する(cDNA103−1は試料中に含まれないので図には描かれていない)。反応は0.5%SDSを含む50mMのリン酸緩衝液(pH7.4)95中で、55℃で30分間行う。金ナノ粒子標識DNAプローブの混合液は予め90℃5秒加熱し、55℃に冷却して直ちに基板上に滴下する。0.5%SDSを含む50mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄する。
FIG. 5C shows the second DNA probes 112-1 and 112 in which the cDNA captured by the probe on the surface of the
図5(D)に、基板上の各スポットエリアにcDNA配列に従い金ナノ粒子112−1,112−2,112−3,113−2,113−3で標識したDNAプローブがハイブリダイズした状態を示す。操作型電子顕微鏡か原子間力顕微鏡で基板表面をスキャンして、各スポットエリアに結合している金ナノ粒子を粒径別にカウントする。 FIG. 5D shows a state in which DNA spots labeled with gold nanoparticles 112-1, 112-2, 112-3, 113-2, and 113-3 are hybridized to each spot area on the substrate according to the cDNA sequence. Show. The surface of the substrate is scanned with an operation electron microscope or an atomic force microscope, and gold nanoparticles bonded to each spot area are counted by particle size.
区画21は5×5μmと微小なため、そこに固定できるプローブ数としては限られた数となってしまう。各区画ごとに3種類のプローブを固定しようとすると更に固定量のばらつき変動が大きくなる。本方法を用いることで、基板表面のプローブ分子間隔をほぼ9nmに保つことができる。3種類のプローブを固定すると、5×5μm程度のスポットでのプローブ固定量のばらつきは従来法のCV=40%程度から本発明によりCV=10%程度まで少なくすることができる。
Since the
100…生体物質解析チップ、1…ガラス基板、5…樹脂製の壁、21…ポリマー薄膜層、22…第1のモノマー部分、23…第2のモノマー部分、24…第1のモノマー部分の第1の官能基、25…第2のモノマー部分の第2の官能基、26…第2のモノマー部分の側鎖としての第3の官能基、27…ポリマー層薄膜と基板表面との間の弱い結合、28…基板のガラス表面のシラノール基とポリマー側の官能基のパイ電子の共有結合した状態、31,92,93…DNAプローブ、32…DNAプローブの5’末端部分、33…DNAプローブの5’末端部分の官能基、41…細胞を破砕して得られた試料溶液、43…mRNA、45…タンパク質、53,54,55,112,113…金ナノ粒子、63,64,65…金ナノ粒子で標識したDNAプローブ、102,103…cDNA。
DESCRIPTION OF
Claims (9)
あるいは
(R1〜R3は任意の残基)の構造を有する酸無水物とNH2−R5−NH2(R5は任意の残基)の構造を有するジアミンモノマーで、ポリマー層がポリアミドないしポリイミドである請求項1記載の生体物質解析チップ。 The combination of the first monomer and the second monomer is
Or
An acid anhydride having a structure of (R 1 to R 3 is an arbitrary residue) and a diamine monomer having a structure of NH 2 —R 5 —NH 2 (R 5 is an arbitrary residue), and the polymer layer is polyamide or claim 1 Symbol placement biological substance analysis chip is polyimide.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005268092A JP4740700B2 (en) | 2005-09-15 | 2005-09-15 | Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005268092A JP4740700B2 (en) | 2005-09-15 | 2005-09-15 | Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007078553A JP2007078553A (en) | 2007-03-29 |
JP4740700B2 true JP4740700B2 (en) | 2011-08-03 |
Family
ID=37939036
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005268092A Active JP4740700B2 (en) | 2005-09-15 | 2005-09-15 | Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4740700B2 (en) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07258370A (en) * | 1994-03-28 | 1995-10-09 | Ulvac Japan Ltd | Production of polyurea film |
JP2002350447A (en) * | 2001-05-24 | 2002-12-04 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Physiological active material fixing carrier, method of manufacturing the same fixing physiological active material, method of analyzing object component in sample and kit for analyzing object component in sample |
JP2004346209A (en) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ionic polymer and the polymer-containing substrate |
JP2004352542A (en) * | 2003-05-28 | 2004-12-16 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Inorganic formed body ornamented with nanoparticle and method for manufacturing the same |
JP2005524058A (en) * | 2002-04-23 | 2005-08-11 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | Substrates coated with polymers for immobilizing biomolecules and cells |
JP2007510929A (en) * | 2003-11-05 | 2007-04-26 | トレリス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド | Use of particulate labels in bioanalyte detection methods |
-
2005
- 2005-09-15 JP JP2005268092A patent/JP4740700B2/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07258370A (en) * | 1994-03-28 | 1995-10-09 | Ulvac Japan Ltd | Production of polyurea film |
JP2002350447A (en) * | 2001-05-24 | 2002-12-04 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Physiological active material fixing carrier, method of manufacturing the same fixing physiological active material, method of analyzing object component in sample and kit for analyzing object component in sample |
JP2005524058A (en) * | 2002-04-23 | 2005-08-11 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | Substrates coated with polymers for immobilizing biomolecules and cells |
JP2004346209A (en) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ionic polymer and the polymer-containing substrate |
JP2004352542A (en) * | 2003-05-28 | 2004-12-16 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Inorganic formed body ornamented with nanoparticle and method for manufacturing the same |
JP2007510929A (en) * | 2003-11-05 | 2007-04-26 | トレリス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド | Use of particulate labels in bioanalyte detection methods |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2007078553A (en) | 2007-03-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4822753B2 (en) | Cell component sorting chip, cell component analysis system, and cell component analysis method using them | |
JP4420020B2 (en) | How to stir the solution | |
US6929944B2 (en) | Analysis using a distributed sample | |
US20080176768A1 (en) | Hydrogel microarray with embedded metal nanoparticles | |
US20020119470A1 (en) | Magnetic bead-based array for genetic detection | |
JP2005524849A (en) | Nanoparticle probes for analyte detection with fingerprints for Raman spectroscopy | |
EP1183387A2 (en) | GENERIC cDNA OR PROTEIN ARRAY FOR CUSTOMIZED ASSAYS | |
EP2130913A1 (en) | Chip for sampling cell component, system for analyzing cell component and method of analyzing cell component using the same | |
EP1322787A1 (en) | Bio-chip, photoluminescent methods for identifying biological material, and apparatuses for use with such methods and bio-chips | |
JP5822929B2 (en) | Nucleic acid analyzer | |
US20030099930A1 (en) | Novel method to enhance microarray surface density and hybridization efficiency | |
US7553621B2 (en) | Reading, detection or quantification method, hybrids or complexes used in said method and the biochip using same | |
JP2018537071A (en) | Method for detecting molecular interactions using immobilized nucleic acids | |
JP4740700B2 (en) | Biological material analysis chip, biological material analysis kit, and biological material analysis method using these | |
US20030224370A1 (en) | Method and apparatus for recognizing molecular compounds | |
US20100035278A1 (en) | Biological substance analysis chip, biological substance analysis kit and method of biological substance analysis using them | |
JP2004537722A (en) | Detection method for detecting the formation or hybridization of a complex between at least two basic molecules on a solid support based on an amplified signal on the support | |
WO2004106357A1 (en) | Method and apparatus for recognizing molecular compounds | |
JP4099540B2 (en) | Biological sample analysis chip and analysis method | |
KR100898623B1 (en) | Method for Immobilzing Biomolecules on Substrate Using Gold Nanoparticles | |
JP4227092B2 (en) | Biological material assay system and assay using scanning electron microscope | |
US20070037174A1 (en) | Chemiluminescent generated fluorescent labeling | |
WO2005106030A1 (en) | Method of nucleic acid detection | |
KR100681943B1 (en) | Detection method of hybridized nucleic acid using brewster angle microscope | |
JP5294963B2 (en) | Method for processing target substance and method for determining total amount of target substance |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070222 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070222 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20070522 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070522 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080819 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20101008 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101019 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101217 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110301 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110318 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110412 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110502 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140513 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |