JP4626930B2

JP4626930B2 - Cyanide-decomposing microorganism

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Publication number: JP4626930B2
Application number: JP2001196143A
Authority: JP
Inventors: 由布子福渡; 篤史西願寺; 洋潤小池; 勝博青山; 英司簗瀬
Original assignee: Tokyo Gas Co Ltd
Current assignee: Tokyo Gas Co Ltd
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: JP2003009847A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示す微生物、並びにその微生物を用いた土壌、排水又は地下水の処理方法及び処理剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアン化合物は、反応性に富み、電気メッキ、写真、医薬、農薬、合成繊維やプラスチックの製造において大量に利用されている。また、製鉄及び石炭のガス化の工程などから排出される処理水中にも含まれている。シアン化合物は生物に対し阻害的に作用することから、環境中に排出されたシアン化合物は微生物等により速やかに分解除去されることが望まれる。シアン化合物は、環境中で遊離体又は金属錯体として存在するが、遊離シアンは、猛毒性を示すものの環境中に存在する微生物によって容易に分解除去される。その一方、金属シアノ錯体は、毒性は弱いものの生物的に分解されにくく、環境中に長期間残存するという問題がある。
【０００３】
微生物を用いて金属シアノ錯体を分解除去することについては既に幾つか報告がある。例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物（特開2000-270848号公報）、オクロバクトルム属（Ochrobactrum）の微生物（特開2000-270874号公報）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の微生物（特開2000-270853号公報）など用いてフェロシアン化物イオンを分解除去する方法が既に知られている。また、フザリウム・オキシウポルム（Fusarium oxysporum）を用いてニッケルシアノ錯体を分解除去する方法（特開平10-262651号公報）も既に知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
環境中には、上述のフェロシアン化物イオンやニッケルシアノ錯体のほかに、フェリシアン化物イオンなどの金属シアノ錯体も存在している。金属シアノ錯体によって汚染された環境を浄化し、無害化するためには、上述した微生物を利用するだけでは不十分であり、フェリシアン化物イオンを分解する微生物も必要である。しかし、現在までのところ、フェリシアン化物イオンを効率よく分解する微生物は知られていない。
【０００５】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、高いフェリシアン化物イオン分解能を示す微生物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、フェロシアン化物イオン分解能を持つ微生物の中から、フェリシアン化物イオンに対しても高い分解能を示す突然変異体を見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の第一は、フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示す微生物であって、フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示すアルカリゲネス属に属する微生物である。
【０００８】
本発明の第二は、上記微生物又はその無細胞抽出液を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【０００９】
本発明の第三は、上記微生物又はその無細胞抽出液を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１０】
本発明の第四は、上記微生物又はその無細胞抽出液と２価の鉄イオン又はコバルトイオンを、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【００１１】
本発明の第五は、上記微生物又はその無細胞抽出液と２価の鉄イオン又はコバルトイオン含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１２】
本発明の第六は、上記微生物をフェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養した後、この微生物又はその無細胞抽出液を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【００１３】
本発明の第七は、フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養した上記微生物又はその無細胞抽出液を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１４】
本発明の第八は、上記微生物をアルミナと混合した後、超音波により破砕し、その破砕物の上清を、シアン化合物を含む土壌、排水又は地下水に添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
【００１５】
本発明の第九は、アルミナと共に超音波処理された上記微生物の破砕物の上清を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の微生物は、以下の（１）及び（２）の性質を有するアルカリゲネス属に属する微生物である。
（１）フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示す。
（２）フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示す。
【００１８】
本発明の微生物は、上記（１）及び（２）の性質を有するものであればどのようなものでもよいが、以下の（３）〜（６）の性質の少なくとも一つの性質を有するものが好ましく、少なくとも二つの性質を有するものが更に好ましく、すべての性質を有するものが最も好ましい。
（３）鉄以外の金属シアノ錯体（例えば、ニッケルシアノ錯体）に対して分解能を示す。
（４）有機シアン化合物（例えば、NC(CH₂)₂CN）に対して分解能を示す。
（５）２価の鉄イオン又はコバルトイオンにより、フェロシアン化物イオンに対する分解能が向上する。
（６）フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養することにより、シアン化物イオンに対する分解能が向上する。
【００１９】
本発明の微生物に含まれる菌株としては、F4B4m株を例示することができる。F4B4m株は、F4B4株の突然変異株であり、この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18376として寄託されている（寄託日：平成13年6月13日）。F4B4m株の親株であるF4B4株は、参考例１に示すように、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属するので、F4B4m株もアルカリゲネス属に属すると考えられる。
【００２０】
本発明の微生物には、F4B4m株の他、この菌株の自然又は人工変異株も含まれる。このような変異株は、（１）フェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオン及びシアン化物イオンに対して分解能を示し、（２）フェロシアン化物イオンよりもフェリシアン化物イオンに対して高い分解能を示すものであれば特に限定されないが、以下の（３）〜（６）の性質の少なくとも一つの性質を有するものが好ましく、少なくとも二つの性質を有するものが更に好ましく、すべての性質を有するものが最も好ましい。
（３）鉄以外の金属シアノ錯体（例えば、ニッケルシアノ錯体）に対して分解能を示す。
（４）有機シアン化合物（例えば、NC(CH₂)₂CN）に対して分解能を示す。
（５）２価の鉄イオン又はコバルトイオンにより、フェロシアン化物イオンに対する分解能が向上する。
（６）フェロシアン化物イオン又はフェリシアン化物イオンを含む培地中で培養することにより、シアン化物イオンに対する分解能が向上する。
【００２１】
本発明の微生物は、アルカリゲネス属に属する一般的な微生物と同様の方法で増殖させることができる。培養は、好気的条件で行うことが好ましく、無機塩、窒素源、その他栄養源を含む無機栄養培地、有機栄養培地等に本発明の微生物を接種し、例えば、振盪培養法、通気攪拌培養法などにより培養を行う。
【００２２】
上記培養における温度条件は、最適生育温度の範囲（20〜40℃）に設定することができる。培地のpHは6.0〜8.0の範囲に設定すればよい。無機塩として培地に添加する物質としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、アンモニウム塩、その他微量金属塩が挙げられる。また、窒素源としては、例えば、フェロシアン化カリウム３水和物、フェリシアン化カリウムやテトラシアノニッケルカリウム等の金属シアノ錯体をはじめとするシアン化合物が挙げられる。これらの窒素源は１種でもよく、２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。さらに、本発明の微生物の増殖を促進するための栄養源として、グルコース、エタノール、グリセロール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトンなどを適量添加することもできる。培養時間は、6〜50日間、好ましくは10日間以上である。
【００２３】
本発明の微生物は、（Ａ）土壌、排水又は地下水の処理方法、（Ｂ）土壌、排水又は地下水の処理剤に利用することができる。以下、これらについて説明する。
（Ａ）土壌、排水又は地下水の処理方法
本発明の微生物をシアン化合物を含む土壌、排水又は地下水（以下、単に「土壌等」という場合がある）に添加することにより、土壌等に含まれるシアン化合物を分解除去することが可能である。
【００２４】
本発明の微生物を添加する土壌等としては、例えば、めっき工場、選鉱精錬所、鉄鋼熱処理工場、コークス製造工場などの周辺土壌、その土壌中に含まれる地下水、これらの工場から排出される排水などを挙げることができるが、シアン化合物を含むものであればどのようなものであってもよい。本発明の微生物はフェリシアン化物イオンに対する分解能が高いので、このイオンを含む土壌等に添加するのがより好ましい。
【００２５】
本発明の微生物の土壌等への添加は、土壌等へ直接散布するか、又は土壌等を回収し、その土壌等に本発明の微生物を混合した後、元に戻すなどの方法によって行うことができる。土壌等への添加量は、含まれるシアン化合物の量や種類等によって異なるが、鉄シアノ錯体の場合は、150〜300mg/Lの鉄シアノ錯体濃度あたり10⁷個以上が好ましく、10⁸〜10⁹個が更に好ましい。なお、排水又は地下水の温度は10〜30℃であることが好ましい。
【００２６】
本発明の微生物を土壌等へ添加する際、微生物のシアン化合物に対する分解能が向上されるような物質を添加してもよい。そのような物質としては、例えば、２価の鉄イオン、コバルトイオンなどを例示することができる。また、本発明の微生物のシアン化合物に対する分解能を向上させるような処理をした後に、微生物を土壌等に添加してもよい。このような処理としては、土壌等に添加する前に、微生物をフェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオンを存在する培地中で培養するといった処理を挙げることができる。
【００２７】
添加する微生物は、通常、菌体自体を使用するが、菌体の代わりに無細胞抽出液を用いてもよい。無細胞抽出液は、通常の方法に従い、菌体を破砕し、その上清を分離することにより調製できる。菌体の破砕手段としては、超音波、フレンチプレス、アルミナによる磨砕を例示することができるが、菌体をアルミナと混合し、超音波処理することが好ましい。
（Ｂ）土壌、排水又は地下水の処理剤
本発明の微生物は、土壌、排水又は地下水の処理剤として使用することができる。本発明の処理剤は、本発明の微生物をそのまま、あるいは適当な液体又は固体の担体と組み合わせて使用することができる。
【００２８】
製剤に使用する液体担体としては、例えば、水が挙げられる。この場合は、純水又は無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、糖（グルコース、ショ糖等）若しくは有機資材（牛肉エキス、酵母エキス等）の水溶液を用いることができる。
【００２９】
また、製剤に使用する固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、高分子性天然物（結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等）、ウレタン等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３０】
本発明の微生物を混合する担体の量は、微生物1,000個あたり粉末で200〜2000mg、水和剤では1〜10g、ゲルビーズでは10〜20gであるが、使用目的によって適宜変更してもよい、
本発明の処理剤には、微生物のシアン化合物に対する分解能が向上されるような物質を混合してもよい。そのような物質としては、例えば、２価の鉄イオン、コバルトイオンなどを例示することができる。また、処理剤中の微生物に適当な処理を施し、シアン化合物に対する分解能を向上させてもよい。このような処理としては、微生物をフェロシアン化物イオン、フェリシアン化物イオンが存在する培地中で培養するといった処理を挙げることができる。
【００３１】
処理剤中の微生物は、通常、菌体自体を使用するが、菌体の代わりに無細胞抽出液を用いてもよい。無細胞抽出液は、通常の方法に従い、菌体を破砕し、その上清を分離することにより調製できる。菌体の破砕手段としては、超音波、フレンチプレス、アルミナによる磨砕を例示することができるが、菌体をアルミナと混合し、超音波処理することが好ましい。
【００３２】
本発明の処理剤は、散布剤、注入剤等を用いて、シアン化合物を含有する土壌等に直接投与することができる。
【００３３】
以上の通り、本発明の微生物は、例えば、鉄シアノ錯体であるフェロシアン化カリウム、フェリシアン化カリウムなどを含んだ培地中で、該シアン化合物を窒素源として生育し、該シアン化合物を迅速に分解する能力を発揮する。従って、安定な化合物である金属シアノ錯体を含んだ排水又は地下水処理にも安価で環境負荷の小さい生物処理を適用できる。また、本発明の微生物は、シアン汚染土壌中に多く含まれる鉄シアノ錯体を分解できる菌であることから、シアン汚染土壌の処理にも対応可能な菌である。
【００３４】
【実施例】
〔実施例１〕
BM液体培地（表１）に、K₃[Fe(CN)₆]を濃度が0.2%になるように添加し、K₃[Fe(CN)₆]を唯一の窒素源とする培地を作製した。この培地にF4B4株（FERM P-17742）を植菌して、培養を行い、生育に違いが認められた培養液を、同組成の平板培地に塗布してコロニーを形成させた。形成したコロニーのうちから、大きなコロニーを選び、培養を繰り返すことにより、最終的に、K₃[Fe(CN)₆]を窒素源として生育する自然突然変異株、F4B4m株を単離した。
【００３５】
【表１】

【００３６】
【表２】

〔実施例２〕
BM液体培地に、種々の窒素化合物を濃度が0.2％になるように添加し、各培地にF4B4株又はF4B4m株を植菌した。30℃で、１週間振盪培養を行った後、培養液の吸光度（610nm）を測定し、増殖状態を評価した。この結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】

表に示すように、F4B4株は、K₃[Fe(CN)₆]よりもK₄[Fe(CN)₆]を添加した培地で良好に増殖したのに対し、F4B4m株はK₄[Fe(CN)₆]よりもK₃[Fe(CN)₆]を添加した培地で良好に増殖した。
〔実施例３〕
BM液体培地に、K₄[Fe(CN)₆]又はK₃[Fe(CN)₆]を濃度が1mMになるように添加し、各培地にF4B4株又はF4B4m株を植菌した。30℃で振盪培養を行い、培養開始時、１週間後、及び２週間後の鉄シアノ錯体の濃度を測定した。鉄シアノ錯体濃度の測定は、JIS法に従って行った。即ち、リン酸酸性条件下でサンプルを加熱蒸留した後、鉄シアノ錯体をアルカリ溶液中に回収し、これをピリジン・ピラゾン法で比色定量した。この結果を図１に示す。
【００３８】
図に示すように、F4B4株を植菌した場合は、K₄[Fe(CN)₆]濃度のみが減少したが、F4B4m株を植菌した場合は、K₄[Fe(CN)₆]濃度、K₃[Fe(CN)₆]濃度のいずれも減少した。
〔実施例４〕
BM液体培地に、K₄[Fe(CN)₆]又はK₃[Fe(CN)₆]を濃度が1mMになるように添加し、各培地にF4B4株又はF4B4m株を植菌した。30℃で振盪培養を行い、培養液の吸光度（610nm）を測定し、増殖の状態を評価した。この結果を図２に示す。
【００３９】
図に示すように、F4B4株は、K₃[Fe(CN)₆]よりもK₄[Fe(CN)₆]を添加した培地で良好に増殖したのに対し、F4B4m株はK₄[Fe(CN)₆]よりもK₃[Fe(CN)₆]を添加した培地で良好に増殖した。
〔実施例５〕
以下の（１）〜（６）の培地にF4B4m株を植菌し、30℃で振盪培養を行った。
（１）基本BM液体培地（表４）に、Vitamin solution II（表２）、Metal solution II（表５）、1.0m% MgSO₄・7H₂O、1.0m% FeCl₃・6H₂Oを添加した培地（図３及び図４中「All+」と記載）
（２）基本BM液体培地に、Vitamin solution II、Metal solution IIを添加した培地（図３及び図４中「Ms-」と記載）
（３）基本BM液体培地に、Metal solution IIを添加した培地（図３及び図４中「MII+」と記載）
（４）基本BM液体培地に、1.0m% MgSO₄・7H₂O、1.0m% FeCl₃・6H₂Oを添加した培地（図３及び図４中「Ms+」と記載）
（５）基本BM液体培地に、Vitamin solution IIを添加した培地（図３及び図４中「V+」と記載）
（６）基本BM液体培地（図３及び図４中「No」と記載）
培養液の吸光度（610nm）及び培地中のK₄[Fe(CN)₆]濃度を経時的に測定し、増殖状態及びK₄[Fe(CN)₆]に対する分解能を評価した。
【００４０】
吸光度の測定結果を図３に、K₄[Fe(CN)₆]濃度の測定結果を図４に、それぞれ示す。
【００４１】
図３及び図４に示すように、培地中に金属塩が含まれない場合（No及びV+）には、F4B4m株は増殖せず、また、K₄[Fe(CN)₆]もほとんど分解されなかった。従って、F4B4m株の増殖及び金属シアノ錯体の分解には、金属塩が必須であることが明らかになった。
【００４２】
【表４】

【００４３】
【表５】

〔実施例６〕
以下の（１）〜（３）の培地にF4B4m株を植菌し、30℃で振盪培養を行った。
（１）基本BM液体培地（表４）にFe²⁺＋Co²⁺を添加した培地
（２）基本BM液体培地に、Fe²⁺を添加した培地
（３）基本BM液体培地に、Co²⁺を添加した培地
培養液の吸光度（610nm）及び培地中のK₄[Fe(CN)₆]濃度を経時的に測定し、増殖状態及びK₄[Fe(CN)₆]に対する分解能を評価した。また、対照としてF4B4m株を植菌しない場合の培養液の吸光度も測定した（図５中「N.C.(Fe²⁺＋Co²⁺)」、「N.C.(Fe²⁺のみ)」、「N.C.(Co²⁺のみ)」と記載）。
【００４４】
吸光度の測定結果を図５に、K₄[Fe(CN)₆]濃度の測定結果を図６に、それぞれ示す。
【００４５】
これらの図に示すように、Fe²⁺、又はCo²⁺のいずれか一方が培地に含まれていれば、F4B4m株は増殖し、K₄[Fe(CN)₆]を分解できることが明らかになった。
〔実施例７〕
BM液体培地（表1）に、種々の窒素源を濃度が0.2%になるように添加し、各培地にF4B4m株を植菌した。30℃で2週間培養を行った後、遠心分離（6,000 rpm、15分）により菌体を回収した。菌体を50mM KPB(pH 7)で洗浄した後、50mM KPB(pH 7)に懸濁した。この菌体懸濁液を含む菌体反応液（菌体懸濁液 2.0ml、500mM KPB(pH 7.5) 0.8ml、20mM KCN 0.4ml、蒸留水 2.0ml）を調製し、反応液中のKCN濃度を経時的に測定し、菌体のKCNに対する分解能を評価した。また、KCNの代謝産物であるHCOOH及びNH₃の濃度も併せて測定した。この結果を図７及び図８に示す。
【００４６】
これらの図に示すように、K₄[Fe(CN)₆]又はK₃[Fe(CN)₆]を含む培地で培養した菌体は、高いKCN分解能を示した。一方、NH₄Clを含む培地で培養した菌体はほとんどKCNを分解しなかった。
【００４７】
K₄[Fe(CN)₆]又はK₃[Fe(CN)₆]によるKCN分解能の誘導を更に詳細に検討するため、K₄[Fe(CN)₆]、K₃[Fe(CN)₆]、K₂[Ni(CN)₆]を用いて上記と同様にKCNに対する分解能を評価した。この結果を図９に示す。
【００４８】
この図に示すように、K₃[Fe(CN)₆]がKCN分解能誘導効果が最も高かった。
〔実施例８〕
10mMのK₄[Fe(CN)₆]、10mMのK₂[Ni(CN)₄]それぞれを唯一の窒素源として含むBM液体培地（表1）にF4B4m株を植菌し、30℃で２週間振盪培養を行った。培養終了後、菌体を超音波により破砕し、その上清を採取した。この上清を無細胞抽出液とし、以下の実験に供した。
【００４９】
無細胞抽出液を含むK₄[Fe(CN)₆]反応液（無細胞抽出液 0.5ml、500mM KPB(pH 7.0) 0.2ml、20mM K₄[Fe(CN)₆] 0.1ml、蒸留水 0.2ml）及びK₂[Ni(CN)₄]反応液（無細胞抽出液 0.5ml、500mM KPB(pH 7.0) 0.2ml、50mM K₂[Ni(CN)₄] 0.1ml、蒸留水 0.2ml）を調製し、各反応液中のK₄[Fe(CN)₆]又はK₂[Ni(CN)₄]濃度及びアンモニア濃度を経時的に測定した。なお、対照として、無細胞抽出液を加えないK₄[Fe(CN)₆]反応液及びK₂[Ni(CN)₄]反応液のK₄[Fe(CN)₆]濃度及びK₂[Ni(CN)₄]濃度も併せて測定した。この結果を図１０に示す。
【００５０】
この図に示すように、無細胞抽出液は、K₄[Fe(CN)₆]あるいはK₂[Ni(CN)₄]を分解し、NH₃を遊離した。しかし、その分解速度は休止菌体に比較して明らかに遅かった。
〔実施例９〕
F4B4m株の休止菌体を超音波破砕機で30分間処理し、その破砕物を遠心処理し（5,000rpm、5分、4℃）、上清と沈殿に分離した。ここで得られた沈殿を細胞画分（図１１中「+Cell」と記載）とした。上清については更に遠心処理（10,000rpm、20分、4℃）し、得られた沈殿を細胞膜画分（図１１中「+Membrane fraction」と記載）とし、上清（図１１中「+C.F.E.」と記載）を細胞質画分とした。
【００５１】
細胞画分、細胞膜画分、細胞質画分0.2mlをそれぞれKCNを含む反応液（500mM KPB(pH 7.0) 0.08ml、20mM KCN 0.04ml、蒸留水 0.08ml）に添加し、反応液中のKCN濃度を経時的に測定した。また、細胞質画分については反応液中のNH₃濃度も併せて測定した。更に、対照として、いずれの画分も添加しない反応液（図１１中「‐C.F.E.」と記載）、KCNを添加しない反応液（図１１中の「-KCN」と記載）のKCN濃度及びNH₃濃度の経時的変化も測定した。以上の結果を図１１に示す。
【００５２】
この図に示すように、細胞質画分を添加した場合のみKCN濃度が減少し、NH₃濃度が上昇した。このことから、細胞質画分中にKCN分解に関与する酵素が存在するものと考えられる。
〔実施例１０〕
以下の４通りの方法によって調製した無細胞抽出液0.2mlをそれぞれKCNを含む反応液（500mM KPB(pH 7.0) 0.08ml、20mM KCN 0.04ml、蒸留水 0.08ml）に加え、その後の溶液中のKCN濃度、及びKCNの代謝物（NH₃及びHCOOH）濃度を経時的に測定した。
（１）通常の超音波破砕：
K₄[Fe(CN)₆]生育湿菌体1.07 gを100 mM KPB（pH 7） 10 mlに溶解し、これを氷冷しながら超音波破砕器で30分間破砕し、無細胞抽出液を調製した。蛋白量は、3.21（mg/ml）であった。
（２）アルミナを用いて超音波破砕：
K₄[Fe(CN)₆]生育湿菌体2.02 gに2 gのアルミナと100 mM KPB（pH 7） 4 mlを加えて、氷冷しながら超音波破砕器で30分間破砕し、無細胞抽出液を調製した。
蛋白量は、10.2（mg/ml）であった。
（３）フレンチプレス：
K₄[Fe(CN)₆]生育湿菌体1.20 gを100 mM KPB（pH 7） 10 mlに溶解し、手動式油圧フレンチ・プレス（大岳製作所）を用いて、1500 kgf/cm²の圧力一定で破砕した。これを2回行った破砕菌体より、無細胞抽出液を調製した。蛋白量は、0.93（mg/ml）であった。
（４）アルミナ摩砕：
K₄[Fe(CN)₆]生育湿菌体1.08 gに1 gのアルミナと2 mlの緩衝液を加えて、氷冷した乳鉢中で30分間磨砕し、無細胞抽出液を調製した。蛋白量は、4.47（mg/ml）であった。
【００５３】
以上の結果を図１２及び図１３に示す。この図に示すように、通常の超音波処理により得られた無細胞抽出液は、3時間の反応で0.19 mMのKCNを分解し、アンモニアとギ酸を生成した。アルミナを添加した超音波破砕処理では、3時間後に0.4 mMのKCNを分解した。フレンチプレスでは、0.21 mMのKCNを、また、アルミナ摩砕法では0.26 mMの分解が認められた。以上の結果から、F4B4m株の無細胞抽出液の調製には、超音波破砕にアルミナを補填して処理を行うことにより、高い抽出効率が得られることを明らかとなった。
〔参考例１〕
F4B4株の菌学的性質を調べた。結果を下表に示す。
【００５４】
【表６】

以上の諸性質をP.R.Murray et al., Mannual of clinical Microbial 6^thed., ASM Press, 1995及びE.Yabuuch et al., Microbial. Immunol., 36, 1251-1275, 1992に基づいて検索したところ、分離株F4B4株は鞭毛の着生状況が周毛であることからアルカリゲネス属に属する菌群と考えられ、生理的性状試験からは、アルカリゲネス・フェカーリス(Alcaligenes faecalis)、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）、CDC gr.IV C-2などが示唆されるが、MacConkey寒天での生育陽性、炭水化物の利用性陰性、TSI寒天で硫化水素非産生であることからCDC gr.IV C-2が最も近縁な菌群と考えられる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明は、シアン化合物分解微生物、並びにそれを用いた土壌、排水又は地下水の処理方法及び処理剤を提供する。本発明の微生物等を利用することにより、シアン化合物、特にフェリシアン化物イオンを効率的に分解、除去することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 F4B4株及びF4B4m株の鉄シアノ錯体に対する分解能を示す図である。
【図２】 F4B4株及びF4B4m株の鉄シアノ錯体存在下での増殖状態を示す図である。
【図３】培地成分とF4B4m株の増殖との関係を示す図である。
【図４】培地成分とF4B4m株のフェロシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図５】金属塩とF4B4m株の増殖との関係を示す図である。
【図６】金属塩とF4B4m株のフェロシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図７】前培養時に添加した窒素化合物とF4B4m株のシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（１）。
【図８】前培養時に添加した窒素化合物とF4B4m株のシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（２）。
【図９】前培養時に添加した金属シアノ錯体とF4B4m株のシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図１０】 F4B4m株の無細胞抽出液の金属シアノ錯体に対する分解能を示す図である。
【図１１】 F4B4m株の破砕物の画分とシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である。
【図１２】 F4B4m株の破砕条件とシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（１）。
【図１３】 F4B4m株の破砕条件とシアン化カリウムに対する分解能との関係を示す図である（２）。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microorganism exhibiting high resolution with respect to ferricyanide ions, and a method and a treatment agent for soil, wastewater or groundwater using the microorganism.
[0002]
[Prior art]
Cyanides are highly reactive and are used in large quantities in the production of electroplating, photography, medicine, agricultural chemicals, synthetic fibers and plastics. It is also contained in treated water discharged from the process of gasification of iron and coal. Since cyan compounds act to inhibit living organisms, it is desirable that cyan compounds discharged into the environment be quickly decomposed and removed by microorganisms or the like. Although cyanide compounds exist in the environment as educts or metal complexes, free cyanide is highly toxic, but is easily decomposed and removed by microorganisms present in the environment. On the other hand, metal cyano complexes have a problem that they are weakly biodegradable but remain in the environment for a long time, although they are less toxic.
[0003]
Several reports have already been made on the decomposition and removal of metal cyano complexes using microorganisms. For example, microorganisms belonging to the genus Rhodococcus (JP 2000-270848 A), microorganisms belonging to the genus Ochrobactrum (JP 2000-270874 A), microorganisms belonging to the genus Streptomyces (JP 2000-2000) A method for decomposing and removing ferrocyanide ions by using, for example, No. 270853) is already known. Further, a method for decomposing and removing a nickel cyano complex using Fusarium oxysporum (Japanese Patent Laid-Open No. 10-262651) is already known.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In addition to the ferrocyanide ions and nickel cyano complexes described above, metal cyano complexes such as ferricyanide ions also exist in the environment. In order to purify and detoxify the environment contaminated by the metal cyano complex, it is not sufficient to use the above-described microorganisms, and a microorganism that decomposes ferricyanide ions is also necessary. However, to date, no microorganism is known that efficiently degrades ferricyanide ions.
[0005]
The present invention has been made under the above technical background, and an object thereof is to provide a microorganism exhibiting high ferricyanide ion resolution.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventor has found a mutant exhibiting high resolution against ferricyanide ions among microorganisms having ferrocyanide ion resolution. The present invention has been completed based on the findings.
[0007]
That is, the first aspect of the present invention is a microorganism that exhibits resolution against ferrocyanide ions, ferricyanide ions, and cyanide ions, and exhibits higher resolution against ferricyanide ions than ferrocyanide ions. It is a microorganism belonging to the genus Alkagenes.
[0008]
The second aspect of the present invention is a method for treating soil, wastewater or groundwater, characterized in that the microorganism or cell-free extract thereof is added to soil, wastewater or groundwater containing cyanide.
[0009]
3rd of this invention is the processing agent for soil, waste_water | drain, or groundwater containing the said microorganisms or its cell-free extract.
[0010]
A fourth aspect of the present invention is the treatment of soil, drainage or groundwater, characterized in that the microorganism or a cell-free extract thereof and divalent iron ions or cobalt ions are added to soil, drainage or groundwater containing cyanide. Is the method.
[0011]
5th of this invention is the processing agent for soil, waste_water | drain, or groundwater containing the said microorganisms or its cell-free extract and a bivalent iron ion or cobalt ion.
[0012]
In the sixth aspect of the present invention, the microorganism is cultured in a medium containing ferrocyanide ions or ferricyanide ions, and then the microorganism or a cell-free extract thereof is added to soil, waste water, or groundwater containing a cyanide compound. This is a method for treating soil, drainage or groundwater.
[0013]
7th of this invention is the processing agent for soil, waste_water | drain, or groundwater containing the said microorganisms or the cell-free extract thereof cultured in the culture medium containing ferrocyanide ion or ferricyanide ion.
[0014]
The eighth aspect of the present invention is that the microorganism is mixed with alumina, then crushed by ultrasonic waves, and the supernatant of the crushed material is added to soil, drainage or groundwater containing cyanide, Or it is a method of treating groundwater.
[0015]
A ninth aspect of the present invention is a treatment agent for soil, drainage or groundwater, which contains the supernatant of the crushed microorganisms sonicated with alumina.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0017]
The microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the genus Alkagenes having the following properties (1) and (2).
(1) The resolution is shown for ferrocyanide ions, ferricyanide ions and cyanide ions.
(2) Higher resolution for ferricyanide ions than for ferrocyanide ions.
[0018]
The microorganism of the present invention may be any microorganism as long as it has the above properties (1) and (2), but has at least one of the following properties (3) to (6). Preferably, those having at least two properties are more preferred, and those having all properties are most preferred.
(3) The resolution is shown for metal cyano complexes other than iron (for example, nickel cyano complex).
(4) The resolution is shown for an organic cyanide compound (for example, NC (CH ₂ ) ₂ CN).
(5) The resolution for ferrocyanide ions is improved by the divalent iron ion or cobalt ion.
(6) By culturing in a medium containing ferrocyanide ions or ferricyanide ions, the resolution for cyanide ions is improved.
[0019]
Examples of the strain contained in the microorganism of the present invention include the F4B4m strain. The F4B4m strain is a mutant strain of the F4B4 strain, and this strain is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center under the deposit number FERM P-18376 (Deposit date: June 2001) The 13th). As shown in Reference Example 1, the F4B4m strain, which is the parent strain of the F4B4m strain, belongs to the genus Alcaligenes, and therefore the F4B4m strain is also considered to belong to the genus Alkagenes.
[0020]
In addition to the F4B4m strain, the microorganisms of the present invention include natural or artificial mutants of this strain. Such mutants show (1) resolution for ferrocyanide ions, ferricyanide ions and cyanide ions, and (2) higher resolution for ferricyanide ions than ferrocyanide ions. Although it will not specifically limit if it is a thing, The thing which has at least 1 property of the following properties (3)-(6) is preferable, The thing which has at least 2 property is more preferable, and the thing which has all the properties is the most preferable.
(3) The resolution is shown for metal cyano complexes other than iron (for example, nickel cyano complex).
(4) The resolution is shown for an organic cyanide compound (for example, NC (CH ₂ ) ₂ CN).
(5) The resolution for ferrocyanide ions is improved by the divalent iron ion or cobalt ion.
(6) By culturing in a medium containing ferrocyanide ions or ferricyanide ions, the resolution for cyanide ions is improved.
[0021]
The microorganism of the present invention can be grown in the same manner as a general microorganism belonging to the genus Alkagenes. Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, and the microorganism of the present invention is inoculated into an inorganic nutrient medium, an organic nutrient medium, or the like containing an inorganic salt, a nitrogen source, and other nutrient sources. Culture is performed by the method.
[0022]
The temperature condition in the culture can be set within the optimum growth temperature range (20 to 40 ° C.). What is necessary is just to set the pH of a culture medium in the range of 6.0-8.0. Substances added to the culture medium as inorganic salts include phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, ammonium salts, and other trace metal salts. Examples of the nitrogen source include cyanide compounds including metal cyano complexes such as potassium ferrocyanide trihydrate, potassium ferricyanide and potassium tetracyanonickel. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, glucose, ethanol, glycerol, yeast extract, beef extract, peptone, etc. can be added in an appropriate amount as a nutrient source for promoting the growth of the microorganism of the present invention. The culture time is 6 to 50 days, preferably 10 days or longer.
[0023]
The microorganism of the present invention can be used in (A) a method for treating soil, drainage or groundwater, and (B) a treatment agent for soil, drainage or groundwater. Hereinafter, these will be described.
(A) Soil, drainage or groundwater treatment method Cyanide contained in soil or the like by adding the microorganism of the present invention to soil, drainage or groundwater containing cyanide (hereinafter sometimes simply referred to as “soil”) It is possible to decompose and remove the compound.
[0024]
Examples of the soil to which the microorganism of the present invention is added include, for example, surrounding soil such as a plating plant, a beneficiation smelter, a steel heat treatment plant, a coke production plant, groundwater contained in the soil, and wastewater discharged from these factories. Any material may be used as long as it contains a cyanide compound. Since the microorganisms of the present invention have a high resolution for ferricyanide ions, it is more preferable to add them to soil containing such ions.
[0025]
Addition of the microorganism of the present invention to the soil or the like may be performed by a method such as spraying directly on the soil or the like, or collecting the soil or the like, mixing the microorganism of the present invention into the soil, and then returning to the original state. it can. The amount added to soil or the like varies depending on the amount and type of cyanide contained, but in the case of an iron cyano complex, it is preferably 10 ⁷ or more per iron cyano complex concentration of 150 to 300 mg / L, 10 ⁸ to 10 ^{Nine is} more preferred. In addition, it is preferable that the temperature of drainage or groundwater is 10-30 degreeC.
[0026]
When the microorganism of the present invention is added to soil or the like, a substance capable of improving the resolution of microorganisms to cyanide compounds may be added. Examples of such substances include divalent iron ions and cobalt ions. Further, the microorganisms of the present invention may be added to the soil or the like after the treatment for improving the resolution of the microorganisms to the cyanide. Examples of such treatment include treatment in which a microorganism is cultured in a medium containing ferrocyanide ions and ferricyanide ions before being added to soil or the like.
[0027]
Usually, the microbial cells themselves are used as the microorganism to be added, but a cell-free extract may be used instead of the microbial cells. The cell-free extract can be prepared by crushing bacterial cells and separating the supernatant according to a usual method. Examples of the means for crushing bacterial cells include ultrasonic waves, French press, and grinding with alumina, but it is preferable to mix the bacterial cells with alumina and perform ultrasonic treatment.
(B) Treatment agent for soil, drainage or groundwater The microorganism of the present invention can be used as a treatment agent for soil, drainage or groundwater. The treatment agent of the present invention can be used as it is or in combination with an appropriate liquid or solid carrier.
[0028]
Examples of the liquid carrier used for the preparation include water. In this case, pure water or an aqueous solution of inorganic salts (such as sodium chloride and potassium chloride), sugar (such as glucose and sucrose) or organic materials (such as beef extract and yeast extract) can be used.
[0029]
Examples of solid carriers used in the preparation include natural mineral powders such as kaolin, clay, talc, chalk, quartz, attapulgite, montmorillonite, and diatomaceous earth, synthetic mineral powders such as silicic acid, alumina, and silicate, and polymers. Natural products (crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.), urethane and the like, and one or more of these can be used in combination.
[0030]
The amount of the carrier to which the microorganism of the present invention is mixed is 200 to 2000 mg in powder per 1,000 microorganisms, 1 to 10 g in wettable powder, and 10 to 20 g in gel beads, but may be appropriately changed depending on the purpose of use.
The treatment agent of the present invention may be mixed with a substance capable of improving the resolution of microorganisms against cyanide compounds. Examples of such substances include divalent iron ions and cobalt ions. In addition, the microorganisms in the treatment agent may be appropriately treated to improve the resolution for cyanide compounds. Examples of such treatment include treatment in which microorganisms are cultured in a medium containing ferrocyanide ions and ferricyanide ions.
[0031]
As the microorganism in the treatment agent, the cell itself is usually used, but a cell-free extract may be used instead of the cell. The cell-free extract can be prepared by crushing bacterial cells and separating the supernatant according to a usual method. Examples of the means for crushing bacterial cells include ultrasonic waves, French press, and grinding with alumina, but it is preferable to mix the bacterial cells with alumina and perform ultrasonic treatment.
[0032]
The treatment agent of the present invention can be directly administered to soil or the like containing a cyanide compound using a spraying agent, an injection agent or the like.
[0033]
As described above, the microorganism of the present invention has, for example, the ability to grow the cyanide as a nitrogen source in a medium containing iron cyano complexes such as potassium ferrocyanide and potassium ferricyanide, and rapidly decompose the cyanide. Demonstrate. Therefore, biological treatment with low environmental impact can be applied to wastewater or groundwater treatment containing a metal cyano complex which is a stable compound. In addition, the microorganism of the present invention is a bacterium capable of decomposing an iron cyano complex contained in a large amount of cyan-contaminated soil, so that it can cope with the treatment of cyan-contaminated soil.
[0034]
【Example】
[Example 1]
To the BM liquid medium (Table 1), K ₃ [Fe (CN) ₆ ] was added to a concentration of 0.2%, and a medium containing K ₃ [Fe (CN) ₆ ] as the only nitrogen source was prepared. . The medium was inoculated with the F4B4 strain (FERM P-17742), cultured, and a culture solution with a difference in growth was applied to a plate medium having the same composition to form colonies. By selecting a large colony from the formed colonies and repeating the culture, a natural mutant strain F4B4m that grows using K ₃ [Fe (CN) ₆ ] as a nitrogen source was finally isolated.
[0035]
[Table 1]

[0036]
[Table 2]

[Example 2]
Various nitrogen compounds were added to the BM liquid medium to a concentration of 0.2%, and the F4B4 strain or the F4B4m strain was inoculated into each medium. After shaking culture at 30 ° C. for 1 week, the absorbance (610 nm) of the culture solution was measured to evaluate the growth state. The results are shown in Table 3.
[0037]
[Table 3]

As shown in Table, F4B4 strain, K ₃ whereas than [Fe (CN) _6] grew well in medium supplemented with _{_{K 4 [Fe (CN) 6}} ], F4B4m strain K ₄ [Fe It grew better in the medium supplemented with K ₃ [Fe (CN) ₆ ] than (CN) ₆ ].
Example 3
To the BM liquid medium, K ₄ [Fe (CN) ₆ ] or K ₃ [Fe (CN) ₆ ] was added to a concentration of 1 mM, and the F4B4 strain or F4B4m strain was inoculated into each medium. Shaking culture was performed at 30 ° C., and the concentration of the iron cyano complex was measured at the start of culture, after 1 week, and after 2 weeks. The iron cyano complex concentration was measured according to the JIS method. That is, after the sample was heated and distilled under acidic conditions of phosphoric acid, the iron cyano complex was recovered in an alkaline solution, and this was colorimetrically determined by the pyridine pyrazone method. The result is shown in FIG.
[0038]
As shown in the figure, when inoculated with F4B4 strain, only _{_{K 4 [Fe (CN) 6}} ] concentration was reduced, when inoculated with F4B4m strain, _{_{K 4 [Fe (CN) 6}} ] Concentration , Both K ₃ [Fe (CN) ₆ ] concentrations decreased.
Example 4
To the BM liquid medium, K ₄ [Fe (CN) ₆ ] or K ₃ [Fe (CN) ₆ ] was added to a concentration of 1 mM, and the F4B4 strain or F4B4m strain was inoculated into each medium. After shaking culture at 30 ° C., the absorbance (610 nm) of the culture solution was measured to evaluate the growth state. The result is shown in FIG.
[0039]
As shown in FIG, F4B4 strain, K ₃ whereas than [Fe (CN) _6] grew well in medium supplemented with _{_{K 4 [Fe (CN) 6}} ], F4B4m strain K ₄ [Fe It grew better in the medium supplemented with K ₃ [Fe (CN) ₆ ] than (CN) ₆ ].
Example 5
The F4B4m strain was inoculated into the following media (1) to (6) and cultured at 30 ° C. with shaking.
(1) Vitamin solution II (Table 2), Metal solution II (Table 5), 1.0m% MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1.0m% FeCl ₃ · 6H ₂ O added to basic BM liquid medium (Table 4) Medium (described as “All +” in FIGS. 3 and 4)
(2) Medium obtained by adding Vitamin solution II and Metal solution II to the basic BM liquid medium (described as “Ms-” in FIGS. 3 and 4)
(3) Medium obtained by adding Metal solution II to basic BM liquid medium (denoted as “MII +” in FIGS. 3 and 4)
(4) Medium supplemented with 1.0m% MgSO ₄ · 7H ₂ O and 1.0m% FeCl ₃ · 6H ₂ O in basic BM liquid medium (denoted as "Ms +" in Figs. 3 and 4)
(5) Medium obtained by adding Vitamin solution II to basic BM liquid medium (described as “V +” in FIGS. 3 and 4)
(6) Basic BM liquid medium (described as “No” in FIGS. 3 and 4)
The absorbance (610 nm) of the culture solution and the concentration of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] in the medium were measured over time to evaluate the growth state and the resolution for K ₄ [Fe (CN) ₆ ].
[0040]
The measurement result of the absorbance is shown in FIG. 3, and the measurement result of the K ₄ [Fe (CN) ₆ ] concentration is shown in FIG.
[0041]
As shown in FIG. 3 and FIG. 4, when the metal salt is not contained in the medium (No and V +), the F4B4m strain does not grow, and K ₄ [Fe (CN) ₆ ] is hardly degraded. There wasn't. Therefore, it was revealed that metal salts are essential for the growth of F4B4m strain and the decomposition of metal cyano complexes.
[0042]
[Table 4]

[0043]
[Table 5]

Example 6
The F4B4m strain was inoculated into the following media (1) to (3) and cultured at 30 ° C. with shaking.
(1) Medium in which Fe ²⁺ + Co ²⁺ is added to the basic BM liquid medium (Table 4) (2) Medium in which Fe ²⁺ is added to the basic BM liquid medium (3) Co ^{2+ in the} basic BM liquid medium The absorbance (610 nm) of the culture medium supplemented with K and the concentration of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] in the medium were measured over time to evaluate the growth state and resolution for K ₄ [Fe (CN) ₆ ]. In addition, the absorbance of the culture solution when the F4B4m strain was not inoculated as a control was also measured (“NC (Fe ²⁺ + Co ²⁺ )”, “NC (Fe ²⁺ only)”, “NC (Co ^{2 in} FIG. 5). ⁺ Only) ”).
[0044]
FIG. 5 shows the measurement results of absorbance, and FIG. 6 shows the measurement results of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] concentration.
[0045]
As shown in these figures, it is clear that if either Fe ²⁺ or Co ²⁺ is contained in the medium, the F4B4m strain can grow and degrade K ₄ [Fe (CN) ₆ ]. became.
Example 7
Various nitrogen sources were added to the BM liquid medium (Table 1) so that the concentration was 0.2%, and the F4B4m strain was inoculated into each medium. After culturing at 30 ° C. for 2 weeks, the cells were collected by centrifugation (6,000 rpm, 15 minutes). The cells were washed with 50 mM KPB (pH 7) and then suspended in 50 mM KPB (pH 7). Prepare a cell reaction solution containing this cell suspension (2.0 mL of cell suspension, 0.8 ml of 500 mM KPB (pH 7.5), 0.4 ml of 20 mM KCN, 2.0 ml of distilled water), and the concentration of KCN in the reaction solution Was measured over time to evaluate the resolution of bacterial cells to KCN. The concentrations of HCOOH and NH ₃ which are metabolites of KCN were also measured. The results are shown in FIGS.
[0046]
As shown in these figures, the cells cultured in a medium containing K ₄ [Fe (CN) ₆ ] or K ₃ [Fe (CN) ₆ ] showed high KCN resolution. On the other hand, cells cultured in a medium containing NH ₄ Cl hardly decomposed KCN.
[0047]
In order to examine the induction of KCN resolution by K ₄ [Fe (CN) ₆ ] or K ₃ [Fe (CN) ₆ ] in more detail, K ₄ [Fe (CN) ₆ ], K ₃ [Fe (CN) ₆ ], K ₂ [Ni (CN) ₆ ] was used to evaluate the resolution for KCN as described above. The result is shown in FIG.
[0048]
As shown in this figure, K ₃ [Fe (CN) ₆ ] had the highest KCN resolution induction effect.
Example 8
F4B4m strain was inoculated into BM liquid medium (Table 1) containing 10 mM K ₄ [Fe (CN) ₆ ] and 10 mM K ₂ [Ni (CN) ₄ ] as the only nitrogen source. Weekly shaking culture was performed. After completion of the culture, the cells were disrupted by ultrasonic waves, and the supernatant was collected. This supernatant was used as a cell-free extract and subjected to the following experiment.
[0049]
K ₄ [Fe (CN) ₆ ] reaction solution containing cell-free extract (cell-free extract 0.5 ml, 500 mM KPB (pH 7.0) 0.2 ml, 20 mM K ₄ [Fe (CN) ₆ ] 0.1 ml, distilled water 0.2 ml) and K ₂ [Ni (CN) ₄ ] reaction solution (cell-free extract 0.5 ml, 500 mM KPB (pH 7.0) 0.2 ml, 50 mM K ₂ [Ni (CN) ₄ ] 0.1 ml, distilled water 0.2 ml) The K ₄ [Fe (CN) ₆ ] or K ₂ [Ni (CN) ₄ ] concentration and ammonia concentration in each reaction solution were measured over time. As a control, K ₄ without addition of cell-free extract [Fe (CN) _6] reaction solution and _{_{K 2 [Ni (CN) 4}} ] of the reaction solution K ₄ [Fe (CN) _6] concentration and K ₂ [ The Ni (CN) ₄ ] concentration was also measured. The result is shown in FIG.
[0050]
As shown in this figure, the cell-free extract decomposes K ₄ [Fe (CN) ₆ ] or K ₂ [Ni (CN) ₄ ] and liberates NH ₃ . However, the degradation rate was clearly slower than that of resting cells.
Example 9
The resting cells of the F4B4m strain were treated with an ultrasonic crusher for 30 minutes, and the crushed material was centrifuged (5,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.) to separate into a supernatant and a precipitate. The precipitate obtained here was used as a cell fraction (described as “+ Cell” in FIG. 11). The supernatant was further centrifuged (10,000 rpm, 20 minutes, 4 ° C.), and the resulting precipitate was used as a cell membrane fraction (described as “+ Membrane fraction” in FIG. 11), and the supernatant (“+ CFE in FIG. 11) was obtained. Was designated as the cytoplasmic fraction.
[0051]
Add 0.2 ml of cell fraction, cell membrane fraction, and cytoplasm fraction to the reaction solution containing KCN (500 mM KPB (pH 7.0) 0.08 ml, 20 mM KCN 0.04 ml, distilled water 0.08 ml), respectively. Was measured over time. For the cytoplasmic fraction, the NH ₃ concentration in the reaction solution was also measured. Further, as a control, the KCN concentration and NH _{3 of the} reaction solution to which none of the fractions were added (described as “-CFE” in FIG. 11) and the reaction solution to which KCN was not added (described as “-KCN” in FIG. 11) were added. The change in concentration over time was also measured. The above results are shown in FIG.
[0052]
As shown in this figure, the KCN concentration decreased and the NH ₃ concentration increased only when the cytoplasmic fraction was added. From this, it is considered that an enzyme involved in KCN degradation exists in the cytoplasmic fraction.
Example 10
Add 0.2 ml of cell-free extract prepared by the following four methods to the reaction solution containing KCN (500 mM KPB (pH 7.0) 0.08 ml, 20 mM KCN 0.04 ml, distilled water 0.08 ml), respectively. KCN concentration and KCN metabolite (NH ₃ and HCOOH) concentrations were measured over time.
(1) Normal ultrasonic crushing:
Dissolve 1.07 g of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] -growing wet cells in 10 ml of 100 mM KPB (pH 7) and crush it with an ultrasonic crusher for 30 minutes while cooling with ice. Prepared. The amount of protein was 3.21 (mg / ml).
(2) Ultrasonic crushing using alumina:
Add 2 g of alumina and 4 ml of 100 mM KPB (pH 7) to 2.02 g of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] -growing wet cells and crush them with an ultrasonic crusher for 30 minutes while cooling with ice. An extract was prepared.
The amount of protein was 10.2 (mg / ml).
(3) French press:
Dissolve 1.20 g of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] -growing wet cells in 10 ml of 100 mM KPB (pH 7) and use a manual hydraulic French press (Otake Seisakusho) with a pressure of 1500 kgf / cm ² Constant and crushed. A cell-free extract was prepared from the disrupted bacterial cells obtained by performing this twice. The amount of protein was 0.93 (mg / ml).
(4) Alumina grinding:
1 g of alumina and 2 ml of a buffer solution were added to 1.08 g of K ₄ [Fe (CN) ₆ ] -growing wet cells, and ground in an ice-cooled mortar for 30 minutes to prepare a cell-free extract. The amount of protein was 4.47 (mg / ml).
[0053]
The above results are shown in FIGS. As shown in this figure, the cell-free extract obtained by normal sonication decomposed 0.19 mM KCN in a reaction for 3 hours to produce ammonia and formic acid. In ultrasonic crushing treatment with addition of alumina, 0.4 mM KCN was decomposed after 3 hours. Decomposition of 0.21 mM KCN was observed with the French press, and 0.26 mM with the alumina grinding method. From the above results, it has been clarified that high extraction efficiency can be obtained by preparing a cell-free extract of the F4B4m strain by treating with ultrasonic crushing supplemented with alumina.
[Reference Example 1]
The mycological properties of strain F4B4 were investigated. The results are shown in the table below.
[0054]
[Table 6]

Or more of the properties the PRMurray et al., Mannual of clinical Microbial 6 th ed., ASM Press, 1995 and E.Yabuuch et al., Microbial. Immunol ., 36, 1251-1275, was searched on the basis of 1992, Isolate F4B4 is considered to be a group of bacteria belonging to the genus Algenigenes because the flagellar growth is perimeter, and from physiological properties tests, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes denitrificans (Alcaligenes denitrificans), CDC gr.IV C-2, etc., but CDC gr.IV C-2 is the most popular because of positive growth in MacConkey agar, negative availability of carbohydrates, and non-hydrogen sulfide production in TSI agar. It is considered to be a closely related fungus group.
[0055]
【The invention's effect】
The present invention provides cyanide-decomposing microorganisms, and methods and agents for treating soil, wastewater or groundwater using the microorganisms. By utilizing the microorganism of the present invention, it becomes possible to efficiently decompose and remove cyanide compounds, particularly ferricyanide ions.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the resolution of an F4B4 strain and an F4B4m strain with respect to an iron cyano complex.
FIG. 2 is a diagram showing the growth state of F4B4 strain and F4B4m strain in the presence of an iron cyano complex.
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between medium components and growth of F4B4m strain.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between medium components and the resolution of F4B4m strain to potassium ferrocyanide.
FIG. 5 is a graph showing the relationship between the metal salt and the growth of F4B4m strain.
FIG. 6 is a graph showing the relationship between the metal salt and the resolution of F4B4m strain to potassium ferrocyanide.
FIG. 7 is a graph showing the relationship between the nitrogen compound added during preculture and the resolution of F4B4m strain to potassium cyanide (1).
FIG. 8 is a graph showing the relationship between the nitrogen compound added during preculture and the resolution of F4B4m strain to potassium cyanide (2).
FIG. 9 is a graph showing the relationship between the metal cyano complex added during preculture and the resolution of F4B4m strain to potassium cyanide.
FIG. 10 is a diagram showing the resolution of a cell-free extract of F4B4m strain with respect to a metal cyano complex.
FIG. 11 is a diagram showing the relationship between the fraction of F4B4m strain crushed material and the resolution for potassium cyanide.
FIG. 12 is a graph showing the relationship between the disruption conditions for the F4B4m strain and the resolution for potassium cyanide (1).
FIG. 13 is a graph showing the relationship between the disruption conditions for the F4B4m strain and the resolution for potassium cyanide (2).

Claims

Alkaline Genes sp.F4B4m strain (Accession No.FERMP -18376).

A method for treating soil, wastewater or groundwater, comprising adding the microorganism according to claim 1 or a cell-free extract thereof to soil, wastewater or groundwater containing cyanide.

A treatment agent for soil, drainage or groundwater, comprising the microorganism according to claim 1 or a cell-free extract thereof.

A method for treating soil, wastewater or groundwater, comprising adding the microorganism according to claim 1 or a cell-free extract thereof and divalent iron ions or cobalt ions to soil, wastewater or groundwater containing a cyanide compound.

A treatment agent for soil, wastewater or groundwater, comprising the microorganism according to claim 1 or a cell-free extract thereof and divalent iron ions or cobalt ions.

The microorganism according to claim 1 is cultured in a medium containing ferrocyanide ion or ferricyanide ion, and then the microorganism or a cell-free extract thereof is added to soil, wastewater or groundwater containing cyanide. Soil, drainage or groundwater treatment method.

The processing agent for soil, waste_water | drain, or groundwater containing the microorganisms of Claim 1 cultured in the culture medium containing ferrocyanide ion or ferricyanide ion, or its cell-free extract.

The microorganism according to claim 1 is mixed with alumina and then crushed by ultrasonic waves, and the supernatant of the crushed material is added to soil, drainage or groundwater containing cyanide, Processing method.

A treating agent for soil, drainage or groundwater, comprising the supernatant of the crushed microorganisms according to claim 1 sonicated together with alumina.