JP4607264B2

JP4607264B2 - Ectopic calcification inhibitor containing hyaluronic acid as an active ingredient

Info

Publication number: JP4607264B2
Application number: JP34138398A
Authority: JP
Inventors: 幸子後藤; 純一女屋
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2018-12-01
Also published as: JP2000159677A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分とする異所性石灰化抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管の透過性亢進は、軟部組織等の硬組織を除く体組織において、正常な状態では石灰化が認められない部位に石灰が沈着したり、骨化が起こる異所性石灰化に関与していることが知られている（加藤, 小椋, 骨代謝, 14(1981), 29-34等）。異所性石灰化によって引き起こされる疾患としては、例えば挫傷、火傷等の創傷又は炎症による石灰化；皮膚筋炎；強皮症；石灰沈着性腱炎；石灰沈着性滑膜包炎；軟骨石灰沈着症；限局性石灰沈着症；汎発性石灰沈着症；頚椎後縦靭帯骨化症及び脊椎靭帯骨化症等が知られている。
【０００３】
血管の透過性亢進は、肥満細胞の脱顆粒によるヒスタミンの放出がその引き金となることが知られており、抗ヒスタミン剤は血管透過性亢進作用を有することが知られているが、抗ヒスタミン剤を適用して血管の透過性亢進を抑制したとしても異所性石灰化を抑制することは不可能であり、血管の透過性亢進抑制剤を、異所性石灰化抑制剤として使用することはできなかった。
【０００４】
また、ヒアルロン酸が血管の透過性亢進を抑制することが宮崎らによって報告されているが（応用薬理, 28(1984), 1123-1135）、組織の石灰化を抑制する働きを有することは知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、異所性石灰化の抑制を可能とする、安全性の高い医薬は未だ得られておらず、従って、安全で有用な異所性石灰化抑制剤の開発が期待されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を鑑み、異所性石灰化を抑制する作用を有する物質を鋭意探索、検討した結果、驚くべきことにヒアルロン酸が異所性石灰化を抑制することを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨はヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分とする異所性石灰化抑制剤である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
本発明の異所性石灰化抑制剤（本発明薬剤）
本発明薬剤は、ヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分とする。
【０００９】
本発明薬剤におけるヒアルロン酸は、一般に入手可能なヒアルロン酸を使用することが可能であり、好ましくは重量平均分子量3,000〜400万、より好ましくは10,000〜200万、またその由来は細菌由来、哺乳動物由来、鳥類由来など特に限定はされない。
【００１０】
通常、ヒアルロン酸を医薬として使用する際は、薬理学的に許容されうる塩の形態で使用するが、本発明医薬組成物においても上記塩の形態で使用することが好ましい。本発明医薬組成物におけるヒアルロン酸の薬理学的に許容されうる塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩等）及び四級アンモニウム塩等が挙げられるが、その中でもアルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。以下の説明において、「ヒアルロン酸」とは、特に断らない限りこのような塩も包含する広義の用語として使用する。
【００１１】
本明細書中における異所性石灰化とは、石灰化が本来とは異なる部位に起こることを指称し、本発明の異所性石灰化抑制は、健常人では石灰の沈着が観察されることのない、軟組織への石灰化を防止することのできる薬剤を指称する。上記の石灰化とは、組織へのカルシウムイオン及びリン酸イオンの沈着により硬化する過程を指称する。従って、石灰化の程度は、組織中に含まれるカルシウム量及びリン量を測定し、健常組織中のカルシウム量及びリン量と比較することで把握することが可能である。
【００１２】
本発明薬剤はヒトを含む温血動物の異所性石灰化を処置するための薬剤として使用される。ここで、処置とは、治療のみを意味するものではなく、疾病の予防、進行防止をも包含する。
【００１３】
本発明薬剤を適用することができる疾病としては、血管透過性の亢進に起因する軟部組織などの硬組織以外の体組織における石灰化が原因の疾病であれば特に限定はされない。その中でも特に好ましくは挫傷、火傷等の創傷又は炎症による石灰化；皮膚筋炎；強皮症；石灰沈着性腱炎；石灰沈着性滑膜包炎；軟骨石灰沈着症；限局性石灰沈着症；汎発性石灰沈着症；頚椎後縦靭帯骨化症及び脊椎靭帯骨化症等が挙げられる。
【００１４】
本発明薬剤を生体に投与する際の剤形及び投与経路としては、適用の対象とする疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒアルロン酸を薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤等と共に医薬（例えば注射剤、坐剤、錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、軟膏剤）として、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ等）に対して、非経口的又は経口的に安全に投与することができる。
【００１５】
特に本発明薬剤の投与経路としては、非経口投与が好ましく、その投与に適した剤形としては、液剤又は軟膏が挙げられ、その投与方法は点滴、注射又は塗布等が好ましい態様として挙げられるがこれらに限定はされない。
【００１６】
例えば上述の液剤は、ヒアルロン酸またはその薬理学的に許容されうる塩を、医薬品に慣用される水性溶媒に溶解させて製造することが可能である。上記溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水等を挙げることが可能であるが、本発明においては、前記溶媒としては蒸留水又はリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）を用いることが好ましく、PBSが好ましい。また、ヒアルロン酸以外に、薬理学的に許容されうる補助剤、例えばpH調節剤、緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤、安定化剤、無機塩類、界面活性剤、消泡剤、糖類、糖アルコールなど；医薬として許容される生理活性物質、例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子などを添加することが出来る。
【００１７】
ヒアルロン酸の、本発明薬剤中の配合量及び投与量は、その製剤の投与方法、剤形、患者の具体的症状、及び患者の体重に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、一般にヒアルロン酸の投与量は１日あたり概ね100μg/kg〜100mg/kg程度を例示することができる。また、上記製剤の投与回数は、1日1回程度でも可能であり、1日2〜4回、又はそれ以上の回数に分けて投与することもできる。
【００１８】
本発明薬剤に使用するヒアルロン酸ナトリウムは、後述の実施例にも示すとおり、健常ラットに投与した際に、死亡例が見られなかったこと、及び対象疾患は異なるが、ヒアルロン酸ナトリウムは医薬としての利用がなされていることから、上記物質を有効成分として含有する本発明薬剤は温血動物に対する安全性が高いと言える。
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
〔血管透過性抑制作用〕
ラットを用いてグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸Ａ）が有する血管透過性抑制作用を確認した。すなわち、6週令のウィスター系雄性ラットに酢酸鉛（昭和化学製）50mg/5ml生理食塩水/kgを静注後、2%エバンス・ブルー5ml/kgを静注し、直ちに被検物質（ヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業(株)製）又はコンドロイチン硫酸Ａナトリウム（生化学工業(株)製））を1.0%(w/w)で溶解した生理食塩水（ポリミキシンB（Sigma社製）を300μg/ml含む）を0.1mlずつ皮下投与した。対照として被検物質を含まずポリミキシンのみを含む生理食塩水を調製した。ポリミキシン投与10分後にラットを屠殺、解剖し、背部の皮膚を隔離した。ポリミキシン投与部位を中心に40mm×40mmの大きさで切り取った。
【００１９】
切り取った組織片からKatayamaらの方法（Japan J. Pharmacol., 25, Suppl., 103 (1984)）に従ってエバンス・ブルーを抽出した。すなわち、上記切り取った組織片にKOH（1N）4mlを添加し、24時間、37℃で保温、振盪後、0.6NのH₃PO₄ 5mlを添加し、アセトンを17ml添加した後1,500×gで15分間遠心処理を行い、上清を回収して620nmの吸光度により比色定量した。測定値は等分散の場合はstudentのt-検定、不等分散の場合はCochranの方法により平均値の差の検定を行った（表１）。
【００２０】
【表１】
表１

【００２１】
その結果、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸Ａ双方に、血管透過性亢進の抑制作用があることが明かとなった。
【００２２】
ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸Ａの血管透過性亢進の抑制作用は、肥満細胞の脱顆粒現象の抑制、ヒスタミン或いはポリミキシンBとの相互作用が、関与している可能性が考えられる。
実施例２
〔石灰化防止作用〕
ラットを用いてヒアルロン酸が有する異所性石灰化を抑制する作用を確認した。すなわち、6週令のウィスター系雄性ラットに酢酸鉛（昭和化学製）50mg/5ml生理食塩水/kgを静注後、直ちに被検物質（ヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業(株)製））を1.0%(w/w)で溶解した生理食塩水（ポリミキシンB（Sigma社製）を300μg/ml含む）を0.1mlずつ皮下投与した。対照としてヒアルロン酸ナトリウムの代わりにコンドロイチン硫酸Ａを含むか、被検物質を含まずポリミキシンのみを含む生理食塩水をそれぞれ調製した。ポリミキシン投与8日後にラットを屠殺、解剖し、背部の皮膚を剥離し、肉眼的観察により石灰化部位の長径及び短径を測定して、石灰化面積を算出した（表２）。統計処理はstudentのt-検定によって行った。
【００２３】
【表２】
表２

【００２４】
その結果、血管透過性亢進抑制作用を有することが実施例１で示されたコンドロイチン硫酸Ａ群においては異所性石灰化抑制作用が観察されなかったのに対し、ヒアルロン酸群において顕著な異所性石灰化抑制作用が観察された。
【００２５】
更に、石灰化部位を含む皮膚45mm×30mmを切り取り、該切片をアセトンを用いて脱脂及び脱水して試料を乾燥させ、重量を測定したのち、電気マッフル炉により600℃で7時間、熱灰化して重量を測定した。そして、0.1N HClに溶解してCa及び無機Pについて定量した（表３）。Caの定量はo-クレゾールフタレインコンプレキソン法（OCPC）法によるCa定量キット（和光純薬工業社製）、無機Pの定量はモリブデン・ブルー法による無機P定量キット（和光純薬工業社製）を用いた。無処置群として正常ラットの同部位45mm×30mmを切り取り、上記と同様の処理を行った。
【００２６】
【表３】
表３

【００２７】
その結果、各測定値においても、コンドロイチン硫酸Ａ群は対照群と有意な差は得られなかったが、ヒアルロン酸群においては顕著な異所性石灰化抑制作用が観察された。このことから、血管透過性亢進を抑制するのみでは異所性石灰化を抑制することが不可能であることが示唆されると共に、ヒアルロン酸は血管透過性亢進の抑制作用に加えて、組織への石灰化物の沈着防止作用を有することが示された。
実施例３
[製剤例]
（１）注射剤（液剤）
ヒアルロン酸ナトリウムの凍結乾燥物（30mg）を終濃度5mg/mlとなるようにPBSに溶解し、これを無菌濾過した後、2mlずつアンプルに分注してヒアルロン酸を有効成分とする注射剤を製造した。
（２）軟膏剤
ヒアルロン酸ナトリウムの凍結乾燥物100mg、鉱油4g、石油ゼリー8g、混合メチル／プロピルパラバン60mg、非イオン性界面活性剤1g及び精製水30gを均一に混合した。この混合物を容器に充填してヒアルロン酸ナトリウムを有効成分とする軟膏剤を製造した。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、ヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分とする異所性石灰化抑制剤が提供される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an ectopic calcification inhibitor comprising hyaluronic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Increased permeability of blood vessels is related to ectopic calcification that occurs in body tissues other than hard tissues such as soft tissues where calcification is deposited or ossification occurs in areas where calcification is not normally observed. (Kato, Kominato, bone metabolism, 14 (1981), 29-34, etc.). Examples of diseases caused by ectopic calcification include calcification caused by wounds or inflammation such as bruises and burns; dermatomyositis; scleroderma; calcific tendonitis; calcific synovial cystitis; Localized calcification disease; generalized calcification disease; cervical posterior longitudinal ligament ossification and vertebral ligament ossification are known.
[0003]
It is known that the increase in vascular permeability is triggered by the release of histamine by degranulation of mast cells, and antihistamines are known to have vascular permeability enhancing effects. Even if vascular hyperpermeability was suppressed, ectopic calcification could not be suppressed, and vascular hyperpermeability inhibitors could not be used as ectopic calcification inhibitors.
[0004]
Miyazaki et al. Have reported that hyaluronic acid suppresses vascular hyperpermeability (Applied Pharmacology, 28 (1984), 1123-1135), but it is known that it has a function to suppress tissue calcification. It is not done.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, a highly safe pharmaceutical that can suppress ectopic calcification has not yet been obtained, and therefore, development of a safe and useful ectopic calcification inhibitor is expected. .
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above problems, the present inventors have eagerly searched for and examined a substance having an action of suppressing ectopic calcification, and surprisingly found that hyaluronic acid suppresses ectopic calcification. .
[0007]
That is, the gist of the present invention is an ectopic calcification inhibitor containing hyaluronic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
Ectopic calcification inhibitor of the present invention (the drug of the present invention)
The agent of the present invention contains hyaluronic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0009]
As the hyaluronic acid in the drug of the present invention, generally available hyaluronic acid can be used, preferably a weight average molecular weight of 3,000 to 4,000,000, more preferably 10,000 to 2,000,000, and its origin is derived from bacteria, mammals There are no particular limitations on the origin and origin of birds.
[0010]
Usually, when hyaluronic acid is used as a medicine, it is used in the form of a pharmacologically acceptable salt, but it is preferably used in the form of the salt in the pharmaceutical composition of the present invention. Examples of pharmacologically acceptable salts of hyaluronic acid in the pharmaceutical composition of the present invention include alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salts (magnesium salt, calcium salt, etc.) and quaternary ammonium salts. Among them, alkali metal salts are preferable, and sodium salts are most preferable. In the following description, “hyaluronic acid” is used as a broad term including such salts unless otherwise specified.
[0011]
In the present specification, ectopic calcification means that calcification occurs at a site different from the original, and the ectopic calcification inhibition of the present invention is that calcification is observed in healthy persons. It refers to a drug that can prevent calcification to soft tissue without any hydration. Said mineralization refers to the process which hardens | cures by deposition of the calcium ion and phosphate ion to a structure | tissue. Therefore, the degree of calcification can be grasped by measuring the amount of calcium and phosphorus contained in the tissue and comparing with the amount of calcium and phosphorus in the healthy tissue.
[0012]
The medicament of the present invention is used as a medicament for treating ectopic calcification of warm-blooded animals including humans. Here, the treatment does not mean only treatment but also includes prevention of disease and prevention of progression.
[0013]
The disease to which the agent of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it is a disease caused by calcification in body tissues other than hard tissues such as soft tissues caused by increased vascular permeability. Among them, calcification caused by wounds or inflammation such as bruises, burns, etc .; dermatomyositis; scleroderma; calcific tendonitis; calcific synovial cystitis; cartilage calcification disease; localized calcification disease; Examples include calcific calcification; posterior longitudinal ligament ossification of the cervical spine and ossification of the spinal ligament.
[0014]
The dosage form and administration route for administering the drug of the present invention to a living body can be appropriately selected according to the nature and severity of the disease to be applied. For example, hyaluronic acid as a pharmaceutical (eg, injection, suppository, tablet, capsule, liquid, gel, ointment) together with a pharmacologically acceptable carrier, excipient, diluent, etc. For example, it can be safely administered parenterally or orally to humans, mice, rats, hamsters, rabbits, dogs, cats, horses, etc.).
[0015]
In particular, the administration route of the drug of the present invention is preferably parenteral administration, and the dosage form suitable for the administration includes liquid or ointment, and the administration method includes drip, injection or application as preferred embodiments. These are not limited.
[0016]
For example, the above-mentioned solution can be produced by dissolving hyaluronic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof in an aqueous solvent commonly used for pharmaceuticals. Examples of the solvent include distilled water, buffer solution, physiological saline, and water containing an aqueous organic solvent. In the present invention, the solvent includes distilled water or phosphate buffered physiological saline. (PBS) is preferably used, and PBS is preferred. In addition to hyaluronic acid, pharmacologically acceptable adjuvants such as pH adjusters, buffers, tonicity adjusters, wetting agents, stabilizers, inorganic salts, surfactants, antifoaming agents, sugars, Sugar alcohol and the like; pharmaceutically acceptable physiologically active substances such as anti-inflammatory agents, analgesics, vitamin agents, antibacterial agents, growth factors, adhesion factors and the like can be added.
[0017]
The amount and dosage of hyaluronic acid in the drug of the present invention are matters to be determined individually according to the method of administration of the preparation, the dosage form, the specific symptoms of the patient, and the weight of the patient, Although not limited, in general, the dosage of hyaluronic acid can be exemplified as about 100 μg / kg to 100 mg / kg per day. Moreover, the frequency | count of administration of the said formulation can also be about once a day, and can also be divided into 2-4 times a day, or can also be divided and administered.
[0018]
Sodium hyaluronate used in the drug of the present invention, as shown in the examples described later, was that no death was observed when administered to healthy rats, and the target disease was different, but sodium hyaluronate was used as a pharmaceutical. Therefore, it can be said that the drug of the present invention containing the above substance as an active ingredient is highly safe against warm-blooded animals.
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
Example 1
[Inhibition of vascular permeability]
Using rats, the vascular permeability inhibitory action of glycosaminoglycan (hyaluronic acid and chondroitin sulfate A) was confirmed. Specifically, lead acetate (made by Showa Chemical) 50 mg / 5 ml physiological saline / kg was intravenously administered to 6-week-old male Wistar rats, followed by intravenous injection of 2% Evans Blue 5 ml / kg. 300 μg of physiological saline (polymyxin B (manufactured by Sigma) dissolved in 1.0% (w / w) of sodium sulfate (manufactured by Seikagaku Corporation) or sodium chondroitin sulfate A (manufactured by Seikagaku Corporation)) 0.1 ml each) was administered subcutaneously. As a control, a physiological saline containing only polymyxin without a test substance was prepared. Rats were sacrificed and dissected 10 minutes after polymyxin administration, and the dorsal skin was isolated. The polymyxin administration site was cut out with a size of 40 mm × 40 mm.
[0019]
Evans blue was extracted from the cut tissue pieces according to the method of Katayama et al. (Japan J. Pharmacol., 25, Suppl., 103 (1984)). That is, 4 ml of KOH (1N) was added to the cut tissue piece, incubated at 37 ° C. for 24 hours, shaken, then 5 ml of 0.6N H ₃ PO ₄ was added, 17 ml of acetone was added, and 1,500 × g Centrifugation was performed for 15 minutes, and the supernatant was collected and colorimetrically determined by absorbance at 620 nm. The measured values were tested for Student's t-test in the case of equal variance and in the case of unequal variance by means of Cochran's method (Table 1).
[0020]
[Table 1]
Table 1

[0021]
As a result, it was revealed that both hyaluronic acid and chondroitin sulfate A have an inhibitory effect on the increase in vascular permeability.
[0022]
The inhibitory action of hyaluronic acid and chondroitin sulfate A on the increase in vascular permeability may involve the inhibition of degranulation of mast cells and the interaction with histamine or polymyxin B.
Example 2
[Calcification prevention]
The effect | action which suppresses the ectopic calcification which hyaluronic acid has was confirmed using the rat. That is, lead acetate (made by Showa Chemical) 50 mg / 5 ml physiological saline / kg is intravenously injected into 6-week-old male Wistar rats, and the test substance (sodium hyaluronate (Seikagaku Corporation)) is immediately injected. 0.1 ml of physiological saline dissolved in 1.0% (w / w) (containing 300 μg / ml of polymyxin B (Sigma)) was subcutaneously administered. As controls, physiological saline containing chondroitin sulfate A instead of sodium hyaluronate or containing only polymyxin but no test substance was prepared. Eight days after administration of polymyxin, the rats were sacrificed and dissected, the skin on the back was exfoliated, and the major axis and minor axis of the calcified site were measured by visual observation to calculate the calcified area (Table 2). Statistical processing was performed by student's t-test.
[0023]
[Table 2]
Table 2

[0024]
As a result, the ectopic calcification inhibitory action was not observed in the chondroitin sulfate A group which was shown in Example 1 to have a vascular permeability enhancement action, whereas the remarkable ectopic part in the hyaluronic acid group. Calcification-inhibiting action was observed.
[0025]
Further, cut out 45 mm × 30 mm skin containing the calcified site, degrease and dehydrate the section using acetone, dry the sample, measure the weight, and then heat ash at 600 ° C for 7 hours with an electric muffle furnace. The weight was measured. And it melt | dissolved in 0.1N HCl and determined about Ca and inorganic P (Table 3). Quantitative determination of Ca by Ca quantification kit by O-cresolphthalein complexone method (OCPC) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), inorganic quantification by inorganic blue quantification kit by molybdenum blue method (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) Was used. As an untreated group, 45 mm × 30 mm of the same region of normal rats was cut out and treated in the same manner as above.
[0026]
[Table 3]
Table 3

[0027]
As a result, in each measured value, the chondroitin sulfate A group was not significantly different from the control group, but a significant ectopic calcification inhibitory effect was observed in the hyaluronic acid group. This suggests that it is impossible to suppress ectopic calcification only by suppressing vascular permeability enhancement, and hyaluronic acid is added to the tissue in addition to the inhibitory action of vascular permeability enhancement. It has been shown that it has an action to prevent the deposition of calcifications.
Example 3
[Formulation example]
(1) Injection (solution)
Dissolve lyophilized sodium hyaluronate (30 mg) in PBS to a final concentration of 5 mg / ml, filter it aseptically, and dispense 2 ml each into ampoules to prepare an injection containing hyaluronic acid as the active ingredient. Manufactured.
(2) Ointment 100 mg freeze-dried sodium hyaluronate, mineral oil 4 g, petroleum jelly 8 g, mixed methyl / propylparaban 60 mg, nonionic surfactant 1 g and purified water 30 g were uniformly mixed. The mixture was filled in a container to produce an ointment containing sodium hyaluronate as an active ingredient.
[0028]
【The invention's effect】
The present invention provides an ectopic calcification inhibitor containing hyaluronic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.

Claims

A skin calcification inhibitor comprising sodium hyaluronate as an active ingredient and administered subcutaneously.

The calcification inhibitor for skin according to claim 1, which is used for treatment of scleroderma.