JP4544663B2 - Deaminoneuraminic acid derivative, deaminoneuraminidase purification method, and deaminoneuraminic acid binding substance detection method - Google Patents

Description

（式中、Ｘは、Ｓ、ＣＨ₂又はＮＨであり、Ａは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素、好ましくは飽和炭化水素または芳香族炭化水素の２価基であり、Ｄは不溶性担体との結合に使用可能な官能基を示す。）
【００１０】
本発明誘導体において、Ｄは好ましくはアミノ基である。
本発明誘導体は、好ましくは、下記式(2)で示される。
【００１１】
【化４】

【００１２】
また、本発明は、本発明誘導体が結合した不溶性担体（以下、本発明不溶性担体ともいう）を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明不溶性担体を用いる、デアミノノイラミニダーゼの精製方法（以下、本発明精製方法ともいう）、および、デアミノノイラミン酸結合性物質の検出方法（以下、本発明検出方法ともいう）を提供する。
【００１４】
本発明精製方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼを溶離する工程。
【００１５】
本発明検出方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミン酸結合性物質を含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミン酸結合性物質を特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミン酸結合性物質を検出する工程。
【００１６】
本発明検出方法においては、デアミノノイラミン酸結合性物質は、好ましくは、デアミノノイラミニダーゼである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明誘導体は、上記一般式(1)で示されるデアミノノイラミン酸誘導体である。
【００１８】
一般式(1)において、Ｘは、Ｓ、ＣＨ₂又はＮＨであり、好ましくはＳである。
【００１９】
Ａは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素、好ましくは飽和炭化水素（アルカン、シクロアルカン等）または芳香族炭化水素（アレーン、アルキルアレーン等）の２価基である。飽和炭化水素の２価基はアルキレン基およびシクロアルキレン基を包含する。飽和炭化水素の２価基の例としては、メチレン、エチレン、プロピレン等が挙げられる。芳香族炭化水素は、飽和炭化水素の側鎖を１以上有する芳香族炭化水素を包含し、側鎖を有する芳香族炭化水素の２価基においては、遊離原子価は、共に環と側鎖の一方にあっても、環と側鎖の両方にあってもよい。芳香族炭化水素の２価基の例としては、（ｏ−、ｍ−またはｐ−）フェニレン、メチルフェニレン、ベンジリデン、
【化５】

等が挙げられる。炭素数１〜１０の炭化水素、好ましくは飽和炭化水素または芳香族炭化水素の置換基としては、アルキル基（通常には炭素数１〜５）、アシル基（通常には炭素数１〜４）、水酸基、ニトリル基、ニトロ基等が挙げられる。
置換基は複数存在してもよい。
【００２０】
Ａは、好ましくは、Ｘと結合する遊離原子価が環にあるもの例えばフェニレン基）が好ましい。
【００２１】
Ｄは不溶性担体との結合に使用可能な官能基を示す。Ｄの例としては、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、イミダゾール基が挙げられ、不溶性担体の官能基と結合させることのできるものであればよい。なお、リガンドの不溶性担体への結合方法として、隣接する水酸基をもつ担体（アガロースやセファロースなど）をＢｒＣＮで活性化させ、アミノ基と結合させる方法や、エポキシ活性化された担体のエポキシ基とアミノ基とを結合させる方法が一般的であり、アミノ基と結合させる不溶性担体の入手が容易であることから、Ｄはアミノ基であることが好ましい。
【００２２】
本発明誘導体は、好ましくは、上記式(2)で示される。
【００２３】
本発明誘導体の製造方法について以下説明する。
一般式(1)においてＸがＳであり、Ｄがアミノ基である本発明誘導体は、次のようにして製造することができる。
【００２４】
【化６】

【００２５】
先ず、一般式(3)で示される化合物と一般式(4)で示される化合物を反応させて、一般式(5)で示される化合物を得る。
【００２６】
式中、Ｒ¹は水酸基の保護基であり、例えば、アシル基、アラルキル基、シリル基、アルキルオキシメチル基、アセタール型またはケタール型保護基である。
【００２７】
アシル基の例としては、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、プロピオニル、ｎ−ブチリル、（Ｅ）−２−メチルブテノイル、ペンタノイル、ベンゾイル、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、ｐ−トルオイル、ｐ−アニソイル、ｐ−クロロベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイルなどの基が挙げられる。
【００２８】
アラルキル基の例としては、ベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、ｐ−シアノベンジルなどの基が挙げられる。
【００２９】
シリル基の例としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルなどの基が挙げられる。
【００３０】
アルキルオキシメチル基の例としては、メトキシメチル、エトキシメチルなどの基が挙げられる。
【００３１】
アセタール型またはケタール型保護基の例としては、イソプロピリデン、エチリデン、プロピリデン、ベンジリデン、メトキシメチリデンなどの基が挙げられる。
【００３２】
好ましいＲ¹は、アセチル基、ベンゾイル基およびベンジル基であるが、アセチル基がより好ましい。
【００３３】
Ｒ¹は、互いに同一でも異なっていてもよく、異なっている場合には２種以上をどのように組み合わせてもよい。なお、Ｒ¹は、互いに同一であることが好ましい。最も好ましいのは、Ｒ¹が互いに同一であり、かつＲ¹がアセチル基であるものである。
【００３４】
Ｒ²はカルボキシル基の保護基であり、例えばアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基など）やベンジル基である。
【００３５】
ＬおよびＭは、反応により脱離してＬの結合している炭素原子とイオウ原子との結合を形成する基であり、例えば、Ｌとしてハロゲン原子と、Ｍとしてアルカリ金属原子または有機塩基との組合せである。ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。アルカリ金属原子の例としては、リチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子が挙げられる。有機塩基の例としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。
【００３６】
Ａは、炭素数１〜１０の前記の炭化水素の２価基である。Ａの例は、上記一般式(1)について挙げたものが挙げられる。Ａは、好ましくは、Ｘ（ここではＳ）と結合する遊離原子価が環にあるもの（例えばフェニレン基）が好ましい。このような好ましい基を用いると、本発明誘導体の製造において、(a)反応工程の手順が少なくなる、(b)反応が容易になる、(c)安価に製造できる、(d)反応生成物の収率が高くなる、等の利点が得られる。
【００３７】
Ｒ³はアミノ基に誘導できる基であり、例えば、ニトロ基、アジド基、保護されたアミノ基（例えば、ベンジルオキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−ＣＢｚ）、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｂｏｃ））である。
【００３８】
一般式(3)で示される化合物と一般式(4)で示される化合物との反応は、通常には、有機溶媒（例えば、アセトニトリルなど）中、０〜４０℃で０．５〜２４時間の条件で行うことができる。一般式(5)で示される化合物の他に副産物が生じる場合もあるが、その場合には、必要により、シリカゲルクロマトグラフィーなどの常法によって一般式(5)で示される化合物を精製することができる。
【００３９】
Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³の各基は、一般式(3)で示される化合物と一般式(4)で示される化合物との反応の条件で反応しないものが選択される。
【００４０】
次に、一般式(5)で示される化合物の水酸基およびカルボキシル基の保護基を除去し、一般式(6)で示される化合物を得る。水酸基およびカルボキシル基の保護基の除去は、ナトリウムアルコキシド、アルカリ、酸等を用いる公知の方法によって行うことができる。
【００４１】
そして、一般式(6)におけるＲ³をアミノ基に誘導することにより、一般式(7)で示される化合物（一般式(1)においてＸがＳであり、Ｄがアミノ基である本発明誘導体）を得る。Ｒ³のアミノ基への誘導は、公知の方法によって行うことができる。例えば、ニトロ基である場合には、パラジウム−炭素（Ｐｄ−Ｃ）等の触媒の存在下、水素により還元することでアミノ基に誘導できる。また、保護されたアミノ基である場合には、保護基を除去することでアミノ基に誘導できる。
【００４２】
Ｒ¹とＲ³の組合せによっては、アミノ基への誘導の後に水酸基の保護基の除去を行ってもよいし、また、アミノ基への誘導と水酸基の保護基の除去を同時に行ってもよい。
【００４３】
一般式(1)においてＸがＣＨ₂である場合は、一般式(4)で示される化合物として、Ｒ³−Ａ−ＣＨ₂−Ｓｎ−（Ｃ₄Ｈ₉）₃（例えば、トリブチル−４−ニトロベンジルスズ）を用いて、Tetrahedron Lett., 32, 3953(1991)に記載の方法に従って一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。あるいは、一般式(4)で示される化合物として、Ｒ³−Ａ−ＣＨ₂−Ｓｉ−（ＣＨ₃）₃（例えば、トリメチル−４−ニトロベンジルシラン）を用いて、Chemistry Lett., 1529(1984)に記載の方法に従って一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。
【００４４】
一般式(1)においてＸがＮＨである場合は、一般式(4)で示される化合物として、Ｒ³−Ａ−ＮＨ₂（例えば、ｐ−ニトロアニリン）を用いて、上記のＸがＳである場合と同様の方法により一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。あるいは、一般式(4)で示される化合物としてＮＨ₂−Ａ−ＮＨＢｏｃを用いて、Glycoconjugate Journal, 15, 663-669(1998)に記載の方法に従って、一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。
【００４５】
本発明誘導体は、不溶性担体に結合させることができ、これにより本発明不溶性担体を得ることができる。
【００４６】
本発明不溶性担体は、本発明誘導体が結合した不溶性担体である。本明細書において「不溶性」とは、不溶性担体が使用される条件において、不溶性担体が、それに接触する液体から、濾過等の固液分離手段により分離可能であることを意味する。
【００４７】
本発明誘導体が結合される不溶性担体は、物質の精製や分析に通常に使用される不溶性担体でよく、天然物質からなる担体及び合成物質からなる担体のいずれでもよい。具体例としては、セルロース（例えば、セルロファイン（商品名）、アガロース、架橋アガロース（例えば、セファロース（商品名））、架橋デキストラン（例えば、セファデックス（商品名））、親水性ビニルポリマー（例えば、トヨパール（商品名））などが挙げられる。
【００４８】
不溶性担体の形態は特に限定されず、繊維、微顆粒、ビーズ等のいずれでもよい。
【００４９】
本発明誘導体の不溶性担体への結合は、先ず、一般式(1)におけるＤに結合可能な官能基を有する不溶性担体を準備し、次いで本発明誘導体と官能基を有する不溶性担体を結合させることによって行うことができる。不溶性担体への官能基の導入及び本発明誘導体と官能基を有する不溶性担体との結合は、公知のアフィニティクロマトグラフィー用の担体の調製方法に準じた条件で行うことができる。
【００５０】
上記の官能基は、不溶性担体にスペーサーを介して結合したものであってもよい。
【００５１】
アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、イミダゾール基等に結合可能な官能基を導入した不溶性担体は、市販品としても得ることができる。
【００５２】
また、一般式(1)におけるＤがアミノ基の場合には、アガロースなどの隣接する水酸基を有する担体をＢｒＣＮで活性化させ、それにアミノ基を結合させることができる。
【００５３】
本発明不溶性担体は、デアミノノイラミニダーゼの精製やデアミノノイラミン酸結合物質の検出に使用することができる。また、デアミノノイラミニダーゼの拮抗阻害剤として使用することができる。
【００５４】
本発明精製方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼを溶離する工程。
【００５５】
なお、工程(A)と工程(B)の間に、固液分離の工程を含むことが好ましい。
【００５６】
デアミノノイラミニダーゼは、特に限定されず、例としては、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム由来のもの（以下、「ＫＤＮａｓｅＳｍ」ともいう）が挙げられる。
【００５７】
ＫＤＮａｓｅＳｍはスフィンゴバクテリウム・マルチボラムにおいて誘導可能な酵素であり、本発明者らは、ＫＤＮａｓｅＳｍをラージスケールで調製するため、合成ＫＤＮ−グリコシドを誘導剤として用いる酵素誘導の最適条件を確立している（Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 505-510(1998)）。
【００５８】
デアミノノイラミニダーゼがＫＤＮａｓｅＳｍである場合には、ＫＤＮａｓｅＳｍの精製効率が高いため、Ａは、Ｘと結合する遊離原子価が環にあるもの（例えばフェニレン基）であることが好ましい。
【００５９】
デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液は、特に制限されず、例としては、デアミノノイラミニダーゼを産生する細菌の菌体から、超音波処理などによる破砕、もしくは浸透圧ショック等の適当な方法によって放出された酵素を含む溶液、または、この溶液から、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの公知の酵素精製法により精製した酵素の溶液が挙げられる。
【００６０】
デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる方法としては、不溶性担体としてビーズ等の形態のもの（例えば、クロマト担体）を用いた場合、デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件下において、本発明不溶性担体を充填したカラムにデアミノノイラミニダーゼ含有溶液を通過させ、次いで非特異的結合物質を除去するためにカラムを洗浄液で洗浄する方法（カラム法）、デアミノノイラミニダーゼ含有溶液に本発明不溶性担体を加えて攪拌した後本発明不溶性担体を溶液から分離し、次いで、非特異的結合物質を除去するために本発明不溶性担体を洗浄液で洗浄する方法（バッチ法）などが挙げられる。
【００６１】
デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件は、デアミノノイラミニダーゼの種類により適宜選択されるが、通常には、その酵素活性が発揮される条件である。例えばＫＤＮａｓｅＳｍの場合には、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜０．２Ｍ（ＮａＣｌの場合）という条件が挙げられる。このような条件は、例えば、本発明不溶性担体（又はそのカラム）を適切な緩衝液（例えば、０．１ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１））で平衡化し、また、必要により、デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液を同緩衝液で希釈したり、同緩衝液に対して透析したりすることで得られる。
洗浄も、デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件下で行われる。例えばＫＤＮａｓｅＳｍの場合には、洗浄液としては、上記の緩衝液が挙げられる。
【００６２】
本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼの溶離は、デアミノノイラミニダーゼの種類に依存するが、通常には、デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件において、塩濃度を高めることによって行うことができる。(A)の工程として上記に例示した本発明不溶性担体を充填したカラムにデアミノノイラミニダーゼ含有溶液を通過させ、次いでカラムを洗浄液で洗浄する方法を用いた場合には、塩濃度を高めた洗浄液をカラムに流すことによってデアミノノイラミニダーゼを溶離できる。例えばＫＤＮａｓｅＳｍの場合には、ｐＨ６〜８、塩濃度０．５〜１Ｍ（ＮａＣｌの場合）という条件が挙げられる。
【００６３】
本発明精製方法は、上記(A)及び(B)の工程の前後のいずれかまたは両方に、硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム等による塩析、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、電気泳動法などの公知の酵素精製工程の一つ以上の工程を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明検出方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミン酸結合性物質を含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミン酸結合性物質（以下、ＫＤＮ結合性物質ともいう）を特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したＫＤＮ結合性物質を検出する工程。
【００６５】
なお、工程(A)と工程(B)の間に、固液分離の工程を含むことが好ましい。
【００６６】
ＫＤＮ結合性物質は、デアミノノイラミン酸に結合可能なものである限り特に制限されず、公知の物質でも未知の物質でもよい。例としては、デアミノノイラミニダーゼなどが挙げられ、好ましくは、デアミノノイラミニダーゼである。
【００６７】
ＫＤＮ結合性物質を含有する溶液は、ＫＤＮ結合性物質を含有する、または含有する可能性がある溶液である限り、特に限定されない。また、この溶液は予め精製されている必要はない。例えば、細胞、微生物、生体組織等の抽出液をそのまま用いることもできる。
【００６８】
このような溶液中に、ＫＤＮ結合性物質以外の物質が含有されていても、本発明検出方法では、検出対象であるＫＤＮ結合性物質を特異的に検出することができる。
【００６９】
本発明検出方法における(A)の工程は、本発明精製方法の(A)の工程と同様にして行うことができる。すなわち、ＫＤＮ結合性物質を含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にＫＤＮ結合性物質を特異的に結合させる方法としては、不溶性担体としてビーズ等の形態のもの（例えば、クロマト担体）を用いた場合、ＫＤＮ結合性物質が本発明不溶性担体に結合する条件下において、本発明不溶性担体を充填したカラムにＫＤＮ結合性物質含有溶液を通過させ、次いで非特異的結合物質を除去するためにカラムを洗浄液で洗浄する方法（カラム法）、ＫＤＮ結合性物質含有溶液に本発明不溶性担体を加えて攪拌した後本発明不溶性担体を溶液から分離し、次いで、非特異的結合物質を除去するために本発明不溶性担体を洗浄液で洗浄する方法（バッチ法）などが挙げられる。
【００７０】
ＫＤＮ結合性物質が本発明不溶性担体に結合する条件は、ＫＤＮ結合性物質の種類等により適宜選択される。
【００７１】
本発明不溶性担体に結合したＫＤＮ結合性物質を検出する方法は、定性的な方法でも定量的な方法でもよい。
【００７２】
検出の方法の例としては、ＫＤＮ結合性物質を本発明不溶性担体から分離した後に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色や銀染色などのタンパク質染色法により染色する方法が挙げられる。また、必要に応じ、ＫＤＮ結合性物質の種類を同定するために、例えば同定の目的とするＫＤＮ結合性物質に対して特異的な抗体等を用い、例えばウェスタンブロッティング等を行ってもよい。
【００７３】
また、検出は、ＫＤＮ結合性物質を本発明不溶性担体に結合させたまま、ＫＤＮ結合性物質に対する抗体を用いる通常の免疫学的検出法により行うこともできる。
【００７４】
ＫＤＮ結合性物質に対する抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナルのいずれでもよい。この抗体は、ＫＤＮ結合性物質もしくはその部分またはこれらと他の物質との複合体を抗原として、常法に従って例えば以下のように作成することが可能である。
【００７５】
ポリクローナル抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を上記抗原で免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られた抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精製してもよい。
【００７６】
モノクローナル抗体は、例えば次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマからＫＤＮ結合性物質に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナルな抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナルな抗体を大量に製造することができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞種由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００７７】
得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。なおこの抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して得られるＦａｂを含むフラグメントとしても良い。
【００７８】
抗体の標識物質による標識方法および標識物質の検出方法は、通常の免疫学的方法で採用されるものでよい。
【００７９】
本発明検出方法において、ＫＤＮ結合性物質の本発明不溶性担体からの分離は必須ではない。すなわち、本発明不溶性担体に結合したままのＫＤＮ結合性物質を定性的または定量的に検出してもよい。このような検出方法としては、本発明不溶性担体に結合したＫＤＮ結合性物質を認識できる抗体を用いる免疫学的測定法が挙げられる。例えば、本発明不溶性担体に結合したままのＫＤＮ結合物質に結合できる、ＫＤＮ結合性物質に対する標識した抗体、または、本発明不溶性担体に結合したままのＫＤＮ結合性物質に結合できる、ＫＤＮ結合性物質に対する抗体およびこの抗体に対する標識した抗体を用いて、本発明不溶性担体−ＫＤＮ結合性物質−標識した抗ＫＤＮ結合性物質抗体の複合体、または、本発明不溶性担体−ＫＤＮ結合性物質−抗ＫＤＮ結合性物質抗体−標識した抗（抗ＫＤＮ結合性物質抗体）抗体の複合体を形成させ、複合体の標識を測定することにより、測定することができる。
【００８０】
ＫＤＮには未知の生理活性も期待されており、医薬品等への利用も期待される。ＫＤＮに結合する物質は、ＫＤＮの生理活性を増加、減少又は変化等させる可能性も考えられることから、医薬品等としてもの利用可能性も期待される。本発明検出方法は、このようなＫＤＮ結合性物質の探索等にも有用である。
【００８１】
【実施例】
以下に本発明を、実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００８２】
【実施例１】
4-アミノフェニル 2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸（KDNα2-S-4AP）の合成
合成の各ステップにおける生成物の物性は以下の方法により測定した。
【００８３】
融点(mp)は、Yazawa By-10融点測定装置(前田理科器株式会社)を用いて測定し、補正は行わなかった。質量スペクトル(MS)は、高速原子衝撃法(FAB, マトリックスとして3-ニトロベンジルアルコール(NBA)を用いた）により、JEOL JMS-DX300及びJMS-AX505HA装置(日本電子株式会社)を用いて測定した。赤外線吸収(IR)スペクトルは、JASCO A-102装置(日本分光工業株式会社)を用いて、KBr錠剤法で測定した。比旋光度([α]_D)は、JASCO DIP-370装置(日本分光工業株式会社)を用い20℃で測定した。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Varian VXR-300装置(バリアンジャパンリミテッド)を用い、測定溶媒の内部標準としてテトラメチルシラン(TMS)及び3-(トリメチルシリル)-1-プロパンスルホン酸ナトリウム(DSS)を用いて測定した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Silica gel 60(メルク社製、70-230 mesh)を用いた。
【００８４】
合成の概要を以下に示す。
【００８５】
【化７】

【００８６】
以下、各ステップについて説明する。
（１）メチル (p-ニトロフェニル 4,5,7,8,9-ペンタ-O-アセチル-2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシド)オネート（Methyl (p-nitrophenyl 4,5,7,8,9-penta-O-acetyl-2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onate）(化合物３)の合成
メチル 4,5,7,8,9-ペンタ-O-アセチル-2-クロロ-2,3-ジデオキシ-D-glycero-β-D-galacto-2-ノヌロピラノソネート(Chem. Pharm. Bull., 39(12), 3140-3144(1991))(化合物１, 1.02 g, 2 mmol)をアセトニトリル(30 ml)に溶解し、4-ニトロチオフェノールNa塩(化合物２, 0.71 g, 4 mmol)を加えて室温で３時間攪拌した後、反応液をろ過し、ろ液を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン−酢酸エチル＝１：１)で分離、精製することにより、目的化合物３(0.88 g, 70%)と、副生成物として既知化合物(Chem. Pharm. Bull., 43(19), 1654-1658(1995))であるデオキシ誘導体４(76 mg, 8%)及び５(41 mg, 5%)を得た。化合物３の粗生成物をエチルアルコールからの再結晶に付し、化合物３(0.5 g)を薄い淡黄色のプリズム晶として得た。
【００８７】
mp 113-114℃, [α]_D +37.7°(c = 1.0, MeOH)
元素分析 Calcd for C₂₆H₃₁NO₁₅S: C, 49.60; H, 4.96; N, 2.22. Found: C, 49.58; H: 4.99; N, 2.25.
FAB-MS m/z: 630(M⁺+1), 652(M⁺+Na)
IRν_max(cm^-1): 1740, 1600, 1590, 1500.
¹H-NMR(CDCl₃)δ: 2.06 (dd, 1H, J = 11.0, 13.0 Hz, 3-Hax), 2.93 (dd, 1H, J = 4.5, 13.0 Hz, 3-Heq), 4.04 (dd, 1H, J = 1.0, 10.0 Hz, 6-H), 4.13 (dd, 1H, J = 2.5, 12.5 Hz, 9-H), 4.29 (dd, 1H, J = 1.5, 12.5 Hz, 9-H'), 4.84 (dd, 1H, J = 9.5, 10.0 Hz, 5-H), 4.89 (ddd, 1H, J = 4.5, 9.5, 11.0 Hz, 4-H), 5.31 (br.s, 2H, 7及び8-H), 2.01 (s, 6H, OAc×2), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 3.61 (s, 3H, CO₂Me), 7.63 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 4-ニトロフェニル基), 8.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 4-ニトロフェニル基).
【００８８】
（２）4-ニトロフェニル 2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸（4-Nitrophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid）(化合物６)の合成
化合物３(0.94 g, 1.5 mmol)をメタノール(30 ml)に溶解し、２８％ナトリウムメトキシド−メタノール溶液(1 ml)を加えて室温で２時間撹拌した後、反応液を減圧下、２０℃で乾固し、これに水(10 ml)を加え室温で３時間放置した。反応液に水(20 ml)を加え薄めた後、Dowex-50(H⁺)(ダウケミカル社)を加えて弱酸性にし、樹脂をろ去し、更に水で洗った。ろ液及び洗液を合わせて凍結乾燥して、化合物６(0.60 g, 98%)を淡黄色の粉末として得た。
【００８９】
[α]_D +37.6°(c = 0.5, MeOH)
元素分析 Calcd for C₁₅H₁₉NO₁₀S: C, 44.44; H, 4.72; N, 3.46. Found: C, 44.65; H, 4.84; N, 3.37.
FAB-MS m/z: 406(M⁺+1), 428(M⁺+Na)
IRν_max(cm^-1): 3400, 1705, 1600, 1590, 1510.
¹H-NMR(D₂O)δ: 1.92 (dd, 1H, J = 11.0, 12.5 Hz, 3-Hax), 2.86 (dd, 1H, J = 4.5, 12.5 Hz, 3-Heq), 3.50 (dd, 1H, J = 1.5, 9.5 Hz, 6-H), 3.59 (dd, 1H, J = 8.5, 9.5 Hz, 5-H), 3.63 (dd, 1H, J = 6.0, 11.5 Hz, 9-H), 3.64 (ddd, 1H, J = 4.5, 8.5, 11.0 Hz, 4-H), 3.75 (ddd, 1H, J = 2.5, 6.0, 9.0 Hz, 8-H), 3.82 (dd, 1H, J = 1.5, 9.0 Hz, 7-H), 3.85 (dd, 1H, J = 2.5, 11.5 Hz, 9-H'), 7.79 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 4-ニトロフェニル基), 8.22 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 4-ニトロフェニル基).
【００９０】
（３）4-アミノフェニル 2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸（4-Aminophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid）(化合物７)の合成
化合物６(0.41 g, 1 mmol)をメタノール(50 ml)に溶解し、５％パラジウム−炭素(Pd-C)(1 g)を加えて、水素気流中で室温にて６時間攪拌した後、反応液をろ過し、残渣をメタノールで洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせ減圧下で濃縮乾固し粉末を得た。得られた粉末をＬＨ−２０ゲル(ファルマシアバイオテク)(溶媒：MeOH)を用いて精製し、淡橙色の粉末として化合物７(0.34 g, 90%)を得た。
【００９１】
[α]_D -5.8°(c = 0.5, MeOH)
元素分析 Calcd for C₁₅H₂₁NO₈S: C, 47.99; H, 5.64; N, 3.73. Found: C, 47.67; H, 5.84; N, 3.67.
FAB-MS m/z: 376(M⁺+1), 398(M⁺+Na)
IRν_max(cm^-1): 3300, 1605, 1595, 1500.
¹H-NMR(D₂O)δ: 1.9 (dd, 1H, J = 13.0, 11.5 Hz, 3-Hax), 2.82 (dd, 1H, J = 4.5, 13.0 Hz, 3-Heq), 3.41 (dd, 1H, J = 2.0, 9.5 Hz, 6-H), 3.57 (dd, 1H, J = 9.0, 9.5 Hz, 5-H), 3.57 (dd, 1H, J = 6.5, 11.5 Hz, 9-H), 3.62 (ddd, 1H, J = 4.5, 9.0, 11.5 Hz, 4-H), 3.69 (ddd, 1H, J = 2.5, 6.5, 8.5 Hz, 8-H), 3.78 (dd, 1H, J = 2.0, 8.5 Hz, 7-H), 3.81 (dd, 1H, J = 2.5, 11.5 Hz, 9-H'), 7.42 (d, 2H, J = 8.5 Hz, 4-ニトロフェニル基), 7.69 (d, 2H, J = 8.5 Hz, 4-ニトロフェニル基).
¹³C-NMR(D₂O)δ: 41.90 (C-3), 65.36 (C-9), 70.39 (C-7), 72.02 (C-5), 72.70 (C-4), 74.95 (C-8), 78.98 (C-6), 89.24 (C-2), 174.33 (C-1), 126.25 (C-2',6'), 140.63 (C-3',5'), 132.44 (C-1'), 134.49 (C-4').
【００９２】
【実施例２】
KDNα2-S-4APを結合させた不溶性担体の作成及びKDNα2-S-4APを結合させた不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるKDNase Smの精製
(1)アフィニティーカラムの作成
エポキシ活性化セファロース6B（Pharmacia Biotech）の凍結乾燥粉末1.0 gを脱イオン水で膨潤させ、その後、ガラスフィルターを用い、脱イオン水200 ml以上で洗浄した。凍結乾燥粉末1.0 gは、膨潤するとおよそ3.5 mlのゲルになる。2.0 mlアシストチューブにリガンドとしてKDNα2-S-4AP 210 μmolを測りとり、0.6 M NaHCO₃ 1.2 mlに溶解した。ここに膨潤したゲル0.6 mlを添加し、25℃(20℃〜45℃)で17.5時間（一夜）よく撹拌した。撹拌後、2.5 mlシリンジ(TERUMO)に詰め、0.4 M NaHCO₃で洗浄して余分なリガンドを除去した。活性基のブロッキングのため溶媒を1 Mエタノールアミン(pH 8.0)に置換し、37℃で16時間静置した。次いで、0.5 M NaCl/0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.0)と0.5 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)とを交互に３回繰り返して流し、洗浄した。これにより、KDNα2-S-4APを結合させた不溶性担体を充填したアフィニティーカラム(0.9×1.2 cm)が作成された。
【００９３】
(2) アフィニティーカラムに対するKDNase Smの結合と溶離
S. multivorumの菌体から浸透圧ショック法により抽出し、KDNase粗画分を得た。具体的には、S. multivorumの菌体（湿重量８ｇ）を氷冷した0.03 M NaCl/0.01 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)に懸濁し、遠心（13,000×g, 20分）を行って洗浄した。この菌体の沈渣に菌体重量の10倍容（この場合、80 ml）の0.033 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)を加えて懸濁させた後、よく撹拌しながら菌体重量の10倍容の40%ショ糖/0.033 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)および0.0001倍容の0.1 M EDTA二ナトリウム塩を加えて、室温で10分間振盪した。遠心（13,000×g, 10分）して菌体を集め、そこに最初の菌体重量の20倍容の氷冷した1 mM酢酸マグネシウム（pH 7.1に調整）を加えて、10分間ゆっくりと攪拌した。さらに、２倍容の氷冷1 M NaCl/1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)を加え、遠心（13,000×g, 30分）して上清を得、これをKDNase粗画分とした。
【００９４】
KDNase粗画分0.5 ml(2.6 units)を実施例２（上記(1)）で作成したアフィニティーカラムにかけ、1 mM Mg(CH₃COO)₂/0.1 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)で洗浄した後、1 mM Mg(CH₃COO)₂/0.5 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)で溶離し、各500 μlずつ４本（各緩衝液について計2.0 ml）分取した。
分取した各フラクションの20μlを用い、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／００７８１号に記載の４−メチルウンベリフェリルＫＤＮを用いる方法によりKDNase活性を測定した。さらに、このフラクションの400 μlをmicrocon 10（Amicon Inc.）で20μlに濃縮し、SDS-PAGEに付した。これをCBB染色することによって、タンパク質を検出した。
【００９５】
結果を図１及び２に示す。画分番号４で洗浄液から溶出液に変えた。0.5 M NaClで溶出したフラクション（画分番号５および６）に、KDNase活性が確認された。画分番号５および６には、CBB染色によって、KDNase Smの推定分子量約50KDaのバンドが見られ、またその他のタンパク質のバンドは数本しか確認されなかったことから、KDNを特異的に認識する物質を効率よく保持するカラムであると考えられる。
【００９６】
J. Biol. Chem., 269, 21415-21419, 1994には、KDN-OS（ＫＤＮオリゴ糖アルコール）を含む糖ペプチドをアフィニティーリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを含む、KDNase Smの精製に関する結果が報告されている。この報告では、更に精製を進めた段階でアフィニティークロマトグラフィーを用いており、比活性の上昇は、このアフィニティークロマトグラフィーステップで60倍で、全体として173倍であった。このステップ後の比活性は127 units/mgタンパク質であった。本実施例では、より粗精製である浸透圧ショック後の画分から始めて、一度の精製で1,450 units/mgタンパク質まで比活性が上昇し、この方法の有効性は明らかである。
【００９７】
なお、このアフィニティーカラムは、繰り返し使用しても同様の結果を与え、繰り返しの使用に対して安定であった。
【００９８】
【実施例３】
KDNα2-S-4APを結合した不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーと、他のクロマトグラフィーとの組合せによるKDNase Smの精製
(a) KDNaseの粗画分の調製
【００９９】
KDN-OSによってS. multivorumに誘導をかけて（Nishino et al., J. Biol. Chem. 271, 2909, 1996）得られた菌体を洗浄後、0.1 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)を加えて、5 g/30 mlの懸濁液とした。次に、超音波発生装置（INSONATOR 201型、久保田商事）を用いて、氷冷下で超音波処理（100 W, 3〜5分）した。この処理液を13,000×gで60分遠心して、上清を採取した。この上清を限外濾過で濃縮して、液量を60 mlとした。
【０１００】
(b) DEAE-Toyopearl 650Mクロマトグラフィー
(a)で得られた粗画分（60 ml、4,500 units）をDEAE-Toyopearlカラム（2.4×24 cm, 109 ml,東ソー製; 0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で平衡化）にかけて、カラムに保持されないで素通りする画分を採取して、0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-アセテート緩衝液(pH 6.0)に対して透析した。収量は、3,500 units(17 ml)であった。
【０１０１】
(c) CM-Toyopearl 650Mクロマトグラフィー
(b)で得られた画分をCM-Toyopearl 650Mカラム（2.4×23.8 cm, 108 ml,東ソー製; 0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-アセテート緩衝液(pH 6.0)で平衡化）にかけた後、0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-アセテート緩衝液(pH 6.0)中で0〜1 M NaClの塩濃度勾配によって溶出した。溶出画分の活性測定を行い、活性のある画分をプールして、限外濾過によって濃縮した。収量は、3,500 units(17 ml)であった。
【０１０２】
(d) フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー
(c)で得られた濃縮KDNase活性画分を3 M NaCl/50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)に対して透析したものを、フェニルセファロースカラム（1.6×20.3 cm, 41 ml,ファルマシア製）にかけて、400 mlの50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)中で3 M〜0 M NaClの直線塩濃度勾配によって溶出した。溶出液を分画して活性測定を行い、活性をもつ画分を集めて、限外濾過で濃縮した。溶媒を限外濾過によって0.1 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)に置換して、2 mlにした。収量は2,530 unitsであった。
【０１０３】
(e) KDNチオグリコシドをリガンドとするアフィニティーカラムの作成及びそれを用いたアフィニティークロマトグラフィー
KDNα2-S-4AP 800 μmol (4 ml)に、エポキシ活性化セファロース6Bゲル4.5 mlを加えて、室温で20時間撹拌した。その3 mlのゲルをカラムに詰めて、0.4 M NaHCO₃で洗浄した後、溶媒を1 Mエタノールアミン(pH 8.0)に置換して、室温で16時間静置した。0.5 M NaCl/0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)と0.5 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)とを交互に３回繰り返し流すことによってカラムを洗浄した。
【０１０４】
(d)で調製したKDNase活性画分を25.8 units(60 μl)をカラムに載せて、まず、0.1 M NaCl/1 mM Mg(CH₃COO)₂/0.1 M Tris-HCl(pH 7.1)を21 ml流して洗浄した後、0.5 M NaCl/1 mM Mg(CH₃COO)₂/0.1 M Tris-HCl(pH 7.1)を12 ml流して溶離した。洗浄液および溶離液を3 mlずつ分取した。各画分について、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／００７８１号に記載の４−メチルウンベリフェリルＫＤＮを用いる方法によりKDNase活性を測定した。結果を図３に示す。21 unitsが８〜10画分に回収され、これはカラムに載せた量の81%であった。このことから、カラムのKDNase結合の容量は、21 units/3 mlであるから、7 units/mlと計算された。また、溶出画分のSDS-PAGE/銀染色の解析から、カラムに載せる前に観察されていた約134K、約108K、約60Kおよび約42Kのバンドの中、約60Kのバンドのみが溶離された活性画分に見い出された。このバンドは、SDS-PAGE/銀染色で単一バンドとして検出され、精製KDNaseであると判断された。
【０１０５】
【発明の効果】
デアミノノイラミニダーゼなどのデアミノノイラミン酸結合性物質の精製や検出に有用な不溶性担体を製造するのに有用なデアミノノイラミン酸誘導体が提供される。また、このデアミノノイラミン酸誘導体が結合した不溶性担体、並びに、この不溶性担体を用いるデアミノノイラミン酸結合物質の精製方法および検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例２におけるアフィニティークロマトグラフィーにより得られた溶出画分のKDNase活性を示す。Voは排除体積、Vtはベッド容量を示す。
【図２】 実施例２におけるアフィニティークロマトグラフィーにより得られた溶出画分のSDS-PAGE分析の結果を示す。
【図３】 実施例３におけるアフィニティークロマトグラフィーにより得られた溶出画分のKDNase活性を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a deaminoneuraminic acid derivative, a method for purifying deaminoneuraminidase, and a method for detecting a deaminoneuraminic acid binding substance.
[0002]
[Prior art]
Deaminoneuraminic acid (3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonic acid or 2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid; hereinafter also referred to as “KDN”) The structure is the same as that of sialic acid except that the N-acyl group bonded to the 5-position carbon of sialic acid is replaced with a hydroxyl group. Until now, it has been found that KDN is widely distributed in the biological world as a component of complex carbohydrates and has various modes of existence, like sialic acid. KDN has unique properties different from sialic acid, and it has been clarified that KDN-containing complex carbohydrates play an important role in egg-sperm interaction during fertilization. There is great interest in elucidating the structure and function of lipids.
[0003]
There have been several reports on an enzyme that cleaves a KDN ketoside bond in a glycoconjugate containing KDN (deaminoneuraminidase; hereinafter also referred to as “KDNase”). For example, International Publication Pamphlet No. WO96 / 00781 describes KDNase, which is considered to be an enzyme that does not cleave N-acylneuraminyl bonds, that is, specifically cleaves KDN ketoside bonds. This strict substrate specificity of KDNase is useful for elucidating the structure and function of KDN-containing glycoconjugates.
[0004]
As a method for purifying KDNase, a method using affinity chromatography has been reported. For example, a method using a carrier to which a KDN-containing glycopeptide fraction obtained by degrading a KDN-containing glycoprotein with pronase is used (J. Biol. Chem., 269, 21415-21419 (1994)) is known. . As a neuraminidase purification method, α-thiosialoside (2-S- (2-aminoethyl) 5-acetamido-3,5-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid) There is known a method using a carrier to which is bound (Glycoconjugate Journal, 15, 663-669 (1998)).
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an affinity carrier suitable for use in affinity chromatography of a deaminoneuraminic acid binding substance such as KDNase.
[0006]
Another object of the present invention is to provide a method for purifying and detecting a deaminoneuraminic acid-binding substance such as KDNase using the carrier.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that KDNase can be easily, rapidly and highly purified prepared by using a carrier to which a KDN derivative such as a specific KDN-thioglycoside is bound, thereby completing the present invention.
[0008]
The present invention provides a deaminoneuraminic acid derivative (hereinafter also referred to as the present invention derivative) represented by the following general formula (1).
[0009]
[Chemical 3]

(Wherein X is S, CH ₂ Or NH, A is an optionally substituted hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms, preferably a saturated hydrocarbon or aromatic hydrocarbon divalent group, and D is a bond to an insoluble carrier. Shows functional groups that can be used. )
[0010]
In the derivative of the present invention, D is preferably an amino group.
The derivative of the present invention is preferably represented by the following formula (2).
[0011]
[Formula 4]

[0012]
The present invention also provides an insoluble carrier to which the derivative of the present invention is bound (hereinafter also referred to as the insoluble carrier of the present invention).
[0013]
Furthermore, the present invention provides a method for purifying deaminoneuraminidase using the insoluble carrier of the present invention (hereinafter also referred to as the present purification method) and a method for detecting a deaminoneuraminic acid binding substance (hereinafter referred to as the present detection method). (Also called).
[0014]
The purification method of the present invention includes at least the following steps (A) and (B).
(A) A step of bringing a solution containing deaminoneuraminidase into contact with the insoluble carrier of the present invention to specifically bind deaminoneuraminidase to the insoluble carrier.
(B) A step of eluting deaminoneuraminidase bound to the insoluble carrier of the present invention.
[0015]
The detection method of the present invention includes at least the following steps (A) and (B).
(A) A step of bringing a solution containing a deaminoneuraminic acid binding substance into contact with the insoluble carrier of the present invention to specifically bind the deaminoneuraminic acid binding substance to the insoluble carrier.
(B) A step of detecting a deaminoneuraminic acid binding substance bound to the insoluble carrier of the present invention.
[0016]
In the detection method of the present invention, the deaminoneuraminic acid binding substance is preferably deaminoneuraminidase.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The derivative of the present invention is a deaminoneuraminic acid derivative represented by the above general formula (1).
[0018]
In the general formula (1), X is S, CH ₂ Or NH, preferably S.
[0019]
A is a divalent group of an optionally substituted hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms, preferably a saturated hydrocarbon (alkane, cycloalkane, etc.) or an aromatic hydrocarbon (arene, alkylarene, etc.). is there. The divalent group of the saturated hydrocarbon includes an alkylene group and a cycloalkylene group. Examples of saturated hydrocarbon divalent groups include methylene, ethylene, propylene, and the like. Aromatic hydrocarbons include aromatic hydrocarbons having one or more saturated hydrocarbon side chains. In the aromatic hydrocarbon divalent group having side chains, the free valences of both the ring and the side chain are It may be on one side or on both the ring and the side chain. Examples of aromatic hydrocarbon divalent groups include (o-, m- or p-) phenylene, methylphenylene, benzylidene,
[Chemical formula 5]

Etc. As a substituent of a hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms, preferably a saturated hydrocarbon or an aromatic hydrocarbon, an alkyl group (usually 1 to 5 carbon atoms), an acyl group (usually 1 to 4 carbon atoms) , Hydroxyl group, nitrile group, nitro group and the like.
There may be a plurality of substituents.
[0020]
A is preferably a ring having a free valence bonded to X, such as a phenylene group.
[0021]
D represents a functional group that can be used for binding to an insoluble carrier. Examples of D include an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group, and an imidazole group, as long as they can be combined with a functional group of an insoluble carrier. As a method for binding a ligand to an insoluble carrier, a carrier having an adjacent hydroxyl group (such as agarose or sepharose) is activated with BrCN and bound to an amino group, or an epoxy group and an amino group of an epoxy-activated carrier. In general, D is preferably an amino group, since a method of bonding to a group is common and it is easy to obtain an insoluble carrier to be bonded to an amino group.
[0022]
The derivative of the present invention is preferably represented by the above formula (2).
[0023]
The method for producing the derivative of the present invention will be described below.
The derivative of the present invention in which X is S and D is an amino group in the general formula (1) can be produced as follows.
[0024]
[Chemical 6]

[0025]
First, the compound represented by the general formula (3) and the compound represented by the general formula (4) are reacted to obtain a compound represented by the general formula (5).
[0026]
Where R ¹ Is a hydroxyl-protecting group, for example, an acyl group, an aralkyl group, a silyl group, an alkyloxymethyl group, an acetal type or a ketal type protective group.
[0027]
Examples of acyl groups include acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trifluoroacetyl, methoxyacetyl, propionyl, n-butyryl, (E) -2-methylbutenoyl, pentanoyl, benzoyl, o- (methoxycarbonyl) benzoyl, p- Examples include groups such as phenylbenzoyl, p-toluoyl, p-anisoyl, p-chlorobenzoyl, p-nitrobenzoyl.
[0028]
Examples of the aralkyl group include groups such as benzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, o-nitrobenzyl, p-halobenzyl, p-cyanobenzyl and the like.
[0029]
Examples of the silyl group include groups such as trimethylsilyl, triethylsilyl, dimethylisopropylsilyl, isopropyldimethylsilyl, methyldi-t-butylsilyl, and t-butyldimethylsilyl.
[0030]
Examples of the alkyloxymethyl group include groups such as methoxymethyl and ethoxymethyl.
[0031]
Examples of acetal type or ketal type protecting groups include groups such as isopropylidene, ethylidene, propylidene, benzylidene, methoxymethylidene and the like.
[0032]
Preferred R ¹ Are an acetyl group, a benzoyl group and a benzyl group, with an acetyl group being more preferred.
[0033]
R ¹ May be the same as or different from each other, and if they are different, any combination of two or more may be used. R ¹ Are preferably identical to each other. Most preferred is R ¹ Are identical to each other and R ¹ Is an acetyl group.
[0034]
R ² Is a protective group for a carboxyl group, such as an alkyl group (methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, etc.) or benzyl group.
[0035]
L and M are groups that are eliminated by a reaction to form a bond between a carbon atom to which L is bonded and a sulfur atom. For example, a combination of a halogen atom as L and an alkali metal atom or organic base as M It is. Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, and a bromine atom. Examples of the alkali metal atom include a lithium atom, a sodium atom, and a potassium atom. Examples of the organic base include triethylamine and diisopropylethylamine.
[0036]
A is a divalent group of the above hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms. Examples of A include those given for general formula (1) above. A is preferably a ring having a free valence bonded to X (here, S) in the ring (for example, a phenylene group). When such a preferred group is used, in the production of the derivative of the present invention, (a) the number of steps of the reaction step is reduced, (b) the reaction is facilitated, (c) it can be produced at low cost, (d) the reaction product The advantage that the yield of is increased.
[0037]
R ^Three Is a group that can be derived from an amino group, for example, a nitro group, an azide group, a protected amino group (for example, benzyloxycarbonylamino (—NH—CBz), t-butoxycarbonylamino (—NH—Boc)) is there.
[0038]
The reaction of the compound represented by the general formula (3) and the compound represented by the general formula (4) is usually performed in an organic solvent (for example, acetonitrile) at 0 to 40 ° C. for 0.5 to 24 hours. Can be done under conditions. In addition to the compound represented by the general formula (5), a by-product may be generated. In that case, if necessary, the compound represented by the general formula (5) may be purified by a conventional method such as silica gel chromatography. it can.
[0039]
R ¹ , R ² And R ^Three Each group is selected so that it does not react under the reaction conditions between the compound represented by the general formula (3) and the compound represented by the general formula (4).
[0040]
Next, the protecting group for the hydroxyl group and carboxyl group of the compound represented by the general formula (5) is removed to obtain the compound represented by the general formula (6). Removal of the protective group for the hydroxyl group and carboxyl group can be carried out by a known method using sodium alkoxide, alkali, acid or the like.
[0041]
And R in the general formula (6) ^Three Is derived into an amino group to obtain a compound represented by the general formula (7) (the derivative of the present invention wherein X is S and D is an amino group in the general formula (1)). R ^Three The amino group can be derived by a known method. For example, when it is a nitro group, it can be derived into an amino group by reduction with hydrogen in the presence of a catalyst such as palladium-carbon (Pd-C). In the case of a protected amino group, the amino group can be derived by removing the protective group.
[0042]
R ¹ And R ^Three Depending on the combination, the protective group for the hydroxyl group may be removed after the induction to the amino group, or the protective group for the hydroxyl group may be removed simultaneously with the induction to the amino group.
[0043]
In the general formula (1), X is CH. ₂ In this case, as the compound represented by the general formula (4), R ^Three -A-CH ₂ -Sn- (C _Four H ₉ ) _Three (For example, tributyl-4-nitrobenzyltin) can be reacted with a compound represented by the general formula (3) according to the method described in Tetrahedron Lett., 32, 3953 (1991). Alternatively, as the compound represented by the general formula (4), R ^Three -A-CH ₂ -Si- (CH _Three ) _Three (For example, trimethyl-4-nitrobenzylsilane) can be used to react with a compound represented by the general formula (3) according to the method described in Chemistry Lett., 1529 (1984).
[0044]
In the general formula (1), when X is NH, the compound represented by the general formula (4) is represented by R ^Three -A-NH ₂ (For example, p-nitroaniline) can be used to react with the compound represented by the general formula (3) in the same manner as in the case where X is S. Alternatively, as the compound represented by the general formula (4), NH ₂ -A-NHBoc can be used to react with a compound represented by the general formula (3) according to the method described in Glycoconjugate Journal, 15, 663-669 (1998).
[0045]
The derivative of the present invention can be bound to an insoluble carrier, whereby the insoluble carrier of the present invention can be obtained.
[0046]
The insoluble carrier of the present invention is an insoluble carrier to which the derivative of the present invention is bound. In the present specification, the term “insoluble” means that the insoluble carrier can be separated from the liquid in contact therewith by solid-liquid separation means such as filtration under the conditions where the insoluble carrier is used.
[0047]
The insoluble carrier to which the derivative of the present invention is bound may be an insoluble carrier ordinarily used for purification or analysis of substances, and may be either a carrier made of a natural substance or a carrier made of a synthetic substance. Specific examples include cellulose (eg, cellulofine (trade name), agarose, cross-linked agarose (eg, sepharose (trade name)), cross-linked dextran (eg, Sephadex (trade name)), hydrophilic vinyl polymer (eg, Toyopearl (trade name)).
[0048]
The form of the insoluble carrier is not particularly limited, and any of fibers, fine granules, beads and the like may be used.
[0049]
The derivative of the present invention is bound to the insoluble carrier by first preparing an insoluble carrier having a functional group capable of binding to D in the general formula (1), and then binding the derivative of the present invention and the insoluble carrier having a functional group. It can be carried out. The introduction of the functional group into the insoluble carrier and the binding between the derivative of the present invention and the insoluble carrier having a functional group can be performed under conditions according to a known method for preparing a carrier for affinity chromatography.
[0050]
The functional group may be bonded to an insoluble carrier via a spacer.
[0051]
An insoluble carrier into which a functional group capable of binding to an amino group, carboxyl group, sulfhydryl group, imidazole group or the like is introduced can also be obtained as a commercial product.
[0052]
When D in the general formula (1) is an amino group, a carrier having an adjacent hydroxyl group such as agarose can be activated with BrCN and an amino group can be bound thereto.
[0053]
The insoluble carrier of the present invention can be used for purification of deaminoneuraminidase and detection of deaminoneuraminic acid binding substance. Moreover, it can be used as a competitive inhibitor of deaminoneuraminidase.
[0054]
The purification method of the present invention includes at least the following steps (A) and (B).
(A) A step of bringing a solution containing deaminoneuraminidase into contact with the insoluble carrier of the present invention to specifically bind deaminoneuraminidase to the insoluble carrier.
(B) A step of eluting deaminoneuraminidase bound to the insoluble carrier of the present invention.
[0055]
Note that it is preferable to include a solid-liquid separation step between the step (A) and the step (B).
[0056]
The deaminoneuraminidase is not particularly limited, and examples thereof include those derived from Sphingobacter multiborum (hereinafter also referred to as “KDNaseSm”).
[0057]
KDNaseSm is an inducible enzyme in Sphingobacterium multiborum, and the present inventors have established optimal conditions for enzyme induction using synthetic KDN-glycoside as an inducer in order to prepare KDNaseSm on a large scale ( Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 505-510 (1998)).
[0058]
When the deaminoneuraminidase is KDNaseSm, since the purification efficiency of KDNaseSm is high, A is preferably a ring having a free valence bonded to X (for example, a phenylene group).
[0059]
The solution containing deaminoneuraminidase is not particularly limited. For example, the solution was released from bacterial cells producing deaminoneuraminidase by an appropriate method such as disruption by ultrasonic treatment or osmotic shock. Examples include a solution containing an enzyme, or an enzyme solution purified from the solution by a known enzyme purification method such as salting out or ion exchange chromatography.
[0060]
As a method for bringing a solution containing deaminoneuraminidase into contact with the insoluble carrier of the present invention and specifically binding deaminoneuraminidase to the insoluble carrier, the insoluble carrier is in the form of beads (for example, chromatographic carrier). In order to remove the nonspecific binding substance, the deaminoneuraminidase-containing solution is passed through a column packed with the insoluble carrier of the present invention under conditions where the deaminoneuraminidase binds to the insoluble carrier of the present invention. A method of washing a column with a washing solution (column method), adding an insoluble carrier of the present invention to a deaminoneuraminidase-containing solution, stirring, separating the insoluble carrier of the present invention from the solution, and then removing nonspecific binding substances The method (batch method) etc. which wash | clean the insoluble support | carrier of this invention with a washing | cleaning liquid are mentioned.
[0061]
Conditions under which deaminoneuraminidase binds to the insoluble carrier of the present invention are appropriately selected depending on the type of deaminoneuraminidase, but are usually conditions under which the enzyme activity is exhibited. For example, in the case of KDNaseSm, the conditions of pH 6-8 and salt concentration 0.05-0.2M (in the case of NaCl) are mentioned. Such conditions include, for example, equilibration of the insoluble carrier of the present invention (or its column) with an appropriate buffer (for example, 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) containing 0.1 M NaCl), and Thus, it can be obtained by diluting a solution containing deaminoneuraminidase with the same buffer or dialyzing against the same buffer.
Washing is also performed under conditions where deaminoneuraminidase binds to the insoluble carrier of the present invention. For example, in the case of KDNaseSm, examples of the cleaning liquid include the above-described buffer.
[0062]
The elution of the deaminoneuraminidase bound to the insoluble carrier of the present invention depends on the type of deaminoneuraminidase, but it is usually performed by increasing the salt concentration under the condition that the deaminoneuraminidase binds to the insoluble carrier of the present invention. Can do. When using the method of passing the deaminoneuraminidase-containing solution through the column packed with the insoluble carrier of the present invention exemplified above as the step (A) and then washing the column with the washing solution, the washing solution with an increased salt concentration is used. Deaminoneuraminidase can be eluted by flowing through a column. For example, in the case of KDNaseSm, the conditions of pH 6-8 and salt concentration 0.5-1M (in the case of NaCl) are mentioned.
[0063]
In the purification method of the present invention, salt precipitation with ammonium sulfate (ammonium sulfate), sodium sulfate or the like, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, anion, before or after the steps (A) and (B) And one or more steps of known enzyme purification steps such as cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and electrophoresis.
[0064]
The detection method of the present invention includes at least the following steps (A) and (B).
(A) A solution containing a deaminoneuraminic acid binding substance is brought into contact with the insoluble carrier of the present invention, and the deaminoneuraminic acid binding substance (hereinafter also referred to as a KDN binding substance) is brought into contact with the insoluble carrier. Specific binding step.
(B) A step of detecting a KDN-binding substance bound to the insoluble carrier of the present invention.
[0065]
Note that it is preferable to include a solid-liquid separation step between the step (A) and the step (B).
[0066]
The KDN binding substance is not particularly limited as long as it can bind to deaminoneuraminic acid, and may be a known substance or an unknown substance. Examples include deaminoneuraminidase, and preferably deaminoneuraminidase.
[0067]
The solution containing the KDN-binding substance is not particularly limited as long as it is a solution containing or possibly containing the KDN-binding substance. Moreover, this solution does not need to be purified in advance. For example, extracts of cells, microorganisms, living tissues, etc. can be used as they are.
[0068]
Even if a substance other than the KDN-binding substance is contained in such a solution, the detection method of the present invention can specifically detect the KDN-binding substance to be detected.
[0069]
The step (A) in the detection method of the present invention can be performed in the same manner as the step (A) of the purification method of the present invention. That is, as a method for bringing a solution containing a KDN-binding substance into contact with the insoluble carrier of the present invention and specifically binding the KDN-binding substance to the insoluble carrier, the insoluble carrier is in the form of beads or the like ( For example, when a chromatographic carrier) is used, the KDN-binding substance-containing solution is passed through a column packed with the insoluble carrier of the present invention under conditions where the KDN-binding substance binds to the insoluble carrier of the present invention, and then nonspecific binding is performed. In order to remove the substance, the column is washed with a washing solution (column method), the insoluble carrier of the present invention is added to the KDN-binding substance-containing solution and stirred, and then the insoluble carrier of the present invention is separated from the solution. Examples include a method (batch method) of washing the insoluble carrier of the present invention with a washing liquid in order to remove the binding substance.
[0070]
Conditions for binding of the KDN-binding substance to the insoluble carrier of the present invention are appropriately selected depending on the type of the KDN-binding substance.
[0071]
The method for detecting the KDN-binding substance bound to the insoluble carrier of the present invention may be a qualitative method or a quantitative method.
[0072]
As an example of the detection method, after separating the KDN-binding substance from the insoluble carrier of the present invention, it is subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining or silver staining. A method of staining by a protein staining method such as If necessary, in order to identify the type of KDN-binding substance, for example, an antibody specific for the KDN-binding substance to be identified may be used, for example, Western blotting may be performed.
[0073]
The detection can also be performed by a usual immunological detection method using an antibody against the KDN-binding substance while the KDN-binding substance is bound to the insoluble carrier of the present invention.
[0074]
The antibody against the KDN-binding substance may be either polyclonal or monoclonal. This antibody can be prepared according to a conventional method, for example, as follows using a KDN-binding substance or a part thereof or a complex of these and another substance as an antigen.
[0075]
Polyclonal antibodies can be obtained by immunizing immunized animals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats and sheep with the above antigens and collecting serum from these animals. When an immunized animal is immunized, it is desirable to use an adjuvant (adjuvant) in combination because it activates antibody-producing cells. The immunoglobulin fraction may be purified from the obtained antiserum by a conventional method.
[0076]
A monoclonal antibody can be obtained, for example, as follows. That is, after the above antigen was administered intraperitoneally, subcutaneously, and footpad of an immunized animal such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep, etc., the spleen or popliteal lymph node was removed and collected from these A cell line in which a hybridoma is established by cell fusion of a cell and a myeloma cell which is a tumor cell line, the resulting hybridoma is continuously grown, and a specific antibody against a KDN binding substance is continuously produced from the obtained hybridoma Sort out. By culturing the strain thus selected in a suitable medium, a monoclonal antibody can be obtained in the medium. Alternatively, a large amount of monoclonal antibody can be produced by culturing the hybridoma in a living body such as the abdominal cavity of a mouse. As cells used for cell fusion, lymph node cells and lymphocytes in peripheral blood can be used in addition to spleen cells. The myeloma cell line is preferably derived from the same cell type as compared to that derived from a heterogeneous cell type, and a stable antibody-producing hybridoma can be obtained.
[0077]
Purification methods of the obtained polyclonal and monoclonal antibodies include salting out with sodium sulfate, ammonium sulfate, etc., low temperature alcohol precipitation, selective precipitation fractionation with polyethylene glycol or isoelectric point, electrophoresis, DEAE (diethylaminoethyl)- Derivatives, ion exchange chromatography using ion exchangers such as CM (carboxymethyl) -derivatives, affinity chromatography using protein A or protein G, hydroxyapatite chromatography, immunoadsorption chromatography with immobilized antigen, gel Examples thereof include a filtration method and an ultracentrifugation method. In addition, it is good also as a fragment containing Fab obtained by processing this antibody with protease (for example, plasmin, pepsin, papain etc.) which does not decompose | disassemble an antigen binding site (Fab).
[0078]
The labeling method of the antibody with a labeling substance and the detection method of the labeling substance may be those employed in ordinary immunological methods.
[0079]
In the detection method of the present invention, it is not essential to separate the KDN-binding substance from the insoluble carrier of the present invention. That is, the KDN-binding substance remaining bound to the insoluble carrier of the present invention may be detected qualitatively or quantitatively. Examples of such a detection method include an immunological assay using an antibody capable of recognizing a KDN-binding substance bound to the insoluble carrier of the present invention. For example, a labeled antibody against a KDN-binding substance that can bind to a KDN-binding substance that remains bound to the insoluble carrier of the present invention, or a KDN-binding substance that can bind to a KDN-binding substance that remains bound to the insoluble carrier of the present invention An insoluble carrier-KDN-binding substance-labeled anti-KDN-binding substance antibody complex, or an insoluble carrier-KDN-binding substance-anti-KDN binding of the present invention using an antibody against the antibody and a labeled antibody against the antibody It can be measured by forming a complex of a substance-antibody-labeled anti- (anti-KDN-binding substance antibody) antibody and measuring the label of the complex.
[0080]
KDN is also expected to have an unknown physiological activity, and is expected to be used for pharmaceuticals. Since the substance that binds to KDN may increase, decrease, or change the physiological activity of KDN, it can be expected to be used as a medicine. The detection method of the present invention is useful for searching for such a KDN-binding substance.
[0081]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. However, the technical scope of the present invention should not be limited by these.
[0082]
[Example 1]
Synthesis of 4-aminophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonuropyranoside acid (KDNα2-S-4AP)
The physical properties of the product at each step of the synthesis were measured by the following method.
[0083]
The melting point (mp) was measured using a Yazawa By-10 melting point measurement apparatus (Maeda Science Instruments Co., Ltd.), and no correction was performed. Mass spectrum (MS) was measured by the fast atom bombardment method (FAB, using 3-nitrobenzyl alcohol (NBA) as a matrix) using JEOL JMS-DX300 and JMS-AX505HA equipment (JEOL Ltd.). . Infrared absorption (IR) spectrum was measured by KBr tablet method using JASCO A-102 apparatus (JASCO Corporation). Specific rotation ([α] _D ) Was measured at 20 ° C. using a JASCO DIP-370 apparatus (JASCO Corporation). Nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum was measured using a Varian VXR-300 instrument (Varian Japan Limited), and tetramethylsilane (TMS) and sodium 3- (trimethylsilyl) -1-propanesulfonate (DSS) as internal standards for the measurement solvent. It measured using. Silica gel 60 (Merck, 70-230 mesh) was used for silica gel column chromatography.
[0084]
An outline of the synthesis is shown below.
[0085]
[Chemical 7]

[0086]
Hereinafter, each step will be described.
(1) Methyl (p-nitrophenyl 4,5,7,8,9-penta-O-acetyl-2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonuropyranoside) onate (Methyl (p-nitrophenyl 4,5,7,8,9-penta-O-acetyl-2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid) onate) (compound 3) Synthesis
Methyl 4,5,7,8,9-penta-O-acetyl-2-chloro-2,3-dideoxy-D-glycero-β-D-galacto-2-nonuropyranosonate (Chem. Pharm. Bull ., 39 (12), 3140-3144 (1991)) (compound 1, 1.02 g, 2 mmol) dissolved in acetonitrile (30 ml) and 4-nitrothiophenol sodium salt (compound 2, 0.71 g, 4 mmol) ) And stirred at room temperature for 3 hours, the reaction solution was filtered, and the filtrate was evaporated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel column chromatography (n-hexane-ethyl acetate = 1: 1) to obtain the target compound 3 (0.88 g, 70%) and a known compound (Chem. Pharm. Bull., 43 (19), 1654-1658 (1995)), and deoxy derivatives 4 (76 mg, 8%) and 5 (41 mg, 5%) were obtained. The crude product of compound 3 was recrystallized from ethyl alcohol to obtain compound 3 (0.5 g) as light pale yellow prisms.
[0087]
mp 113-114 ℃, [α] _D + 37.7 ° (c = 1.0, MeOH)
Elemental analysis Calcd for C ₂₆ H ₃₁ NO ₁₅ S: C, 49.60; H, 4.96; N, 2.22. Found: C, 49.58; H: 4.99; N, 2.25.
FAB-MS m / z: 630 (M ⁺ +1), 652 (M ⁺ + Na)
IRν _max (cm ^-1 ): 1740, 1600, 1590, 1500.
¹ H-NMR (CDCl _Three ) δ: 2.06 (dd, 1H, J = 11.0, 13.0 Hz, 3-Hax), 2.93 (dd, 1H, J = 4.5, 13.0 Hz, 3-Heq), 4.04 (dd, 1H, J = 1.0, 10.0 Hz, 6-H), 4.13 (dd, 1H, J = 2.5, 12.5 Hz, 9-H), 4.29 (dd, 1H, J = 1.5, 12.5 Hz, 9-H '), 4.84 (dd, 1H, J = 9.5, 10.0 Hz, 5-H), 4.89 (ddd, 1H, J = 4.5, 9.5, 11.0 Hz, 4-H), 5.31 (br.s, 2H, 7 and 8-H), 2.01 (s , 6H, OAc × 2), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 3.61 (s, 3H, CO ₂ Me), 7.63 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 4-nitrophenyl group), 8.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 4-nitrophenyl group).
[0088]
(2) 4-nitrophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonuropyranoside acid (4-Nitrophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D -glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid) (Compound 6)
Compound 3 (0.94 g, 1.5 mmol) was dissolved in methanol (30 ml), 28% sodium methoxide-methanol solution (1 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Water (10 ml) was added thereto and left at room temperature for 3 hours. After adding water (20 ml) to the reaction solution and diluting, Dowex-50 (H ⁺ ) (Dow Chemical) was added to make it weakly acidic, and the resin was filtered off and further washed with water. The filtrate and washings were combined and lyophilized to give compound 6 (0.60 g, 98%) as a pale yellow powder.
[0089]
[α] _D + 37.6 ° (c = 0.5, MeOH)
Elemental analysis Calcd for C ₁₅ H ₁₉ NO _Ten S: C, 44.44; H, 4.72; N, 3.46. Found: C, 44.65; H, 4.84; N, 3.37.
FAB-MS m / z: 406 (M ⁺ +1), 428 (M ⁺ + Na)
IRν _max (cm ^-1 ): 3400, 1705, 1600, 1590, 1510.
¹ H-NMR (D ₂ O) δ: 1.92 (dd, 1H, J = 11.0, 12.5 Hz, 3-Hax), 2.86 (dd, 1H, J = 4.5, 12.5 Hz, 3-Heq), 3.50 (dd, 1H, J = 1.5, 9.5 Hz, 6-H), 3.59 (dd, 1H, J = 8.5, 9.5 Hz, 5-H), 3.63 (dd, 1H, J = 6.0, 11.5 Hz, 9-H), 3.64 (ddd, 1H, J = 4.5, 8.5, 11.0 Hz, 4-H), 3.75 (ddd, 1H, J = 2.5, 6.0, 9.0 Hz, 8-H), 3.82 (dd, 1H, J = 1.5, 9.0 Hz, 7-H ), 3.85 (dd, 1H, J = 2.5, 11.5 Hz, 9-H '), 7.79 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 4-nitrophenyl group), 8.22 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 4-nitrophenyl group).
[0090]
(3) 4-Aminophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D (4-Aminophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D) -glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid) (Compound 7)
Compound 6 (0.41 g, 1 mmol) was dissolved in methanol (50 ml), 5% palladium-carbon (Pd-C) (1 g) was added, and the mixture was stirred in a hydrogen stream at room temperature for 6 hours. The reaction solution was filtered, and the residue was washed with methanol. The filtrate and the washing solution were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain a powder. The obtained powder was purified using LH-20 gel (Pharmacia Biotech) (solvent: MeOH) to obtain Compound 7 (0.34 g, 90%) as a pale orange powder.
[0091]
[α] _D -5.8 ° (c = 0.5, MeOH)
Elemental analysis Calcd for C ₁₅ H _{twenty one} NO ₈ S: C, 47.99; H, 5.64; N, 3.73. Found: C, 47.67; H, 5.84; N, 3.67.
FAB-MS m / z: 376 (M ⁺ +1), 398 (M ⁺ + Na)
IRν _max (cm ^-1 ): 3300, 1605, 1595, 1500.
¹ H-NMR (D ₂ O) δ: 1.9 (dd, 1H, J = 13.0, 11.5 Hz, 3-Hax), 2.82 (dd, 1H, J = 4.5, 13.0 Hz, 3-Heq), 3.41 (dd, 1H, J = 2.0, 9.5 Hz, 6-H), 3.57 (dd, 1H, J = 9.0, 9.5 Hz, 5-H), 3.57 (dd, 1H, J = 6.5, 11.5 Hz, 9-H), 3.62 (ddd, 1H, J = 4.5, 9.0, 11.5 Hz, 4-H), 3.69 (ddd, 1H, J = 2.5, 6.5, 8.5 Hz, 8-H), 3.78 (dd, 1H, J = 2.0, 8.5 Hz, 7-H ), 3.81 (dd, 1H, J = 2.5, 11.5 Hz, 9-H '), 7.42 (d, 2H, J = 8.5 Hz, 4-nitrophenyl group), 7.69 (d, 2H, J = 8.5 Hz, 4-nitrophenyl group).
¹³ C-NMR (D ₂ O) δ: 41.90 (C-3), 65.36 (C-9), 70.39 (C-7), 72.02 (C-5), 72.70 (C-4), 74.95 (C-8), 78.98 (C- 6), 89.24 (C-2), 174.33 (C-1), 126.25 (C-2 ', 6'), 140.63 (C-3 ', 5'), 132.44 (C-1 '), 134.49 (C -Four').
[0092]
[Example 2]
Preparation of insoluble carrier bound with KDNα2-S-4AP and purification of KDNase Sm by affinity chromatography using insoluble carrier bound with KDNα2-S-4AP
(1) Creating an affinity column
Epoxy-activated Sepharose 6B (Pharmacia Biotech) lyophilized powder 1.0 g was swollen with deionized water and then washed with 200 ml or more of deionized water using a glass filter. 1.0 g of lyophilized powder swells to approximately 3.5 ml of gel. Measure 210 μmol of KDNα2-S-4AP as a ligand in a 2.0 ml assist tube and add 0.6 M NaHCO _Three Dissolved in 1.2 ml. 0.6 ml of swollen gel was added thereto and stirred well at 25 ° C. (20 ° C. to 45 ° C.) for 17.5 hours (overnight). After stirring, pack into a 2.5 ml syringe (TERUMO) and add 0.4 M NaHCO _Three To remove excess ligand. The solvent was replaced with 1 M ethanolamine (pH 8.0) for blocking active groups, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours. Next, 0.5 M NaCl / 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) and 0.5 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) were alternately and repeatedly flowed three times for washing. As a result, an affinity column (0.9 × 1.2 cm) packed with an insoluble carrier to which KDNα2-S-4AP was bound was prepared.
[0093]
(2) Binding and elution of KDNase Sm to affinity column
The KDNase crude fraction was obtained by extraction from S. multivorum cells by osmotic shock. Specifically, cells of S. multivorum (wet weight 8g) were suspended in ice-cooled 0.03 M NaCl / 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) and centrifuged (13,000 × g, 20 minutes). And washed. 10 times the cell weight (in this case, 80 ml) of 0.033 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) is added to the sediment and suspended, and then the cell weight is 10 Double volume of 40% sucrose / 0.033 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) and 0.0001 volume of 0.1 M EDTA disodium salt were added and shaken at room temperature for 10 minutes. Centrifugation (13,000 xg, 10 minutes) collects the cells, and 20 ml of ice-cold 1 mM magnesium acetate (adjusted to pH 7.1) is added to the initial cell weight and stirred gently for 10 minutes. did. Furthermore, 2 volumes of ice-cold 1 M NaCl / 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) was added and centrifuged (13,000 × g, 30 minutes) to obtain a supernatant, which was used as a crude KDNase fraction. .
[0094]
Apply 0.5 ml (2.6 units) of KDNase crude fraction to the affinity column prepared in Example 2 (above (1)), and add 1 mM Mg (CH _Three COO) ₂ After washing with /0.1 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1), 1 mM Mg (CH _Three COO) ₂ Elution was carried out with /0.5 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1), and 500 μl of each 4 bottles (total 2.0 ml for each buffer) were collected.
Using 20 μl of each fractionated fraction, KDNase activity was measured by a method using 4-methylumbelliferyl KDN described in International Publication Pamphlet No. WO96 / 00781. Furthermore, 400 μl of this fraction was concentrated to 20 μl with microcon 10 (Amicon Inc.) and subjected to SDS-PAGE. The protein was detected by staining this with CBB.
[0095]
The results are shown in FIGS. In fraction number 4, the washing solution was changed to the eluate. KDNase activity was confirmed in fractions eluted with 0.5 M NaCl (fractions 5 and 6). In fraction numbers 5 and 6, a band with an estimated molecular weight of about 50 KDa of KDNase Sm was found by CBB staining, and only a few other protein bands were confirmed, so that KDN was specifically recognized. The column is considered to hold the substance efficiently.
[0096]
J. Biol. Chem., 269, 21415-21419, 1994 reported results on purification of KDNase Sm, including affinity chromatography using a glycopeptide containing KDN-OS (KDN oligosaccharide alcohol) as an affinity ligand. ing. In this report, affinity chromatography was used at the stage of further purification, and the increase in specific activity was 60 times in this affinity chromatography step and 173 times as a whole. The specific activity after this step was 127 units / mg protein. In this example, starting from a fraction after osmotic shock, which is a cruder purification, the specific activity increases up to 1,450 units / mg protein in a single purification, and the effectiveness of this method is clear.
[0097]
This affinity column gave the same result even when used repeatedly, and was stable to repeated use.
[0098]
[Example 3]
Purification of KDNase Sm by combination of affinity chromatography using an insoluble carrier bound to KDNα2-S-4AP and other chromatography
(a) Preparation of crude fraction of KDNase
[0099]
After inducing S. multivorum with KDN-OS (Nishino et al., J. Biol. Chem. 271, 2909, 1996), the cells obtained were washed, and then 0.1 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) was added to make a suspension of 5 g / 30 ml. Next, using an ultrasonic generator (INSONATOR 201 type, Kubota Corporation), ultrasonic treatment (100 W, 3 to 5 minutes) was performed under ice cooling. This treatment solution was centrifuged at 13,000 × g for 60 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was concentrated by ultrafiltration to make a liquid volume of 60 ml.
[0100]
(b) DEAE-Toyopearl 650M chromatography
The crude fraction (60 ml, 4,500 units) obtained in (a) was added to a DEAE-Toyopearl column (2.4 × 24 cm, 109 ml, manufactured by Tosoh; 0.1 M NaCl-0.25% sucrose-20 mM Tris-HCl buffer ( The fraction that passed through without being retained on the column was collected and dialyzed against 0.1 M NaCl-0.25% sucrose-20 mM Tris-acetate buffer (pH 6.0). The yield was 3,500 units (17 ml).
[0101]
(c) CM-Toyopearl 650M chromatography
The fraction obtained in (b) was CM-Toyopearl 650M column (2.4 × 23.8 cm, 108 ml, manufactured by Tosoh; equilibrated with 0.1 M NaCl-0.25% sucrose-20 mM Tris-acetate buffer (pH 6.0)) And then eluted with a salt gradient from 0 to 1 M NaCl in 0.1 M NaCl-0.25% sucrose-20 mM Tris-acetate buffer (pH 6.0). The activity of the eluted fractions was measured and active fractions were pooled and concentrated by ultrafiltration. The yield was 3,500 units (17 ml).
[0102]
(d) Phenyl Sepharose column chromatography
The concentrated KDNase-active fraction obtained in (c) was dialyzed against 3 M NaCl / 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.1), and then a phenyl sepharose column (1.6 × 20.3 cm, 41 ml, manufactured by Pharmacia) ) And eluted with a linear salt gradient from 3 M to 0 M NaCl in 400 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.1). The eluate was fractionated and activity was measured, and fractions having activity were collected and concentrated by ultrafiltration. The solvent was replaced with 0.1 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1) by ultrafiltration to 2 ml. The yield was 2,530 units.
[0103]
(e) Preparation of affinity column with KDN thioglycoside as ligand and affinity chromatography using the same
To 800 μmol (4 ml) of KDNα2-S-4AP, 4.5 ml of epoxy-activated Sepharose 6B gel was added and stirred at room temperature for 20 hours. Pack the 3 ml gel into a column and add 0.4 M NaHCO _Three Then, the solvent was replaced with 1 M ethanolamine (pH 8.0), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 16 hours. The column was washed by repeatedly flowing 0.5 M NaCl / 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.0) and 0.5 M NaCl / 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) three times alternately.
[0104]
Place 25.8 units (60 μl) of the KDNase active fraction prepared in (d) on a column, and then first add 0.1 M NaCl / 1 mM Mg (CH _Three COO) ₂ After washing with 21 ml of 0.1 M Tris-HCl (pH 7.1), 0.5 M NaCl / 1 mM Mg (CH _Three COO) ₂ Elution was performed by flowing 12 ml of /0.1 M Tris-HCl (pH 7.1). The washing solution and the eluent were collected in 3 ml portions. About each fraction, KDNase activity was measured by the method using 4-methylumbelliferyl KDN as described in international publication pamphlet WO96 / 00781. The results are shown in FIG. 21 units were collected in 8-10 fractions, 81% of the amount on the column. From this, the capacity of KDNase binding of the column was calculated as 7 units / ml since it was 21 units / 3 ml. In addition, from the analysis of SDS-PAGE / silver staining of the eluted fraction, only the band of about 60K was eluted out of the bands of about 134K, about 108K, about 60K and about 42K that were observed before being loaded on the column. Found in the active fraction. This band was detected as a single band by SDS-PAGE / silver staining and judged to be purified KDNase.
[0105]
【The invention's effect】
Deaminoneuraminic acid derivatives useful for producing an insoluble carrier useful for purification and detection of deaminoneuraminic acid binding substances such as deaminoneuraminidase are provided. Also provided are an insoluble carrier to which the deaminoneuraminic acid derivative is bound, and a method for purifying and detecting a deaminoneuraminic acid binding substance using the insoluble carrier.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the KDNase activity of the eluted fraction obtained by affinity chromatography in Example 2. Vo is the excluded volume, and Vt is the bed capacity.
FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE analysis of the eluted fraction obtained by affinity chromatography in Example 2.
FIG. 3 shows the KDNase activity of the eluted fraction obtained by affinity chromatography in Example 3.

Claims (1)

A method for purifying deaminoneuraminidase comprising at least the following steps (A) and (B).
(A) A solution containing deaminoneuraminidase is brought into contact with an insoluble carrier in which a deaminoneuraminic acid derivative represented by the following formula is bound at its amino group, and deaminoneuraminidase is specifically bound to the insoluble carrier. Process.
(B) A step of eluting deaminoneuraminidase bound to the insoluble carrier .
[Chemical formula 1]

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