JP4477506B2

JP4477506B2 - Peptide and pharmaceutical composition containing the same

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Publication number: JP4477506B2
Application number: JP2004555011A
Authority: JP
Inventors: 誠良尾上; 広介遠藤; 麻美松本
Original assignee: ILS Inc
Current assignee: ILS Inc
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: WO2004048401A1; ATE521624T1; CA2507616A1; EP1571155A1; AU2003284428B2; EP1571155B1; JPWO2004048401A1; US20060276384A1; US7332473B2; AU2003284428A1; KR20050067439A; ES2368565T3; CN100381462C; CN1732182A; EP1571155A4

Abstract

This invention provides a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a peptide derived from a PACAP or VIP peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof. This invention provides a PACAP/VIP derivative that can inhibit tautomerization in a solution and that can be applied to clinical applications over a long period of time. Such peptides are useful for ameliorating symptoms of diseases, such as regressive neurodegenerative diseases, erectile dysfunction, and bronchial asthma.

Description

本発明は、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体の製造過程、保存時、そして生体内において異性化反応が抑制され安定性の高いペプチド誘導体に関する。 The present invention relates to a peptide derivative having high stability in which the isomerization reaction is suppressed in the production process, storage, and in vivo of the PACAP / VIP derivative.

ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド；ＶｏｓｏａｃｔｉｖｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＰｅｐｔｉｄｅ）は、脳−腸管ペプチドと呼ばれ、血流促進、血圧低下作用をもつ生理活性ペプチドの一種である。このＶＩＰは、ブタ腸管から抽出されており、２８個のアミノ酸残基からなる（例えば非特許文献１参照）。一方、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド；ＰｉｔｕｉｔａｒｙＡｄｅｎｙｌａｔｅＣｙｃｌａｓｅＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、羊の視床下部から下垂体培養細胞のアデニル酸シクラーゼを活性化させるバイオアッセイ系を指標にして単離され構造決定された３８個のアミノ酸残基よりなるペプチドであり、ＰＡＣＡＰ３８と、ＰＡＣＡＰ２７の２種類がある（例えば非特許文献２参照）。このＰＡＣＡＰのＮ末端側から２７個のアミノ酸配列はＶＩＰと極めて類似した構造を有している。また、ＶＩＰとＰＡＣＡＰのアミノ酸配列は、セクレチン、グルカゴン等に類似していることから、グルカゴン−セクレチンスーパーファミリーに属するペプチドとされている。これらＰＡＣＡＰおよびＶＩＰはＰＡＣＡＰ／ＶＩＰレセプターを介してその生理作用を示すが、このＰＡＣＡＰ／ＶＩＰレセプターは生体内において広い分布を示し、それ故ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰは多くの生理活性を有することが報告されている。例えば、抗喘息作用（特許文献１）、血圧低下作用（特許文献２）、増毛作用（特許文献３）、インポテンツ改善作用（特許文献４）、膣潤滑誘発作用（特許文献５）、胃腸管蠕動運動抑制作用（特許文献６）、神経変性疾患・低酸素症・記憶能力低下改善作用（特許文献７）、皮膚潰瘍治療作用（特許文献８）、ニューロンネットワーク形成促進（特許文献９）、コンフォメーション病改善薬（非特許文献３）などである。これらの生理作用を考慮すれば医薬応用の可能性は非常に大きいものと考えられるが、ＰＡＣＡＰやＶＩＰ等の生理活性ペプチドは概して不安定であり、特に生体内においては速やかな代謝を受けるためにその作用継続時間は非常に短いものである。そこで本発明者らは先に、酵素耐性を新規機能として保持させたＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体を創製し（特許文献１０）、実際にこれらがトリプシン等生体内ペプチダーゼによる代謝に対して優れていること（非特許文献４参照）、さらには気管支拡張作用を指標としてこれらの誘導体が著しい薬効持続作用を有することを明らかにした（非特許文献５及び６を参照）。従って、この長時間作動型ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体は医薬応用において極めて有用なものと考えられ、特に先述の各種生理・薬理作用を目的とした薬剤の有力な候補として考えられた。しかしながら、生物化学的には安定であることを確認したＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体は、製剤学的な安定性、特に溶液状態における長期安定性において大きな問題が起こりうることが今回初めて明らかとなり、これら著しい減成はＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ類の活性減退、もしくは生成する不純物による予期せぬ副作用等が強く懸念されるところである。ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ類の生理・薬理作用を考慮すれば、これらの薬剤は単回投与に終わることはまずあり得ず、臨床使用において長期にわたって投与し続ける必要性をもった薬剤となることは推測するに容易である。それ故、この安定性の諸問題から生じる副反応物の生成は殊更に重大な問題と考えられる。
特開平８−３３３２７６号公報特開昭６３−１７９８９４号公報特開平０１−８３０１２号公報特開平０１−１９０９７号公報特表平０１−５０１９３７号公報特表平０６−５０７４１５号公報特開平０７−６９９１９号公報特開平０８−４０９２６号公報特開２００１−２２６２８４号公報特開平８−３３３２７６号公報サイド（Ｓ．Ｉ．Ｓａｉｄ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）１９７０年１６９巻ｐ．１２１７宮田（Ａ．Ｍｉｙａｔａ）ら、「バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」（米国）１９８９年１６４巻ｐ．５６７尾上（Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．）ら、「フェブスレターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ）」（オランダ）２００２年５２２巻ｐ．６５−ｐ．７０樫本（Ｋａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．）ら、「ペプチドケミストリー（ＰｅｐｔｉｄｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」１９９６年１９９７巻ｐ．２４９−ｐ．２５２吉原（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．）ら、「ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」（米国）１９９８年１９巻ｐ．５９３−ｐ．５９７吉原（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．）ら、「ブリティッシュジャーナルオブファーマコロジー（ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」１９９７年１２１巻ｐ．１７３０−ｐ．１７３４ VIP (vasoactive intestinal peptide) is called brain-intestinal peptide, and is a kind of physiologically active peptide having blood flow promotion and blood pressure lowering effects. This VIP is extracted from the porcine intestinal tract and consists of 28 amino acid residues (see Non-Patent Document 1, for example). On the other hand, PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide) is isolated from sheep hypothalamus using a bioassay system that activates adenylate cyclase in pituitary cultured cells as an index. There are two types of peptides consisting of the determined 38 amino acid residues, PACAP38 and PACAP27 (see Non-Patent Document 2, for example). The 27 amino acid sequence from the N-terminal side of PACAP has a structure very similar to VIP. Moreover, since the amino acid sequences of VIP and PACAP are similar to secretin, glucagon and the like, they are considered to be peptides belonging to the glucagon-secretin superfamily. Although these PACAPs and VIPs exhibit their physiological actions via PACAP / VIP receptors, these PACAP / VIP receptors have a wide distribution in vivo, and therefore PACAP / VIP has been reported to have many physiological activities. Yes. For example, anti-asthma action (Patent Document 1), blood pressure lowering action (Patent Document 2), hair thickening action (Patent Document 3), impotence improving action (Patent Document 4), vaginal lubrication inducing action (Patent Document 5), gastrointestinal peristalsis Movement inhibitory action (Patent Document 6), neurodegenerative disease / hypoxia / memory ability reduction action (Patent Document 7), skin ulcer treatment action (Patent Document 8), promotion of neuron network formation (Patent Document 9), conformation Disease improving drug (Non-patent Document 3). Considering these physiological actions, the potential for pharmaceutical application is considered to be very large, but physiologically active peptides such as PACAP and VIP are generally unstable, and in particular because they undergo rapid metabolism in vivo. Its duration of action is very short. Therefore, the present inventors first created a PACAP / VIP derivative that preserves enzyme resistance as a new function (Patent Document 10), and actually these are excellent for metabolism by in vivo peptidases such as trypsin ( It was clarified that these derivatives have a remarkable effect of sustained drug efficacy using bronchodilating action as an index (see Non-Patent Documents 5 and 6). Therefore, this long-acting PACAP / VIP derivative is considered to be extremely useful in pharmaceutical applications, and in particular, it was considered as a promising candidate for the aforementioned various physiological and pharmacological actions. However, it has been revealed for the first time that PACAP / VIP derivatives that have been confirmed to be biochemically stable can cause significant problems in pharmaceutical stability, particularly long-term stability in solution. There is a strong concern about the decrease in the activity of PACAP / VIPs or unexpected side effects due to impurities generated. Given the physiological and pharmacological effects of PACAP / VIPs, these drugs are unlikely to end in a single dose, and are expected to be drugs that need to be administered over a long period in clinical use. Easy to. Therefore, the formation of by-products from this stability problem is considered a particularly serious problem.
JP-A-8-333276 JP-A 63-179894 Japanese Patent Laid-Open No. 01-83012 Japanese Unexamined Patent Publication No. 01-19097 Japanese translation of PCT publication No. 01-501937 Japanese Translation of National Publication No. 06-507415 Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-69919 Japanese Patent Laid-Open No. 08-40926 JP 2001-226284 A JP-A-8-333276 S. I. Said, et al., “Science” (USA) 1970, volume 169, p. 1217 A. Miyata et al., “Biochemical and biophysical research communications” (USA) 1989, 164, p. 567 Onoue, S. et al., “FEBS Letters” (Netherlands) 2002, 522, p. 65-p. 70 Kashimoto, K. et al., “Peptide Chemistry”, 1996, 1997, p. 249-p. 252 Yoshihara, S. et al., “Peptides” (USA) 1998, 19 p. 593-p. 597 Yoshihara, S. et al., “British Journal of Pharmacology” 1997, vol. 121, p. 1730-p. 1734

従って、本発明は、安定性に富み、臨床上安全に使用できるＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体からなる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰおよびその誘導体ペプチドの溶液中における不安定に寄与する要因について鋭意研究を重ねた結果、幾つかの配列において異性化反応が起こり、臨床的に医薬組成物の有効成分として使用するには好適でないことを見出した。この異性化反応はアスパラギン酸やグルタミン酸等の酸性アミノ酸やそのアミド体であるアスパラギンおよびグルタミンに特徴的なものであり、これらアミノ酸を含むペプチド・蛋白質は隣接するアミノ酸構成によって、酸性や塩基性条件でスクシンイミドやグルタル酸イミドを副生しやすいことが報告されている（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｅｓ．，１９７８，１２，６９；泉屋信夫ら，「ペプチド合成の基礎と実験」丸善，７１−７２）。この反応はアミノ酸側鎖をベンジルエステルなどで保護している場合に、側鎖が遊離している場合よりも副反応の起こる傾向が大きい。特にアスパルチルペプチドは不安定で、中性でもイミドを形成することがある。また、ペプチド中においてアスパラギン酸およびアスパラギンの次にグリシン、セリン、スレオニンあるいはヒスチジンが存在すると特に不安定である。ＶＩＰの場合は２４，２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ配列が特に異性化が起こりやすく、酵素耐性ＶＩＰ誘導体であるペプチド４は、２４，２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ配列に加えて、２８，２９位のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列においても同様の異性化が起こると考えられる。また、Ｋｉｔａｄａらの報告（ＰｅｐｔｉｄｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９０，１９９１，２３９−２４４）によれば、ＶＩＰおよびその関連誘導体の８，９位のＡｓｐ−Ａｓｎ配列も容易にスクシンイミドを形成することが報告されている。さらに、ＰＡＣＡＰの場合においても、その３，４位のＡｓｐ−Ｇｌｙ配列はスクシンイミドを形成する可能性を有しており、溶液中における安定性が非常に問題となるところである。
そこで、本発明者らは、これらの配列に注目してより安定なアミノ酸配列に置換することによって、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチドとしての生理活性を有し、かつより安定な化合物群を創製することを試みた。
まず、本発明者らの先の報告（Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１９９９，２０，２１９−２３１；Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００１，２２，８６７−８７２；Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｒｅｖ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，１２，１−９）によれば、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰが作用を発現するために必須なＰＡＣＡＰ／ＶＩＰレセプターとの結合に関して、この受容体特異認識性に大きく寄与するのはそのＮ末端構造である。この概念に従って、
（ｉ）ＶＩＰの不安定要因配列２４，２５位をＰＡＣＡＰの安定配列２４，２５位に置換した。
加えて、本発明者が先に見出した（Ｎａｇａｎｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ２００１２００２，１４７−１５０）、ＶＩＰの２８位Ａｓｎ残基は活性に寄与しないという事実から、
（ｉｉ）ペプチド４（天然型ＶＩＰに対してＡｒｇ残基含量を増すよう改変したペプチド）の２８位を削除し、Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列による異性化の危険性を排除した。
ＶＩＰの１７位Ｍｅｔは生体内あるいはその製造工程中において速やかな代謝を受けてメチオニンスルホキシドとなり、活性に大きな影響を与えるので、
（ｉｉｉ）１７位ＭｅｔはＬｅｕまたはＮｌｅに置換する。
また、ＶＩＰにおける８位のＡｓｐを、異性化の危険性がＡｓｐよりも少ないＧｌｕ、またはＡｌａに置換した化合物も作製した。ＶＩＰの８位をＡｌａに置換した場合、そのレセプター結合活性が向上することが報告されており（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２００２，３７−５０）、誘導体の安定化と高活性の両者が期待できる。
尚、ＶＩＰの活性最小単位は２３残基であることが本発明者らによって報告されており（Ｎａｇａｎｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ２００１，２００２，１４７−１５０）、上記アミノ酸置換を施したＶＩＰ誘導体に関してＮ末端より少なくとも２３残基以上保持していればＶＩＰの生理活性が期待できる。
また、ＰＡＣＡＰの３，４位によるスクシニルペプチド形成を阻害するために
（ｉｖ）４位のＧｌｙ残基をＶＩＰの同位置アミノ酸に相当するＡｌａ残基に置換することにより、安定化を図ることができる。この置換はＰＡＣＡＰ２７（ペプチド２）のみならず、ＰＡＣＡＰ３８（ペプチド３）、ペプチド５（ＰＡＣＡＰ３０）、そしてペプチド６（ＰＡＣＡＰ３８に対してＡｒｇ残基含量を増すよう改変したペプチド）のようなＰＡＣＡＰ関連ペプチドの安定化に対しても有効である。
ＡＰＣＡＰの最小活性単位はＶＩＰと同様Ｎ末端より２３残基であることが公知の事実となっており（Ｋｉｔａｄａ，Ｃ．ｅｔａｌ．，ＰｅｐｔｉｄｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９０，１９９１，２３９−２４４）、上記ＰＡＣＡＰ誘導体群についてもＮ末端より２３残基以上あればＰＡＣＡＰの生理・薬理効果が期待できる。
上記観点から本発明者らは多数のペプチドを合成し、天然型ＶＩＰ及びＰＡＣＡＰと同様、またはそれ以上の高い生理活性を有すると共に、高い安定性を有するペプチドを見出すに到った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）下記式（Ｉ）：
（式中、Ａは、ＶａｌまたはＩｌｅ；Ｂは、Ａｓｐ，ＧｌｕまたはＡｌａ；Ｃは、ＡｓｎまたはＳｅｒ；Ｄは、ＴｈｒまたはＳｅｒ；Ｅは、ＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｆ，Ｈ，ＩはＬｙｓまたはＡｒｇ；Ｇは、ＬｅｕまたはｎＬｅｕ；Ｊは、Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｋは、Ｌｅｕ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ；ＬはＣ末端アミノ酸のα位カルボキシル基修飾を表し、−ＮＨ_２あるいは−ＯＨを示す。）
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
（２）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、Ｌが−ＮＨ_２であり、Ｎ末端より２３残基のアミノ酸から構成される上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド１０（配列番号１１）に相当する。
（３）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ_２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド１２（配列番号１３）に相当する。
（４）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＧｌｕ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ_２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２１（配列番号２２）に相当する。
（５）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｌａ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ_２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２３（配列番号２４）に相当する。
（６）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ_２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２５（配列番号２６）に相当する。
（７）一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ_２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２６（配列番号２７）に相当する。
（８）一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ_２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２９（配列番号３０）に相当する。
（９）一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、Ｌが−ＮＨ_２であり、Ｎ末端より２３残基のアミノ酸から構成される上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド３１（配列番号３２）に相当する。
上記ペプチド１０，１２，２１，２３，２５，２６，２９，３１は、いずれも上記の（ｉ）〜（ｉｖ）の改変を行ったペプチドであり、ペプチド２１及び２３は更に８位のアミノ酸がＧｌｕ、またはＡｌａとなっている。
（１０）上記（１）〜（９）のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物。
（１１）上記（１）〜（９）のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩の含有量が有効成分としての生理活性ペプチド全体の５０重量％以上である、上記（１０）に記載の医薬組成物。
ここで、「有効成分」とは、医薬組成物において被験者の疾患、症状または状態を治療、予防、変化または緩和させることを目的として被験者に対する作用を有するものとして含有させるものである。また、「生理活性ペプチド」とは、上記被験者に対して生理活性を有するペプチドのことであり、本明細書では特にＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチド、その塩、及び誘導体を包含する。また、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチドとは、ヒト及び動物の天然型ＰＡＣＡＰまたはＶＩＰ、及びこれらと類似のアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＰＡＣＡＰまたはＶＩＰと同様の生理活性を有するペプチドのことをいい、グルカゴン−セクレチンファミリーに属するペプチドが包含される。
（１２）脳塞栓症および脳血栓症を含む虚血性脳血管障害、中枢あるいは末梢神経に毒性をもたらす疾患、脳血管虚血、血栓症、コンフォメーション病、神経変性疾患、脱毛、男性不能症、痴呆症、腎不全、視神経萎縮、虚血性視神経症を含む視神経変性疾患および網膜変性疾患からなる群から構成される１種以上の疾患または症状の治療または予防のための、または血流改善、気管支平滑筋弛緩若しくは胃腸管運動抑制のための、上記（１０）または（１１）に記載の医薬組成物。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の高安定性ペプチド誘導体は、具体的には一般式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、それに含まれるペプチドの代表例を表１に示した。ここに示したペプチド１０〜３２は、後記配列表の配列番号１１〜３３に対応するペプチドである。ただし、ペプチド１０，２２，２４，３１，３２はＮ末端より２３残基に相当するペプチドであり、ペプチド１３，２８，３２はＮ末端アミノ基にアセチル基が、そしてペプチド１４のＮ末端アミノ基にはステアリル基が結合している。ペプチド３３（配列番号３４）は４番目のアミノ酸がグリシンである以外はペプチド３１（配列番号３２）と同じアミノ酸配列を有する２３残基のペプチドである。
上記ペプチドは、使用の際にはそのＮ末端に極性物質または非極性物質（脂肪酸、アシル基等）を結合させて分子の極性を変化させたり、ポリエチレングリコール、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸等）の高分子を結合させて酵素耐性を増強したり、リポソーム基質に結合させてリポソームに封入したり、あるいは脂質膜表面に固定することもできる。アシル基の導入は、その活性の向上のみならず、自己凝集を抑制することが当業者間で知られている。
本発明のペプチドは、蒸留水や緩衝液等の水性溶液中における安定性が非常に高いことが確認された。例えば本発明のペプチドは、ｐＨ６．０及び７．０に調製した溶液中で４０℃で１週間保存した場合、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上の残存率で存在し得る。また、ｐＨ６．０及び７．０に調製した溶液中で５５℃で３日間保存した場合は、８５％以上、好ましくは９０％以上の残存率で存在し得る。本発明において、特に好ましいペプチドは、ペプチド１０，１２，２１，２３，２５，２６，２９，及び３１である。
本発明の神経突起誘発剤に使用するペプチドは、特に限定するものではないが、公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド（ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻（１９６６年）［ＳｃｈｒｅｄｅｒａｎｄＬｕｈｋｅ著、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．］、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）］の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。
本発明においてペプチド合成は、上記のような一般的なポリペプチドの合成法に従って、例えば末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワイズ法によって、または数個のフラグメントに分けてカップリングさせていく方法により行われる。
例えばステップワイズ法による固相合成は、具体的には、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ．Ｒ．Ｂ．）の方法［Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９−２１５９（１９６３）］に従い、以下のようにして行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従って、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂からはずす。
上記の固相合成において用いられる不溶性樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するものであればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げられる。
また、α−アミノ基の保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）を使用する場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂など、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって樹脂から脱離できるものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を使用する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂から脱離できるものがよい。樹脂１ｇ当りペプチド濃度は０．５ｍｍｏｌｅ以下とすることが好ましい。
上記の方法においては、アミノ酸のペプチド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に関与するカルボキシル基の活性化が必要である。
アミノ基の保護基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフイノチオイルなどの基が挙げられる。
また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有するもの、例えばＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＳｅｒは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。官能基の保護は、通常用いられている方法で、下記のような通常の保護基を結合させることにより行われ、反応終了後、該保護基は脱離される。
Ｈｉｓのイミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられる。
Ｓｅｒ及びＴｈｒの水酸基は、例えばエステル化またはエーテル化によって保護することができるが、この保護は必須ではない。エステル化に適する基としては、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。
Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えばベンジル（Ｂｚｌ）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アセチル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
Ｌｙｓのアミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
Ａｒｇのグアニジノ基の保護基としては、例えばｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）基などが挙げられる。
Ａｓｐのカルボキシル基の保護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、シクロヘキシル（ｃＨｅｘ）などによるエステル化により行われる。
その他のアミノ酸の保護基として、Ｔｒｐのインドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カルボベンゾキシル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。
Ｍｅｔのチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は必須ではない。
一方、カルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公知のものから適宜選択し得る。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）などを形成させることにより行う。
上記の固相における反応性アミノ基と反応性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用できるものであればいずれでもよい。例えば無水または含水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）などを単独で、あるいは２種以上の混合溶媒として使用することができる。
また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（ＤＣＣ）、カルボジイミダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Ｂｏｐ試薬）などの存在下に行うこともできる。
合成されたペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、セファデックスＧ−２５などの分配クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
上記のようにして精製したペプチドは、各種の酸を用いて、所望により薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、塩酸塩、リン酸塩等にすることができる。
上記ペプチドまたはその塩は、医薬的に許容できる溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、注射剤、錠剤、散剤、顆粒剤、坐剤、腸溶剤、点鼻剤、吸入経肺剤、口腔吸収剤、カプセル剤、点眼剤，軟膏，経皮吸収剤，徐放製剤，およびその他のドラッグデリバリーシステムなどの医薬組成物として調製する。
本発明のペプチドまたはその塩は、従来公知のＰＡＣＡＰ／ＶＩＰと同様の生理作用を有するものであり、同様にして使用することができる。また、上記ペプチドおよびその塩は、神経突起誘発作用を有するので神経突起誘発剤として有用であり、当該製剤は、各種疾病、具体的には、アルツハイマー型痴呆症、パーキンソン病、神経細胞死、神経芽腫、健忘症などの、神経細胞の変性を伴う疾患の予防・治療、ならびに神経系に障害を与える薬物に対する防御に有効である。さらに、該ペプチドの気管支拡張作用により抗喘息作用として、また内視鏡検査時に用いる胃蠕動運動抑制剤としても有用である。また、本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬組成物は、例えば、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰと同様、脳塞栓症や脳血栓症を含む虚血性脳血管障害、これに伴う／またはその他の原因による脳あるいは末梢の神経脱落、コンフォメーション病、神経変性疾患、脱毛、男性不能症、痴呆症、腎不全、視神経萎縮、虚血性視神経症を含む視神経変性疾患および網膜変性疾患からなる群から構成される１種以上の疾患または症状の治療または予防のために使用することができ、また、血流改善、気管支平滑筋弛緩若しくは胃腸管運動抑制のために使用することもできるが、用途は特に限定されるものではない。尚、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチドがコンフォメーション病を発症し得る特定のタンパク質に対して神経保護作用を有することは、本発明者らが先に見出している（特願２００１−３８６６９９号）。
本発明の医薬組成物は、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に、さらには点鼻剤、吸入剤、徐放製剤、点眼剤、軟膏，経皮吸収剤，徐放製剤，口腔吸収剤等ドラッグデリバリーシステムを必要に応じて用いて、安全に投与することができる。実際には、患者の疾患の種類、期待する効果、および患者の全身状態等に応じて、適切な投与方法、投与する剤形、投与頻度等は、担当医師等の専門家により決定され得る。ここで使用する投与デバイスとして、点鼻剤では、ジェットライザー、パブライザーやネーザルインサフレーター、吸入剤では、スピンヘラー、イーヘラー、ＦｌｏｗＣａｐｓ、ジェットヘラー、デスクヘラー、ローターヘラー、ターブヘラー、イージーヘラー、アキュヘラー、クリックヘラー、インスパイヤーイース、インハレーションエイト等があげられるが、これらに限定される物ではない。当該医薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場合、ペプチド量として１人１日当たり約１ｐｇ〜１ｍｇ／ｋｇ程度を適用することが例示される。その際、有効成分として、本発明のペプチドまたはその塩を、組成物中の生理活性ペプチドの５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、更に好ましくは９５重量％以上含有させる。このことは、生理活性ペプチドのうち、一般式（Ｉ）に含まれないペプチドを、組成物中に５０重量％未満、好ましくは２０重量％未満、特に好ましくは５重量％未満しか含有しないことを意味する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３４４５２３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a PACAP / VIP derivative that is rich in stability and can be used clinically safely.
As a result of intensive studies on the factors contributing to instability of PACAP / VIP and its derivative peptides in solution, the present inventors have conducted isomerization reactions in several sequences, and clinically effective pharmaceutical compositions are effective. It has been found that it is not suitable for use as an ingredient. This isomerization reaction is characteristic of acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid and their amides, asparagine and glutamine. Peptides and proteins containing these amino acids can be used under acidic or basic conditions depending on the adjacent amino acid composition. It is reported that succinimide and glutaric imide are easily produced as by-products (Bodanzky, M. et al., Int. J. Pept. Protein. Res., 1978, 12, 69; “Izumiya Nobuo et al.,“ Fundamentals and experiments "Maruzen, 71-72). In this reaction, when the amino acid side chain is protected with benzyl ester or the like, side reaction tends to occur more than when the side chain is free. In particular, aspartyl peptides are unstable and may form imides even when neutral. In addition, it is particularly unstable when glycine, serine, threonine or histidine is present after aspartic acid and asparagine in the peptide. In the case of VIP, the Asn-Ser sequence at positions 24 and 25 is particularly susceptible to isomerization, and peptide 4, which is an enzyme-resistant VIP derivative, has Asn at positions 28 and 29 in addition to the Asn-Ser sequence at positions 24 and 25. Similar isomerization is considered to occur in the -Gly sequence. Also, according to a report by Kitada et al. (Peptide Chemistry 1990, 1991, 239-244), it has been reported that Asp-Asn sequences at positions 8 and 9 of VIP and its related derivatives easily form succinimide. Further, even in the case of PACAP, the Asp-Gly sequence at the 3rd and 4th positions has a possibility of forming succinimide, and the stability in solution is a very problem.
Accordingly, the present inventors have attempted to create a more stable compound group having physiological activity as a PACAP / VIP peptide by paying attention to these sequences and substituting them with more stable amino acid sequences. It was.
First, our previous report (Onoue, S. et al., Biomed. Res., 1999, 20, 219-231; Onoue, S. et al., Peptides, 2001, 22, 867-872; According to Onoue, S. et al., Pharmcol. Rev. Commun., 2002, 12, 1-9), this receptor for binding to the PACAP / VIP receptor essential for PACAP / VIP to exert its action. It is the N-terminal structure that greatly contributes to body-specific recognition. Following this concept,
(I) VIP unstable factor sequences 24 and 25 were replaced with PACAP stable sequences 24 and 25, respectively.
In addition, from the fact that the inventor previously found (Nagano, Y. et al., Peptide Science 2001 2002, 147-150), the Asn residue at position 28 of VIP does not contribute to activity.
(Ii) Position 28 of peptide 4 (a peptide modified to increase the Arg residue content with respect to native VIP) was deleted to eliminate the risk of isomerization by the Asn-Gly sequence.
VIP 17-position Met is rapidly metabolized in vivo or during its production process to become methionine sulfoxide, which greatly affects the activity.
(Iii) Met at position 17 is replaced with Leu or Nle.
In addition, a compound was also prepared in which Asp at position 8 in VIP was substituted with Glu or Ala, which has a lower risk of isomerization than Asp. It has been reported that when the position 8 of VIP is substituted with Ala, its receptor binding activity is improved (Igarashi, H. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 37-50). Both stabilization and high activity can be expected.
In addition, it has been reported by the present inventors that the smallest active unit of VIP is 23 residues (Nagano, Y. et al., Peptide Science 2001, 2002, 147-150), and the above amino acid substitution was performed. If the VIP derivative retains at least 23 residues from the N-terminal, the physiological activity of VIP can be expected.
In addition, in order to inhibit succinyl peptide formation at the 3rd and 4th positions of PACAP, (iv) the stabilization can be achieved by substituting the Gly residue at the 4th position with an Ala residue corresponding to the same position amino acid of VIP. it can. This substitution is not only for PACAP27 (peptide 2), but also for PACAP-related peptides such as PACAP38 (peptide 3), peptide 5 (PACAP30), and peptide 6 (peptides modified to increase Arg residue content relative to PACAP38). It is also effective for stabilization.
It is known that the minimum active unit of APCAP is 23 residues from the N-terminal as in VIP (Kitada, C. et al., Peptide Chemistry 1990, 1991, 239-244). As for the physiologic and pharmacological effects of PACAP, it can be expected that there are 23 residues or more from the N-terminal.
From the above viewpoint, the present inventors have synthesized a large number of peptides and have found peptides having high physiological activity similar to or higher than natural VIP and PACAP and high stability.
That is, the present invention provides the following inventions (1) to (12).
(1) The following formula (I):
(Where A is Val or Ile; B is Asp, Glu or Ala; C is Asn or Ser; D is Thr or Ser; E is Leu or Tyr; F, H, I is Lys or Arg. G is Leu or nLeu; J is Ile, Val; K is Leu, Leu-Asn, Leu-Gly, Leu-Gly-Lys, Leu-Gly-Arg, Leu-Gly-Lys-Lys, Leu-; Gly-Lys-Arg, Leu-Gl-Arg-Arg, Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys, Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg- Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg; L represents the α-position carboxyl group modification of the C-terminal amino acid, and —NH ₂ Or -OH is shown.)
A peptide consisting of at least 23 residues from the N-terminus, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(2) In the general formula (I), A is Val, B is Asp, C is Asn, D is Thr, E is Leu, F, H, I is Arg, G is Leu, and L is —NH ₂ . The peptide according to (1) above, which is composed of 23 amino acids from the N-terminus, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, the peptide corresponds to peptide 10 (SEQ ID NO: 11) described later.
(3) In general formula (I), A is Val, B is Asp, C is Asn, D is Thr, E is Leu, F, H, I is Arg, G is Leu, J is Ile, and K is Leu−. Gly-Arg-Arg, L is a peptide according to (1) a -NH ₂ or a pharmaceutically acceptable salt thereof,. Specifically, the peptide corresponds to peptide 12 (SEQ ID NO: 13) described later.
(4) In general formula (I), A is Val, B is Glu, C is Asn, D is Thr, E is Leu, F, H, I is Arg, G is Leu, J is Ile, and K is Leu−. Gly-Arg-Arg, L is a peptide according to (1) a -NH ₂ or a pharmaceutically acceptable salt thereof,. Specifically, the peptide corresponds to peptide 21 (SEQ ID NO: 22) described later.
(5) In general formula (I), A is Val, B is Ala, C is Asn, D is Thr, E is Leu, F, H, I is Arg, G is Leu, J is Ile, and K is Leu−. Gly-Arg-Arg, L is a peptide according to (1) a -NH ₂ or a pharmaceutically acceptable salt thereof,. Specifically, the peptide corresponds to peptide 23 (SEQ ID NO: 24) described later.
(6) In general formula (I), A is Val, B is Asp, C is Asn, D is Thr, E is Leu, F, H, I is Arg, G is Leu, J is Val, and K is Leu−. Gly-Arg-Arg, L is a peptide according to (1) a -NH ₂ or a pharmaceutically acceptable salt thereof,. Specifically, the peptide corresponds to peptide 25 (SEQ ID NO: 26) described later.
(7) In general formula (I), A is Ile, B is Asp, C is Ser, D is Ser, E is Tyr, F, H, I is Arg, G is Leu, J is Val, and K is Leu- Gly-Arg-Arg, L is a peptide according to (1) a -NH ₂ or a pharmaceutically acceptable salt thereof,. Specifically, the peptide corresponds to peptide 26 (SEQ ID NO: 27) described later.
(8) In general formula (I), A is Ile, B is Asp, C is Ser, D is Ser, E is Tyr, F, H, I is Arg, G is Leu, J is Val, and K is Leu- Gly-Arg-Arg-Tyr- Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg, L is a peptide according to (1) a -NH ₂ or a pharmaceutically acceptable salt thereof,. Specifically, the peptide corresponds to peptide 29 (SEQ ID NO: 30) described later.
(9) In the general formula (I), A is Ile, B is Asp, C is Ser, D is Ser, E is Tyr, F, H, I is Arg, G is Leu, and L is —NH ₂ . The peptide according to (1) above, which is composed of 23 amino acids from the N-terminus, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, the peptide corresponds to peptide 31 (SEQ ID NO: 32) described later.
Peptides 10, 12, 21, 23, 25, 26, 29, and 31 are all modified peptides (i) to (iv) described above, and peptides 21 and 23 have an amino acid at the 8-position. It is Glu or Ala.
(10) A pharmaceutical composition comprising the peptide of (1) to (9) above or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(11) The medicament according to (10) above, wherein the content of the peptide of (1) to (9) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 50% by weight or more of the whole physiologically active peptide as an active ingredient Composition.
Here, the “active ingredient” is contained in a pharmaceutical composition as having an action on a subject for the purpose of treating, preventing, changing or alleviating the disease, symptom or condition of the subject. In addition, the “bioactive peptide” is a peptide having physiological activity with respect to the subject, and particularly includes PACAP / VIP peptide, salt and derivative thereof in the present specification. The PACAP / VIP peptide is a natural human or animal PACAP or VIP and a peptide having an amino acid sequence similar to these, and having a physiological activity similar to that of PACAP or VIP. Glucagon -Peptides belonging to the secretin family are included.
(12) Ischemic cerebrovascular disorders including cerebral embolism and cerebral thrombosis, diseases that cause toxicity to the central or peripheral nerves, cerebrovascular ischemia, thrombosis, conformation disease, neurodegenerative diseases, alopecia, male dysfunction, dementia For the treatment or prevention of one or more diseases or symptoms composed of the group consisting of optic neurodegenerative diseases and retinal degenerative diseases including cerebral dysfunction, renal failure, optic atrophy, ischemic optic neuropathy, or improvement of blood flow, bronchial smoothness The pharmaceutical composition according to (10) or (11) above, for muscle relaxation or gastrointestinal motility inhibition.
The present invention will be specifically described below.
The highly stable peptide derivative of the present invention is specifically a peptide having an amino acid sequence described in the general formula (I), and typical examples of peptides contained therein are shown in Table 1. Peptides 10 to 32 shown here are peptides corresponding to SEQ ID Nos. 11 to 33 in the Sequence Listing described later. However, peptides 10, 22, 24, 31, and 32 are peptides corresponding to 23 residues from the N-terminus, peptides 13, 28, and 32 have an acetyl group at the N-terminal amino group and the N-terminal amino group of peptide 14 Has a stearyl group bonded thereto. Peptide 33 (SEQ ID NO: 34) is a 23-residue peptide having the same amino acid sequence as peptide 31 (SEQ ID NO: 32) except that the fourth amino acid is glycine.
When using the above peptides, polar substances or non-polar substances (fatty acids, acyl groups, etc.) are bonded to the N-terminus of the peptides to change the polarity of the molecules, or polyethylene glycol, glucosaminoglycans (hyaluronic acid, etc.) These polymers can be bound to enhance enzyme resistance, bound to a liposome substrate and encapsulated in liposomes, or immobilized on the lipid membrane surface. It is known among those skilled in the art that introduction of an acyl group not only improves its activity but also suppresses self-aggregation.
It was confirmed that the peptide of the present invention has very high stability in an aqueous solution such as distilled water or a buffer solution. For example, the peptide of the present invention is present in a residual ratio of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more when stored at 40 ° C. for 1 week in a solution prepared at pH 6.0 and 7.0. Can do. Moreover, when it preserve | saves at 55 degreeC for 3 days in the solution prepared to pH 6.0 and 7.0, it may exist with the residual rate of 85% or more, Preferably it is 90% or more. Particularly preferred peptides in the present invention are peptides 10, 12, 21, 23, 25, 26, 29, and 31.
Although the peptide used for the neurite inducer of this invention is not specifically limited, It can synthesize | combine according to the well-known conventional method of peptide synthesis. For example, “The Peptides”, Volume 1 (1966) [Schredder and Luhke, Academic Press, New York, U.S. Pat. S. A. Or “peptide synthesis” [Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd. (1975)], specifically, azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method, Active ester method (P-nitrophenyl ester method, N-hydroxysuccinimide ester method, cyanomethyl ester method, etc.), method using Woodward reagent K, carboimidazole method, redox method, DCC-additive (HONB, It can be synthesized by various methods such as HOBt, HOSu) method. These methods can be applied to both solid phase synthesis and liquid phase synthesis.
In the present invention, peptide synthesis is carried out according to the general method for synthesizing polypeptides as described above, for example, by so-called stepwise method in which amino acids are sequentially condensed to the terminal amino acids one by one or divided into several fragments. It is done by the method of going.
For example, solid phase synthesis by the stepwise method is specifically performed by the method of Merrifield (RB) [Solid phase peptide synthesis, J. et al. Amer. Chem. Soc. , 85, 2149-2159 (1963)]. First, the C-terminal amino acid (amino-protected amino group) is bonded to the insoluble resin by its carboxyl group, and then the amino-protecting group of the C-terminal amino acid is removed. Subsequently, the reactive carboxyl group of the amino acid which protected the amino group is sequentially couple | bonded with this free reactive amino group obtained by the condensation reaction according to the amino acid sequence of the target peptide. After synthesizing the entire sequence step by step in this way, the peptide is removed from the insoluble resin.
Any insoluble resin used in the above solid-phase synthesis can be used as long as it has a binding property with a reactive carboxyl group. For example, benzhydrylamine resin (BHA resin), chloromethyl resin, oxymethyl resin, amino acid can be used. Examples thereof include methyl resin, methylbenzhydryl resin (MBHA resin), 4-aminomethylphenoxymethyl resin, 4-hydroxymethylphenoxymethyl resin, and 4-oxymethylphenylacetamidomethyl resin.
In addition, when 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) is used as a protecting group for α-amino group, 4-hydroxymethylphenoxymethyl resin such as 4-hydroxymethylphenoxymethyl resin can be removed from the resin by trifluoroacetic acid (TFA). In the case of using a t-butoxycarbonyl group (Boc), it is preferable that it can be removed from the resin by hydrogen fluoride or the like, such as 4-oxymethylphenylacetamidomethyl resin (PAM resin). The peptide concentration per gram of resin is preferably 0.5 mmole or less.
In the above method, it is necessary to bond a protective group to an amino group involved in amino acid peptide bond, to remove the protective group, and to activate a carboxyl group involved in peptide bond of amino acid.
Examples of amino-protecting groups include benzyloxycarbonyl (Z), t-butoxycarbonyl (Boc), t-aminooxycarbonyl (Aoc), isobornyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, 2-chloro-benzyl. Examples include oxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, o-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl and the like.
Among amino acids, those having a functional group in the side chain, such as His, Tyr, Thr, Lys, Asp, Arg, and Ser, preferably have the functional group in the side chain protected. The functional group is protected by a commonly used method by bonding a normal protective group as described below, and the protective group is removed after the reaction is completed.
Examples of the protecting group for the imino group of His include benzyloxymethyl (Bom), p-toluenesulfonyl (Tos), benzyl (Bzl), benzyloxycarbonyl (Z), and a trityl group.
The hydroxyl groups of Ser and Thr can be protected, for example, by esterification or etherification, but this protection is not essential. Groups suitable for esterification include lower alkanoyl groups such as acetyl, aroyl groups such as benzoyl, groups derived from carbonic acid such as benzoyloxycarbonyl, ethyloxycarbonyl, and the like. Examples of the group suitable for etherification include benzyl (Bzl), tetrahydropyranyl, tert-butyl group and the like.
Examples of the protecting group for the hydroxyl group of Tyr include benzyl (Bzl), bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z), dichlorobenzyl (Cl ₂ -Bzl), benzyloxycarbonyl (Z), acetyl, and p-toluenesulfonyl (Tos). Groups and the like.
The protecting group of the amino groups of Lys, for example, benzyloxycarbonyl (Z), chlorobenzyloxycarbonyl (Cl-Z), dichlorobenzyl _(Cl 2 -Bzl), t- butoxycarbonyl group (Boc), p-toluenesulfonyl (Tos) group etc. are mentioned.
Examples of the protecting group for the guanidino group of Arg include p-toluenesulfonyl (Tos), nitro, benzyloxycarbonyl (Z), t-amyloxycarbonyl (Aoc) groups and the like.
Protection of the carboxyl group of Asp is performed by esterification with, for example, benzyl alcohol, methanol, ethanol, tert-butanol, cyclohexyl (cHex), or the like.
Examples of protecting groups for other amino acids such as formyl, carbobenzoxyl, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, 2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl, etc. This protection is not essential.
As a protecting group for Met's thiomethyl group, there is a method in which methyl sulfoxide is previously prepared and then reduced, but this protection is not essential.
On the other hand, activation of the carboxyl group can be performed by a conventionally known method, and the reagent used can be appropriately selected from known ones. For example, the activation of a carboxy group can be accomplished by reacting the carboxyl group with various reagents and corresponding acid chlorides, anhydrides or mixed anhydrides, azides, active esters (pentachlorophenol, p-nitrophenol, N -Ester with hydroxy succinimide, N-hydroxybenztriazole, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, etc.).
As the solvent used for the condensation reaction (peptide bond formation reaction) between the reactive amino group and the reactive carboxyl group in the solid phase, any solvent can be used as long as it can be used for peptide bond formation. For example, anhydrous or hydrous dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), pyridine, chloroform, dioxane, dichloromethane (DCM), tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate, N-methylpyrrolidone, hexamethylphosphoric triamide (HMPA), etc. Can be used alone or as a mixed solvent of two or more.
The condensation reaction is carried out by using a condensing agent such as a carbodiimide reagent such as dicyclohexylcarboximide (DCC) or carbodiimidazole, tetraethylpyrophosphate, benzotriazole-N-hydroxytrisdimethylaminophosphonium hexafluorophosphide salt (Bop reagent). It can also be performed in the presence of.
The synthesized peptide can be desalted and purified according to ordinary methods. For example, ion exchange chromatography such as DEAE-cellulose, partition chromatography such as Sephadex LH-20 and Sephadex G-25, normal phase chromatography such as silica gel, reverse phase chromatography such as ODS-silica gel, high performance liquid chromatography Examples include graphy.
The peptide purified as described above can be converted into a pharmaceutically acceptable salt, for example, an acetate salt, a hydrochloride salt, a phosphate salt, or the like, if desired, using various acids.
The peptide or salt thereof uses a pharmaceutically acceptable solvent, excipient, carrier, adjuvant, etc., and is in the form of a liquid, injection, tablet, powder, granule, suppository, intestinal solvent according to a conventional method for producing a preparation. It is prepared as a pharmaceutical composition such as nasal drops, inhaled pulmonary agents, oral absorption agents, capsules, eye drops, ointments, transdermal absorption agents, sustained-release preparations, and other drug delivery systems.
The peptide of the present invention or a salt thereof has a physiological action similar to that of conventionally known PACAP / VIP and can be used in the same manner. The peptides and salts thereof are useful as neurite inducers because they have a neurite inducing action, and the preparations are useful for various diseases such as Alzheimer's dementia, Parkinson's disease, neuronal cell death, nerves. It is effective for prevention and treatment of diseases associated with neuronal degeneration such as blastoma and amnesia, and protection against drugs that damage the nervous system. Furthermore, it is useful as an anti-asthma action due to the bronchodilating action of the peptide, and as a gastric peristalsis inhibitor used in endoscopy. Moreover, the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention or a salt thereof is, for example, the same as PACAP / VIP, ischemic cerebrovascular disorders including cerebral embolism and cerebral thrombosis, and / or the brain caused by this or other causes. Peripheral nerve loss, conformation disease, neurodegenerative disease, hair loss, male dysfunction, dementia, renal failure, optic nerve atrophy, optic neurodegenerative diseases including ischemic optic neuropathy and retinal degenerative diseases It can be used for the treatment or prevention of the above diseases or symptoms, and can also be used for improving blood flow, relaxing bronchial smooth muscle or suppressing gastrointestinal motility, but uses are particularly limited is not. In addition, the present inventors have previously found that PACAP / VIP peptide has a neuroprotective action against a specific protein capable of causing conformation disease (Japanese Patent Application No. 2001-386699).
The pharmaceutical composition of the present invention is used parenterally or orally for mammals such as humans, mice, rats, rabbits, dogs and cats, and further, nasal drops, inhalants, sustained-release preparations, eye drops It can be safely administered using a drug delivery system such as an agent, ointment, transdermal absorbent, sustained-release preparation, or oral absorbent as necessary. In practice, an appropriate administration method, dosage form to be administered, administration frequency, and the like can be determined by a specialist such as a doctor in charge depending on the type of disease of the patient, the expected effect, the general condition of the patient, and the like. As the administration device used here, for nasal drops, jet risers, publizers and nasal insufflators, for inhalants, spin hellers, ehalers, flow caps, jet hellers, desk hellers, rotor hellers, tarb hellers, easy hellers, accumulators, Click Heller, Inspire Ys, Inhalation Eight, etc. are included, but are not limited to these. The dosage of the pharmaceutical composition can be appropriately changed depending on the dosage form, administration route, symptoms, etc. For example, when administered to mammals including humans, the amount of peptide is about 1 pg to 1 mg / kg per person per day. Application is illustrated. In that case, the peptide of the present invention or a salt thereof is contained as an active ingredient in an amount of 50% by weight or more, preferably 80% by weight or more, more preferably 95% by weight or more of the physiologically active peptide in the composition. This means that among the biologically active peptides, peptides not contained in the general formula (I) are contained in the composition in an amount of less than 50% by weight, preferably less than 20% by weight, particularly preferably less than 5% by weight. means.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2002-344523, which is the basis of the priority of the present application.

図１は、ペプチド４（Ｉ）及びペプチド４をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し（濃度：３００μｇ／ｍＬ）、５５℃の恒温槽に２４時間静置したサンプル（ＩＩ）のクロマトグラムチャートを示す。
図２は、高次構造解析計算方法に基づいて算出されたペプチド１，７及び８の高次構造におけるヘリックス構造の比率を示す。
図３は、ペプチド１（天然型ＶＩＰ）に対するペプチド７及び８のマウス胃平滑筋の相対収縮抑制率を示す。
図４は、ペプチド１２，２１，２３の気管支弛緩作用を示す。（Ａ）はペプチド１２、（Ｂ）はペプチド２１、（Ｃ）はペプチド２３についての結果である。
図５は、コントロール（ペプチド無添加検体）、ペプチド１（天然型ＶＩＰ）、ペプチド４，１２，２１，及び２３の神経突起誘発作用を示す。
図６は、異常プリオン（ＰｒＰ１０６−１２６）に対するペプチド４，１２，２１，２３の神経保護作用を示す。
＃＃：ペプチド非存在下の検体と比して有意（Ｐ＜０．０１）
＊＊：ペプチド１と比して有意（Ｐ＜０．０１）FIG. 1 shows a chromatogram of sample (II) in which peptide 4 (I) and peptide 4 are dissolved in a phosphate buffer solution of pH 7.0 (concentration: 300 μg / mL) and left in a constant temperature bath at 55 ° C. for 24 hours. A chart is shown.
FIG. 2 shows the ratio of helix structures in the higher order structures of peptides 1, 7 and 8 calculated based on the higher order structure analysis calculation method.
FIG. 3 shows the relative contraction inhibition rate of mouse gastric smooth muscle of peptides 7 and 8 with respect to peptide 1 (natural VIP).
FIG. 4 shows the bronchorelaxing effect of peptides 12, 21, 23. (A) is the result for peptide 12, (B) is the result for peptide 21, and (C) is the result for peptide 23.
FIG. 5 shows the neurite inducing action of the control (analyte without peptide), peptide 1 (natural VIP), peptides 4, 12, 21, and 23.
FIG. 6 shows the neuroprotective action of peptides 4, 12, 21, 23 against an abnormal prion (PrP106-126).
##: Significant compared with specimen in absence of peptide (P <0.01)
**: Significant compared to peptide 1 (P <0.01)

以下に本発明を参考例、実施例を挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕ペプチドの合成
配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するペプチド１２をペプチド固相合成の常法に従い製造した。
ＭＢＨＡ樹脂ＨＣｌ塩（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−１％ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ共重合体，１００〜２００ｍｅｓｈ）をマニュアル合成用反応槽（ガラス製，φ６．０ｘ２９．５ｃｍ）に加え、樹脂容量の２〜３倍量のメタノールで攪拌洗浄し、次いでジクロロメタン（樹脂容量の２〜３倍量）で攪拌洗浄して樹脂を膨潤させた。１０％トリエチルアミン／ジクロロメタンにて中和反応を行い、Ｃ末端アミノ酸に相当するＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨを樹脂の約２倍当量用い、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ハイドロキシベンゾトリアゾールを加えて縮合反応を行った。約２時間の反応（攪拌下）後、メタノールおよびジクロロメタンにて洗浄し、カイザー試験にてα−アミノ基の消失を確認後、５０％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンにて３０分間処理して脱保護を行った。次いで、１０％トリエチルアミン／ジクロロメタンにて中和し、メタノールおよびジクロロメタンにて再洗浄後、再びカイザー試験を実施して脱保護反応の確認を行った。確認後はＣ末より２番目のＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨのカップリングを行うため、同様の工程を繰り返した。その後、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−ＯＨの順に順次カップリング／脱保護を行い、ペプチド１２に相当する保護ペプチド；Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＢＨＡを得た。ここで得られた保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂にエタンジチオールおよびアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに１０％酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行いペプチド１２を得た。
上記方法と同様にして、下記のペプチド１〜３３を化学合成した。
〔実施例２〕（ペプチド４の安定性）
天然型ＶＩＰに対してＡｒｇ残基含量を増すように改変したペプチドであるペプチド４を約１ｍｇ秤量し、ｐＨ４．０，５．０，６．０，７．０に調製した蒸留水（大塚蒸留水）に溶解して終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。４０℃に設定した恒温槽（ＬＨ２０−１１Ｍ，ナガノ科学機械製作所）に２４時間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２８％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４の残存量を検討した。表２に示すようにｐＨが中性付近では顕著な減成を認めた。
〔実施例３〕（ペプチド４変異体のアミノ酸分析およびＬＣ−ＭＳ解析）
ペプチド４をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し（濃度：３００μｇ／ｍＬ）、５５℃の恒温槽に２４時間静置し、図１（ＩＩ）に示すようなクロマトグラムチャートを得た。図１（Ｉ）はペプチド４（対照）のチャートである。これら変異体Ａ−Ｂについて、ＨＰＬＣにて分取し、アミノ酸分析を行った。その結果、表３に示すように、各変異体のアミノ酸分析結果はペプチド４の理論値とほぼ同じであった。
この結果から、変異体のアミノ酸配列はペプチド４と酷似しており、異なる可能性があるのは酸性アミノ酸ＡｓｘとＧｌｘのみであることが示唆された。
さらに、これら変異体の分子量をＬＣ−ＭＳによって測定したところ、表４に示すような結果になった。
表４の結果から、全ての変異体はペプチド４との比較において分子量が１増えていることが明らかとなった。アミノ酸分析の結果と併せて考慮すれば、ＡｓｎがＡｓｐへと、あるいはＧｌｎがＧｌｕへと変化していることが示唆された。ペプチド４のアミノ酸配列から判断するとＡｓｎ含有領域においてスクシンイミドを形成し、それに伴ってアミノ基が脱離し、分子量が１増加しているものと推定した。従って、ペプチド４では、２４，２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ配列、あるいは２８，２９位Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列においてα−ωペプチド転移反応が起こっていることを確認した。
〔実施例４〕（ペプチド７とペプチド８の構造）
ＶＩＰ（ペプチド１、配列番号２）、ＶＩＰのＮ末端２５残基に相当するペプチド７、（配列番号８）そしてその１７位メチオニンが酸化されたペプチド８（配列番号９）について、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、ＪａｓｃｏＪ−７２０（日本分光）により円二色性スペクトルを検討した。Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄらによって提唱された高次構造解析計算方法に従うと、ペプチド１は約５０％ヘリックス構造を有することが明らかとなった（図２）。ペプチド７もその高次構造を高い比率で保持していることが示唆されるが、一方、メチオニンが酸化されたペプチド８のヘリックス構造は約半分にまで減少し、著しく構造が変化していることが示唆された。
〔実施例５〕（ペプチド７とペプチド８の薬理活性）
雄のＩＣＲマウス（９週齢）を１週間予備飼育した後、１０〜１８週齢にわたって使用した。頸椎脱臼処理後、直ちに開腹し胃を全摘出、生理食塩水にて胃内部を十分に洗浄し、標本とした。出来上がった標本を内容量２０ｍＬのマグヌス槽（容量２０ｍＬ，温度３７℃，荷重２．０ｇ，９５％ＣＯ_２＋５％ＣＯ_２通気下：理研開発）内に懸垂した。生理的溶液としてＫｒｅｂｓ−ＨｅｎｓｅｌｅｉｔＢｕｆｆｅｒＭｏｄｉｆｉｅｄ（ＳＩＧＭＡ）溶液を使用した。反応はアンプＲＭＰ−６００４（日本光電）を介してレコーダーＲ−６４Ｍ（理化電機）上に描記した。実験は標本をマグヌス装置にセットして、ベースラインが安定した後、カルバコール溶液（添加濃度６ｘ１０^−３Ｍ）を１００μＬ添加した。１０分後に精製ペプチドの試料溶液を添加し、標本の弛緩作用を観察した。カルバコール収縮に対するペプチド１（天然型ＶＩＰ）の作用を１００％として、ペプチド７またはペプチド８を添加したときの平滑筋の最大収縮抑制率を求めた。図３に、ペプチド１，７，そして８の最終濃度１０^−６Ｍにおけるマウス胃平滑筋の最大収縮抑制率を相対的に示す。ペプチド８は、ペプチド７と比べて著しい活性の減退を示し、メチオニン残基酸化による影響を強く示唆した。なおかつ実施例４を考慮すれば、この活性減退は、これら化合物のヘリックス含量と高い相関を示していることが分かった。すなわち、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ類のメチオニン酸化によって分子レベルでの高次構造上の変化が誘起され、活性に大きく影響していることが示された。
〔実施例６〕（ペプチド１２の安定性）
ペプチド１２を適当量秤量し、蒸留水（大塚蒸留水）に溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、０．１ＮＮａＯＨにてｐＨ６．０，７．０に調製した。さらに１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、４０℃に設定した恒温槽にて２４時間静置した。指示時間後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド１２の残存量を検討した。その結果、ｐＨ６．０，７．０の両検体において特に顕著な未同定ピークの生成を認めなかった。従って、本ペプチドは安定性があることが示唆された。
〔実施例７〕（ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ６．０，７．０に調製した蒸留水（大塚蒸留水）に溶解して終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。５５℃に設定した恒温槽（ＦＣ−６１０，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に３日間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を検討した。表５に示すように、ペプチド１２，２１，２３はペプチド４に比べ、著しく安定性が増していることが見られ、特にｐＨ７．０ではその傾向が顕著であった。
〔実施例８〕（ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ７．０に調製した蒸留水（大塚蒸留水）に溶解して終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。５５℃に設定した恒温槽（ＦＣ−６１０，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）にそれぞれ０，１０，２０，３０日間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を検討した。表６に示すように、ペプチド４は１０日間の保存で完全に消失しているにも関わらず、ペプチド１２，２１，２３は３０日後でも残存し、著しく安定性が増していることが見られた。
［実施例９］（ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ６．０，７．０に調製したリン酸緩衝液（０．００１％リン酸二水素ナトリウム水溶液）に溶解して終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。４０℃、７５％ＲＨに設定した恒温恒湿器（ＬＨ−２０−１１，ナガノ化学（株））に１週間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を測定した。表７に示すようにペプチド１２，２１，２３はペプチド４に比べ、安定性が顕著に増していることが見られた。
［実施例１０］（ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ７．０に調製したリン酸緩衝液（０．００１％リン酸二水素ナトリウム水溶液）に溶解して終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。４０℃、７５％ＲＨに設定した恒温恒湿器（ＬＨ−２０−１１，ナガノ化学（株））にそれぞれ０，１０，２０，３０日間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を測定した。表８に示すようにペプチド１２，２１，２３はペプチド４に比べ、安定性が顕著に増し、３０日経過後ではペプチド４は消失したが、ペプチド１２，２１，２３は残存していた。
〔実施例１１］（胃蠕動運動抑制作用）
ペプチド９，１０，３３の胃蠕動運動抑制作用を実施例５と同様にして検討した。
マウスは雄のＩＣＲマウス９週齢を使用した。頸椎脱臼処理後、直ちに開腹し胃を全摘出、生理食塩水にて胃内部を十分に洗浄し、標本とした。出来上がった標本を内容量２０ｍＬのマグヌス槽（容量２０ｍＬ、温度３７℃、荷重２．０ｇ、９５％Ｏ_２＋５％ＣＯ_２通気下：理研開発）内に懸垂した。生理的溶液としてＫｒｅｂｓ−ＨｅｎｓｅｌｅｉｔＢｕｆｆｅｒＭｏｄｉｆｉｅｄ（ＳＩＧＭＡ）溶液を使用した。反応はアンプＲＭＰ−６００４（日本光電）を介してレコーダーＲ−６４Ｍ（理化電機）上に描記した。実験は標本をマグヌス装置にセットして、ベースラインが安定した後、カルバコール溶液（３×１０^−６Ｍ）を添加し，収縮安定後に各被験ペプチド（１０^−６Ｍ）を添加し、標本の弛緩作用を観察した。カルバコール添加前の収縮度合いを０％、カルバコール添加安定化後の収縮の度合いを１００％として、各試料溶液を添加したときの胃の収縮抑制率を算出した。表９に薬剤投与１５分後の各物質の収縮抑制率を示す（対照薬：ペプチド９を１００としたときの各物質（ペプチド１０，３３）の収縮抑制率を示す）。
〔実施例１２〕（気管支平滑筋弛緩作用）
ペプチド１２，２１，２３について、以下の方法に従い、気管支平滑筋拡張時の一時的な収縮作用の有無を試験した。
Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット（４４０ｇ）、７週齢（日本ＳＬＣ）を麻酔下、大腿動脈より放血致死させた後、開胸し気管を摘出した。気管に付着している脂肪組織等を可及的に除去し、軟骨に沿って軟骨４〜５本を含む幅に切断した後、食道と反対側の軟骨部分を縦に切断し、切片とした。気道上部、中央付近及び下部のそれぞれ１切片を標本として用いた。標本はマグヌス槽（容量２０ｍＬ，温度３７℃，荷重０．５ｇ，９５％Ｏ_２＋５％ＣＯ_２通気下）内に懸引した。生理的溶液にはＫｒｅｂｓ−ＨｅｎｓｅｌｅｉｔＢｕｆｆｅｒＭｏｄｉｆｉｅｄ（ＳＩＧＭＡ）溶液を用いた。反応はｉｓｏｍｅｔｒｉｃｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＴＢ−６１１Ｔ：日本光電）を用いてアンプＲＭＰ−６００４（日本光電）を介してレコーダーＲ−６４Ｍ（理化電気）上に描写した。カルバコール３ｘ１０^−７Ｍによる収縮が安定後、ペプチド１２を累積的（１０^−９Ｍ〜３×１０^−６Ｍ）に投与し、一方ペプチド２１及びペプチド２３は単回投与（３ｘ１０^−６Ｍ）した。測定後イソプロテレノール１０^−６Ｍを投与し、その値を１００％弛緩として各被験物質の弛緩率を求めた。その結果ペプチド１２，２１，２３は全て図４に示すとおり、ペプチド添加に依存した明瞭な気管支弛緩作用を持つことが明らかとなった。
〔実施例１３〕（神経突起誘発作用）
ペプチド１，４，１２，２１，２３について以下の方法に従って、神経突起誘発作用を試験した。ＰＣ−１２細胞は５％馬血清および５％新生仔ウシ血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ_２／９５％ａｉｒの環境で３７℃に保って培養した。トリプシンにて細胞を培養フラスコからはがした後、細胞を血球計算器にてカウントし、１．０ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。２４ｗｅｌｌのコラーゲンタイプＩＶバイオコートディッシュに、上記細胞含有液体培地を１ｍｌずつ加え、２４時間５％ＣＯ_２／９５％ａｉｒの環境で３７℃に保って培養した。２４時間後培地を交換し、その際に各ペプチド（１００ｎＭ）を添加した。これを３日間継続培養し、写真撮影を行った。その写真を図５に示す。各写真のスケールバーは全て１００μｍを示す。写真に示すようにペプチド４，１２，２１，２３は、コントロール（ペプチド無添加検体）およびペプチド１（天然型ＶＩＰ）と比較して著しい神経突起誘発を認めた。
〔実施例１４〕（神経保護作用）
正常プリオンは既に構造変換により異常体のプリオンに変換されることが確認されているので（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，（２０００）ｖｏｌ．７５，２５３６−２５４５）、脳・神経系研究におけるモデル系として用いられているラットの副腎髄質褐色細胞腫由来細胞、ＰＣ１２細胞を使用してフォールディング異常タンパク質のプリオン（１０６−１２６）による細胞死を検討した。５％ウマ血清及び５％新生仔ウシ血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて、ＰＣ１２細胞を５％ＣＯ_２／９５％ａｉｒの環境下で３７℃に保って培養した。トリプシンにてＰＣ１２細胞を培養フラスコからはがした後、９６ｗｅｌｌ培養プレートにて前記細胞を培養した（１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。このＰＣ１２培養細胞にプリオン（１０６−１２６）（アメリカンペプタイドカンパニー社製）を５０μＭと１０^−７Ｍの神経ペプチド（ペプチド１，４，１２，２１，２３）を添加し、ＷＳＴ−８法によって生存細胞数を算出し、異常プリオン（ＰｒＰ１０６−１２６）に対する神経保護作用の程度を数値化した。その結果を図６に示す。ペプチド１（天然型ＶＩＰ）はペプチド非存在下の検体と比して有意（＃＃，Ｐ＜０．０１）に生存細胞数が多く、有意な神経保護作用を示した。一方、ペプチド４，１２，２１，２３は、ペプチド１と比して有意（＊＊，Ｐ＜０．０１）に神経保護作用が強いことを確認した。
〔実施例１５〕（吸入経肺および点鼻用製剤の作製）
吸入経肺および点鼻用製剤の作製は、原則として、特開２００３−３４６５２に記載の粉末製剤作製方法に従って行った。
粉砕条件
使用機器：Ａ−Ｏ−ＪｅｔＭｉｌｌ（セイシン企業）
原料供給方法：オートフィーダー
供給エアー圧力：６．０ｋｇ／ｃｍ^２Ｇ
粉砕エアー圧力：６．５ｋｇ／ｃｍ^２Ｇ
集塵方法：アウトレットバグ
上記方法にて、ペプチド４，１２，２１，２３の乳糖希釈物あるいはエリスリトール希釈物を作製し、エリスリトール担体（平均粒径７０μｍ）または乳糖担体（平均粒径５０μｍ）を微粉砕物／担体＝０．４／ｌにて非帯電袋を用いて混合した。
〔実施例１６〕（点眼剤の作製）
神経ペプチド１０ｍｇ
ホウ酸７００ｍｇ
ホウ砂適量
塩化ナトリウム５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース０．５ｇ
エデト酸ナトリウム０．００５ｍｇ
ｐＨ７．０
滅菌精製水全量１００ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬを約８０℃まで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液に神経ペプチド、塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えてｐＨを７．０に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。
神経ペプチドとして、ペプチド４，１２，２１，２３を用いた。
〔実施例１７〕（注射剤の製造）
神経ペプチド１０ｍｇ
塩化ナトリウム９００ｍｇ
１Ｎ水酸化ナトリウム適量
注射用蒸留水全量１００ｍＬ
以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。神経ペプチドとして、ペプチド４，１２，２１，２３を用いた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference examples and examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Synthesis of Peptide Peptide 12 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 was produced according to a conventional method for peptide solid phase synthesis.
Add MBHA resin HCl salt (polystyrene-1% divinylbenzene copolymer, 100-200 mesh) to a reaction vessel for manual synthesis (made of glass, φ6.0 × 29.5 cm), and stir and wash with 2-3 times the amount of methanol in the resin volume Then, the resin was swollen by stirring and washing with dichloromethane (2 to 3 times the resin volume). Neutralization reaction is performed with 10% triethylamine / dichloromethane, Boc-Arg (Tos) -OH corresponding to the C-terminal amino acid is used about twice as much as the resin, and dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxybenzotriazole are added to conduct the condensation reaction. went. After reaction for 2 hours (under stirring), washing with methanol and dichloromethane, confirming disappearance of α-amino group by Kaiser test, and then treating with 50% trifluoroacetic acid / dichloromethane for 30 minutes for deprotection. went. Next, the mixture was neutralized with 10% triethylamine / dichloromethane, washed again with methanol and dichloromethane, and then a Kaiser test was performed again to confirm the deprotection reaction. After confirmation, the same process was repeated in order to perform coupling of Boc-Arg (Tos) -OH, which is the second from the C-terminal. Thereafter, Boc-Gly-OH, Boc -Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr (Cl 2 -Bzl) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln (Xan) -OH, Boc-Arg (Tos ) -OH, Boc-Arg (Tos ) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Tyr (Cl 2 -Bzl) -OH, Boc -Asn (Xan) -OH, Boc-Asp (OcHex) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-V Coupling / deprotection is carried out in the order of al-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHex) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-His (Bom) -OH, and peptide 12 corresponding protected peptide; His (Bom) -Ser (Bzl ) -Asp (OcHex) -Ala-Val-Phe-Thr (Bzl) -Asp (OcHex) -Asn-Tyr (Cl 2 -Bzl) -Thr (Bzl) -Arg (Tos) -Leu-Arg ( Tos) -Arg (Tos) -Gln-Leu-Ala-Val-Arg (Tos) -Arg (Tos) -Tyr (Cl 2 -Bzl) -Leu-Ala-Ala- Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-MBHA was obtained. The protected peptide-MBHA resin obtained here was reacted with anhydrous hydrogen fluoride in the presence of ethanedithiol and anisole. After the reaction, anhydrous hydrogen fluoride was distilled off under reduced pressure, the residue was washed with ether, and 10% acetic acid was added thereto to extract the peptide. The extract was purified by reverse phase column chromatography and freeze-dried to obtain peptide 12.
The following peptides 1-33 were chemically synthesized in the same manner as described above.
[Example 2] (Stability of peptide 4)
About 1 mg of peptide 4, which is a peptide modified so as to increase the Arg residue content with respect to natural VIP, was weighed, and distilled water (Otsuka distilled) adjusted to pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0. The final concentration was 10 μg / mL. After standing for 24 hours in a constant temperature bath (LH20-11M, Nagano Kagaku Kikai Seisakusho) set at 40 ° C., reverse phase HPLC (detection wavelength: 220 nm, mobile phase: 28% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, column : ODS-120T (Tosoh), column temperature: 25 ° C.), and the remaining amount of peptide 4 was examined. As shown in Table 2, significant degradation was observed near neutral pH.
[Example 3] (Amino acid analysis and LC-MS analysis of peptide 4 mutant)
Peptide 4 was dissolved in pH 7.0 phosphate buffer (concentration: 300 μg / mL) and allowed to stand in a constant temperature bath at 55 ° C. for 24 hours to obtain a chromatogram chart as shown in FIG. 1 (II). FIG. 1 (I) is a chart of peptide 4 (control). These mutants AB were separated by HPLC and analyzed for amino acids. As a result, as shown in Table 3, the amino acid analysis result of each mutant was almost the same as the theoretical value of peptide 4.
From these results, it was suggested that the amino acid sequence of the mutant is very similar to that of peptide 4, and that only the acidic amino acids Asx and Glx may be different.
Furthermore, when the molecular weight of these variants was measured by LC-MS, the results shown in Table 4 were obtained.
From the results in Table 4, it was revealed that all the mutants had a molecular weight increased by 1 in comparison with peptide 4. Taking into account the results of amino acid analysis, it was suggested that Asn was changed to Asp or Gln was changed to Glu. Judging from the amino acid sequence of peptide 4, it was estimated that succinimide was formed in the Asn-containing region, the amino group was eliminated, and the molecular weight was increased by 1. Therefore, in peptide 4, it was confirmed that an α-ω peptide transfer reaction occurred in the Asn-Ser sequence at positions 24 and 25 or the Asn-Gly sequence at positions 28 and 29.
[Example 4] (Structure of peptide 7 and peptide 8)
For VIP (peptide 1, SEQ ID NO: 2), peptide 7 corresponding to the N-terminal 25 residues of VIP (SEQ ID NO: 8) and peptide 8 (SEQ ID NO: 9) in which the 17-position methionine was oxidized, 20 mM Tris-HCl It was dissolved in a buffer solution (pH 7.4), and a circular dichroism spectrum was examined by Jasco J-720 (JASCO). According to the higher-order structure analysis calculation method proposed by Greenfield et al., It was revealed that peptide 1 has an approximately 50% helical structure (FIG. 2). Peptide 7 is also suggested to retain its higher-order structure at a high ratio, whereas the helical structure of peptide 8 oxidized with methionine is reduced to about half, and the structure is remarkably changed. Was suggested.
[Example 5] (Pharmacological activity of peptide 7 and peptide 8)
Male ICR mice (9 weeks old) were bred for 1 week and then used for 10-18 weeks of age. Immediately after cervical dislocation, the abdomen was opened and the stomach was completely removed, and the inside of the stomach was thoroughly washed with physiological saline to prepare a specimen. The finished specimen was suspended in a 20-mL Magnus tank (capacity 20 mL, temperature 37 ° C., load 2.0 g, 95% CO ₂ + 5% CO ₂ aerated: developed by RIKEN). A Krebs-Henseleit Buffer Modified (SIGMA) solution was used as a physiological solution. The reaction was drawn on a recorder R-64M (Rika Denki) via an amplifier RMP-6004 (Nihon Kohden). In the experiment, the specimen was set in a Magnus apparatus, and after the baseline was stabilized, 100 μL of a carbachol solution (addition concentration 6 × 10 ⁻³ M) was added. Ten minutes later, a sample solution of purified peptide was added, and the relaxation action of the specimen was observed. Taking the effect of peptide 1 (natural VIP) on carbachol contraction as 100%, the maximum contraction inhibition rate of smooth muscle when peptide 7 or peptide 8 was added was determined. FIG. 3 relatively shows the maximum contraction inhibition rate of mouse gastric smooth muscle at a final concentration of 10 ⁻⁶ M of peptides 1, 7, and 8. Peptide 8 showed a marked decrease in activity compared to peptide 7, strongly suggesting the effect of methionine residue oxidation. Moreover, considering Example 4, it was found that this decreased activity was highly correlated with the helix content of these compounds. In other words, it was shown that higher-order structural changes at the molecular level were induced by methionine oxidation of VIP / PACAPs, greatly affecting activity.
[Example 6] (Stability of peptide 12)
Peptide 12 was weighed in an appropriate amount, dissolved in distilled water (Otsuka distilled water) (1 mg / mL), and adjusted to pH 6.0, 7.0 with 0.1 N NaOH. Furthermore, it diluted to the density | concentration of 10 microgram / mL and left still for 24 hours in the thermostat set to 40 degreeC. After the indicated time, analysis was performed by reversed-phase HPLC (detection wavelength: 220 nm, mobile phase: 29% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, column: ODS-120T (Tosoh), column temperature: 25 ° C.), and peptide The remaining amount of 12 was examined. As a result, the generation of particularly unidentified peaks was not observed in both samples of pH 6.0 and 7.0. Therefore, it was suggested that this peptide has stability.
[Example 7] (Stability of peptides 4, 12, 21, 23)
Peptides 4, 12, 21, and 23 were weighed appropriately and dissolved in distilled water (Otsuka distilled water) adjusted to pH 6.0 and 7.0 to a final concentration of 10 μg / mL. After standing in a thermostatic chamber (FC-610, ADVANTEC) set at 55 ° C. for 3 days, reverse phase HPLC (detection wavelength: 220 nm, mobile phase: 29.5% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, column: Analysis was performed with ODS-120T (Tosoh), column temperature: 25 ° C.), and the residual ratio of peptides 4, 12, 21, 23 was examined. As shown in Table 5, it was found that the stability of peptide 12, 21, 23 was significantly increased compared to peptide 4, and this tendency was particularly remarkable at pH 7.0.
[Example 8] (Stability of peptides 4, 12, 21, 23)
Peptides 4, 12, 21, 23 were weighed in an appropriate amount and dissolved in distilled water adjusted to pH 7.0 (Otsuka distilled water) to a final concentration of 100 μg / mL. After standing in a thermostat (FC-610, ADVANTEC) set at 55 ° C. for 0, 10, 20, and 30 days, respectively, reverse-phase HPLC (detection wavelength: 220 nm, mobile phase: 29.5% acetonitrile / 0.1 % Trifluoroacetic acid, column: ODS-120T (Tosoh), column temperature: 25 ° C.), and the residual ratio of peptides 4, 12, 21, 23 was examined. As shown in Table 6, although peptide 4 was completely lost after storage for 10 days, peptides 12, 21, and 23 remained after 30 days, and it was found that the stability was significantly increased. It was.
[Example 9] (Stability of peptides 4, 12, 21, 23)
Peptides 4, 12, 21, and 23 are weighed in an appropriate amount and dissolved in a phosphate buffer solution (0.001% aqueous sodium dihydrogen phosphate solution) adjusted to pH 6.0 and 7.0 to a final concentration of 100 μg / mL. did. After standing for 1 week in a constant temperature and humidity chamber (LH-20-11, Nagano Chemical Co., Ltd.) set to 40 ° C. and 75% RH, reverse phase HPLC (detection wavelength: 220 nm, mobile phase: 29.5%) Analysis was performed with acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, column: ODS-120T (Tosoh), column temperature: 25 ° C.), and the residual ratio of peptides 4, 12, 21, 23 was measured. As shown in Table 7, it was found that the stability of peptide 12, 21, 23 was significantly increased compared to peptide 4.
[Example 10] (Stability of peptides 4, 12, 21, 23)
Peptides 4, 12, 21, and 23 were weighed in an appropriate amount and dissolved in a phosphate buffer (0.001% sodium dihydrogen phosphate aqueous solution) adjusted to pH 7.0 to a final concentration of 100 μg / mL. After standing still for 0, 10, 20, 30 days in a thermo-hygrostat (LH-20-11, Nagano Chemical Co., Ltd.) set to 40 ° C. and 75% RH, respectively, reversed-phase HPLC (detection wavelength: 220 nm, Mobile phase: 29.5% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, column: ODS-120T (Tosoh), column temperature: 25 ° C.), and the residual ratio of peptides 4, 12, 21, 23 was determined. It was measured. As shown in Table 8, the stability of peptide 12, 21, and 23 was significantly increased compared to peptide 4, and peptide 30 disappeared after 30 days, but peptide 12, 21, and 23 remained.
[Example 11] (Inhibition of gastric peristalsis)
The inhibitory action of peptide 9, 10, 33 on gastric peristalsis was examined in the same manner as in Example 5.
As the mouse, a 9-week-old male ICR mouse was used. Immediately after cervical dislocation, the abdomen was opened and the stomach was completely removed, and the inside of the stomach was thoroughly washed with physiological saline to prepare a specimen. The completed specimen was suspended in a 20-mL Magnus tank (capacity 20 mL, temperature 37 ° C., load 2.0 g, 95% O ₂ + 5% CO ₂ aerated: developed by RIKEN). A Krebs-Henseleit Buffer Modified (SIGMA) solution was used as a physiological solution. The reaction was drawn on a recorder R-64M (Rika Denki) via an amplifier RMP-6004 (Nihon Kohden). In the experiment, the specimen was set in a Magnus apparatus, and after the baseline was stabilized, carbachol solution (3 × 10 ⁻⁶ M) was added, and after each contraction was stabilized, each test peptide (10 ⁻⁶ M) was added. The relaxation effect was observed. The rate of contraction of the stomach when each sample solution was added was calculated with the degree of contraction before carbachol addition being 0% and the degree of contraction after stabilization of carbachol addition being 100%. Table 9 shows the contraction inhibition rate of each substance 15 minutes after drug administration (control drug: the contraction inhibition rate of each substance (peptides 10 and 33) when peptide 9 is taken as 100).
[Example 12] (Bronchial smooth muscle relaxation action)
Peptides 12, 21, and 23 were tested for the presence or absence of temporary contraction during bronchial smooth muscle expansion according to the following method.
Hartley male guinea pigs (440 g), 7 weeks old (Japan SLC) were exsanguinated from the femoral artery under anesthesia, and then thoracotomy was performed to remove the trachea. Adipose tissue attached to the trachea is removed as much as possible, cut to a width including 4-5 cartilage along the cartilage, and then the cartilage portion opposite to the esophagus is cut vertically to form a section. . One section of each of the upper airway, near the center, and the lower part was used as a sample. The specimen was suspended in a Magnus tank (capacity 20 mL, temperature 37 ° C., load 0.5 g, 95% O ₂ + 5% CO ₂ aerated). As a physiological solution, a Krebs-Henseleit Buffer Modified (SIGMA) solution was used. The reaction was depicted on a recorder R-64M (Rika Denki) via an amplifier RMP-6004 (Nihon Kohden) using an isometric transducer (TB-611T: Nihon Kohden). After contraction by carbachol 3 × 10 ⁻⁷ M was stabilized, peptide 12 was administered cumulatively (10 ⁻⁹ M to 3 × 10 ⁻⁶ M), while peptide 21 and peptide 23 were administered once (3 × 10 ⁻⁶ M). . After the measurement, isoproterenol 10 ⁻⁶ M was administered, and the relaxation rate of each test substance was determined with the value as 100% relaxation. As a result, it was revealed that peptides 12, 21, and 23 all had a clear bronchorelaxing action depending on peptide addition as shown in FIG.
Example 13 (Nerite Inducing Action)
Peptides 1, 4, 12, 21, 23 were tested for neurite inducing action according to the following method. PC-12 cells were cultured in Dulbecco's modified minimum medium (DMEM) containing 5% horse serum and 5% newborn calf serum at 37 ° C. in an environment of 5% CO ₂ /95% air. After the cells were peeled from the culture flask with trypsin, the cells were counted with a hemocytometer and prepared to be 1.0 × 10 ⁴ cells / ml. The cell-containing liquid medium was added in an amount of 1 ml to a 24-well collagen type IV biocoat dish and cultured at 37 ° C. in an environment of 5% CO ₂ /95% air for 24 hours. After 24 hours, the medium was changed, and each peptide (100 nM) was added. This was continuously cultured for 3 days and photographed. The photograph is shown in FIG. All the scale bars in each photograph show 100 μm. As shown in the photograph, peptides 4, 12, 21, and 23 showed significant neurite induction compared to control (peptide-free specimen) and peptide 1 (natural VIP).
[Example 14] (Neuroprotective effect)
Since normal prions have already been confirmed to be converted into abnormal prions by structural transformation (J. Neurochem, (2000) vol. 75, 2536-2545), they are used as model systems in brain and nervous system research. The cell death due to the abnormal protein prion (106-126) was examined using a rat adrenal medullary pheochromocytoma-derived cell, PC12 cell. In a Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) containing 5% horse serum and 5% newborn calf serum, PC12 cells were cultured at 37 ° C. in an environment of 5% CO ₂ /95% air. PC12 cells were peeled from the culture flask with trypsin, and then the cells were cultured in a 96-well culture plate (10 ⁴ cells / well). To this PC12 cultured cell, 50 μM prion (106-126) (manufactured by American Peptide Company) and 10 ⁻⁷ M neuropeptide (peptides 1, 4, 12, 21, 23) were added, and survival was achieved by the WST-8 method. The number of cells was calculated, and the degree of neuroprotective action against abnormal prions (PrP106-126) was quantified. The result is shown in FIG. Peptide 1 (native VIP) had a significant number of viable cells (#, P <0.01) and a significant neuroprotective effect compared to the specimen in the absence of peptide. On the other hand, peptides 4, 12, 21, and 23 were confirmed to have a significant neuroprotective effect (**, P <0.01) as compared with peptide 1.
[Example 15] (Preparation of inhaled pulmonary and nasal preparations)
In principle, preparations for inhalation pulmonary and nasal preparations were performed according to the method for preparing a powder preparation described in JP-A-2003-34652.
Equipment used for grinding conditions : A-O-Jet Mill (Seishin company)
Raw material supply method: Auto feeder Supply air pressure: 6.0 kg / cm ² G
Grinding air pressure: 6.5 kg / cm ² G
Dust collection method: Outlet bug In the above method, lactose dilution or erythritol dilution of peptide 4,12,21,23 is prepared, and erythritol carrier (average particle size 70 μm) or lactose carrier (average particle size 50 μm) The mixture was pulverized / carrier = 0.4 / l using an uncharged bag.
[Example 16] (Preparation of eye drops)
Neuropeptide 10mg
700mg boric acid
Borax appropriate amount sodium chloride 500mg
Hydroxymethylcellulose 0.5g
Sodium edetate 0.005mg
pH 7.0
Sterile purified water 100mL
Heat 80 mL of sterilized purified water to about 80 ° C., add hydroxymethylcellulose and stir, and return the liquid temperature to room temperature. The neuropeptide, sodium chloride, boric acid, sodium edetate and benzalkonium chloride are added to this solution and dissolved. Adjust the pH to 7.0 by adding an appropriate amount of borax. Add sterile purified water and make up to 100 mL.
Peptides 4, 12, 21, and 23 were used as neuropeptides.
[Example 17] (Production of injection)
Neuropeptide 10mg
Sodium chloride 900mg
1N sodium hydroxide appropriate amount distilled water for injection 100mL
The above ingredients are mixed aseptically by a conventional method to prepare an injection. Peptides 4, 12, 21, and 23 were used as neuropeptides.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Industrial applicability

本発明によれば、長期保存が可能で、副生成物による予期せぬ副作用を回避することが可能なＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体を提供することが出来る。 According to the present invention, it is possible to provide a PACAP / VIP derivative that can be stored for a long period of time and can avoid unexpected side effects due to by-products.

配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：合成ペプチド
配列番号１２：合成ペプチド
配列番号１３：合成ペプチド
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成ペプチド
配列番号１６：合成ペプチド
配列番号１７：合成ペプチド
配列番号１８：合成ペプチド
配列番号１９：合成ペプチド
配列番号２０：合成ペプチド
配列番号２１：合成ペプチド
配列番号２２：合成ペプチド
配列番号２３：合成ペプチド
配列番号２４：合成ペプチド
配列番号２５：合成ペプチド
配列番号２６：合成ペプチド
配列番号２７：合成ペプチド
配列番号２８：合成ペプチド
配列番号２９：合成ペプチド
配列番号３０：合成ペプチド
配列番号３１：合成ペプチド
配列番号３２：合成ベプチド
配列番号３３：合成ペプチド
配列番号３４：合成ペプチドSequence number 1: Synthetic peptide Sequence number 2: Synthetic peptide sequence number 3: Synthetic peptide sequence number 4: Synthetic peptide sequence number 5: Synthetic peptide sequence number 6: Synthetic peptide sequence number 7: Synthetic peptide sequence number 8: Synthetic peptide sequence number 9: Synthetic peptide sequence number 10: Synthetic peptide sequence number 11: Synthetic peptide sequence number 12: Synthetic peptide sequence number 13: Synthetic peptide sequence number 14: Synthetic peptide sequence number 15: Synthetic peptide sequence number 16: Synthetic peptide sequence number 17: Synthetic peptide sequence number 18: Synthetic peptide sequence number 19: Synthetic peptide sequence number 20: Synthetic peptide sequence number 21: Synthetic peptide sequence number 22: Synthetic peptide sequence number 23: Synthetic peptide sequence number 24: Synthetic peptide sequence number 25: Synthetic peptide SEQ ID NO: 26: synthetic peptide SEQ ID NO 7: Synthetic peptide SEQ ID NO: 28: Synthetic peptide SEQ ID NO: 29: Synthetic peptide SEQ ID NO: 30: Synthetic peptide SEQ ID NO 31: Synthetic peptide SEQ ID NO 32: Synthetic Bepuchido SEQ ID NO 33: Synthetic peptide SEQ ID NO: 34: Synthetic Peptide

Claims

The following formula (I):
(Wherein A is Val; B is Asp; C is Asn; D is Thr; E is Leu; F, H, I is Arg; G is Leu; J is Ile; K is Leu-Gly-Arg-Arg; L represents an α-position carboxyl group modification of the C-terminal amino acid and represents —NH _2. )
In the peptide shown or a pharmaceutically acceptable salt thereof,.

The following formula (I):
(Wherein A is Val; B is Glu; C is Asn; D is Thr; E is Leu; F, H, I is Arg; G is Leu; J is Ile; K is Leu-Gly-Arg-Arg; L represents an α-position carboxyl group modification of the C-terminal amino acid and represents —NH _2. )
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

The following formula (I):
(Where A is Val; B is Ala; C is Asn; D is Thr; E is Leu; F, H, I is Arg; G is Leu; J is Ile; K is Leu-Gly-Arg-Arg; L represents an α-position carboxyl group modification of the C-terminal amino acid and represents —NH _2. )
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

The following formula (I):
(Where A is Ile; B is Asp; C is Ser; D is Ser; E is Tyr; F, H, I is Arg; G is Leu; J is Val; K is Leu-Gly-Arg-Arg; L represents an α-position carboxyl group modification of the C-terminal amino acid and represents —NH _2. )
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

A pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of claims 1 to 4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

The pharmaceutical according to claim 5 , wherein the content of the peptide according to any one of claims 1 to 4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 50% by weight or more of the whole physiologically active peptide as an active ingredient. Composition.

Ischemic cerebrovascular disorders including cerebral embolism and cerebral thrombosis, diseases that cause toxicity to central or peripheral nerves, cerebral vascular ischemia, thrombosis, conformation disease, neurodegenerative diseases, alopecia, male dysfunction, dementia, kidney For the treatment or prevention of one or more diseases or conditions comprising the group consisting of optic nerve atrophy, optic nerve atrophy, ischemic optic neuropathy and retinal degenerative diseases, or for improving blood flow, bronchial smooth muscle relaxation or The pharmaceutical composition according to claim 5 or 6 for suppressing gastrointestinal motility.