JP4429410B2 - Novel bioactive substance, its production method and use - Google Patents
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【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オ−ファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＡＰＪに対するリガンドポリペプチド、及びこれをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調節している。これらのレセプターの多くは共役している guanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行い、また７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。
このようなホルモンや神経伝達物質とＧ蛋白質共役型レセプターとの相互作用を通じて生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節などの生体にとって重要な機能調節が行われている。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質に対するレセプター蛋白質が存在し、その機能調節に重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対するレセプターが存在するかどうかについては未だ不明なことが多い。
近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すことを利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを探索する方法が行われるようになり、数多くの、リガンドが不明ないわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質がクローニングされている(Libert, F., et al. Science, 244, 569-572, 1989, Welch, S.K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209, 606-613, 1995, Marchese, A., et al., Genomics, 23, 609-618, 1994, Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995)。また、ゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのランダムな配列決定によっても、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が次々と見出されている(Nomura, N., et al., DNA Research 1巻、27-35頁、1994年）。これらのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する一般的な手段としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一次構造上の類似性から推定するしかなかった。しかし、多くのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は既知のレセプターとのホモロジーが低いものが多く、実際は既知リガンドのレセプターサブタイプである場合を除いては一次構造上の類似性だけでそのリガンドを推定することは困難であった。一方、遺伝子解析から多くのオーファンＧ蛋白質共役型レセプターがみつかっていることから対応する未知のリガンドがまだ数多く存在していることが推定されているが、これまで実際にオーファンＧ蛋白質共役型レセプターのリガンドを同定した例は数少ない。
【０００３】
最近、動物細胞にオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを導入し、新規オピオイドペプチドを探索した例が報告されている（Reinsheid, R. K. et al. , Science、270巻、792-794頁、1995年、Menular, J.-C., et al. , Nature 377巻、532-535頁、1995年）。しかしこの場合は既知Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との類似性や組織分布から、容易にリガンドはオピオイドペプチドのファミリーに属することが予想されていた。オピオイドレセプターを介して生体に作用する物質の研究・開発の歴史は長く、種々のアンタゴニスト・アゴニストが開発されていた。そこで人為的に合成した化合物群の中からこの受容体に対するアゴニストを見出し、それをプローブとして受容体ｃＤＮＡ導入細胞における受容体の発現を検証した後に、アゴニストと同じ様な細胞内情報伝達系の活性化物質を探索し、これを精製し、リガンドの構造を決定している。
またカタツムリのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター（ＧＲＬ１０４）をコードするｃＤＮＡをＣＨＯ細胞に導入してレセプター発現細胞での特異的な細胞内遊離カルシウム濃度の上昇を指標として新規生理活性ペプチドを同定した例が報告されているが（Cox,K.J.A., et al., J. Neurosci., 17(4), 1197-1205, 1997)、この新規生理活性ペプチドは既知のleucokininと高い相同性を有し、ＧＲＬ１０４は既知のleucokininとの反応性もあった。このようにオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の中でリガンドがおおよそ推定されうるものはほとんどなく、特に、既知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ファミリーと類似性が低い場合、リガンドに関する情報はほとんどなく、リガンドを推定することは困難であった。
オーファンＧ蛋白質共役型レセプターとして報告されているものの一つにＡＰＪがある(O'Dowd, B.F., et al., Gene, 436, 355-359, 1993)。ＡＰＪはアンギオテンシンレセプター（ＡＴ１）と低いホモロジーがあるが、ＣＨＯ細胞でＡＰＪを発現させてもアンギオテンシンIIとの反応が全く認められなかったためそのリガンドが何であるのかはこれまで不明であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
中枢神経系、循環器系、生殖器系、免疫系、消化器等で発現しているオーファンＧ蛋白質共役型レセプターであるＡＰＪに対するリガンドは、医薬として有用であると考えられるが、これまでにその構造および機能については明らかにされていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）をコードするｃＤＮＡを適当な手段で発現させた細胞を用い、特異的な細胞刺激（シグナル伝達）活性の測定等を指標に、該レセプター蛋白質がリガンドとして認識するポリペプチドをスクリーニングすることに成功した。
さらに、本発明者らは、該活性因子であるリガンドと上記レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができることを見いだした。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に対する結合能を有するポリペプチドもしくはその前駆体またはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（２）ポリペプチドが配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（３）ポリペプチドが配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列を含有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（４）ポリペプチドが（ａ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４０番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｃ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｄ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｅ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｆ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したアミノ酸配列を有するペプチド、（ｇ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第１番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｉ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｋ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｌ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｍ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｎ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｏ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６４番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｐ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｑ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７６番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたは（ｒ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７５番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（５）ポリペプチドが配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（６）ポリペプチドがpGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Pheで表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１）記載のポリペプチド、
（７）ポリペプチドが配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（８）前駆体が、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（９）前駆体が、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（１０）前駆体が、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（１１）前駆体が、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１）項記載のポリペプチド、
（１２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に対する結合能を有するポリペプチドもしくはその前駆体をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（１３）ポリペプチドが配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（１４）ポリペプチドが配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（１５）ポリペプチドが配列番号：１５、配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（１６）前駆体が、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（１７）前駆体が、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（１８）前駆体が、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（１９）前駆体が、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１２）項記載のＤＮＡ、
（２０）上記（１２）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（２１）上記（１２）項記載のＤＮＡまたは上記（２０）項記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
（２２）上記（２１）項記載の形質転換体を培養することを特徴とする上記（１）項記載のポリペプチド、その部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（２３）上記（１）項記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（２４）上記（１２）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（２５）中枢神経機能調節剤、循環機能調節剤、心臓機能調節剤、免疫機能調節剤、消化器機能調節剤、代謝機能調節剤または生殖器機能調節剤である上記（２３）項または上記（２４）項記載の医薬、
（２６）上記（１）項記載のポリペプチドもしくはその前駆体またはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
（２７）上記（２６）項記載の抗体を含有してなる診断剤、
（２８）上記（１）項記載のポリペプチドまたはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質を用いることを特徴とする配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質と上記（１）項記載のポリペプチドまたはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などに関する。
【０００７】
さらに、本発明は、
（２９）哺乳動物由来である上記（１）項記載のポリペプチド、
および
（３０）痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、糖尿病、癌、膵炎、腎疾患、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫、乳汁分泌不全またはエイズなどの疾病の治療・予防剤である上記（２３）または（２５）項記載の医薬などを提供するものである。
【０００８】
本発明におけるリガンドポリペプチドに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に関して、具体的には、
（３１）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、または
（３２）蛋白質が、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記（３１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩などに関する。
【０００９】
本明細書において、「実質的に同一」とはタンパク質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活性、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿入はしばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさないが、こうした場合その置換、欠失、付加あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができうる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のリガンドポリペプチドは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）に結合することができるものであればいかなるものでもよい。具体的には、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチド、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、などを含有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１１】
本発明のリガンドポリペプチド（以下、単にポリペプチドと略称する場合がある）、その製造法および用途を以下にさらに詳細に説明する。
本発明の上記リガンドポリペプチドとしては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するポリペプチドであって、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであれば如何なるものであってもよく、具体的には、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチド、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチド、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドなどを含有するものであればよい。例えば、本発明のリガンドポリペプチドとしては、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの他に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約５０〜９９．９％（好ましくは７０〜９９．９％、より好ましくは８０〜９９．９％、さらに好ましくは９０〜９９．９％）の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、▲２▼配列番号：１５で表される前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドまたは▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、などが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例えばレセプター結合活性、シグナル伝達活性などが挙げられる。
実質的に同質とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなどの強弱、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１２】
本発明のポリペプチドとして具体的には、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列、などで表わされるアミノ酸配列を含有するマウス脳、ラット脳、ブタ脳、ブタ小腸、ウシ視床下部、ウシ胃、ヒト視床下部またはヒト肺由来のポリペプチドなどが挙げられる。
さらに、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列などと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドに対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加あるいは挿入されているアミノ酸配列を含有するポリペプチドは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとして挙げられる。例えば、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列中の１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列に１個以上２０個以下、好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列中の１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどである。
さらに、本発明のポリペプチドもしくは部分ペプチドには、ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したものなども含まれる。
本発明の前駆体とは、本発明のリガンドペプチドをその部分配列として含有する蛋白であればいかなるものであってもよく、具体的には、配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白などがあげられる（以下、前記のリガンドポリペプチドとともに本発明のポリペプチドまたはリガンドポリペプチドと称することがある）。
また、本発明のポリペプチドの分子量は約１０００〜１００００ダルトン、好ましくは約１０００〜約５０００ダルトン、より好ましくは、約１０００〜約３０００ダルトンである。
本明細書における（ポリ）ペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（-COOH)またはカルボキシレート(-COO-)であるが、Ｃ末端がアミド（-CONH2)またはエステル(-COOR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキルなどのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するポリペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この時のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
本発明のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチドは、ヒトや温血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方法によって製造することもできるし、後述のポリペプチド合成法に準じて製造することもできる。また、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
上記したように本発明のポリペプチドは、自体公知のポリペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１４】
ポリペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBtなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００１５】
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１６】
本発明のポリペプチドとしては、上記した▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列などと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドと同様の作用（中枢神経機能調節作用、心臓機能調節作用、免疫機能調節作用、消化器機能調節作用、代謝機能調節剤または生殖器機能調節作用など）を有しているものであれば、どのようなペプチドであってもよい。このようなペプチドとしてはたとえば、上記した▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列などを有するペプチドから１個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。具体的には、(1)配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(2)配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１３番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(3)配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(4)配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(5)配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(6) 配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドなどが好ましい。
なかでも、配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドなどが好ましい。
また、配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するポリペプチドとして具体的には、
（ａ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４０番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｃ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｄ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｅ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｆ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したもの、（ｇ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第１番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｉ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｋ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｌ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｍ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｎ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｏ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６４番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｐ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｑ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｒ）配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、などがあげられ、なかでも配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したものまたは配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく用いられる。特に、配列番号：１５、３８、４０または４２で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したもの（pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe）が好ましい。さらにpGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Pheで表されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列を有するペプチドも本発明の（ポリ）ペプチドとして好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドはさらに抗リガンドポリペプチド抗体の調製のための抗原として用いることができる。このような抗原としてのポリペプチドは上記した本発明のポリペプチドの他に、上記本発明のポリペプチドのＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、中央部分のペプチドなどの部分ペプチドなどが用いられる。
部分ペプチドとしては、個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本明細書における部分ペプチドもＣ末端がアミド（-CONH2)またはエステル(-COOR)であってもよい。ここでエステル基の例としては上記したポリペプチドの場合と同様である。該部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この時のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドは、さらに、機能あるいは性質がよく知られているタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、前述のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩は、上記したポリペプチドの場合と同様の合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００１７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に対する結合能を有するＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)によって増幅することもできる。
より具体的には、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列を含有するマウス全脳、ラット全脳、ウシ視床下部、ウシ胃由来、ヒト視床下部またはヒト肺由来のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、(1)▲１▼配列番号：２で表される塩基配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１６で表わされる塩基配列の部分配列、▲３▼配列番号：３９で表される塩基配列の部分配列、▲４▼配列番号：４１で表される塩基配列の部分配列、または▲５▼配列番号：４３で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、(2)ストリンジェントな条件下で(1)で規定された配列とハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ、(3)遺伝コードの縮重のため(1)および(2)に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaCl, 10mM NaH2PO4・H2O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。
上記配列番号：２で表される塩基配列において、ＹはＴまたはＣを、ＮはＴ，Ｃ，ＡまたはＧを、ＲはＡまたはＧを、ＭはＣまたはＡを、ＷはＴまたはＡを、ＳはＣまたはＧを示す。
また、本発明の▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、▲２▼配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲３▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の部分配列、▲４▼配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の部分配列または▲５▼配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するポリペプチドをコードするＤＮＡの中で例えば６個以上５１個以下（好ましくは９個以上３０個以下、さらに好ましくは１２個以上３０個以下）の部分塩基配列を含有するＤＮＡ断片はＤＮＡ検出プローブとしても好ましく用いられる。
【００１８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のポリペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えば本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。
クローン化された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００１９】
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２０】
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
【００２１】
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
【００２２】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等が挙げられる。
このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明のポリペプチド等を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポリペプチド等の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチド等をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のポリペプチド等をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のポリペプチド等を生成、蓄積せしめることによって、本発明のポリペプチド等を製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２４】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jounal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（dhfr-）細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
【００２５】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００２６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたは本発明のポリペプチドは、▲１▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドの一部、あるいは全長の合成、▲２▼本発明のポリペプチドの有する生理作用の探索、▲３▼合成オリゴヌクレオチドプローブあるいはＰＣＲのプライマーの作成、▲４▼Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドや前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの入手、▲５▼組換え型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、▲６▼抗体および抗血清の入手、▲７▼ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体または抗血清を用いた診断薬の開発、▲８▼中枢神経機能調節剤、循環機能調節剤、心臓機能調節剤、免疫機能調節剤、消化器機能調節剤、代謝機能調節剤あるいは生殖器機能調節剤などの医薬の開発、▲９▼遺伝子治療等に用いることができる。
特に、後述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系によって、ヒトなどの温血動物に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。
【００２７】
さらに、上記▲８▼に関し、本発明のポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡは中枢神経系、循環器系、心臓、免疫系、消化器系、代謝系または生殖器系などで発現しているＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質がリガンドとして認識するものであるので、安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡは中枢神経機能調節作用、循環機能調節作用、心臓機能調節作用、免疫機能調節作用、消化器機能調節作用、代謝機能調節作用あるいは生殖器機能調節作用などに関与していることから、たとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、糖尿病（例、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いることができる。さらに手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤などとしても用いることができる。
加えて、ＨＩＶ感染症、エイズ（ＡＩＤＳ（Acquired Immune Deficiency Syndrome）：後天性免疫不全症候群）などの治療・予防剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡを上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合は、該ＤＮＡを単独またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従がって実施することができる。
【００２８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の肺気腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の肺気腫患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００２９】
上記本発明のポリペプチドに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、ヒトや温血動物（例えば、哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）など）のあらゆる組織（例えば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であって、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。すなわち、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。
これらの蛋白質が示す活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００３０】
さらに、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００３１】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の塩としては、上記したポリペプチドの塩と同様のものが挙げられる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩またはその部分ペプチドは、ヒトや温血動物の組織または細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、前述のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する方法と同じ方法によっても製造することができる。また、前述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。すなわちＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドの塩としては、上記したリガンドポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００３２】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接自体公知のＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、配列番号：３のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３３】
本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび抗体などの用途について、以下に具体的に説明する。
（１）リガンドポリペプチド欠乏症の予防・治療剤
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）に対する本発明のポリペプチドが有する作用に応じて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをリガンドポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）欠乏症の予防・治療剤としても使用することができる。
例えば、生体内において、本発明のポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）が減少しているためにリガンドの生理作用（中枢神経機能調節作用，循環機能調節作用、心臓機能調節作用、免疫機能調節作用、消化器機能調節作用、代謝機能調節作用あるいは生殖器機能調節作用など）が期待できない患者がいる場合に、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）脳細胞などに本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該脳細胞を該患者に移植することなどによって、該患者の脳細胞におけるリガンドポリペプチドの量を増加させ、リガンドポリペプチドの作用を充分に発揮させることができる。したがって、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、安全で低毒性なリガンドポリペプチド欠乏症の予防・治療剤などとして用いることができる。
上記ＤＮＡを上記治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記した本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを医薬として使用する場合と同様の手段に従って実施することができる。
【００３４】
（２）リガンドポリペプチドに対するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）の定量法
本発明のポリペプチドはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）またはその塩や該レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩に対して結合性を有しているので、生体内におけるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩、または該レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩の濃度を感度良く定量することができる。
この定量法は、例えば競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のポリペプチドと接触させることによって被検体中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩、またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）の部分ペプチドもしくはその塩の濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の▲１▼または▲２▼などに記載の自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
▲１▼入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
▲２▼入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００３５】
（３）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）と、本発明のポリペプチドまたはそれらのアミド、エステルもしくはそれら塩（以下、リガンドまたはリガンドポリペプチドと略称する場合がある。）との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）またはその塩や該部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。このような化合物には、Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（即ちＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）などが含まれる。「リガンドとの結合性を変化させる」とは、リガンドとの結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００３６】
すなわち、本発明は、（ｉ）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩または該レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に、本発明のリガンドを接触させた場合と（ii）上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩または該レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）または該レセプター蛋白質の部分ペプチドに、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）または該レセプター蛋白質の部分ペプチドに、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）または該レセプター蛋白質の部分ペプチドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識した本発明のポリペプチドを、上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）の部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）もしくはその塩、または該部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識した本発明のポリペプチドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識した本発明のポリペプチドを、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００３８】
▲４▼Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチド）をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を含有する細胞に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を活性化する化合物および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を含有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドなど）をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を活性化する化合物、および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００３９】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）としては、上記のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）などが適している。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を製造するには、前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
【００４０】
該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００４１】
本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプターとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識した本発明のポリペプチドが用いられる。Ｇ蛋白質共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。
具体的には、本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターや本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のポリペプチドを添加し、同時に１０-4〜１０-1μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞が必要である。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞としては、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）標品
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したリガンド
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
本発明のポリペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４４】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
［数１］
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0 ：最大結合量
【００４５】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター（ＡＰＪ）との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプターとの結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記したＧ蛋白質共役型レセプターを介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させ、上記Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストである。
(b)Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたはＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストなど）をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物および試験化合物をＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激活性を測定し、比較する。Ｇ蛋白質共役型レセプターを活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニストである。
該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドと同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴニストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のポリペプチドは中枢神経機能調節作用、循環機能調節作用、心臓機能調節作用、免疫機能調節作用、消化器機能調節作用、代謝機能調節作用あるいは生殖器機能調節作用などに関与していることから、上記したアゴニストあるいはアンタゴニストをたとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例：糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いることができる。さらに催眠鎮静剤、手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤、降圧剤などとしても用いることができる。
加えて、ＨＩＶ感染症、エイズ（ＡＩＤＳ（Acquired Immune Deficiency Syndrome）：後天性免疫不全症候群）などの治療・予防剤として用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、上記の本発明のポリペプチドを医薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
【００４６】
（４）本発明のポリペプチドに対する抗体または抗血清の製造
本発明のポリペプチドに対する抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、ポリクローナル抗体は、後述の方法に従って製造することができる。
【００４７】
［ポリクローナル抗体の作製］
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド等抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、後述のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物（例えば、哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）など）に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテン（本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチド）との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、上記温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取される。
抗血清中の本発明のポリペプチドに対する抗体価の測定は、後述のハイブリドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、後述のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４８】
また、モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、温血動物（例えば、哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）など）に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。
【００４９】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された上記の温血動物、たとえばマウスなどから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ポリペプチドまたはその部分ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕等に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明のポリペプチドに対する抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、たとえば本発明のポリペプチド抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドを加え、固相に結合した本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の本発明のポリペプチドに対する抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００５０】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。
上記の（ａ）および（ｂ）の方法に従って製造させる本発明のポリペプチドに対する抗体は、それぞれ本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、
（ｉ）本発明のポリペプチドに反応する抗体と、被検液および標識した本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識した本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法において、一方の抗体が、本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反応する抗体であることを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
【００５１】
本発明のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えばリガンドポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００５２】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗リガンドポリペプチド抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化抗リガンドポリペプチド抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のリガンドポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる抗リガンドポリペプチド抗体は本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ末端部以外、例えばＮ末端部を認識する抗体が用いられる。
【００５３】
本発明のポリペプチドに対する抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５４】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
また、本発明のポリペプチドに対する抗体は、たとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例：糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫または乳汁分泌不全などの診断剤（薬）として用いることができる。
加えて、ＨＩＶ感染症、エイズ（ＡＩＤＳ（Acquired Immune Deficiency Syndrome）：後天性免疫不全症候群）などの診断剤（薬）として用いることができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００５５】
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｙ ：チミンまたはシトシン
Ｎ ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ ：アデニンまたはグアニン
Ｍ ：シトシンまたはアデニン
Ｗ ：チミンまたはアデニン
Ｓ ：シトシンまたはグアニン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ ：グリシン
ＡｌａまたはＡ ：アラニン
ＶａｌまたはＶ ：バリン
ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ ：セリン
【００５６】
ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ ：システイン
ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ ：リジン
ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＡＭ ：フェニルアセトアミドメチル
【００５７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒｔ：トリチル
ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル
【００５８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ウシ型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列（Ｎ末端から１７配列）を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）ｃＤＮＡにコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：６〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：７〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：８〕
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：９〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１０〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１１〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１２〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１３〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１４〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１５〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
マウス型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１８〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：１９〕
ラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２０〕
ラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２１〕
ラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２２〕
ラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２３〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２４〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２５〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２６〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２７〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２８〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：２９〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３０〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３１〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３２〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３３〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３４〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３５〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３６〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３７〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡ。
〔配列番号：３８〕
ラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ラット型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４１〕
ヒト型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
ウシ型リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
後述の実施例１１で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pmA10L-13は平成９年１２月２２日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２１４として寄託されている。
後述の実施例１３で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/prSHe-1は平成１０年１月２０日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２８として寄託されている。
後述の実施例１４で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/phSuN-4は平成１０年１月２０日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２９として寄託されている。
後述の実施例１５で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pBovA10prec24は平成１０年１月２０日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３０として寄託されている。
後述の実施例３５で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）BL21(DE3)/pTB960-13は平成１０年１２月２日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５９０として寄託されている。また平成１０年１１月１１日から受託番号ＩＦＯ１６２２０として財団法人発酵研究所（IFO）に寄託されている。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
【参考例１】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの製造
公知のヒト由来ＴＲＨレセプター蛋白質（ＨＴＲＨＲ）、ヒト由来ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質（Ｌ１０９１８、ＨＵＭＲＡＮＴＥＳ）、ヒトバーキットリンパ腫由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６８１４９、ＨＳＢＬＲ１Ａ）、ヒト由来ソマトスタチンレセプター蛋白質（Ｌ１４８５６、ＨＵＭＳＯＭＡＴ）、ラット由来μ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ０２０８３、ＲＮＵ０２０８３）、ラット由来κ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ００４４２、Ｕ００４４２）、ヒト由来ニューロメジンＢレセプター蛋白質（Ｍ７３４８２、ＨＵＭＮＭＢＲ）、ヒト由来ムスカリン作動性アセチルコリンレセプター蛋白質（Ｘ１５２６６、ＨＳＨＭ４）、ラット由来アドレナリンα１Ｂレセプター蛋白質（Ｌ０８６０９、ＲＡＴＡＡＤＲＥ０１）、ヒト由来ソマトスタチン３レセプター蛋白質（Ｍ９６７３８、ＨＵＭＳＳＴＲ３Ｘ）、ヒト由来Ｃ５ａレセプター蛋白質（ＨＵＭＣ５ＡＡＲ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質（ＨＵＭＲＤＣ１Ａ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｍ８４６０５、ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）およびラット由来アドレナリンα２Ｂレセプター蛋白質（Ｍ９１４６６、ＲＡＴＡ２ＢＡＲ）の第１膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分を見いだした。
また、公知のマウス由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｍ８０４８１、ＭＵＳＧＩＲ）、ヒト由来ボンベジンレセプター蛋白質（Ｌ０８８９３、ＨＵＭＢＯＭＢ３Ｓ）、ヒト由来アデノシンＡ２レセプター蛋白質（Ｓ４６９５０、Ｓ４６９５０）、マウス由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｄ２１０６１、ＭＵＳＧＰＣＲ）、マウス由来ＴＲＨレセプター蛋白質（Ｓ４３３８７、Ｓ４３３８７）、ラット由来ニューロメジンＫレセプター蛋白質（Ｊ０５１８９、ＲＡＴＮＥＵＲＡ）、ラット由来アデノシンＡ１レセプター蛋白質（Ｍ６９０４５、ＲＡＴＡ１ＡＲＡ）、ヒト由来ニューロキニンＡレセプター蛋白質（Ｍ５７４１４、ＨＵＭＮＥＫＡＲ）、ラット由来アデノシンＡ３レセプター蛋白質（Ｍ９４１５２、ＲＡＴＡＤＥＮＲＥＣ）、ヒト由来ソマトスタチン１レセプター蛋白質（Ｍ８１８２９、ＨＵＭＳＲＩ１Ａ）、ヒト由来ニューロキニン３レセプター蛋白質（Ｓ８６３９０、Ｓ８６３７１Ｓ４）、ラット由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６１４９６、ＲＮＣＧＰＣＲ）、ヒト由来ソマトスタチン４レセプター蛋白質（Ｌ０７０６１、ＨＵＭＳＳＴＲ４Ｚ）およびラット由来ＧｎＲＨレセプター蛋白質（Ｍ３１６７０、ＲＡＴＧＮＲＨＡ）の第６膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分を見いだした。
上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Proteinシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフトウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Data Bank を検索した際に示される整理番号であり、それぞれ通常Accession Numberおよびエントリーネームと呼ばれるものである。ただし、ＨＴＲＨＲは特開平７−３０４７９７号に記載されている配列である。
特に、多くのレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩基部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多くのレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために混合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通する塩基配列に相補的である配列番号：５および配列番号：６で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本を作成した。
〔合成ＤＮＡ〕
５'−ＣＧＴＧＧ（ＧまたはＣ）Ｃ（ＡまたはＣ）Ｔ（ＧまたはＣ）（ＧまたはＣ）ＴＧＧＧＣＡＡＣ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＣＣＴＧ−３'（配列番号：５）
５'−ＧＴ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）ＧＧＣＡ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）ＣＣＡＧＣＡＧＡ（ＧまたはＴ）ＧＧＣＡＡＡ−３'（配列番号：６）
（ ）内は合成時に複数の塩基に混合して合成する。
【００６１】
【実施例１】
ヒト扁桃核由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるＧ蛋白質共役型受容体ｃＤＮＡの増幅
ヒト扁桃核由来ｃＤＮＡ（QuickClone、クロンテック社）を鋳型として用い、参考例１で合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列：５’プライマー配列および３’プライマー配列）各１μＭ、鋳型ｃＤＮＡ １ｎｇ、０.２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase １μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応溶液量は１００μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９６℃・３０秒、４５℃・１分、６０℃・３分のサイクルを３０回繰り返した。Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase を添加する前に、残りの反応液を混合し、９５℃・５分、６５℃・５分の加熱を行った。増幅産物の確認は１.２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって行った。
ＰＣＲ後の反応産物の一部（１μｌ）を用いて、ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）の処方に従い、増幅したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲTMII（ＴＭは登録商標を意味する）へサブクローニングした。これを大腸菌ＩＮＶαＦ' competent cell（インビトロゲン社）に導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で選択し、形質転換体の指標である白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離して多数の形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラスミド抽出装置（クラボウ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡの一部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用いて行った。
塩基配列の解析をもとに多数の形質転換体のなかからＧ蛋白質共役型受容体の１種であるＡＰＪ受容体の第１膜〜第６膜に相当するｃＤＮＡのＰＣＲ産物が挿入されたクローン E.coli ＩＮＶ αＦ'／ｐＡ１０を見いだした。
その塩基配列は、O'Dowd, B. F. et al．によって報告されたＡＰＪ受容体遺伝子の塩基配列（Gene 第136巻, 355-360頁, 1993年）の３１８番目から９９３番目までの部分に相当するが、変性プライマーを用いたＰＣＲ産物であるため、プライマー部分の配列はＡＰＪとは異なり、また、Ｎ末端およびＣ末端が欠けている。
【００６２】
【実施例２】
ヒト扁桃核由来ｃＤＮＡライブラリーからのレセプター蛋白質の全コード領域を含むｃＤＮＡのクローニング
完全長のＡＰＪ受容体をコードするＤＮＡを入手するため、ヒト扁桃核由来ｃＤＮＡライブラリーを実施例１で得られたＡＰＪ受容体ｃＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングを行った。ヒト扁桃核由来ｃＤＮＡライブラリーとしては、クローンテック社製のλｇｔ１１ファージベクターを使ったライブラリーを用いた（クローンテック、ＣＬＨＬ３００８６）。２×１０6ｐｆｕ（プラーク・フォーニング・ユニット）分のヒト扁桃核ｃＤＮＡライブラリーを、硫酸マグネシウムで処理した大腸菌Ｙ１０９０-と混ぜ、３７℃、１５分間インキュベートした後、０.５％アガロース（ファルマシア社）ＬＢを加え、１.５％寒天（和光純薬社）ＬＢプレート（５０μg/ml Ampicilin含有）に播いた。４２℃にて一晩培養してプラークのできたプレートにニトロセルロースフィルターを置き、フィルター上にプラークを転写した。このフィルターをアルカリ処理することによって変性させた後、８０℃、３時間の加熱によってＤＮＡの固定を行った。
このフィルターを、５０％ formamide，４×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's溶液，０.１％ ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファー中で以下に述べるプローブと４２℃で一晩インキュベートし、ハイブリダイズさせた。プローブとしては、実施例１で得られたプラスミドｐＡ１０に挿入されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断し、回収後、ランダムプライムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて〔32Ｐ〕ｄＣＴＰ（デュポン社）を取り込ませることによって標識して用いた。洗浄は、２×ＳＳＣ，０.１％ ＳＤＳで５５℃、１時間行い、その後、−８０℃でオートラジオグラフィーを行ってハイブリダイズするプラークを検出した。
このスクリーニングにより、４個の独立したプラークにハイブリダイゼーションのシグナルが認められた。これらの４個のクローンからそれぞれＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化したものをアガロース電気泳動後、スクリーニングに用いたものと同じプローブを用いてサザンブロットにより解析を行ったところ、各々約１.２ｋｂ，１.２ｋｂ，１.３ｋｂ，１.６ｋｂのところにそれぞれハイブリダイズするバンドを生じ、このうち約１.６ｋｂのバンドを生じるものを選択した（λ３４）。λ３４のファージＤＮＡを調製した後、ハイブリダイズするサイズのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、形質転換体 E. coli ＪＭ１０９／ｐＵＣ１１８−λ３４を得た。このプラスミドの塩基配列を実施例１で示した方法と同様に決定したところ、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）の全長をコードするＤＮＡを保持していることが分かった。またコードされているアミノ酸配列は、O'Dowd, B. F. et al.によって報告されているもの（Gene 第136巻, 355-360頁, 1993年）と同一であった。（GenBank accession number：Ｕ０３６４２）そのＤＮＡ配列とアミノ酸配列を〔図１〕に示す。
【００６３】
【実施例３】
ノーザンハイブリダイゼーションによるＡＰＪ受容体ｍＲＮＡのヒト組織における発現・分布の検出
実施例２で得られたプラスミドｐＵＣ１１８−λ３４にコードされるＡＰＪのヒト組織における発現をｍＲＮＡレベルで検出するため、ノーザンブロットを行った。ノーザンブロット用のフィルターはＨｕｍａｎ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ Ｉ，II（ＣＬ７７６０−１，ＣＬ７７５９−１）を用い、プローブは実施例１で用いたものと同じものを用いた。ハイブリダイゼーションは、上に述べたフィルターとプローブを５０％ formamide，５×ＳＳＰＥ，１０×Denhardt's溶液，２％ ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファー中で、４２℃で一晩インキュベートして行った。フィルターの洗浄は、０.１×ＳＳＣ，０.１％ ＳＤＳで５０℃にて行い、風乾後３日間−８０℃でＸ線フィルム（ＸＡＲ５，コダック）に感光させた。その結果を〔図２〕に示した。〔図２〕から、ｐＵＣ１１８−λ３４がコードするレセプター遺伝子はヒトの心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、大腸で発現していることが明らかになった。特に脾臓, 心臓, 胎盤において強く発現している。
【００６４】
【実施例４】
ＡＰＪ受容体発現ＣＨＯ細胞の作製
ｐＵＣ１１８−λ３４にコードされるｃＤＮＡ断片は約０.２ｋｂの５'側非翻訳領域を有し、発現効率を高めるためにはこの部分をできるだけ除去したほうが良いと考えられた。また、発現ベクターのクローニングサイトに対応した制限酵素サイトをｃＤＮＡ部分の両端に付加する必要があった。そのため、５'側と３'側の２本のｃＤＮＡ断片を以下の方法によって別々に処理し、動物細胞用発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１ＨのＳＲαプロモーターの下流に挿入してｐＡＫＫＯ−Ａ１０を構築した。まず、５'側非翻訳領域内とコード領域に各１カ所存在するＢｓｔＸＩサイトでｐＵＣ１１８−λ３４を切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて修復した後、ＳａｌＩリンカーをライゲーションによって付加した。ＳａｌＩ−ＳａｃＩ二重消化後、電気泳動によって分離し、約０.６ｋｂの断片を回収した。次に、ｐＵＣ１１８−λ３４に挿入されたｃＤＮＡ部分の両端をＥｃｏＲＩ消化によって切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって末端を修復した後、ＣｌａＩリンカーをライゲーションによって付加した。５'側部分に相当する断片と区別するためにＥｃｏＲＶで消化、さらにＣｌａＩ−ＳａｃＩ二重消化後、電気泳動によって分離し、約０.８ｋｂの断片を回収した。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるｐＡＫＫＯ−１１１Ｈはマルチクローニングサイト部分の制限酵素サイトＳａｌＩおよびＣｌａＩによって消化後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の操作によって調製したＡＰＪ受容体ｃＤＮＡの５'側、３'側断片および発現ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌ＤＨ５を形質転換してE. coli ＤＨ５／ｐＡＫＫＯ−Ａ１０を得た。
形質転換体E. coli ＤＨ５／ｐＡＫＫＯ−Ａ１０を培養し、プラスミドｐＡＫＫＯ−Ａ１０のＤＮＡを大量に調製した。
そのプラスミドＤＮＡのうちの２０μgを１mlの生理的食塩水（ＰＢＳ）に溶解後、ジーントランスファー（和光純薬）のバイアルに注入し、ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌してＤＮＡを含有するリポソームを形成させた。ＣＨＯｄｈｆｒ-細胞１ないし２×１０6個を直径３５mmの細胞培養用シャーレに播種し、２０時間培養した後に培養液を新鮮なものに交換した。各シャーレに対して０.５μgのＤＮＡに相当する量（２５μｌ）のリポソーム液を滴下し、１６時間インキュベーションを行ってプラスミドＤＮＡの導入を行った。さらに新鮮な培地に交換して１日間培養した後、選択培地に交換して３日間培養を続け、最後にトリプシン消化を行って分散させた細胞を低密度で選択培地（deoxyribonucleosidesおよびribonucleosidesを含有しないminimum essential medium，alpha mediumに１０％透析ウシ血清を加えたもの）中に播種し、形質転換体の選択を行った。形質転換体のみが選択培地中で増殖することが可能であり、継代を繰り返すことによって選択を重ね、ＣＨＯ−Ａ１０細胞を樹立した。
【００６５】
【実施例５】
ＣＨＯ−Ａ１０細胞株での全長レセプター蛋白質の発現量の転写レベルでの確認
Fast Track kit（Invitrogen社）を用い、キットの処方にしたがってＣＨＯ−Ａ１０細胞とコントロールのＣＨＯ細胞からpoly(Ａ)+ＲＮＡを調製した。このpoly(Ａ)+ＲＮＡを０.０２μg用い、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（宝酒造）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。用いたプライマーの種類はrandom 9merで、反応液の全容量は４０μlとした。また、ｃＤＮＡ合成のネガティブコントロールとして、リバーストランスクリプターゼを添加しない反応液も準備した。最初、３０℃で１０分間のインキュベートを行ってプライマーからの伸長反応をある程度行わせた。その後、４２℃で３０分間インキュベートして十分に逆転写反応を進行させ、９９℃で５分間加熱して酵素を失活し、さらに５℃で５分間冷却した。
逆転写反応終了後に反応液の一部を回収し、蒸留水で希釈した後、フェノール／クロロフォルム抽出、ジエチルエーテル抽出を行った。これをエタノール沈殿し、一定量の蒸留水に溶解したものをｃＤＮＡの試料とした。このｃＤＮＡ溶液およびプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−Ａ１０）を段階的に希釈したものを作成し、全長レセプター蛋白質に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。全長レセプター蛋白質のコード領域の塩基配列に基づいて作成したプライマーの配列は、
５'−ＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴ−３'（配列番号：７）
５'−ＡＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴ−３'（配列番号：８）
である。
ＰＣＲ反応は、プライマー各１μMおよびＴａｑ ＤＮＡ polymerase（宝酒造）０.５μl、酵素に添付の反応バッファーおよびｄＮＴＰｓと１０μlの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはプラスミド溶液）を用いて全容量１００μlで行った。最初に９４℃で２分間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後に、９５℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で６０秒のサイクルを２５回行った。反応終了後に１０μlの反応液を用いてアガロールゲル電気泳動を行い増幅産物の検出および量的な比較を行った。その結果全長レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡの配列から推定される大きさ（約１.１ｋｂ）のＰＣＲ産物が、検出された〔図３〕。リバーストランスクリプターゼを添加しなかった逆転写反応産物を鋳型として用いたＰＣＲ反応液のレーンに特異的なバンドは検出されず、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物である可能性は除外され、また、コントロールの細胞のレーンにも特異的なバンドが出現しないことから、ＣＨＯ細胞にもとから発現しているｍＲＮＡ由来ではないことが確認された〔図３〕。
【００６６】
【実施例６】
組織抽出物に含まれるＣＨＯ−Ａ１０細胞を特異的に刺激する活性のサイトセンサーによる検出
ウシ胃，ブタ小腸・脳から、基本的に以下に述べる方法によって抽出物を調製し、冷凍保存したものを細胞刺激活性のスクリーニング用のサンプルとした。
組織を煮沸、破砕したものを０.５Ｍ 酢酸を用いて抽出し、抽出物を濾過後にarginic acidに吸着させ、０.２Ｍ 塩酸によって溶出した画分に含まれる物質をさらに塩析法によって収集し、メタノールにて洗浄後に真空乾燥させた。これを蒸留水に再溶解してｐＨ７.２に調整した後、２倍量のエタノールを添加し、生成した沈殿物を濾過法によって収集した。再び蒸留水に溶解し、ｐＨ４.２に調製して生成した沈殿物を除去した後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物を０.２Ｍ 酢酸に溶解した後、セファデックスＧ−２５カラムにてゲル濾過による分画を行い、各フラクションを凍結乾燥した。
また、ウシ視床下部を煮沸、破砕したものを１Ｍ 酢酸を用いて抽出し、遠心分離した上清に０.０５％ ＴＦＡを添加した後にＣ１８カラムに吸着させ、１０％、３０％、５０％濃度のアセトニトリルによって段階的に溶出した。それぞれの溶出液を２０ｍＭ 酢酸アンモニウム−１０％ アセトニトリル（ｐＨ４.５）でそれぞれ調製後、ＣＭセファロース陽イオン交換カラム（HiPrep CM Sepharose FF，ファルマシア）に吸着させた。１００mM、２５０mM、５００mM、１０００mM酢酸アンモニウム溶出画分およびカラムの素通り画分をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラムを用いて濃縮・脱塩を行った後、凍結乾燥して細胞刺激活性のスクリーニング用のサンプルとした。
細胞刺激活性は、サイトセンサー（モレキュラー・デバイシズ社製）を用いて、細胞外ｐＨの変化率を指標にして測定した。ＣＨＯ−Ａ１０細胞あるいはコントロールの細胞をトリプシン消化によって分散させ、３×１０5個/mlの細胞懸濁液に調製したものをサイトセンサー用のカプセル１個あたり０.９mlずつ分注し、一晩培養した。細胞の入ったカプセルをセンサーチャンバーに移し、さらにサイトセンサーのワークステーションにセットした。サイトセンサーに組み込まれたポンプを用いてポンプＯＮ（１分２０秒間）とポンプＯＦＦ（４０秒間）を繰り返して行い、ポンプＯＦＦ後８秒から３８秒の間（３０秒間）の細胞外ｐＨの変動を測定し、各サイクルごとのｐＨの変化率を算出させた。ｐＨの変化率が安定した値となるまで（約２時間）細胞を馴化させた後、２系統ある流路の一方にサイトセンサー用の培地に溶解したサンプルをセットした。流路の切り換えによって７分２秒間細胞にサンプルの入った培地を暴露し、細胞外ｐＨの変化率の変動を測定した。
上述の方法でウシ胃、ブタ小腸、ブタ脳より調製した組織抽出・精製物の凍結乾燥品に、１０mgあたり１mlの蒸留水を添加し、不溶物を遠心分離によって除去した後、０.１％ ウシ血清アルブミン（Sigma，A-2153，fraction V）を添加したサイトセンサー用のlow buffered RPMI1640培地に１／４０量添加して測定用のサンプルとした（終濃度０.２５mg/ml）。サンプルによっては培地のｐＨを大きく変化させるものがあるため、培地に含有されるフェノールレッドの色を指標としてｐＨの調節を行った。ＣＨＯ−Ａ１０およびコントロールの細胞にこのサンプルを投与し、細胞の反応の差を指標として細胞刺激活性を含有するサンプルをスクリーニングした。また、クロマトグラフィーによって分離・精製したサンプルについては、サンプルを効率良く溶解するために少量のＤＭＳＯに溶解した後、０.１％ ウシ血清アルブミン（Sigma, A-2153，fraction V）を添加したサイトセンサー用のlow buffered RPMI1640培地に溶解した。この場合、サンプルを加えない培地についても同量（０.２％）のＤＭＳＯを添加して細胞をあらかじめ順化させておいた。
ウシ胃、ブタ小腸、ブタ脳より上記の方法にしたがって調製したサンプルについてサイトセンサーを用いて細胞外ｐＨの変化率を指標に細胞刺激活性を測定した結果、〔図４および図５〕に示すようにコントロールの細胞に比べてＡＰＪ受容体導入ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ａ１０）を特異的に活性化（細胞外ｐＨの変化率を上昇）させるサンプル（Ｂ３，Ｂ４，Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｇ４，Ｇ６）を見いだした。また、ウシ視床下部より調製したサンプルについても同様の測定を行った結果、〔図６および図７〕に示すようにＦｒ．１０（Ｃ１８カラムのアセトニトリル３０％溶出画分をＣＭセファロースイオン交換カラムに吸着させ、１０００ｍＭ酢酸アンモニウムで溶出させた画分）に特異的な細胞刺激活性（細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性）を検出した。
【００６７】
【実施例７】
細胞刺激活性の強さを指標としたＡＰＪ受容体高発現細胞の選択
ＣＨＯ−Ａ１０細胞は、発現ベクターｐＡＫＫＯ−Ａ１０を導入して得た形質転換細胞を、選択培地中で培養を続けることによって樹立したものである。そのため、個々の細胞によっては導入されたｃＤＮＡのコピー数などが異なり、そのために細胞上に発現しているＡＰＪ受容体の数に差が生じている可能性がある。そのような集団の中から機能的な受容体の高産生細胞をクローニングによって樹立すれば、高感度で安定的なアッセイの結果が行えるようになることが期待される。そこで、ウシ視床下部から実施例８に示すウシ胃の場合と同様の方法で調製したRESOURCE RPCによる逆相クロマトグラフィー後の活性画分の一部を集めて標準サンプルとし、サイトセンサーによって測定される細胞刺激活性を指標としてＡＰＪ受容体高発現細胞の選択を行った。８個の独立したクローンについて細胞刺激活性を測定したところ〔図８〕に示すようにクローン番号１，３，４，６に対し顕著な細胞刺激活性を検出した。これらのクローンのうちＮｏ．６クローン（ＣＨＯ−Ａ１０，clone 6）をさらに培養し、以降の細胞刺激活性の測定に使用した。
【００６８】
【実施例８】
ウシ胃からのＣＨＯ−Ａ１０細胞株から特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性物質（ペプチド）の精製
ＣＨＯ−Ａ１０細胞株から特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性物質についてウシ第一胃および第二胃から精製した代表例を以下に具体的に述べる。ウシ第一胃１．０ｋｇおよび第二胃１．０ｋｇを小片化し、蒸留水４．０Ｌ中で２０分間煮沸した。氷上にて急冷した後、終濃度１．０Ｍとなるように酢酸２８０ｍｌを加え、ポリトロン（１２，０００ｒｐｍ、１２ｍｉｎ）にてホモジナイズした。ホモジェネートを一晩撹拌した後、遠心（９，５００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）にて上清を得た。沈殿物は１．０Ｍ酢酸２．０Ｌに懸濁し、ポリトロンにてホモジナイズし遠心にて再度上清を得た。上清を一つにまとめ、終濃度０．０５％となるようにＴＦＡを加え、逆相Ｃ１８カラム（Prep C18 125Å 100ml；ミリポア)に添加した。添加後、０．０５％ＴＦＡ／ｄＨ2Ｏ（以下、ｄＨ2Ｏは蒸留水を示す） ２００ｍｌでカラムを洗浄後、１０％、３０％、５０％ＣＨ3ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ／ｄＨ2Ｏで３段階に溶出した。３０％ＣＨ3ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ／ｄＨ2Ｏ溶出画分に２倍量の２０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4／ｄＨ2Ｏを加え、陽イオン交換カラムHiPrep CM-Sepharose FF２０ｍｌ(pharmacia)に添加した。２０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4／１０％ＣＨ3ＣＮ／ｄＨ2Ｏでカラムを洗浄後、１００ｍＭ，２００ｍＭ，５００ｍＭ，１０００ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4／１０％ ＣＨ3ＣＮ／ｄＨ2Ｏで４段階に溶出した。１０００ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4溶出画分にＣＨＯ−Ａ１０細胞株から特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性が見いだされたので、この溶出画分に３倍量のアセトンを加え、除タンパク質およびエバポレーションによる濃縮を行った。濃縮された画分にＴＦＡ（終濃度０．１％）を加え、逆相カラムRESOURCE RPC １ｍｌ(Pharmacia)に添加した。１２．５％−２０．０％ＣＨ3ＣＮ濃度勾配による溶出で、１５．５％−１６．５％および１７．０％−１７．５％ ＣＨ3ＣＮの二つの画分（活性画分をそれぞれＰ−１、Ｐ−２とする）にＣＨＯ−Ａ１０細胞株から特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性が検出された〔図９〕。二つに分離した活性のうち１７．０−１７．５％ ＣＨ3ＣＮの溶出画分（Ｐ−２）を凍結乾燥の後、ＤＭＳＯに溶解し、０．１％ ＴＦＡ／ｄＨ2Ｏに懸濁し、逆相カラムdiphenyl 219TP5415(Vydac)またはSephasil C8 SC 2.1/10(Pharmacia)に添加した。
diphenyl 219TP5415においては、１４．０％−２０．０％ＣＨ3ＣＮ濃度勾配による溶出で、１７．０％ ＣＨ3ＣＮの画分にＣＨＯ−Ａ１０細胞株に対して特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性が検出された〔図１０〕。また、Sephasil C8 SC 2.1/10においては、１８．０％−２４．０％ ＣＨ3ＣＮ濃度勾配による溶出で１９．５％ ＣＨ3ＣＮの画分にＣＨＯ−Ａ１０細胞株に対して特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性が検出された〔図１１〕。diphenyl 219TP5415およびSephasil C8 SC 2.1/10の活性画分をそれぞれ凍結乾燥した後、ＤＭＳＯに溶解し、０．１％ ＴＦＡ／ｄＨ2Ｏに懸濁し、逆相カラムμRPC C2/C18 SC 2.1/10(Pharmacia)に添加した。diphenyl 219TP5415由来の活性画分は、１６．０％ＣＨ3ＣＮ均一濃度での溶出で１９．０−２０．５ｍｉｎに溶出される一つのピークに、Sephasil C8 SC 2.1/10由来の活性画分は、１６．０％ ＣＨ3ＣＮ均一濃度での溶出で１８．０−２０．０ｍｉｎに溶出される一つのピークにそれぞれＣＨＯ−Ａ１０細胞株に特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性が検出された〔図１２および図１３〕。
【００６９】
【実施例９】
ウシ胃からのＣＨＯ−Ａ１０細胞株に特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性物質（ペプチド）のアミノ酸配列決定
実施例８で精製されたＣＨＯ−Ａ１０細胞株に特異的に細胞外ｐＨの変化率を上昇させる活性ペプチド（Ｐ−２）のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラムμRPC C2/C18 SC 2.1/10で活性と一致した二つのピークの画分を凍結乾燥後、ペプチドシークエンサー（ＡＢＩ．４９２）によるアミノ酸配列の分析を行った。
その結果、どちらのピークからも同じアミノ酸配列（Ｎ末端から１７配列）が得られた〔配列番号：１〕。
【００７０】
【実施例１０】
ウシ胃由来ペプチド断片のマウス型をコードする遺伝子断片の同定
実施例９の精製産物のＮ末端アミノ酸分析によって得られた１７アミノ酸のウシ胃由来ペプチド断片を塩基配列に翻訳し〔配列番号：２〕、遺伝子配列解析ソフトGene Bright（日立ソフトウエア）を用いてGenBank/EMBL に登録されているExpressed Sequence Tag（EST）のデータベースに対してホモロジーサーチを行った。その結果、accession number がW33327として登録されていた機能未知のマウス由来ESTをアミノ酸に翻訳した配列に対し、配列番号：1で表される配列の一部が高い相同性を示し、該ESTがウシ胃由来ペプチド断片１７アミノ酸の後半部分から下流のマウス型をコードしていることを見いだした（図１４）。
【実施例１１】
実施例９で得られたＮ末端アミノ酸分析によって得られた１７アミノ酸のウシ胃由来ペプチド断片のマウス型をコードするリガンド遺伝子の全長クローニング
実施例１０で得たESTの配列を基に W33-F1（5'- CTGGCAGGGAGGCAGGAGGAA -3'）〔配列番号：９〕、W33-F2（5'-GCAGGAGGAAATTTCGCAGACAGC-3'）〔配列番号：１０〕、 W33-R1（5'-GAAGAGAATTCATCTGTGGAGTA-3'）〔配列番号：１１〕、W33-R2（5'-ACCGGCACCGGGAGGGCACTT-3'）〔配列番号：１２〕をそれぞれ合成した。またBALB/C マウスの全脳から、Isogen (Nippon gene) を用いてtotal RNAを、つづいてオリゴ(dT)セルロースカラム（mRNA Purification Kit, Pharmacia）を用いて、それぞれマニュアルに従って poly(A)+RNA を調製した。調製した１μｇの poly(A)+RNA からの Rapid Amprification of cDNA Ends (RACE)法で使用する二本鎖cDNA を Marathon cDNA Amplification Kit（Clontech）のマニュアルに従って合成し10μｌの蒸留水に溶解した。 これをさらにTE buffer で50倍に希釈したものを鋳型としてPCRを行った。DNA polymerase として EX Taq （Takara）を使用し、添付の10x EX Taq buffer を2.5 μｌ、dNTP mixture （各2.5mM）を1μｌ、TaqStart Antibody （Clontech）と等量混合した EX Taq を 0.5μｌにMarathon cDNA Amplification Kit に付属のアダプタープライマー AP1 またはAP2（それぞれ10μM）を0.5μｌと遺伝子特異的なプライマーW33-F1,W33-F2、 W33-R1、またはW33-R2（それぞれ10μM）を0.5μｌ、および鋳型cDNAを加え、蒸留水で25μｌとして反応液を調製した。１回目のRACEは、鋳型cDNA 溶液2.5μｌを反応液に加え、３’RACE ではW33-F1とAP1を、また５’RACE では W33-R1とAP1の組合せで、94℃・2分の熱処理後、98℃・10秒、72℃・2分のサイクルを５回、98℃・10秒、70℃・2分のサイクルを5回、続いて98℃・10秒、68℃・2分のサイクルを25回のＰＣＲを行った。この一回目のＰＣＲ産物2.5μｌを２回目のＰＣＲの鋳型として用いた。その際３’RACE ではプライマーの組合せをw33-F2とAP2 に、また５’RACE ではw33-R2とAP2にそれぞれ変更した。ＰＣＲ反応は94℃・2分の熱処理後、98℃・10秒、72℃・2分のサイクルを５回、98℃・10秒、70℃・2分のサイクルを5回、続いて98℃・10秒、68℃・2分のサイクルを30回とした。ＰＣＲ産物を1.2％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し、３’RACEでは約300ｂｐのバンドを、また５’RACEでは約600ｂｐのバンドをそれぞれ剃刀で切りだし、フィルター（UltraFree, Millipore）で遠心濾過後、フェノール抽出、エタノール沈澱をしてDNA 断片を回収した。これらの断片を Dye Terminator Cycle Sequencing Kit （ABI）でマニュアルに従って反応し、DNA sequencer Prism 377 （ABI）で塩基配列を解析し、全長配列を得た。この全長配列を含むDNA 断片を一本の断片として得るために、３’RACEと５’RACEで得られた配列情報を基に ２本のプライマーmF（5'- GAGAGTCGCGGGCAGAGCAGCGTCAG-3'）〔配列番号：１３〕とmR（5'-GAAATCATCCAAGTGAGGGGCGAGAC-3'）〔配列番号：１４〕をそれぞれ合成した。鋳型には、先に調製したマウス全脳 poly(A)+RNA 80ng からRNA PCR kit（Takara）により以下の方法で合成したcDNAを用いた。キット付属の random primer（9 mer）またはoligo(dT) 20-M4 adaptor primer をそれぞれ終濃度2.5 μMで用い、MgCl2を終濃度 5mM 、10x RNA PCR buffer 2μl、dNTP mixture（各2.5mM）を8μl、 RNase Inhibitor 20 U、AMV reverse transcriptase 5 U を加え、蒸留水で20μlとした。これらを30℃、10分（ただし random primer を用いたときのみ）の処理後、42℃で30分間cDNA合成をい、それぞれ５μlの蒸留水に溶解した後に混合して鋳型とした。ＰＣＲの反応液は、DNA polymerase として EX Taq を使用し、添付の10x EX Taq buffer を2.5μｌ、dNTP mixture（各2.5mM）を1μl、TaqStart Antibody（Clontech）と等量混合した EX Taq を 0.5μｌ、10μMのプライマーmF と mRをそれぞれ0.5μｌおよび鋳型cDNAを1μl加え、蒸留水で25μｌとして調製した。
ＰＣＲ反応は94℃・2分の熱処理後、98℃・10秒、68℃・30秒のサイクルを30回繰り返した。ＰＣＲ産物は2％アガロース電気泳動後、上記と同様の方法で約750bpのバンドを回収し、プラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen）へサブクローニングし、さらに E.coli JM109 へ導入し、 E.coli JM109／ｐｍＡ10L−13を得た。得られた形質転換体に挿入されたcDNA 断片の配列を解析した結果、このcDNA 断片はリガンドポリペプチドcDNA の全コード領域を含む断片であることが確認され、その遺伝子配列を図１５に示した。配列番号1に示したウシ胃由来のペプチド断片との比較（図１６）から、このマウス由来アミノ酸配列はウシ型断片のマウス型であると考えられた。
【実施例１２】
ウシ型ペプチドをコードするｃＤＮＡ断片の取得
RNA PCR Kit (AMV) Ver.2（宝酒造）の処方に従い、ウシ視床下部のpoly(A)+RNA画分0.35 μgを鋳型としてランダム9merおよびオリゴdTプライマーについてそれぞれ５本の反応液を調製した。逆転写反応は、30℃で10分間、42℃で30分間行ない、99℃で5分間の加熱によって反応を停止させた。反応液を一つにまとめてエタノール沈殿を行ない、合成したcDNAを反応液より回収した後、40μlの蒸留水に溶解した。このcDNA溶液2μlを鋳型とし、下記の配列の合成ＤＮＡプライマーの10μＭ水溶液各0.5μl、５’−ＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣ−３’〔配列番号：１７〕、５’−ＴＴＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＧＧＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧ−３’〔配列番号：１８〕およびdNTP mixture (各2.5mM) 1μl、TaKaRa EX Taq（宝酒造）1.25 unit、付属の反応バッファーを用いて25μlの反応液を調製した。この反応液を95℃で２分間加熱した後、98℃・10秒間、62℃・20秒間、72℃・10秒間のサイクルを４０回繰り返し、72℃・30秒間インキュベート後に４℃に冷却した。反応後の液をアガロースゲル電気泳動によって解析したところ、エチジウムブロマイド染色によって約230bpの大きさのｃＤＮＡのバンドが検出された。この部分に含まれるＤＮＡをゲルより回収し、同じプライマーセットを用いて再ＰＣＲ（２５回）を行なった。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲルからＤＮＡを回収し、それぞれのプライマーを用いてABI PRISM DyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社）によるシーケンス反応を行なった。ABI PRISM 377 DNA Sequencer を用いてこのｃＤＮＡの配列を解析したところ、その一部に実施例９で決定したアミノ酸配列と同じ配列ＬＶＱＰＲＧＰＲＳＧＰＧＰＷＱＧＧをコードする部分を見出した。
【実施例１３】
ラット型ペプチドをコードするｃＤＮＡの取得
Wistar ラットの全脳から、Isogen (Nippon gene) を用いてtotal RNAを、つづいてオリゴ(dT)セルロースカラム（Pharmacia mRNA purification Kit）を用いて、それぞれマニュアルに従って poly(A)+RNA を調製した。調製した１μgの poly(A)+RNA からMarathon cDNA Amplification Kit （ Clontech ）のマニュアルに従ってcDNA を合成し10μｌの蒸留水に溶解した。これをさらにTE bufferで50倍に希釈したものを鋳型として実施例11（マウスの全長クローニングの実施例）で行ったRACEと同様の方法でPCR を行った。ただしプライマーセットは３’RACE では1回目のＰＣＲで w33-F1とAP1、2回目のPCRではw33-F2とAP1 を使用して約800 bpのバンドを、また5’RACE では1回目のPCRで w33-R1とAP1、2回目のPCRではw33-R2とAP1 を使用し約600 bpのバンドをそれぞれ回収した。これら回収した断片配列を、やはり実施例１１と同様の方法で解析し約1300ｂｐの全長配列を明らかにした。
明らかになった配列のうち、アミノ酸に翻訳されると考えられる領域のみを含むDNA 断片を一本の断片として得るために、３’RACEと５’RACEで得られた配列情報を基に2本のプライマーrFA10（５’−ＧＴＡＧＴＴＧＧＧＡＧＴＣＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣ−３’）〔配列番号：１９〕とrRA10（５’−ＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴ−３’）〔配列番号：２０〕をそれぞれ合成した。鋳型には、先に調製したラット全脳 poly(A)+RNA 160g からRNA PCR kit（Takara）により以下の方法で合成したcDNAを用いた。すなわちキット付属の random primer（9 mer） を終濃度2.5 μMで用い、MgCl2を終濃度 5mM 、10x RNA PCR buffer 4μl、dNTP mixture（各2.5mM）を16μl、 RNase Inhibitor 40 unit、AMV reverse transcriptase 10 unitを加え、蒸留水で40μlとし、これらを30℃ 10分の処理後、42℃で30分間cDNA合成を行い、40μlの蒸留水に溶解した。ＰＣＲの反応液は、DNA polymerase として EX Taq を使用し、添付の10x EX Taq buffer を2.5 μｌ、dNTP mixture（各2.5mM）を1μl、TaqStart Antibody（Clontech）と等量混合した EX Taq を 0.5μｌ、10μMのプライマーrFA10 と rRA10をそれぞれ0.5μｌおよび鋳型cDNAを1μl加え、蒸留水で25μｌとして調製した。PCR反応は94℃ 2分の熱処理後、98℃ 10秒、68℃ 45秒のサイクルを30回繰り返した。PCR産物は1.2％アガロース電気泳動後、前述の方法でバンドを回収し、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO（Invitrogen）へサブクローニングし、さらに E.coli JM109 へ導入した。得られた形質転換体に挿入されたcDNA 断片の配列を解析し、プライマーを含めた約1270bpの塩基配列を確定した。
さらにそれぞれ開始コドンと終止コドンを含む ２本のプライマーrFSal（５’−ＡＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧ−３’）〔配列番号：２１〕とrRNhe（５’−ＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＡＧＡＡＡＧ−３’）〔配列番号：２２〕を合成した。下線を引いた部分に制限酵素SalIあるいはNheIの認識配列を導入してある。これらのプライマーを用いて、上記で得られたrFA10 と rRA10で増幅された断片を含む形質転換体から調製したプラスミド約20ng を鋳型として、これまでと同様EX TaqをDNA polymeraseとして使用し、94℃ 2分の熱処理後、98℃ 10秒、68℃ 30秒のサイクルを24回繰り返す条件でPCRを行った。得られた約260bpのバンドを回収し、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO（Invitrogen）へサブクローニングし、さらに E.coli JM109 へ導入し、E.coli JM109／prSHe-1を得た。得られた形質転換体に挿入されたcDNA 断片の配列を解析した結果、このcDNA 断片はラット型ペプチドの全コード領域を含むことが確認された（図１７）。
【実施例１４】
ヒト型ペプチドをコードするｃＤＮＡの取得
実施例11および13で得られたマウスとラット型の配列間でよく保存されている領域にプライマーAF2（５’−ＧＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＧ−３’）〔配列番号：２３〕とAR1（５’− ＴＴＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＣＣＴＴＡＴＧ−３’）〔配列番号：２４〕を合成した。またClontech社より購入したヒト肺poly(A)+RNA 5μgより、プライマーとして random primer（9 mer、GIBCO BRL）を加え、モロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（GIBCO BRL）で、添付のバッファーとともに42℃で1時間の反応を行ってcDNAを合成し、30μlのTE bufferに溶解した。このcDNA 1μl を鋳型としてPCRを行った。PCRの反応液は実施例11と同様にDNA polymerase として EX Taq を使用し、AF2とAR1のプライマーを用いて調製し、94℃ 2分の後、98℃ 10秒、62℃ 20秒, 72℃ 5秒のサイクルを35回繰り返した。得られた約150bpのバンドを回収し、塩基配列を解析した。その結果、この断片はヒト型ペプチドの断片をコードしていることが明らかになった。
この配列をもとに３’RACE用にh3R1（５’−ＡＣＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣ−３’）〔配列番号：２５〕とh3R2（５’−ＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＴＣＧＧＡＧＧＡＡＡ−３’）〔配列番号：２６〕、5’RACE用にh5R1（５’−ＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＴＴＣＣＴ−３’）〔配列番号：２７〕とh5R2（５’−ＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＴＧＣ−３’）〔配列番号：２８〕を合成した。またMarathon cDNA Amplification Kit （Clontech）のマニュアルに従って、Clontech社より購入したヒト視床下核および肺poly(A)+RNA各1μgよりcDNAを合成し、それぞれ10μｌの蒸留水に溶解、これをさらにTE bufferで50倍に希釈してRACEに用いる鋳型cDNAを調製した。プライマーの組み合わせを３’RACEではh3R1とAP1を、また5’RACEでは5R1とAP1を用いて実施例11と同様に反応液を調製し、94℃ 2分の熱処理後、98℃ 10秒、72℃ 45秒のサイクルを５回、98℃ 10秒、70℃ 45秒のサイクルを5回、続いて98℃ 10秒、68℃ 45秒のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。これらの反応物をTE bufferで50倍に希釈したもの2.5μlを2回目のPCRの鋳型として使用し、プライマーの組み合わせを３’RACEではh3R2とAP1またはAP2を、また5’RACEでは5R2とAP1にそれぞれ変更して、94℃ 2分の熱処理後、98℃ 10秒、72℃ 45秒のサイクルを５回、98℃ 10秒、70℃ 45秒のサイクルを5回、続いて98℃ 10秒、68℃ 45秒のサイクルを35回繰り返す反応を行った。その結果、視床下核の5’RACEから得られた約500bpのバンド、肺の3’RACEから得られた約200bpのバンドをそれぞれ回収、約570bpの塩基配列を調べた結果、ヒト型ペプチドをコードするｃＤＮＡであることが分かった。
さらに予測されたコーディング領域全体を1本のcDNAとして増幅するために、コーディング領域の両端にプライマーhFA10（５’−ＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＡＣＣＴＣＴ−３’）〔配列番号：２９〕とhRA10（５’−ＧＡＣＡＴＡＡＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧ−３’）〔配列番号：３０〕を合成した。鋳型cDNA はRACEに用いたのと同じ視床下核のcDNAを用いた。PCRの反応液は、DNA polymerase として KlenTaq (Clontech)を使用し、添付の10x KlenTaq bufferを2.5 μｌ、dNTP mixture（各2.5mM）を1μl、KlenTaqを 0.5μｌ、10μMのプライマーhFA10と hRA10をそれぞれ0.5μｌおよび鋳型cDNAを1μl加え、蒸留水で25μｌとして調製した。PCR反応は94℃ 2分の熱処理後、98℃ 10秒、68℃ 30秒のサイクルを30回繰り返した。PCR産物は2％アガロース電気泳動後バンドを回収し、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO（Invitrogen）へサブクローニングし、さらに E.coli JM109 へ導入し、E.coli JM109／phSuN-4を得た。得られた形質転換体に挿入されたcDNA 断片の配列を解析した結果、このcDNA 断片はヒト型ペプチドの全コード領域を含むことが確認され、その遺伝子配列を図１８に示した。
【実施例１５】
ウシ型ペプチドをコードするｃＤＮＡの取得
実施例１２で取得したＰＣＲ産物の塩基配列をもとに、5'および3'RACEに使用する特異的プライマーをそれぞれ数本作成した。また、ウシ肺poly(A)+RNAを1μg使用してMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech）のマニュアルに従ってcDNAを合成し、最終ステップでアダプターを付加したcDNA溶液を蒸留水にて50倍に希釈したものを調製した。この50倍に希釈したcDNA溶液2.5μl、下記の配列番号：３１ないし３４などで表わされる特異的プライマー（10μM）0.5μl、AP1プライマー（酵素に付属、10μM）0.5μl、TaqStart Antibody（Clontech）と等量混合したEXTaq DNA polymerase（宝酒造）0.5μl、×10 EXTaq buffer 2.5μl、dNTPs 1μl（いずれも酵素に付属）を加えた25μlの反応液を調製し、95℃ ２分間の熱処理後、98℃ 10秒、72℃ 1分のサイクルを5回、98℃ 10秒、70℃ 1分のサイクルを5回、98℃ 10秒、68℃ 1分のサイクルを25回行なった後、さらに68℃ 1分間加熱して行なった。この反応液1μlを用い、プライマーの組み合わせを別のものにかえた反応液を調製して同様の条件（但し最後の増幅のサイクル数を25回から35回に増やす）にて２回目のＰＣＲを行なった。
各種のプライマーの組み合わせによるＰＣＲ産物のうち、１回目のPCRをFF1（５’−ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧ−３’）〔配列番号：３１〕とAP1（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’）〔配列番号：３２〕の組み合わせで行ない、さらにその反応液の1μlを使用して２回目のPCRをFF2（５’−ＧＣＧＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＧ−３’）〔配列番号：３３〕とAP2（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’）〔配列番号：３４〕のプライマーの組み合わせで行なったPCRの主要産物について、アガロースゲル電気泳動後にゲルから回収して配列決定を行なった。実施例１１で得られたマウスのcDNAと比較することによって、解析した3'RACE産物は翻訳終止コドンからさらに下流の配列を有するcDNA断片であることが判明した。この3'RACEによって明らかになったウシ型ペプチドcDNAの配列をもとに、3'非翻訳領域部分に相当するプライマーを合成した。
また、既に他の動物種で判明しているcDNAの5'非翻訳領域の配列をもとにプライマーを合成した。ウシ視床下部poly(A)+RNA 150ngに相当するcDNAを鋳型として、プライマー（10μM）各0.5μl、TaqStart Antibody（Clontech）と等量混合したEXTaq DNA polymerase（宝酒造）0.5μl、×10 EXTaq buffer 2.5μl、dNTPs 1μl（いずれも酵素に付属）を加えた25μlの反応液を調製し、95℃ ２分間の熱処理後、98℃ 10秒、62℃ 20秒、72℃ 30秒のサイクルを40回、さらに72℃ 30秒間インキュベーションした後、アガロースゲル電気泳動によって反応産物を分離した。主要なPCR産物についてはゲルから回収した後に塩基配列の解析を行なった。NCR4（５’−ＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’）〔配列番号：３５〕とRV1（５’−ＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴ−３’）〔配列番号：３６〕あるいは RV2（５’−ＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’）〔配列番号：３７〕の組み合わせで行なったPCRの主要産物の塩基配列の解析から、完全長の翻訳領域を有するcDNAが増幅されていることが明らかになった。そこで、Original TA Cloning Kit（Invitrogen）を用いてpCR2.1プラスミドベクターにサブクローニングし、さらにE.coli JM109へ導入し、E.coli JM109／pBovA10prec24を得た。得られた形質転換体に挿入されたcDNA断片の配列を解析した結果、このcDNA断片はウシ型ペプチドの全コード領域を含むことが確認された（図１９）。
また実施例１１、１３、１４および１５で明らかになったマウス、ラット、ヒトおよびウシ型ペプチドのアミノ酸配列を比較し図２０に示した。
【実施例１６】
ＡＰＪ受容体に作用するペプチドpGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
市販のBoc-Phe-OCH2-PAM樹脂（0.72 m mole/g resin） 0.5 m mole 分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、自体公知のBoc-strategy（NMP-HOBt）ペプチド合成方法でBoc-Pro, Boc-Met, Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys（Cl-Z）, Boc-His（Bom）, Boc-Ser（Bzl）, Boc-Leu, Boc-Arg（Tos）, Boc-Pro, Boc-Arg（Tos）, Boc-Glnを順に導入し、目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂0.22ｇをp-クレゾール0.43ｇと共に無水弗化水素5 ml中、０℃ ６０分撹袢した後、弗化水素を減圧留去し、残留物へ酢酸水を加えペプチドを酢酸水に抽出した。抽出液を十分に濃縮後、蒸留水とジエチルエ−テルを加え分液抽出し、水層を集め凍結乾燥し、少量の５０％酢酸水に溶解後、同溶媒で充填したセファデックス（登録商標）G-25カラム（2.0 ｘ 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末約５０ｍｇを得た。此れを50％酢酸水５mlに溶解し、60℃の湯浴中で１時間保持、HPLCで13.9分の主要ピークが消失し、15.6分前後のピ−クに全て変化したことを確認後、室温に戻し LiChroprep（登録商標） RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 ｘ 60 cm）に付け、0.1％TFA水 200mlで洗浄、0.1％TFA水 300mlと0.1％TFA含有33％アセトニトリル水 300mlを用いた線型勾配溶出を行い、アセトニトリル濃度20％前後の画分を集め凍結乾燥し、白色粉末28mgを得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ)+1533.953 （計算値 1533.811）
HPLC溶出時間 １５．７分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 ｘ 100mm
溶離液：Ａ液−0.1％ TFA水、Ｂ液−0.1％TFA含有アセトニトリルを用い A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【実施例１７】
ＡＰＪ受容体に対するペプチドpGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheのリガンド活性の測定
実施例１６で得られたペプチドおよび配列番号：４０の第４２番目ないし第７７番目で表わされるアミノ酸配列で表わされるペプチドを滅菌蒸留水を用いて１ｘ１０-3Ｍの濃度に溶解した後、０．１％ＢＳＡを含むサイトセンサー用培地を用いて、それぞれのペプチドを１０-8、１０-9、１０-10、１０-11Ｍに希釈したものを調製した。実施例６と同様にして準備したＡＰＪ受容体ｃＤＮＡ導入ＣＨＯ細胞をサイトセンサーのワークステーションにセットし、各細胞のAcidification Rateが安定したところでペプチド希釈液をサイトセンサーの流路の一つに導入し、流路の切り換えによって細胞に７分２秒間作用させた。細胞の反応が最大となったサンプル導入３サイクル目のAcidification Rateの変化量をBasal levelの値を１００％として算出し、その結果を図２１に示した。
【実施例１８】
Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
市販Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂（0.72 m mole/g resin) 0.5 m mole 分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt) ペプチド合成方法でBoc-Pro, Boc-Met,Boc-Gly, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-His(Bom), Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Phe, Boc-Trp(CHO), Boc-Valをアミノ酸配列に基づき導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。 この樹脂0.17ｇをp-クレゾール1.0ｇ、1,4-ブタンジチオール1.0 mlと共に無水弗化水素8 ml中、０℃ ６０分撹袢した後、弗化水素を減圧留去し、残留物へ酢酸水を加えペプチドを酢酸水に抽出した。抽出液を十分に濃縮後、蒸留水とジエチルエ−テルを加え分液抽出し、水層を集め凍結乾燥し、少量の５０％酢酸水に溶解後、同溶媒で充填したセファデックスTMG-25カラム（2.0 x 80 cm)に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末約約70ｍｇを得た。此れをLiChroprepTM RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm)に付け0.1％TFA水 200mlで洗浄、0.1％TFA含有10％アセトニトリル水 300mlと0.1％TFA含有30％アセトニトリル水 300mlを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末33mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4064.6(計算値 4064.2)
HPLC溶出時間 16.0分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1％ TFA水、Ｂ液−0.1％TFA含有アセトニトリルを用い A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【実施例１９】
Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例１８で得た樹脂へ更にBoc-Leuを導入した後、実施例１と同様に弗化水素処理とクロマト精製を行い、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末23mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4177.7(計算値 4177.3)
HPLC溶出時間 16.2分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1％ TFA水、Ｂ液−0.1％TFA含有アセトニトリルを用い A/B : 95/5〜4
5/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【実施例２０】
Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.3mmol/g) にFmoc-Phe-OH を導入したFmoc-Phe-O-Clt resin (0.32mmol/g) 0.25mmol分をペプチド合成機ABI 433A の反応曹に入れ、 Fmoc/ DCC/ HOBt法を用い、固相合成を行った。Fmocアミノ酸の側鎖保護基はArgにはPbf基、SerにtBu基、Trp、LysにBoc基、His、Asn、GlnにTrt基を用いた。他のアミノ酸は側鎖無保護のものを用い、上記に示す配列のPheからN末端方向へ順にLeuまでペプチド鎖を導入し、目的の保護ペプチド樹脂を得た。
この樹脂50mg(4.45mmol)をTFA, thioanisole, m-cresol, H2O, ethandithiol(82.5:5:5:5:2.5)の混合液1ml中で室温、2時間攪拌した後、反応溶液にエーテルを加え、白色粉末を析出させ遠心分離後、上清を除く操作を3回繰り返した。残渣を水で抽出後、凍結乾燥し白色粉末を23.1mg得た。得られた粗ペプチドをTSK GEL ODS 120T カラム(20 x 300mm)を用いた分取HPLCで、A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルによるA/B: 85/15〜75/25への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末10.2mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4194.8 (計算値4194.3)
HPLC溶出時間 16.5 分
溶出条件
カラム YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50
/50へ 直線型濃度勾配溶出(25分)
流速 1.0ml/分
【実施例２１】
His-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２０で得た樹脂に更にFmoc-His(Trt)を縮合した後、実施例２０と同様に処理精製し白色粉末10mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4331.2(計算値4331.4)
HPLC溶出時間 16.3 分
溶出条件
カラム YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50
/50へ 直線型濃度勾配溶出(25分)
流速 1.0ml/分
【実施例２２】
Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
市販Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂（0.72 m mole/g resin)を用い追加例１と同様にBoc-Pro, Boc-Met,Boc-Gly, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-His(Bom), Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Phe, Boc-Trp(CHO), Boc-Ala, Boc-Thr(Bzl), Boc-Valをアミノ酸配列に基づき導入し目的の保護ペプチド樹脂を得た。この樹脂を追加例１と同様に弗化水素処理し、取り出したペプチドを同様に精製し白色粉末25mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4199.0 (計算値4199.3)
【実施例２３】
Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２２の樹脂へさらにBoc-Tyr(Br-Z)を縮合した後同様に処理、精製し白色粉末12mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4362.7 (計算値4362.4)
【実施例２４】
Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
市販Boc-Phe-OCH2-PAM樹脂（0.72 m mole/g resin)を用い、Boc-Pro, Boc-Met, Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-His(Bom), Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), boc-Proを順位縮合した後、樹脂をｐ−クレゾール共存下弗化水素処理、実施例１８と同様に精製し白色粉末54mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 1266.4 (計算値1266.7)
【実施例２５】
Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２４の樹脂にBoc-Arg(Tos)を縮合後、同様に処理、精製し白色粉末30mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 1422.6 (計算値1422.8)
【実施例２６】
Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２５の樹脂にBoc-Glnを縮合後、同様に処理、精製し希塩酸水から凍結乾燥し白色粉末21mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 1551.1 (計算値1550.8)
【実施例２７】
Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２６の樹脂にBoc-Arg(Tos)を2回縮合後、同様に処理、精製し白色粉末17mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 1862.8 (計算値1863.0)
【実施例２８】
Cys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２７の樹脂にBoc-Phe, Boc-Cys(MeBzl)を縮合後、同様に処理、精製し白色粉末30mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 2113.2 (計算値2113.1)
HPLC溶出時間 16.0 分
溶出条件
カラム YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50/50へ 直線型濃度勾配溶出(25分)
流速 1.0ml/分
【実施例２９】
Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２７の樹脂にBoc-Phe, Boc-Lys(Cl−Z), Boc-Arg(Tos), Boc-Aarg(Tos)を順に縮合後、同様に処理、精製し白色粉末13mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 2450.4 (計算値2450.4)
HPLC溶出時間 15.7 分
溶出条件
カラム YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50/50へ 直線型濃度勾配溶出(25分)
流速 1.0ml/分
【実施例３０】
pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Proの製造
市販Boc-Pro-OCH2-PAM樹脂（0.63 m mole/g resin)を用い、Boc-Met, Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-His(Bom), Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos),Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Z-Gluを順位縮合した後、樹脂をｐ−クレゾール共存下弗化水素処理、実施例１８と同様に精製し白色粉末56mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 1386.4 (計算値1386.7)
HPLC溶出時間 12.7分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1％ TFA水、Ｂ液−0.1％TFA含有アセトニトリルを用い A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【実施例３１】
pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Metの製造
市販Boc-Met-OCH2-PAM樹脂（0.66 m mole/g resin)を用い、Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-His(Bom), Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos),Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Z-Gluを順位縮合した後、樹脂をｐ−クレゾール共存下弗化水素処理、実施例１８と同様に精製し白色粉末29mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 1289.9 (計算値1289.7)
HPLC溶出時間 11.8分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液：Ａ液−0.1％ TFA水、Ｂ液−0.1％TFA含有アセトニトリルを用い A/B : 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：1.0 ml / 分
【実施例３２】
Met-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Pheの製造
実施例２０の樹脂に更にFmoc-Metを縮合後、同様に処理精製し白色粉末5mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 4324.9 (計算値4325.3)
HPLC溶出時間 16.8 分
溶出条件
カラム YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜50/50へ 直線型濃度勾配溶出(25分)
流速 1.0ml/分
【実施例３３】
ホルスコリン刺激ｃＡＭＰ産性の抑制活性の測定
24-well組織培養プレートにCHO-A10 clone 6細胞を3×105cells/wellで播種し、一晩培養した。0.2mM 3-isobutyl-1-methylxantine (IBMX)、0.05%ウシ血清アルブミンを含有するHanks' balanced salt solution (HBSS)をアッセイバッファーとして準備し、各wellを500μlのアッセイバッファーで２回洗浄した後、37℃で30分間プレインキュベーションを行なった。さらに500μlのアッセイバッファーで１回洗浄した後、1μＭのホルスコリンを添加したアッセイバッファーに溶解したサンプルを500μlずつ各wellに添加し、37℃で30分間インキュベーションを行なった。細胞の基礎的ｃＡＭＰ産性量（basal level）を知るためにホルスコリンを加えないアッセイバッファーでインキュベーションしたwellを、また、ホルスコリン刺激による最大ｃＡＭＰ産性量（maximum level）を知るためにホルスコリンを添加したアッセイバッファーでインキュベーションしたwellも同様に用意した。インキュベーション終了後に各wellを500μlのアッセイバッファーで１回洗浄した後、各wellにAmersham社のcAMP EIA systemに付属のlysis buffer 1Bを500μlを加え、ｃＡＭＰの抽出を行なった。キットの処方に従い、各抽出液のうち100μlを用いてｃＡＭＰ量の測定をおこなった。ｃＡＭＰの産性抑制活性量は、maximum levelとサンプルを添加したwellのｃＡＭＰ量の差（ｃＡＭＰの産性抑制量）を求め、さらにホルスコリンに刺激によるｃＡＭＰ産性増大量（maximum levelとbasal levelの差）に対する百分率として算出し、その結果を図２２に示した。
【実施例３４】
ヒトアペリン−36（Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe）構造遺伝子の調製
CTAGAAAGGA GATATCATAT GCTGGTTCAA CCGCGTGGTT CT（#1：グライナー・ジャパン社）、CGTAATGGTC CGGGTCCATG GCAAGGTGGT CGTCGTAAAT TTCGTC（#2：キコーテック社）、
GTCAACGTCC GCGTCTGTCT CATAAAGGTC CGATGCCGTT TTGCC（#3：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）GACCATTACG AGAACCACGC GGTTGAACCA GCATATGATA TCTCCTTT（#4：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）、GGACGTTGAC GACGAAATTT ACGACGACCA CCTTGCCATG GACCCG（#5：グライナー・ジャパン社）、TCGGGGCAAA ACGGCATCGG ACCTTTATGA GACAGACGC（#6：キコーテック社）を用いてアペリン−36の構造遺伝子を調製した。
a)DNAオリゴマーのリン酸化
5'末端になるべき#1及び#6を除いた４種類のオリゴマー各１μgを100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。
b)DNAフラグメントの連結
上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及び#2各１μgを合わせ120μLとした。この混合液を80℃で10分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った。TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。アニーリング液30 μLにII液30 μLを加え良く混合した後、I液60 μLを加え、37℃、１時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、ー70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。
c)5'末端のリン酸化
沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）10 μLに溶解し、100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶解した。
【実施例３５】
ヒトアペリン−36発現プラスミドの調製
pTB960-2（EP-A-499990：小山ら、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー、32巻、273頁）をXbaI及びAvaIで消化し、1％アガロース電気泳動を行い約4.4KbpのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて抽出し、25μLのＴＥ緩衝液に溶解した。このpTB960-2のXbaI, AvaI断片と上記により調製したヒトアペリン−３６の構造遺伝子をTaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。すなわちpTB960-2のXbaI, AvaI断片溶液1μLとヒトアペリン−３６の構造遺伝子溶液4μLを混合し、I液5 μLを加え、16℃、30分間反応させ、ライゲーションを行った。ライゲーション液10 μLを用いてE. coli JM109コンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニーを選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpTB960-13を調製した。このヒトアペリン−３６構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル377ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。プラスミドpTB960-13を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社）に形質転換を行い、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、ヒトアペリン−３６-CS23融合蛋白質発現株BL21(DE3)/pTB960-13を得た。この形質転換大腸菌BL21(DE3)/pTB960-13は受託番号FERM BP-6590で1998年12月2日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また1998年11月11日付で受託番号IFO16220として財団法人発酵研究所（IFO）に寄託された。
【実施例３６】
実施例３５で得られた形質転換細胞を、５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを用いて、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取得し、−８０℃で凍結保存した。
【実施例３７】
ヒトアペリン−３６の取得
実施例３５で得た菌体５５０ｇに１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋１ｍＭ(p-アミジノフェニル)メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐＨ６．０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyopearl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−36−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。
この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、ヒトアペリン−36−ＣＳ２３融合タンパク質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５ｍｇを加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−36−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒトアペリン−36−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛性ソーダを加え、０℃で１５分間反応した。反応終了後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、ヒトアペリン−36を得た。この反応液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID×150mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０−４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ＋３Ｍ尿素、ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−36を画分を得た。このヒトアペリン−36画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で平衡化したＣ４Ｐ−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)に通液し、吸着、洗浄した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０．１％TFA）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−36画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−36凍結乾燥粉末を得た。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、Ｎ末端にメチオニンの付加したヒトアペリン−36のＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１）。
（表１）
アミノ酸組成分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたヒトアペリン−36のＮ末端にはメチオニンが付加していることのほかはＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した（表２）。
（表２）
Ｎ末端アミノ酸配列
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表３）。
（表３）
Ｃ末端アミノ酸分析
【実施例３８】
（生物活性測定）
実施例３７で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−36を用いて、実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、合成品と同等の活性を有することを確認した。
【実施例３９】
Ｎ末端メチオニンの除去
実施例３７で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−36 ４ｍｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．０５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．０４６ｇ、ピリジン ０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×250mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ヒトアペリン−36のジケトン体画分をプールした。続いてこの画分に等量の ４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、ｏ-フェニレンジアミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないヒトアペリン−36画分をプールした。プールしたヒトアペリン−36画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mmL、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−36画分をプールした。さらに、ヒトアペリン−36を０．１％ＴＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml/分の流速で溶出した。 ヒトアペリン−36のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−36Ｌ取得した。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、ｈＡ１０ＬのＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表４）。
（表４）
アミノ酸組成分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたヒトアペリン−36のＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した（表５）。
（表５）
Ｎ末端アミノ酸配列
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表６）。
（表６）
Ｃ末端アミノ酸分析
生物活性測定
実施例３９で取得したヒトアペリン−36を用いて、実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、合成品と同等の活性を有することを確認した。
【００７１】
【配列表】
【配列番号：１】
【配列番号：３】
【配列番号：４】
【配列番号：５】
【配列番号：６】
【配列番号：７】
【配列番号：８】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは中枢神経機能調節作用、循環機能調節作用、心臓機能調節作用、免疫機能調節作用、消化器機能調節作用、代謝機能調節作用あるいは生殖器機能調節作用などに関与していることから、上記したアゴニストあるいはアンタゴニストをたとえば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例：糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症、動脈硬化、肺気腫、肺水腫または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤として用いることができる。さらに催眠鎮静剤、手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤、降圧剤などとしても用いることができる。
加えて、ＨＩＶ感染症、エイズ（ＡＩＤＳ（Acquired Immune Deficiency Syndrome）：後天性免疫不全症候群）などの治療・予防剤として用いることができる。
【００７９】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）ｃＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＡＰＪ）ｍＲＮＡのNorthern blotによる組織分布の解析結果を示す。
【図３】ＣＨＯ−Ａ１０細胞株での全長レセプター蛋白質の発現量の転写レベルでの確認。
レーン１〜７はプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−Ａ１０）を段階的に希釈(1, 1/4, 1/16, 1/256, 1/1024, 1/4096)したもの、レーン８〜１１はＣＨＯ−Ａ１０細胞より調製したｃＤＮＡを段階的に希釈(1, 1/10, 1/100, 1/1000)したもの、レーン１２はリバーストランスクリプターゼを加えなかったもの、レーン１３は鋳型となるｍＲＮＡを使用しなかったもの、レーン１４はコントロールのＣＨＯ細胞より同様の処理をおこなったもの、レーン１５はコントロールのＣＨＯ細胞よりリバーストランスクリプターゼを使用せずに同様の処理を行ったものである。
ＭはＤＮＡのサイズマーカーを示し、左側はλファージＤＮＡをStyI消化したもの、右側はφχ１７４ＤＮＡをHincIIで消化したものである。
【図４】ブタ脳、ウシ胃の抽出物に含まれるＣＨＯ−Ａ１０細胞を特異的に刺激する活性のサイトセンサーによる検出。
Ｂ１〜Ｂ４はブタ脳より調製したサンプル、Ｓ１〜Ｓ４はウシ胃より調製したサンプルの測定結果を表す。それぞれＣＨＯ−Ａ１０細胞（白丸）とコントロール細胞（黒丸）の各測定サイクルの細胞外ｐＨの変化率（Acidification Rate)の経時的変化をbasal levelに対する変化率で表示している。
サンプルはサイクル４〜７の間、細胞に暴露した。
【図５】ブタ小腸の抽出物に含まれるＣＨＯ−Ａ１０細胞を特異的に刺激する活性のサイトセンサーによる検出（図６に続く）。
Ｇ１〜Ｇ８はブタ小腸より調製したサンプルの測定結果を表す。それぞれＣＨＯ−Ａ１０細胞（白丸）とコントロール細胞（黒丸）の各測定サイクルの細胞外ｐＨの変化率（Acidification Rate)の経時的変化をbasal levelに対する変化率で表示している。
サンプルはサイクル４〜７の間、細胞に暴露した。
【図６】ウシ視床下部の抽出物に含まれるＣＨＯ−Ａ１０細胞を特異的に刺激する活性のサイトセンサーによる検出（図７に続く）。Ｆ１〜Ｆ５はＣ１８カラム１０％アセトニトリル溶出画分、Ｆ６〜Ｆ１０は３０％アセトニトリル溶出画分、Ｆ１１〜Ｆ１５は５０％アセトニトリル溶出画分のサンプルである。それぞれをさらにＣＭセファロースイオン交換カラムにおいて素通り画分（Ｆｒ．１，６，１１）、酢酸アンモニウム濃度１００ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．２，７，１２）、２５０ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．３，８，１３）、５００ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．４，９，１４）および１０００ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．５，１０，１５）の合計１５画分に分画し、各サンプルに含まれる細胞刺激活性を測定した。
それぞれ、ＣＨＯ−Ａ１０細胞（白丸）およびコントロールの細胞（黒丸）に対してサイクル４〜７の間サンプルを暴露し、細胞外ｐＨの変化率の経時的変化をbasal levelを１００％として表示した。
表の縦軸はAcidification Rate (% of Basal level)を、横軸はサイクルを示す。
【図７】ウシ視床下部の抽出物に含まれるＣＨＯ−Ａ１０細胞を特異的に刺激する活性のサイトセンサーによる検出（図６の続き）。Ｆ１〜Ｆ５はＣ１８カラム１０％アセトニトリル溶出画分、Ｆ６〜Ｆ１０は３０％アセトニトリル溶出画分、Ｆ１１〜Ｆ１５は５０％アセトニトリル溶出画分のサンプルである。それぞれをさらにＣＭセファロースイオン交換カラムにおいて素通り画分（Ｆｒ．１，６，１１）、酢酸アンモニウム濃度１００ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．２，７，１２）、２５０ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．３，８，１３）、５００ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．４，９，１４）および１０００ｍＭ溶出画分（Ｆｒ．５，１０，１５）の合計１５画分に分画し、各サンプルに含まれる細胞刺激活性を測定した。
それぞれ、ＣＨＯ−Ａ１０細胞（白丸）およびコントロールの細胞（黒丸）に対してサイクル４〜７の間サンプルを暴露し、細胞外ｐＨの変化率の経時的変化をbasal levelを１００％として表示した。
表の縦軸はAcidification Rate (% of Basal level)を、横軸はサイクルを示す。
【図８】細胞刺激活性の強さを指標としたＡＰＪ受容体高発現細胞の選択。
ＣＨＯ−Ａ１０細胞よりクローン化した１〜８の細胞に対して同一のサンプルを暴露した後、４サイクル目の細胞外ＰＨの変化率のbasal levelに対する変化量（％）を表示したものである。
表の縦軸はChange of Acidification Rate (% of Basal level)を、縦軸はＣＨＯ−Ａ１０細胞よりクローン化した細胞の番号を示す。
【図９】ウシ胃からのペプチド粗画分のRESOURCE RPCにおける分離パターンとＣＨＯ−Ａ１０に特異的な活性の検出を示す。
【図１０】RESOURCE RPCにおけるＰ−２活性のVydac diphenyl 219TP5415における分離パターンとＣＨＯ−Ａ１０に特異的な活性の検出を示す。
【図１１】RESOURCE RPCにおけるＰ−２活性のSephasil C8 SC 2.1/10における分離パターンとＣＨＯ−Ａ１０に特異的な活性の検出を示す。
【図１２】Vydac diphenyl 219TP5415における活性画分のμRPC C2/C18 SC 2.1/10における分離パターンとＣＨＯ−Ａ１０に特異的な活性の検出を示す。
【図１３】Sephasil C8 SC 2.1/10における活性画分のμRPC C2/C18 SC 2.1/10における分離パターンとＣＨＯ−Ａ１０に特異的な活性の検出を示す。
【図１４】マウス由来EST(Mouse EST)と配列番号：１(Bovine)で示されるウシ胃由来ペプチド断片との相同性を示す。
【図１５】マウス型リガンドポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１６】マウス型リガンドポリペプチド(mouse)と配列番号：１(Bovine parti)で示されるウシ胃由来ペプチド断片との相同性を示す。
【図１７】ラット型リガンドポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１８】ヒト型リガンドポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１９】ウシ型リガンドポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２０】ウシ、マウス、ラットおよびヒト型リガンドポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列にコードされるアミノ酸配列の比較を示す。
【図２１】実施例１６で得られたペプチドと配列番号：４２の第４２番目ないし第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチドのAcidification Rateの変化量を示す図を示す。
図中、○−○は実施例１６で得られたペプチドのAcidification Rateの変化量、●−●は配列番号：４２の第４２番目ないし第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチドのAcidification Rateの変化量を示す。
【図２２】実施例３３で行われたホルスコリン刺激ｃＡＭＰ産生の抑制活性の測定結果を示す図を示す。
図中、○−○は配列番号：４２の第４２番目ないし第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチド、●−●は配列番号：４０の第６５番目ないし第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチドを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a ligand polypeptide for APJ which is an orphan G protein-coupled receptor protein, and a DNA encoding the same.
[0002]
[Prior art]
Many hormones and neurotransmitters regulate biological functions through specific receptors present on cell membranes. Many of these receptors perform intracellular signal transduction through activation of conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein), and have a common 7-transmembrane region. Because of their structure, they are collectively referred to as G protein-coupled receptors or 7-transmembrane receptors.
Through the interaction of such hormones and neurotransmitters with G protein-coupled receptors, the maintenance of homeostasis in the body, reproduction, individual development, metabolism, growth, nervous system, circulatory system, immune system, digestive system, metabolism Functional adjustments important for living bodies such as system adjustments are performed. Thus, it is known that there are receptor proteins for various hormones and neurotransmitters in the regulation of biological functions and play an important role in the regulation of their functions, but unknown agents (hormones and neurotransmitters) Etc.) and whether there are receptors for them are still unclear.
In recent years, a novel receptor protein by the polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method utilizing the fact that G protein-coupled receptor protein shows amino acid sequence similarity in a part of its structure. As a result of the search for DNAs encoding the DNA, a number of so-called orphan G protein-coupled receptor proteins with unknown ligands have been cloned (Libert, F., et al. Science, 244, 569). -572, 1989, Welch, SK, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209, 606-613, 1995, Marchese, A., et al., Genomics, 23, 609-618, 1994, Marchese , A., Genomics, 29, 335-344, 1995). Also, novel G protein-coupled receptor proteins have been found one after another by random sequencing of genomic DNA or cDNA (Nomura, N., et al., DNA Research Vol. 1, pp. 27-35, 1994). Year). The general means for determining the ligands of these orphan G protein-coupled receptor proteins could only be estimated from the similarity in the primary structure of the G protein-coupled receptor protein. However, many orphan G protein-coupled receptor proteins often have low homology with known receptors. In fact, except for receptor subtypes of known ligands, the ligands can be expressed only by their primary structural similarity. It was difficult to estimate. On the other hand, since many orphan G protein-coupled receptors have been found from gene analysis, it is estimated that there are still many corresponding unknown ligands. Few examples have identified receptor ligands.
[0003]
Recently, there has been reported an example in which cDNA encoding an orphan G protein-coupled receptor protein is introduced into animal cells to search for a novel opioid peptide (Reinsheid, RK et al., Science, 270, 792-794). 1995, Menular, J.-C., et al., Nature 377, 532-535, 1995). However, in this case, the ligand was easily expected to belong to the family of opioid peptides from the similarity and tissue distribution with known G protein-coupled receptor proteins. The history of research and development of substances that act on living bodies via opioid receptors has been long, and various antagonists and agonists have been developed. Therefore, after finding an agonist for this receptor from a group of artificially synthesized compounds and using it as a probe to verify the expression of the receptor in the cell into which the receptor cDNA was introduced, the activity of the intracellular signal transduction system similar to that of the agonist was confirmed. We search for chemical substances, purify them, and determine the structure of the ligand.
In addition, a cDNA encoding the snail orphan G protein-coupled receptor (GRL104) was introduced into CHO cells, and a novel physiologically active peptide was identified using as an index the increase in the intracellular free calcium concentration in the receptor-expressing cells. (Cox, KJA, et al., J. Neurosci., 17 (4), 1197-1205, 1997), this novel bioactive peptide has high homology with known leucokinin, and GRL104 Was also reactive with known leucokinin. As described above, there are few orphan G protein-coupled receptor proteins with which the ligand can be roughly estimated. In particular, when the similarity to the known G protein-coupled receptor protein family is low, there is little information on the ligand, It was difficult to estimate the ligand.
One of those reported as orphan G protein-coupled receptors is APJ (O'Dowd, BF, et al., Gene, 436, 355-359, 1993). Although APJ has a low homology with the angiotensin receptor (AT1), no reaction with angiotensin II was observed even when APJ was expressed in CHO cells, so it was unclear what the ligand was.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Ligands for APJ, an orphan G protein-coupled receptor expressed in the central nervous system, circulatory system, reproductive system, immune system, digestive system, etc., are thought to be useful as pharmaceuticals. The structure and function are not disclosed.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors use cells in which cDNA encoding orphan G protein-coupled receptor protein (APJ) is expressed by an appropriate means, using measurement of specific cell stimulation (signal transduction) activity as an index, etc. The polypeptide which the receptor protein recognizes as a ligand was successfully screened.
Furthermore, the present inventors have found that a compound that changes the binding property between the ligand that is the active factor and the receptor protein can be screened.
[0006]
That is, the present invention
(1) a polypeptide having a binding ability to a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as that represented by SEQ ID NO: 3, or a precursor thereof, an amide or ester thereof, or a salt thereof;
(2) The polypeptide according to (1) above, wherein the polypeptide is a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(3) The polypeptide according to (1) above, wherein the polypeptide is a polypeptide containing a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 42 ,
(4) a peptide in which the polypeptide has (a) the 6th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, (b) SEQ ID NO: 15, 38, A peptide having the 40th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 40 or 42, (c) the 42nd to 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 (D) a peptide having the 47th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, (e) SEQ ID NO: 15, A peptide having the 61st to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 38, 40 or 42, (f) SEQ ID NO: 15, 38, 40 or A peptide having the 65th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 2 or a peptide having an amino acid sequence in which the N-terminal amino acid (Gln) is pyroglutamine-oxidized, (g) SEQ ID NO: 15, 38 A peptide having the first to 25th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 40 or 42, (h) the 6th to the 6th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the 25th amino acid sequence, (i) a peptide having the 42nd to 64th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, (j) SEQ ID NO: 15 A peptide having the amino acid sequence from the 61st to the 64th amino acid sequence represented by, 38, 40 or 42, (k) the sequence No .: Peptide having the 43rd to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 15, 38, 40 or 42, (l) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the 41st to 77th amino acid sequence, (m) a peptide having the 66th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40, or 42, (n ) A peptide having the 67th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42; (o) the amino acid represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42; A peptide having the 64th to 77th amino acid sequence of the sequence, (p) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the 63rd to 77th amino acid sequence, (q) a peptide having the 65th to 76th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, or (r) The polypeptide according to (1) above, which is a peptide having the amino acid sequence from the 65th to the 75th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42;
(5) The above polypeptide, wherein the polypeptide is a polypeptide comprising the 65th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 42 The polypeptide according to (1),
(6) The polypeptide according to (1) above, wherein the polypeptide is a polypeptide containing an amino acid sequence represented by pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe,
(7) The above polypeptide, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence from the 42nd to the 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 42 The polypeptide according to (1),
(8) The polypeptide according to (1) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15,
(9) The polypeptide according to (1) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38,
(10) The polypeptide according to (1) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40,
(11) The polypeptide according to (1) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42,
(12) DNA containing a DNA having a base sequence encoding a polypeptide having a binding ability to a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a precursor thereof ,
(13) The DNA according to (12) above, wherein the polypeptide is a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(14) The above polypeptide, wherein the polypeptide comprises the 65th to 77th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 42 DNA according to (12),
(15) The above polypeptide, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence from the 42nd to the 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 42 DNA according to (12),
(16) The DNA according to (12) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15,
(17) The DNA according to (12) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38,
(18) The DNA according to (12) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40,
(19) The DNA according to (12) above, wherein the precursor is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42,
(20) a recombinant vector containing the DNA according to (12) above,
(21) A transformant carrying the DNA of (12) or the recombinant vector of (20),
(22) A method for producing the polypeptide, partial peptide or salt thereof according to (1), wherein the transformant according to (21) is cultured.
(23) A medicament comprising the polypeptide according to (1) above, a partial peptide thereof, an amide or ester thereof, or a salt thereof,
(24) A pharmaceutical comprising the DNA according to (12) above,
(25) The above (23) or (24), which is a central nervous function regulator, circulatory function regulator, cardiac function regulator, immune function regulator, digestive organ function regulator, metabolic function regulator or genital function regulator ) The medicine described in the item,
(26) An antibody against the polypeptide according to (1) above or a precursor thereof, an amide or ester thereof, or a salt thereof,
(27) a diagnostic agent comprising the antibody according to (26) above,
(28) Use of a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 with the polypeptide according to (1) above or an amide or ester thereof or a salt thereof. The binding property of the receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 to the polypeptide of the above (1), its amide, its ester or its salt And the like.
[0007]
Furthermore, the present invention provides
(29) The polypeptide according to the above (1), which is derived from a mammal,
and
(30) Dementia, depression, hyperactive child (microencephalopathy) syndrome, consciousness disorder, anxiety disorder, schizophrenia, phobia, growth hormone secretion disorder, bulimia, bulimia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia Disease, hyperlipidemia, hyperprolactinemia, diabetes, cancer, pancreatitis, kidney disease, Turner syndrome, neurosis, rheumatoid arthritis, spinal cord injury, transient ischemic attack, amyotrophic lateral sclerosis, acute It is a therapeutic / preventive agent for diseases such as myocardial infarction, spinocerebellar degeneration, fracture, wound, atopic dermatitis, osteoporosis, asthma, epilepsy, infertility, arteriosclerosis, emphysema, pulmonary edema, lactation insufficiency or AIDS (23) The medicine etc. of (25) description are provided.
[0008]
Regarding the G protein-coupled receptor protein for the ligand polypeptide in the present invention, specifically,
(31) A G protein-coupled receptor protein or a salt thereof comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or
(32) an amino acid sequence in which the protein has a deletion of 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 1 to 30 or less, preferably 1 to 10 amino acids added (or inserted), or 1 to 30 or less in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, preferably Relates to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to (31) above, which is a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted with other amino acids.
[0009]
In the present specification, “substantially the same” means that the activity of a protein, for example, the binding activity of a ligand and a receptor, physiological characteristics, and the like are substantially the same. Amino acid substitutions, deletions, additions or insertions often do not result in significant changes in the physiological or chemical properties of the polypeptide, but in such cases the polypeptide with the substitution, deletion, addition or insertion Would be substantially identical to those without such substitutions, deletions, additions or insertions. Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can be selected from other amino acids in the class to which the amino acid belongs, for example. Nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, and the like. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The ligand polypeptide of the present invention may be any as long as it can bind to a G protein-coupled receptor protein (APJ). Specifically, (1) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof; (2) the amino acid represented by SEQ ID NO: 15 A partial peptide of a precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the sequence, (3) a portion of the precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 A peptide, (4) a partial peptide of a precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 40, or (5) the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 Alternatively, a polypeptide containing a precursor partial peptide containing substantially the same amino acid sequence, and the like can be mentioned.
[0011]
The ligand polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as polypeptide), its production method and use will be described in more detail below.
Examples of the ligand polypeptide of the present invention include humans and warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) (eg, pituitary, pancreas, brain, kidney, liver, A polypeptide derived from the gonad, thyroid gland, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract, blood vessel, heart, etc.) or cell, etc., which is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Any polypeptide may be used as long as it contains the same amino acid sequence. Specifically, (1) it contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or a partial peptide thereof, (2) containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 Partial peptide of the precursor, (3) partial peptide of the precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, (4) represented by SEQ ID NO: 40 A partial peptide of a precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, or (5) a precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 Any partial peptide may be used. For example, the ligand polypeptide of the present invention includes (1) a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the like, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and about 50 to 99.9%. An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising an amino acid sequence having a homology of (preferably 70 to 99.9%, more preferably 80 to 99.9%, still more preferably 90 to 99.9%) A polypeptide having substantially the same quality of activity as a polypeptide containing a polypeptide, (2) a polypeptide having substantially the same quality of activity as a partial peptide of the precursor represented by SEQ ID NO: 15, and (3) a sequence number A polypeptide having substantially the same quality of activity as the partial peptide of the precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 38, (4) A polypeptide having substantially the same activity as a partial peptide of a precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 40, or (5) represented by SEQ ID No. 42 And a polypeptide having substantially the same quality of activity as a partial peptide of a precursor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence. Examples of substantially the same activity include receptor binding activity and signal transduction activity.
“Substantially the same quality” means that the receptor binding activity and the like are the same in nature. Accordingly, strength factors such as the strength of receptor binding activity and quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
[0012]
Specifically, the polypeptide of the present invention includes (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, (3) SEQ ID NO: : Partial sequence of amino acid sequence represented by 38, (4) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, (5) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, etc. Examples include mouse brain, rat brain, porcine brain, porcine small intestine, bovine hypothalamus, bovine stomach, human hypothalamus or human lung-containing polypeptide containing an amino acid sequence.
Further, (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and (3) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 (4) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, or the like. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted into the polypeptide or a partial peptide thereof is a polypeptide containing substantially the same amino acid sequence. Can be mentioned. For example, (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and (3) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 Or a partial sequence of the amino acid sequence represented by (4) SEQ ID NO: 40 or a partial sequence of the amino acid sequence represented by (5) SEQ ID NO: 42, preferably 1 to 7 inclusive, preferably 1 An amino acid sequence in which one or more and five or less, more preferably one or more and three or less amino acids are deleted, (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) SEQ ID NO: 15 (3) partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, (4) partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) SEQ ID NO: A represented by 42 An amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acids are added (or inserted) to the partial sequence of the no acid sequence, (1) sequence No. 1 amino acid sequence or partial sequence thereof, (2) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, (3) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, (4) ▼ Partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or 5) Partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, 1 or more and 7 or less, preferably 1 or more and 5 or less, More preferred is a polypeptide containing an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted with other amino acids.
Furthermore, the polypeptide or partial peptide of the present invention includes those in which the N-terminal side of Gln is cleaved in vivo and the Gln is pyroglutamine oxidized.
The precursor of the present invention may be any protein as long as it contains the ligand peptide of the present invention as a partial sequence. Specifically, the precursor is represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42. (Hereinafter, sometimes referred to as the polypeptide of the present invention or the ligand polypeptide together with the ligand polypeptide).
The polypeptide of the present invention has a molecular weight of about 1000 to 10,000 daltons, preferably about 1000 to about 5000 daltons, more preferably about 1000 to about 3000 daltons.
In the present specification, the (poly) peptide has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, (3) the portion of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 The polypeptide containing the sequence, (4) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, etc. has a normal carboxyl group ( -COOH) or carboxylate (-COO - ), But the C-terminus is an amide (-CONH 2 ) Or ester (-COOR). Examples of the R of the ester include C such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 C such as alkyl group, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 C such as cycloalkyl group, phenyl, α-naphthyl, etc. 6-12 Phenyl-C such as aryl group, benzyl, phenethyl, benzhydryl 1-2 Alkyl or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as alkyl 7-14 In addition to the aralkyl group, pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, can be mentioned. (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, (3) the portion of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 A polypeptide containing the sequence, (4) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, etc. In the case of having a carboxylate, those in which those groups are amidated or esterified are also included in the polypeptide of the present invention. As the ester at this time, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
As a salt of the polypeptide of the present invention, a salt with a physiologically acceptable base (for example, alkali metal) or an acid (organic acid, inorganic acid) is used, and particularly a physiologically acceptable acid addition salt. Is preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
The polypeptide of the present invention can be produced by a method for purifying a polypeptide from human or warm-blooded animal tissue or cells, or can be produced according to the polypeptide synthesis method described below. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding a polypeptide to be described later.
When producing from tissues or cells of humans or warm-blooded animals, homogenize the tissues or cells of humans or warm-blooded animals, and then perform extraction with acid, etc., and extract the extracted solution using salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase It can be purified and isolated by combining chromatography such as chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
[0013]
As described above, the polypeptide of the present invention can be produced according to a known method for synthesizing a polypeptide or by cleaving a polypeptide containing the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing the partial peptide or amino acid that can constitute the polypeptide of the present invention and the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in (1) to (5) below.
(1) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara,
(5) Supervised by Haruaki Yajima, Development of follow-up
Further, after the reaction, the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the polypeptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can do.
[0014]
As the amide form of the polypeptide, a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenyl. Examples include acetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. . Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se. At the end of the reaction, the peptide is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. If necessary, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide.
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. Examples of carbodiimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and the like. For activation by these, a protected amino acid together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt, etc.) is added directly to the resin, or a pre-protected amino acid such as a symmetric anhydride or HOBt ester or HOOBt ester is added. It can be added to the resin after activation. The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable for the peptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and sulfoxides such as dimethyl sulfoxide. , Tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material amino acid include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoro Acetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like can be mentioned. Examples of the protecting group for the carboxyl group include C described above as R. 1-6 Alkyl group, C 3-8 A cycloalkyl group, C 7-14 In addition to the aralkyl group, 2-adamantyl, 4-nitrobenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like can be mentioned.
The hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Examples of groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tertiary butyl group.
Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl and Cl. 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyano Methyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt)] and the like. Examples of the activated amino group of the raw material include the corresponding phosphoric acid amide.
[0015]
Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid. And acid treatment with trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1 Therefore, the addition of a cation scavenger such as 2-ethanedithiol is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine was removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the above 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol and the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia and the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a polypeptide, first, the α-carboxyl group of the carboxyl terminal amino acid is amidated, the peptide chain is extended to the amino group side to a desired chain length, and then the N of the peptide chain is determined. A peptide from which only the terminal α-amino protecting group is removed and a peptide (or amino acid) from which only the C-terminal carboxyl protecting group is removed are produced, and both peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Let The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method to obtain the desired crude polypeptide. This crude polypeptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide of the desired polypeptide.
To obtain an ester of a polypeptide, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired polypeptide is obtained in the same manner as the amide of the polypeptide. Can do.
[0016]
The polypeptide of the present invention includes (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and (3) SEQ ID NO: : Partial sequence of amino acid sequence represented by 38, (4) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, or the like Action similar to that of a polypeptide containing substantially the same amino acid sequence (central nerve function regulating action, cardiac function regulating action, immune function regulating action, digestive function regulating action, metabolic function regulating agent or genital function regulating action, etc.) Any peptide may be used as long as it has the following. Examples of such peptides include (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and (3) SEQ ID NO: A peptide having a partial sequence of the amino acid sequence represented by 38, (4) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, etc. And peptides having an amino acid sequence from which one or more amino acids have been deleted. Specifically, (1) a peptide having the first to twelfth amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (2) the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A peptide having the 13th amino acid sequence from (3), a peptide having the first to the 14th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (4) the peptide represented by SEQ ID NO: 1. A peptide having the first to the fifteenth amino acid sequence of the amino acid sequence, (5) a peptide having the first to the sixteenth amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (6) the sequence number : Peptides having a partial sequence of the amino acid sequence represented by 15, 38, 40 or 42 are preferred.
Of these, a peptide having a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 is preferred.
Further, specifically, as a polypeptide having a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42,
(A) a peptide having the 6th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, (b) represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the amino acid sequence from the 40th to the 77th amino acid sequence, (c) having the amino acid sequence from the 42nd to the 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide, (d) a peptide having the 47th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40, or 42, (e) a SEQ ID NO: 15, 38, 40, or 42 A peptide having the 61st to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by (f) an amino acid represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42; A peptide having the 65th to 77th amino acid sequence of the sequence, or an N-terminal amino acid (Gln) thereof having undergone pyroglutamine oxidation, (g) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 (H) a peptide having the 6th to 25th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, i) a peptide having the amino acid sequence from the 42nd to the 64th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, (j) represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the 61st to 64th amino acid sequence of the amino acid sequence, (k) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the amino acid sequence from the 43rd to the 77th amino acid sequence, (l) having the amino acid sequence from the 41st to the 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide, (m) a peptide having the amino acid sequence from 66th to 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, (n) SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide having the 67th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented, (o) the 64th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 (P) having the 63rd to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 A peptide, (q) a peptide having the amino acid sequence from the 65th to the 76th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42, and (r) the SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 Peptides having the 65th to 75th amino acid sequences of the amino acid sequence represented, and the like. Among them, the 65th to 77th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 are mentioned. A peptide having the amino acid sequence or its amino acid sequence (Gln) oxidized with pyroglutamine, or the amino acid sequence from the 42nd to the 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 Peptides having the following are preferably used. In particular, the peptide represented by the 65th to 77th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 38, 40 or 42 or the N-terminal amino acid (Gln) thereof having undergone pyroglutamine oxidation (pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe). Furthermore, a peptide having a partial amino acid sequence of the amino acid sequence represented by pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe is also preferably used as the (poly) peptide of the present invention.
The polypeptides of the present invention can further be used as antigens for the preparation of anti-ligand polypeptide antibodies. In addition to the polypeptide of the present invention described above, a partial peptide such as the N-terminal peptide, C-terminal peptide, and central peptide of the polypeptide of the present invention is used as the polypeptide as such an antigen.
As the partial peptide, a peptide including individual domains can be used, but a partial peptide including a plurality of domains simultaneously may be used.
In the partial peptides in this specification, the C-terminus is also an amide (-CONH 2 ) Or ester (-COOR). Here, examples of the ester group are the same as those of the above-described polypeptide. When the partial peptide has a carboxyl group or a carboxylate other than the C-terminus, those in which these groups are amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester at this time, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
The polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof may further be a fusion protein with a protein whose function or property is well known.
As the partial peptide salt of the polypeptide of the present invention, the same salt as the aforementioned polypeptide salt is used.
A partial peptide of the polypeptide of the present invention or an amide, ester or salt thereof can be produced according to the same synthetic method as in the above-mentioned polypeptide or by cleaving the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase. it can.
[0017]
The DNA encoding the polypeptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a DNA having a binding ability to a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It may be a thing. Specifically, (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, (3) SEQ ID NO: 38 (4) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) amino acid sequence represented by partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 As long as it contains a base sequence encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence, any one may be used. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the tissue / cell described above, cDNA library derived from the tissue / cell described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be amplified directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the tissues and cells.
More specifically, (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, (3) represented by SEQ ID NO: 38 (4) partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) whole mouse brain and rat containing partial sequence of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 Examples of DNA encoding a polypeptide derived from whole brain, bovine hypothalamus, bovine stomach, human hypothalamus or human lung include (1) (1) base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a partial sequence thereof, 2) Partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, (3) Partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39, (4) Partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 41, or (5) SEQ ID NO: 43 (2) DNA containing a DNA having a partial sequence of the nucleotide sequence represented, (2) DNA derived from a mammal that hybridizes with the sequence specified in (1) under stringent conditions, and (3) reduction of the genetic code. Due to its heavy weight, DNA or the like encoding a polypeptide having the same amino acid sequence is used although it does not hybridize with the sequences defined in (1) and (2). Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Examples of the stringent conditions include 42 ° C., 50% formamide, 4 × SSPE (1 × SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM NaH). 2 PO Four ・ H 2 O, 1 mM EDTA pH 7.4), 5 × Denhardt's solution, 0.1% SDS.
In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, Y is T or C, N is T, C, A or G, R is A or G, M is C or A, W is T or A , S represents C or G.
Further, (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, (2) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and (3) represented by SEQ ID NO: 38. DNA encoding a polypeptide containing a partial sequence of the amino acid sequence, (4) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, or (5) a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 Among them, for example, a DNA fragment containing a partial base sequence of 6 or more and 51 or less (preferably 9 or more and 30 or less, more preferably 12 or more and 30 or less) is also preferably used as a DNA detection probe.
[0018]
The DNA encoding the polypeptide of the present invention can also be produced by the following genetic engineering technique.
As a means for cloning DNA that completely encodes the polypeptide of the present invention, the objective is to use the synthetic DNA primer having a partial base sequence of the polypeptide of the present invention as a target from the DNA library or the like by a PCR method known per se. DNA can be amplified or can be selected by hybridization with DNA labeled with, for example, a DNA fragment having a part or all of the polypeptide of the present invention or a synthetic DNA. . The hybridization method is performed according to the method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. When a commercially available library is used, it is carried out according to the method described in the attached instruction manual.
The cloned DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
Examples of the expression vector for the polypeptide of the present invention include (a) excising a target DNA fragment from the DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (b) placing the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. It can manufacture by connecting.
Examples of the vector include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. Animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
[0019]
When the host for transformation is an animal cell, SV40-derived promoters, retrovirus promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, cytomegalovirus promoters, SRα promoters and the like can be used. When the host is Escherichia, trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, λP L When the host is Bacillus, the promoter, lpp promoter, etc. are SPO1, SPO2, promoter, etc. When the host is yeast, the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter, etc. Is preferred. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r And neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like. In particular, CHO (dhfr - ) When using the DHFR gene as a selection marker using cells, it can also be selected by a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide or a partial peptide thereof. When the host is Escherichia, the phoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, mating factor α (MFα) signal sequence, invertase signal sequence, etc. When the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. Can be used respectively.
A transformant can be produced using a vector containing DNA encoding the polypeptide thus constructed.
[0020]
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect or insect cells, animal cells, and the like are used.
Examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 / DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology], 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], and the like.
Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gen, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984). ] Is used.
[0021]
Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R. - NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, etc. are used.
Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, silkworm-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells [Vaughn, JL et al., In Vitro, Vol. 13, 213-217 (1977)].
Examples of animal cells include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CHO (dhfr-CHO cells), mouse L cells, mouse 3T3 cells, mouse myeloma cells, human HEK293 cells, Human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALB3T3 cells, Sp-2 / O cells and the like are used.
In order to transform Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, 2110 (1972), for example, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA ) And Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus is carried out according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, see, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). This is done according to the method described.
[0022]
Insect cells or insects are transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, pp. 47-55 (1988).
Animal cells are transformed according to the method described in, for example, Virology, Vol. 52, 456 (1973).
Examples of methods for introducing an expression vector into cells include the lipofection method [Felgner, PL et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America), 84, 7413 (1987)], calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology, 52, 456-467 (1973)], Electroporation (Nuemann, E. et al. Embo Journal (EMBO J.), Vol. 1, pp. 841-845 (1982)).
Thus, a transformant transformed with an expression vector containing a DNA encoding the polypeptide of the present invention is obtained.
In addition, as a method of stably expressing the polypeptide of the present invention using animal cells, there is a method of selecting a cell in which the expression vector introduced into the animal cell is incorporated into a chromosome by clone selection. Specifically, a transformant is selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having high expression ability of the polypeptide of the present invention can be obtained by repeatedly selecting clones for the animal cells obtained using the selection marker. In addition, when the dhfr gene is used as a selection marker, the MTX concentration is gradually increased and cultured, and a resistant strain is selected so that the DNA encoding the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof can be obtained together with the dhfr gene. The animal cell line can be obtained by further amplification.
Producing the polypeptide of the present invention by culturing the above transformant under conditions capable of expressing the DNA encoding the polypeptide of the present invention, and generating and accumulating the polypeptide of the present invention. Can do.
When cultivating a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like. Or as an organic substance and an inorganic substance, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride etc. are mentioned, for example. In addition, yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
[0023]
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. Here, in order to make the promoter work efficiently if necessary, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.
When the host is Escherichia, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When culturing a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimal medium [Bostian, KL et al., “Procedures of the National Academy of Sciences of Sciences. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., “Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)] The pH of the medium should be adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
[0024]
When cultivating a transformant whose host is an insect cell, as a medium, an additive such as 10% bovine serum that has been immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) Those added as appropriate are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When culturing a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal calf serum [Seience, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium [ Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Jounal of the
Especially CHO (dhfr - ) When cells and dhfr genes are used as selection markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal calf serum that contains almost no thymidine.
[0025]
Separation and purification of the polypeptide of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
When the polypeptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw. For example, a method of obtaining a crude polypeptide extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by, for example, can be used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark, hereinafter may be abbreviated as TM).
When the polypeptide is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the polypeptide of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point such as a method, isoelectric focusing method or chromatofocusing is used.
When the polypeptide of the present invention thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely when it is obtained as a salt, a method known per se Alternatively, it can be converted into a free form or other salt by a method similar thereto.
The polypeptide of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially removed by allowing an appropriate protein-modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
The presence of the polypeptide of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody.
[0026]
The DNA encoding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention comprises (1) synthesis of a part or the full length of a ligand of a G protein-coupled receptor protein, and (2) physiological activity of the polypeptide of the present invention. Search, (3) Preparation of synthetic oligonucleotide probe or PCR primer, (4) Acquisition of DNA encoding ligand and precursor protein of G protein coupled receptor protein, (5) Expression system of recombinant receptor protein Development of receptor binding assay system and screening of drug candidate compounds, (6) Acquisition of antibodies and antisera, (7) Development of diagnostic agents using DNA, RNA, antibodies or antisera, (8) Central nervous function Regulator, Circulatory Function Controller, Cardiac Function Regulator, Immune Function Regulator, Gastrointestinal Function Regulator, Metabolic Function Regulator, or Liver Drug development, such as vessels functional modifier can be used in ▲ 9 ▼ gene therapy and the like.
In particular, G protein-coupled receptor agonists or antagonists specific to warm-blooded animals such as humans can be screened by a receptor binding assay system using a recombinant G protein-coupled receptor protein expression system described below, The agonist or antagonist can be used as a prophylactic / therapeutic agent for various diseases.
[0027]
Further, regarding the above (8), the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same is a G protein expressed in the central nervous system, circulatory system, heart, immune system, digestive system, metabolic system or genital system. Since the conjugated receptor protein is recognized as a ligand, it is useful as a safe and low-toxic drug. The polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same is used for a CNS function regulating action, a circulatory function regulating action, a cardiac function regulating action, an immune function regulating action, a digestive function regulating action, a metabolic function regulating action or a genital function regulating action, etc. Dementia caused by, for example, senile dementia, cerebrovascular dementia, systematic degenerative degenerative diseases (eg Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.), infectious diseases (eg : Dementia, endocrine, metabolic, and toxic diseases (eg, hypothyroidism, vitamin B12 deficiency, alcoholism, various drugs, metals, and organics) caused by Creutzfeldt-late virus infection such as Jacob disease) Dementia caused by compound poisoning, etc., dementia caused by neoplastic disease (eg, brain tumor, etc.), traumatic disease (eg, chronic subdural) Dementia such as dementia, depression, hyperactive child (microbrain disorder) syndrome, consciousness disorder, anxiety disorder, schizophrenia, phobia, growth hormone secretion disorder (eg, giantism, acromegaly) ), Bulimia, bulimia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, hyperprolactinemia, diabetes (eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic) Retinopathy, etc.), cancer (eg, breast cancer, lymphocytic leukemia, lung cancer, bladder cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc.), pancreatitis, kidney disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), Turner syndrome, neurosis, rheumatism Arthritis, spinal cord injury, transient ischemic attack, amyotrophic lateral sclerosis, acute myocardial infarction, spinocerebellar degeneration, fracture, wound, atopic dermatitis, osteoporosis, asthma, epilepsy, infertility, arteriosclerosis Emphysema, pulmonary edema or lactation insufficiency It can be used as a therapeutic and preventive agent for disease. Furthermore, it can be used as a nutritional condition improving agent, a pressor agent and the like after surgery.
In addition, it can be used as a therapeutic / preventive agent for HIV infection, AIDS (AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)) and the like.
When the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same is used as the above-mentioned pharmaceutical, it can be carried out according to conventional means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating or enteric coating as necessary, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a suspension. For example, the compound or salt thereof is admixed in a unit dosage form generally accepted in accepted pharmaceutical practice with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like. Can be manufactured. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained. When the DNA of the present invention is used, it can be carried out according to conventional means after inserting the DNA alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. .
[0028]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like A swelling agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, red oil, or cherry are used. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. .
Examples of aqueous solutions for injection include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and appropriate solubilizing agents. For example, you may use together with alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50), etc. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
Buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), storage You may mix | blend with an agent (for example, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans and mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, rabbits, chickens, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, baboons, chimpanzees, etc. ).
The dose of the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same varies depending on symptoms and the like, but in the case of oral administration, it is generally about 0. 0 per day for adult emphysema patients (with a body weight of 60 kg). 1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, in administration to an adult emphysema patient (with a body weight of 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0029]
Examples of the G protein-coupled receptor protein for the polypeptide of the present invention include humans and warm-blooded animals (eg, mammalian warm-blooded animals (eg, rabbits, sheep, goats, rats, mice, guinea pigs, cows, horses, pigs), Any tissue (eg, pituitary, pancreas, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestion, etc. of birds (eg, chickens, pigeons, ducks, geese, quails) Tube protein, blood vessel, heart, etc.) or cell-derived G protein-coupled receptor protein, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It may be a thing. That is, as a G protein-coupled receptor protein, in addition to a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, etc., the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 has a homology of about 90 to 99.9%. And a protein having substantially the same activity as that of the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
Examples of the activity exhibited by these proteins include ligand binding activity and signal transduction. “Substantially the same quality” means that the ligand binding activity and the like are the same in nature. Therefore, the quantitative factors such as the strength of the ligand binding activity and the molecular weight of the receptor protein may be different.
[0030]
Furthermore, in G protein-coupled receptor proteins, N-terminal Met is a protecting group (for example, C-form such as formyl group, acetyl group, etc.). 1-6 That are protected with an acyl group, the N terminal side of Gln is cleaved in vivo and the Gln is pyroglutamine oxidized, and the side chain of the amino acid in the molecule is an appropriate protecting group (for example, formyl group, acetyl group) C such as group 1-6 Examples thereof include those protected with an acyl group or the like, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
[0031]
Examples of the salt of the G protein-coupled receptor protein include the same salts as the aforementioned polypeptide salts.
The G protein-coupled receptor protein or a salt thereof or a partial peptide thereof can be produced from a human or warm-blooded animal tissue or cell by a known protein purification method, and contains a DNA encoding the aforementioned polypeptide. It can also be produced by the same method as the method for culturing the transformant to be cultured. Moreover, it can also manufacture according to the above-mentioned peptide synthesis method.
As the partial peptide of the G protein-coupled receptor protein, for example, a portion of the G protein-coupled receptor protein molecule that is exposed outside the cell membrane is used. That is, it is a peptide containing a portion analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobicity plot analysis of a G protein-coupled receptor protein. In addition, a peptide partially including a hydrophobic site can be used as well. Peptides containing individual domains can also be used, but partial peptides containing multiple domains simultaneously may be used.
As the partial peptide salt of the G protein-coupled receptor protein, the same salt as the ligand polypeptide salt described above can be used.
[0032]
The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein includes a nucleotide sequence encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 3. Anything can be used. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, tissue / cell-derived cDNA, tissue / cell-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can be directly amplified by a well-known RT-PCR method using a RNA fraction prepared from a tissue / cell.
Specifically, as the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is used.
[0033]
The use of the polypeptide of the present invention, DNA encoding the polypeptide, and antibody will be specifically described below.
(1) Prophylactic / therapeutic agent for ligand polypeptide deficiency
According to the action of the polypeptide of the present invention on the G protein-coupled receptor protein (APJ), the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used to prevent or treat a ligand polypeptide or G protein-coupled receptor protein (APJ) deficiency. It can also be used as an agent.
For example, since the polypeptide of the present invention or the G protein-coupled receptor protein (APJ) is decreased in vivo, the physiological action of the ligand (central nervous function regulating action, circulatory function regulating action, cardiac function regulating action, immunity, etc.) When there is a patient who cannot expect a function regulating action, a digestive function regulating action, a metabolic function regulating action, a genital function regulating action, etc.) Or (b) a ligand polypeptide in the brain cells of the patient by inserting and expressing the DNA encoding the polypeptide of the present invention in the brain cells and then transplanting the brain cells into the patient. Thus, the action of the ligand polypeptide can be fully exerted. Therefore, the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used as a safe and low-toxic ligand polypeptide deficiency prophylactic / therapeutic agent.
When the DNA is used as the therapeutic agent, the DNA of the present invention described above or the polypeptide thereof can be used after the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. It can be carried out according to the same means as in the case of using DNA encoding a partial peptide as a medicine.
[0034]
(2) Quantification method of G protein-coupled receptor protein (APJ) against ligand polypeptide
Since the polypeptide of the present invention has binding properties to the G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof, or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof, the G protein-coupled receptor protein ( APJ) or a salt thereof, or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof can be quantified with high sensitivity.
This quantification method can be used by combining with a competitive method, for example. That is, the concentration of a G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof, or a partial peptide of a G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof by bringing the subject into contact with the polypeptide of the present invention. Can be measured. Specifically, for example, it can be used according to a method known per se described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
▲ 1 Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, 1974)
▲ 2 Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979)
[0035]
(3) The binding property between the G protein-coupled receptor protein (APJ) and the polypeptide of the present invention or an amide, ester or salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as ligand or ligand polypeptide) is changed. For screening compounds
A G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof, a partial peptide or a salt thereof, or a recombinant receptor protein (APJ) expression system is constructed, and a receptor binding assay system using the expression system is prepared. Screening compounds (eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof that change the binding properties of the ligand polypeptide and G protein-coupled receptor protein (APJ). can do. Such compounds include cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca via G protein coupled receptor (APJ)). 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) A compound having a cell stimulating activity (that is, a G protein-coupled receptor antagonist) and the like. “Changing the binding property to the ligand” includes both the case where the binding with the ligand is inhibited and the case where the binding with the ligand is promoted.
[0036]
That is, the present invention includes (i) a case where the ligand of the present invention is brought into contact with (i) a G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof, or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof; A polypeptide of the present invention, characterized in that a comparison is made with a polypeptide of the present invention and a test compound in contact with a conjugated receptor protein (APJ) or a salt thereof or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof. And a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between G protein-coupled receptor protein (APJ) and G protein-coupled receptor protein.
In the screening method of the present invention, (i) the above-mentioned G protein-coupled receptor protein (APJ) or a partial peptide of the receptor protein is brought into contact with the polypeptide of the present invention; and (ii) the above-described G protein coupling. When the polypeptide of the present invention and a test compound are brought into contact with the receptor protein (APJ) or a partial peptide of the receptor protein, for example, the ligand for the G protein-coupled receptor protein (APJ) or the partial peptide of the receptor protein Measure the amount of binding, cell stimulating activity, etc. and compare.
[0037]
Specifically, the screening method of the present invention includes:
(1) When the labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with the above-mentioned G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof, or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof; The labeled polypeptide of the present invention when the polypeptide of the present invention and the test compound are contacted with a G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof. The polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein, characterized by measuring and comparing the binding amount of the polypeptide to the G protein-coupled receptor protein (APJ) or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof. Of a compound or a salt thereof that changes the binding property to (APJ) Cleaning method,
(2) When the labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with a cell containing a G protein-coupled receptor protein (APJ) or a membrane fraction of the cell, the labeled polypeptide of the present invention and the test compound The amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the cell or the membrane fraction when contacting with a cell containing the G protein-coupled receptor protein (APJ) or the membrane fraction of the cell is measured and compared. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein (APJ),
(3) G protein-coupled receptor protein (APJ) expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein (APJ) with the labeled polypeptide of the present invention A G protein conjugate expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the labeled polypeptide of the present invention and a test compound containing DNA encoding the G protein coupled receptor protein (APJ). The polypeptide of the present invention and G protein, wherein the amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the G protein-coupled receptor protein when contacted with a type A receptor protein (APJ) is measured and compared A script for a compound or a salt thereof that changes the binding property to a conjugated receptor protein (APJ) Training method,
[0038]
(4) When a compound that activates a G protein-coupled receptor (APJ) (for example, the polypeptide of the present invention) is brought into contact with a cell containing the G protein-coupled receptor protein (APJ); Cell stimulation activity via G protein-coupled receptor (APJ) when a compound that activates receptor (APJ) and a test compound are contacted with a cell containing G protein-coupled receptor protein (APJ) (for example, Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein (APJ), characterized by measuring and comparing; and
(5) culturing a transformant containing a DNA encoding a G protein-coupled receptor protein (APJ) with a compound that activates the G protein-coupled receptor (APJ) (for example, the polypeptide of the present invention). A G protein-coupled receptor protein (APJ), a compound that activates the G protein-coupled receptor (APJ), and a test compound that is a G protein-coupled receptor protein (APJ). Cell stimulation activity via G protein-coupled receptor (APJ) when contacted with G protein-coupled receptor protein (APJ) expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the encoded DNA (for example, Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) And a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein (APJ), which is characterized by measuring and comparing.
[0039]
A specific description of the screening method of the present invention will be given below.
First, as the G protein-coupled receptor protein (APJ) used in the screening method of the present invention, any G protein-coupled receptor protein or any protein containing a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein may be used. The membrane fraction of human or warm-blooded animal organs is preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, G protein-coupled receptor protein (APJ) and the like that are expressed in large quantities using recombinants are suitable for screening.
In order to produce a G protein-coupled receptor protein (APJ), the above-described method or the like is used.
In the screening method of the present invention, when a cell containing a G protein-coupled receptor protein or a cell membrane fraction is used, the preparation method described later may be followed.
When cells containing a G protein-coupled receptor protein are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
A cell containing a G protein-coupled receptor protein refers to a host cell that expresses a G protein-coupled receptor protein. Examples of the host cell include the aforementioned E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like. Can be mentioned.
The membrane fraction refers to a fraction containing a lot of cell membranes obtained by a method known per se after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, and pressurizing with a French press, etc. Crushing by things. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is taken as the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed G protein-coupled receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
[0040]
The amount of G protein-coupled receptor protein in cells or membrane fractions containing the G protein-coupled receptor protein is 10 per cell. Three -10 8 Preferably it is a molecule. Five -10 7 It is preferably a molecule. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large amount of samples in the same lot. .
[0041]
In order to carry out the above-mentioned (1) to (3) for screening a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor, an appropriate G protein-coupled receptor fraction and a label are used. The polypeptide of the present invention is used. The G protein-coupled receptor fraction is preferably a natural G protein-coupled receptor fraction or a recombinant G protein-coupled receptor fraction having the same activity. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used. For example [ Three H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 A ligand labeled with S] or the like can be used.
Specifically, in order to screen for a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein, first a cell or a membrane of a cell containing a G protein-coupled receptor protein (APJ) is used. A receptor preparation is prepared by suspending the fraction in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably
[0042]
In order to carry out the above methods (4) to (5) for screening a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein (APJ), the G protein-coupled receptor protein is used. Cell-stimulating activity through the cell (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or inhibit pH reduction, etc.) It can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing a G protein-coupled receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on the cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing an appropriate G protein-coupled receptor protein are required. The cells expressing the G protein-coupled receptor protein of the present invention are preferably the above-mentioned recombinant G protein-coupled receptor protein (APJ) -expressing cell line.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like, and these compounds may be novel compounds. In addition, a known compound may be used.
[0043]
A screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein (APJ) comprises a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, and a part of the G protein-coupled receptor protein. A peptide or a salt thereof, a cell fraction containing a G protein-coupled receptor protein, or a membrane fraction of a cell containing a G protein-coupled receptor protein, and the polypeptide of the present invention.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagents
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) G protein-coupled receptor (APJ) preparation
CHO cells expressing G protein-coupled receptor protein (APJ) were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 Five Passed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO 2 Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Labeled ligand
[ Three H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and other labeled ligands
A solution dissolved in an appropriate solvent or buffer is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer at the time of use.
(4) Ligand standard solution
The polypeptide of the present invention is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
[0044]
2. Measuring method
{Circle around (1)} Cells expressing a G protein-coupled receptor protein cultured on a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
▲ 2 ▼ 10 -3 -10 -Ten After adding 5 μl of the test compound solution of M, 5 μl of the labeled peptide of the present invention is added and allowed to react at room temperature for 1 hour. To know the amount of non-specific binding, instead of the test compound, 10 -3
(3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
{Circle around (4)} Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation [Formula 1].
[Equation 1]
PMB = [(B-NSB) / (B 0 -NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added
NSB: Non-specific binding
B 0 : Maximum binding amount
[0045]
The compound or salt thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention is a compound that changes (inhibits or promotes binding) the binding between the polypeptide of the present invention and the G protein-coupled receptor (APJ). Yes, specifically, a compound having a cell stimulating activity via a G protein-coupled receptor or a salt thereof (so-called G protein-coupled receptor agonist), or a compound not having the stimulating activity (so-called G protein-coupled receptor antagonist) It is.
Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
The specific evaluation method of whether it is a G protein-coupled receptor agonist or an antagonist may follow the following (i) or (ii).
(I) A compound that changes the binding property (especially, inhibits binding) between the polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor by performing the binding assay shown by the screening methods of (1) to (3) above. Thereafter, it is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity via the G protein-coupled receptor described above. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a G protein-coupled receptor agonist, and a compound having no such activity or a salt thereof is a G protein-coupled receptor antagonist.
(Ii) (a) A test compound is contacted with a cell containing a G protein-coupled receptor protein, and the cell stimulating activity via the G protein-coupled receptor is measured. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a G protein-coupled receptor agonist.
(b) a compound that activates a G protein-coupled receptor (for example, a polypeptide of the present invention or a G protein-coupled receptor agonist) is brought into contact with a cell containing the G protein-coupled receptor protein; The cell stimulating activity via the G protein-coupled receptor when a compound that activates the coupled receptor and a test compound are brought into contact with a cell containing the G protein-coupled receptor protein is measured and compared. A compound or a salt thereof that can reduce the cell stimulating activity of a compound that activates a G protein-coupled receptor is a G protein-coupled receptor antagonist.
Since the G protein-coupled receptor agonist has the same action as the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the G protein-coupled receptor protein, it is a safe and low toxic pharmaceutical similar to the polypeptide of the present invention. Useful as.
Conversely, G protein-coupled receptor antagonists can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention against G protein-coupled receptor proteins, and are therefore useful as safe and low-toxic pharmaceuticals that inhibit the receptor activity. is there.
Since the polypeptide of the present invention is involved in CNS function regulating action, circulatory function regulating action, cardiac function regulating action, immune function regulating action, digestive organ function regulating action, metabolic function regulating action or genital function regulating action, etc. Dementia and infectious diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.) : Dementia, endocrine, metabolic, and toxic diseases (eg, hypothyroidism, vitamin B12 deficiency, alcoholism, various drugs, metals, and organics) caused by Creutzfeldt-late virus infection such as Jacob disease) Dementia caused by compound poisoning, etc., dementia caused by neoplastic disease (eg brain tumor, etc.), traumatic disease ( : Dementia such as dementia caused by chronic subdural hematoma), depression, hyperactive child (microencephalopathy) syndrome, consciousness disorder, anxiety disorder, schizophrenia, phobia, growth hormone secretion disorder (eg, giantism) Terminal hypertrophy etc.), bulimia, bulimia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, hyperprolactinemia, hypoglycemia, hypopituitarism, pituitary dwarfism , Diabetes (eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), cancer (eg, breast cancer, lymphocytic leukemia, lung cancer, bladder cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc.), Pancreatitis, kidney disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), Turner syndrome, neurosis, rheumatoid arthritis, spinal cord injury, transient ischemic attack, amyotrophic lateral sclerosis, acute myocardial infarction, spinocerebellar degeneration Disease, fracture, wound, atopic dermatitis, osteoporosis, asthma, epilepsy N, infertility, arteriosclerosis, emphysema, can be used as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as pulmonary edema or lactation failure. Further, it can be used as a hypnotic sedative, a post-surgical nutritional condition improving agent, a pressor, a hypotensive agent, and the like.
In addition, it can be used as a therapeutic / preventive agent for HIV infection, AIDS (AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)) and the like.
Examples of the salt of the compound obtained using the screening method or screening kit described above include pharmaceutically acceptable salts. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
Preferable examples of the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt.
Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine. And salt.
Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
Preferable examples of the salt with organic acid include formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid. And salt.
Preferable examples of the salt with basic amino acid include salts with arginine, lysine, ortinine and the like, and preferable examples with acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like.
When the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out in the same manner as when the above-described polypeptide of the present invention is implemented as a medicament.
[0046]
(4) Production of antibody or antiserum against the polypeptide of the present invention
An antibody (eg, polyclonal antibody, monoclonal antibody) or antiserum against the polypeptide of the present invention can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se, using the polypeptide of the present invention as an antigen.
For example, a polyclonal antibody can be produced according to the method described below.
[0047]
[Preparation of polyclonal antibody]
A polyclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immune antigen (antigen such as a polypeptide) and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal (eg, a mammal warm-blooded animal (eg, rabbit, sheep, goat, rat) is produced in the same manner as the monoclonal antibody production method described below. , Mice, guinea pigs, cows, horses, pigs), birds (eg, chickens, pigeons, ducks, geese, quails) etc., and the antibody-containing product against the polypeptide of the present invention is collected from the immunized animals. It can be produced by separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used for immunizing mammals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten (polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof) are cross-linked to the carrier. Any antibody can be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the immunized hapten. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. by weight ratio. A method is used in which hapten 1 is coupled at a ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5.
Various coupling agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiopyridyl group are used.
The condensation product is administered to the above-mentioned warm-blooded animal per se, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks and about 3 to 10 times in total.
The polyclonal antibody is collected from blood, ascites, etc. of mammals immunized by the above method, preferably from blood.
The antibody titer against the polypeptide of the present invention in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer of the hybridoma culture supernatant described later. Separation and purification of the antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as that of the monoclonal antibody described later.
[0048]
Monoclonal antibodies can be produced according to the method described below.
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The polypeptide of the present invention is a warm-blooded animal (eg, a mammal warm-blooded animal (eg, rabbit, sheep, goat, rat, mouse, guinea pig, cow, horse, pig), bird (eg, chicken, pigeon, duck, goose). , Quail, etc.) by administration to a site where antibody production is possible by administration, together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total.
[0049]
When producing monoclonal antibody-producing cells, select an individual with an antibody titer from the above-mentioned warm-blooded animal immunized with an antigen, such as a mouse, and collect the spleen or
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like. P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be efficiently carried out by incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes.
Various methods can be used for screening of antibody-producing hybridomas against the polypeptide of the present invention. For example, the hybridoma culture supernatant is applied to a solid phase (eg, microplate) on which the polypeptide antigen of the present invention is adsorbed directly or together with a carrier. Then add anti-immunoglobulin antibody (if the cells used for cell fusion are mice, anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A labeled with a radioactive substance or enzyme, etc. A method for detecting a monoclonal antibody against the polypeptide of the invention, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding the polypeptide of the present invention labeled with a radioactive substance or an enzyme, Monoclonal to a polypeptide of the invention bound to a solid phase Such as a method for detecting a body, and the like.
Selection of a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it is performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal calf serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culture is usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer to the polypeptide of the present invention in the above antiserum.
[0050]
(B) Purification of monoclonal antibody
Separation and purification of the monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be carried out in the same manner as in the separation and purification of conventional polyclonal antibodies (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion Absorbing and desorbing using an exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or using an active adsorbent such as protein A or protein G, and collecting the antibody alone to obtain the antibody Specific purification method].
Since the antibody against the polypeptide of the present invention produced according to the above methods (a) and (b) can specifically recognize the polypeptide of the present invention, the polypeptide of the present invention in the test solution It can be used for quantification of urine, especially quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention provides, for example,
(I) An antibody that reacts with the polypeptide of the present invention is reacted competitively with the test solution and the labeled polypeptide of the present invention, and the ratio of the labeled polypeptide of the present invention bound to the antibody is measured. A method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution,
(Ii) A test solution characterized by measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier after reacting the test solution with the antibody insolubilized on the carrier and the labeled antibody simultaneously or continuously. In the method for quantifying the polypeptide of the present invention, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the polypeptide of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the polypeptide of the present invention. There is provided a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test liquid, which is characterized in that it exists.
[0051]
In addition to measuring the polypeptide of the present invention using a monoclonal antibody that recognizes the polypeptide of the present invention, detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ′) of the antibody molecule. 2 , Fab ′, or Fab fractions may be used. The measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, amount of ligand polypeptide) in the solution to be measured is chemically determined. Alternatively, any measurement method may be used as long as it is a measurement method that is detected by physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in view of sensitivity and specificity.
Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ Three H], [ 14 C] and the like are preferably stable and large specific activities, such as β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, and the like. Examples of the luminescent substance include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
[0052]
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized anti-ligand polypeptide antibody (primary reaction), and the labeled anti-ligand polypeptide antibody is further reacted (secondary reaction). By measuring the activity, the amount of the ligand polypeptide in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
The labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
In the method for measuring the polypeptide of the present invention by the sandwich method of the present invention, the anti-ligand polypeptide antibody used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site for the polypeptide of the present invention. . That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody used in the primary reaction when, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminus of the polypeptide of the present invention. For example, an antibody that recognizes the N-terminal part other than the C-terminal part is used.
[0053]
The antibody against the polypeptide of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like. In the competition method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble one is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
[0054]
In applying these individual immunological measurement methods to the measurement method of the present invention, special conditions, operations, and the like are not required to be set. A measurement system for the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, review articles, books, etc. can be referred to (for example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay”. (Kodansha, published in 1979), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Medical School, published in 1978), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Second Edition) (Medical School, 1982) Published by Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Shoin, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid. Antibodies and General Immunoassay Methods)), Vol. 121 (Immun ochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (see above, published by Academic Press).
As described above, the polypeptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using an antibody against the polypeptide of the present invention.
The antibody against the polypeptide of the present invention includes, for example, senile dementia, cerebrovascular dementia, degenerative degenerative disease of systematic transformation (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.), infection Dementia, endocrine, metabolic, and toxic diseases (eg, hypothyroidism, vitamin B12 deficiency, alcoholism, various drugs) caused by sexually transmitted diseases (eg, delayed viral infections such as Creutzfeldt-Jakob disease)・ Dementia caused by metal / organic compound poisoning, etc., dementia caused by neoplastic disease (eg, brain tumor), dementia such as dementia caused by traumatic disease (eg, chronic subdural hematoma, etc.), depression , Hyperactive child (microencephalopathy) syndrome, consciousness disorder, anxiety disorder, schizophrenia, phobia, growth hormone secretion disorder (eg, giantism, acromegaly), bulimia, polyphagia , Hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, hyperprolactinemia, hypoglycemia, hypopituitarism, pituitary dwarfism, diabetes (eg, diabetic complications, diabetic kidneys) , Diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, etc., cancer (eg, breast cancer, lymphocytic leukemia, lung cancer, bladder cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc.), pancreatitis, kidney disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.) ), Turner syndrome, neurosis, rheumatoid arthritis, spinal cord injury, transient ischemic attack, amyotrophic lateral sclerosis, acute myocardial infarction, spinocerebellar degeneration, fracture, wound, atopic dermatitis, osteoporosis, It can be used as a diagnostic agent (medicine) for asthma, epilepsy, infertility, arteriosclerosis, emphysema, pulmonary edema or lactation failure.
In addition, it can be used as a diagnostic agent (drug) for HIV infection, AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome).
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
[0055]
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
Y: thymine or cytosine
N: thymine, cytosine, adenine or guanine
R: adenine or guanine
M: cytosine or adenine
W: thymine or adenine
S: cytosine or guanine
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP: Deoxythymidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: sodium dodecyl sulfate
TFA: trifluoroacetic acid
EIA: Enzyme immunoassay
Gly or G: Glycine
Ala or A: Alanine
Val or V: Valine
Leu or L: Leucine
Ile or I: isoleucine
Ser or S: Serine
[0056]
Thr or T: Threonine
Cys or C: cysteine
Met or M: methionine
Glu or E: Glutamic acid
Asp or D: Aspartic acid
Lys or K: lysine
Arg or R: Arginine
His or H: histidine
Phe or F: phenylalanine
Tyr or Y: tyrosine
Trp or W: Tryptophan
Pro or P: proline
Asn or N: Asparagine
Gln or Q: glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
Bom: benzyloxymethyl
NMP: N-methylpyrrolidone
PAM: Phenylacetamidomethyl
[0057]
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl
HONB: N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
Bzl: benzyl
Z: benzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butyloxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
TFA: trifluoroacetic acid
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
DNP: Dinitrophenyl
Bum: Tertiary butoxymethyl
Trt: Trityl
MeBzl: 4-methylbenzyl
[0058]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
1 shows the amino acid sequence of bovine ligand polypeptide (17 sequences from the N-terminus).
[SEQ ID NO: 2]
This shows the base sequence of cDNA encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 3]
G protein-coupled receptor protein (APJ) This shows the entire amino acid sequence of the G protein-coupled receptor protein encoded by cDNA.
[SEQ ID NO: 4]
The entire base sequence of G protein-coupled receptor protein (APJ) cDNA is shown.
[SEQ ID NO: 5]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding G protein-coupled receptor protein.
[SEQ ID NO: 6]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding G protein-coupled receptor protein.
[SEQ ID NO: 7]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding G protein-coupled receptor protein.
[SEQ ID NO: 8]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding G protein-coupled receptor protein.
[SEQ ID NO: 9]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 10]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 11]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 12]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 13]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 14]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 15]
2 shows an amino acid sequence encoded by cDNA encoding a mouse ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 16]
The base sequence of cDNA encoding mouse-type ligand polypeptide is shown.
[SEQ ID NO: 17]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 18]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 19]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding rat-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 20]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding rat-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 21]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding rat-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 22]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding rat-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 23]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 24]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 25]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 26]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 27]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 28]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 29]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 30]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 31]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 32]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 33]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 34]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 35]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 36]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 37]
Synthetic DNA used for screening of cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 38]
1 shows an amino acid sequence encoded by cDNA encoding rat type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 39]
1 shows the base sequence of cDNA encoding rat-type ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 40]
The amino acid sequence encoded by the cDNA encoding the human type ligand polypeptide is shown.
[SEQ ID NO: 41]
This shows the base sequence of cDNA encoding human ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 42]
1 shows the amino acid sequence encoded by cDNA encoding bovine ligand polypeptide.
[SEQ ID NO: 43]
The base sequence of cDNA encoding a bovine ligand polypeptide is shown.
The transformant Escherichia coli JM109 / pmA10L-13 obtained in Example 11, which will be described later, was deposited with the National Institute of Biotechnology, NIBH from December 22, 1997. Deposited as FERM BP-6214.
The transformant Escherichia coli JM109 / prSHe-1 obtained in Example 13, which will be described later, was deposited with the National Institute of Biotechnology, NIBH from January 20, 1998. Deposited as FERM BP-6228.
The transformant Escherichia coli JM109 / phSuN-4 obtained in Example 14, which will be described later, has been deposited with the National Institute of Biotechnology, NIBH from January 20, 1998. Deposited as FERM BP-6229.
The transformant Escherichia coli JM109 / pBovA10prec24 obtained in Example 15, which will be described later, was deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) on January 20, 1998 with a deposit number of FERM BP. Deposited as -6230.
The transformant Escherichia coli BL21 (DE3) / pTB960-13 obtained in Example 35 to be described later is NIBH from NIEDH on December 2, 1998. Has been deposited under the deposit number FERM BP-6590. Also, since November 11, 1998, it has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO16220.
[0059]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[0060]
[Reference Example 1]
Production of synthetic DNA primer for amplifying DNA encoding G protein-coupled receptor protein
Known human-derived TRH receptor protein (HTRHR), human-derived RANTES receptor protein (L10918, HUMRANTES), human Burkitt lymphoma-derived ligand unknown receptor protein (X68149, HSBLR1A), human-derived somatostatin receptor protein (L14856, HUMSOMAT), rat-derived μ-opioid receptor protein (U02083, RNU02083), rat-derived κ-opioid receptor protein (U00442, U00442), human-derived neuromedin B receptor protein (M73482, HUMMBBR), human-derived muscarinic acetylcholine receptor protein (X15266, HSHM4), Rat-derived adrenergic α1B receptor protein (L08609, RATAADR) 01), human-derived
Furthermore, known mouse-derived ligand unknown receptor protein (M80481, MUSGIR), human-derived bombedin receptor protein (L08893, HUMBOMB3S), human-derived adenosine A2 receptor protein (S46950, S46950), mouse-derived ligand-unknown receptor protein (D21061, MUSGPCR) ), Mouse-derived TRH receptor protein (S43387, S43387), rat-derived neuromedin K receptor protein (J05189, RATNEURA), rat-derived adenosine A1 receptor protein (M69045, RATA1ARA), human-derived neurokinin A receptor protein (M57414, HUMNEKAR), Rat derived adenosine A3 receptor protein (M94152, RATADENNREC) Human-derived
The abbreviations in parentheses above are reference numbers shown when searching GenBank / EMBL Data Bank using the DNASIS Gene / Protein Sequence Database (CD019, Hitachi Software Engineering). It is what is called. However, HTRHR is a sequence described in JP-A-7-304797.
In particular, the introduction of mixed bases was planned in order to increase the coincidence of sequences with as many receptor cDNAs as possible in other parts, with reference to the base parts that coincide in cDNAs encoding many receptor proteins. Based on this sequence, two synthetic DNAs having the base sequences represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 that are complementary to the common base sequence were prepared.
[Synthetic DNA]
5′-CGTGGG (G or C) C (A or C) T (G or C) (G or C) TGGGCAAC (A, G, C or T) (C or T) CCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 5 )
5'-GT (A, G, C or T) G (A or T) (A or G) (A or G) GGCA (A, G, C or T) CCAGCAGA (G or T) GGCAAA-3 '( SEQ ID NO: 6)
Figures in parentheses are synthesized by mixing with a plurality of bases at the time of synthesis.
[0061]
[Example 1]
Amplification of G protein-coupled receptor cDNA by PCR using cDNA derived from human amygdala
Amplification by PCR was performed using the DNA primer synthesized in Reference Example 1 using human amygdaloid nucleus-derived cDNA (QuickClone, Clontech) as a template. The composition of the reaction solution is 1 μM each of synthetic DNA primers (sequence: 5 ′ primer sequence and 3 ′ primer sequence), 1 ng of template cDNA, 0.25 mM dNTPs, 1 μl of Taq DNA polymerase, and a buffer attached to the enzyme. Was 100 μl. As a cycle for amplification, a thermal cycler (Perkin Elmer) was used, and a cycle of 96 ° C. for 30 seconds, 45 ° C. for 1 minute, and 60 ° C. for 3 minutes was repeated 30 times. Before adding Taq DNA polymerase, the remaining reaction solution was mixed and heated at 95 ° C. for 5 minutes and at 65 ° C. for 5 minutes. The amplification product was confirmed by 1.2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
Using a part of the reaction product after PCR (1 μl), the amplified DNA was converted into plasmid vector pCR according to the prescription of TA cloning kit (Invitrogen). TM Subcloned into II (TM means registered trademark). This is introduced into E. coli INVαF 'competent cell (Invitrogen) and transformed, and then a clone having a cDNA insert is selected in an LB agar medium containing ampicillin and X-gal, which is an indicator of the transformant. A large number of transformants were obtained by separating only white clones using sterilized toothpicks. Individual clones were cultured overnight in LB medium containing ampicillin, and plasmid DNA was prepared using an automatic plasmid extractor (Kurabo). A portion of the prepared DNA was cut with EcoRI, and the size of the inserted cDNA fragment was confirmed. A part of the remaining DNA was further treated with RNase, extracted with phenol / chloroform, and concentrated by ethanol precipitation. The reaction for determining the base sequence is carried out using the DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI), decoded using a fluorescent automatic sequencer, and the obtained base sequence information using DNASIS (Hitachi System Engineering) I went.
A clone in which a PCR product of cDNA corresponding to the first to sixth membranes of the APJ receptor, which is one of G protein-coupled receptors, is inserted from a large number of transformants based on the analysis of the nucleotide sequence E.coli INV αF ′ / pA10 was found.
Its base sequence is described in O'Dowd, BF et al. This corresponds to the 318th to 993th part of the base sequence of the APJ receptor gene reported by Gene (Vol. 136, 355-360, 1993), but is a PCR product using a denatured primer. The sequence of the primer portion is different from that of APJ and lacks the N-terminus and C-terminus.
[0062]
[Example 2]
Cloning of cDNA containing the entire coding region of receptor protein from cDNA library derived from human amygdala
In order to obtain DNA encoding the full-length APJ receptor, a human amygdaloid nucleus-derived cDNA library was screened using the APJ receptor cDNA fragment obtained in Example 1 as a probe. As a cDNA library derived from human amygdala, a library using a λgt11 phage vector manufactured by Clontech (Clontech, CLHL30086) was used. 2 × 10 6 Escherichia coli Y1090 in which a human amygdaloid cDNA library for pfu (plaque-forning unit) was treated with magnesium sulfate - After incubation at 37 ° C. for 15 minutes, 0.5% agarose (Pharmacia) LB was added and seeded on a 1.5% agar (Wako Pure Chemical Industries) LB plate (containing 50 μg / ml Ampicilin). A nitrocellulose filter was placed on a plate on which plaques were cultured overnight at 42 ° C., and the plaques were transferred onto the filter. After this filter was denatured by alkali treatment, DNA was fixed by heating at 80 ° C. for 3 hours.
This filter is incubated overnight at 42 ° C. with a probe described below in a buffer containing 50% formamide, 4 × SSPE, 5 × Denhardt's solution, 0.1% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA, and allowed to hybridize. It was. As a probe, the DNA fragment inserted into the plasmid pA10 obtained in Example 1 was cleaved with EcoRI, recovered, and then used with a random prime DNA labeling kit (Amersham) [ 32 P] dCTP (DuPont) was used for labeling. Washing was performed with 2 × SSC, 0.1% SDS at 55 ° C. for 1 hour, and then autoradiography was performed at −80 ° C. to detect hybridized plaques.
By this screening, hybridization signals were observed in 4 independent plaques. DNA was prepared from each of these 4 clones, and the digested with EcoRI was subjected to agarose electrophoresis and then analyzed by Southern blotting using the same probe as that used for screening. Hybridized bands were generated at 1.2 kb, 1.3 kb, and 1.6 kb, respectively, and a band that produced a band of about 1.6 kb was selected (λ34). After preparing phage DNA of λ34, an EcoRI fragment of a size to hybridize is subcloned into the EcoRI site of plasmid pUC118, and E. coli JM109 / pUC118-λ34 is obtained by transforming E. coli JM109 with this plasmid. It was. When the nucleotide sequence of this plasmid was determined in the same manner as in Example 1, it was found that the DNA encoding the full length of the G protein-coupled receptor protein (APJ) was retained. The encoded amino acid sequence was identical to that reported by O'Dowd, BF et al. (Gene 136, 355-360, 1993). (GenBank accession number: U03642) The DNA sequence and amino acid sequence are shown in FIG.
[0063]
[Example 3]
Detection of APJ receptor mRNA expression and distribution in human tissues by Northern hybridization
To detect the expression of APJ encoded by the plasmid pUC118-λ34 obtained in Example 2 in human tissue at the mRNA level, Northern blotting was performed. As a filter for Northern blotting, Human MTN Blot I, II (CL7760-1, CL7759-1) was used, and the same probe as that used in Example 1 was used. Hybridization was performed by incubating the filter and probe described above in a buffer containing 50% formamide, 5 × SSPE, 10 × Denhardt's solution, 2% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA overnight at 42 ° C. It was. The filter was washed with 0.1 × SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. and air-dried and exposed to X-ray film (XAR5, Kodak) at −80 ° C. for 3 days. The results are shown in FIG. From FIG. 2, it is found that the receptor gene encoded by pUC118-λ34 is expressed in human heart, brain, placenta, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas, spleen, thymus, prostate, ovary, small intestine and large intestine. It was revealed. In particular, it is strongly expressed in the spleen, heart, and placenta.
[0064]
[Example 4]
Preparation of APJ receptor-expressing CHO cells
The cDNA fragment encoded by pUC118-λ34 has a 5 ′ untranslated region of about 0.2 kb, and it was considered that this portion should be removed as much as possible in order to increase the expression efficiency. In addition, it was necessary to add restriction enzyme sites corresponding to the cloning sites of the expression vector at both ends of the cDNA portion. Therefore, two cDNA fragments on the 5 ′ side and 3 ′ side were separately treated by the following method and inserted downstream of the SRα promoter of the animal cell expression vector pAKKO-111H to construct pAKKO-A10. First, pUC118-λ34 was cleaved at the BstXI site present in each of the 5 ′ untranslated region and the coding region, the ends were repaired using T4 DNA polymerase, and then a SalI linker was added by ligation. After double digestion with SalI-SacI, separation was performed by electrophoresis, and a fragment of about 0.6 kb was recovered. Next, both ends of the cDNA portion inserted into pUC118-λ34 were cleaved by EcoRI digestion, the ends were repaired with T4 DNA polymerase, and then a ClaI linker was added by ligation. In order to distinguish it from the fragment corresponding to the 5′-side portion, digestion with EcoRV, further double digestion with ClaI-SacI, followed by separation by electrophoresis, a fragment of about 0.8 kb was recovered. Furthermore, pAKKO-111H, which is an expression vector for animal cells, was digested with restriction enzyme sites SalI and ClaI in the multicloning site, and then electrophoresed to recover the vector portion. The 5′-side and 3′-side fragments of APJ receptor cDNA and the expression vector prepared by the above operation were ligated by ligation, and E. coli DH5 was transformed to obtain E. coli DH5 / pAKKO-A10.
Transformant E. coli DH5 / pAKKO-A10 was cultured, and a large amount of DNA of plasmid pAKKO-A10 was prepared.
20 μg of the plasmid DNA is dissolved in 1 ml of physiological saline (PBS), then injected into a gene transfer (Wako Pure Chemical) vial, and vigorously stirred using a vortex mixer to form DNA-containing liposomes. I let you. CHOdhfr - Cells 1 to 2 × 10 6 The cells were seeded in a cell culture dish having a diameter of 35 mm, and after culturing for 20 hours, the culture solution was replaced with a fresh one. An amount (25 μl) of a liposome solution corresponding to 0.5 μg of DNA was added dropwise to each petri dish and incubated for 16 hours to introduce plasmid DNA. Furthermore, after changing to a fresh medium and culturing for 1 day, changing to a selective medium and continuing culturing for 3 days, finally, trypsin digestion and dispersing the dispersed cells at low density (without deoxyribonucleosides and ribonucleosides) Transformants were selected by seeding in 10% dialyzed bovine serum (minimum essential medium, alpha medium). Only transformants were able to grow in the selective medium, and selection was repeated by repeated passages to establish CHO-A10 cells.
[0065]
[Example 5]
Confirmation of expression level of full-length receptor protein in CHO-A10 cell line at transcription level
Using Fast Track kit (Invitrogen), poly (A) from CHO-A10 cells and control CHO cells according to the kit prescription + RNA was prepared. This poly (A) + Using 0.02 μg of RNA, cDNA was synthesized using RNA PCR kit (Takara Shuzo). The kind of primer used was random 9mer, and the total volume of the reaction solution was 40 μl. In addition, a reaction solution without reverse transcriptase was also prepared as a negative control for cDNA synthesis. Initially, incubation was performed at 30 ° C. for 10 minutes to allow some extension reaction from the primers. Thereafter, the reverse transcription reaction was sufficiently advanced by incubation at 42 ° C. for 30 minutes, the enzyme was inactivated by heating at 99 ° C. for 5 minutes, and further cooled at 5 ° C. for 5 minutes.
After completion of the reverse transcription reaction, a part of the reaction solution was collected and diluted with distilled water, followed by phenol / chloroform extraction and diethyl ether extraction. This was ethanol precipitated and dissolved in a certain amount of distilled water to prepare a cDNA sample. This cDNA solution and plasmid DNA (pAKKO-A10) were diluted in stages, and PCR was performed using primers specific for the full-length receptor protein. The primer sequence created based on the base sequence of the coding region of the full-length receptor protein is:
5′-CAGACAACCAGTCTGGATGTGGAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
5'-ATGGATTTCTGCGCATCTGTTTCT-3 '(SEQ ID NO: 8)
It is.
The PCR reaction was performed in a total volume of 100 μl using 1 μM of each primer and 0.5 μl of Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), a reaction buffer attached to the enzyme and dNTPs and 10 μl of template DNA (cDNA or plasmid solution). First, after heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes to sufficiently denature the template DNA, a cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 65 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds was performed 25 times. After the reaction was completed, agarol gel electrophoresis was performed using 10 μl of the reaction solution, and amplification products were detected and quantitatively compared. As a result, a PCR product having a size (about 1.1 kb) estimated from the sequence of the cDNA encoding the full-length receptor protein was detected [FIG. 3]. No specific band was detected in the lane of the PCR reaction solution using the reverse transcription reaction product to which reverse transcriptase was not added as a template, and the possibility of being a PCR product derived from genomic DNA of CHO cells was excluded, In addition, since no specific band appeared in the lane of the control cell, it was confirmed that it was not derived from mRNA originally expressed in CHO cells [FIG. 3].
[0066]
[Example 6]
Detection of activity specifically stimulating CHO-A10 cells contained in tissue extract with a site sensor
An extract was prepared from bovine stomach, porcine small intestine / brain basically by the method described below, and cryopreserved was used as a sample for screening for cell stimulating activity.
Boiled and crushed tissue is extracted with 0.5 M acetic acid, the extract is filtered and adsorbed to arginic acid, and the substances contained in the fraction eluted with 0.2 M hydrochloric acid are further collected by salting out. Then, it was dried in vacuum after washing with methanol. This was redissolved in distilled water and adjusted to pH 7.2, then twice the amount of ethanol was added, and the resulting precipitate was collected by filtration. The precipitate was dissolved again in distilled water, adjusted to pH 4.2 to remove the generated precipitate, and then lyophilized. This lyophilized product was dissolved in 0.2 M acetic acid, and fractionated by gel filtration on a Sephadex G-25 column, and each fraction was lyophilized.
Also, the bovine hypothalamus boiled and crushed was extracted with 1M acetic acid, and 0.05% TFA was added to the centrifuged supernatant, and then adsorbed on C18 column, and 10%, 30%, 50% concentration Elute stepwise with acetonitrile. Each eluate was prepared with 20 mM ammonium acetate-10% acetonitrile (pH 4.5) and then adsorbed onto a CM Sepharose cation exchange column (HiPrep CM Sepharose FF, Pharmacia). The 100 mM, 250 mM, 500 mM, and 1000 mM ammonium acetate elution fractions and the flow-through fraction of the column were concentrated and desalted using a Sep-Pak C18 column, and then lyophilized to obtain a sample for screening for cell stimulating activity. .
The cell stimulation activity was measured using a site sensor (Molecular Devices, Inc.) with the rate of change of extracellular pH as an index. Disperse CHO-A10 cells or control cells by trypsin digestion and 3 × 10 Five Each cell suspension prepared in a cell suspension was dispensed in an amount of 0.9 ml per capsule for cytosensor and cultured overnight. The capsule containing the cells was transferred to the sensor chamber and set on the site sensor workstation. Changes in extracellular pH between 8 seconds and 38 seconds (30 seconds) after the pump is turned off by repeatedly turning the pump on (1
To the freeze-dried tissue extract / purified product prepared from bovine stomach, pig small intestine and pig brain by the above method, 1 ml of distilled water was added per 10 mg, and insoluble matter was removed by centrifugation. A 1/40 amount of low buffered RPMI 1640 medium for cytosensor added with bovine serum albumin (Sigma, A-2153, fraction V) was added to prepare a sample for measurement (final concentration 0.25 mg / ml). Since some samples greatly change the pH of the medium, the pH was adjusted using the color of phenol red contained in the medium as an index. This sample was administered to CHO-A10 and control cells, and a sample containing a cell stimulating activity was screened using a difference in cell response as an index. For samples separated and purified by chromatography, a site to which 0.1% bovine serum albumin (Sigma, A-2153, fraction V) was added after dissolving in a small amount of DMSO to dissolve the sample efficiently. Dissolved in low buffered RPMI 1640 medium for sensor. In this case, the same amount (0.2%) of DMSO was added to the medium to which no sample was added, and the cells were acclimated in advance.
As shown in [FIGS. 4 and 5], the cell stimulating activity of samples prepared from bovine stomach, pig small intestine, and pig brain according to the above method was measured using a site sensor and the rate of change of extracellular pH as an index. Samples (B3, B4, S1, S2, S3, S4, G4) that specifically activate APJ receptor-introduced CHO cells (CHO-A10) compared to control cells (increase rate of change in extracellular pH) , G6). Further, as a result of performing the same measurement on the sample prepared from the bovine hypothalamus, as shown in [FIGS. 6 and 7], Fr. 10 (A fraction that is adsorbed on a CM Sepharose ion-exchange column and eluted with 1000 mM ammonium acetate from a C18 column with 30% elution of acetonitrile) has specific cell stimulating activity (activity that increases the rate of change of extracellular pH) Was detected.
[0067]
[Example 7]
Selection of cells with high expression of APJ receptor using cell stimulation activity as an index
The CHO-A10 cell was established by continuing to culture a transformed cell obtained by introducing the expression vector pAKKO-A10 in a selective medium. For this reason, the copy number of the introduced cDNA differs depending on the individual cell, which may cause a difference in the number of APJ receptors expressed on the cell. It is expected that high-sensitivity and stable assay results can be achieved by establishing a high functional receptor-producing cell from such a population by cloning. Therefore, a part of the active fraction after reverse phase chromatography by RESOURCE RPC prepared from the bovine hypothalamus in the same manner as in the case of the bovine stomach shown in Example 8 is collected and used as a standard sample, which is measured by a site sensor. APJ receptor highly expressing cells were selected using cell stimulating activity as an index. When cell stimulating activity was measured for 8 independent clones, remarkable cell stimulating activity was detected for clones Nos. 1, 3, 4 and 6 as shown in FIG. Of these clones, no. Six clones (CHO-A10, clone 6) were further cultured and used for the subsequent measurement of cell stimulating activity.
[0068]
[Example 8]
Purification of active substance (peptide) that specifically increases the rate of change of extracellular pH from CHO-A10 cell line from bovine stomach
Representative examples purified from bovine rumen and rumen for active substances that specifically increase the rate of change of extracellular pH from the CHO-A10 cell line will be specifically described below. Bovine rumen 1.0 kg and rumen 1.0 kg were cut into small pieces and boiled in 4.0 L of distilled water for 20 minutes. After quenching on ice, 280 ml of acetic acid was added to a final concentration of 1.0 M, and homogenized with polytron (12,000 rpm, 12 min). The homogenate was stirred overnight, and then the supernatant was obtained by centrifugation (9,500 rpm, 20 min). The precipitate was suspended in 2.0 L of 1.0 M acetic acid, homogenized with Polytron, and the supernatant was obtained again by centrifugation. The supernatants were combined, TFA was added to a final concentration of 0.05%, and added to a reverse phase C18 column (Prep C18 12518 100 ml; Millipore). After addition, 0.05% TFA / dH 2 O (hereinafter dH 2 O represents distilled water) After washing the column with 200 ml, 10%, 30%, 50% CH Three CN / 0.05% TFA / dH 2 Elutes in 3 steps. 30% CH Three CN / 0.05% TFA /
In diphenyl 219TP5415, 14.0% -20.0% CH Three Elution with CN gradient, 17.0% CH Three In the CN fraction, an activity that specifically increases the rate of change of extracellular pH with respect to the CHO-A10 cell line was detected [FIG. 10]. In Sephasil C8 SC 2.1 / 10, 18.0% -24.0% CH Three 19.5% CH by elution with CN gradient Three The activity of increasing the rate of change of extracellular pH specifically for the CHO-A10 cell line was detected in the CN fraction [FIG. 11]. The active fractions of diphenyl 219TP5415 and Sephasil C8 SC 2.1 / 10 were lyophilized and then dissolved in DMSO to give 0.1% TFA / dH. 2 Suspended in O and added to reverse phase column μRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 (Pharmacia). The active fraction derived from diphenyl 219TP5415 is 16.0% CH Three An active fraction derived from Sephasil C8 SC 2.1 / 10 is 16.0% CH in one peak eluted at 19.0-20.5 min with elution at a uniform concentration of CN. Three In one peak eluted at 18.0-20.0 min with elution at a uniform concentration of CN, an activity that specifically increases the rate of change of extracellular pH was detected in the CHO-A10 cell line [Fig. 12 and FIG. 13].
[0069]
[Example 9]
Amino acid sequencing of an active substance (peptide) that specifically increases the rate of change of extracellular pH in the CHO-A10 cell line from bovine stomach
The amino acid sequence of the active peptide (P-2) that specifically increases the rate of change of extracellular pH in the CHO-A10 cell line purified in Example 8 was determined. The fractions of the two peaks that coincided with the activity in the reverse phase column μRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 were lyophilized, and the amino acid sequence was analyzed by a peptide sequencer (ABI.492).
As a result, the same amino acid sequence (17 sequences from the N-terminus) was obtained from both peaks [SEQ ID NO: 1].
[0070]
[Example 10]
Identification of a gene fragment encoding the mouse form of a bovine stomach-derived peptide fragment
A 17 amino acid bovine stomach-derived peptide fragment obtained by N-terminal amino acid analysis of the purified product of Example 9 was translated into a base sequence [SEQ ID NO: 2], and gene sequence analysis software Gene Bright (Hitachi Software) was used. A homology search was performed against the database of Expressed Sequence Tag (EST) registered in GenBank / EMBL. As a result, a part of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 shows high homology to a sequence obtained by translating an unknown function mouse-derived EST whose accession number was registered as W33327 into an amino acid. It was found that the mouse fragment downstream from the latter half of the 17 amino acids of the stomach-derived peptide fragment was encoded (FIG. 14).
Example 11
Full-length cloning of a ligand gene encoding a mouse form of a 17 amino acid bovine stomach-derived peptide fragment obtained by N-terminal amino acid analysis obtained in Example 9
Based on the sequence of EST obtained in Example 10, W33-F1 (5′-CTGGCAGGGAGGCAGGAGGAA-3 ′) [SEQ ID NO: 9], W33-F2 (5′-GCAGGAGGAAATTTCGCAGACAGC-3 ′) [SEQ ID NO: 10], W33-R1 (5′-GAAGAGAATTCATCTGTGGAGTA-3 ′) [SEQ ID NO: 11] and W33-R2 (5′-ACCGGCACCGGGAGGGCACTT-3 ′) [SEQ ID NO: 12] were respectively synthesized. In addition, from the whole brain of BALB / C mice, using total RNA from Isogen (Nippon gene), followed by oligo (dT) cellulose column (mRNA Purification Kit, Pharmacia) according to the respective manuals, poly (A) + RNA was prepared. 1 μg of prepared poly (A) + Double-stranded cDNA used in Rapid Amprification of cDNA Ends (RACE) method from RNA was synthesized according to the manual of Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) and dissolved in 10 μl of distilled water. This was further diluted 50 times with TE buffer, and PCR was carried out using as a template. Use EX Taq (Takara) as the DNA polymerase, 2.5 μl of the attached 10x EX Taq buffer, 1 μl of dNTP mixture (2.5 mM each), and 0.5 μl of EX Taq mixed with TaqStart Antibody (Clontech) in an amount of 0.5 μl Marathon cDNA 0.5 μl of adapter primer AP1 or AP2 (10 μM each) supplied with the Amplification Kit, 0.5 μl of gene-specific primers W33-F1, W33-F2, W33-R1, or W33-R2 (10 μM each), and template cDNA Was added to make 25 μl with distilled water to prepare a reaction solution. For the first RACE, add 2.5 μl of template cDNA solution to the reaction solution and heat treatment at 94 ° C for 2 minutes with W33-F1 and AP1 for 3'RACE and W33-R1 and AP1 for 5'RACE. , 98 ° C · 10 seconds, 72 ° C · 2
In the PCR reaction, after a heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 30 seconds was repeated 30 times. The PCR product was subjected to 2% agarose electrophoresis, and a band of about 750 bp was recovered in the same manner as described above, subcloned into the plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen), further introduced into E. coli JM109, and E. coli JM109 / pmA10L-13 was obtained. As a result of analyzing the sequence of the cDNA fragment inserted into the obtained transformant, it was confirmed that this cDNA fragment was a fragment containing the entire coding region of the ligand polypeptide cDNA, and its gene sequence is shown in FIG. . From comparison with the bovine stomach-derived peptide fragment shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 16), this mouse-derived amino acid sequence was considered to be a mouse-type bovine fragment.
Example 12
Obtaining a cDNA fragment encoding a bovine peptide
Following the prescription of RNA PCR Kit (AMV) Ver.2 (Takara Shuzo), bovine hypothalamus poly (A) + Five reaction solutions were prepared for each random 9mer and oligo dT primer using 0.35 μg of RNA fraction as a template. The reverse transcription reaction was carried out at 30 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 30 minutes, and stopped by heating at 99 ° C. for 5 minutes. The reaction solutions were combined into one and subjected to ethanol precipitation, and the synthesized cDNA was recovered from the reaction solution and then dissolved in 40 μl of distilled water. Using 2 μl of this cDNA solution as a template, 0.5 μl each of a 10 μM aqueous solution of a synthetic DNA primer having the following sequence, 5′-GAATCTGAGGTTCTGCCGTGCAGGGC-3 ′ [SEQ ID NO: 17], 5′-TTAGAAAGGCCATGGGGCCCTTATG-3 ′ [SEQ ID NO: 18] and 25 μl of a reaction solution was prepared using 1 μl of dNTP mixture (2.5 mM each), 1.25 units of TaKaRa EX Taq (Takara Shuzo), and the attached reaction buffer. The reaction solution was heated at 95 ° C. for 2 minutes, and then a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 62 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 10 seconds was repeated 40 times, and the mixture was cooled to 4 ° C. after incubation at 72 ° C. for 30 seconds. When the solution after the reaction was analyzed by agarose gel electrophoresis, a cDNA band having a size of about 230 bp was detected by ethidium bromide staining. The DNA contained in this part was recovered from the gel and re-PCR (25 times) was performed using the same primer set. After amplification products were separated by agarose gel electrophoresis, DNA was collected from the gel and subjected to a sequencing reaction using ABI PRISM DyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems) using each primer. When the sequence of this cDNA was analyzed using ABI PRISM 377 DNA Sequencer, a portion encoding the same sequence LVQPRGPRSGPGWQGG as the amino acid sequence determined in Example 9 was found in a part thereof.
Example 13
Acquisition of cDNA encoding rat peptide
From the whole brain of Wistar rats, total RNA was prepared using Isogen (Nippon gene), and then poly (A) + RNA was prepared using an oligo (dT) cellulose column (Pharmacia mRNA purification Kit) according to the manual. CDNA was synthesized from 1 μg of the prepared poly (A) + RNA according to the manual of Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) and dissolved in 10 μl of distilled water. This was further diluted 50-fold with TE buffer as a template, and PCR was performed by the same method as RACE performed in Example 11 (Example of full-length mouse cloning). However, the primer set is the first PCR for 3'RACE, w33-F1 and AP1 for the second PCR, the band of about 800 bp using w33-F2 and AP1 for the second PCR, and the first PCR for 5'RACE. A band of about 600 bp was collected using w33-R1 and AP1, and w33-R2 and AP1 in the second PCR. These recovered fragment sequences were analyzed by the same method as in Example 11 to reveal a full-length sequence of about 1300 bp.
In order to obtain a single DNA fragment containing only the region that is considered to be translated into amino acids among the revealed sequences, two based on the sequence information obtained with 3'RACE and 5'RACE The primers rFA10 (5′-GTAGTTGGGAGGTCGCGGGCAGAGCAC-3 ′) [SEQ ID NO: 19] and rRA10 (5′-TAGAACCCATGTCAGGATCAGCACTTT-3 ′) [SEQ ID NO: 20] were synthesized respectively. The template is rat whole brain poly (A) prepared earlier. + CDNA synthesized from RNA 160g by RNA PCR kit (Takara) by the following method was used. In other words, using the random primer (9 mer) included in the kit at a final concentration of 2.5 μM, 2 Add final concentration 5mM, 10x RNA PCR buffer 4μl, dNTP mixture (each 2.5mM) 16μl,
In addition, two primers rFSal (5′-A) each containing a start codon and a stop codon. GTCGAC GCATGAATCTGAGTTTCTG-3 ′) [SEQ ID NO: 21] and rRNhe (5′-GAGCCCTCCAA GCTAGC TTTAGAAAG-3 ′) [SEQ ID NO: 22] was synthesized. A recognition sequence for restriction enzyme SalI or NheI is introduced in the underlined portion. Using these primers, approximately 20 ng of the plasmid prepared from the transformant containing the rFA10 and rRA10-amplified fragments obtained above was used as a template, and EX Taq was used as a DNA polymerase as before, at 94 ° C. After heat treatment for 2 minutes, PCR was carried out under the conditions of repeating a cycle of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 30
Example 14
Acquisition of cDNA encoding human peptide
Primers AF2 (5′-GTGCCCACTGATGCGTCCCTCGAGATGGG-3 ′) [SEQ ID NO: 23] and AR1 (5′-TTTAGAAGGCATGGGTCCCTTATG-3) are well conserved between the mouse and rat sequences obtained in Examples 11 and 13. ') [SEQ ID NO: 24] was synthesized. Random primer (9 mer, GIBCO BRL) was added as primer from 5 μg of human lung poly (A) + RNA purchased from Clontech, and it was added at 42 ° C with Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (GIBCO BRL). Then, the reaction was performed for 1 hour to synthesize cDNA and dissolved in 30 μl of TE buffer. PCR was performed using 1 μl of this cDNA as a template. The PCR reaction solution was prepared by using EX Taq as a DNA polymerase in the same manner as in Example 11, using AF2 and AR1 primers, 94 ° C for 2 minutes, 98 ° C for 10 seconds, 62 ° C for 20 seconds, 72 ° C. The 5 second cycle was repeated 35 times. The obtained band of about 150 bp was collected and the base sequence was analyzed. As a result, it was revealed that this fragment encodes a fragment of a human type peptide.
Based on this sequence, h3R1 (5'-ACGGCAATGTCCGCCCACCTGGTGC-3 ') [SEQ ID NO: 25] and h3R2 (5'-CCCTGGCAGGGAGGTCGGGAGAAA-3') [SEQ ID NO: 26], 5'RACE h5R1 (5′-GGGCCGCTGGCGGCGGAGATCTC-3 ′) [SEQ ID NO: 27] and h5R2 (5′-GCTGCACCAGGGGGCGGAATTGC-3 ′) [SEQ ID NO: 28] were synthesized. In addition, according to the manual of Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech), human hypothalamic nucleus and lung poly (A) purchased from Clontech + CDNA was synthesized from 1 μg of each RNA, dissolved in 10 μl of distilled water, and diluted 50 times with TE buffer to prepare a template cDNA for use in RACE. Prepare a reaction solution in the same manner as in Example 11 using h3R1 and AP1 for 3′RACE and 5R1 and AP1 for 5′RACE. After heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 10 seconds, 72 A PCR reaction was performed by repeating a cycle of 45 ° C. for 5 times, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds and a 70 ° C. for 45
Furthermore, in order to amplify the entire predicted coding region as a single cDNA, primers hFA10 (5′-TTGGCCTCCGGGCGCCGCACCCTCT-3 ′) and hRA10 (5′-GACATAACCGCAGGGGGTGGCGCTGTG-3 ′) are attached to both ends of the coding region. ) [SEQ ID NO: 30] was synthesized. As the template cDNA, the same subthalamic nucleus cDNA used for RACE was used. The PCR reaction solution uses KlenTaq (Clontech) as a DNA polymerase, 2.5 μl of the attached 10x KlenTaq buffer, 1 μl of dNTP mixture (each 2.5 mM), 0.5 μl of KlenTaq, 0.5 μl of 10 μM primers hFA10 and hRA10, respectively. μl and 1 μl of template cDNA were added to prepare 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes was followed by 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 30 seconds. The PCR product band was collected after 2% agarose electrophoresis, subcloned into the plasmid vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), and further introduced into E. coli JM109 to obtain E. coli JM109 / phSuN-4. As a result of analyzing the sequence of the cDNA fragment inserted into the obtained transformant, it was confirmed that this cDNA fragment contained the entire coding region of the human type peptide. The gene sequence is shown in FIG.
Example 15
Obtaining cDNA encoding bovine peptide
Based on the base sequence of the PCR product obtained in Example 12, several specific primers used for 5 ′ and 3 ′ RACE were prepared. Bovine lung poly (A) + Using 1 μg of RNA, cDNA was synthesized according to the manual of Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech), and the cDNA solution to which the adapter was added in the final step was diluted 50 times with distilled water to prepare. 2.5 μl of this 50 times diluted cDNA solution, 0.5 μl of a specific primer (10 μM) represented by the following SEQ ID NOs: 31 to 34, 0.5 μl of AP1 primer (attached to the enzyme, 10 μM), TaqStart Antibody (Clontech) Prepare 25 μl reaction solution with 0.5 μl of EXTaq DNA polymerase (Takara Shuzo) mixed in an equal volume, 2.5 μl of × 10 EXTaq buffer and 1 μl of dNTPs (both included with the enzyme), heat treatment at 95 ° C. for 2 minutes, and then 98 ° C. 5 cycles of 10 seconds, 72 °
Among the PCR products obtained by combining various primers, the first PCR was performed using FF1 (5′-CCTGCTGCTCCTGCTCTCCCTGAG-3 ′) [SEQ ID NO: 31] and AP1 (5′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ′) [SEQ ID NO: 32]. A second PCR was performed using 1 μl of the reaction mixture and FF2 (5′-GCGGTGTGCGGAGGACCCCTCTG-3 ′) and AP2 (5′-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGCGC-3 ′) [SEQ ID NO: The main product of PCR performed with the combination of primers [34] was recovered from the gel after agarose gel electrophoresis and sequenced. Comparison with the mouse cDNA obtained in Example 11 revealed that the analyzed 3′RACE product was a cDNA fragment having a sequence further downstream from the translation stop codon. Based on the bovine peptide cDNA sequence revealed by 3'RACE, a primer corresponding to the 3 'untranslated region was synthesized.
In addition, primers were synthesized based on the sequence of the 5 ′ untranslated region of cDNA already known in other animal species. Bovine hypothalamus poly (A) + Using cDNA corresponding to 150 ng of RNA as a template, 0.5 μl of each primer (10 μM), 0.5 μl of EXTaq DNA polymerase (Takara Shuzo) mixed with equal amount of TaqStart Antibody (Clontech), × 10 EXTaq buffer 2.5 μl,
Further, the amino acid sequences of mouse, rat, human and bovine peptides revealed in Examples 11, 13, 14 and 15 were compared and shown in FIG.
Example 16
Production of peptide pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe acting on APJ receptor
Commercial Boc-Phe-OCH 2 -PAM resin (0.72 m mole / g resin) 0.5 m mole was put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-Pro, Boc-Met, Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys (Cl-Z), Boc-His (Bom), Boc-Ser (Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg (Tos), Boc-Pro, Boc-Arg ( Tos) and Boc-Gln were sequentially introduced to obtain the desired protected peptide resin. After 0.22 g of this resin and 0.43 g of p-cresol were stirred in 5 ml of anhydrous hydrogen fluoride at 0 ° C. for 60 minutes, the hydrogen fluoride was distilled off under reduced pressure, acetic acid water was added to the residue, and the peptide was extracted into acetic acid water. did. After fully concentrating the extract, distilled water and diethyl ether are added to separate and extract, the aqueous layer is collected and freeze-dried, dissolved in a small amount of 50% aqueous acetic acid, and then filled with the same solvent, Sephadex (registered trademark) G-25 column (2.0 x 80 cm) was applied and developed with the same solvent, and main fractions were collected and lyophilized to obtain about 50 mg of white powder. This was dissolved in 5 ml of 50% aqueous acetic acid and kept in a 60 ° C water bath for 1 hour. After confirming that the main peak of 13.9 minutes had disappeared by HPLC and that all peaks had changed to around 15.6 minutes, Return to room temperature, attach to a reverse phase chromatography column (2.6 x 60 cm) packed with LiChroprep (registered trademark) RP-18, wash with 200 ml of 0.1% TFA water, 300 ml of 0.1% TFA water and 300% of 33% acetonitrile water containing 0.1% TFA Was used, and fractions with an acetonitrile concentration of around 20% were collected and freeze-dried to obtain 28 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 1533.953 (calculated value 1533.811)
HPLC elution time 15.7 minutes
Column conditions
Column Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
Eluent: Solution A-0.1% TFA water, Solution B-0.1% TFA-containing acetonitrile A / B: Linear gradient elution from 95/5 to 45/55 (25 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
[Example 17]
Measurement of ligand activity of peptide pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe for APJ receptor
1 × 10 of the peptide obtained in Example 16 and the peptide represented by the amino acid sequence represented by the 42nd to 77th positions of SEQ ID NO: 40 using sterilized distilled water -3 After dissolving at a concentration of M, 10% of each peptide was prepared using a cytosensor medium containing 0.1% BSA. -8 10 -9 10 -Ten 10 -11 Diluted to M was prepared. APJ receptor cDNA-introduced CHO cells prepared in the same manner as in Example 6 were set on the site sensor workstation, and when the Acidification Rate of each cell was stabilized, a peptide dilution was introduced into one of the site sensor channels. The cells were allowed to act for 7 minutes and 2 seconds by switching the flow path. The change in the Acidification Rate at the third cycle of sample introduction where the cell response was maximized was calculated with the Basal level value set to 100%, and the results are shown in FIG.
Example 18
Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro- Manufacture of Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Commercial Boc-Phe-OCH 2 -PAM resin (0.72 m mole / g resin) 0.5 m mole was put into the reaction soda of the peptide synthesizer ABI 430A and Boc-Pro, Boc-Met, Boc-Gly was synthesized using the Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method. , Boc-Lys (Cl-Z), Boc-His (Bom), Boc-Ser (Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg (Tos), Boc-Gln, Boc-Phe, Boc-Trp (CHO), Boc-Val was introduced based on the amino acid sequence to obtain the desired protected peptide resin. After 0.17 g of this resin was stirred in 1.0 ml of p-cresol and 1.0 ml of 1,4-butanedithiol in 8 ml of anhydrous hydrogen fluoride at 0 ° C. for 60 minutes, the hydrogen fluoride was distilled off under reduced pressure and acetic acid was added to the residue. Water was added and the peptide was extracted into aqueous acetic acid. After fully concentrating the extract, distilled water and diethyl ether are added to separate and extract, the aqueous layer is collected and lyophilized, dissolved in a small amount of 50% acetic acid, and then filled with the same solvent. TM G-25 column (2.0 x 80 cm) was applied and developed with the same solvent. Main fractions were collected and lyophilized to obtain about 70 mg of white powder. This is LiChroprep TM It is attached to a reverse phase chromatographic column (2.6 x 60 cm) packed with RP-18, washed with 200 ml of 0.1% TFA water, linear gradient using 300 ml of 10% acetonitrile water containing 0.1% TFA and 300 ml of 30% acetonitrile water containing 0.1% TFA. Elution was performed and the main fractions were collected and lyophilized to obtain 33 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4064.6 (calculated value 4064.2)
HPLC elution time 16.0 minutes
Column conditions
Column Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
Eluent: Solution A-0.1% TFA water, Solution B-0.1% TFA-containing acetonitrile A / B: Linear gradient elution from 95/5 to 45/55 (25 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
Example 19
Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg- Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
After further introducing Boc-Leu into the resin obtained in Example 18, hydrogen fluoride treatment and chromatographic purification were carried out in the same manner as in Example 1. The main fractions were collected and freeze-dried to obtain 23 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4177.7 (calculated value 4177.3)
HPLC elution time 16.2 minutes
Column conditions
Column Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
Eluent: A solution-0.1% TFA water, B solution-0.1% TFA-containing acetonitrile A / B: 95/5 ~ 4
5/55 linear gradient elution (25 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
Example 20
Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg- Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
0.25 mmol of Fmoc-Phe-O-Clt resin (0.32 mmol / g) obtained by introducing Fmoc-Phe-OH into commercially available 2-chlorotrityl resin (Clt resin, 1.3 mmol / g) is used as a reaction solution for the peptide synthesizer ABI 433A. The solid phase synthesis was performed using the Fmoc / DCC / HOBt method. The side chain protecting group of Fmoc amino acid was Pbf group for Arg, tBu group for Ser, Boc group for Trp and Lys, and Trt group for His, Asn, and Gln. Other amino acids were used without side chain protection, and the peptide chain was introduced from Phe in the sequence shown above to Leu in the N-terminal direction in order to obtain the desired protected peptide resin.
50 mg (4.45 mmol) of this resin was added to TFA, thioanisole, m-cresol, H 2 After stirring in 1 ml of a mixture of O, ethandithiol (82.5: 5: 5: 5: 2.5) at room temperature for 2 hours, add ether to the reaction solution, precipitate a white powder, centrifuge and remove the supernatant. Repeated 3 times. The residue was extracted with water and lyophilized to obtain 23.1 mg of white powder. The obtained crude peptide was subjected to preparative HPLC using a TSK GEL ODS 120T column (20 × 300 mm). A / B: 0.1% TFA-water, B: 0.1% TFA-containing acetonitrile A / B: 85/15 to Linear concentration gradient elution (75 minutes) to 75/25 was performed, and fractions containing the target product were collected and lyophilized to obtain 10.2 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4194.8 (calculated value 4194.3)
HPLC elution time 16.5 minutes
Elution conditions
Column YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
Eluent A: 0.1% TFA-water, B: 0.1% TFA-containing acetonitrile, A / B: 100 / 0-50
To / 50 Linear type gradient elution (25 minutes)
Flow rate 1.0ml / min
Example 21
His-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln- Production of Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Fmoc-His (Trt) was further condensed to the resin obtained in Example 20, and then treated and purified in the same manner as in Example 20 to obtain 10 mg of a white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4331.2 (calculated value 4331.4)
HPLC elution time 16.3 minutes
Elution conditions
Column YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
Eluent A: 0.1% TFA-water, B: 0.1% TFA-containing acetonitrile, A / B: 100 / 0-50
To / 50 Linear type gradient elution (25 minutes)
Flow rate 1.0ml / min
[Example 22]
Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg- Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Commercial Boc-Phe-OCH 2 Boc-Pro, Boc-Met, Boc-Gly, Boc-Lys (Cl-Z), Boc-His (Bom), Boc-Ser in the same manner as in addition example 1 using -PAM resin (0.72 m mole / g resin) (Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg (Tos), Boc-Gln, Boc-Phe, Boc-Trp (CHO), Boc-Ala, Boc-Thr (Bzl), Boc-Val based on amino acid sequence The desired protected peptide resin was obtained. This resin was treated with hydrogen fluoride in the same manner as in Example 1, and the extracted peptide was purified in the same manner to obtain 25 mg of a white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4199.0 (calculated value 4199.3)
Example 23
Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln- Production of Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Boc-Tyr (Br-Z) was further condensed to the resin of Example 22, and then treated and purified in the same manner to obtain 12 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4362.7 (calculated value 4362.4)
Example 24
Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Commercial Boc-Phe-OCH 2 -PAM resin (0.72 m mole / g resin), Boc-Pro, Boc-Met, Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys (Cl-Z), Boc-His (Bom), Boc-Ser ( Bzl), Boc-Leu, Boc-Arg (Tos), and boc-Pro were subjected to sequential condensation, and the resin was treated with hydrogen fluoride in the presence of p-cresol and purified in the same manner as in Example 18 to obtain 54 mg of a white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 1266.4 (calculated value 1266.7)
Example 25
Production of Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
After condensing Boc-Arg (Tos) to the resin of Example 24, the same treatment and purification were performed to obtain 30 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 1422.6 (calculated value 1422.8)
Example 26
Production of Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
After condensing Boc-Gln to the resin of Example 25, the same treatment and purification were carried out, followed by lyophilization from dilute hydrochloric acid water to obtain 21 mg of a white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 1551.1 (calculated value 1550.8)
Example 27
Production of Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Boc-Arg (Tos) was condensed twice with the resin of Example 26, then treated and purified in the same manner to obtain 17 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 1862.8 (calculated value 1863.0)
Example 28
Cys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
After condensing Boc-Phe, Boc-Cys (MeBzl) to the resin of Example 27, the same treatment and purification were carried out to obtain 30 mg of a white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 2113.2 (calculated value 2113.1)
HPLC elution time 16.0 minutes
Elution conditions
Column YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
Eluent A: 0.1% TFA-water, B: 0.1% TFA-containing acetonitrile, A / B: 100/0 to 50/50 Linear gradient elution (25 minutes)
Flow rate 1.0ml / min
Example 29
Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Boc-Phe, Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Arg (Tos), and Boc-Aarg (Tos) were condensed in this order with the resin of Example 27, and the same treatment and purification were carried out to obtain 13 mg of a white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 2450.4 (calculated value 2450.4)
HPLC elution time 15.7 minutes
Elution conditions
Column YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
Eluent A: 0.1% TFA-water, B: 0.1% TFA-containing acetonitrile, A / B: 100/0 to 50/50 Linear gradient elution (25 minutes)
Flow rate 1.0ml / min
Example 30
pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro
Commercial Boc-Pro-OCH 2 -PAM resin (0.63 m mole / g resin), Boc-Met, Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys (Cl-Z), Boc-His (Bom), Boc-Ser (Bzl), Boc -Leu, Boc-Arg (Tos), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos) and Z-Glu were subjected to sequential condensation, and the resin was treated with hydrogen fluoride in the presence of p-cresol and purified in the same manner as in Example 18. 56 mg of white powder was obtained.
By mass spectrometry (M + H) + 1386.4 (calculated value 1386.7)
HPLC elution time 12.7 minutes
Column conditions
Column Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
Eluent: Solution A-0.1% TFA water, Solution B-0.1% TFA-containing acetonitrile A / B: Linear gradient elution from 95/5 to 45/55 (25 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
Example 31
Production of pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met
Commercial Boc-Met-OCH 2 -PAM resin (0.66 m mole / g resin), Boc-Pro, Boc-Gly, Boc-Lys (Cl-Z), Boc-His (Bom), Boc-Ser (Bzl), Boc-Leu, Boc -Arg (Tos), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos) and Z-Glu were subjected to sequential condensation, and the resin was treated with hydrogen fluoride in the presence of p-cresol, and purified in the same manner as in Example 18 to obtain 29 mg of white powder. Obtained.
By mass spectrometry (M + H) + 1289.9 (calculated value 1289.7)
HPLC elution time 11.8 minutes
Column conditions
Column Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
Eluent: Solution A-0.1% TFA water, Solution B-0.1% TFA-containing acetonitrile A / B: Linear gradient elution from 95/5 to 45/55 (25 minutes)
Flow rate: 1.0 ml / min
Example 32
Met-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln- Production of Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
Fmoc-Met was further condensed with the resin of Example 20, and then treated and purified in the same manner to obtain 5 mg of white powder.
By mass spectrometry (M + H) + 4324.9 (calculated value 4325.3)
HPLC elution time 16.8 minutes
Elution conditions
Column YMC A-301-3 (4.6 x 100mm)
Eluent A: 0.1% TFA-water, B: 0.1% TFA-containing acetonitrile, A / B: 100/0 to 50/50 Linear gradient elution (25 minutes)
Flow rate 1.0ml / min
Example 33
Measurement of inhibitory activity of forskolin-stimulated cAMP production
3 x 10 CHO-
Example 34
Preparation of human apelin-36 (Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe)
CTAGAAAGGA GATATCATAT GCTGGTTCAA CCGCGTGGTT CT (# 1: Greiner Japan), CGTAATGGTC CGGGTCCATG GCAAGGTGGT CGTCGTAAAT TTCGTC (# 2: Kiko Tech)
GTCAACGTCC GCGTCTGTCT CATAAAGGTC CGATGCCGTT TTGCC (# 3: Amersham Pharmacia Biotech) GACCATTACG AGAACCACGC GGTTGAACCA GCATATGATA TCTCCTTT (# 4: Amersham Pharmacia Biotech) GCAGTTGAC GAGG ACG The structural gene of apelin-36 was prepared using ACCTTTATGA GACAGACGC (# 6: KIKO TECH).
a) Phosphorylation of DNA oligomer
100 µL of phosphorylation reaction solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl] 2 , 1 mM spermidine, 10 mM dithiothreitol, 0.1 mg / mL bovine serum albumin, 1 mM ATP, 10 units T4 polynucleotide kinase (Nippon Gene)] at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end . After the phenol treatment, the aqueous layer was recovered, twice as much ethanol was added, cooled to −70 ° C., and then DNA was precipitated by centrifugation.
b) Ligation of DNA fragments
The phosphorylated DNA fragment obtained in a) above and 1 μg each of # 1 and # 2 were combined to make 120 μL. This mixed solution was kept at 80 ° C. for 10 minutes, and then gradually cooled to room temperature for annealing. Ligation reaction was performed using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo). After adding 30 μL of the II solution to 30 μL of the annealing solution and mixing well, 60 μL of the I solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour for ligation. After the phenol treatment, the aqueous layer was recovered, twice as much ethanol was added, cooled to −70 ° C., and then DNA was precipitated by centrifugation.
c) 5 'end phosphorylation
Dissolve the precipitate in 10 μL of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) and add 100 μL of phosphorylation reaction solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 , 1 mM spermidine, 10 mM dithiothreitol, 0.1 mg / mL bovine serum albumin, 1 mM ATP, 10 units T4 polynucleotide kinase (Nippon Gene)] at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end . After the phenol treatment, the aqueous layer was collected, twice the amount of ethanol was added, and cooled to -70 ° C. Then, the DNA was precipitated by centrifugation and dissolved in 20 µL of TE buffer.
Example 35
Preparation of human apelin-36 expression plasmid
pTB960-2 (EP-A-499990: Koyama et al., Journal of Biotechnology, 32, 273) was digested with XbaI and AvaI and subjected to 1% agarose electrophoresis to obtain a DNA fragment of about 4.4 Kbp QIAquick Gel Extraction was performed using Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 μL of TE buffer. The pTB960-2 XbaI and AvaI fragments and the human apelin-36 structural gene prepared above were subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). That is, 1 μL of pTB960-2 XbaI / AvaI fragment solution and 4 μL of human apelin-36 structural gene solution were mixed, 5 μL of solution I was added, and reacted at 16 ° C. for 30 minutes for ligation. E. coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed with 10 μL of the ligation solution, plated on LB agar medium containing 10 μg / mL tetracycline, cultured at 37 ° C. for 1 day, and the resulting tetracycline resistant colonies were identified. I chose. This transformant was cultured overnight in LB medium, and plasmid pTB960-13 was prepared using QIAprep8 Miniprep Kit (Qiagen). The base sequence of the human apelin-36 structural gene portion was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer. Plasmid pTB960-13 was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain (Novagen), seeded on LB agar medium containing 10 μg / mL tetracycline, cultured at 37 ° C. for 1 day, and human apelin-36-CS23 fusion protein The expression strain BL21 (DE3) / pTB960-13 was obtained. This transformed Escherichia coli BL21 (DE3) / pTB960-13 was deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry on December 2, 1998, under the accession number FERM BP-6590. On November 11, 1998, it was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO16220.
Example 36
The transformed cells obtained in Example 35 were 2 liters using 1 L of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) containing 5.0 mg / L tetracycline. The culture was shaken in a flask at 37 ° C. for 8 hours. The obtained culture broth was added to 19 liters of main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.05 Transplanted into a 50-liter fermentor containing 1% magnesium sulfate, 0.02% antifoam, 0.00025% ferrous sulfate, 0.00025% thiamine hydrochloride, 1.5% glucose, 1.5% casamino acid) Then, aeration stirring culture was started at 30 ° C. When the turbidity of the culture solution reached about 500 kret units, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 12 mg / L, and the culture was further continued for 4 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain about 660 g of wet cells and stored frozen at -80 ° C.
Example 37
Acquisition of human apelin-36
To 550 g of the cells obtained in Example 35, 1500 ml of 10 mM EDTA + 1 mM (p-amidinophenyl) methanesulfonyl fluoride hydrochloride (pH 6.0) solution was added, followed by sonication (BRANSON SONIFIER MODEL 450), followed by centrifugation (10000 rpm, 60 min). The supernatant was pooled, and the same operation was performed again for precipitation. The pooled supernatant was adjusted to pH 6.0, passed through an AF-Heparin Toyopearl 650M column (30 mm ID x 500 mm L, Tosoh) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), adsorbed and washed. And elution with a step gradient of 0-100% B (B = 50 mM phosphate buffer + 2M NaCl, pH 6.0) to obtain 530 ml of human apelin-36-CS23 fusion protein fraction.
The eluate was concentrated with a Pericon minicassette (Millipore) while adding 0.1 M acetic acid to obtain a 0.1 M acetic acid solution of human apelin-36-CS23 fusion protein. After urea was added to this solution to a final concentration of 6M, 35 mg of 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium salt (DMAP-CN) was added and reacted at room temperature for 15 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (46 mm ID × 600 mm L, Pharmacia) equilibrated with 10% acetic acid, and 10% acetic acid used for equilibration was developed at a flow rate of 6 ml / min. -Cyanated human apelin-36-CS23 fusion protein fraction was obtained. This eluate was concentrated and desalted with a pericon minicassette (Millipore) to obtain a desalted solution of human apelin-36-CS23 fusion protein. After adding urea to the desalted solution to a final concentration of 6M, 1N sodium hydroxide was further added to a concentration of 0.06N, and the reaction was carried out at 0 ° C. for 15 minutes. After completion of the reaction, the pH was adjusted to 6.0 with acetic acid to obtain human apelin-36. This reaction solution was passed through SP-5PW (21.5 mm ID × 150 mm L, Tosoh) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 3 M urea, adsorbed and washed, and then 0-40% B ( Elution was performed with a step gradient of B = 50 mM phosphate buffer + 1 M NaCl + 3 M urea, pH 6.5) to obtain human apelin-36. This human apelin-36 fraction was further passed through C4P-50 (21.5 mm ID × 300 mm L, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), adsorbed and washed, and then 15-30% Elution was performed with a step gradient of B (B: 80% acetonitrile / 0.1% TFA), and human apelin-36 fractions were pooled and then lyophilized to obtain human apelin-36 lyophilized powder.
a) Amino acid composition analysis
The amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer).
As a result, it was consistent with the amino acid composition predicted from the DNA base sequence of human apelin-36 with methionine added to the N-terminus (Table 1).
(Table 1)
Amino acid composition analysis
The N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems model 477A). As a result, it was in agreement with the N-terminal amino acid sequence predicted from the DNA base sequence except that methionine was added to the N-terminus of the obtained human apelin-36 (Table 2).
(Table 2)
N-terminal amino acid sequence
The C-terminal amino acid was analyzed using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer) (Table 3).
(Table 3)
C-terminal amino acid analysis
Example 38
(Bioactivity measurement)
Using Met-human apelin-36 obtained in Example 37, the activity was measured by the method described in Example 6 (site sensor), and it was confirmed that the activity was equivalent to that of the synthesized product.
Example 39
Removal of N-terminal methionine
After 4 mg of Met-human apelin-36 obtained in Example 37 was dissolved in 0.8 ml of 3M urea solution, a mixed solution of 0.05 ml of 80 mM copper sulfate, 0.046 g of glyoxylic acid and 0.1 ml of pyridine was added at 25 ° C. Reacted for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (10 mm ID × 250 mm L) equilibrated with 2.5 M urea + 10 mM phosphate buffer (pH 5.5), and the solution used for equilibration. Was developed at a flow rate of 0.5 ml / min, and the diketone fractions of Met-human apelin-36 were pooled. Subsequently, after adding an equal amount of 4M acetic acid, 4M sodium acetate, 3M urea solution to this fraction, o-phenylenediamine was added to a concentration of 40 mM, deaeration and nitrogen gas sealing were carried out at 25 ° C. For 5 days. After completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (25 mm ID × 600 mm L) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the buffer used for equilibration was flowed at a flow rate of 4 ml / min. The human apelin-36 fraction without methionine added at the N-terminal was pooled. CM-5PW (7.5 mmID × 75 mmL, Tosoh Corp.) prepared by adjusting the pooled human apelin-36 fraction to pH 6.0 and equilibrated with 50 mM phosphate buffer + 0.1 M NaCl + 2.5 M urea (pH 5.0) And then eluted with a step gradient of 0-100% B (B = 50 mM borate buffer + 0.1 M NaCl + 2.5 M urea, pH 9.0) for 40 minutes at a flow rate of 0.8 ml / min. 36 fractions were pooled. Further, after adsorbing to C4P-50 (10 mm ID × 250 mm L, Showa Denko KK) equilibrated with human apelin-36 with 0.1% TFA, 15-30% B (B = 80% acetonitrile / 0.1% Elute at a flow rate of 2 ml / min with a step gradient of TFA) for 40 minutes. The human apelin-36 fractions were pooled and then lyophilized to obtain human apelin-36L.
a) Amino acid composition analysis
The amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer).
The result was consistent with the amino acid composition predicted from the DNA base sequence of hA10L (Table 4).
(Table 4)
Amino acid composition analysis
The N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems model 477A). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence predicted from the obtained DNA base sequence of human apelin-36 (Table 5).
(Table 5)
N-terminal amino acid sequence
The C-terminal amino acid was analyzed using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer) (Table 6).
(Table 6)
C-terminal amino acid analysis
Bioactivity measurement
Using human apelin-36 obtained in Example 39, the activity was measured by the method described in Example 6 (site sensor), and it was confirmed that the activity was equivalent to that of the synthetic product.
[0071]
[Sequence Listing]
[SEQ ID NO: 1]
[SEQ ID NO: 3]
[SEQ ID NO: 4]
[SEQ ID NO: 5]
[SEQ ID NO: 6]
[SEQ ID NO: 7]
[SEQ ID NO: 8]
【The invention's effect】
Since the polypeptide of the present invention is involved in CNS function regulating action, circulatory function regulating action, cardiac function regulating action, immune function regulating action, digestive organ function regulating action, metabolic function regulating action or genital function regulating action, etc. Dementia and infectious diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.) : Dementia, endocrine, metabolic, and toxic diseases (eg, hypothyroidism, vitamin B12 deficiency, alcoholism, various drugs, metals, and organics) caused by Creutzfeldt-late virus infection such as Jacob disease) Dementia caused by compound poisoning, etc., dementia caused by neoplastic disease (eg brain tumor, etc.), traumatic disease ( : Dementia such as dementia caused by chronic subdural hematoma), depression, hyperactive child (microencephalopathy) syndrome, consciousness disorder, anxiety disorder, schizophrenia, phobia, growth hormone secretion disorder (eg, giantism) Terminal hypertrophy etc.), bulimia, bulimia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, hyperprolactinemia, hypoglycemia, hypopituitarism, pituitary dwarfism , Diabetes (eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), cancer (eg, breast cancer, lymphocytic leukemia, lung cancer, bladder cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc.), Pancreatitis, kidney disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), Turner syndrome, neurosis, rheumatoid arthritis, spinal cord injury, transient ischemic attack, amyotrophic lateral sclerosis, acute myocardial infarction, spinocerebellar degeneration Disease, fracture, wound, atopic dermatitis, osteoporosis, asthma, epilepsy N, infertility, arteriosclerosis, emphysema, can be used as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as pulmonary edema or lactation failure. Further, it can be used as a hypnotic sedative, a post-surgical nutritional condition improving agent, a pressor, a hypotensive agent, and the like.
In addition, it can be used as a therapeutic / preventive agent for HIV infection, AIDS (AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)) and the like.
[0079]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the base sequence of G protein-coupled receptor protein (APJ) cDNA and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 2 shows the analysis result of tissue distribution by Northern blot of G protein-coupled receptor protein (APJ) mRNA.
FIG. 3 shows the expression level of full-length receptor protein in the CHO-A10 cell line at the transcription level.
M represents a DNA size marker, the left side is λ phage DNA digested with StyI, and the right side is φχ174 DNA digested with HincII.
FIG. 4 shows detection by a cytosensor of the activity specifically stimulating CHO-A10 cells contained in porcine brain and bovine stomach extracts.
B1 to B4 represent measurement results of samples prepared from pig brain, and S1 to S4 represent measurement results of samples prepared from bovine stomach. The change with time of the extracellular pH change rate (Acidification Rate) of each measurement cycle of CHO-A10 cells (white circles) and control cells (black circles) is shown as a change rate with respect to the basal level.
Samples were exposed to cells during cycles 4-7.
FIG. 5 Detection of activity specifically stimulating CHO-A10 cells contained in porcine small intestine extracts by a cytosensor (continuation of FIG. 6).
G1 to G8 represent measurement results of samples prepared from the porcine small intestine. The change with time of the extracellular pH change rate (Acidification Rate) of each measurement cycle of CHO-A10 cells (white circles) and control cells (black circles) is shown as a change rate with respect to the basal level.
Samples were exposed to cells during cycles 4-7.
FIG. 6 Detection of activity specifically stimulating CHO-A10 cells contained in bovine hypothalamic extract with a cytosensor (continuation of FIG. 7). F1 to F5 are
Samples were exposed to CHO-A10 cells (open circles) and control cells (filled circles) during
The vertical axis of the table indicates the Acidification Rate (% of Basal level), and the horizontal axis indicates the cycle.
FIG. 7 Detection of activity specifically stimulating CHO-A10 cells contained in bovine hypothalamic extract with a cytosensor (continuation of FIG. 6). F1 to F5 are
Samples were exposed to CHO-A10 cells (open circles) and control cells (filled circles) during
The vertical axis of the table indicates the Acidification Rate (% of Basal level), and the horizontal axis indicates the cycle.
FIG. 8: Selection of APJ receptor high-expressing cells using the strength of cell stimulating activity as an index.
After the same sample was exposed to 1 to 8 cells cloned from CHO-A10 cells, the change amount (%) of the change rate of extracellular PH in the fourth cycle with respect to the basal level is displayed.
The vertical axis of the table indicates Change of Acidification Rate (% of Basal level), and the vertical axis indicates the number of cells cloned from CHO-A10 cells.
FIG. 9 shows the separation pattern in the RESOURCE RPC of the crude peptide fraction from bovine stomach and the detection of activity specific for CHO-A10.
FIG. 10 shows the separation pattern of P-2 activity Vydac diphenyl 219TP5415 in RESOURCE RPC and the detection of activity specific for CHO-A10.
FIG. 11 shows the separation pattern of Sephasil C8 SC 2.1 / 10 with P-2 activity in RESOURCE RPC and detection of activity specific for CHO-A10.
FIG. 12 shows the separation pattern of μRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 in the active fraction of Vydac diphenyl 219TP5415 and the detection of activity specific for CHO-A10.
FIG. 13 shows the separation pattern of active fractions in Sephasil C8 SC 2.1 / 10 in μRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 and the detection of activity specific for CHO-A10.
FIG. 14 shows the homology between a mouse-derived EST (Mouse EST) and a bovine stomach-derived peptide fragment represented by SEQ ID NO: 1 (Bovine).
FIG. 15 shows the nucleotide sequence of mouse-type ligand polypeptide cDNA and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 16 shows homology between a mouse-type ligand polypeptide (mouse) and a bovine stomach-derived peptide fragment represented by SEQ ID NO: 1 (Bovine parti).
FIG. 17 shows the nucleotide sequence of rat type ligand polypeptide cDNA and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 18 shows the base sequence of cDNA of human ligand polypeptide and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 19 shows the base sequence of cDNA of bovine ligand polypeptide and the amino acid sequence encoded thereby.
FIG. 20 shows a comparison of amino acid sequences encoded by base sequences of cDNAs of bovine, mouse, rat and human type ligand polypeptides.
FIG. 21 is a view showing a change in the Acidification Rate of the peptide obtained in Example 16 and the peptide represented by the 42nd to 77th amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.
In the figure, ◯-○ represents the change in the Acidification Rate of the peptide obtained in Example 16, and ●-● represents the change in the Acidification Rate of the peptide represented by the 42nd to 77th amino acid sequence of SEQ ID NO: 42. Indicates the amount.
22 shows the measurement results of the forskolin-stimulated cAMP production inhibitory activity carried out in Example 33. FIG.
In the figure, ◯-○ is a peptide represented by the 42nd to 77th amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and ●-● is a peptide represented by the 65th to 77th amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Indicates.
Claims (12)
（ｃ）配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（ｅ）配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、または
（ｆ）配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したアミノ酸配列を含有するペプチド。 A polypeptide having the ability to bind to a receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, which is any of the following polypeptides, amides or esters thereof, or salts thereof :
( C) a peptide containing the amino acid sequence from the 42nd to the 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 ,
(E) SEQ ID NO: Peptide containing the first 61 th from the 77 amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 40 or (f) SEQ ID NO: 77 from the 65 amino acid sequence represented by 40 peptide which th peptide or its N-terminus comprising the amino acid sequence of amino acids (Gln) contains an amino acid sequence pyroglutamic acid.
（ｃ）配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（ｅ）配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、または
（ｆ）配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチド。 DNA comprising a DNA comprising a base sequence encoding a polypeptide having the ability to bind to a receptor protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein the polypeptide is any of the following :
( C) a peptide containing the amino acid sequence from the 42nd to the 77th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 ,
(E) SEQ ID NO: Peptide containing the first 61 th from the 77 amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 40 or (f) SEQ ID NO: 77 from the 65 amino acid sequence represented by 40 peptides containing the amino acid sequence.
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