JP4312953B2

JP4312953B2 - 生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するための均質方法およびその方法の実施に使用されるキット

Info

Publication number: JP4312953B2
Application number: JP2000513143A
Authority: JP
Inventors: ジェラールマチ; エリックトゥリンク; マルコプレーダ
Original assignee: セアエスバイオアンテルナシィオナル
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: JP2001517796A; EP1018009A1; FR2768817B1; DE69813850T2; ATE238551T1; FR2768817A1; US6753156B1; ES2198744T3; DE69813850D1; WO1999015896A1; EP1018009B1

Description

【０００１】
本発明は、チロシン，セリンおよび／またはトレオニンを含んだ基質に対する生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するための新規な均質方法、および、斯かる方法の実施に使用されるキットに関する。
【０００２】
ペプチドあるいは蛋白質の如くの生体分子についてのキナーゼによるリン酸化は、細胞の代謝を調節するための主要な生物学的メカニズムである。リン酸化活性を有する酵素の大多数は、極めて高いＫｍ（ミカエリス定数）（一般的には、１０^-3〜１０^-5Ｍ）と極めて低い変換収率（基質における活性部位の５〜０．００１％がリン酸化される）とを有する。
【０００３】
このようなもとにあっては、基質のリン酸化は、その活性部位が反応中を通じて極めて過剰と言える程度に存在する場合にのみ、検出され得ることになる。斯かる活性部位が極めて過剰と言える程度に存在する状態は、高濃度の基質を用いること（僅かな活性部位しか有さない基質の場合）、あるいは、多数のリン酸化部位を有する基質を選ぶことによって得ることができる。
【０００４】
今日まで、リン酸化のメカニズムについては、一般に、放射性物質を用いた不均一検出方法あるいは酵素を用いた不均一検出方法による研究がなされてきている。これらの方法によるもとでは、固相に固定された基質のリン酸化は、³²Ｐの酵素基質との結合状態を測定することにより、あるいは、リン酸化部位に向けられた標識抗体（同位体トレーサー，酵素トレーサーもしくは蛍光トレーサー）を用いることによって検出される。
【０００５】
こうした方法による分析によれば、大量の基質を固相に固定することができ、それゆえ、少数の活性部位しか有していない基質についても、そのリン酸化を検出することができる。しかしながら、その反面、同位体マーカーが頻繁に使用されること，分析工程間において過剰な試薬を除去するための分離工程が必要とされること，気質捕捉工程を調節する必要があること（例えば、アビジンを伴ったプレートをビオチン基質とともに使用する場合），というような無視できない不都合がある。
【０００６】
均質方法による場合には、検出されるべきリン酸化された基質を十分な量のものとするため、基質の濃縮度を高めることがしばしば必要とされる。そして、そのためには大量の試薬が必要とされるので、全ての基質を捕捉することが困難とされ、試薬が蛍光性のものである場合には、高い特定のバックグラウンドノイズが発生することになるという不都合が生じる。
【０００７】
現在にあっては、基質のリン酸化を複数の基質が共有結合している発光担体分子を用いる均質方法によって検出できることが分かっている。酵素を用いたリン酸化反応の後においては、発光分子により標識化したリン酸化された基質のための特異受容体からのエネルギー転移により生じる、発光担体分子からの発光シグナルを測定することにより、リン酸化された基質の量を知ることができる。
【０００８】
この方法は、生体分子、例えば、天然の、もしくは、病理学的過程における、あるいは、核酸もしくは蛋白質を合成する過程等の合成過程におけるペプチド，ポリペプチド，蛋白質あるいはヌクレオチドのリン酸化の測定にあたって格別に有効である。
【０００９】
本発明の第１の態様にあっては、本発明は、チロシンおよび／またはセリンおよび／またはトレオニンを含んだ基質に対する生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するための均質方法を提供し、この方法は、チロシンおよび／またはセリンおよび／またはトレオニンを含んだ基質に対する生物学的物質が、非放射の標識化がなされたリン酸塩源およびリン酸化されたペプチドあるいはポリペプチドのための特異受容体の存在下において、担体分子と共有結合したチロシン，セリンおよび／またはトレオニンを含んだ複数の同種もしくは異種のペプチドあるいはポリペプチドと接触せしめられたもとで、発光分子または少なくとも一つの発光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した非発光分子から成る上述の担体分子と、少なくとも一つの発光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した上述の特異受容体と、の間の相互作用の結果生じる発光シグナルが測定されることにより、生物学的物質のリン酸化活性の検出および／または測定が行われることを特徴とする。
【００１０】
“発光マーカー”とは、担体分子と特異受容体との間の相互作用の検出のために用いられる発光分子を意味する。また、“発光活性調節因子”とは、発光分子の近傍に位置したとき、発光分子の発光シグナル特性を変化させる分子を意味する。
【００１１】
担体分子として用いられる分子および特異受容体として用いられる分子によっては、さらには、担体分子として用いられる分子と特異受容体として用いられる分子との間の相互作用によっては、一つの発光化合物が、発光マーカーとして、あるいは、発光活性調節因子として作用することが可能とされる。
【００１２】
斯かる発光活性調節因子は、例えば、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０２３２３４８号に記載されている如くの、発光分子、例えば、発光ドナー分子もしくは発光アクセプタ分子、もしくは、非発光分子、例えば、高原子番号を有した原子から成る分子もしくは高原子番号を有した原子を含んだ分子、あるいは、スピンマーカーとされ得る。
【００１３】
担体分子は、数十キロダルトン程度の高分子量を有した発光分子、例えば、アロフィコシアニンもしくはＣフィコシアニンの如くの発光分子；非発光分子、例えば、少なくとも一つの発光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合したチログロブリン；複数のペプチドもしくはポリペプチド基質を固定するに十分な表面積を有した発光分散固体；少なくとも一つの発光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した、複数のペプチドもしくはポリペプチド基質を固定するに十分な表面積を有した発光分散固体のうちのいずれかとされ得る。従って、担体分子は、発光アクセプタ分子、あるいは、少なくとも一つの発光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した非発光分子とされ得ることになる。
【００１４】
以下の記述においては、“分子”および“化合物”という用語は、発光マーカー、あるいは、担体分子もしくは特異受容体と結合した発光活性調節因子を言うものとして区別なく使用される。
【００１５】
本発明に係る方法の優れた特徴の一つによれば、担体分子が、蛍光アクセプタ分子，蛍光ドナー分子、あるいは、少なくとも一つの蛍光アクセプタ化合物もしくは少なくとも一つの蛍光ドナー化合物と結合した非蛍光分子とされる。都合が良いことに、リン酸化されたペプチドもしくはポリペプチドのための特異受容体の夫々と結合した発光マーカーもしくは発光活性調節因子は、蛍光ドナー分子もしくは蛍光アクプタ分子であってよい。
【００１６】
本発明に係る方法の好ましい例の一つにあっては、担体分子と、リン酸化されたペプチドもしくはポリペプチドのための特異受容体と結合した発光マーカーもしくは発光活性調節因子と、の間の非放射エネルギー転移の結果生じる発光シグナルが測定されることにより、生物学的物質のリン酸化活性の検出および／または測定が行われる。
【００１７】
従って、所望のリン酸化活性の検出および／または測定を可能とする発光シグナルは、特異受容体と結合した発光マーカーもしくは発光活性調節因子から担体分子への非放射エネルギー転移、あるいは、逆に、担体分子の発光マーカーもしくは発光活性調節因子から特異受容体と結合した発光マーカーへの非放射エネルギー転移によってもたらされ得ることになる。
【００１８】
それゆえ、“担体分子と、リン酸化されたペプチドもしくはポリペプチドのための特異受容体と結合した発光マーカーもしくは発光活性調節因子と、の間の非放射エネルギー転移”とは、上述の２種類のメカニズムを意味している。
【００１９】
非放射エネルギー転移は、その原理については Clin. Chem., 1993, 39, 1953〜1959 に掲載された G. Mathis・他による論文に記載されているところであるが、以下の条件が満たされた場合に生じる。
条件１：アクセプタ化合物が、ドナーの放出スペクトラムと少なくとも部分に重複し、その重複領域において高いモル吸収度を示す吸収スペクトラムと、ドナーによる弱い固有の放出がみられる波長領域の全体に亙る放出スペクトラムとを有したものであること。
条件２：アクセプタとドナーとが、互いに近接した位置にあること。
【００２０】
発光担体分子と共有結合したペプチドもしくはポリペプチドの量は、１発光担体分子あたり約２から１０００とすることができる。
【００２１】
リン酸化されたペプチドもしくはポリペプチドのための特異受容体は、例えば、モノクロナール抗体およびポリクロナール抗体のうちから選ぶことができる。
【００２２】
本発明に係る方法の好ましい例の一つにあっては、リン酸化されたペプチドもしくはポリペプチドのための特異受容体あるいは担体分子に発光マーカーもしくは発光活性調節因子として結合した発光分子は、担体分子と特異受容体との間の相互作用のメカニズムに応じて、キレート，クリプテートもしくは希土類イオンの巨大環式化合物とされる。
【００２３】
以下の記述においては、“キレート”および“クリプテート”という用語、さらには、使用可能な巨大環および多環についての命名法は、J. M. Lehn によりStruct. Bonding (Berlin), 16, 1, 1973 および Acc. Chem. Res., 11, 49 (1979) において定義されたところに従う。
【００２４】
前述の蛍光ドナー化合物は、好ましくは、テルビウムクリプテート，ユーロピウムクリプテート，サマリウムクリプテート，ネオジウムクリプテートおよびジスプロシウムクリプテートのうちから選択された希土類クリプテートとされる。
【００２５】
本発明に係る方法の好ましい例の一つにあっては、上述の希土類クリプテートは、下記の式：化２によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも一つの希土類塩とされる。
【００２６】
【化２】

【００２７】
式：化２中、Ｚは３価もしくは４価の原子を示し、Ｒはなにも無いこと，水素，水酸基，アミノ基もしくは炭化水素基を示し、互いに独立した２価の基である丸で囲まれたＡ，ＢおよびＣが、一つもしくは複数のヘテロ原子を含有してヘテロ巨大環によって断続された炭化水素環であり、また、２価の基である丸で囲まれたＡ，ＢおよびＣのうちの少なくとも一つが、少なくとも一つの分子部分を含有して成るものか、あるいは、本質的に一つの分子部分から成るものとされ、その分子部分が錯体化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項エネルギーを有するものとされる。
【００２８】
上記の式：化２によりあらわされる好ましいクリプテートにあっては、フェナントロリン，アントラセン，ベンゼン，ナフタレン，ビフェニルおよびテルフェニル，アゾベンゼン，アゾフィリジン，ピリジン，ビピリジン，ビスキノリンおよび下記の式：化３，化４及び化５によってあらわされる化合物のうちから選択される。
【００２９】
【化３】
−Ｃ₂ Ｈ₄ −Ｘ₁ −Ｃ₆ Ｈ₄ −Ｘ₂ −Ｃ₂ Ｈ₄ −
【００３０】
【化４】
−Ｃ₂ Ｈ₄ −Ｘ₁ −ＣＨ₂ −Ｃ₆ Ｈ₄ −ＣＨ₂ −Ｘ₂ −Ｃ₂ Ｈ₄ −
【００３１】
式：化３及び化４において、Ｘ₁ 及びＸ₂ は、同一であっても相違していてもよく、酸素，窒素もしくは硫黄を示す。
【００３２】
【化５】

【００３３】
式：化５において、Ｘは酸素もしくは水素である。
【００３４】
本発明に係る方法の優れた特徴の一つによれば、蛍光化合物は、巨大環式化合物：（２２）フェナントロリン；（２２）フェナントロリンアミド；（２２）アントラセン；（２２）アントラセンアミド；（２２）ビイソキノリン；（２２）ビフェニル−ビス−ピリジン；（２２）ビピリジン；（２２）ビピリジンアミド、および、巨大多環式トリス−ビピリジン，トリス−フェナントロリン，フェナントロリン−ビス−ビピリジン，ビイソキノリン−ビス−ビピリジンおよびビス−ピリジンジフェニルピリジンのうちの一つによって錯体化されたテルビウムもしくはユーロピウムから成る希土類クリプテートとされる。
【００３５】
取り分け有効な蛍光化合物は、ユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンである。
【００３６】
これらの化合物は、例えば、ヨーロッパ特許ＥＰ１８０４９２号に記載されている。
【００３７】
希土類イオンと錯体を作り、分子部分がビピラジン，ビピリミジンおよび窒素酸化物基を含んだ窒素複素環のうちから選択されたものとされる巨大環式化合物を用いることもできる。
【００３８】
ビピラジン部分を含んだ巨大環式化合物は、New J. Chem., 1996, 20, 1041〜1045 に掲載された F. Bodar-Houillon・他による論文に記載されている。また、ビピリミジン部分を含んだ巨大環式化合物は、Helv. Chem. Acta, 1992, 75, 1221 に掲載されたＪ. M. Lehn ・他による論文に記載されている。さらに、窒素酸化物基を含む窒素複素環を含んだ巨大環式化合物は、Helv. Chem. Acta, 1991, 74, 572 に掲載された J. M. Lehn・他による論文に記載されている。
【００３９】
蛍光ドナー化合物として用いられる希土類クリプテートは、下記の式：化６および化７によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも一つの希土類塩から成るものとされてもよい。
【００４０】
【化６】

【００４１】
【化７】

【００４２】
式：化６及び化７において、下記の式：化８によってあらされる環は、下記の式：化９によってあらされる環のうちの一つである。
【００４３】
【化８】

【００４４】
【化９】

【００４５】
上述の式：化６〜化９において、
−Ｙは、一つもしくは複数の二重結合もしくは三重結合を含んだ、および／または、一つもしくは複数の酸素，窒素，硫黄もしくはリンの如くのヘテロ原子によってＣ₅ 〜Ｃ₈ シクロアルキレン基もしくはＣ₆ 〜Ｃ₁₄アリレン基から分断された線状もしくは分枝状Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀アルキレン基のうちから選択された２価の有機基から成る基もしくはスペーサ・アームであり、斯かるアルキレン基，シクロアルキレン基あるいはアリレン基は、アルキル基，アリル基あるいはサルフォネート基により置換され得るものとされ、
−Ｚは、生体物質と共有結合することができる官能基であり、
−Ｒは、メチル基あるいは−Ｙ−Ｚ基であり、
−Ｒ’は、水素あるいは−ＣＯＯＲ”基であって、Ｒ”は、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル基および、好ましくは、メチル基，エチル基あるいはテルトブチル基であり、さもなくば、−Ｒ’は、−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ基である。
【００４６】
これらの化合物は、例えば、ヨーロッパ特許ＥＰ３２１３５３号に記載されている。
【００４７】
本発明に係る方法においては、上述の蛍光化合物は、特異受容体もしくは担体分子と、直接にあるいはスペーサ・アームを介して、結合できるものとされる。このスペーサ・アームは、例えば、一つもしくは複数の二重結合を含んだ、および／または、一つもしくは複数の酸素，窒素，硫黄もしくはリンの如くのヘテロ原子によって分断された線状もしくは分枝状Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀アルキレン基，カルバモイル基およびカルボキサミド基，Ｃ₅ 〜Ｃ₈ シクロアルキレン基、および、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄アリレン基のうちから選択された２価の有機基から成り、斯かるアルキレン基，シクロアルキレン基あるいはアリレン基は、アルキル基，アリル基あるいはサルフォネート基により置換され得るものとされる。
【００４８】
本発明に係る方法の好ましい例の一つにあっては、ユーロピウムクリプテートは、特異受容体と結合した蛍光ドナー化合物として用いられ、また、アロフィコシアニン，アロフィコシアニンＢ，化学的修飾がなされたアロフィコシアニン誘導体，Ｃフィコシアニン，Ｒフィコシアニンもしくはシアニンが、担体分子あるいは担体分子に結合した蛍光アクセプタ化合物として用いられる。
【００４９】
本発明に係る方法の好ましい例の一つにあっては、テルビウムクリプテートは、特異受容体と結合した蛍光ドナー化合物として用いられ、また、ローダミン，チオニン，Ｒフィコシアニン，フィコエリトロシアニン，Ｃフィコエリトリン，Ｂフィコエリトリン，Ｒフィコエリトリンもしくはシアニンが、担体分子あるいは担体分子に結合した蛍光アクセプタ化合物として用いられる。
【００５０】
アクセプタ化合物として用いることができる他の蛍光化合物は、国際特許出願ＷＯ９６／４２０１６号に記載されたフィコビリ蛋白質／結合ペプチド錯体とされる。
【００５１】
本発明の第２の態様にあっては、本発明は、チロシン，セリンおよび／またはトレオニンを含んだ基質に対する生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するためのキットを提供し、このキットは、複数の同種もしくは異種のペプチドあるいはポリペプチドが共有結合した少なくとも一つの担体分子、および、少なくとも一つのマーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した、少なくとも一つのリン酸化されたペプチドあるいはポリペプチドに対する特異受容体を含むことを特徴とする。
【００５２】
担体分子は、上述において定義された如くのもの、即ち、元来発光性を有するもの、あるいは、少なくとも一つの発光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合することによって発光性を有するものとされ得る。都合が良いことに、本発明に係るキットにあっては、担体分子および特異受容体と結合した発光マーカーもしくは発光活性調節因子は、発光化合物である。
【００５３】
本発明に係るキットの好ましい例の一つにあっては、特異受容体と結合した発光化合物（光マーカーもしくは発光活性調節因子）および担体分子は、夫々、蛍光ドナー化合物及び蛍光アクセプタ化合物とされる。
【００５４】
また、本発明に係るキットにおける特異受容体と結合した発光化合物は、ユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンもしくはテルビウムクリプテートＴｂトリス−ビピリジンとされ得るものである。
【００５５】
さらに、本発明に係るキットは、好ましくは、適切な緩衝媒体，非放射の標識化がなされたリン酸塩源、および、前述の生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するための均質方法を実施するための使用説明を含むものとされる。
【００５６】
以下に、本発明について実施例を参照して説明する。
【００５７】
実施例１：ＳＲＣペプチドのリン酸化の検出
ＳＲＣペプチドは、表皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体におけるチロシンキナーゼのための気質である。このＳＲＣペプチドは、単一のチロシン部分を含んだ１１アミノ酸のペプチドであり、式：化１０によってあらわされる。
【００５８】
【化１０】
[Ｈ] −Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ− [ＯＨ]
【００５９】
以下においては、次の如くの略記が用いられる。
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール
ＥｕＴＢＰ＝ユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンジアミン
ＢＳＡ＝牛血清アルブミン
ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ
ＭＨＳ＝マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＳＰＤＰ＝Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ＝スルフォスクシンイミジル−４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
【００６０】
１）発光担体分子とペプチド基質との接合
化学的に修飾されたアロフィコシアニン誘導体（ＸＬ₆₆₅ ，セアエスバイオアンテルナシィオナル (Cis bio international)）が用いられる。このアロフィコシアニン誘導体は、高分子量を有しており、各々がリン酸化部位を有した多数のペプチドによって標識化され得るものである。
【００６１】
ａ）ＳＰＤＰを用いたＸＬ₆₆₅ の活性化
無水エタノール中において８０ｍＭのＳＰＤＰが存在する溶液が、ｐＨを７．０とする１００ｍＭリン酸緩衝液中において３．４５ｍｇ／ｍｌの濃度を示す６ｍｇのＸＬ₆₆₅ に、ＸＬ₆₆₅ １モルあたり活性剤６０モルの割合をもって加えられる。次に、室温のもとで３０分間の活性化がなされた後、ｐＨを７．０とする１００ｍＭリン酸緩衝液中に２００ｍＭのＤＴＴが存在する溶液が、活性剤１モルあたり還元剤５モルの割合をもって加えられる。その後、室温のもとに１５分間置かれた後、不要な反応生成物が、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨを６．５とする１００ｍＭリン酸緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱を用いる排斥拡散クロマトグラフィによって除去される。そして、生成物がカップリングに先立って摂氏４度のもとに貯蔵される。
【００６２】
ｂ）ＭＨＳを用いたペプチドの活性化
アセトニトリル中に２２０ｍＭのＭＨＳが存在する溶液が、４ｍｇ（２．６ピコモル）のペプチドに、ペプチド１モルあたり活性剤４モルの割合をもって加えられる。そして、室温のもとに３０分間置かれた後、不要な反応生成物が、ｐＨを７．０とする１００ｍＭリン酸緩衝液中に置かれた Superdex 30イオン交換樹脂柱（ファルマシア (PHARMACIA)）を用いる排斥拡散クロマトグラフィによって除去される。
【００６３】
ｃ）ペプチド−マレイミド／ＸＬ₆₆₅ −ＳＨカップリング
上述と同様にして、マレイミド基が、ＸＬ₆₆₅ に固定されたチオール基と、ＸＬ₆₆₅ １モルあたりペプチド１００モルの割合をもって反応せしめられる。そして、摂氏４０度のもとで１８時間温置され、Ｎ−エチルマレイミドによって残留遊離チオール基がブロックされた後、カップリングされなかったペプチドが、ｐＨを７．０とする１００ｍＭリン酸緩衝液中に置かれた TSK 3000 SWイオン交換樹脂柱（メルク (MERCK)）を用いる排斥拡散クロマトグラフィによって除去される。それにより、ＸＬ₆₆₅ １分子あたり２０から４０のペプチドを含んだ結合体が得られる。
【００６４】
２）抗リン酸チロシン抗体とユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンとの間の接合体の調製
【００６５】
ａ）ＳＰＤＰを用いたＩｇＧＰＹ２０の活性化
ｐＨを７．０とする１００ｍＭリン酸緩衝液中において１０ｍｇ／ｍｌの濃度を示す５ｍｇのＩｇＧＰＹ２０（トランスダクションラボラトリーズ (Transduction Laboratories)が、ジオキサン中において６．４ｍＭのＳＰＤＰ（ピアス (Pierce),USA)が存在する溶液が、ＩｇＧＰＹ２０１モルあたりＳＰＤＰ７．５モルの割合をもって添加されて活性化される。次に、室温のもとで３５分間の活性化がなされた後、ＩｇＧピリジン−２−チオンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨを６．５とする１００ｍＭリン酸緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱を用いる排斥拡散クロマトグラフィによって精製される。蛋白質が濃縮され、２−ピリジルジスルフィド基が、最終濃度を１９ｍＭとするＤＴＴ（シグマ (Sigma), USA)溶液が用いられて、室温のもとで１５分間還元される。そして、ＤＴＴおよびピリジン−２−チオンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨを６．５とする１００ｍＭリン酸緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱を用いる精製によって除去される。ＩｇＧ−ＳＨの濃度は、２１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1のε_280nm が用いられて、波長２８０ｎｍのもとで測定される。
【００６６】
ｂ）ＩｇＧＰＹ２０／ＥｕＴＢＰ接合体の調製
２０ｍＭリン酸緩衝液中に２５ｍＭのスルフォ−ＳＭＣＣが存在する、１０％のジメチルフォルムアミド（ｖ／ｖ，ｐＨが７．０）を含んだ溶液が、５ｍｇ（５．１０^-6モル）のＥｕＴＢＰ（ヨーロッパ特許３２１３５３号の実施例３および４に記載されている如くに調製されたユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンジアミン）に、ＥｕＴＢＰ１モルあたり活性剤２．５モルの割合をもって加えられる。次に、室温のもとで４５分間の活性化がなされた後、沈殿物が除去されるように、反応媒体が０．８μｍフィルタによって濾過される。不要な反応生成物（スルフォ−ＳＭＣＣ，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，（Ｎ−マレイミドメチル）カルボン酸）が、ＮａＣｌショック下において、１０％（ｖ／ｖ）のジメチルフォルムアミドを含むｐＨを７．０とする２０ｍＭリン酸緩衝液中に置かれた Mono Q イオン交換樹脂柱（ファルマシア (Pharmacia)，スウエーデン）を用いるイオン交換クロマトグラフィによって除去される。ＥｕＴＢＰ−マレイミドの濃度は、２５，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1のε_307nm が用いられて、波長３０７ｎｍのもとで測定され、また、比：Ａ_307nm ／Ａ_280nm も測定される。
【００６７】
上述と同様にして、マレイミド基が、抗体に固定されたチオール基と、ＩｇＧＰＹ２０−ＳＨに対するＥｕＴＢＰ−マレイミドのモル比が１０から３０までの間とされるもとで反応せしめられる。そして、摂氏４度のもとで１８時間温置され、Ｎ−エチルマレイミドによって残留遊離チオール基がブロックされた後、カップリングされなかったＥｕＴＢＰが、ｐＨを７．０とする１００ｍＭリン酸緩衝液中において、枯渇点まで（透析槽中に蛍光が発せられなくなる状態まで）透析されることにより除去される。接合体の特性は、波長を３０７ｎｍおよび２８０ｎｍとする光についての吸収度合いによって測定され、求められた比：Ａ_307nm ／Ａ_280nm によって定められるクリプテートの固有の吸収が以下の値によってあらわされる。
ＥｕＴＢＰ−マレイミドについて：
ε_307nm ＝２５，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1
Ａ_307nm ／Ａ_280nm ＝実験的に求められる
ＩｇＧＰＹ２０−ＳＨについて：
ε_280nm ＝２１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1
【００６８】
３）リン酸化
ＥＧＦ受容体を含んだＡ４３１細胞（シグマ（SIGMA)）が、室温のもとで１０分間ＥＧＦによって予め活性化される。リン酸化緩衝液は、３０μＭのＡＴＰ，５０ｍＭのＭｇ⁺⁺および１０ｍＭのＭｎ⁺⁺を含み、ｐＨを７．４とする６０ｍＭＴＲＩＳ／ＭＥＳ緩衝液とされる。以下のものが、マイクロプレートに設けられた９６個の“分析”ウエルに順次加えられていく。
・１０μｌの予め活性化されたＡ４３１細胞
・１０μｌのＸＬ₆₆₅ ／ＳＲＣペプチド接合体
・３０μｌのリン酸化緩衝液
１０μｌのＸＬ₆₆₅ ／ペプチド接合体および４０μｌのリン酸化緩衝液が、“ブランク”制御ウエルに入れられる。斯かる状態をもって、室温のもとで３０分間温置される。
【００６９】
４）開示
以下のものが、各マイクロプレート・ウエルに順次加えられる。
・５０μｌのクリプテートＥｕトリス−ビピリジンによって標識化された抗フォスフォチロシン抗体
・０．４ＭのＫＦおよび０．１％のＢＳＡを含んだ、ｐＨを７．０とする１００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液
【００７０】
そして、室温のもとで３０分間温置された後、以下に述べられる原型レーザ蛍光光度計によって、波長を６２０ｎｍから６６５ｎｍとする範囲における蛍光が読み出される。窒素パルスレーザ（レーザサイエンス社（LASER SCIENCE INC.), モデルＬＳ１−３３７ＮＤ）が、励起源（波長を３３７．１ｎｍ）として用いられる。特定パルス持続時間は、３ナノ秒であり、周波数を１０Ｈｚとして繰り返される。ビームは、励起を妨害する波長３３７ｎｍ以外の光りを除去すべく、フィルタ（コーニング（CORNING)) を通過せしめられるものとされる。
【００７１】
ビームは、測定室に入った後、４５度の角度をもって配された、紫外線を反射するとともに可視光を通過させるダイクロイックフィルタによって反射される。ダイクロイックフィルタによって反射されたビームは、融解石英レンズによって測定されるべきマイクロプレート・ウエルに集められる。立体角２０度をもって集められる蛍光放射は、同じレンズにより平行化されるとともに、ダイクロイックフィルタを真っ直ぐに通過する（可視光蛍光）。検出されるべき蛍光波長に従って定義される特性を有した干渉フィルタは、その強度が光増幅器（ハママツ（HAMAMATSU) R2949）によって測定されるシグナルと干渉する虞のある光の除去を可能とする。
【００７２】
使用された光子カウンタは、その操作とレーザとの同期化とが、ＲＳ２３２ポートを通じたＩＢＭＰＣ−ＡＴコンピュータによって制御されるＳＲ−４００（スタンフォードリサーチシステムズ（STANFORD RESEARCH SYSTEMS)）である。光増幅器において発生されるパルスは、それらが光増幅器のノイズ対シグナル比を最適にすべく光子カウンタによって選択された識別レベルを越えるものであるとき、所定のタイムウインドウ（ｔｇ）にわたって、さらには、所定の遅れ時間（ｔｄ）をもって記録される。
【００７３】
ＩＢＭＰＣ−ＡＴコンピュータによって駆動されるＸ−Ｙプロッタは、ステッピングモータにより、測定用マイクロプレートに、装着位置，励起ビームの下方の位置，９６個のウエルを自動的に順次読み取る位置、及び、出口位置を含んだ複数の異なる位置をとらせる。
【００７４】
ＸＬ₆₆₅ ／ＳＲＣペプチド接合体から発せられる蛍光は、６６５ｎｍフィルタ（半波高幅：１０ｎｍ）を備えた原型蛍光光度計により、４００μｓにわたり、５０μｓの遅れ時間をもって測定される。その結果は、図１に示されるグラフの如くに得られる。このグラフにあっては、縦軸がリン酸化の程度を示し、横軸がＸＬ₆₆₅ ／ＳＲＣペプチド接合体の濃度を示している。リン酸化の程度は、変数ＤＲ＝Ｒ_sample−Ｒ_blank によってあらわされ、ここで、Ｒは波長を６６５ｎｍとする発光シグナルと波長を６２０ｎｍとする発光シグナルとの比である。また、ＸＬ₆₆₅ ／ＳＲＣペプチド接合体の濃度は、ＸＬ₆₆₅ のｎＭとしてあらわされる。これらの結果は、リン酸化の程度の増加とＸＬ₆₆₅ ／ＳＲＣペプチド接合体の濃度の増加とが相互に関連していることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＬ₆₆₅ ／ＳＲＣペプチド接合体の濃度とリン酸化の程度との関係を示すグラフである。

Claims

チロシン、セリンおよびトレオニンから選択される少なくとも１種のアミノ酸を含む基質に対する生物学的物質のリン酸化活性を検出および／測定するための均質方法において、
前記生物学的物質と、前記の少なくとも１種のアミノ酸を含む複数の同一のまたは異なるペプチドまたはポリペプチドであって担体分子に共有結合しているものとを、非放射標識化リン酸塩源とリン酸化されたペプチドまたはポリペプチドのための特異受容体との存在下で接触せしめ、ここで、前記担体分子は、（ａ）発光分子、（ｂ）少なくとも一つの発光マーカーと結合した非発光分子または（ｃ）少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した非発光分子からなり、そして前記特異受容体は、少なくとも一つの発光マーカーまたは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合しており；そして
前記担体分子と前記特異的結合受容体との間の相互作用から生ずる発光シグナルを測定することにより、前記リン酸化活性を検出および／または測定する；
ことを特徴とする方法。
生物学的物質のリン酸化活性の検出および／または測定が、担体分子と、リン酸化されたペプチドまたはポリペプチドのための特異受容体と結合した発光マーカーまたは発光活性調節因子と、の間におけるエネルギー転移の結果生じる発光シグナルが測定されることにより行われる、請求項１記載の生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するための均質方法。
前記発光担体分子が、蛍光分子、あるいは、少なくとも一つの蛍光マーカーもしくは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した非蛍光分子である、請求項１または請求項２記載の方法。
前記特異受容体に結合した発光マーカーもしくは発光活性調節因子が蛍光化合物である、請求項１、請求項２または請求項３記載の方法。
前記特異受容体が蛍光ドナー化合物と結合しており、そして前記担体分子が蛍光アクセプタ分子または蛍光アクセプタ化合物と結合している、請求項１から請求項４までのいずれかに記載の方法。
前記特異受容体が蛍光アクセプタ化合物と結合しており、そして前記発光担体分子が蛍光ドナー分子または蛍光ドナー化合物と結合している、請求項１から請求項５までのいずれかに記載の生物学的物質のリン酸化活性を検出および／または測定するための均質方法。
前記発光担体分子と共有結合したペプチドまたはポリペプチドの量が２〜1000である、請求項１から請求項６までのいずれかに記載の方法。
前記特異受容体が、キレート，クリプテート、または希土類イオンの巨大環錯体と結合している、請求項１から請求項７までのいずれかに記載の方法。
前記特異受容体が、キレート，クリプテート、あるいは、ユーロピウム，テルビウム，ジスプロシウム，サマリウムもしくはネオジムの巨大環錯体と結合したものである、請求項８記載の方法。
前記特異受容体が、式：化１

（この式中、Ｚは３価または４価の原子を示し、Ｒは不存在、水素、水酸基、アミノ基または炭化水素基を示し、２価の基である丸で囲まれたＡ，ＢおよびＣは、互いに独立に、１または複数のヘテロ原子を含有してもよくそしてヘテロ巨大環によって中断されていてもよい炭化水素環であり、また、上記２価の基である丸で囲まれたＡ，ＢおよびＣのうちの少なくとも１つは、少なくとも一つの分子部分を含有して成るか、または本質的に一つの分子部分から成り、当該分子部分は、錯体化された希土類イオンの発光準位の三重項エネルギーより大なる三重項エネルギーを有する）
により表される巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも一つの希土類塩から成る希土類クリプテートと結合している、請求項９記載の方法。
前記特異受容体と結合した蛍光化合物が、巨大環式化合物：（22）フェナントロリン；（22）フェナントロリンアミド；（22）アントラセン；（22）アントラセンアミド；（22）ビイソキノリン；（22）ビフェニル−ビス−ピリジン；（22）ビピリジン；（22）ビピリジンアミド、および、巨大多環式トリス−ビピリジン、トリス−フェナントロリン、フェナントロリン−ビス−ビピリジン、ビイソキノリン−ビス−ビピリジンおよびビス−ピリジンジフェニルピリジンのうちの一つによって錯体化されたテルビウムもしくはユーロピウムから成る希土類クリプテートである、請求項10記載の方法。
前記蛍光化合物がユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンである、請求項11記載の方法。
前記ユーロピウムクリプテートが、特異受容体と結合した蛍光ドナー化合物として用いられ、そしてアロフィコシアニン，アロフィコシアニンＢ，化学的修飾がなされたアロフィコシアニン誘導体，Ｃフィコシアニン，Ｒフィコシアニンまたはシアニンが、担体分子または担体分子に結合した蛍光アクセプタ化合物として用いられる、請求項１から請求項12までのいずれかに記載の方法。
テルビウムクリプテートが、特異受容体と結合した蛍光ドナー化合物として用いられ、そしてローダミン、チオニン、Ｒフィコシアニン、フィコエリトロシアニン、Ｃフィコエリトリン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリンまたはシアニンが、担体分子または担体分子に結合した蛍光アクセプタ化合物として用いられる、請求項１から請求項12までのいずれかに記載の方法。
前記特異受容体と結合した蛍光ドナー化合物が、ユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンまたはテルビウムクリプテートＴｂトリス−ビピリジンである、請求項１から請求項１４までのいずれかに記載の方法。
前記特異受容体がポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体のうちから選択される、請求項１から請求項15までのいずれかに記載の方法。
チロシン、セリンおよびトレオニンから選択される少なくとも１種のアミノ酸を含む基質に対する生物学的物質のリン酸化活性を検出および／測定するためのキットにおいて、
複数の同種または異種のペプチドまたはポリペプチドが共有結合している少なくとも一つの担体分子、当該担体分子は、（ａ）発光分子、（ｂ）少なくとも一つの発光マーカーと結合した非発光分子または（ｃ）少なくとも一つの発光活性調節因子と結合した非発光分子からなる；ならびに
リン酸化された前記ペプチドまたはポリペプチドに対する特異受容体、当該特異受容体は、少なくとも一つの発光マーカーまたは少なくとも一つの発光活性調節因子と結合している；
を含むことを特徴とするキット。
前記担体分子および前記特異受容体と結合した発光マーカー分子が蛍光分子である、請求項１７記載のキット。
前記特異受容体と結合した発光マーカーまたは発光活性調節因子、および担体分子が、夫々、蛍光ドナー化合物及び蛍光アクセプタ化合物である、請求項18記載のキット。
前記特異受容体と結合した発光化合物が、ユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンまたはテルビウムクリプテートＴｂトリス−ビピリジンである、請求項17、請求項18または請求項19記載のキット。
適切な緩衝媒体，非放射の標識化がなされたリン酸塩源、および、請求項１から請求項16までのいずれかに記載の方法を実施するための使用説明書を含むことを特徴とする、請求項17から請求項20までのいずれかに記載のキット。