JP4271610B2 - 電気泳動用マイクロチップ - Google Patents
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Description
(a)サンプルの無駄が多くなる。
非特許文献1では、一且、電気泳動に必要なサンプル最より過剰な量が入ったポート202から泳動用チャネル200の全長にわたってサンプル214を導入する。すなわち、気送チャネル208を引圧にしたのち、気送チャネル210から正圧の空気を送り出すことで、不必要量のサンプル214をすべてポート202に戻し、サンプル必要量の秤取を行なう。しかしここではひとつのポート202をサンプル214とゲル216で共用しているため、次工程でのゲル導入の際、ポート202に戻された余剰サンプル214を取り除かなくてはならず、無駄となる可能性がある。また、一且サンプル214を泳動チャネル200全長にわたって導入するため、余剰サンプル除去後も泳動レーン壁面などにサンプル214の取り残しが生じる可能性があり、電気泳動結果に悪影響を及ぽすと推測される。
(b)ポート202からのサンプル214の導入距離が長く、サンプル必要量を秤取できない。
非特許文献1では、ポート202からの導入距離が非常に長く、サンプル導入時の移送中にサンプル214が泳動用チャネル200の壁面などにとられる可能性がある。そのため、サンプル必要量が秤取できないことがあると推測される。
(c)サンプル必要量の調整が困難である。
非特許文献1では、サンプルの秤取を行なう疎水性細管ベント212に繋がる気送チャネル208及び210が或る間隔で断続的に配置されているため、サンプル量の調整が困難である。
(d)サンプル214とゲル216の界面をきれいに合わせることは困難である。
電気泳動において、バンドを明確に分離するためには、サンプルとゲルの界面を直線状に合一させることが効果的である。非特許文献1では、疎水性細管ベント212に繋がる気送チャネル210を引圧にすることで両者の合一を行なうが、これらの疎水性細管ベント212はピッチ12.5μmと断続的な溝であり、かつ、泳動チャネル200の片側から引圧にしていることで、界面が直線状でほなく傾斜を持つ可能性があり、きれいに合―することは困難である。
(e)DNAの分離分解能を向上させることは難しい。
非特許文献1では、電極間隔を3mm、分離泳動電圧を5Vとして、DNAの分離を行なっている。5Vという低電圧の印加であるため、一般に起こりうる溶液の電気分解による電極部でのガスの発生は見られなかったと推測できる。しかし、DNAの分離分解能を向上させようとすると、一般的には泳動距離を長くとり、分離泳動電圧は高圧を必要とする。そのため、溶液の電気分解による電極部でのガスの発生は避けられない。ガスの発生はガスが溶液を寸断させ、泳動用チャネル200内に電流が流れなくなるといった障害を新たに発生きせてしまう。
前記電気泳動用マイクロチップはサンプル注入部と電気泳動部とからなり、
前記サンプル注入部は、所定の容積を有する容積部を有し、該容積部にはサンプル導入用のポートと、正圧を印加するための加圧ポートと、引圧を印加するための第1の引圧ポートとが接続されており、
前記サンプル導入用ポートは途中に開閉弁が配設された第1の流路により前記容積部と連通されており、
前記加圧ポートは逆止弁を介して前記容積部と接続され、該逆止弁は所定の容積を有する圧力室と、該圧力室の内部に延びると共に前記容積部の上流側に連通する第2の流路と、該圧力室の周縁部に連通すると共に前記加圧ポートに連通する第3の流路とを有し、前記圧力室内の第2の流路の周囲が気体透過性の隔壁により仕切られており、
前記第1の引圧ポートは第1の空気抜き弁を介して前記容積部と接続され、該第1の空気抜き弁は所定の容積を有する圧力室と、該圧力室の内部に延びると共に前記容積部の下流側に連通する第4の流路と、該圧力室の周縁部に連通すると共に前記第1の引圧ポートに連通する第5の流路とを有し、前記圧力室内の第4の流路の周囲が気体透過性の隔壁により仕切られており、
前記電気泳動部は、電気泳動用チャネルと、ゲル電解質導入用のポートと、引圧を印加するための第2の引圧ポートとを有し、
前記ゲル電解質導入用ポートは途中に開閉弁が配設された第6の流路により前記電気泳動用チャネルの一方の端部と連通されており、
前記第2の引圧ポートは第2の空気抜き弁を介して前記電気泳動用チャネルと接続され、該第2の空気抜き弁は所定の容積を有する圧力室と、該圧力室の周縁部に連通すると共に前記第2の引圧ポートに連通する第7の流路とを有し、前記圧力室は前記電気泳動用チャネルの少なくとも一部を取り囲むように配置され、前記圧力室と前記電気泳動用チャネルとの間が気体透過性の隔壁により仕切られており、
前記一対の電極は前記電気泳動用チャネルと交差するように所定の間隔で配置され、
前記容積部と前記電気泳動用チャネルとは細管により連通されていることを特徴とする電気泳動用マイクロチップを提供する。
Q=D・ΔP・S/L
{式中、Qは気体透過量(m3/s)であり、Dは比例係数(m3・s/kg)であり、ΔPは膜前後の差圧(Pa)であり、Sは膜の表面積であり、Lは膜厚(m)である。}
本発明に当てはめると、隔壁36を透過して流れる気体の流量、すなわち流路13dに引き込まれて流れる液体の流量は、隔壁前後の差圧ΔPと隔壁の面積Sに比例し、隔壁の厚さLに反比例する。本発明者らの実験では、PDMSの場合、比例計数Dは約2〜3x10−15(m3・s/kg)と計測された。これを本発明に当てはめると、隔壁36を透過して流れる気体の流量を増大させるには、(1)隔壁36前後の差圧を大きくする、(2)隔壁36の面積を大きくする、及び(3)隔壁36の厚さを薄くすればよい。
(I)容積部17へのサンプル導入
容積部17へのサンプルの導入手順について図8を参照しながら説明する。
(1)大気に向かって開口しているポート5aからピペット(図示されていない)などの公知常用の器具を用いてサンプルと、必要に応じて試薬類を別々に、又は一緒に滴下する。
(2)開閉弁15bを閉じる。これにより、細管19に連通する電気泳動用チャネル3からの空気の流入が阻止される。
(3)開閉弁15aを開け、引圧ポート25aを引圧にすることにより空気抜き弁21aが閉じられ、開口ポート5aから容積部17内にサンプル(試薬類)を導入し、容積部17及び流路13dを満たす。なお、容積部17とは図8においてグレーに着色された区画を意味する。
(1)図9に示されるように、加圧ポート23から圧力を加えて正圧にすることにより逆止弁20が開かれ(図5B参照)、容積部17に秤取された必要量のみをとり、流路13bなどに存在する残りのサンプルを開口ポート5aに戻す。所望により、このサンプルは再利用することもできる。
(2)次いで、開閉弁15aを閉じて、開口ポート5aからのサンプルの流入を抑え、また、開閉弁15bを開き、細管19に連通する電気泳動用チャネル3を大気圧解放とする。
(3)次いで、図10に示されるように、加圧ポート23から適正な正圧(ここでは注入圧力)を印加し、逆止弁20を開いて(図5B参照)、容積部17内のサンプルを細管19を通して電気泳動用チャネル3に注入する。このような容積部から電気泳動用チャネル3にサンプルを注入する方法は、本願出願人の先願である特願2003−180567号明細書に詳述されている。注入動作を繰り返すことにより、サンプル(試薬類)必要量の調整が可能である。また、細管19を電気泳動用チャネル3の端部付近に配置することで、サンプル導入距離を短くとることができ、電気泳動用チャネル3の壁面にサンプルが取られることが抑制される。
図11に示されるように、電気泳動用チャネル3へのサンプル注入が完了したら、引圧ポート25bを引圧にすることにより空気抜き弁21bが閉じられ、注入されたサンプルを電気泳動用チャネル3の左端部(電極9a側)に移送させる。
電気泳動において、閉じられたチャネルで泳動することは、一般に電気浸透流が発生せず、明確なバンドの分離を可能にする。しかし、通常、端部が閉じられたチャネルにおいて、チャネル内の液体を閉じられた側へ移送させることはできず、移送するためには、空気抜き等の手段を必要とする。本発明では、空気抜き弁21bが電気泳動用チャネル3内の空気を排除するので、閉じられた電気泳動用チャネル3の左端部(電極9a側)へ移送することができる。また、ここでは、注入されたサンプルの気液界面形状は直角方向に直線的となり、きれいな気液界面を形成する。このことは後工程のサンプルとゲルとの界面を直線として形成することに効果的である。
非特許文献1では、疎水性細管ベント(HMCV)は泳動レーンの片側から引圧しているが(図22参照)、本発明では電気泳動用チャネル(泳動レーン)3の両側から対称に引圧しているため、閉じられたチャネルの端部にきれいな気液界面を形成することができる。図12は気液界面形状の悪い例を示す模式図である。
図13を参照しながら電気泳動用チャネル3へのゲル電解質の導入手順を説明する。
(1)容積部17から細管19を通して電気泳動用チャネル3への空気の流入がないことを確認する。細管19がサンプルなどの液体で満たされており、容積部17は逆止弁20を通して注入圧力が溜まった状態である。
(2)開口ポート5bからピペット(図示されていない)などの公知常用の器具を用いてゲル電解質(例えば、ポリアクリルアミドゲル)を滴下する。
(3)開閉弁15bを開いた状態にし、引圧ポート25bを引き続き引圧状態にし、空気抜き弁21bを閉じた状態とし、開口ポート5bから電気泳動用チャネル3へゲル電解質を引き込み、チャネル3をゲル電解質で満たす。
(4)このとき、電気泳動用チャネル3内がゲル電解質で満たされると同時に、既に電気泳動用チャネル3の左端部(電極9a側)に注入されたサンプルとの合一が行われる。
空気抜き弁21bが閉じていることにより、図14(A)に示されるように、電気泳動用チャネル3内の空気が電気泳動用チャネル3の両側の隔壁36を通して排除される。その結果、図14(B)に示されるように、サンプルとゲルとの界面は空気の混入がなく、しかも電気泳動用チャネル3の幅に等しい長さの直線状となる。サンプルとゲルの界面を電気泳動用チャネル3に直角方向に直線的に形成することは、電気泳動において明確なバンド分離に有利であり、大変効果がある。
図15を参照しながら電気泳動手順について説明する。
(1)引圧ポート25aから引圧しながら、空気抜き弁21bは閉じたまま、すなわち電気泳動用チャネル3と圧力室34との間の隔壁36を通して空気が排除されている状態にする。
(2)電極9aをグランド(GND)、電極9bを陽極とするように、電源27から両極間に所定の電圧を印加する。DNA電気泳動の場合、DNAサンプルはマイナスの電荷を帯びており、電極9bに引き寄せられる。次第に塩基対(bp:base pair)の長さによってゲル電解質中で篩い分けられる。多くの場合、DNAサンプルは蛍光試薬で標識されており、これによりバンドに分離していく様子を蛍光顕微鏡(図示されていない)を用いて観察する。
また、両電極間に電圧を印加することにより、溶液の電気分解によりガスが発生する。ガスの発生は印加電圧が高いほど起こりやすい。このガス発生現象は避けることができない。これにより溶液が分断され、電気泳動用チャネル3内に電流が流れなくといった弊害が新たに発生する。このように電気分解中に発生したガスは、本発明の電気泳動用マイクロチップ1によれば、空気抜き弁21bの働きにより、電気泳動用チャネル3と空気抜き弁21bの圧力室34との間の隔壁36をガスが透過できるので、電極部(電極9a及び9bの周辺)に発生したガスは直ちに排除され、ガスによる弊害が生じる前に電気泳動用チャネル3内には気体の残留を無くすことができる。従って、空気抜き弁21bは2つの機能を果たすことができる。ひとつは電極部に発生したガスの排除機能であり、もうひとつはサンプルやゲル電解質の導入機能である。
(1)マイクロチップ
PDMS基板(厚さ2mm)+ガラス基板(厚さ1mm,電極パターン付)
PDMSの吸着力のみでガラス基板と貼り合わせた(恒久接着せず)。
(2)ポート
開口ポート5a,5bは内径2.4mmであった。
引圧ポート25a,25b及び加圧ポート23は下穴内径2mmであり、シリコンチューブ(外径2mm,内径1mm)を接着剤RTV(KE45T)で接着した。
(3)インジェクション方式
注入機構を使用した。容積部17のサイズは幅200μm、高さ50μm、長さ300μmであり、注入量は3nLであった。
(4)泳動レーン
幅200μm、高さ50μmであった。
(5)電極
電極は、Cr(薄膜)+Pt(厚さ2μm)、幅200μmであった。電極間距離は5mmであった。
(6)DNAサンプル
G210A(プロメガ)、バンド数11本、塩基対長100〜1000bp(100bpおき)+1500bp、濃度0.13μg/μL(バンド当たり0.01μg/μL、但し、1500bpのみ0.03μg/μL)。ピペットで開口ポート5aに3μL分注した。
(7)蛍光試薬
SYBRグリーンI 核酸ゲルステイン1万倍(分子プローブ)。励起光波長254nm及び497nm、蛍光波長520nm。希釈倍率100倍。使用量3μL。開口ポート5aでDNAサンプルと混合した。
(8)泳動ゲル
0.4%HPMC(アルドリッチ社製No.20032-8)×0.5TBEを使用した。
ピペットで開口ポート5bに10μL分注した。
(9)泳動電源
スイッチング電源又はシリーズ電源を使用した。電圧は5〜40V(トリマーで調整)。
(10)泳動電圧
8.6V、電圧勾配1.72V/mm、電流1.5→0.4μA(測定値)
(11)蛍光観察
顕微鏡としてニコン倒立顕微鏡を、光源として高圧水銀ランプを、フィルターとしてニコンFITC(EX460−500、DM505、BA515)を、カメラとしてチルドカメラ(浜松ホトニクス社製)を、記録手段としてテレビデオをそれぞれ使用した。
実験結果を図16に示す。図16に示されるように、バンドの分離は極めて明瞭に行うことができた。なお、泳動速度は約2mm/分(500bp)であった。図17は電気泳動によるバンド分離状態を示す連続写真である。
本発明の電気泳動用マイクロチップは遺伝子解析、臨床診断、薬物スクリーニングなどの化学、生化学、薬学、医学、獣医学分野のみならず、化学工業、環境計測などの幅広い用途に使用できる。常用サイズの同種の装置に比べて、本発明の電気泳動用マイクロチップは(1)サンプル及び試薬の使用量が著しく少ない、(2)分析時間が短い、(3)感度が高い、(4)現場に携帯し、その場で分析できる、及び(5)使い捨てできるなどの利点を有する。
3 電気泳動用チャネル
5a サンプル注入用ポート
5b ゲル電解質注入用ポート
7 PDMS基板
9a,9b 電極
11 ガラス基板
13a〜13g 流路
15a,15b 開閉弁
17 容積部
19 細管
20 逆止弁
21a,21b 空気抜き弁
23 加圧ポート
25a,25b 引圧ポート
27 電源
30 針
32 注射器
34 圧力室
36 隔壁
Claims (8)
- 少なくとも微細流路構造が形成された少なくとも一枚のPDMS基板と、一対の電極が形成された対面基板とからなり、前記PDMS基板の微細流路構造形成面と前記対面電極の電極形成面とを貼り合わせた電気泳動用マイクロチップにおいて、
前記電気泳動用マイクロチップはサンプル注入部と電気泳動部とからなり、
前記サンプル注入部は、所定の容積を有する容積部を有し、該容積部にはサンプル導入用のポートと、正圧を印加するための加圧ポートと、引圧を印加するための第1の引圧ポートとが接続されており、
前記サンプル導入用ポートは途中に開閉弁が配設された第1の流路により前記容積部と連通されており、
前記加圧ポートは逆止弁を介して前記容積部と接続され、該逆止弁は所定の容積を有する圧力室と、該圧力室の内部に延びると共に前記容積部の上流側に連通する第2の流路と、該圧力室の周縁部に連通すると共に前記加圧ポートに連通する第3の流路とを有し、前記圧力室内の第2の流路の周囲が気体透過性の隔壁により仕切られており、
前記第1の引圧ポートは第1の空気抜き弁を介して前記容積部と接続され、該第1の空気抜き弁は所定の容積を有する圧力室と、該圧力室の内部に延びると共に前記容積部の下流側に連通する第4の流路と、該圧力室の周縁部に連通すると共に前記第1の引圧ポートに連通する第5の流路とを有し、前記圧力室内の第4の流路の周囲が気体透過性の隔壁により仕切られており、
前記電気泳動部は、電気泳動用チャネルと、ゲル電解質導入用のポートと、引圧を印加するための第2の引圧ポートとを有し、
前記ゲル電解質導入用ポートは途中に開閉弁が配設された第6の流路により前記電気泳動用チャネルの一方の端部と連通されており、
前記第2の引圧ポートは第2の空気抜き弁を介して前記電気泳動用チャネルと接続され、該第2の空気抜き弁は所定の容積を有する圧力室と、該圧力室の周縁部に連通すると共に前記第2の引圧ポートに連通する第7の流路とを有し、前記圧力室は前記電気泳動用チャネルの少なくとも一部を取り囲むように配置され、前記圧力室と前記電気泳動用チャネルとの間が気体透過性の隔壁により仕切られており、
前記一対の電極は前記電気泳動用チャネルと交差するように所定の間隔で配置され、
前記容積部と前記電気泳動用チャネルとは細管により連通されていることを特徴とする電気泳動用マイクロチップ。 - 前記逆止弁の隔壁は下部の基板と非接着にされており、加圧ポートから圧力を印加して圧力室を正圧にすると圧力室全体が厚み方向に向かって膨大することにより前記隔壁が持ち上げられ、隔壁と下部の基板との間に隙間を生じることができることを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
- 前記第2の空気抜き弁の圧力室は電気泳動用チャネルとゲル電解質導入用ポートの周囲の大部分を取り囲むように配置されていることを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
- 一方の電極が電気泳動用チャネルの端部に該チャネルの幅方向と直交するように配置され、所定の間隔で他方の電極が該チャネルの幅方向と直交するように配置されていることを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
- 前記サンプル導入用ポート及びゲル電解質導入用ポートが大気に向かって開放された開口を有することを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
- 前記サンプル導入用ポート及びゲル電解質導入用ポートが大気に向かって開放されていない閉塞空間であることを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
- 前記加圧ポート、第1の引圧ポート及び第2の引圧ポートが大気に向かって開放された開口を有することを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
- 前記加圧ポート、第1の引圧ポート及び第2の引圧ポートが大気に向かって開放されていない閉塞空間であることを特徴とする請求項1に記載の電気泳動用マイクロチップ。
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