JP4265134B2 - Novel fluorescent dye and method for measuring nucleic acid - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、新規な蛍光色素、その製造方法、該色素を化学結合で結合した核酸プローブ、そしてこれを使用することを特徴とする核酸の測定方法に関するものである。本願発明は、詳しくはストークスシフトが大きく、しかも二本鎖核酸存在時に蛍光強度が著しく増大する新規蛍光性色素、その製造方法、該色素を化学結合で結合した核酸プローブ、そしてこれを使用することを特徴とする核酸の測定方法に関するものである。
【０００２】
なお、本願発明の測定法は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩基配列を含む標的ＲＮＡの定性又は定量分析方法に関するものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用で、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量に有用な測定法である。
【０００３】
【従来の技術】
一般的に、生体成分の分析には高い特異性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配列を有する核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体を形成する性質が利用される。
【０００４】
特定塩基配列を有する標的核酸の定量には、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を得る手段が重要であり、更に臨床診断等の目的においては、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であることから、該手段は極微量核酸を増幅する工程が必要となる。
【０００５】
特にウイルス感染症の診断では、臨床試薬中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために信号強度を向上し高感度化する目的から、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法等によって標的核酸を増幅しておく方法が試みられている。また、ＲＮＡの増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法（例えば特許第２６５０１５９号公報参照）や３ＳＲ法（例えば欧州公開特許第３７３９６０号公報参照）と呼ばれる方法も知られている。
【０００６】
標的核酸の特定塩基配列に相補的な核酸配列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するようにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブ（例えば特開平８−２１１０５０号公報参照）は、標的核酸と相補結合を形成することで測定可能な蛍光信号を発するため、相補結合の形成の有無、及び相補結合体の定量を可能とするものであり、相補結合していないプローブを反応系から分離する必要がないために、増幅された試料を反応容器から取り出す必要がなく、増幅産物の飛散等に由来する偽陽性を惹起しないという利点がある。
【０００７】
そして核酸プライマー及び核酸ポリメレースの作用により、特定塩基配列から成るＲＮＡを一定温度にて増幅する工程を、この核酸プローブ共存下で実施することによって、標的ＲＮＡの増幅とその分析を一定温度条件下で、担体を使用することなく、しかも、密閉条件で行う方法も開発されている。（特願２０００−１４４００号公報参照）。
【０００８】
インターカレーター性蛍光色素は、二本鎖核酸にインターカレーションし、インターカレーションによって遊離状態とは蛍光特性が変化する物質である。この様な性質を持つ化合物としては、エチジウムブロミド、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ等が知られている。更に、これらの化合物をリンカーで結合して、二量化することにより得られるエチジウムダイマー、ＹＯＹＯ等も、二本鎖核酸にインターカレートし蛍光増感を示すことが知られている。従って、識別可能な蛍光特性の変化を引き起こす二種類以上のインターカレーター性蛍光色素を用いて複数の核酸を同時に増幅し、増幅産物を同時に測定することができれば、産業上、有意義な用途が数多く考えられる。例えば、一つの試料中に含まれる複数の標的核酸を同時に検出したり、既知量の標準核酸を標的核酸と同時に増幅することで、増幅反応等の正否の判定、又は、標的核酸の定量を可能とすることが例示できる。
【０００９】
しかしながら、インターカレーター性蛍光色素の種類には限りがあり、それらが発する蛍光は、極大波長を中心とした幅を持ったスペクトルとして観察され、かつ、その蛍光量子収率は、一般的に蛍光色素によって異なる。従って、蛍光スペクトルが互いに重なり合うインターカレーター性蛍光色素では、特定の波長における蛍光強度を精密に測定することは困難である。また、インターカレーター性蛍光色素を励起するための光源には、レーザーや、発光ダイオード等が考えられるが、これも種類に制限があり、至適な励起用光源の組み合わせから考えた場合、蛍光スペクトルが互いに重ならない二種類以上のインターカレーター性蛍光色素を選択する事は非常に困難であった。例えば、公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローやチアゾールオレンジ等のシアニン系色素において、二つの蛍光スペクトルが重なり合わないためには、両者の蛍光極大波長の差が約１００ｎｍ以上なければならないが、シアニン系蛍光物質の蛍光極大波長と励起極大波長の差は２０から４０ｎｍ程度であり、また、両者を蛍光測定が可能なように励起するためには、二つの励起光源が必要となって、該測定を実施するうえでの制約となる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の第１の目的は、核酸検出において二本鎖核酸にインターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差が大きい（すなわちストークスシフトの大きい）新規なインターカレーター性蛍光色素であって、従来公知のインターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが重なり合わないという特徴を有する化合物を提供することにある。また本願発明の第２の目的は、該蛍光色素を化学結合で結合した新規な核酸プローブを提供することにある。そして本願発明の第３の目的は、該核酸プローブを用いた核酸の測定法（定性、定量法）であって、試料の中に含まれる一種以上の標的核酸を増幅し、分離操作を行うことなしに、増幅産物を密閉容器内で測定する方法を提供し、標的核酸の存在の有無、及び量を高精度に決定する測定法、特に、二種類以上の標的核酸の同時測定等を可能とする測定法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
特定の条件を満たす近接した二つの化合物の一方を励起すると、他方にエネルギートランスファーが起こり、エネルギーを受け取った化合物（アクセプター）が蛍光を発することは広く知られている。本願発明者らは、このエネルギートランスファーを分子内で効率的に起こす物質について研究を重ね、核酸検出において核酸二本鎖にインターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差が大きい、すなわちストークシフトの大きい新規な蛍光色素を見い出すに至った。このようにして前記目的を実現すべく完成された本願請求項１の発明は、従来はその構造、合成法、蛍光特性等が全く知られていない、新規な前記一般式１（式中、Ｒ1は低級アルキル基を表す。Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（該式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（該式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（該式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（該式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表す。Ｚは酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで表される基（該式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）で表されることを特徴とする化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体である。
【００１２】
本願請求項２の発明は、前記請求項1に記載の化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体の製造方法である。
【００１３】
本願請求項３の発明は、試料中に含まれると予想される核酸の有無又は量を測定する方法であって、前記請求項1に記載の化合物を用いることを特徴とする。本願請求項４の発明は、請求項３の発明に係り、前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物である測定法である。
【００１４】
本願請求項５の発明は、特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドと前記一般式１で表わされる化合物を化学結合で結合した核酸プローブである。本願請求項６の発明は、前記請求項５の発明に係り、前記一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴマーである核酸プローブである。本願請求項７の発明は、前記請求項６の発明に係り、ＤＮＡオリゴマー中のリン部分からリンカーを介して前記化学結合を形成したことを特徴とする。本願請求項８の発明は、前記請求項７の発明に係り、前記一般式１で表わされる化合物が、標的核酸と一本鎖ＤＮＡプローブとの相補結合部分にインターカレーションすることにより蛍光特性が変化することを特徴とする。
【００１５】
本願請求項９の発明は、試料中に含まれる少なくとも一種類以上の特定核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法であって、前記請求項６の核酸プローブを用いることを特徴とする。
【００１６】
本願請求項１０の発明は、試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、二種類以上の標的ＲＮＡを同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法である。本願請求項１１の発明は、試料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試料に既知量の標準核酸を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測定した既知量の標準核酸の蛍光強度と比較する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法である。
【００１７】
本願請求項１２の発明は、前記請求項１０又は１１の発明に係り、前記他のインターカレーター性蛍光色素の少なくとも１つがオキサゾールイエローであることを特徴とする。そして本願請求項１３の発明は、前記請求項１２の発明に係り、測定におけるインターカレーター性蛍光色素の励起波長が４５０から５００ｎｍであることを特徴とする。以下、本願の各発明を詳細に説明する。なお本願明細書では、特に断らない限り「低級」なる用語は炭素数が１〜６個の直鎖又は分枝した炭素鎖を意味する。
【００１８】
一般式１において、低級アルキル基としては、具体的には例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル（アミル）基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル（アミル）基、ヘキシル基等を例示できる。また一般式１において、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基としては、例えばフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、３−フルオロプロピル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、３−クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基等を例示できる。そして一般式１において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示できる。
【００１９】
前記一般式１で表される本願発明の化合物（芳香族化合物誘導体、その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体）を具体的に説明するために、一般式１において用いられる各種記号について、その好適な具体例を挙げて詳細に説明する。
【００２０】
Ｒ1は低級アルキル基を表す。かかるアルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜４個の直鎖状又は分枝状のアルキル基で、より好ましくはメチル基、エチル基であるが、中でもメチル基はＲ1として最も好ましい低級アルキル基である。
【００２１】
Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子である。Ａ及びＤは、好ましくは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、又は酸素原子である。Ａ及びＤは、更に好ましくは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）である。
【００２２】
前記Ｑは、ハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）で、好ましくは、ハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であるが、ハロゲン原子であることが最も好ましい。
【００２３】
前記ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表すが、好ましくは同一又は相異なって、２〜４の整数であり、特に好ましくは同一又は相異なって、２又は３である。
【００２４】
前記Ｒ2は、水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、好ましくは水素原子又は低級アルキル基であり、特に好ましくは水素原子、メチル基、エチル基である。中でも水素原子が最も好ましい。
【００２５】
前記Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、好ましくは水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基、又は、２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基、２−ブロモエチル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基等のハロゲン原子で置換された低級アルキル基である。Ｒ3は、より好ましくは水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基、又は、２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基等のヨード原子で置換された低級アルキル基等である。中でも、水素原子、又は、メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基が最も好ましい。
【００２６】
前記Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基である。Ｒ4及びＲ5は、好ましくは、同一又は相異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基、２−ブロモエチル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基等である。Ｒ4及びＲ5は、より好ましくは、同一又は相異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基等である。Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基であることが最も好ましい。
【００２７】
前記Ｒ6は、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等であり、更に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基である。
【００２８】
前記Ｒ7は、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても良いフェニル基であり、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、フェニル基、ｐ−メチルフェニル基等であり、更に好ましくはメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
【００２９】
前記Ｚは、酸素原子又は硫黄原子であり、好ましくは硫黄原子である。
【００３０】
前記Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）である。Ｘ1及びＸ2は、好ましくは、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）である。Ｘ1及びＸ2は、更に好ましくは、同一又は相異なって、ハロゲン原子である。
【００３１】
前記Ｒ8は、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等で、更に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基である。
【００３２】
前記Ｒ9は、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても良いフェニル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基等で、更に好ましくはメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
【００３３】
上記一般式１で表される本願発明の化合物において、好ましい例としては、Ｒ1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子又は低級アルキル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数であり、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換されていても良い低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であるものが例示できる。更に好ましい化合物として、Ｒ1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑは、ハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）又は酸素原子であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であるものが例示できる。そしてより好ましい化合物として、Ｒ1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）である化合物が例示できる。
【００３４】
上記具体的な一般式１の化合物のうちでも、Ｒ1がメチル基又はエチル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子；メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メチル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7はメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9はメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基を表す。）であるものが特に好ましい。
【００３５】
一般式１で示される化合物は、不斉炭素を含む化合物も含む。即ち、本願発明の一般式１で示される化合物は、光学活性体、ラセミ体、ジアステレオマー等の各種光学異性体の混合物及びそれらの単離されたものを含む。
【００３６】
また、一般式１の化合物にはアミン残基が存在するが、これらのアミン誘導体は酸付加体を形成する場合がある。その結果、一般式１で示される化合物は、そのような塩、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、燐酸等の鉱酸、蟻酸、酢酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸等との酸付加体塩を含むものである。また更には、一般式１で示される化合物は、各種水和物、溶媒和物や結晶多形の物質も含むものである。
【００３７】
次に、前記一般式１で表される化合物の製造方法について説明する。本願発明化合物は、種々の方法により製造できるが、以下の製造方法は例示であって、本願発明の製造方法を限定するものではない。なお、反応式中において、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を表すものである。
【００３８】
第１の製造法は、下記反応式１（式中、Ｒ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表す。Ａ1及びＤ1は、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。）によるものである。
【００３９】
前記一般式１の化合物（上記反応式１における化合物ＩＩ）は、化合物４と化合物５を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。化合物４は、化合物３と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することに製造することが出来る。化合物３は、化合物２を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物２は、相当するジヨード化合物と化合物１をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あるいは無溶媒で、室温ないし２００℃で、数分から３０時間反応することで製造することができる。
【００４０】
以上、反応式１の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４１】
【化２】
【００４２】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＩ）は、化合物９を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物９は、化合物７と化合物２を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにり製造することが出来る。化合物７は、化合物５と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あるいは無溶媒で、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。また、化合物９は、化合物１０と化合物５を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することによっても製造することが出来る。化合物１０は、化合物２と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。
【００４３】
以上、反応式２の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４４】
【化３】
【００４５】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＩ）は、化合物７と化合物３を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式３の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４６】
【化４】
【００４７】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＩＩ）は、化合物１４を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１４は、化合物１３と化合物１を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。
【００４８】
化合物１３は、４−メチルキノリンから化合物１２を経て既知の方法に準じて合成出来る。（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６４，１９９（１９４２））。
【００４９】
以上、反応式４の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５０】
【化５】
【００５１】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＶ）は、化合物１７を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１７は、化合物１６とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式５の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５２】
【化６】
【００５３】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＩＶ）は、化合物Ｖとアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式６の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５４】
【化７】
【００５５】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＶＩＩ）は、化合物１９を臭化水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１９は、化合物１８とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式７の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５６】
【化８】
【００５７】
前記一般式１の化合物（上記反応式２における化合物ＶＩＩ）は、化合物ＶＩとアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより製造することが出来る。以上、反応式８の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５８】
【化９】
【００５９】
一般式１で表わされる化合物は、励起波長帯が幅広いエチジウムブロマイド（フェニルフェナンスリジン）誘導体と、６６０ｎｍ付近に蛍光極大を持つチアゾール誘導体又は６３０nm付近に極大を持つオキサゾール誘導体をリンカーで結合した構造を有するものである。従って、該化合物に励起光を照射すると、まず、エチジウム誘導体が励起される。励起されたエネルギーは、いわゆる蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってチアゾール又はオキサゾール誘導体に移動する。そしてこの結果励起されたチアゾール又はオキサゾール誘導体が蛍光を発するのである。
【００６０】
エチジウムブロマイドは、５３５ｎｍ付近に極大吸収波長を持つ化合物であるが、その吸収スペクトルは、幅広いピークを示す。従って一般式１で表わされる化合物は、幅広い波長で励起することが可能である。チアゾール誘導体等が発する蛍光はシャープなピークを有するため、一般式１で表わされる化合物を励起した場合には、チアゾール誘導体等が発する該シャープなピークの蛍光が観察される。従って、一般式１で表される化合物を用いることにより、試料中に含まれると予想される核酸の有無又は量を測定することが可能となる。
【００６１】
例えば、一般式１の化合物は、二本鎖核酸と混合することにより、二本鎖核酸の相補鎖間にインターカレーションし、顕著な蛍光増感を示す（一般式１の化合物と二本鎖核酸との混合水溶液の蛍光は、一般式１のみの水溶液の蛍光強度と比較して顕著に大きい）。従って、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物が存在する試料中に添加するだけで、前記核酸の有無を知ることができる。また既知量の二本鎖核酸について比較試験を行えば、試料中に存在する前記核酸の量を定量することもできる。
【００６２】
また例えば、一般式１の化合物を、特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）と化学結合で結合して核酸プローブとすることができる。該核酸プローブでは、一般式１の化合物を、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとの相補結合部分にインターカレーション可能に結合することが特に好ましい。この核酸プローブは、前記一本鎖オリゴヌクレオチドと結合しているため、標的核酸に対する十分な特異性を有しており、しかも、試料中の標的核酸との相補結合部分に一般式１の化合物がインターカレーションし、その結果、顕著な蛍光増感を示すため、標的核酸と未結合の核酸プローブを除去する操作を行うことなく、密閉容器中で標的核酸を測定することが可能となる。なお、一般式１の化合物を、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとの相補結合部分にインターカレーション可能に結合する方法は特に限定されないが、オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）オリゴマー中のリン部分から適当なリンカーを介して化学結合させることが好ましい。ここで、リンカーについても特に限定されないが、例えば、アミノ基で修飾したＤＮＡオリゴマーに、公知の二架橋性リンカーであるＳＰＤＰ（Ｓ-ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐａｎｙｌ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を結合しておき、一方で一般式１の化合物には、ＳＨ基と反応性の官能基を結合した化合物を結合させておき、両者を反応させる等すればよい。
【００６３】
前記本願発明の核酸プローブは、標的ＲＮＡの増幅工程を行う際に反応液中に共存させることが可能である。従って、この核酸プローブを用いれば、標的ＲＮＡの増幅から測定までを、密閉容器中で、一段階で行うこと（最初に必要な試薬を容器中に投入することにより、後に試薬を加えたり、不要な試薬を除去する操作を行うことなく標的ＲＮＡの測定を行うこと）が可能である。ここで、増幅工程自体は、例えば特許第２６５０１５９号公報に記載されたもの、例えば欧州公開特許第３７３９６０号公報に記載されたもの、そして更には、例えば特開平８−２１１０５０号公報に記載されたものを採用することができる。
【００６４】
一般式１の化合物の蛍光スペクトルは、従来公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローの蛍光スペクトルと重なり合わない。このように、一般式１の化合物と、これとは蛍光スペクトルが重なり合わない従来公知のインターカレーター性蛍光色素を用いることにより、従来は困難であった二種類以上の標的ＲＮＡの測定等が可能になる。オキサゾールイエローは、４８８ｎｍに吸収極大、５１０ｎｍに蛍光極大を持つことが知られている。これに対して一般式１の化合物もまた４８８ｎｍで励起することが可能であるが、その蛍光は６６０ｎｍに極大を持つスペクトルとして観察され、両者の蛍光極大波長には１５０ｎｍの差があるために互いの蛍光スペクトルは重なり合わない。また一般式１の化合物とオキサゾールイエローの組み合わせでは、ともに４７０ｎｍ付近で励起することが出来るため、励起光源として、安価で、小型の発光ダイオード共用できるという利点もある。
【００６５】
上記した、一般式１の化合物と従来公知のインターカレーター性蛍光色素を使用する測定法は、両色素を一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）に結合した核酸プローブを用いるものである。具体的には、試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を同時に増幅する工程を、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定することからなる。ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせである。また具体的には、試料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試料に既知量の標準核酸（標準核酸は、標的ＲＮＡとは配列が異なる）を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に増幅する工程を、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測定した既知量の標準核酸について、同様の試薬を用いて同様の測定を行ったときの蛍光強度（増幅工程の進行に伴う蛍光強度の増大を示した増幅曲線）等と比較することからなる。ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせである。これら測定法は、血清、血漿、体液、尿、糞便、等の生物学的試料、更には食品、室内、土壌、河川水、海水等の環境中の微生物を含むと予想される試料や、これらから核酸成分を抽出した抽出試料について実施可能である。
【００６６】
増幅の方法は限定的ではないが、ＲＮＡを原料として、ＲＮＡを産生する反応が、概ね一定温度で進行する方法が好ましい。
【００６７】
前記したように、従来公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローは、一般式１の化合物と同一波長帯で励起可能で、かつ、蛍光波長が異なるため、前記測定法を実施するうえで好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。一般式１の化合物とオキサゾールイエローを組み合わせて使用する場合には、４５０から５００ｎｍの励起波長を用いれば、単一の励起光源で両者を同時に励起できるという利点もある。
【００６８】
前記測定法のうち、同時に二種類以上の標的核酸を測定する測定法では、例えば複数のウイルス、微生物等に由来する複数のＲＮＡ、一つのＲＮＡ上の複数の特定の配列を標的核酸とすることで、短時間のうちにこれらの有無や存在量を測定することが可能となる。また前記測定法のうち、試料に既知量の標準核酸を加え、標的核酸と標準核酸を同時に増幅し測定する前記測定法では、標的核酸が存在しているにもかかわらず、増幅反応が、例えば反応用酵素の失活、基質及びプライマー類の分解等の理由で進行しないために測定できないという、いわゆる偽陰性の問題を回避して、高い信頼性が要求される臨床診断に適用可能な測定法を提供することができる。なお標準核酸を試料に直接添加した後、該試料から核酸成分を抽出した抽出試料を増幅反応に供することにより、増幅反応の正否のみならず、抽出工程の正否及び効率を決定することも可能である。
【００６９】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を実施例により更に詳細に説明するが、これらの実施例は本願発明の一例であり、本願発明を限定するものではない。
【００７０】
実施例１
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式９に示す。
（１）反応式９中の化合物１の合成
３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン（１．２ｇ）の酢酸（７ｍｌ）溶液に、無水酢酸（３．３ｍｌ）を加え、１．５時間撹拌した。水（２６ｍｌ）を加えた後、氷冷下、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）を滴下した。生じた固体を減圧濾過後、水洗し乾燥した。得られた粗生成物を熱エタノールに溶かし、室温下放置した。生じた固体を濾過して、目的とする化合物１を０．７８ｇ得た。
【００７１】
なお化合物１は淡褐色固体であり、ＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７２】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
２．０５（ｂｓ、３Ｈ）、２．１３（ｂｓ、３Ｈ）、７．４２−７．９５（ｍ、６Ｈ）
８．１０−８．５０（ｍ、３Ｈ）、８．５５−８．８２（ｍ、２Ｈ）
１０．３０（ｂｓ、２Ｈ）
（２）反応式９中の化合物２の合成
得られた化合物１（５００ｍｇ）を１，３−ジヨードプロパン（１０ｍｌ）に懸濁し、１５５℃で６時間撹拌した。放冷後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物を熱メタノールに溶かし、室温下放置した。生じた固体を濾過して、目的とする化合物２を３２０ｍｇ得た。
【００７３】
なお化合物２は淡褐色固体であり、ＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７４】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．３６−２．４５（ｍ、２Ｈ）
３．２６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３（ｓ、３Ｈ）
４．６７（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７２−７．８２（ｍ、５Ｈ）
７．８８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．１２（ｄｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ）
８．４２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ）
８．９２（ｓ、１Ｈ）、９．０３（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
９．０９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、１０．５（ｓ、１Ｈ）、１０．８（ｓ、１Ｈ）
（３）反応式９中の化合物４の合成
まず、既知の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６４，１９９（１９４２））に準じて化合物３を合成した。化合物３（７４ｍｇ）のＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−１，３−プロパンジアミン（０．２ｍｌ）を加え、室温下１時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする化合物４を６０ｍｇ得た。
【００７５】
なお化合物４はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．４８−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１（ｍ、２Ｈ）、２．１１（ｓ、６Ｈ）
２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）
２．２８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）
３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．４７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）
６．４９（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．１１（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．５９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．８４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．９５（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．０９（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．１５（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．４７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
（４）一般式１の化合物（反応式９中の「化合物１」）の合成
化合物４（２０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に化合物２（２２ｍｇ）を加え、１３０℃で１時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮し、粗生成物５を得た。得られた粗生成物５を４７％臭化水素水に溶かし、１７０℃で１時間撹拌した。反応後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、目的とする一般式１の化合物を６ｍｇ得た。
【００７７】
なお一般式１の化合物（反応式９中の「化合物１」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００７８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．７９−１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１（ｍ、２Ｈ）
２．０５−２．１４（ｍ、２Ｈ）、２．１５（ｓ、３Ｈ）、２．２３−２．４２（ｍ、８Ｈ）
３．０４（ｓ、６Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．３５−４．４５（ｍ、２Ｈ）
４．５２−４．６０（ｍ、２Ｈ）、５．９１（ｓ、１Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ）
６．４２（ｄ、１Ｈ）、６．５４（ｓ、１Ｈ）、７．０４（ｄ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、１Ｈ）
７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５−８．１５（ｍ、１３Ｈ）
８．３２（ｄ、１Ｈ）、８．４２（ｄ、１Ｈ）、８．５４（ｄ、２Ｈ）
【００７９】
【化１０】
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式１０に示す。
（１）反応式１０中の化合物６の合成
前記化合物２（２０６ｍｇ）を４７％ＨＢｒ水溶液（６ｍｌ）に溶かし、１．５時間撹拌した。放冷後、減圧濃縮した。得られた粗生成物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に懸濁した後、生じた固体を濾過して、目的とする化合物６を２１５ｍｇ得た。
【００８０】
なお化合物６はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
２．３３−２．４３（ｍ、２Ｈ）、３．５６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）
４．５７（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．４６（ｓ、１Ｈ）
７．３８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５（ｓ、１Ｈ）
７．６２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．６８−７．７４（ｍ、２Ｈ）、７．７４−７．８０（ｍ、３Ｈ）
８．６８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
（２）反応式１０中の化合物７の合成
前記化合物３（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする化合物７を１２ｍｇ得た。
【００８２】
なお化合物７はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８３】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．６６−１．７６（ｍ、２Ｈ）、１．９９−２．０７（ｍ、２Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）
２．４１（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．４７（ｓ、３Ｈ）
２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｓ、３Ｈ）
４．５２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．５７（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．０１−７．０７（ｍ、２Ｈ）、７．１４（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）
７．３０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８−７．５５（ｍ、２Ｈ）
７．６２（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−７．７４（ｍ、２Ｈ）
７．８８（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．５５（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）
（３）一般式１の化合物（反応式１０中の「化合物２」）の合成
化合物７（１２ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（０．０７ｍｌ）及び化合物６（１４ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。
【００８４】
得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９７／３）で精製し、目的とする一般式１の化合物を４ｍｇ得た。
【００８５】
なお一般式１の化合物（反応式１０中の「化合物２」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３０−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８８（ｓ、３Ｈ）、１．９１−２．０１（ｍ、４Ｈ）
２．０７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）
２．１４（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）２．２８（ｔ、２Ｈ）
２．３３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．３１−４．３８（ｍ、２Ｈ）
４．５５（ｔ、２Ｈ）、５．９２（ｓ、１Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）
６．３６（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．０５（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．２３−７．３３（ｍ、３Ｈ）
７．４６−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．６３−７．７３（ｍ、４Ｈ）、７．８１（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）
７．９３（ｔ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．１０（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３５（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．４３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５３（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
８．５８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
【００８７】
【化１１】
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式１１に示す。
（１）反応式１１中の化合物８の合成
前記化合物６（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、目的とする化合物８を９ｍｇ得た。
【００８８】
なお化合物８はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３８（ｔ、２Ｈ）、１．８５−２．００（ｍ、５Ｈ）、２．１０−２．１８（ｍ、２Ｈ）
２．２０−２．３８（ｍ、７Ｈ）、４．４０（ｔ、２Ｈ）、５．９４（ｓ、１Ｈ）
６．２７（ｓ、１Ｈ）、６．４１（ｓ、１Ｈ）、７．２８−７．３６（ｍ、２Ｈ）
７．５１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−７．７８（ｍ、３Ｈ）
８．５９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）
（２）一般式１の化合物（反応式１１中の「化合物２」）の合成
化合物８（９ｍｇ）のＤＭＦ（１．２ｍｌ）溶液に、前記化合物３（１０ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物５をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９７／３）で精製し、目的とする一般式１の化合物（反応式１１中の「化合物２」）を５ｍｇ得た。
【００９０】
【化１２】
以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この反応工程を下記反応式１２に示す。
（１）反応式１２中の化合物１０の合成
Ｎ−メチル−１，３−プロパンジアミン（２ｇ）と二炭酸ジ−ｔ−ブチル（１．１ｇ）をメタノール（１６ｍｌ）に溶解し、室温下１時間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより目的とする化合物１０を１４０ｍｇ得た。
【００９１】
なお化合物１０はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｐｐｍ）
１．４４（ｓ、９Ｈ）、１．７０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）２．４４（ｓ、３Ｈ）
２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１７−３．２４（ｍ、２Ｈ）
３．１７−３．２４（ｍ、２Ｈ）、３．４２（ｂｓ、１Ｈ）、５．０８（ｂｓ、１Ｈ）
（２）反応式１２中の化合物１１の合成
得られた化合物１０（１４０ｍｇ）と前記化合物６（４０ｍｇ）をＤＭＦ（１．８ｍｌ）に溶解し、室温下３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製することにより目的とする化合物１１を２９ｍｇ得た。
【００９３】
なお化合物１１はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３４−１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．９０（ｓ、３Ｈ）、１．９１−１．９８（ｍ、２Ｈ）
２．１０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２８（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）
２．８３（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６（ｂｓ、１Ｈ）
４．３７−４．４５（ｍ、２Ｈ）、５．９３（ｓ、１Ｈ）、６．２７（ｓ、１Ｈ）
６．４０（ｓ、１Ｈ）、７．３０−７．３８（ｍ、２Ｈ）
７．５２（ｄｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、３Ｈ）
８．５９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．６５（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）
（３）反応式１２中の化合物１２の合成
得られた化合物１１（２９ｍｇ）をメタノール（２ｍｌ）に溶かし、４７％ＨＢｒ水溶液（１ｍｌ）を加えた。室温下１時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする化合物１２を１５ｍｇ得た。
【００９５】
なお化合物１２はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．２９−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８０−２．０１（ｍ、４Ｈ）
２．１３（ｔ、２Ｈ）、２．２２−２．３５（ｍ、５Ｈ）
４．３５−４．４８（ｍ、２Ｈ）、５．９４（ｓ、１Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）
６．４３（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３５（ｍ、２Ｈ）
７．４８−７．５２（ｍ、１Ｈ）、７．６８−７．８０（ｍ、３Ｈ）
８．５７−８．６７（ｍ、２Ｈ）
（４）一般式１の化合物（反応式１２中の「化合物３」）の合成
化合物１２（１５ｍｇ）及び前記化合物３（１９ｍｇ）を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶かし、室温下で２３時間反応した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、目的とする一般式１の化合物３を６ｍｇ得た。
【００９７】
なお一般式１の化合物（反応式１２中の「化合物３」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【００９８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．３８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８３−２．０５（ｍ、９Ｈ）
２．１１（ｔ、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２４−２．３３（ｍ、２Ｈ）
２．３６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）
４．３１−４．４１（ｍ、２Ｈ）、４．６０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）
５．９４（ｓ、１Ｈ）、６．２３（ｓ、１Ｈ）、６．３８（ｓ、１Ｈ）
６．４６（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．０９（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）
７．２４−７．３６（ｍ、３Ｈ）、７．４４−７．５４（ｍ、２Ｈ）
７．５６−７．７７（ｍ、７Ｈ）、７．８０−７．８６（ｍ、１Ｈ）
７．９２（ｔ、１Ｈ）、８．０６−８．１４（ｍ、１Ｈ）
８．３８（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５（ｄ、１Ｈ）
８．５６（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
【００９９】
【化１３】
実施例１で合成した一般式１の化合物（反応式９における「化合物１」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行った。用いた二本鎖核酸の核酸配列は、ｄＴ３０ｍｅｒが配列番号１、ｄＡ３０ｍｅｒが配列番号２に記載した通りのものである。
【０１００】
一般式１の化合物（反応式９における「化合物１」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４８８nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、２．５であった。
【０１０１】
次に、一般式１の化合物（反応式９における「化合物１」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、それぞれ５３．６４及び１０４．７であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。図1に測定された蛍光スペクトルを示す。
【０１０２】
実施例６ 二本鎖核酸の検出２
実施例２で合成した一般式１の化合物（反応式１０における「化合物２」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行った。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と同一である。
【０１０３】
一般式１の化合物（反応式１０における「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５ＭＥＤＴＡ（０．３μＭ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４８８8nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、３．５であった。
【０１０４】
次に、一般式１の化合物（反応式１０における「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏｌをＨ2Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定したところ、それぞれ、３８．３及び７６．０であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。図２に測定された蛍光スペクトルを示す。
【０１０５】
実施例７
以下に示す方法で、一般式１の化合物を合成した。この反応を下記反応式１３に示す。
（１）化合物（１３）の合成
化合物（１）（０．２０ｇ）とジヨードヘキサン（１．８ｍｌ）をニトロベンゼン１．８ｍｌに懸濁し、１６０℃２．５時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを添加し、析出した固体を熱メタノールに溶かし、エーテルを加え、氷冷下放置した。生じた固体をろ過して、目的とする化合物（１３ａ）を０．１７１ｇ得た。得られた化合物（１３ａ）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【０１０６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２４（ｍ、２Ｈ）１．６２（ｍ、２Ｈ）、
１．９２（ｍ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、
３．１９（ｔ、２Ｈ）、４．５４（ｍ、２Ｈ）、７．７−９．２（ｍ、１３Ｈ）、
１０．５２（ｓ、１Ｈ）、１０．８０（ｓ、１Ｈ）。
【０１０７】
同様に、化合物（１）（０．１０ｇ）とジヨードヘプタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１３ｂ）を０．１１３ｇ、化合物（１）（０．１ｇ）とジヨードオクタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１３ｃ）を０．１３９ｇ得た。
（２）化合物（１４）の合成
得られた化合物（１３ａ）（１１７ｍｇ）と３−アミノプロパノール（０．１６ｍｌ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、１２０℃ ３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９０／１０）で精製することにより目的とする化合物（１４ａ）を１２８ｍｇ得た。得られた化合物（１４ａ）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示した。
【０１０８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δｐｐｍ）
１．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２５（ｍ、２Ｈ）、１．５５（ｍ、２Ｈ）、
１．７７（ｍ、２Ｈ）、１．９２（ｍ、２Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）、
２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．７５−３．００（ｍ、４Ｈ）、
３．４８（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、２Ｈ）、
７．６０−９．２０（ｍ、１３Ｈ）、１０．６２（ｓ、１Ｈ）、
１１．１９（ｓ、１Ｈ）。
【０１０９】
同様に、化合物（１３ｂ） （１１３ｍｇ）から、目的とする化合物（１４ｂ）を４０ｍｇ、化合物（１３ｃ）（１３９ｍｇ）から、目的とする化合物（１４ｃ）を５６ｍｇ得た。
（３）化合物（１５）の合成
得られた化合物（１４ａ）（１２８ｍｇ）と１当量の化合物（３）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶かし、１３０℃２．５時間加熱した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒酢酸エチル／酢酸／水＝６０／３０／２０）で精製することにより目的とする化合物（１５ａ）を３５ｍｇ得た。
【０１１０】
同様に、化合物（１４ｂ）（４０ｍｇ）から、目的とする化合物（１５ｂ）を７ｍｇ、化合物（１４ｃ）から、目的とする化合物（１５ｃ）を８ｍｇ得た。
（４）化合物（１６）の合成
得られた化合物（１５ａ）に４８％ＨＢｒ水溶液（１．５ｍｌ）を加えた。１４５℃、１時間撹拌した後、減圧濃縮した。エタノールで共沸し、残さ（化合物（１６ａ）；１．４ｍｇ）を得た。
【０１１１】
同様に、化合物（１５ｂ）から、化合物（１６ｂ） を含む残さ ８ｍｇ、化合物（１５ｃ）から、化合物（１６ｃ）を含む残さ ８ｍｇを得た。
【０１１２】
【化１４】
以下に示す方法で、本発明の核酸プローブを合成した。この反応を下記反応式１４に示す。
【０１１３】
ＤＮＡオリゴマー（化合物（１７））（３７ｎｍｏｌ）を蒸留水 １００μｌ、ＤＭＦ ３００μｌ に溶解し、ジチオスレイトールのＤＭＦ溶液（１Ｍ）４０μｌを添加した。１時間後、反応液１３３μｌを採取し、化合物（１６ｃ）のＤＭＦ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ及び、トリエチルアミン１１０μｌを添加した。反応液を室温下一晩静置した後、減圧濃縮した。残さをｎ―ブタノール−水で分配した。水層をブタノール濃縮した後、エタノールを添加し、−７８℃で３０分静置した。析出した固体を遠心分離により集めた。得られた沈殿をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、東ソー製）により精製し、目的の化合物（１８）を０．９４ｎｍｏｌ得た。
【０１１４】
【化１５】
実施例７で合成した一般式１の化合物（反応式１３における化合物（１６ｃ））を用いて、二本鎖核酸の検出を行った。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と同じである。
（１）一般式１の化合物（反応式１３における化合物（１６ｃ））の２５μＭ溶液 ６０μｌに、×２０ ＳＳＣ（３０μｌ）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１．２μｌ）及び、蒸留水（４８４．８μｌ）を加えた。
（２）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ＴＥ バッファー ６μｌを添加した。
（３）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ｄＴ３０ｍｅｒの１２．５μＭ溶液３μｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの１２．５μｌ溶液３μｌを添加した。
（４）（２）及び（３）の反応液を７５℃で３０分インキュベートした後、室温まで放冷した。
（５）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を室温下で測定した。
【０１１５】
図３に測定された蛍光スペクトルを示す。（２）の反応液の蛍光波長６５４ｎｍにおける蛍光強度（図中の（１））は５．７９であり、（３）の反応液の蛍光強度（図中の（２））は、５８．２６であった。２本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。
【０１１６】
実施例１０
実施例８で合成した本発明の核酸プローブ（反応式１４における化合物（１８））を用いて、標的核酸（ＤＮＡ）の検出を行った。プローブの核酸配列は、配列番号３、標的核酸の核酸配列は、配列番号４に記載したとおりのものである。
（１）本発明の核酸プローブ（反応式１４における化合物（１８））の２．５μＭ 溶液 １０μＭ溶液 ３１．５μｌに、蒸留水 ２６０．８μｌ、２０× ＳＳＣ １５．８μｌ、及び、０．５μＭ ＥＤＴＡ ０．６μｌを添加した。
（２）（１）の反応液を１４７μｌ 採取し、ＴＥバッファー ３μｌ添加した。
（３）（１）の反応液を１４７μｌ 採取し、標的核酸の５０μＭ 溶液 ３μｌを添加した。
（４）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を４１℃で測定した。
【０１１７】
図４に測定された蛍光スペクトルを示す。（２）の反応液の６５６ｎｍにおける蛍光強度（図中の（１））は、１．８であり、（３）の反応液の蛍光強度（図中の（２））は、５．７であった。標的核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認された。
【０１１８】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本願発明によれば、従来知られていないインターカレーター性蛍光色素であって、核酸検出において二本鎖核酸にインターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差が大きい（すなわちストークスシフトの大きい）新規な化合物が提供される。この化合物は、二本鎖核酸と接触させたり、一本鎖オリゴヌクレオチドと結合して核酸プローブとすることにより、従来から実施されている核酸の測定に供することが可能である。
【０１１９】
特に本願発明の化合物を適当なリンカーを介して一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した核酸プローブ等では、特定の配列を有する核酸と該一本鎖オリゴヌクレオチドが相補結合を形成した場合にのみ蛍光増感が起こるため、未結合の核酸プローブを分離する操作を行う必要がなく、従って均一系での簡便な一段階の操作による核酸測定方法を実施することができる。
【０１２０】
また本願発明の化合物は、従来公知のインターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが重なり合わないという特徴を有する。このため、本願発明の化合物と従来から知られているインターカレーター性蛍光色素を用いて製造した２種類以上の核酸プローブを用いることにより、試料の中に含まれる二種以上の標的核酸を増幅し、分離操作を行うことなしに、増幅産物を密閉容器内で測定する方法、即ち二種類以上の標的核酸の同時測定等を可能とする測定法を提供することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例5における化合物１の蛍光スペクトルである。図中（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４８８ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８８ｎｍでの結果である。
【図２】実施例６における化合物２の蛍光スペクトルである。図中、（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４８８ ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８８ｎｍでの結果である。
【図３】実施例９における化合物（１６ｃ）（２．５μＭ）の蛍光スペクトルである。図中（１）は、二本鎖核酸なし、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．２５μＭ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．２５μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果である。
【図４】実施例１０における化合物（１８）（１μＭ）の蛍光スペクトルである。図中（１）は、標的核酸なし、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）は、標的核酸（１μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel fluorescent dye, a method for producing the same, a nucleic acid probe in which the dye is bound by a chemical bond, and a method for measuring a nucleic acid using the same. The present invention specifically relates to a novel fluorescent dye having a large Stokes shift and a significant increase in fluorescence intensity in the presence of double-stranded nucleic acid, a method for producing the same, a nucleic acid probe in which the dye is bound by a chemical bond, and use of the same It is related with the measuring method of the nucleic acid characterized by these.
[0002]
The measurement method of the present invention relates to a method for qualitative or quantitative analysis of a target RNA containing a specific base sequence, which is expected to be contained in a gene mixture such as DNA or RNA. In addition, it is a measurement method useful for qualitative or quantitative determination of microorganisms in the environment such as in food, indoors, soil, rivers, and the ocean.
[0003]
[Prior art]
In general, analysis of biological components requires high specificity and sensitivity. Analysis of a nucleic acid containing a specific base sequence (target nucleic acid) utilizes the property that the nucleic acid forms a complex in a sequence-specific manner with a nucleic acid (nucleic acid probe) having a sequence complementary to the specific base sequence.
[0004]
For quantification of a target nucleic acid having a specific base sequence, a means for obtaining a measurable signal related to the amount of the complex formed is important. Further, for the purpose of clinical diagnosis, a target that may be present in a sample Since the amount of nucleic acid is extremely small, the means requires a step of amplifying a very small amount of nucleic acid.
[0005]
Especially in the diagnosis of viral infections, the target nucleic acid (viral nucleic acid) in clinical reagents is often very small, so the signal intensity is improved and the sensitivity is increased in order to achieve high sensitivity and good reproducibility. For this purpose, attempts have been made to amplify the target nucleic acid by the polymerase chain reaction (PCR) method or the like. In addition, as an RNA amplification method, a method called NASBA method (for example, see Japanese Patent No. 2650159) or 3SR method (for example, see European Patent No. 373960) is also known.
[0006]
A nucleic acid probe having a nucleic acid sequence complementary to a specific base sequence of a target nucleic acid and labeled with an intercalating fluorescent dye so as to emit a measurable fluorescent signal when bound to the target nucleic acid (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-211050) (See the publication) emits a fluorescent signal that can be measured by forming a complementary bond with a target nucleic acid, and therefore enables the presence or absence of complementary bond formation and the quantification of complementary conjugates, but not complementary bonds. Since it is not necessary to separate the probe from the reaction system, there is no need to take out the amplified sample from the reaction container, and there is an advantage that false positives derived from scattering of amplification products are not caused.
[0007]
The target RNA is amplified and analyzed under constant temperature conditions by performing the process of amplifying RNA consisting of a specific base sequence at a constant temperature by the action of the nucleic acid primer and nucleic acid polymerase in the presence of the nucleic acid probe. In addition, a method has been developed which does not use a carrier and performs the process under sealed conditions. (See Japanese Patent Application No. 2000-14400).
[0008]
An intercalating fluorescent dye is a substance that intercalates into a double-stranded nucleic acid and changes its fluorescence characteristics from the free state due to the intercalation. Known compounds having such properties include ethidium bromide, oxazole yellow, and thiazole orange. Furthermore, it is known that ethidium dimer, YOYO, and the like obtained by dimerizing these compounds with a linker are intercalated into a double-stranded nucleic acid and exhibit fluorescence sensitization. Therefore, if multiple nucleic acids can be amplified simultaneously using two or more types of intercalating fluorescent dyes that cause a change in distinguishable fluorescence characteristics, and amplification products can be measured simultaneously, there are many industrially significant uses. It is done. For example, by detecting multiple target nucleic acids contained in one sample at the same time or amplifying a known amount of standard nucleic acid simultaneously with the target nucleic acid, it is possible to determine whether the amplification reaction is correct or not, or to quantify the target nucleic acid. Can be exemplified.
[0009]
However, the types of intercalating fluorescent dyes are limited, and the fluorescence emitted from them is observed as a spectrum with a width centered on the maximum wavelength, and the fluorescence quantum yield is generally It depends on. Therefore, it is difficult to accurately measure the fluorescence intensity at a specific wavelength with intercalating fluorescent dyes whose fluorescence spectra overlap each other. Lasers and light-emitting diodes can be used as the light source for exciting the intercalating fluorescent dye. However, there are also restrictions on the type of light source, and when considering the optimal combination of excitation light sources, the fluorescence spectrum It was very difficult to select two or more types of intercalating fluorescent dyes that do not overlap each other. For example, in the case of cyanine dyes such as oxazole yellow and thiazole orange, which are known intercalator fluorescent dyes, the difference between the two fluorescence maximum wavelengths must be about 100 nm or more so that the two fluorescence spectra do not overlap. The difference between the fluorescence maximum wavelength and the excitation maximum wavelength of the cyanine-based fluorescent material is about 20 to 40 nm, and in order to excite both so that fluorescence measurement is possible, two excitation light sources are required, This is a limitation in carrying out the measurement.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The first object of the present invention is to provide a novel intercalator having a large fluorescence sensitization when intercalated into a double-stranded nucleic acid in nucleic acid detection, and a large difference between the excitation wavelength and the fluorescence wavelength (ie, a large Stokes shift). An object of the present invention is to provide a compound having a characteristic that the fluorescence spectrum does not overlap with a conventionally known intercalator fluorescent dye. A second object of the present invention is to provide a novel nucleic acid probe in which the fluorescent dye is bound by a chemical bond. A third object of the present invention is a nucleic acid measurement method (qualitative and quantitative method) using the nucleic acid probe, which amplifies one or more target nucleic acids contained in a sample and performs a separation operation. Without the need to provide a method for measuring the amplification product in a sealed container, enabling measurement of the presence or absence of target nucleic acid and its amount with high accuracy, particularly simultaneous measurement of two or more types of target nucleic acids. It is to provide a measurement method.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
It is widely known that when one of two adjacent compounds satisfying a specific condition is excited, energy transfer occurs in the other, and the compound (acceptor) that receives the energy emits fluorescence. The inventors of the present application have conducted research on substances that cause this energy transfer efficiently in the molecule, and have a large fluorescence sensitization when intercalating into a nucleic acid duplex in nucleic acid detection. A new fluorescent dye having a large difference, that is, a large Stoke shift has been found. Thus, the invention of
[0012]
The invention of
[0013]
The invention of
[0014]
The invention of claim 5 of the present application provides a chemical bond between a single-stranded oligonucleotide having a nucleic acid sequence complementary to a specific nucleic acid sequence in a nucleic acid having a specific nucleic acid sequence (target nucleic acid) and the compound represented by the
[0015]
The invention of claim 9 of the present application is a method for measuring a nucleic acid (target nucleic acid) having at least one specific nucleic acid sequence contained in a sample, wherein the nucleic acid probe of claim 6 is used. .
[0016]
The invention of claim 10 of the present application is a method for measuring RNA (target RNA) having two or more kinds of specific nucleic acid sequences contained in a sample, comprising the step of simultaneously amplifying two or more kinds of target RNA, The RNA amplification step is caused in the presence of a probe labeled with a different intercalating fluorescent dye having a sequence complementary to each amplification product, and the intercalating property of the complementary binding portion formed by the amplification product and the probe. A step of measuring the fluorescence intensity changed by the intercalation of the fluorescent dye, wherein the intercalator fluorescent dye is different in fluorescence wavelength from the compound represented by the
[0017]
The invention of claim 12 of the present application relates to the invention of claim 10 or 11, characterized in that at least one of the other intercalating fluorescent dyes is oxazole yellow. The invention of claim 13 relates to the invention of claim 12, characterized in that the excitation wavelength of the intercalating fluorescent dye in the measurement is 450 to 500 nm. Hereinafter, each invention of the present application will be described in detail. In the present specification, unless otherwise specified, the term “lower” means a straight chain or branched carbon chain having 1 to 6 carbon atoms.
[0018]
In the
[0019]
To specifically describe the compound of the present invention represented by the general formula 1 (aromatic compound derivative, salt, hydrate, solvate or stereoisomer thereof), it is used in the
[0020]
R 1 Represents a lower alkyl group. Such an alkyl group is preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, or a propyl group, and more preferably a methyl group or an ethyl group. Among them, the methyl group is R 1 As the most preferred lower alkyl group.
[0021]
A and D are the same or different and have the formula: -CHR 2 A group represented by-(wherein R 2 Represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ), Formula: -NR Three A group represented by-(wherein R Three Represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ), Formula: -N + R Four R Five ・ Q - A group represented by-(wherein R Four And R Five Are the same or different and represent a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. Q is a halogen atom, formula: R 6 A group represented by COO (wherein R 6 Represents a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: R 7 SO Three A group represented by the formula: 7 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ). ), An oxygen atom or a sulfur atom. A and D are preferably the same or different and have the formula -NR Three A group represented by-(wherein R Three Represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ), Formula: -N + R Four R Five ・ Q - A group represented by-(wherein R Four And R Five Are the same or different and represent a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. Q is a halogen atom, formula: R 6 A group represented by COO (wherein R 6 Represents a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: R 7 SO Three A group represented by the formula: 7 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ). Or an oxygen atom. A and D are more preferably the same or different and have the formula: —NR Three A group represented by-(wherein R Three Represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: -N + R Four R Five ・ Q - A group represented by-(wherein R Four And R Five Are the same or different and represent a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. Q is a halogen atom, formula: R 6 A group represented by COO (wherein R 6 Represents a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: R 7 SO Three A group represented by the formula: 7 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ). ).
[0022]
Q is a halogen atom, the formula: R 6 A group represented by COO (wherein R 6 Represents a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: R 7 SO Three A group represented by the formula: 7 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ), Preferably a halogen atom or the formula: R 7 SO Three A group represented by the formula: 7 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. However, it is most preferably a halogen atom.
[0023]
L, m and n are the same or different and represent an integer of 2 to 5, preferably the same or different and an integer of 2 to 4, particularly preferably the same or different, 2 or 3.
[0024]
R 2 Is a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom, preferably a hydrogen atom or a lower alkyl group, particularly preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group. Of these, a hydrogen atom is most preferable.
[0025]
R Three Is a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom, preferably a hydrogen atom; a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a 2-iodoethyl group, a 3-iodopropyl group, 4 -Iodobutyl group, 5-iodopentyl group, 6-iodohexyl group, 2-bromoethyl group, 3-bromopropyl group, 4-bromobutyl group, 5-bromopentyl group, 6-bromohexyl group, 2-chloroethyl group, 3 -A lower alkyl group substituted with a halogen atom such as a chloropropyl group, a 4-chlorobutyl group, a 5-chloropentyl group, or a 6-chlorohexyl group. R Three Is more preferably a hydrogen atom; an iodo atom such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, or a 2-iodoethyl group, a 3-iodopropyl group, a 4-iodobutyl group, a 5-iodopentyl group, or a 6-iodohexyl group. A lower alkyl group substituted with or the like. Among these, a hydrogen atom or a methyl group, an ethyl group; 2-iodoethyl group, 3-iodopropyl group, 4-iodobutyl group, 5-iodopentyl group, and 6-iodohexyl group are most preferable.
[0026]
R Four And R Five Are the same or different, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. R Four And R Five Are preferably the same or different and are methyl group, ethyl group, propyl group; 2-iodoethyl group, 3-iodopropyl group, 4-iodobutyl group, 5-iodopentyl group, 6-iodohexyl group, 2- Bromoethyl group, 3-bromopropyl group, 4-bromobutyl group, 5-bromopentyl group, 6-bromohexyl group, 2-chloroethyl group, 3-chloropropyl group, 4-chlorobutyl group, 5-chloropentyl group, 6- And a chlorohexyl group. R Four And R Five Are more preferably the same or different, such as methyl group, ethyl group, propyl group; 2-iodoethyl group, 3-iodopropyl group, 4-iodobutyl group, 5-iodopentyl group, 6-iodohexyl group, etc. is there. R Four And R Five Are the same or different and are most preferably a methyl group, an ethyl group; a 2-iodoethyl group, a 3-iodopropyl group, a 4-iodobutyl group, a 5-iodopentyl group, or a 6-iodohexyl group.
[0027]
R 6 Is a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group; a fluoromethyl group, a difluoromethyl group, a trifluoromethyl group, a chloromethyl group, a dichloromethyl group, A trichloromethyl group and the like, more preferably a methyl group, a trifluoromethyl group, and a trichloromethyl group.
[0028]
R 7 Is a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group; a fluoromethyl group, a difluoromethyl group Trifluoromethyl group, chloromethyl group, dichloromethyl group, trichloromethyl group, phenyl group, p-methylphenyl group, etc., more preferably methyl group; trifluoromethyl group, trichloromethyl group; phenyl group, p- It is a methylphenyl group.
[0029]
Z is an oxygen atom or a sulfur atom, preferably a sulfur atom.
[0030]
X 1 And X 2 Are the same or different and are a halogen atom, the formula: R 8 A group represented by COO (wherein R 8 Represents a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: R 9 SO Three A group represented by the formula: 9 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ). X 1 And X 2 Are preferably the same or different, a halogen atom or the formula: R 9 SO Three A group represented by the formula: 9 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ). X 1 And X 2 Are more preferably the same or different and are halogen atoms.
[0031]
R 8 Is a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group; a fluoromethyl group, a difluoromethyl group, a trifluoromethyl group, a chloromethyl group, a dichloromethyl group, A trichloromethyl group and the like, more preferably a methyl group, a trifluoromethyl group, and a trichloromethyl group.
[0032]
R 9 Is a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group; a fluoromethyl group, a difluoromethyl group, Trifluoromethyl group, chloromethyl group, dichloromethyl group, trichloromethyl group; phenyl group, p-methylphenyl group, etc., more preferably methyl group; trifluoromethyl group, trichloromethyl group; phenyl group, p-methylphenyl It is a group.
[0033]
In the compound of the present invention represented by the above
[0034]
Among the above specific compounds of the
[0035]
The compound represented by the
[0036]
Moreover, although the amine residue exists in the compound of
[0037]
Next, the manufacturing method of the compound represented by the said
[0038]
The first production method is represented by the following reaction formula 1 (wherein R 1 , Z, X 1 , X 2 , L, m, and n have the same meaning as described above. A 1 And D 1 Are the same or different and have the formula: -NR Three A group represented by-(wherein R Three Represents a hydrogen atom, a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ), Formula: -N + R Four R Five ・ Q - A group represented by-(wherein R Four And R Five Are the same or different and represent a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. Q is a halogen atom, formula: R 6 A group represented by COO (wherein R 6 Represents a lower alkyl group or a lower alkyl group substituted with a halogen atom. ) Or formula: R 7 SO Three A group represented by the formula: 7 Represents a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen atom, or a phenyl group optionally substituted with a lower alkyl group. ). ), An oxygen atom or a sulfur atom. ).
[0039]
The compound of the general formula 1 (compound II in the above reaction scheme 1) is obtained by combining the compound 4 and the compound 5 in a polar solvent such as DMF (dimethylformamide), DMSO (dimethyl sulfoxide) or methanol in the presence or absence of a base. It can be produced by reacting at 0 ° C. to 150 ° C. for several minutes to 30 hours. Compound 4 reacts
[0040]
As mentioned above, examples of the base used in the production method of
[0041]
[Chemical formula 2]
[0042]
The compound of the general formula 1 (compound II in the above reaction formula 2) can be synthesized by heating the compound 9 with an acid such as hydrogen bromide or hydrogen chloride. Compound 9 is a reaction of compound 7 and
[0043]
As mentioned above, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, triethylamine, pyridine, ethyldiisopropylamine, sodium hydride and the like can be exemplified as the base used in the production method of
[0044]
[Chemical 3]
[0045]
The compound of the above general formula 1 (compound II in the above reaction formula 2) is obtained by combining the compound 7 and the
[0046]
[Formula 4]
[0047]
The compound of the general formula 1 (compound III in the above reaction scheme 2) can be synthesized by heating the compound 14 with an acid such as hydrogen bromide or hydrogen chloride. Compound 14 is obtained by reacting compound 13 and
[0048]
Compound 13 can be synthesized from 4-methylquinoline via compound 12 according to a known method. (J. Am. Chem. Soc., 64, 199 (1942)).
[0049]
As mentioned above, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, triethylamine, pyridine, ethyldiisopropylamine, sodium hydride and the like can be exemplified as the base used in the production method of Reaction Scheme 4. I can do it.
[0050]
[Chemical formula 5]
[0051]
The compound of the general formula 1 (compound IV in the above reaction formula 2) can be synthesized by heating the compound 17 with an acid such as hydrogen bromide or hydrogen chloride. Compound 17 comprises compound 16 and alkylating agent 20 in a polar solvent such as DMF (dimethylformamide), DMSO (dimethyl sulfoxide) or methanol in the presence or absence of a base at 0 ° C. to 150 ° C. for several minutes to 30 It can be produced by reacting for a time. As mentioned above, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, triethylamine, pyridine, ethyldiisopropylamine, sodium hydride and the like can be exemplified as the base used in the production method of Reaction Scheme 5. I can do it.
[0052]
[Chemical 6]
[0053]
The compound of the general formula 1 (compound IV in the above reaction formula 2) is obtained by reacting the compound V and the alkylating agent 20 in a polar solvent such as DMF (dimethylformamide), DMSO (dimethylsulfoxide) or methanol in the presence of a base or non- It can be produced by reacting at 0 ° C. to 150 ° C. for several minutes to 30 hours in the presence. As mentioned above, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, triethylamine, pyridine, ethyldiisopropylamine, sodium hydride and the like can be exemplified as the base used in the production method of reaction formula 6. I can do it.
[0054]
[Chemical 7]
[0055]
The compound of the general formula 1 (compound VII in the above reaction formula 2) can be synthesized by heating the compound 19 with an acid such as hydrogen bromide or hydrogen chloride. Compound 19 comprises compound 18 and alkylating agent 20 in a polar solvent such as DMF (dimethylformamide), DMSO (dimethylsulfoxide) or methanol in the presence or absence of a base at 0 ° C. to 150 ° C. for several minutes to 30 hours. It can be produced by reacting. As mentioned above, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, triethylamine, pyridine, ethyldiisopropylamine, sodium hydride and the like can be exemplified as the base used in the production method of reaction formula 7. I can do it.
[0056]
[Chemical 8]
[0057]
The compound of the general formula 1 (compound VII in the above reaction scheme 2) is obtained by reacting the compound VI and the alkylating agent 20 in a polar solvent such as DMF (dimethylformamide), DMSO (dimethyl sulfoxide) or methanol in the presence of a base or non- It can be produced by reacting in the presence at 0 ° C. to 150 ° C. for several minutes to 30 hours. As mentioned above, sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, triethylamine, pyridine, ethyldiisopropylamine, sodium hydride and the like can be exemplified as the base used in the production method of reaction formula 8. I can do it.
[0058]
[Chemical 9]
[0059]
The compound represented by the
[0060]
Ethidium bromide is a compound having a maximum absorption wavelength near 535 nm, but its absorption spectrum shows a broad peak. Therefore, the compound represented by the
[0061]
For example, when the compound of the
[0062]
In addition, for example, the compound of the
[0063]
The nucleic acid probe of the present invention can coexist in the reaction solution when performing the target RNA amplification step. Therefore, with this nucleic acid probe, target RNA amplification and measurement can be performed in a single step in a sealed container (by adding the necessary reagents to the container first, adding reagents later or unnecessary) It is possible to measure the target RNA without performing an operation to remove a simple reagent). Here, the amplification step itself is described in, for example, Japanese Patent No. 2650159, for example, European Patent No. 373960, and further described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-211050. Things can be adopted.
[0064]
The fluorescence spectrum of the compound of
[0065]
The above-described measurement method using the compound of the
[0066]
The amplification method is not limited, but a method in which the reaction for producing RNA using RNA as a raw material proceeds at a substantially constant temperature is preferable.
[0067]
As described above, oxazole yellow, which is a conventionally known intercalator fluorescent dye, can be excited in the same wavelength band as the compound of
[0068]
Among the above-mentioned measurement methods, in the measurement method for measuring two or more types of target nucleic acids at the same time, for example, a plurality of RNAs derived from a plurality of viruses, microorganisms, etc., a plurality of specific sequences on one RNA are used as target nucleic acids. Thus, it is possible to measure the presence or absence and the abundance of these in a short time. In the measurement method, a known amount of a standard nucleic acid is added to a sample, and the target nucleic acid and the standard nucleic acid are simultaneously amplified and measured. Measurement method applicable to clinical diagnosis that requires high reliability by avoiding the so-called false negative problem that measurement cannot be performed due to inactivation of reaction enzyme, decomposition of substrate and primers, etc. Can be provided. In addition, after adding the standard nucleic acid directly to the sample, it is possible to determine not only the correctness of the amplification reaction but also the correctness and efficiency of the extraction process by subjecting the extracted sample obtained by extracting the nucleic acid component from the sample to the amplification reaction. is there.
[0069]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, these Examples are examples of this invention, and do not limit this invention.
[0070]
Example 1
The compound of the
(1) Synthesis of
Acetic anhydride (3.3 ml) was added to a solution of 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (1.2 g) in acetic acid (7 ml) and stirred for 1.5 hours. Water (26 ml) was added, and 28% aqueous ammonia (20 ml) was added dropwise under ice cooling. The resulting solid was filtered under reduced pressure, washed with water and dried. The obtained crude product was dissolved in hot ethanol and allowed to stand at room temperature. The resulting solid was filtered to obtain 0.78 g of the
[0071]
[0072]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
2.05 (bs, 3H), 2.13 (bs, 3H), 7.42-7.95 (m, 6H)
8.10-8.50 (m, 3H), 8.55-8.82 (m, 2H)
10.30 (bs, 2H)
(2) Synthesis of
The obtained compound 1 (500 mg) was suspended in 1,3-diiodopropane (10 ml) and stirred at 155 ° C. for 6 hours. After cooling, the solution was concentrated under reduced pressure using a vacuum pump. The obtained crude product was dissolved in hot methanol and allowed to stand at room temperature. The resulting solid was filtered to obtain 320 mg of the intended
[0073]
[0074]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
2.02 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.36-2.45 (m, 2H)
3.26 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.33 (s, 3H)
4.67 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 7.72-7.82 (m, 5H)
7.88 (d, J = 2.0Hz, 1H)
8.12 (dd, J = 1.5 Hz, 9.0 Hz, 1H)
8.42 (dd, J = 2.0 Hz, 9.0 Hz, 1H)
8.92 (s, 1H), 9.03 (d, J = 9.0 Hz, 1H)
9.09 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 10.5 (s, 1H), 10.8 (s, 1H)
(3) Synthesis of Compound 4 in Reaction Formula 9
First,
[0075]
Compound 4 exhibited the following characteristics in NMR measurement.
[0076]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.48-1.55 (m, 2H), 1.92-2.01 (m, 2H), 2.11 (s, 6H)
2.12 (s, 3H), 2.19 (t, J = 7.5Hz, 2H)
2.28 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 6.5 Hz, 2H)
3.74 (s, 3H), 4.47 (t, J = 6.5 Hz, 2H)
6.49 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 13.5 Hz, 1H)
7.31 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 8.0 Hz, 1H)
7.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 7.5 Hz, 1H)
7.84 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H)
7.95 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 9.0 Hz, 1H)
8.15 (t, J = 13.0 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 7.0 Hz, 1H)
8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H)
(4) Synthesis of compound of general formula 1 (“
Compound 2 (22 mg) was added to a solution of compound 4 (20 mg) in DMF (1 ml), and the mixture was stirred at 130 ° C. for 1 hour. After the reaction, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure with a vacuum pump to obtain a crude product 5. The obtained crude product 5 was dissolved in 47% aqueous hydrogen bromide and stirred at 170 ° C. for 1 hour. After the reaction, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the resulting crude product was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 9/1). 6 mg of the target compound of the
[0077]
In addition, the compound of the general formula 1 (“
[0078]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.79-1.90 (m, 2H), 1.92-2.01 (m, 2H)
2.05-2.14 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.23-2.42 (m, 8H)
3.04 (s, 6H), 3.74 (s, 3H), 4.35-4.45 (m, 2H)
4.52-4.60 (m, 2H), 5.91 (s, 1H), 6.22 (s, 1H)
6.42 (d, 1H), 6.54 (s, 1H), 7.04 (d, 1H), 7.20 (d, 1H)
7.31 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.45-8.15 (m, 13H)
8.32 (d, 1H), 8.42 (d, 1H), 8.54 (d, 2H)
[0079]
[Chemical Formula 10]
The compound of the
(1) Synthesis of Compound 6 in Reaction Formula 10
Compound 2 (206 mg) was dissolved in 47% aqueous HBr solution (6 ml) and stirred for 1.5 hours. After cooling, the mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained crude product was suspended in ethyl acetate (10 ml), and the resulting solid was filtered to obtain 215 mg of the intended compound 6.
[0080]
Compound 6 exhibited the following characteristics in NMR measurement.
[0081]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
2.33-2.43 (m, 2H), 3.56 (t, J = 6.0 Hz, 2H)
4.57 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.46 (s, 1H)
7.38 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H)
7.62 (dd, J = 2.0 Hz, 9.0 Hz, 1 H)
7.68-7.74 (m, 2H), 7.74-7.80 (m, 3H)
8.68 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 8.71 (d, J = 9.5 Hz, 1H)
(2) Synthesis of Compound 7 in Reaction Formula 10
N, N′-dimethyl-1,3-propanediamine (0.15 ml) was added to a DMF (0.7 ml) solution of the compound 3 (15 mg), and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After the reaction, the mixture was concentrated under reduced pressure using a vacuum pump. The obtained crude product was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 95/5) to obtain the intended compound 7 12 mg was obtained.
[0082]
Compound 7 exhibited the following characteristics in NMR measurement.
[0083]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.66-1.76 (m, 2H), 1.99-2.07 (m, 2H), 2.21 (s, 3H)
2.41 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.47 (s, 3H)
2.66 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H)
4.52 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H)
7.01-7.07 (m, 2H), 7.14 (t, J = 7.5Hz, 1H)
7.30 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.48-7.55 (m, 2H)
7.62 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.65-7.74 (m, 2H)
7.88 (t, J = 13.0 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H)
8.55 (d, J = 6.5 Hz, 1H)
(3) Synthesis of compound of general formula 1 (“
N-ethyldiisopropylamine (0.07 ml) and compound 6 (14 mg) were added to a solution of compound 7 (12 mg) in DMF (1 ml), and the mixture was stirred at 70 ° C. for 2 hours. After the reaction, the mixture was concentrated under reduced pressure using a vacuum pump.
[0084]
The obtained crude product was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 97/3), and the target
[0085]
In addition, the compound of the general formula 1 (“
[0086]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.30-1.40 (m, 2H), 1.88 (s, 3H), 1.91-2.01 (m, 4H)
2.07 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H)
2.14 (t, J = 7.0 Hz, 2H) 2.28 (t, 2H)
2.33 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 4.31-4.38 (m, 2H)
4.55 (t, 2H), 5.92 (s, 1H), 6.22 (d, J = 2.5Hz, 1H)
6.36 (s, 1H), 6.43 (d, J = 12.0 Hz, 1H)
7.05 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 7.23-7.33 (m, 3H)
7.46-7.53 (m, 2H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H)
7.63-7.73 (m, 4H), 7.81 (t, J = 8.5 Hz, 2H)
7.93 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 9.0 Hz, 1H)
8.10 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 8.35 (d, J = 7.0 Hz, 1H)
8.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 9.0 Hz, 1H)
8.58 (d, J = 9.5 Hz, 1H)
[0087]
Embedded image
The compound of the
(1) Synthesis of Compound 8 in Reaction Formula 11
N, N′-dimethyl-1,3-propanediamine (0.15 ml) was added to a DMF (0.7 ml) solution of the compound 6 (15 mg), and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After the reaction, the mixture was concentrated under reduced pressure using a vacuum pump. The obtained crude product was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 9/1) to obtain the target compound 8 9 mg was obtained.
[0088]
Compound 8 showed the following characteristics in NMR measurement.
[0089]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.38 (t, 2H), 1.85-2.00 (m, 5H), 2.10-2.18 (m, 2H)
2.20-2.38 (m, 7H), 4.40 (t, 2H), 5.94 (s, 1H)
6.27 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 7.28-7.36 (m, 2H)
7.51 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.65-7.78 (m, 3H)
8.59 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.64 (d, J = 7.5 Hz, 1H)
(2) Synthesis of compound of general formula 1 (“
The compound 3 (10 mg) was added to a solution of compound 8 (9 mg) in DMF (1.2 ml), and the mixture was stirred at 70 ° C. for 2 hours. After the reaction, the mixture was concentrated under reduced pressure using a vacuum pump. The resulting crude product 5 was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 97/3), and the desired general formula 5 mg of Compound 1 (“
[0090]
Embedded image
The compound of the
(1) Synthesis of Compound 10 in Reaction Formula 12
N-methyl-1,3-propanediamine (2 g) and di-t-butyl dicarbonate (1.1 g) were dissolved in methanol (16 ml) and stirred at room temperature for 1 hour. After concentration under reduced pressure, the obtained crude product was purified by silica gel column chromatography to obtain 140 mg of the intended compound 10.
[0091]
Compound 10 showed the following characteristics in NMR measurement.
[0092]
1H-NMR (500 MHz,
1.44 (s, 9H), 1.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H) 2.44 (s, 3H)
2.66 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.17-3.24 (m, 2H)
3.17-3.24 (m, 2H), 3.42 (bs, 1H), 5.08 (bs, 1H)
(2) Synthesis of Compound 11 in Reaction Formula 12
The obtained compound 10 (140 mg) and the compound 6 (40 mg) were dissolved in DMF (1.8 ml) and stirred at room temperature for 3 hours. After concentration under reduced pressure, the obtained crude product was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 95/5). 29 mg of the compound 11 was obtained.
[0093]
Compound 11 showed the following characteristics in NMR measurement.
[0094]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.34-1.42 (m, 5H), 1.90 (s, 3H), 1.91-1.98 (m, 2H)
2.10 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 6.0 Hz, 2H)
2.83 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.36 (bs, 1H)
4.37-4.45 (m, 2H), 5.93 (s, 1H), 6.27 (s, 1H)
6.40 (s, 1H), 7.30-7.38 (m, 2H)
7.52 (dd, J = 2.5 Hz, 9.0 Hz, 1H), 7.65-7.80 (m, 3H)
8.59 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 9.0 Hz, 1H)
(3) Synthesis of Compound 12 in Reaction Formula 12
The obtained compound 11 (29 mg) was dissolved in methanol (2 ml), and 47% HBr aqueous solution (1 ml) was added. After stirring at room temperature for 1 hour, the mixture was concentrated under reduced pressure. The obtained crude product was purified by column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 95/5) to obtain the target compound 12 15 mg was obtained.
[0095]
Compound 12 exhibited the following characteristics in NMR measurement.
[0096]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.29-1.40 (m, 2H), 1.80-2.01 (m, 4H)
2.13 (t, 2H), 2.22-2.35 (m, 5H)
4.35-4.48 (m, 2H), 5.94 (s, 1H), 6.26 (s, 1H)
6.43 (s, 1H), 7.26-7.35 (m, 2H)
7.48-7.52 (m, 1H), 7.68-7.80 (m, 3H)
8.57-8.67 (m, 2H)
(4) Synthesis of compound of general formula 1 (“
Compound 12 (15 mg) and the compound 3 (19 mg) were dissolved in DMF (1.5 ml) and reacted at room temperature for 23 hours. After the reaction, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure with a vacuum pump, and the resulting crude product was subjected to column chromatography (amino group-modified silica gel NH-DM1020, trade name, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd .; developing solvent chloroform / methanol = 95/5). Purification gave 6 mg of the desired
[0097]
The compound of the general formula 1 (“
[0098]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.38 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.83 to 2.05 (m, 9H)
2.11 (t, 7.5 Hz, 2H), 2.24-2.33 (m, 2H)
2.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H)
4.31-4.41 (m, 2H), 4.60 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
5.94 (s, 1H), 6.23 (s, 1H), 6.38 (s, 1H)
6.46 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 13.0 Hz, 1H)
7.24-7.36 (m, 3H), 7.44-7.54 (m, 2H)
7.56-7.77 (m, 7H), 7.80-7.86 (m, 1H)
7.92 (t, 1H), 8.06-8.14 (m, 1H)
8.38 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.45 (d, 1H)
8.56 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.61 (d, J = 9.5 Hz, 1H)
[0099]
Embedded image
Using the compound of
[0100]
Dissolve 0.3 nmol of the compound of general formula 1 (“
[0101]
Next, 0.3 nmol, 0.04 nmol of dT30mer and 0.04 nmol of dA30mer of the compound of general formula 1 (“
[0102]
Example 6 Detection of double-stranded
Using the compound of
[0103]
0.3 nmol of the compound of the general formula 1 (“
[0104]
Next, 0.3 nmol of the compound of the general formula 1 (“
[0105]
Example 7
The compound of
(1) Synthesis of compound (13)
Compound (1) (0.20 g) and diiodohexane (1.8 ml) were suspended in 1.8 ml of nitrobenzene and stirred at 160 ° C. for 2.5 hours. After allowing to cool, methylene chloride was added, the precipitated solid was dissolved in hot methanol, ether was added, and the mixture was allowed to stand under ice cooling. The resulting solid was filtered to obtain 0.171 g of the desired compound (13a). The obtained compound (13a) showed the following characteristics in NMR measurement.
[0106]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.19 (m, 2H), 1.24 (m, 2H) 1.62 (m, 2H),
1.92 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.21 (s, 3H),
3.19 (t, 2H), 4.54 (m, 2H), 7.7-9.2 (m, 13H),
10.52 (s, 1H), 10.80 (s, 1H).
[0107]
Similarly, from the compound (1) (0.10 g) and diiodoheptane (3 ml), the target compound (13b) is 0.113 g, the compound (1) (0.1 g) and diiodooctane (3 ml). As a result, 0.139 g of the intended compound (13c) was obtained.
(2) Synthesis of compound (14)
The obtained compound (13a) (117 mg) and 3-aminopropanol (0.16 ml) were dissolved in DMF (3 ml) and stirred at 120 ° C. for 3 hours. After concentration under reduced pressure, the obtained crude product was purified by silica gel column chromatography (developing solvent chloroform / methanol = 90/10) to obtain 128 mg of the desired compound (14a). The obtained compound (14a) showed the following characteristics in NMR measurement.
[0108]
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
1.19 (m, 2H), 1.25 (m, 2H), 1.55 (m, 2H),
1.77 (m, 2H), 1.92 (m, 2H), 2.02 (s, 3H),
2.21 (s, 3H), 2.75-3.00 (m, 4H),
3.48 (m, 2H), 4.48 (m, 2H),
7.60-9.20 (m, 13H), 10.62 (s, 1H),
11.19 (s, 1H).
[0109]
Similarly, 40 mg of the target compound (14b) was obtained from the compound (13b) (113 mg), and 56 mg of the target compound (14c) was obtained from the compound (13c) (139 mg).
(3) Synthesis of compound (15)
The obtained compound (14a) (128 mg) and 1 equivalent of the compound (3) were dissolved in DMF (3 ml) and heated at 130 ° C. for 2.5 hours. After concentration under reduced pressure, the obtained crude product was purified by silica gel column chromatography (developing solvent: ethyl acetate / acetic acid / water = 60/30/20) to obtain 35 mg of the desired compound (15a).
[0110]
Similarly, 7 mg of the target compound (15b) was obtained from the compound (14b) (40 mg), and 8 mg of the target compound (15c) was obtained from the compound (14c).
(4) Synthesis of compound (16)
A 48% HBr aqueous solution (1.5 ml) was added to the obtained compound (15a). After stirring at 145 ° C. for 1 hour, the mixture was concentrated under reduced pressure. Azeotropy with ethanol gave the residue (compound (16a); 1.4 mg).
[0111]
Similarly, 8 mg of the residue containing the compound (16b) was obtained from the compound (15b), and 8 mg of the residue containing the compound (16c) was obtained from the compound (15c).
[0112]
Embedded image
The nucleic acid probe of the present invention was synthesized by the method shown below. This reaction is shown in the following reaction formula 14.
[0113]
DNA oligomer (compound (17)) (37 nmol) was dissolved in distilled water (100 μl) and DMF (300 μl), and dithiothreitol in DMF (1M) (40 μl) was added. One hour later, 133 μl of the reaction solution was collected, and 100 μl of a DMF solution (2 mg / ml) of compound (16c) and 110 μl of triethylamine were added. The reaction solution was allowed to stand at room temperature overnight and then concentrated under reduced pressure. The residue was partitioned with n-butanol-water. The aqueous layer was concentrated with butanol, ethanol was added, and the mixture was allowed to stand at −78 ° C. for 30 minutes. The precipitated solid was collected by centrifugation. The obtained precipitate was purified by HPLC (ODS-80Ts, manufactured by Tosoh Corporation) to obtain 0.94 nmol of the target compound (18).
[0114]
Embedded image
Double-stranded nucleic acid was detected using the compound of
(1) To 60 μl of a 25 μM solution of the compound of general formula 1 (compound (16c) in Reaction Scheme 13), × 20 SSC (30 μl), 0.5 M EDTA (1.2 μl) and distilled water (484.8 μl) added.
(2) 144 μl of the reaction solution of (1) was collected, and 6 μl of TE buffer was added.
(3) 144 μl of the reaction solution from (1) was collected, and 3 μl of a 12.5 μl solution of dA30mer and 3 μl of a 12.5 μl solution of dA30mer were added.
(4) The reaction solutions of (2) and (3) were incubated at 75 ° C. for 30 minutes, and then allowed to cool to room temperature.
(5) The fluorescence intensity at an excitation wavelength of 470 nm was measured at room temperature.
[0115]
FIG. 3 shows the measured fluorescence spectrum. The fluorescence intensity ((1) in the figure) of the reaction liquid (2) at the fluorescence wavelength 654 nm is 5.79, and the fluorescence intensity ((2) in the figure) of the reaction liquid (3) is 58.26. Met. In the presence of double-stranded nucleic acid, a significant increase in fluorescence intensity was confirmed.
[0116]
Example 10
Using the nucleic acid probe of the present invention synthesized in Example 8 (compound (18) in Reaction Scheme 14), the target nucleic acid (DNA) was detected. The nucleic acid sequence of the probe is as shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleic acid sequence of the target nucleic acid is as shown in SEQ ID NO: 4.
(1) 2.5 μM solution of the nucleic acid probe of the present invention (compound (18) in reaction formula 14) 10 μM solution 31.5 μl, distilled water 260.8 μl, 20 × SSC 15.8 μl, and 0.5 μM EDTA 0 .6 μl was added.
(2) 147 μl of the reaction solution of (1) was collected, and 3 μl of TE buffer was added.
(3) 147 μl of the reaction solution of (1) was collected, and 3 μl of a 50 μM solution of the target nucleic acid was added.
(4) The fluorescence intensity at an excitation wavelength of 470 nm was measured at 41 ° C.
[0117]
FIG. 4 shows the measured fluorescence spectrum. The fluorescence intensity ((1) in the figure) of the reaction liquid of (2) at 656 nm is 1.8, and the fluorescence intensity of the reaction liquid of (3) ((2) in the figure) is 5.7. there were. A significant increase in fluorescence intensity was confirmed in the presence of the target nucleic acid.
[0118]
【The invention's effect】
As is clear from the above explanation, according to the present invention, it is an intercalator fluorescent dye that has not been known so far, and has a large fluorescence sensitization when intercalated into a double-stranded nucleic acid in nucleic acid detection, Novel compounds having a large difference between the excitation wavelength and the fluorescence wavelength (that is, a large Stokes shift) are provided. This compound can be used for conventional nucleic acid measurements by contacting with a double-stranded nucleic acid or binding to a single-stranded oligonucleotide to form a nucleic acid probe.
[0119]
In particular, in the case of a nucleic acid probe in which the compound of the present invention is bound to a single-stranded oligonucleotide via an appropriate linker, fluorescence sensitization is performed only when the nucleic acid having a specific sequence and the single-stranded oligonucleotide form a complementary bond. Therefore, it is not necessary to perform an operation for separating unbound nucleic acid probes, and therefore, a nucleic acid measurement method by a simple one-step operation in a homogeneous system can be carried out.
[0120]
Further, the compound of the present invention has a feature that the fluorescence spectrum does not overlap with a conventionally known intercalator fluorescent dye. For this reason, two or more types of target nucleic acids contained in a sample are amplified by using two or more types of nucleic acid probes produced using the compound of the present invention and a conventionally known intercalating fluorescent dye. It is possible to provide a method for measuring an amplification product in a sealed container without performing a separation operation, that is, a measurement method that enables simultaneous measurement of two or more types of target nucleic acids.
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
1 is a fluorescence spectrum of
2 is a fluorescence spectrum of
3 is a fluorescence spectrum of the compound (16c) (2.5 μM) in Example 9. FIG. In the figure, (1) is the result at the excitation wavelength of 470 nm without the double-stranded nucleic acid, and (2) is the result at the excitation wavelength of 470 nm in the presence of dT30mer (0.25 μM) and dA30mer (0.25 μM). .
4 is a fluorescence spectrum of the compound (18) (1 μM) in Example 10. FIG. In the figure, (1) is the result at the excitation wavelength of 470 nm without the target nucleic acid, and (2) is the result at the excitation wavelength of 470 nm in the presence of the target nucleic acid (1 μM).
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