JP4223548B2 - Supplement or non-supplemented tissue sealant, their preparation and use - Google Patents

Supplement or non-supplemented tissue sealant, their preparation and use Download PDF

Info

Publication number
JP4223548B2
JP4223548B2 JP51775396A JP51775396A JP4223548B2 JP 4223548 B2 JP4223548 B2 JP 4223548B2 JP 51775396 A JP51775396 A JP 51775396A JP 51775396 A JP51775396 A JP 51775396A JP 4223548 B2 JP4223548 B2 JP 4223548B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fg
fibrin
ts
growth factor
ml
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51775396A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH10510183A (en
Inventor
ハワード・ピー グライスラー、
ウイリアム・ナッシュ ドロハン、
ハーナン・エー ヌネズ、
ウイルソン・ヘイルズ バーゲス、
ジェフリー・オー ホーリンガー、
トーマス マシャグ、
マックフィー、マーティン・ジェイムズ
カルロス・アイ ラサ・ジュニア、
Original Assignee
アメリカ合衆国
ジ・アメリカン・ナショナル・レッド・クロス
ロヨラ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US35100694A priority Critical
Priority to US08/351,006 priority
Application filed by アメリカ合衆国, ジ・アメリカン・ナショナル・レッド・クロス, ロヨラ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ filed Critical アメリカ合衆国
Priority to PCT/US1995/015876 priority patent/WO1996017633A1/en
Publication of JPH10510183A publication Critical patent/JPH10510183A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4223548B2 publication Critical patent/JP4223548B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Application status is Expired - Lifetime legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/363Fibrinogen
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0015Medicaments; Biocides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0036Porous materials, e.g. foams or sponges
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10Polypeptides; Proteins
    • A61L24/106Fibrin; Fibrinogen
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/404Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
    • A61L2300/406Antibiotics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414Growth factors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/416Anti-neoplastic or anti-proliferative or anti-restenosis or anti-angiogenic agents, e.g. paclitaxel, sirolimus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/418Agents promoting blood coagulation, blood-clotting agents, embolising agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION, OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS, OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/606Coatings
    • A61L2300/608Coatings having two or more layers

Description

発明の分野本発明は、フィブリングルー(接着剤)(fibrin glue)(FG)のごとき非補足(unsupplemented)または補足(supplemented)組織シーラント(tissue sealant)(TS)、ならびにそれらの製法および使用に指向される。 Field of the Invention The present invention, fibrin glue (glue) (fibrin glue) unsupplemented such as (FG) (unsupplemented) or supplemental (Supplemented) tissue sealant (tissue sealant) (TS), and directed to their preparation and use It is. 1つの態様において、本発明は、全厚さに渡る(full-thickness)皮膚の創傷治癒を阻害しないTSに指向される。 In one aspect, the present invention is, over the entire thickness (full-thickness) is directed to a TS that does not inhibit wound healing in the skin. もう1つの態様において、本発明は、成長因子(類)および/または薬物(類)を補足したTS、ならびにそれらの製法および使用に指向される。 In another aspect, the present invention is, TS supplemented with growth factor (s) and / or drug (s), and is directed to their preparation and use. 選択された特別の成長因子(類)または薬物(類)はその使用の関数である。 Special growth factors that have been selected (s) or drug (s) is a function of its use.
発明の背景A. Background of the Invention A. 創傷治癒および成長因子創傷治癒、病巣の修復は、損傷後ほとんど直ちに開始する。 Wound healing and growth factor wound healing, lesions of repair, almost immediately after the start of damage. それは、種々の細胞の連続的共働的機能ならびに分解的および再生的過程の綿密な調節を要する。 It requires careful adjustment of the continuously cooperatively function as well as decomposition and regenerative processes of various cells. 細胞の増殖、分化および移動は、創傷治癒を基礎付け、また、フィブリン血餅形成、血餅の吸収、線維増多のごとき組織の再構築、内皮形成および上皮形成を含む重要な生物学的過程である。 Cell proliferation, differentiation and migration, basic with wound healing, also fibrin clot formation, absorption of blood clots, reconstruction of such fibrosis of tissue, important biological processes including endothelial formation and epithelialization it is. 創傷治癒は、多数の毛細血管を含有する高度血管化組織、多くの活性な線維芽細胞、および豊富なコラーゲンフィブリルの形成を含むが、特殊化された皮膚構造の形成を含まない。 Wound healing is a highly vascularized tissue that contains numerous capillaries, including the formation of many active fibroblasts, and abundant collagen fibrils, it does not include the formation of specialized skin structures.
創傷治癒の過程は、負傷細胞から流出するトロンボプラスチンによって開始され得る。 Process of wound healing can be initiated by thromboplastin which flows out from the injured cells. トロナボプラスチンは血漿第VII因子と接触して第X因子アクチベーターが形成され、次いで、これは第V因子と一緒に、リン脂質およびカルシウムとの複合体において、プロトロンビンをトロンビンに変換する。 Toro Nabo Plus Chin factor X activator in contact with the plasma factor VII is formed, then it is together with the factor V, in complex with phospholipids and calcium, converts prothrombin to thrombin. トロンビンはフィブリノーゲンからのフィブリノペプチドAおよびBの放出を触媒してフィブリンモノマーを生じ、これは凝集してフィブリンフィラメントを形成する。 Thrombin resulting fibrin monomer catalyzes the release of fibrinopeptide A and B from fibrinogen, which forms a fibrin filaments to aggregate. また、トロンビンはトランスグルタミナーゼ、第XIIIa因子を活性化し、これは、フィブリンフィラメントを共有結合的に架橋させるイソペプチド結合の形成を触媒する。 Also, thrombin activates the transglutaminase, factor XIIIa, which catalyzes the formation of isopeptide bonds to covalently cross-link the fibrin filaments. 次いで、アルファ2−抗プラスミンが第XIII因子によってフィブリンフィラメントへ結合され、それにより、フィラメントがプラスミンによる分解から保護する(例えば、Doolittleら,Ann. Rev. Biochem. 53:195-229(1984)参照)。 Then, alpha2-antiplasmin is bonded to fibrin filaments by the Factor XIII, whereby the filament is protected from degradation by plasmin (e.g., Doolittle et al., Ann Rev. Biochem 53:.. 195-229 (1984) see ).
組織が負傷すると、一連の生物学的活性を呈するポリペプチド成長因子が創傷に放出され、それは治癒で非常に重要な役割を演じる(例えば、Hormanal Proteins and Peptides(Li, CH編),第7巻,Academic Press, Inc., New York, NY231-177頁(1979)およびBruntら,Biotechnology 6:25-30(1988)参照)。 When tissue is injured, polypeptide growth factors which exhibits a range of biological activities are released into the wound, it plays a very important role in healing (e.g., Hormanal Proteins and Peptides (Li, CH eds), Vol. 7 , Academic Press, Inc., New York, pp. NY231-177 (1979) and Brunt et al., Biotechnology 6: see 25-30 (1988)). これらの活性は、白血球および線維芽細胞のごとき細胞を損傷領域に補給し、細胞の増殖および分化を誘導する。 These activities, supplemented with leukocytes and cells such as fibroblasts in the damaged region, to induce proliferation and differentiation of cells. 創傷治癒に参画する成長因子は、限定されるものではないが、血小板由来成長因子(PDGF);インスリン結合性成長因子−1(IGF−1);インスリン結合性成長因子−2(IGF−2);表皮成長因子(EGF);形質転換(transforming)成長因子−α(TGF−α):形質転換成長因子−β(TGF−β);血小板第4因子(PF−4);およびヘパリン結合成長因子1および2(各々、HBGF−1およびHBGF−2)を含む。 Participate growth factor in wound healing include, but are not limited to, platelet-derived growth factor (PDGF); insulin-binding growth factor -1 (IGF-1); insulin-binding growth factor -2 (IGF-2) ; epidermal growth factor (EGF); transforming (transforming) growth factor -α (TGF-α): transforming growth factor -β (TGF-β); platelet factor 4 (PF-4); and heparin binding growth factor 1 and 2 (respectively, HBGF-1 and HBGF-2).
PDGF類は循環血小板のアルファ顆粒に貯蔵され、血液凝固の間に創傷部位で放出される(例えば、Lynchら,J. Clin. Invest. 84:640-646(1989)参照)。 PDGF such is stored in the alpha granules of circulating platelets, are released at wound sites during blood clotting (e.g., Lynch et al., J Clin Invest 84:... 640-646 (1989) refer). PDGF類はPDGF;血小板由来血管形成因子(PDAF);TGF−β;および好中球に対する化学誘因物質であるPF−4を含む(Knightonら,Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing;Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., New York, New York, 319-329頁(1988))。 PDGF acids is PDGF; platelet-derived angiogenesis factor (PDAF); TGF-β; against and neutrophils containing PF-4 is a chemoattractant (Knighton et al., Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing; Biological and Clinical Implications , Alan R. Liss, Inc., New York, New York, pp. 319-329 (1988)). PDGFは、分裂促進因子、化学誘因物質、および線維芽細胞および平滑筋細胞を含めた間葉起源の細胞における蛋白質合成め刺激物質である。 PDGF is a mitogen, chemoattractant and a protein synthesis Me stimulator in cells of mesenchymal origin, including fibroblasts and smooth muscle cells. また、PDGFは内皮細胞に対する非分裂促進化学誘因物質である(例えば、Adelmann-Grillら,Eur. J. Cell Biol. 51:322-326(1990))。 Moreover, PDGF is a non-mitogenic chemoattractant for endothelial cells (e.g., Adelmann-Grill et al., Eur J. Cell Biol 51:.. 322-326 (1990)).
IGF−1はPDGFとの組合せで作用して、培養中の間葉細胞における有糸分裂誘発および蛋白質合成を促進する。 IGF-1 is acting in combination with PDGF, to promote mitogenesis and protein synthesis in mesenchymal cells in culture. PDGFまたはIGF−1単独の皮膚創傷への適用は治癒を促進せず、両因子を一緒に適用すると、結合組織および上皮組織増殖を促進するようである(Lynchら,Proc. Natl. Acad. Sci. 76:1279-1283(1987))。 Application to PDGF or IGF-1 alone skin wounds does not promote healing seem Applying both factors together, to promote connective tissue and epithelial tissue growth (Lynch et al., Proc. Natl. Acad. Sci . 76: 1279-1283 (1987)).
TGF−βはマクロファージおよび単球に対する化学誘因物質である。 The TGF-beta is a chemoattractant for macrophages and monocytes. 他の成長因子の存在または不存在に応じて、TGF−βは多くの細胞型の成長を刺激または阻害し得る。 Depending on the presence or absence of other growth factors, TGF-beta can stimulate or inhibit the growth of many cell types. 例えば、イン・ビボで適用すると、TGF−βは治癒しつつある皮膚創傷の引張強度を増加させる。 For example, when applied in vivo, TGF-beta increases the tensile strength of the skin wound that is being cured. また、TGF−βは内皮細胞有糸分裂を阻害し、線維芽細胞によるコラーゲンおよびグリコサミノグリカン合成を刺激する。 In addition, TGF-β inhibits endothelial cell mitosis, and stimulates collagen and glycosaminoglycan synthesis by fibroblasts. .
EGF、TGF−α、HBGF類およびオステオゲニンのごとき他の成長因子も創傷治癒で重要である。 EGF, TGF-α, other growth factors such as HBGF acids and osteogenin are also important in wound healing. 胃分泌物および唾液に見い出されたEGF、および正常および形質転換細胞双方によって作られるTGF−αは構造的に関連し、同一のレセプターを認識し得る。 The TGF-alpha produced EGF was found to gastric secretions and saliva, and the normal and transformed cells both structurally related and may recognize the same receptors. これらのレセプターは上皮細胞の増殖を媒介する。 These receptors mediate the proliferation of epithelial cells. 両因子は皮膚創傷の再上皮形成を加速する。 Both factors accelerate reepithelialization of skin wounds. 外因性EGFは、ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞の増殖を刺激することによって創傷治癒を促進する(Nanneyら,J. Invest. Dermatol. 83:385-393(1984)およびCoffeyら,Nature 328:817-820(1987))。 Exogenous EGF promotes wound healing by stimulating the proliferation of keratinocytes and dermal fibroblasts (Nanney et al., J Invest Dermatol 83:... 385-393 (1984) and Coffey et al., Nature 328: 817- 820 (1987)). EGFの局所適用は、ヒトにおける部分的厚みの創傷の治癒速度を加速する(Schultzら,Science 235:350-352(1987))。 Topical application of EGF accelerates the rate of wound healing of partial thickness in humans (Schultz et al., Science 235: 350-352 (1987)). 無機質脱落骨から精製されたオステオゲニンは骨成長を促進するようである(例えば、Luytenら,J. Biol. Chem. 264:13377(1989)。加えて、局所適用のための軟膏の形態である血小板由来創傷治癒処方、血小板抽出物が記載されている(例えば、Knightonら,Ann. Surg. 204:322-330(1986))。 Osteogenin purified from demineralized bone appears to promote bone growth (e.g., Luyten et al., J Biol Chem 264:.... 13377 (1989) in addition is the ointment forms for topical application platelet-derived wound healing formulations, platelet extracts have been described (e.g., Knighton et al., Ann Surg 204:.. 322-330 (1986)).
酸性HBGF(HBFG−1またはFGF−1としても知られているaHBGF)および塩基性HBGF(HBGF−2またはFGF−2としても知られているbHBGF)を含めた、線維芽細胞成長因子としても知られているヘパリン結合性成長因子(HBGF)は、内皮細胞を含めた中胚葉および神経外胚葉系の細胞に対する効力のある分裂促進因子である(Burgessら,Ann. Rev. Biochem. 58:575-606(1989))。 Including acidic HBGF (bHBGF also known as HBGF-2 or FGF-2) (HBFG-1 or also known aHBGF as FGF-1) and basic HBGF, known as fibroblast growth factor .. its dependent heparin-binding growth factor (HBGF) is a mitogen potent against mesoderm and neuroectodermal cells in, including endothelial cells (Burgess et al., Ann Rev. Biochem 58: 575- 606 (1989)). 加えて、HBGF−1は内皮細胞および大膠細胞を走化させる。 In addition, HBGF-1 causes chemotactic endothelial cells and Dainikawa cells. HBGF−1およびHBGF−2はヘパリンに結合し、ヘパリンはそれらを蛋白分解から保護する。 HBGF-1 and HBGF-2 bind to heparin, heparin protects them from proteolysis. HBGFによって呈される一連の生物学的活性は、それらが創傷治癒で重要な役割を演じることを示唆する。 Range of biological activity exhibited by HBGF suggests that they play an important role in wound healing.
塩基性線維芽細胞成長因子(FGF−2)は、血管形成ならびに線維芽細胞の移動および増殖の優れた刺激物質である(例えば、Gospodaroviczら,Mol. Cell. Endocinol. 46:187-204(1986)およびGospodaroviczら,Endo. Rev. 8:95-114(1985))。 Basic fibroblast growth factor (FGF-2) is a good stimulator of angiogenesis and migration and proliferation of fibroblasts (e.g., Gospodarovicz et, Mol Cell Endocinol 46:... 187-204 (1986 ) and Gospodarovicz et al., Endo Rev. 8:. 95-114 (1985)). 酸性線維芽細胞成長因子(FGF−1)は内皮細胞に対する優れた血管形成因子であることが示されている(Burgessら,前掲,1989)。 Acidic fibroblast growth factor (FGF-1) has been shown to be an excellent angiogenic factor for endothelial cells (Burgess et al., Supra, 1989). しかしながら、FGF成長因子が成長因子を走化させるか否かは確立されていない。 However, not whether FGF growth factor is chemotactic growth factors established.
従って、成長因子は、創傷治癒および組織修復を特異的に促進するのにかなり有用である。 Thus, growth factors are quite useful for specifically promoting wound healing and tissue repair. しかしながら、創傷治癒を促進するそれらの使用は矛盾する結果を生じている(例えば、Carterら,Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., New York, New York, 303-317頁(1988))。 However, occurs the results of their use to promote wound healing conflict (e.g., Carter et al., Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., New York, New York, pp. 303-317 (1988)). 例えば、ブタにおいて標準化された皮膚創傷に別々に適用されたPDGF、IGF−1、EGF、TGF−βおよびFGF(HBGFとしても知られている)は、創傷における結合組織または上皮細胞の再生に対してほとんど効果を有しなかった(Lynchら,J. Clin. Invest. 84:640-646(1989))。 For example, standardized skin wound separately applied PDGF in pigs, IGF-1, EGF, TGF-β and FGF (also known as HBGF), compared connective tissue or regeneration of epithelial cells in a wound It had little effect Te (Lynch et al., J Clin Invest 84:... 640-646 (1989)). テストした因子のうち、TGF−βは単独で最大の応答を刺激した。 Of the tested factor, the TGF-β stimulated the greatest response alone. しかしながら、PDGF−bbホモダイマーおよびIGF−1またはTGF−αのごとき因子の組合せは、結合組織の再生および上皮形成の劇的増加を生じた(同上)。 However, the combination of PDGF-bb homodimer and IGF-1 or such factors TGF-alpha resulted in regeneration and dramatic increase in epithelialization of connective tissue (Id.). ツボイらは、開いた創傷へのbFGFの毎日の適用は治癒しつつある障害において創傷治癒を刺激したが正常マウスでは刺激しなかったことを報告している(J. Exp. Med. 172:245-251(1990))。 Tsuboi et al., Daily application of bFGF to an open wound is stimulated wound healing in disorders are becoming healing have reported that were not stimulated in normal mice (J. Exp Med 172:.. 245 -251 (1990)). 他方、恐らくは成長因子を含有した、ブタおよびウシ血小板溶解物の粗調製物のヒト皮膚創傷への適用は、創傷が閉じる速度、治癒領域における細胞数、血管の成長、コラーゲン沈積および傷組織の強度を増大させた(Carterら,前掲)。 Strength of the other, possibly containing growth factors, application to human skin wounds of crude preparations of porcine and bovine platelet lysate, the rate at which the wound is closed, the number of cells in the healing area, the growth of blood vessels, collagen deposition and wound tissue the increased (Carter et al., supra).
かかる矛盾する結果の理由は知られていないが、通常の一連の生物学的活性を呈することができるように成長因子を哺乳動物における創傷に適用する困難性の結果であろう。 Results of the reasons for such inconsistent is not known but may be the result of difficulty in applying to a wound in a mammal a growth factor to be able to exhibit normal range of biological activity. 例えば、いくつかの成長因子レセプターは、最大生物学的効果を生じるには少なくとも12時間占有されていなければならないようである(Prestaら,Cell Regul. 2:719-726(1991)およびRusnatiら,J. Cell Physiol.154:152-161(1993))。 For example, several growth factor receptor is occurring maximum biological effect is so must be occupied for at least 12 hours (Presta et al., Cell Regul 2:. 719-726 (1991) and Rusnati et al., J. Cell Physiol.154: 152-161 (1993)). かかる矛盾する結果のため、創傷治癒を刺激するにおいて、外因的に適用された成長因子によって演じられる役割は明瞭でない。 Results for the such contradictory, in stimulating wound healing, role played by the growth factor exogenously applied is not clear. さらに、成長因子を創傷に適用して創傷および成長因子(類)の間の接触の延長を生じる手段は現在知られていない。 Furthermore, it means for producing a prolonged contact between the wound and the growth factor by applying growth factors to a wound (s) is not presently known.
B. B. TS類血漿蛋白質を含有する外科接着剤およびTSは骨および皮膚におけるごとき外部および内部創傷をシールして、血液損失を減少させ、ホメオスタシスを維持するために使用される。 Surgical adhesives containing TS such plasma protein and TS is to seal the external and internal wounds such as in bone and skin, reduces blood loss, is used to maintain homeostasis. かかるTS類は血液凝固因子および他の血液蛋白質を含有する。 Such TS acids contain blood clotting factors and other blood proteins. フィブリンシーラントとも呼ばれるFGは、血漿から調製される天然血餅と同様のゲルである。 FG, also called fibrin sealant, is similar to the gel and natural clot which is prepared from plasma. 各FGの正確な成分は、出発物質として使用される個々の血漿画分の関数である。 The exact components of each FG are individual functions of the plasma fraction used as the starting material. 血漿成分の分画は、エタノール、ポリエチレングリコールおよび硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーのごとき標準的な蛋白質精製方法によって行うことができる。 Fractionation of plasma components can be carried out ethanol, polyethylene glycol and ammonium sulfate precipitation by standard protein purification methods such as ion exchange and gel filtration chromatography. 典型的には、FGは、痕跡量のアルブミン、フィブロネクチンおよびプラスミノーゲンを含めた蛋白質の混合物を含有する。 Typically, FG contains a mixture of proteins including traces of albumin, fibronectin and plasminogen. カナダ国、欧州および恐らくは他の地域において、商業的に入手可能なFGは、典型的には、安定化剤としてのアプロチニンも含有する。 Canada, in Europe and possibly elsewhere, commercially available FG typically also contains aprotinin as a stabilizer.
FG類は、一般に、(1)フィブロネクチン、第XIII因子およびフォンビルブランド因子を含有するフィブリノーゲン濃縮物;(2)乾燥したヒトおよびウシトロンビン;および(3)カルシウムイオンから調製される。 FG acids are generally (1) fibronectin, XIII, fibrinogen concentrate containing Factor and von Willebrand factor; prepared from and (3) calcium ions; that (2) dried human or bovine thrombin. 商業的に入手可能なFGは、一般に、ウシ成分を含有する。 Commercially available FG generally contain bovine components. フィブリノーゲン濃縮物は、低温沈殿、続いての分画によって血漿から調製して、トロンビンおよびカルシウムイオンのごときトロンビンのアクチベーターと混合するとシーラントまたは血餅を形成する組成物を得ることができる。 Fibrinogen concentrate can be obtained cryoprecipitate, followed by fractionation and prepared from plasma by the, mixed with thrombin activator such as thrombin and calcium ions to form a sealant or clot composition. フィブリノーゲンおよびトロンビン濃縮物は凍結乾燥形態で調製され、使用直前に塩化カルシウムの溶液と混合される。 Fibrinogen and thrombin concentrates are prepared in lyophilized form, is mixed with a solution of calcium chloride immediately prior to use. 混合して、該成分は組織に適用され、そこで、該成分は該組織表面に凝固し、架橋されたフィブリンを含む血餅を形成する。 Mixed and, the components are applied to the tissue where the component solidifies on the tissue surface to form blood clots containing cross-linked fibrin. フィブリノーゲン濃縮物に存在する第XIII因子は架橋を触媒する。 Factor XIII present in fibrinogen concentrate catalyzes the crosslinking.
オーストラリア特許第65097/87号は、フィブリノーゲン、第XIII因子、抗トロンビンIIIのごときトロンビン阻害剤、プロトロンビン因子、カルシウムイオン、および要すればプラスミン阻害剤の水性溶液を含有する一成分接着剤を記載している。 Australian Patent No. 65097/87, the described fibrinogen, Factor XIII, thrombin inhibitors such as antithrombin III, prothrombin factors, calcium ions, and the one-component adhesive containing an aqueous solution of a plasmin inhibitor optionally ing. ストレートマン(Stroetmann)の米国特許第4,427,650号および第4,427,651号は、フィブリノーゲン、トロンビンおよび/またはプロトロンビン、ならびにフィブリン溶解阻害剤を含有し、また血小板抽出物のごとき他の成分をも含有し得る創傷の閉鎖および治癒の増強のための粉末または噴霧可能な調製物の形態である富血漿誘導体の調製を記載している。 Straight Man No. 4,427,650 and No. 4,427,651 of (Stroetmann) is fibrinogen, thrombin and / or prothrombin, and contain fibrinolysis inhibitors, also other, such as platelet extracts It describes the preparation of rich plasma derivatives in the form of a powder or sprayable preparation for enhanced closure and healing of wounds may also contain components. ローズ(Rose)の米国特許第4,627,879号および第4,928,603号は、フィブリノーゲンおよび第XIII因子を含有する低温沈殿させた懸濁液を調製する方法、およびFGを調製するためのそれらの使用を開示している。 Rose U.S. Pat. Nos. 4,627,879 and No. 4,928,603 of (Rose), a method of preparing a suspension obtained by cryoprecipitate containing fibrinogen and Factor XIII, and for the preparation of FG They disclose their use. JP 1−99565は、創傷治癒のためのフィブリン接着剤を調製するためのキットを開示している。 JP 1-99565 discloses a kit for preparing a fibrin glue for wound healing. アルターバウム(Alterbaum)(米国特許第4,714,457号)およびモース(Morse)ら(米国特許第5,030,215号)はオートロガスFGを生産するための方法を開示している。 Alter Baum (Alterbaum) (U.S. Pat. No. 4,714,457) and Morse (Morse) (U.S. Pat. No. 5,030,215) discloses a process for the production of autologous FG. 加えて、改良されたFG送達系がほかのところで開示されている(Millerらの米国特許第4,932,942号およびMorseらのPCT出願WO91/09641)。 In addition, improved FG delivery systems have been disclosed in elsewhere (Miller et al., U.S. Pat. No. 4,932,942 and No. Morse et al PCT application WO91 / 09641) was.
イムノ社(IMMUNO AG)(ウイーン,オーストリア)およびベーリングウェルケ社(BEHRINGWERKE AG)(ドイツ国)(Gibbleら,Trasnfusion 30:741-747(1990))は、現在、欧州および他の地域の市場でFG類を有している(例えば、イムノ社によって所有されている米国特許第4,377,572号および第4,298,598号参照)。 Immunoblotting, Inc. (IMMUNO AG) (Vienna, Austria) and the Bering well Quai, Inc. (BEHRINGWERKE AG) (Germany) (Gibble et al., Trasnfusion 30: 741-747 (1990)) is currently in Europe and other regional markets and a FG compound (see, e.g., U.S. Patent No. 4,377,572 and No. 4,298,598, which is owned by immunoaffinity Inc.). TS類は米国では商業的に入手できない。 TS class is not available commercially in the United States. しかしながら、米国国立赤十字(American National Red Cross)およびバクスター/ハイランド(BAXTER/HYLAND)(ロスアンゼルス、カリフォルニア州)は、最近、今や臨床実験に付されているFG(ARC/BH FG)を共同開発した。 However, the National Red Cross (American National Red Cross) and Baxter / Highland (BAXTER / HYLAND) (Los Angeles, CA), recently, was now jointly develop FG that has been subjected to a clinical experiment (ARC / BH FG) .
米国外で臨床的に使用されているTS類は、ある臨床的リスクの問題が持ち上がり、米国での使用ではアメリカ食品医薬品庁によって認可されていない。 TS compounds that are in clinical use outside the United States, some of the clinical risk problem is lifted, in use in the United States have not been approved by the US Food and Drug Administration. 例えば、欧州で入手可能なTS類は、アプロチニンおよびウシトロンビンのごとき非ヒト起源の蛋白質を含有する。 For example, TS such available in Europe, contain proteins of non-human origin such as aprotinin and bovine thrombin. これらの蛋白質は非ヒト起源であるので、人々はそれらに対するアレルギー反応を発症するかも知れない。 Since these proteins are non-human origin, people may develop allergic reactions to them. 欧州では、Fgの成分に存在し得るウイルスを不活化するために加熱不活化が使用されている。 In Europe, heat inactivated are used to inactivate viruses which may be present in component of Fg. しかしながら、この加熱不活化方法は、やはりアレルギー性であり得るFG中の変性蛋白質を生じかねない。 However, this heat inactivation method does also could produce denatured proteins in the FG which may be allergic. 加えて、この不活化方法は、そこでのウシ蛋白質の使用のためTSな存在し得る、ウシ海綿状脳障害、「狂牛病(mad cow disease)」を引き起こすプリオンを不活化しないであろうという懸念がある。 In addition, the inactivation process may exist a TS for use of bovine proteins therein, bovine spongiform encephalopathy, "mad cow disease (mad cow disease)" will not inactivate prions which cause that there is a concern. この病気はヒツジからすでに運ばれているようであり、そこではそれは雌牛に対して「スクラピー」と呼ばれ、それがヒトを感染し得るということは、些細な関心事ではない。 The disease is like already carried from sheep, where it is called "scrapie" to cows, it is possible that can infect humans, not a trivial concern.
ARC/BH FGはウシ蛋白質を含有しないので、欧州で利用できるTS類以上の利点を有する。 Since ARC / BH FG does not contain bovine proteins, having a TS class or more advantages available in Europe. 例えば、ARC/BH TSはウシトロンビンの代わりにヒトトロンビンを含有し、アプロチニンを含有しない。 For example, ARC / BH TS contains human thrombin instead of bovine thrombin and does not contain aprotinin. ARC/BH FGはウシ蛋白質を含有しないので、欧州で入手可能なTS類よりもヒトにおいてアレルギー性が低いはずである。 Since ARC / BH FG does not contain bovine proteins it should be less allergenic in humans than possible TS acids available in Europe. 加えて、ARC/BH FGはより少ない変性蛋白質を生じる溶媒界面活性剤方法によってウイルス不活化されており、かくして、欧州で入手できるものよりもアレルギー性が低い。 In addition, ARC / BH FG is virally inactivated by solvent detergent method for producing fewer denatured proteins and thus is less allergenic than those available in Europe. 従って、ARC/BH FGは今日他の国で商業的に入手可能であるTS類以上の利点を有する。 Therefore, ARC / BH FG has a commercially TS such above advantages available in other countries today.
FGは、主として、には臨床局所適用のために処方され、出血を制御し、ホメオスタシスを維持し、創傷治癒を促進するのに使用される。 FG is primarily formulated for clinical topical application to control the bleeding, to maintain homeostasis, it is used to promote wound healing. FGの臨床使用は最近総括されている(Gibbleら,Transfusion 30:741-747(1990);Lernerら,J. Surg. Res. 48:165-181(1990))。 Clinical use of FG have recently been summarized (Gibble et al., Transfusion 30:... 741-747 (1990); Lerner et al., J Surg Res 48: 165-181 (1990)). シーリングによって組織FGは空気または流体漏出を防ぎ、ホメオスタシスを誘導し、出血、血腫、感染等のごとき創傷治癒に干渉し得る事象を減少または防止することによって創傷治癒に間接的に寄与し得る。 Tissue FG by a sealing prevents air or fluid leaks, induces homeostasis, bleeding, hematoma, may indirectly contribute to wound healing by reducing or preventing events which may interfere with wound healing such as infection. FGはホメオスタシスを維持し、血液喪失を減少させるものの、真実の創傷治癒特性を有することは未だ示されていない。 FG maintains homeostasis, but reduces blood loss, has not yet been shown to have wound healing properties of the truth. FGは骨および皮膚損傷のごとき内部および外部損傷双方に適し、ホメオスタシスを維持するのに適するので、その創傷治癒特性を増強するのが望ましい。 FG is suitable for internal and external damage both, such as bone and skin injuries, since suitable for maintaining the homeostasis, it is desirable to enhance its wound healing properties.
ほぼ39g/lのフィブリノーゲン濃度および200−600U/mlのトロンビン濃度を持つFGは有意に増加した張力、エネルギー吸収および弾性値を持つ血餅を生じている(Byrneら,Br. J. Surg. 78:841-843(1991))。 Almost FG with fibrinogen concentration and thrombin concentration of 200-600U / ml of 39g / l is produced significantly increased tension clot with energy absorption and elasticity values ​​(Byrne et al., Br. J. Surg. 78 : 841-843 (1991)). フィブリン血餅(5mg/ml)を充填し、皮下移植された穿孔テフロンシリンダーは、空のシリンダーと比較して、コラーゲンの増大した沈殿を含めた、顆粒化組織の形成を刺激した(Hedelinら,Eur. Surg. Res. 15:312(1983))。 Filling fibrin clot (5 mg / ml), perforated Teflon cylinders implanted subcutaneously, as compared to empty cylinders, including an increased precipitation of collagen, it stimulated the formation of granulation tissue (Hedelin et al., ... Eur Surg Res 15: 312 (1983)).
C. C. 骨創傷およびその修復骨誘導の順序はまず無機質脱落骨皮質マトリックスを用いイリスト(Irist)によって記載された(Clin. Orthop. Rel. Res. 71:271(1970)およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3511(1973))。 The order of the bone wound and repair bone induction was first described by Irisuto (Irist) using demineralized bone cortical matrix (Clin Orthop Rel Res 71:....... 271 (1970) and Proc Natl Acad Sci. USA 70: 3511 (1973)). 局所分裂促進因子として使用して間葉細胞の増殖を刺激する無機質脱落骨皮質マトリックスが同種異系受容者に皮下移植された(Rathら,Nature(Lond.)278:855(1979))。 Demineralized bone cortical matrix to stimulate the proliferation of mesenchymal cells using as a local mitogen is implanted subcutaneously in allogeneic recipients (Rath et al., Nature (Lond) 278:. 855 (1979)). 新しい骨形成は移植後12日および18日の間に起こる。 The new bone formation occurs between 12 days and 18 days after transplantation. 骨髄造血系が豊富な小骨発生が21日までに起こった(Reddt, A., Extracellular Matrix Biochemistry(Plezら編)Elsevler, New York, NY, 575-412頁(1984))。 Bone marrow hematopoietic system is rich in small bones evolution occurred in up to 21 days (Reddt, A., Extracellular Matrix Biochemistry (Plez et al., Eds.) Elsevler, New York, NY, pp. 575-412 (1984)).
無機質脱落骨マトリックス(DBM)は骨形態発生蛋白質(BMP)として知られている骨誘導性蛋白質および先祖骨細胞の増殖を変調する成長因子の源である(例えば、Hauschkaら,J. Biol. Chem. 261:12665-12674(1986)およびCanalisら,J. Clin, Invest.81:277-281(1988)参照)。 Demineralized bone matrix (DBM) is a source of growth factors that modulate the proliferation of osteoinductive protein and progenitor bone cells known as bone morphogenetic protein (BMP) (e.g., Hauschka et al., J. Biol. Chem . 261:. 12665-12674 (1986) and Canalis et al., J Clin, Invest.81: 277-281 (1988) refer). 8つのBMPが現在同定され、BMP−1ないしBMP−8と略されている。 Eight BMP is now identified, to no BMP-1 are abbreviated BMP-8. BMP−3およびBMP−7は、各々、オステオゲニンおよび骨原性蛋白質−1(OP−1)としても知られている。 BMP-3 and BMP-7, respectively, are also known as osteogenin and osteogenic protein -1 (OP-1).
不運なことに、DBM物質は、粒状骨髄自己移植と組み合わせるのでなければ臨床的用途をほとんど有しない。 Unfortunately, DBM materials have little clinical use unless the combination with particulate marrow autografts. 外科的に受容者の骨に組み入れて治療効果を生じることができるDBM量には限界がある。 The DBM amount capable of producing a therapeutic effect by incorporating the bone surgically recipient is limited. 加えて、吸収は少なくとも49%であると報告されている(Toriumiら,Arch. Otolatyngo. Head Neck Surg. 116:676-680(1990))。 In addition, the absorption has been reported to be at least 49% (toriumi et al, Arch Otolatyngo Head Neck Surg 116:... 676-680 (1990)).
DBM粉末およびオステオゲニンは、それらの骨誘導性可能性が発現される前に組織流体によって洗浄除去される可能性がある。 DBM powder and osteogenin are likely to be washed away by tissue fluids before their osteoinductive potential is expressed. 加えて、組織流体のDBM充填骨腔への浸潤および軟組織の創傷床への崩壊は、DBMおよびオステオゲニンの骨誘導性特性に有意に影響し得る2つの因子である。 In addition, invasion of the DBM-filled bone cavity of tissue fluid and collapse into the wound bed soft tissue are two factors that may significantly affect the osteoinductive properties of DBM and osteogenin. 軟組織の創傷床への崩壊は、同様に、骨成分幹細胞の創傷床への適切な移動を阻害する。 Collapse into the wound bed soft tissue likewise inhibit the proper migration of the wound bed of the bone component stem cells.
粉末形態のヒトDBMは、口腔手術の問に生じた顎骨腔を充填するために米国歯科医によって現在使用されている。 Human DBM in powder form is currently used by the US dentist to fill the jawbone cavities occurring in question oral surgery. しかしながら、粉末形態のDBMは使用するのが困難である。 However, DBM in powder form is difficult to use.
精製されたBMPは、FG(Hattori, T.,日本整形外科学会雑誌64:874-834(1990);Kawamuraら、Clin. Orthop. Rel.Res. 235:302-310(1988);Schlagら,Clin. Orthop. Rel. Res. 227:269-285(1988)およびSchwarzら,Clin. Orthop. Rel. Res. 238:282-287(1987))および全血血餅(Wangら,J. Cell. biochem. 15F:Q20 Abstract(1990))を含めた種々の手段によって送達した場合、動物で骨誘導効果を有する。 Purified BMP will, FG (Hattori, T., Nihonseikeigekagakkai Journal 64: 874-834 (1990); Kawamura et al., Clin Orthop Rel.Res 235:... 302-310 (1988); Schlag et al., .... Clin Orthop Rel Res 227: 269-285 (1988) and Schwarz et al., Clin Orthop Rel Res 238:..... 282-287 (1987)) and Zenchichimochi (Wang et al., J Cell. biochem 15F:. Q20 Abstract (1990)) when delivered by a variety of means including, with bone-inducing effect in animals. しかしながら、シュワルツ(Schwarz)ら(前掲)は、異所性骨誘導またはBMP−依存性骨再生に対するFGの明瞭な正または負の効果をいずれも証明していない。 However, Schwartz (Schwarz) et al. (Supra), both clear positive or negative effect of FG for ectopic bone induction or BMP- dependent bone regeneration not proven. 従って、これらの結果は矛盾し混乱している。 Therefore, these results are inconsistent and confusing.
TSはその細胞を用いて創傷領域に移動させて新しい組織を生じることができる「足場物質」としても働き得る。 TS may also act as a "scaffold material" capable of producing a new organization is moved to the wound area using the cells. しかしながら、商業的に入手可能なFGおよび他のTS類は、それらへのおよびそれらを通じての細胞移動を可能とするにはあまりにも濃過ぎる。 However, commercially FG and other TS acids available, too dark too to allow cell migration through to them and their. これはいくつかのイン・ビボ使用におけるそれらの有効性を限定する。 This limits their effectiveness in some in vivo uses.
骨偽関節欠陥と呼ばれる骨創傷の1のタイプにおいて、新しい骨形成が自然には起こらない最小ギャップがある。 In one type of bone wound, called bone nonunion defects, new bone formation and there is a minimum gap that does not occur in nature. 臨床的には、これらの状況のための治療は骨移植である。 Clinically, the treatment for these situations is bone grafting. しかしながら、骨移植の源は通常限定され、同種異系骨の使用はウイルス汚染の高度の危険を伴う。 However, the source of bone graft is usually limited, the use of allogeneic bone with the risk of high viral contamination. この状況のため、無機質が脱落しウイルス不活化された骨粉末は魅力的な解決である。 For this situation, the bone powder mineral is shed virus inactivation is an attractive solution.
D. D. 血管補綴人工的血管補綴は頻繁にポリテトラフルオロエチレン(PTFE)から作成され、ヒトおよび他の動物において所望の血管を置き換えるのに使用されている。 Vascular prosthetic artificial vascular prosthesis made from frequently polytetrafluoroethylene (PTFE), are used to replace the desired vessel in humans and other animals. 開通率を最大化し、血管補綴のトロンボゲン形成性を最小化するために、非オートロガス内皮細胞の補綴への着床を含めた種々の技術が使用されている。 To maximize patency rates and minimize the thrombogenicity of vascular prostheses various techniques, including implantation into prosthetic non autologous endothelial cells are used. 血管移植片および内皮細胞双方に接着する種々の基材が、内皮細胞着床を増加させるための中間的基材として調べられている。 Various substrates to adhere vascular grafts and endothelial cells both, have been investigated as an intermediate substrate to increase endothelial cell implantation. これらの基材は予備凝集した(preclotted)血液(Herringら,Surgery 84:498-504(1978),FG(Rosenmanら,J. Vasc. Surg. 2:778-784(1985);Schrenkら,Thorac. Cardiovasc. Surg. 33:6-10(1986);Kovekerら,Thorac. Cardiovasc. Surgeon 34:49-51(1986)およびZillaら,Surgery 105:515-522(1989))、フィブロネクチン(例えば、Keslerら,J. Vasc. Surg. 3:58-64(1986);Macarakら,J. Cell Physiol. 116:76-86(1983)およびRamalnjeonaら,J.Vasc.Surg.3:264−272(1986))、またはコラーゲン(Williamsら,J. Surg. res. 38:618-629(1985))を含む。しかしながら、これらの技術に伴う1つの一般的問題は、非オートロガス細胞を着床のために使用し、かくして、組織拒絶の可能性を生起するということである。加えて、密集した内皮細胞は通常確立されず、確立される These substrates were pre-agglomerated (preclotted) blood (Herring et al., Surgery 84: 498-504 (1978), FG (Rosenman et al., J Vasc Surg 2:... 778-784 (1985); Schrenk et al., Thorac ... Cardiovasc Surg 33:.. 6-10 (1986); Koveker et al, Thorac Cardiovasc Surgeon 34: 49-51 (1986) and Zilla et al, Surgery 105: 515-522 (1989)), fibronectin (e.g., Kesler al, J Vasc Surg 3:..... 58-64 (1986); Macarak al, J Cell Physiol 116: 76-86 (1983) and Ramalnjeona al, J.Vasc.Surg.3: 264-272 (1986 )), or collagen (Williams et al., J Surg res 38:.... 618-629 including (1985)) However, one common problem with these techniques, a non-autologous cells for implantation use, thus, that to rise to the possibility of tissue rejection is. in addition, dense endothelial cells are not normally established, it is established すれば数カ月を要する。この遅延の結果、血管補綴の高閉塞率がある(例えば、Zillaら,前掲参照)。 It takes several months if. The result of this delay, there is a high occlusion rate of vascular prostheses (e.g., Zilla et al., Supra).
E. E. 血管形成血管形成は新しい血管の誘導である。 Angiogenesis is the induction of new blood vessels. HBGF−1およびHBGF−2のごとき増殖因子は血管形成性である。 Such growth factors HBGF-1 and HBGF-2 are angiogenic. しかしながら、それらのコラーゲン海綿(Thompsonら,Science 241:1349-1352(1988));ビーズ(Hayekら,Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:876-880(1987));海綿様構造中に配置されたコラーゲンで被覆された固体PTFE繊維(Thompsonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7928-7932(1989))に付着させた;あるいは注入による(Puumalaら,Brain Res. 534:283-286(1990))イン・ビボ投与の結果、ランダムな非組織化血管が生じる。 However, those of collagen sponge (Thompson et al., Science 241: 1349-1352 (1988)); beads (Hayek et al., Biochem Biophys Res Commun 147:.... 876-880 (1987)); disposed spongiform structure collagen coated solid PTFE fibers (Thompson et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA86: 7928-7932 (1989)). to the deposited; or infusion by (Puumala et al, Brain Res 534: 283- 286 (1990)) in vivo results of the administration, random, non-organized blood vessels occurs. これらの成長因子はイン・ビボで所与の部位において新しい血管の成長を指示するために首尾よく使用されたことがない。 These growth factors have never been used successfully to direct the growth of new blood vessels at a given site in vivo. 加えて、プレキシガラスチャンバーに入れて皮下移植させたフィブリンゲル(0.5−10mg/ml)は、空のチャンバーまたは滅菌培地を充填したチャンバーと比較して、移植4日以内に血管形成を誘導する(Dvorakら,Lab. Invest. 57:673(1987))。 In addition, plexi fibrin gel placed in a glass chamber was implanted subcutaneously (0.5-10 mg / ml), compared with a chamber filled with empty chamber or sterile media to induce angiogenesis within transplantation 4 days (Dvorak et al., Lab Invest 57:.. 673 (1987)).
F. F. 部位特異的局所化薬物送達医学のいくつかの領域では効果的な部位特異的薬物送達系が大いに必要とされる。 Effective site-specific drug delivery systems in several areas of the site-specific localized drug delivery medicine is a great need. 例えば、局所化薬物送達は、抗微生物剤の全身投与が効果的でない歯周炎のごとき局所感染の治療で必要である。 For example, localized drug delivery is needed in the treatment of such systemic administration is ineffective periodontitis local infection of the antimicrobial agent. 全身投与後の問題は、通常、標的部位で達成できる抗微生物剤の低濃度に存する。 After systemic administration problem usually consists in the low concentration of antimicrobial agent that can be achieved at the target site. 局所濃度を上昇させるためには、全身投与量の増加は効果的であり得るが、毒性、微生物耐性および薬物不適合成をも生じかねない。 In order to increase the local concentration, increased systemic doses can be effective, toxicity, it could occur microbial resistance and drug unsuitable synthesis. これらの問題のいくつかを迂回するために、いくつかの別法が考案されるいるがいずれも理想的ではない。 To bypass some of these problems, several alternative methods have be devised not any ideal. 例えば、無定形の流動性塊としての水性媒質に分散されたコラーゲンおよび/またはフィブリノーゲン、および安定な定置が可能な蛋白質性マトリックス組成物も薬物を局所的に送達することが示されている(Luckらの米国再発行特許第33,375号;Luckらの米国特許第4,978,322号)。 For example, it has been shown that locally delivering amorphous collagen and / or fibrinogen dispersed in an aqueous medium as a flowable mass, and a stable stationary capable proteinaceous matrix composition also drugs (Luck et U.S. reissue Patent No. 33,375; Luck et al., U.S. Pat. No. 4,978,322).
種々の抗体(AB)がFGから放出されるが、比較的低濃度で、かつ数時間ないし数日の範囲の短時間であることが報告されている(Kramら,J. Surg. Res. 50:175-178(1991))。 While various antibody (AB) is released from FG, it has been reported that at relatively low concentration, and for a short time in the range of a few hours to several days (Kram et al., J. Surg. Res. 50 : 175-178 (1991)). ABのほとんどは自由に水に溶解する形態であって、それが調製される間にTSに添加されている。 Most AB in the form of freely soluble in water, is added to the TS while it is prepared. しかしながら、テトラサイクリン塩酸塩(TET HCl)およびAB類の他の自由に水に溶解する形態のFGへの取り込みは、AB補足FGの形成の間のフィブリン重合に干渉している(Schlagら,Biomaterials 4:29-32(1983))。 However, other free incorporation into FG form which dissolves in water tetracycline hydrochloride (TET HCl) and AB compounds are interfering with fibrin polymerization during the formation of the AB supplemented FG (Schlag et al., Biomaterials 4 : 29-32 (1983)). この干渉は、AB−FG混合物で達成できるTET HClの量および濃度を限定し、AB濃度依存性のようであった。 This interference limited the amount and concentration of the TET HCl that can be achieved with AB-FG mixture were as AB concentration dependent. FGからABへの比較的短い放出時間はAB補足TSの比較的短い寿命またはAB−TSにおけるABの形態および/または量を反映し得る。 Relatively short release time to AB from FG may reflect the form and / or amount of AB in a relatively short life or AB-TS of AB supplemented TS.
G. G. TS類からの制御された薬物放出いくつかの臨床的適用では、制御され局所化された薬物放出が望ましい。 In clinical application of some controlled drug release from TS class, controlled localized drug release is desirable. 前記したごとく、いくつかの薬物、特にAB類は、FGのごときTS類に一体化されそれから放出されている。 As mentioned above, some drugs, especially AB class is integrated in such TS such FG are emitted therefrom. しかしながら、明らかに、少なくとも部分的には薬物補足FGの比較的短い寿命の反映である薬物放出の持続に対する制御はほとんどまたは全くない。 However, apparently little or no control for sustained drug release is a reflection of the relatively short life of the at least partially drug supplemented FG. 従って、TSからの他の補足物の延長された一体化および延長された放出に対する新しい技術である、延長された薬物放出を可能とするFGおよび他のTS類を安定化する手段が望ましくかつ必要とされる。 Therefore, a new technique for prolonged integration and extended release of other supplements from TS, means of stabilizing the FG and other TS class to allow extended drug release is desirable and necessary It is.
H. H. 開示されたTS調製物は外傷創傷に対する救命非常事態治療を提供する。 TS preparations disclosed provides a life-saving emergency treatment for traumatic wounds.
外傷医療における継続的進歩に拘わらず、軍人および市民双方の集団の有意なパーセントが、毎年、致死的または重症の出血にかかる。 Regardless of the ongoing advances in trauma medicine, a significant percent of the military personnel and the citizens both of the population, every year, according to the bleeding of lethal or severe. 驚くほどの数の事故死は防止可能である。 Astonishing number of fatalities can be prevented. というのは、生命救助を達成できるものの存在の発生は、適当なツールおよび訓練があれば、それらの創傷を制御するからである。 Since the occurrence of the presence of what can be achieved life rescue, if there is appropriate tools and training, because control their wounds. 本明細書で開示するTSの利用可能性は、進歩した使用が容易で実践的止血調製物に対する長年の要求を満足し、訓練された医療人のみならず訓練されていない個人が迅速に外傷犠牲者で出血を減じることができるようにする。 Availability of TS disclosed herein satisfies the longstanding demand for easy and practical hemostatic preparations use advanced, individuals quickly trauma victim untrained not only medical professionals trained to be able to reduce the bleeding in person. 開示されたTSの利用性の結果、2重の利点;外傷死亡の減少、および入手可能な血液供給に対する要求の減少が生じる。 Use of the results of the disclosed TS, 2 double advantage; reduction of trauma deaths, and a decrease in demand for available blood supply occurs.
開示された技術は、災害状況における犠牲者集団の治療にも利用できる。 Disclosed techniques, can also be used in the treatment of victims population in the disaster situation. ひどい天然または人為災害が起こると、地方の病院および診療所は外傷医療を必要とする多数の個人で一杯となる。 When the terrible natural or human disaster occurs, local hospitals and clinics will be filled with a number of individuals who require trauma care. かかる災害の孤立する結果と併せると、血液および血液製品に対するその結果の要求はしばしば地方で入手できる供給を超過する。 Taken together with the results for the isolated of such accidents, the results demand for blood and blood products often exceed supply available at local. 多くの場合、地方の医療人に対する要求も訓練された個人の利用可能な数を超過する。 In many cases, it exceeds the available number of local requests for medical professionals were also trained individual. その結果、ひどくない負傷者が顧みられず、あるいは最適には至らない医療しか与えられない。 As a result, not be neglected is not badly injured, or not only given medical care that does not lead to the optimum. 以下に開示する使用が容易で自己含有されたTS調製物の利用性は、地方の医療人および災害救助者が負傷者に完全な医療が利用できるまで一時的な治療を供するのを可能とする。 Use of TS preparations used were readily self-containing disclosed below allows for the local medical professionals and disaster rescuer to provide temporary therapy to available full medical within wounded . さらに、開示されたTS調製物は、医療救援が供されるまで、災害犠牲者の自己治療を可能とする。 Furthermore, TS preparations disclosed until medical relief is provided to allow for self-treatment of disaster victims.
しばしば、血液喪失による死亡を防ぐためにかかる状況下で適用できる医療的処置の唯一の形態は圧迫包帯、止血帯および圧点である。 Often, the only form of medical treatment that can be applied in situations where such to prevent death from blood loss compression bandages, a tourniquet and pressure points. しかしながら、不運なことに、これらの各処置は連続的監視および注意が必要である。 Unfortunately, however, each of these treatments is required continuous monitoring and attention. かかる注意は緊急または災害状況では通常可能ではないので、過剰の血液喪失を首尾よく制御できる簡便で即効性の応急処置に対して当該分野で明確な要求がある。 Since such care is not normally possible in an emergency or disaster situations, there is a clear demand in the art for immediate emergency treatment with simple that can successfully control the excess blood loss.
軍人への開示したTS調製物の適用は、特に孤立した戦場状況においては容易に明らかとなる。 Application of TS preparations disclosed to military will become readily apparent in particular isolated battlefield conditions. 戦場における死亡の単一最大の原因は放血であり、これは現在まですべての戦闘犠牲者の50%までを占めていた。 The single biggest cause of death in the battlefield is exsanguination, which accounted for up to 50 percent of all combat casualties up to now.
発明の概要1の態様において、本発明は、TSを包含し、該シーラントは全厚さに渡る皮膚創傷治癒を阻害しない組成物を提供する。 In embodiments of the outline 1 of the invention, the present invention encompasses a TS, the sealant provides a composition that does not inhibit the skin wound healing over the entire thickness.
もう1つの態様において、本発明はTSを包含し、該シーラントの全蛋白質濃度は30mg/ml未満である組成物を提供する。 In another aspect, the present invention encompasses a TS, total protein concentration of the sealant provides a composition is less than 30 mg / ml.
もう1つの態様において、補足TSを包含し、全蛋白質濃度は30mg/ml未満であって、該補足物は成長因子(類)および/または薬物(類)である組成物を提供する。 In another aspect, it includes a supplemental TS, total protein concentration is less than 30 mg / ml, the supplemental material provides a composition is a growth factor (s) and / or drug (s).
もう1つの態様において、本発明は、補足TSを包含し、全蛋白質濃度は30mg/ml未満であって、該補足物は成長因子(類)および/または薬物(類)である組成物を提供する。 In another aspect, the present invention encompasses a supplemental TS, provides total protein concentration is less than 30 mg / ml, the supplemental material is a growth factor (s) and / or drug (s) compositions to.
もう1つの態様において、本発明は、TS、および有効濃度の少なくとも1種の成長因子を包含し、該成長因子の濃度は動物細胞の指向された移動を促進するのに効果的である、動物細胞の指向された移動(migration)を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the present invention encompasses at least one growth factor of TS, and the effective concentration, the concentration of the growth factor is effective in promoting the movement directed in animal cells, animal It provides a composition for promoting directed the migration of cells (migration).
もう1つの態様において、本発明は、TS、および有効濃度の少なくとも1種の成長因子を包含し、該濃度は創傷治癒を促進するのに効果的である創傷治癒を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the present invention encompasses at least one growth factor of TS, and the effective concentration, the concentration which provides a composition for promoting wound healing is effective in promoting wound healing .
もう1つの態様において、本発明は、TS、および有効濃度の少なくとも1種の成長因子を包含し、該濃度は血管補綴の内皮形成を促進するのに効果的である、血管補綴の内皮形成を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the present invention is, TS, and effective to include at least one growth factor of concentration, the concentration is effective in promoting the endothelialization of vascular prostheses, endothelialization of vascular prosthesis It provides a composition for promoting.
もう1つの態様において、本発明は、TS、および有効濃度の少なくとも1種の成長因子を包含し、該濃度は動物細胞の増殖および/または分化を促進するのに効果的である、動物細胞の増殖および/または分化を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the present invention encompasses at least one growth factor of TS, and the effective concentration, the concentration is effective in promoting growth and / or differentiation of animal cells, animal cells It provides a composition for promoting the proliferation and / or differentiation.
もう1つの態様において、本発明は、TS、および少なくとも1種の薬物を包含し、少なくとも1種の薬物の局所化送達を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the invention encompasses TS, and at least one drug, provides a composition that promotes localized delivery of at least one drug.
もう1つの態様において、本発明は、TS、および少なくとも1種の成長因子を包含し、少なくとも1種の成長因子の局所化送達を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the invention encompasses TS, and at least one growth factor, provides a composition that promotes localized delivery of at least one growth factor.
もう1つの態様において、TSおよび有効濃度の少なくとも1種の成長因子を含有し、該濃度が創傷治癒を促進するのに効果的である組成物を創傷に適用することよりなる創傷治癒を促進する方法を提供する。 In another embodiment, it contains at least one growth factor of TS and an effective concentration, the concentration promotes wound healing consists in applying a composition which is effective in promoting wound healing in a wound to provide a method.
もう1つの態様において、本発明は、TSおよび有効濃度の少なくとも1種の成長因子を含有し、該濃度が血管補綴の内皮形成を促進するのに効果的である組成物を血管補綴に適用することよりなる、血管補綴の内皮形成を促進する方法を提供する。 In another aspect, the present invention may contain at least one growth factor of TS and an effective concentration, concentration is effective and that the composition to promote endothelialization of vascular prosthesis applied to vascular prosthesis It consists in, to provide a method of promoting endothelialization of vascular prostheses.
もう1つの態様において、本発明は、有効濃度の少なくとも1種の成長因子を含有し、該濃度が細胞の増殖および/または分化を促進するのに効果的であるTSに十分に近接させて動物細胞を置くことよりなる、動物細胞の増殖および/または分化を促進する方法を提供する。 In another aspect, the present invention may contain at least one growth factor of the effective concentration, the concentration is allowed to sufficiently close to the TS is effective in promoting growth and / or differentiation of cells Animals consists in placing the cell, it provides a method of promoting the proliferation and / or differentiation of animal cells.
さらなる態様において、本発明は、少なくとも1種の薬物を含有するTSを組織に適用することよりなる、組織に少なくとも1種の薬物を局所化送達する方法を提供する。 In a further aspect, the present invention consists in applying a TS which contains at least one drug in tissue provides a method of delivering localized at least one drug in the tissue.
もう1つの態様において、本発明は、少なくとも1種の成長因子を含有するTSを組織に適用することよりなる、組織に少なくとも1種の成長因子を局所化送達する方法を提供する。 In another aspect, the present invention consists in applying a TS which contains at least one growth factor in the tissue, provides a method of delivering localized at least one growth factor in the tissue.
もう1つの態様において、本発明は、有効濃度の少なくとも1種の成長因子を含有し、該濃度が動物細胞の所望の指向された移動を生じるのに効果的であるTSを該細胞に十分近接させて置くことよりなる、動物細胞の指向された移動を生じさせる方法を提供する。 In another aspect, the present invention may contain at least one growth factor effective concentration sufficiently close to TS is effective in the cell to produce a movement of said concentration is desired directivity of animal cells is allowed consists in put, provides a method for producing a movement directed in animal cells.
もう1つの態様において、本発明は、(a)乾燥したウイルス不活化(virally-inactivated)精製フィブリノーゲン、(b)乾燥したウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、(c)水和に際して組織シール性フィブリン血餅を生じるのに有効な量のカルシウムおよび/または第XIII因子を包含する乾燥物質の層が付着された閉塞性(occlusive)裏打ちを備える、患者において創傷組織に組織シール性組成物を適用するための使用が簡便で即効性で実践的なフィブリン包帯を提供する。 In another aspect, the present invention is, (a) dry virus inactivation (virally-inactivated) purified fibrinogen, (b) an effective amount of a combination of dry virus inactivation purified thrombin, and optionally, (c) layers including dry substance calcium and / or factor XIII in an amount effective to produce a tissue seal fibrin clot during hydration is attached obstructive (occlusive) comprising a backing, tissue wounded tissue in a patient use for applying a sealing composition to provide a practical fibrin bandage simple and immediate.
さらなる態様において、本発明は、(a)乾燥したウイルス不活化精製フィブリノーゲン、(b)乾燥したウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、(c)水和に際して組織シール性フィブリン血餅を生じるのに有効な量のカルシウムおよび/または第XIII因子を包含する乾燥物質の層に付着された(1)閉塞性裏打ちよりなるフィブリン包帯を創傷に適用することによって患者において創傷組織を治療する方法を提供する。 In a further aspect, the present invention is, (a) dry virus inactivation purified fibrinogen, (b) an effective amount of a combination of dry virus inactivation purified thrombin, and optionally, tissue sealing fibrin during (c) hydrated the wound tissue in a patient by applying a fibrin bandage consisting of an effective amount of calcium and / or include dry substance layer attached to the (1) occlusive backing factor XIII to produce a clot in a wound to provide a method of treatment.
さらにもう1つの態様において、本発明は、(1)ウイルス不活化精製フィブリノーゲン、(2)ウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、(3)カルシウムおよび/または第XIII因子を包含する発泡性フォームとして処方され、該組成物は十分な厚みの皮膚創傷治癒を有意には阻害しない、患者において創傷組織を治療するための使用が簡便で即効性の実践的なフィブリン包帯剤を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides (1) viral inactivation purified fibrinogen, (2) virus inactivation effective amount of a combination of purified thrombin, and optionally, the (3) calcium and / or Factor XIII encompasses formulated as effervescent foam, the composition does not inhibit significantly skin wound healing sufficient thickness, a simple and immediate practical fibrin dressings used to treat wounded tissue in a patient provide.
さらなる態様において、本発明は、(1)ウイルス不活化精製フィブリノーゲン、(2)ウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および要すれば、(3)カルシウムおよび/または第XIII因子を包含し、該組成物は全厚さに渡る皮膚の創傷治癒を有意には阻害しない、組織シーラント発泡性フォーム包帯剤を創傷に適用することによって患者において創傷組織を治療する方法を提供する。 In a further aspect, the present invention provides (1) viral inactivation purified fibrinogen, (2) virus inactivation effective amount of a combination of purified thrombin, and optionally, include (3) a calcium and / or Factor XIII, the compositions do not significantly inhibit the wound healing of the skin over the entire thickness, provides a method of treating wounded tissue in a patient by applying a tissue sealant expandable foam dressing to the wound.
本発明の態様において、TSはFGであってよい。 In embodiments of the present invention, TS may be FG.
本発明の種々の態様において、FGは、局所フィブリノーゲン複合体(TFC)、ヒトトロンビンおよび塩化カルシウムを混合することから作製できる。 In various embodiments of the present invention, FG, the topical fibrinogen complex (TFC), can be made from mixing the human thrombin and calcium chloride. TFCの濃度の変更は、最終FGマトリックスの密度に対して最も重要な効果を有する。 Changing the TFC concentration has the most important effect on the density of the final FG matrix. トロンビンの濃度の変更は、最終FGの全蛋白質濃度に対して些細な効果を有するが、フィブリンへのTFCのフィブリノーゲン成分の重合に要する時間に対しては大きな効果を有する。 Changing the concentration of thrombin has the trivial effect on total protein concentration of the final FG, it has a large effect on the time required for polymerization of the fibrinogen component of the TFC into fibrin. この効果はよく知られているが、それを単独でまたは補足して使用する場合、FGの有効性を最大化するのに使用できることは一般に認識されていない。 This effect is well known, when using it alone or supplemental to, generally not recognized can be used to maximize the effectiveness of the FG. この効果のため、FG成分の混合とFGの硬化の間の時間を変更できる。 Because of this effect, it changes the time between cure the mixture and FG of the FG components. かくして、創傷における深い間隙にFGをより自由に流動させることができ、FGが硬化する前に創傷を完全に満たすことができる。 Thus, it is possible to more freely flowing FG deep gap in wound, FG can completely fill the wound prior to curing. 別法として、FGを十分迅速に硬化させて、特にもし創傷が加圧下で漏出する流体であれば(例えば、血液、リンパ、細胞間流体等)、創傷部位から出ることを防ぐことができる。 Alternatively, by sufficiently fast cure FG, particularly if as long as the fluid wound leaks under pressure (e.g., blood, lymph, intercellular fluid and the like) can be prevented, to leave the wound site. また、この特性は、外科手術によってのみ接近可能であった身体中の部位へのFGまたは補足FGの適用を可能とするのに重要な、長い通路を持つ送達デバイス、すなわち、カテーテル、内視鏡等をFGが動かなくするのを避けるのに重要である。 Furthermore, this property is important to allow the application of FG or supplemented FG to sites in the body were accessible only by surgery, delivery devices with long passages, i.e., catheters, endoscopes it is important to avoid jamming the FG and the like. この効果は、懸濁液中に不溶性補足物を保持し、それらがアプリケーター中または組織部位中で沈降するのを妨ぐという点でも重要である。 This effect, the insoluble supplements held in suspension, they are also important in that 妨Gu from settling at or in the tissue site applicator.
本明細書で使用するTFCとは精製されウイルス不活化されたヒト血漿蛋白質の凍結乾燥混合物である。 Is a lyophilized mixture of human plasma proteins from the TFC to be used is purified virus inactivation herein. 再構築(再構成)された場合、TFCは以下のものを含有する。 If the reconstructed (reconstructed), TFC contains the following.
合計蛋白質:100〜130mg/ml The total protein: 100~130mg / ml
フィブリノーゲン:(凝集可能蛋白質として)合計蛋白質の80%(最小) 80% of fibrinogen :( as condensable protein) Total Protein (Min)
アルブミン(ヒト):5〜25mg/ml Albumin (human): 5~25mg / ml
プラスミノーゲン:5mg/ml Plasminogen: 5mg / ml
第XIII因子:10〜40単位/ml Factor XIII: 10 to 40 units / ml
ポリソルベート−80:0.3%(最大) Polysorbate-80: 0.3% (maximum)
pH:7.1〜7.5 pH: 7.1~7.5
再構築したTFCは痕跡量のフィブリノーゲンも含有し得る。 TFC reconstructed may also contain trace amounts of fibrinogen.
本明細書で使用するヒトトロンビンとは、精製されウイルス不活化されたヒト血漿蛋白質の凍結乾燥混合物である。 The human thrombin used herein, is a lyophilized mixture of purified virus inactivated human plasma proteins. 再構築した場合、それは以下のものを含有する。 If reconstructed, it contains the following.
トロンビン効力:300±50国際単位/ml Thrombin potency: 300 ± 50 International Units / ml
アルブミン(ヒト):5mg/ml Albumin (human): 5mg / ml
グリシン:0.3M±0.05M Glycine: 0.3M ± 0.05M
pH:6.5〜7.1 pH: 6.5~7.1
塩化カルシウムは、トロンビンを活性化するのに十分な濃度で添加する。 Calcium chloride is added in sufficient concentration to activate the Thrombin. 十分なカルシウムがある限り、その濃度は重要ではない。 As long as there is sufficient calcium, its concentration is not critical.
成長因子を含有する本発明の組成物において、該組成物は阻害性化合物(類)および/または促進性化合物(類)を含有することができ、ここに、該阻害性化合物(類)は成長因子のいずれかの生物学的活性と干渉するシーラントの活性を阻害し、該促進性化合物(類)は、成長因子のいずれかの生物学的活性を増強し、媒介しまたは増大し、ここに、阻害性または促進性化合物の濃度は阻害、促進、媒介または増強を達成するのに効果的なものである。 In the compositions of the present invention containing growth factors, the composition can contain inhibitory compound (s) and / or accelerating compound (s), wherein, the said inhibitory compound (s) is growing inhibit any biological activity with the activity of interfering sealant factors, the accelerating compound (s) is to enhance one of the biological activity of growth factors, mediated or increased, here , the concentration of inhibitory or accelerating compound inhibits, promotes, an action which is effective to achieve mediated or enhanced.
本発明の成長因子補足TS類は、創傷、特に糖尿病個人における皮膚潰瘍のごとき容易に治癒しないものの治癒を促進するのに、および限定されるものではないがFGF−1、FGF−2、FGF−4、PDGF類、EGF類、IGF類、PDGF−bb、BMP−1、BMP−2、OP−1、TGF−β、軟骨−誘導因子−A(CIF−A)、軟骨−誘導因子−B(CIF−B)、類骨−誘導因子(OIF)、アンジオゲニン(類)、エンドセリン(類)、肝細胞成長因子およびケラチノサイト成長因子を含む成長因子を送達するのに、および創傷部位および成長因子(類)の間の延長された接触のための媒体を供するのに有用である。 Growth factors supplements TS compounds of the present invention, a wound, in particular for promoting the healing of those that do not heal such easily skin ulcers in diabetic individuals, and not limitation FGF-1, FGF-2, FGF- 4, PDGF compound, EGF acids, IGF compounds, PDGF-bb, BMP-1, BMP-2, OP-1, TGF-β, cartilage - inducing factor -A (CIF-A), cartilage - inducing factor -B ( CIF-B), osteoid - inducing factor (OIF), angiogenin (s), endothelin (s), for delivering growth factors, including hepatocyte growth factor and keratinocyte growth factors, and wound site and growth factor (s it is useful in providing a medium for prolonged contact between). 成長因子補足TSは火傷および他の皮膚創傷を治療するのに使用でき、それは成長因子(類)に加えて、TS、抗生物質(類)および/または鎮痛剤(類)等を含むことができる。 Growth factors supplemented TS can be used to treat burns and other skin wounds, which in addition to growth factor (s) may include TS, antibiotic (s) and / or analgesic agent (s), etc. . 成長因子補足TSは、皮膚創傷に対する皮膚のごとき天然または人工移植片の移植を助けるのに使用できる。 Growth factor supplement TS can be used to help implant of such natural or artificial grafts of skin to skin wounds. また、それらは、TSがFGF、EGF、抗生物質およびミノキシジル、ならびに他の成分を含有し得る、例えば毛髪移植において美容的に使用できる。 They also, TS is FGF, EGF, antibiotics and minoxidil, and may contain other ingredients, for example, for cosmetic use in hair transplantation. 本発明の組成物についてのさらなる美容的使用は、シリコーンまたは他の成分を使用する代わりに皺および傷を治療することである。 Additional cosmetic use for the compositions of the present invention is to treat wrinkles and scars instead of using silicone or other components. 本態様において、例えば、TSはFGF−1、FGF−4および/またはPDGF類および脂肪細胞を含有することができる。 In the present embodiment, for example, TS can contain FGF-1, FGF-4 and / or PDGF acids and adipocytes. 成長因子補足TS類は、その治癒を促進するために、外科創傷、骨折した骨または胃潰瘍および他のかかる内部創傷に適用することができる。 Growth factors supplements TS compounds can be applied to promote healing thereof, a surgical wound, fractured bone or gastric and other such internal wounds. 本発明のTS類は、例えば、移植片が天然組織よりなる場合のように、人工または天然を問わず、移植片を動物体内に一体化するのを助けるために使用できる。 TS compounds of the present invention, for example when the graft is made of natural tissue, whether artificial or natural, graft can be used to help integrate the animal. 本発明のTS類は、歯周炎のごときある種の疾患、すなわち執拗な感染、骨吸収、靭帯の喪失および歯周ポケットの未成熟内皮形成に関連する主要な問題のいくつかと戦うために使用できる。 TS compounds of the present invention, certain diseases such as periodontitis, namely relentless infection, used to combat some of the bone resorption, major problems associated with immature endothelialization loss and periodontal pockets ligament it can.
もう1つの態様において、本発明は、FG、DBMおよび/または精製BMP類の混合物を提供する。 In another aspect, the present invention is, FG, providing a mixture of DBM and / or purified BMP class. この混合物は、身体の細胞成分がそれに移動し、かくして、必要な場合に骨誘導を生じるのを可能とするマトリックスを提供する。 The mixture moves cellular components of the body to it, thus providing a matrix that allows the resulting osteoinductive if necessary. (フィブリノーゲンおよび第XIII因子のごとき)蛋白質類、(トロンビンおよびプラスミンのごとき)酵素類、BMP類、成長因子類およびDBMならびにそれらの濃度に関するマトリックス組成物は適当に処方して、この一時的足場物質構造の寿命および起こることが必要な骨誘導を最適化する。 (Fibrinogen and Factor XIII, such as) proteins, (thrombin and plasmin such as) enzymes, BMP, growth factors, and DBM and matrix composition for their concentration is suitably formulated, this temporary scaffold material optimize the lifetime and happens it is osteoinductive necessary structures. 全てのFG成分は骨成形の間を除いて生分解性であり、該混合物は、新しく形成された骨の形状および位置を決定できる非崩壊性足場物質を提供する。 All FG components are biodegradable except during bone molding, the mixture provides a non-disintegrating scaffold material capable of determining the shape and position of the newly formed bone. 骨再構成外科手術で問題である、軟組織の骨偽関節欠陥への崩壊はかくして回避されるであろう。 Is a problem in bone reconstruction surgery, the collapse of the bone nonunion defects of the soft tissues would will thus be avoided. 軟骨の発生を促進するCIF−AおよびCIF−B(後記参照)のごとき成長因子を補足したTSの使用は、喪失したまたは損傷した軟骨および/または損傷した骨の再構成で有用であろう。 Using TS supplemented with growth factors such as CIF-A and CIF-B promotes generation (see below) of the cartilage may be useful in the lost or damaged cartilage and / or damaged reconstituted bone.
好ましい態様において、創傷治癒を促進する能力を有する成長因子補足TSを提供するために、HBGF−1の有効濃度をFGに添加する。 In a preferred embodiment, in order to provide a growth factor supplement TS having the ability to promote wound healing, adding an effective concentration of HBGF-1 in the FG. もう1つの好ましい態様において、有効量の血小板由来抽出物をFGに添加する。 In another preferred embodiment, adding an effective amount of a platelet-derived extract FG. 他の好ましい態様において、有効濃度の少なくとも2種の成長因子の混合物をFGに添加し、有効量の成長因子(類)−補足FGを創傷組織に適用する。 In another preferred embodiment, the addition of a mixture of at least two growth factors effective concentration FG, the effective amount of growth factor (s) - supplementary FG applied to the wound tissue.
成長因子類に加え、薬物類、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体および限定されるものではないがDBMおよびBMP類を含めた他の成分類をTSに添加することができる。 In addition to growth factors, drugs include, but are not polyclonal and monoclonal antibodies and limited can be added to other ingredients, including the DBM and BMP class in TS. それらは創傷治癒を加速し、感染、新形成および/または他の疾患過程と戦い、TSにおける成長因子の活性を媒介しまたは促進し、および/またはTSにおける成長因子の活性を阻害するTS成分に干渉する。 They accelerate wound healing, infection, fight neoplasia and / or other disease processes, or to promote mediate activities of growth factors in TS, and / or the TS components that inhibit the activity of growth factor in TS have a finger in the pie. これらの薬物は限定されるものではないが、テトラサイクリンおよびシプロフロキサシンのごとき抗生物質:5−フルオロウラシル(5−FU)、タキソールおよび/またはタキソテーレのごとき抗増殖/細胞毒薬物:ガングシクロビル、ジドブジン、アマンチジン、ビダラビン、リバラビン、トリフルリジン、アシクロビル、ジデオキシウリジンおよびウイルス成分または遺伝子産物に対する抗体のごとき抗ウイルス剤:α−またはβ−またはγ−インターフェロン、α−またはβ−腫瘍壊死因子およびインターメイキン類のごときサイトカイン類:コロニー刺激因子:エリスロポエチン:ジフルカン、ケタコニゾールおよびニスタチンのごとき抗真菌剤:ペンタミジンのごとき抗寄生虫剤:α−1−抗トリプシンおよびα−1−抗キモトリプ These drugs are not limited to, tetracycline and ciprofloxacin, such as antibiotics: 5-fluorouracil (5-FU), taxol and / or taxotere of such antiproliferative / cytotoxic drug: gangcyclovir, zidovudine, amantidine, vidarabine, Ribarabin, trifluridine, acyclovir, antiviral agents such as antibodies to dideoxyuridine and viral components or gene products: alpha-or β- or γ- interferon, alpha-or β- tumor necrosis factor and inter Makin such cytokines classes: colony stimulating factors: erythropoietin: Diflucan, Ketakonizoru and nystatin of such antifungal agents: pentamidine such antiparasitic agents: alpha-1-antitrypsin and alpha-1-anti Kimotoripu ンのごとき抗炎症剤:ステロイド類:麻酔剤:およびホルモン類を含む。 Emissions of such anti-inflammatory agents: steroids: including and hormones: anesthetic. TSに添加することができる他の成分は、限定されるものではないが、ビタミン類および他の栄養補給剤:ホルモン類:糖蛋白質類:フイブロネクチン:ペプチド類および蛋白質類:炭水化物類(単純および/または複合体):プロテオグリカン類:抗アンジオテンシン類:抗原類:オリゴヌクレオチド類(センスおよび/またはアンチセンスDNAおよび/またはRNA):BMP類DBM:抗生物質(例えば、感染剤、腫瘍、薬物類またはホルモン類に対するもの):および遺伝子療法剤を含む。 Other components that can be added to the TS include, but are not limited to, vitamins and other nutritional supplements: hormones: glycoproteins such: fibronectin: peptides and proteins,: carbohydrates (simple and / or complex): proteoglycans: anti-angiotensin type: antigens: oligonucleotides (sense and / or antisense DNA and / or RNA): BMP class DBM: antibiotics (e.g., infectious agents, tumors, drugs such or hormones those for s): and a gene therapy agent. 遺伝的に改変した細胞および/または他の細胞を本発明のTSに含むこともできる。 Can also include genetically modified cells and / or other cells in the TS of the present invention. 本発明を実施するのに使用できる骨誘導性成分は、限定されるものではないが、オステオゲニン(BMP3):BMP−2:OP−1:BMP−2A、−2Bおよび−7:TGF−β、HBGF−1および−2:およびFGF−1および−4を含む。 Osteoinductive component that can be used to implement the present invention, but are not limited to, osteogenin (BMP3): BMP-2: OP-1: BMP-2A, -2B and -7: TGF-beta , HBGF-1 and -2: including and FGF-1 and -4. 加えて、TSを破壊しないいずれのものも本発明のTSに添加することができる。 In addition, it can also be added to the TS of the present invention any of those not destroy the TS.
本明細書に報告する研究は、予期せぬことに、遊離塩基TETまたはシプロフロキサシン(CIP)HClのごとき成分をFGまたはそれでのFGの処置に含ませると、補足FGに延長された寿命を賦与することを示す。 Life studies reported herein, unexpectedly, the inclusion of the free base TET or ciprofloxacin (CIP) HCl such ingredients in the treatment of FG of the FG at or, which is extended to supplement FG indicating that to impart. この現象はTSからの薬物放出の持続を増加させるのに活用できる。 This phenomenon can be exploited to increase the duration of drug release from the TS. 別法として、この現象は、やはりTET−FGに一体化させる、FGを安定化させるのに使用される化合物以外のもう1つの薬物(類)の放出を変調し、および/またはFGをイン・ビボまたはイン・ビトロで長時間存在させるのに活用できる。 Alternatively, this phenomenon also be integrated into TET-FG, modulate the release of another drug other than a compound used to stabilize the FG (s), and / or the FG-in It can be exploited to be present for a long time in vivo or in vitro.
一般に、TETの遊離塩基のごとき薬物の貧水溶性形態は、その自由に水に溶解する形態よりもTSからの薬物の送達を増加させる。 In general, poorly water soluble form of the free base of such drugs TET increases the delivery of the drug from the TS than the form of the freely soluble in water. 従って、薬物を、TS内のフィブリノーゲンまたは活性炭のごとき不溶性担体に結合させて、補足TSからの薬物の送達を延長させることができる。 Accordingly, the drug, and is bound to an insoluble carrier such as fibrinogen or activated carbon in the TS, it is possible to prolong the delivery of drug from supplemental TS.
もう1つの態様において、補足TSは、小器官で使用することができ、例えば、FGF−1、FGF−2、FGF−4およびOP−1のごとき成長因子を含有させることができよう。 In another embodiment, supplemental TS can be used in organelles, for example, it could be contained FGF-1, FGF-2, a growth factor such as FGF-4 and OP-1.
もう1つの態様において、本発明は、TSおよび有効濃度の抗生物質の少なくとも1種の貧水溶性形態よりなる、TETの遊離塩基形態のごとき抗生物質の貧水溶性形態、および他の薬物(類)の局所化送達を促進する組成物を提供する。 In another aspect, the present invention comprises at least one consisting of poorly water-soluble form, poorly water soluble form, and other drugs (class of antibiotics such as the free base form of TET antibiotics TS and an effective concentration ) to provide a composition that promotes localized delivery of.
本発明は、従前に使用されたTS組成物および方法よりも優れたいくつかの利点を有する。 The present invention has several advantages over TS composition used previously and methods. 第1の利点は、本発明の成長因子−および/または薬物−補足TS類は理想的な生分解性担体の多くの特徴を有することである。 The first advantage is that the growth factors of the present invention - and / or drug - Supplement TS class is to have many of the characteristics of an ideal biodegradable carrier. すなわち、それらはヒト蛋白質のみを含有するように処方でき、かくして、免疫原性問題および外来物−身体反応を排除または最小化し;それらの投与は有用であり;それらは宿主自体の天然フィブリン溶解系によって分解されるので、それらの宿主組織からの除去は必要ではない。 That is, they can be formulated to contain only human proteins, thus immunogenicity problems and foreign matter - to eliminate or minimize physical reaction; their administration is useful; natural fibrinolytic system thereof hosts themselves because it is degraded by the removal from their host tissue is not necessary.
第2の利点は、本発明は、成長因子および/または薬物を長期間、内部または外部創傷に効果的に送達する良好な方法を提供することである。 The second advantage is that the present invention, long-term growth factors and / or drugs, and to provide a good way to effectively deliver the internal or external wounds. いくつかの成長因子レセプターは少なくとも12時間占有されて、最大生物学的効果を生じなければならない。 Some growth factor receptors are occupied for at least 12 hours, it must occur a maximum biological effect. 従前には、そうする方法がなかった。 The previously, there was no way to do so. 本発明は、成長因子およびそのレセプターの間の延長された接触が起こることを可能とし、かくして、強力な生物学的効果が生じるのを可能とする。 The present invention allows prolonged contact between the growth factor and its receptor occurs, thus, to allow the resulting strong biological effects.
本発明の第3の利点は、動物細胞が本発明のTS類へおよびそれを通って移動でき、その中で増殖できることである。 A third advantage of the present invention, animal cells can migrate through the TS class and its invention is that it can grow therein. これは隣接する組織および補綴への細胞の移植を助力する。 This is to help the transplantation of cells into the adjacent tissue and the prosthesis. 欧州で入手可能なTS類の組成物に基づき、これはこれらの処方では不可能であると予測される。 Based on the composition of the TS class available in Europe, which is expected to be not possible with these formulations. 代わりに、動物細胞は商業的に入手可能なTSの回りを移動し、あるいはそれを消化しなければならない。 Instead, animal cells must digest moving around commercially available TS, or it. 商業的に入手可能なTSの欧州から米国への輸入は不法である(それらの米国での使用は米国FDAによって認可されていない)。 Imports into the United States from Europe commercially available TS is illegal (used in those the United States has not been approved by the US FDA).
第4の利点は、その最初の液体性質のため、本発明のTSは多くの従前に利用可能であった送達系よりもより徹底的にかっ完全に表面を被覆することができる。 The fourth advantage is due to its initial liquid nature, TS of the present invention can cover more thoroughly cut completely surface than delivery systems were available to many previously. これは生体物質を被覆するにおいて、および血管補綴の内皮形成において、本発明の使用で特に重要である。 This in coating the biological material, and in endothelial formation of blood vessels prosthesis is particularly important in the use of the present invention. 何故ならば、成長因子補足FGは血管補綴の内部、外部および孔を被覆するだろうからである。 Because growth factor supplemented FG is because going to cover the inside of a blood vessel prosthesis, the external and pore. この結果、TSへおよびそれを通って移動する内皮細胞の能力がプラスされると、オートロガス内皮細胞の移植は血管補綴の全長に沿って起こり、それにより、そのトロンボゲン形成性および抗原性を減少させる。 As a result, the ability of endothelial cells to migrate through the and it TS is positive, transplantation of autologous endothelial cells occur along the entire length of the vessel prosthesis, thereby decreasing its thrombogenicity and antigenicity . 従前に使用されたTS類では、移植は血管補綴の末端で開始し、ともかくその内部まで進行し、かくして、長期間のトロンボゲン形成性および抗原性を発生させる。 The TS acids used previously, transplanted starts at the end of the vessel prosthesis, anyway progressed to the interior, thus to generate a long-term thrombogenicity and antigenicity. 血管補綴で従前に使用されたTS類は、まず、身体によって拒絶され、補綴を通る血液の剪断力によって容易に洗い流され得る非オートロガス細胞を着床させた。 TS acids used previously in vascular prosthesis is first rejected by the body, was landed non autologous cells that can be easily washed off by the shearing force of blood through the prosthesis.
第5の利点は、本発明の補足および非補足TSは成形でき、かくして、ほとんどいずれの形状にも通常作製できることである。 A fifth advantage is supplemented and unsupplemented TS of the present invention may be molded, thus, it is that usually can be produced in almost any shape. 例えば、FGのごときTSはBMP類および/またはDBMを補足でき、最も適切に骨創傷を治療するのに必要な形状に通常作製できる。 For example, TS such as FG can supplement BMP acids and / or DBM, usually can be prepared in the most proper shape necessary to treat the bone wounds. これは、DBM粉末がその形状を維持しないでうあろうからDBM粉末ではなすことができない。 This can not speak with DBM powder because DBM powder will allo will not maintain its shape.
第6の利点は、TET−FGのごとき本発明のAB補足FGは、非補足FGのそれと比較してFGの寿命および安定性を予期せぬことに増大させたことである。 The advantage of the sixth, AB supplemented FG of this invention, such as TET-FG is that compared to that of unsupplemented FG was increased unexpectedly lifetime and stability of the FG. この増大された安定性は、認識可能な量のABがもはやFGに存在しない後であっても継続する。 The increased stability, AB recognized amounts no longer be continued even after that does not exist in the FG. 例えば、新しく形成されたFG血餅を、遊離塩基TETから生成したTETの飽和溶液またはCIP HClの溶液に浸漬させるとFG血餅を生じ、これは実質的に全てのTETまたはCIPがFG血餅を去った後でも安定で保存される。 For example, the newly formed FG clot and is immersed in a solution of saturated solution or CIP HCl of TET produced from free base TET produce FG clot which substantially all of the TET or CIP has FG clot It is stored stable even after leaving. この効果がいかに生じるかについていずれかの理論に束縛されるつもりはないが、TETまたはCIPのごときABはTFCに存在するプラスミノーゲンを阻害し、FGを破壊すると考えられる。 This effect is not intending to be bound by any theory for how occurs, AB such as TET or CIP, inhibits plasminogen which exists in TFC, is believed to destroy the FG. 一旦プラスミノーゲンが阻害されると、その継続する阻害はFGに残存するTETまたはCIPの認められる量に依存しないようである。 Once the plasminogen is inhibited, inhibition of its continuation does not appear to depend on the amount found the TET or CIP remaining in the FG. この安定化効果の結果、TSの増大した貯蔵寿命、および恐らくはイン・ビボでの増大した持続を予期することができる。 As a result of the stabilizing effect, it is possible to anticipate increased persistence in increased shelf life, and possibly in vivo for TS.
本発明の第7の利点は、TSの延長された寿命および安定性の直接的結果である。 Seventh advantage of the present invention is a direct result of the prolonged longevity and stability of the TS. TSの安定性におけるこの予期せぬ増大の結果、AB補足FGを用いて、薬物(類)および/または成長因子(類)の局所化された長期間送達を生じさせることができる。 The result of this unexpected increase in stability of the TS, by using the AB supplemented FG, can give rise to localized long-term delivery of a drug (s) and / or growth factor (s). この送達は、TETまたはCIPのごとき安定化薬物が実質的にTSを去った後でも継続するであろう。 This delivery, TET or CIP of such stabilizing drug will continue even after leaving substantially TS. 遊離塩基のごとき薬物の固体形態、好ましくは貧水溶性形態を、例えば、TETまたはCIPによって安定化されたTSに含ませると、安定化されたTSが長期間、その薬物(または成長因子)を局所的に送達するのを可能とする。 Solid forms such as free-base drug, preferably poorly water-soluble form, for example, the inclusion in the TS, which is stabilized by TET or CIP, long-term stabilized TS is, the drug (or growth factor) to allow for topical delivery. 遊離塩基TETのごとき薬物のいくつかの形態は、TSの安定化および延長された送達の双方を可能とする。 Some forms of drugs, such as free base TET permits both delivery stabilized and extension of TS. 他の薬物は一方または他方を可能とするが双方を可能とはしない。 Other drugs allows for one or the other but not allow both. 延長された局所化薬物送達を生じるためのTSの安定化で用いる化合物は従前には当該分野で知られていない。 Compounds used in the stabilization of the TS for producing extended localized drug delivery are previously not known in the art.
本発明の第8の利点はそれが部位特異的血管形成をイン・ビボで起こるのを可能とすることである。 Eighth advantage of the present invention is to enable it happen site specific angiogenesis in vivo. 他の者は局所化された非特異的血管形成を示しているが(前掲)、いずれの者も部位特異的血管形成を促進するTSを使用していなかった。 While others show nonspecific angiogenesis is localized (supra), it did not use TS to promote site-specific angiogenesis any person.
本発明の第9の利点は、TSの成分は使用が簡便で即効性の実践的包帯剤のいくつかの形態に処方できるので、今や、出血する外傷創傷からの出血を制御し、それにより、従前に失われた多数の命を救うことができることである。 Ninth advantage of the present invention, the components of the TS can be formulated into some form of simple and immediate practical dressing used, now, to control bleeding from the bleeding trauma wounds, whereby it is that it is possible to save many lives lost previously. かかる創傷を治療する生命救助方法は、訓練された医療人または十分に設備の整った病院で可能であるが、本発明は、緊急または災害状況において、訓練されていない個人が医療助力が得られるまで外傷負傷者を処置して出血を制御するのを可能とする使用が容易な応急(自己適用性でさえある)処置に対する社会の長い間の要望を満足する。 Life rescue method for treating such wounds, but is possible with trained medical professionals or well-equipped hospital of the well-equipped, the present invention provides, in an emergency or disaster situation, personal medical assistance that has not been trained obtained until use that allows to control the bleeding by treating traumatic injuries (even self applicability) easy emergency satisfy the demands of long society to treatment.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
図1は、増大させていく濃度のヘパリンの存在下における250U/mlトロンビンと共にインキュベートしたHBGF−1βを含有する試料についてのゲルのウェスタンブロットを示す。 Figure 1 shows a Western blot of the gel of the samples containing HBGF-l [beta] were incubated with 250 U / ml thrombin in the presence of heparin concentrations gradually increased. HBGF−1β(10μg/ml)、トロンビン(250μg/ml)および増大させていく濃度のヘパリン(0、0.5、5、10、20および50単位/ml)を含有する溶液を37℃で72時間インキュベートした。 HBGF-1β (10μg / ml), thrombin (250 [mu] g / ml) concentrations of gradually and is increased heparin (0,0.5,5,10,20 and 50 units / ml) 72 solution 37 ° C. The containing time was incubated. インキュベートする混合物の各々から周期的にアリコットを取り出し、レムリ(Laemmli)(Nature 227:680(1970))によって記載されているごとくに調製し泳動させる8%SDSポリアクリルアミドゲルに負荷した。 Periodically removed aliquot from each incubation to the mixture, Laemmli (Laemmli) (Nature 227: 680 (1970)) was loaded onto 8% SDS-polyacrylamide gels for electrophoresis were prepared as described by. 次いで、該ゲルをニトロセルロースに電気ブロットし、HBGF−1βに対応するバンドを、アフィニティー精製したHBGF−1βに対するポリクローナルウサギ抗血清を用いて同定した。 Then the gel were electroblotted to nitrocellulose, the band corresponding to HBGF-l [beta], were identified using polyclonal rabbit antisera to HBGF-l [beta] affinity purified. インキュベートする混合物中のヘパリンの濃度は:パネルA)0単位/ml:パネルB)0.5U/ml;パネルC)5U/ml:パネルD)10U/ml:パネルE)20U/ml:およびパネルF)50U/mlであった。 Concentrations of heparin in the mixture is incubated: Panel A) 0 units / ml: Panel B) 0.5U / ml; panel C) 5U / ml: panel D) 10 U / ml: Panel E) 20 U / ml: and Panel It was F) 50U / ml. パネルA−Fの各々に描いたゲルにおいて、各レーンは以下のものを含有する:レーン1はSDS−PAGE低分子量標準を含有する;レーン2はビオチン化標準を含有する;レーン3は10μg/mlHBGF−Iβを含有する;レーン4は250U/mlトロンビンを含有する;およびレーン5−13は、時点0、1、2、4、6、8、24、48および72時間でインキュベートする混合物から取り出した試料を含有する。 In the gel depicted in each panel A-F, each lane contains the following: lane 1 contains SDS-PAGE low molecular weight standards; lane 2 contains biotinylated standards; Lane 3 10 [mu] g / containing mlHBGF-Iβ; lane 4 contains 250 U / ml thrombin; and lanes 5-13 are removed from the mixture is incubated at 0,1,2,4,6,8,24,48 and 72 hours containing the sample.
図2は、相対的HBGF−1β濃度の関数としての3 H−チミジンの取込を示す。 Figure 2 shows the incorporation of 3 H- thymidine as a function of the relative HBGF-l [beta] concentrations. 250U/mlのトロンビンおよび5U/mlのヘパリンの存在下、図1および実施例2に記載したごとくに、1HBGF−1βの試料を0、24または72時間インキュベートした。 The presence of 250 U / ml of thrombin and 5U / ml heparin, in as described in Figure 1 and Example 2, the samples were incubated for 1HBGF-1β 0,24 or 72 hours. 次いで、これらの試料の希釈物をNIH 3T3細胞に添加し、これを実施例3に記載したごとくに平板培養した。 Then added dilutions of these samples NIH 3T3 cells were plated as described it to the third embodiment. CPMをHBGF−1濃度に対してプロットする。 The CPM is plotted against HBGF-1 concentration.
図3。100ng/mlの活性な野生型FGF−1を補足したFG上での7日間の増殖後におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of FIG 3.100ng / ml of active, wild-type human umbilical vein endothelial cells after 7 days of growth of the FGF-1 on FG supplemented. 非常に多数の細胞およびそれらの細長い形状に注意されたい。 Note large number of cells and their elongated shape. 非補足FG上で増殖させた細胞(図3)の少数と比較されたし。 It was compared with the small number of cells grown on unsupplemented FG (Figure 3).
図4。10ng/mlの活性な野生型FGF−1を補足したFG上での7日間の増殖後におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of FIG 4.10ng / ml of active, wild-type human umbilical vein endothelial cells after 7 days of growth of the FGF-1 on FG supplemented. 非常に多数の細胞およびそれらの細長い形状に注意されたい。 Note large number of cells and their elongated shape. 非補足FG上で増殖させた細胞(図5)の少数と比較されたし。 It was compared with the small number of cells grown on unsupplemented FG (Figure 5).
図5。 Figure 5. 非補足FG上で7日間増殖させた後における臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of umbilical vein endothelial cells after providing grown on unsupplemented FG 7 days. 図3および4における細胞数と比較して、より遅い増殖速度を示す、少数の細胞に注意されたし。 Compared to the number of cells in Figures 3 and 4 show a slower growth rate, Note the small number of cells.
図6。100ng/mlの不活性な突然変異体FGF−1を補足したFG上での7日間の増殖後におけるヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of FIG 6.100ng / ml of human umbilical vein endothelial cells after growth for 7 days on FG supplemented with inactive mutant FGF-1. 図3および4における細胞数と比較して、より遅い増殖速度を示す、少数の細胞に注意されたし。 Compared to the number of cells in Figures 3 and 4 show a slower growth rate, Note the small number of cells.
図7。 Figure 7. PG1ml当たり10 5細胞の濃度でFGに埋め込んだ24時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of human umbilical endothelial cells at 24 hours post embedded in FG at a concentration of 10 5 cells per PG1ml. FGの蛋白質およびトロンビン濃度は、各々、4mg/mlおよび0.6NIH単位/mlであった。 Protein and thrombin concentrations of the FG, respectively, was 4 mg / ml and 0.6NIH units / ml. それらの細長い多足状形態およびそれらは相互に接触する細胞ネットワークを形成することに注意されたい。 Elongated their multi-legged shaped form and they should be noted that to form a cell network in contact with each other. フィブロネクチン中で増殖させた同様の細胞の丸石形態(図9)と比較されたい。 Cf. cobblestone form of similar cells grown in fibronectin (Fig. 9).
図8。 Figure 8. FG1ml当たり10 5細胞の濃度でFG中に埋め込んだ48時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of human umbilical endothelial cells in 48 hours after embedded in FG at a concentration of 10 5 cells per FG1ml. 培養条件は図7に記載したものである。 The culture conditions are as described in FIG. さらに際立った細長して多足状形態および細胞ネットワークの増大する発生に注意されたい。 Note further pronounced elongated to increasing occurrence of multi-legged shaped morphology and cellular networks. フィブロネクチン中で増殖させた丸石形状細胞(図10)と比較し、後者における細胞ネットワークの欠如に注意されたい。 Compared with cobblestone shape cells grown in fibronectin (Fig. 10) Note the lack of cellular network in the latter.
図9。 Figure 9. フィブロネクチンを被覆した表面で培養した24時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of human umbilical endothelial cells in 24 hours after cultured in fibronectin was coated surface. 細胞の丸石形状および細胞ネットワークの欠如に注意されたい。 Note the lack of cobblestone shape and cellular network of cells. 図7と比較されたい。 It is to be compared with FIG. 7.
図10。 Figure 10. フィブロネクチンの通常の使用されるフィルム中で培養した48時間後におけるヒト臍帯内皮細胞の典型的パターン。 Typical pattern of human umbilical endothelial cells in 48 hours after cultured in a film in which the normal use of fibronectin. 細胞の丸石形状および細胞ネットワークの欠如に注意されたい。 Note the lack of cobblestone shape and cellular network of cells. 図8と比較されたい。 It is to be compared with FIG. 8.
図11。7日後(パネルA、C、E)または28日後(パネルB、D、F)におけるイヌから外植したPTFE血管移植片の断面の顕微鏡写真。 Figure 11. After 7 days (panel A, C, E) or after 28 days (panels B, D, F) micrographs of a cross section of the PTFE vascular graft explanted from dogs in. 移植に先立ち、移植片は処理しないか(AおよびG)、FG単独で被覆するか(CおよびD)、またはヘパリンおよびHBGF−1を補足したFGで被覆した(EおよびF)。 Prior to transplantation, the graft coated with or not treated (A and G), or coated with FG alone (C and D), or supplemented with heparin and HBGF-1 FG (E and F).
未処理対照(AおよびB)は、最小の間葉組織内部成長を示し、両者の間隙はフィブリン凝塊が充填され、それらの管腔表面はフィブリン凝塊で被覆されていた。 Untreated control (A and B) showed minimal mesenchymal tissue ingrowth, both gaps fibrin clot is filled, their luminal surface was coated with fibrin coagulum. FG−処理移植片は移植片間隙の外方半分においてのみ間葉組織内部成長を示し、残りはフィブリン凝塊が充填されていた。 FG- treated grafts showed only mesenchymal tissue ingrowth in the outer half of the grafts gap remainder fibrin clot was filled. 非常に少数の間隙毛細血管が存在した。 Very few of the gap capillaries were present. 対照的に、FGF−1を含有するFGで処理した移植片はより豊富な間隙内部成長を示し、28日までには、多数の毛細血管、筋芽細胞およびマクロファージを示し、内部のカプセルは密集した内皮細胞層の直下のいくつかの層の筋芽細胞よりなっていた。 In contrast, grafts treated with FG containing FGF-1 showed more abundant interstitial ingrowth and until 28 days, a large number of capillaries, shows myoblasts and macrophages, the interior of the capsule is compact It was had been than myoblasts several layers immediately below the endothelial cell layer. 移植128日後における同様の移植片結果は同様であり、より多数の毛細血管がFG+FGF−1群にあった(データは示さず)。 Similar implants results after implantation 128 days are similar, a greater number of capillaries was in FG + FGF-1 group (data not shown).
図12。 Figure 12. 移植28日後における図11に記載した血管移植片の内部ライニングの走査型顕微鏡写真。 Scanning electron micrograph of the internal lining of the vascular grafts described in Figure 11 after transplantation 28 days. 移植片は処理しないか(G)、FG単独で被覆するか(H)、あるいはヘパリンおよびHBGF−1を補足したFGで被覆した(I)。 Or graft not process (G), or coated with FG alone (H), or coated with FG supplemented with heparin and HBGF-1 (I). 未処理対照移植片(G)は、赤血球、血小板を含有する血栓の領域、および暴露したPTFE移植片物質の領域(写真の中央および頂部に見える)の真中に内皮細胞被覆のまばらな領域を示した。 Untreated control grafts (G) is, red blood cells, showed sparse areas of middle endothelial cells covering the thrombus region containing platelets, and areas of exposed PTFE-graft material (visible in the center and top of the photograph) It was. FG単独で被覆した移植片(H)は、フィブリン凝塊の領域の真中に内皮細胞の島を示した。 FG alone coated grafts (H) showed islands of endothelial cells in the middle region of the fibrin clot. 対照的に、FG+HBGF−1で処理した移植片(I)は、血流の方向に沿って配向した密集内皮細胞を示した。 In contrast, grafts treated with FG + HBGF-1 (I) showed dense endothelial cells oriented along the direction of blood flow.
図13。 Figure 13. アルミニウムモールドを用いて調製した厚さ1mmおよび直径8mmのディスク形状移植片の調製。 Preparation of disc-shaped implants with a thickness of 1mm and 8mm diameter prepared using an aluminum mold.
図14。 Figure 14. DBM単独による、FG移植片による、あるいはDBM−FGによるラットにおける骨形成の誘導のための筋肉内バイオアッセイのダイアグラム。 DBM alone by intramuscular diagram bioassay for induction of bone formation in rats by by FG ​​implants or DBM-FG,.
図15。 Figure 15. DBM−FGによる頭蓋冠移植片における骨吸収の誘導を説明するダイアグラム。 Diagram illustrating the induction of bone resorption in calvarial implants by DBM-FG.
図16。 Figure 16. DBM−FGまたはFGの筋肉内移植片からの手術28日後における放射線−不透明性データ。 Radiation in the operating 28 days after the intramuscular implants of DBM-FG or FG - opacity data.
図17。 Figure 17. 手術後28日、3カ月および4カ月におけるDBM−FG(30mg/ml)頭蓋冠移植片からの放射線−不透明性データ。 28 days after surgery, radiation from DBM-FG (30mg / ml) calvarial implants at 3 months and 4 months - opacity data.
図18。 Figure 18. 図18Aは処理動物における外科手術後28日における開頭部位の写真である。 FIG. 18A is a photograph of the open head position in the 28 days after surgery in the treated animals.
図18Bは手術後28日における未処理対照からの頭蓋冠創傷の写真である。 Figure 18B is a photograph of the calvarial wound from an untreated control at 28 days after surgery. 繊維状結合組織のみが開頭創傷を横切って発育したことに注意されたい。 It should be noted that only fibrous connective tissue has been developing across the craniotomy wound.
図19。 Figure 19. DBM粒子のみで処理した動物の開頭創傷からの写真。 Photos from the craniotomy wound of only animals treated with DBM particles.
図20。 Figure 20. DBM−FG(15mg/ml)に応答して開頭部位で形成された新しい骨の写真。 New bone Pictures formed in craniotomy site in response to DBM-FG (15mg / ml).
図21。 Figure 21. DBM−Fg(15mg/ml)に応答して開頭部位で形成された新しい骨の写真。 New bone Pictures formed in craniotomy site in response to DBM-Fg (15mg / ml). 典型的には、DBM移植片単独と比較して、DBM−FGディスクを移植した開頭創傷でより多く骨髄が形成されたことに注意されたい。 Typically, compared with DBM implants alone, it should be noted that more bone marrow formed in craniotomy wounds implanted with DBM-FG disks.
図22。37℃におけるFGの3×6mm直径ディスクからのTETの放出。 Release of TET from 3 × 6 mm diameter disks of FG at Figure 22.37 ° C.. 放出されたTETの濃度は、毎日取り替えた2mlのPBS上清中、分光光度法により測定した。 The concentration of released TET during PBS supernatant 2ml was changed daily, it was determined by spectrophotometry. これらの「静的」イン・ビトロ実験のうちの2つは実施して同一結果が得られた。 The two are the same results with the implementation of one of these "static" in vitro experiments were obtained. それらのうちの1つの結果をここに示す。 It shows the result of one of them here.
図23。37℃におけるFGの3×6mm直径ディスクからのTETの放出。 Release of TET from 3 × 6 mm diameter disks of FG at Figure 23.37 ° C.. 該ディスクは100mg/mlのTETよりなり、2mlのPBSを満たした密閉容器に入れた。 The disk is made of TET of 100 mg / ml, it was placed in a sealed container filled with PBS for 2 ml. TET濃度は3ml/日の率で連続的に交換したPBS流出物において分光光度法により測定した。 TET concentration was measured spectrophotometrically in PBS effluent was continuously exchanged at a rate of 3 ml / day. PBS上清の容量はほぼ2mlにて一定に保持した。 Volumes of PBS supernatant was kept constant at approximately 2 ml. データは2の実験の平均である。 Data are the mean of 2 experiments.
図24。37℃における、50または100TETmg/mlFGを含有する3×6mm直径データからのTETの唾液への放出。 In Figure 24.37 ° C., release into TET saliva from 3 × 6 mm diameter data containing 50 or 100TETmg / mlFG. TET濃度は、毎日取り替えた0.75mlの唾液上清において分光光度法により測定した。 TET concentration was measured spectrophotometrically in the saliva supernatant 0.75ml which was replaced daily. これらの実験で使用した唾液を10のドナーからプールし、遠心し、濾過し、4℃に維持した。 The saliva used in these experiments were pooled from 10 donors, centrifuged, filtered and kept at 4 ° C..
図25。 Figure 25. TET補足FGの安定性は対照FGのそれと比較して増大した。 Stability of TET supplemented FG was increased compared to that of control FG. 15日間にわたるTETを含まないおよび50および100mg/mlTETを含む3×6mm直径FGマトリックスの写真。 Images of 3 × 6 mm diameter FG matrix comprising and 50 and 100mg / mlTET containing no TET for 15 days. ディスクは毎日交換する0.75mlの唾液中に維持した。 Disk was maintained in the saliva of 0.75ml to be replaced every day. 唾液を10のドナーからプールした。 Saliva were pooled from 10 donors. 次いで、それを遠心し、濾過し、本実験で使用する前に4℃で貯蔵した。 It was then centrifuged, filtered and stored at 4 ° C. prior to use in this experiment. 第9日において、TETを含有しないFGマトリックスは、50または100mg/mlのTETいずれかを含有するマトリックスよりも崩壊したことに注意されたい。 In a ninth day, FG matrix containing no TET is noted that than matrices containing either 50 or 100 mg / ml of TET collapsed. また、第15日には、TETを含有しないFGマトリックスはほとんど全部崩壊したのに対し、50または100mg/mlのTETを含有するFGマトリックスはほとんど変化しなかったことにも注意されたい。 Further, in the first 15 days, FG matrix containing no TET whereas was almost entirely collapsed, FG matrices containing TET 50 or 100 mg / ml is noted also that hardly changed. 従って、50または100mg/mlのTETを含有させると、イン・ビトロにて唾液中のFGマトリックスの寿命を劇的に延長した。 Therefore, the inclusion of TET 50 or 100 mg / ml, dramatically extend the life of the FG matrix in saliva in vitro.
図26。 Figure 26. TET補足FGから放出されたTETの抗菌活性。 Released from TET supplemented FG was TET antibacterial activity. 3×6mmのTET補足FGディスクを囲む2mlPBSを毎日取り替えた。 The 2mlPBS surrounding the 3 × 6mm of TET supplement FG disk was replaced every day. 放出されたTETの抗微生物活性をテストするために、収集した溶出物を含浸させた6mmペーパーディスクを、イー・コリ(E. coli)を含有する寒天プレート上で37℃で18時間インキュベートした。 To test the antimicrobial activity of the released TET, collected 6mm paper disks impregnated with eluates were incubated for 18 hours at 37 ° C. on agar plates containing E. coli (E. coli). 次いで、阻止ゾーンの直径を測定した。 Then, to measure the diameter of the blocking zone.
図27。 Figure 27. FGマトリックスからのシプロフロキサシン、アモキシシリンおよびメトロニダゾールの放出。 Ciprofloxacin from FG matrices, amoxicillin and release of metronidazole. 各抗生物質の100mg/mlを含有する個々の3×6mm直径ディスクを37℃にてリン緩衝化生理食塩水2mlに浸漬した。 Individual 3 × 6 mm diameter disks containing 100 mg / ml of each antibiotic was immersed in phosphate buffered saline 2ml at 37 ° C.. 上清を毎日取り替え、抗生物質濃度を、各々、275、274および320nmにおいて分光光度法により測定した。 Replacing the supernatant every day, the antibiotic concentration, respectively, were determined spectrophotometrically at 275,274 and 320 nm.
図28。 Figure 28. TET補足FGディスクからのTET放出は、TET−FGディスクを浴するPBSの温度に比例していた。 TET release from TET Supplemental FG disks was proportional to the temperature of the PBS bathing the TET-FG disks.
図29。 Figure 29. TET−FGからのTETの放出に対するFG蛋白質濃度の効果。 The effect of FG protein concentration on the release of TET from TET-FG. より高いFG蛋白質濃度の結果、TET−FGからのより遅いTET放出速度となる。 Result of higher FG protein concentration, the slower TET release rate from the TET-FG.
図30。5−FU補足FGからの5−FUの放出は5−FUの固体形態の使用によって延長された。 Release of 5-FU from Figure 30.5-FU supplemented FG was prolonged by the use of solid forms of 5-FU.
図31。 Figure 31. フィブロネクチンに対するNIH 3T3の走化性応答の用量−応答関係。 Doses of chemotactic response of NIH 3T3 to fibronectin - response relationship. 濃度を段階的に増加させるグラジエントのフィブロネクチンを修飾されたボイデン(Boyden)チャンバーの低方ウェルに添加した。 Concentration was added to the low way well of stepwise Boyden modified fibronectin gradient increasing (Boyden) chamber. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはフィブロネクチンが、用量の関数として、それに向かうNIH 3T3細胞の走化性を誘導したことを示した。 Expressed as, which fibronectin, as a function of dose, indicating that induced NIH 3T3 cell chemotaxis towards it.
図32。 Figure 32. FGF−1に対するNIH 3T3線維芽細胞の走化性応答の用量−応答関係。 Doses of chemotactic response of NIH 3T3 fibroblasts for FGF-1 - response relationship. ヘパリンの存在下、濃度を段階的に増加させるグラジエントのFGF−1を修飾されたボイデン(Boyden)チャンバーの低方ウェルに添加した。 Presence of heparin was added to the low way well of FGF-1 modified Boyden (Boyden) chamber a gradient of increasing concentration stepwise. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGF−1が、用量の関数として、それに向かうNIH 3T3細胞の走化性を誘導したことを示した。 It expressed as, which is FGF-1 is, as a function of dose, indicating that induced NIH 3T3 cell chemotaxis towards it.
図33。 Figure 33. FGF−2に対するNIH 3T3線維芽細胞の走化性応答の用量−応答関係。 Doses of chemotactic response of NIH 3T3 fibroblasts for FGF-2 - response relationship. 濃度を段階的に増加させるグラジエントのFGF−2を修飾されたボイデン(Boyden)チャンバーの低方ウェルに添加した。 Concentration was added to the low way well of stepwise Boyden modified with FGF-2 gradient increasing (Boyden) chamber a. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGF−2が、用量の関数として、それに向かうNIH 3T3細胞の走化性を誘導したことを示した。 It expressed as, which is FGF-2 is, as a function of dose, indicating that induced NIH 3T3 cell chemotaxis towards it.
図34。 Figure 34. FGF−4に対するNIH 3T3線維芽細胞の走化性応答の用量−応答関係。 Doses of chemotactic response of NIH 3T3 fibroblasts for FGF-4 - response relationship. ヘパリンの存在下、濃度を段階的に増加させるグラジエントのFGF−4を修飾されたボイデンチャンバーの低方ウェルに添加した。 Presence of heparin was added to the low way well of Boyden chamber modified with FGF-4 gradient increasing the concentration stepwise. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGF−4が、用量の関数として、それに向かうNIH 3T3細胞の走化性を誘導したことを示した。 It expressed as, which is FGF-4 is, as a function of dose, indicating that induced NIH 3T3 cell chemotaxis towards it.
図35。 Figure 35. FGF−1に対するヒト皮膚線維芽細胞(HDF)の走化性応答の用量−応答関係。 Doses of chemotactic response of human dermal fibroblast cells to FGF-1 (HDF) - response relationships. ヘパリンの存在下、濃度を段階的に増加させるグラジエントのFGF−1を修飾されたボイデンチャンバーの低方ウェルに添加した。 Presence of heparin was added to the low way well of Boyden chamber modified with FGF-1 gradient increasing the concentration stepwise. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGF−1が、用量の関数として、それに向かうHDFの走化性を誘導したことを示した。 Expressed as, which is FGF-1 is, as a function of dose, indicating that induced HDF chemotaxis towards it.
図36。 Figure 36. FGF−2に対するHDFの走化性応答の用量−応答関係。 Dose of HDF chemotactic response to FGF-2 - response relationship. 濃度を段階的に増加させるグラジエントのFGF−2を修飾されたボイデン(Boyden)チャンバーの低方ウェルに添加した。 Concentration was added to the low way well of stepwise Boyden modified with FGF-2 gradient increasing (Boyden) chamber a. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGF−2が、用量の関数として、それに向かうHDFの走化性を誘導したことを示した。 Expressed as, which is FGF-2 is, as a function of dose, indicating that induced HDF chemotaxis towards it.
図37。 Figure 37. FGF−4に対するHDFの走化性応答の用量−応答関係。 Dose of HDF chemotactic response to FGF-4 - response relationship. 濃度を段階的に増加させるグラジエントのFGF−4を修飾されたボイデンチャンバーの低方ウェルに添加した。 It was added to lower how well Boyden chamber modified with FGF-4 gradient increasing the concentration stepwise. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGF−4が、用量の関数として、それに向かうHDFの走化性を誘導したことを示した。 Expressed as, which is FGF-4 is, as a function of dose, indicating that induced HDF chemotaxis towards it.
図38。 Figure 38. 溶液中およびFG中におけるFGF−4に対するHDFの走化性応答の用量−応答関係。 Dose of HDF chemotactic response to FGF-4 in solution and in FG - response relationship. FGF−4をFGに取り込み、走化性チャンバーの底部ウェルに入れた。 Uptake FGF-4 to FG, placed in the bottom wells of the chemotaxis chamber. FG中のFGFの量は、低方チャンバー中のFGおよび媒体全体に均一に分配された場合に示した濃度となるのに十分なものであった。 The amount of FGF in the FG was sufficient to give a concentration shown if it is evenly distributed throughout the FG and medium low way in the chamber. 陰性対照は媒体単独およびFGを含み、FGFは含まなかった。 Negative controls include vehicle alone and FG, not included FGF. 低方チャンバー中の10ng/mlの濃度でFGF−4を含有する媒体は陽性対照として用いた。 Medium containing FGF-4 at a concentration of 10 ng / ml of low way in the chamber was used as a positive control. データは、高出力場当たりの移動細胞の平均±S. Data mean ± S mobile cell high output ad hoc. E. E. として表し、これはFGから放出されたFGF−4が、用量の関数として、それに向かうHDFの走化性を誘導したことを示した。 Expressed as, which is FGF-4 released from FG is as a function of dose, indicating that induced HDF chemotaxis towards it.
図39。 Figure 39. 自己含有された(self-contained)TS創傷包帯剤のダイアグラム。 Are self-contained (self-contained) Diagram of TS wound dressing.
好ましい態様の記載定義特に断りのない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常に理解されるのと同一の意味を有する。 Preferred unless otherwise defined in the description of the embodiment, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. 本明細書で挙げる全ての特許および刊行物は引用して本明細書の一部とする。 All patents and publications cited herein are incorporated herein by reference.
本明細書で使用する創傷とは、生きた生物体におけるいずれの組織に対する損傷をも含む。 The wound as used herein, also includes damage to any tissue in a living organism. 該組織は胃ライニングまたは骨のごとき内部組織、あるいは皮膚のごとき外部組織であり得る。 The tissue may be an internal tissue, or such as skin external tissue such as the stomach lining or a bone. それ自体、創傷は、限定されるものではないが、胃腸管海洋、骨折、新形成、および切ったまたは擦過された皮膚を含み得る。 Itself, wounds, but not limited to, may include gastrointestinal marine, fractures, neoplasia, and cut or the abraded skin. 創傷は脾臓のごとき軟組織、または骨のごとき硬組織におけるものであってよい。 Wounds may be those in soft tissue, or hard tissue such as bone, such as the spleen. 創傷は、外傷負傷、感染または外科的介入を含めたいずれの剤によって引き起こされたものであってもよい。 Wounds, traumatic injury, or may be caused by any agent, including infection or surgical intervention.
本明細書で用いるTSとは、創傷への適用に際し、創傷をシールし、それにより、血液喪失を低下させ、止血を維持する物質または組成物である。 The TS used herein, upon application to a wound, seals the wound, thereby reducing the blood loss, is a substance or composition to maintain hemostasis. 本明細書で使用するFGとは、創傷への適用に際して、血餅を形成し、それにより創傷をシールし、血液喪失を低下させ、止血を維持する組換えまたは血漿蛋白質から調製された組成物である。 The FG used herein, when applied to the wound to form a clot, thereby sealing the wound, reducing the blood loss, the composition prepared from recombinant or plasma proteins to maintain hemostasis it is. FG(前掲)はTSの一形態である。 FG (supra) is a form of TS.
本明細書で使用する補足TSは、実質的修飾なしに、成長因子、薬物または他の化合物、またはその混合物の送達用の担体ビヒクルとして働き、その接着性または吸着性特性によって、補足TSに、その所望の効果、例えば、創傷治癒を促進するのに十分な時間、該部位との接触を維持できるいずれのTSをも含む。 Supplemental TS used herein, without substantial modifications, growth factors, drugs or other compounds, or serve as a carrier vehicle for delivery of the mixture, by its adhesive or adsorptive properties, to supplement TS, its desired effect, e.g., a time sufficient to promote wound healing, including any TS that can maintain contact with the site.
本明細書で使用する成長因子補足TSとは、少なくとも1種の成長因子が、その述べた目的に十分な濃度で添加されたTSである。 The growth factor supplements TS used herein, at least one growth factor, a the added TS in sufficient concentration to the stated purpose. 成長因子は、例えば、創傷治癒または組織の(再)生を加速、促進または改良できる。 Growth factors, for example, wound healing or tissue (re) producing the acceleration, can promote or improve. また、成長因子補足TS類は、1)TSにおける成長因子(類)の生物学的活性を促進し、刺激し、または媒介し;2)生物学的活性またはシーラント中の成長因子(類)を阻害しまたは破壊する成長因子補足TSの成分の活性を低下させ;あるいは3)TSからの補足物の延長された送達を可能とし;4)他の所望の特性を保有する、薬物、抗生物質、抗凝固剤および他の成分を含めたさらなる成分を含有させることができる。 The growth factor supplemented TS compounds are 1) to promote the biological activity of the growth factor (s) in the TS, stimulate or mediate; 2) growth factor biological activity or sealant (s) reduced inhibition or component of the activity of growth factor supplemented TS to destroy; or 3) allow prolonged delivery of the supplement from TS; 4) possess other desirable properties, drugs, antibiotics, anticoagulant and additional ingredients including other components can be contained.
本明細書で用いる促進性化合物とは、TS中の成長因子の生物学的活性を媒介しまたは増加させる化合物である。 The accelerating compound used herein is a mediator or a compound that increases the biological activity of the growth factor in TS. ヘパリンは、HBGF−1の生物学的活性を促進する化合物の例である。 Heparin is an example of a compound that promotes HBGF-1 biological activity.
本明細書で用いる阻害性化合物とは、TS中の成長因子または成長因子類の生物学的活性に干渉しまたはそれを阻害するTSの成分の有害活性を阻害、それに干渉し、またはそれを破壊する化合物である。 The inhibitory compound for use herein, inhibit the toxic activity of a component of the TS that inhibits growth interfering factors or biological activity of growth factors, or it in the TS, interfere with it or destroy it it is a compound that. 阻害性化合物は成長因子を分解から保護することによってその効果を発揮し得る。 Inhibitory compounds may exert their effect by protecting the growth factor from degradation. しかしながら、阻害性化合物は、例えば、成長因子補足TSの創傷治癒のごとき所望の特性に必須であるいずれの活性も阻害しない。 However, inhibitory compound, for example, do not inhibit any activity which is essential for the desired properties, such as wound healing growth factors supplements TS. 阻害性化合物の例はヘパリンである。 Examples of inhibitory compound is heparin.
本明細書で用いる成長因子とは、細胞増殖、細胞分化、組織再生、細胞誘因、創傷修復および/またはいずれかの発生もしくは増殖プロセスを調節するいずれの可溶性因子をも含む。 The growth factor as used herein, includes cell growth, cell differentiation, tissue regeneration, cell incentives, any of soluble factors regulating wound repair and / or any developmental or proliferative process. 成長因子は、当業者に知られている、天然源からの抽出、合成化学による生産、組換えDNA技術およびウイルス不活化成長因子(類)−富血小板放出物を含めたいずれかの他の技術の使用による生産を含むいずれかの適当な手段によって生産することができる。 Growth factors are known to those skilled in the art, extraction from natural sources, production by synthetic chemistry, recombinant DNA technology and virus inactivation growth factor (s) - or other techniques, including platelet-rich effluent it can be produced by any suitable means, including production by use of. 成長因子なる語は、いずれの前駆体、突然変異体、またはそれが由来しまたは関連する成長因子のものと同様の生物学的活性を保有するその他の形態、またはそのサブセットも含むことを意図する。 Comprising the growth factor term is intended any precursor, other forms mutant, or it possess the same biological activity as those derived from or related growth factors or also comprise a subset, .
本明細書で用いる、内皮細胞成長因子(ECGF)およびFGF−1のごとき当業者に別の名称でも知られているHBGF−1とは、HBGF−1αの前駆体であるHBGF−1βを含めたHBGF−1のいずれの生物学的活性形およびFGFのごとき他の切形形態をもいう。 As used herein, the HBGF-1, also known by another name to those skilled in the art, such as endothelial cell growth factor (ECGF) and FGF-1 of including HBGF-l [beta] which is a precursor of HBGF-l [alpha] any biologically active form of HBGF-1 and is also referred to other truncated forms, such as FGF. ここに引用して本明細書の一部とみなすJayeらに対する米国特許第4,868,113号は、HBGFの各形態のアミノ酸配列を記載している。 U.S. Patent No. 4,868,113 for Jaye et regarded as incorporated herein by reference herein, describes the amino acid sequence of each form of HBGF. かくして、HBGF−1は、HBGF−1の生物学的活性を呈する前駆体、切形もしくは他の修飾形態、またはその突然変異体、またはそのサブセットを含めたいずれの生物学的活性ペプチドも含む。 Thus, HBGF-1 also includes precursors, truncated or other modified forms, or mutants thereof, or any biologically active peptide, including subsets thereof exhibiting HBGF-1 biological activity.
他の成長因子も別の命名法によって当業者によって知られているかも知れない。 Other growth factors by alternative nomenclature might be known by those skilled in the art. 従って、1の名称による特定の成長因子への本明細書での言及は、該因子が当業者に取られているいずれかの他の名称も含み、また、その生物学的誘導体または前駆体、切形突然変異体、または他の修飾形態も含む。 Accordingly, references herein to a particular growth factor by one name also includes any other names the factor is taken by those skilled in the art, its biological derivatives or precursors, truncation mutants or other modified forms, including.
本明細書で用いる生物学的活性とは、イン・ビボおよび/またはイン・ビトロで特定の成長因子に関連する1または全ての活性をいう。 The biological activity, as used herein, refers to one or all of the activity associated with a particular growth factor in vivo and / or in vitro. 一般に、成長因子は、分裂促進活性(細胞増殖を誘導または維持する能力)および分化および/または発生を誘導しまたは維持する能力を含めた非分裂促進活性を含む、いくつかの活性を呈する。 In general, growth factors, mitogenic activity including non mitogenic activity, including the ability to induce (induce or ability to maintain cell proliferation) and differentiation and / or development or maintenance, presents several activities. 加えて、成長因子は、増殖および発生過程がそれから進行する特定の細胞を補給または誘因できる。 In addition, growth factors may supply or trigger specific cellular proliferation and developmental processes proceeds therefrom. 例えば、適当な条件下で、HBGF−1は内皮細胞を補給し、それから血管の形成を指示する。 For example, under appropriate conditions, HBGF-1 is supplemented with endothelial cells, then instructs the formation of blood vessels. この活性により、成長因子補足TSは、それにより、特異的部位への血流および栄養物を増強する手段を提供し得る。 This activity, growth factor supplemented TS may thereby may provide a means to enhance blood flow and nutrients to specific sites.
本明細書で用いる延長された寿命とは、目視的に観察できる有用なTSのイン・ビトロの寿命の少なくとも2倍増加を意味する。 The extended life used herein, means at least 2-fold increase in visual useful TS in vitro lifetime can be observed.
本明細書で用いる無機質脱落骨マトリックス(DBM)とは、骨が塩酸または他の酸で脱カルシウム化された後に残る骨の有機性マトリックスを意味する。 The demineralization bone matrix used herein (DBM), bone means an organic matrix of bone that remains after being decalcified in a hydrochloric acid or other acids.
本明細書で用いる骨形態発生蛋白質(BMP)とは、元々、DBMの骨−誘導体抽出物におけるその存在によって同定された一群の関連蛋白質を意味する。 Bone morphogenetic proteins used in this specification and (BMP) was originally, DBM bone - means a group of related proteins that are identified by their presence in derivatives extract. 少なくとも8種の関連メンバーが同定されており、BMP−1ないしBMP−8と命名されている。 At least eight related members have been identified, to no BMP-1 have been designated BMP-8. BMP類は他の名称よっても知られている。 BMP class is also known by other names. BMP−2はBMP−2Aとしても知られている。 BMP-2 is also known as BMP-2A. BMP−4はBMP−2Bとしても知られている。 BMP-4 is also known as BMP-2B. BMP−3はオステオゲニンとしても知られている。 BMP-3 is also known as osteogenin. BMP−6はVgr−1としても知られている。 BMP-6 is also known as Vgr-1. BMP−7はOP−1としても知られている。 BMP-7 is also known as OP-1. 骨形態発生蛋白質はBMP−1ないしBMP−8を含むが、それらに限定されるものではない。 Bone morphogenetic protein includes BMP-8 to no BMP-1, but is not limited to them.
本明細書で用いる増加とは、補足または非補足TSを用いて動物身体の成分の内部または外部表面の外形を変化させることを意味する。 The increased used herein, means changing the outer shape of inner or outer surfaces of the components of the animal body by using the supplement or unsupplemented TS.
本明細書で用いる損傷骨とは、骨折し、破砕し、その一部を失った骨、または健康でない正常な骨である。 The damage bone used herein, fractured, crushed, it is a part of the lost bone or normal bone unhealthy.
本明細書で用いる欠陥骨とは、その機能を果たすのに不適当な形状または容量を有する骨である。 The defective bone used herein, a bone have inadequate shape or volume to perform its function.
本明細書で用いる骨またはTSを補足するのに使用されるDBMは、粉末、懸濁液、ストリップまたはブロックあるいは必要に応じてその所望の機能を発揮する他の形態であり得る。 DBM used to supplement bone or TS used herein include powders, suspensions, other forms to exert its desired function depending on strips or blocks or necessary.
本明細書で用いる小器官とは、全体的にまたは部分的に、天然器官の機能を置き換える天然要素または人工的要素、あるいは天然および人工的要素の組合せよりなるものであってよい。 The organelle used herein, in whole or in part, may be comprised of a combination of natural elements or artificial elements replace the natural organ function or natural and artificial elements. その例は、インスリンの遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトした細胞によって囲まれた毛細血管のネットワークからなる人工膵臓であろう。 Examples would be artificial pancreas consisting of capillary networks surrounded by cells transfected with the expression vector containing the gene of insulin. かかる小器官は、I型糖尿病を持つ患者の血流にインスリンを放出するように機能するであろう。 Such organelles would function to release insulin into the bloodstream of patients with type I diabetes.
補足TSの調製本明細書で開示する本発明のいずれもの態様を実施する場合の第1工程として、補足物およびTSを選択しなければならない。 As a first step in the case of implementing aspects any of the present invention disclosed in Preparation herein supplementary TS, you must select the supplements and TS. 補足物およびTSは、当業者に知られた方法によって調製でき、本出願の方法に従って調製できる。 Supplement and TS may be prepared by methods known to those skilled in the art, it can be prepared according to the method of the present application. 好ましい態様において、成長因子、薬物またはDBM補足FGを調製する。 In a preferred embodiment, to prepare a growth factor, a drug or DBM supplemented FG.
本発明の態様のいずれにおいても、混合してTSを形成する前に、補足物をフィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムおよび/または水成分に添加することができる。 In any of the embodiments of the present invention, before forming the TS is mixed, can be added supplements fibrinogen, thrombin, calcium and / or water component. 別法として、補足物(類)は、それらを混合してTSを形成しつつ成分類に添加することができる。 Alternatively, supplement (s), while forming a TS by mixing them may be added to the ingredients.
本発明の態様において、カルシウムおよび/またはトロンビンは、例えば、創傷におけるもののごとき体液から外因的に供給することができる。 In embodiments of the present invention, calcium and / or thrombin, for example, can be exogenously supplied from such body fluids those in a wound.
TS類の調製限定されるものではないが、血管補綴のごとき本発明のある態様において、および骨および軟骨増加において、細胞をそれに移動させおよび/またはそれを通って移動させるTSが好ましくは使用できる。 Without being prepared limitation of TS include, in some embodiments of the such the present invention vascular prosthesis, and in bone and cartilage increases, TS to move cells through the allowed and / or it moves to it preferably can be used .
商業的に入手可能なFGのごときいずれのTSも本発明のいくつかの態様で使用できる。 Any of TS such as commercially available FG can also be used in some embodiments of the present invention. 例えば、当業者によく知られているFG類(例えば、引用して本明細書の一部とみなす米国特許第4,672.879号;第4,377,572号;および第4,298,598号)は、イムノ社(IMMUNO AG)(ウィーン、オーストリア)およびベーリングウェルケ社(BEHRINGWERKE AG)(ドイツ国)のごときその供給業者または製造業者から購入できる。 For example, well known to those skilled in the FG compound (e.g., U.S. Patent No. 4,672.879 regarded as incorporated herein by reference; No. 4,377,572; and No. 4,298, 598 No.) may be purchased from immunoblotting, Inc. (iMMUNO AG) (Vienna, Austria) and the Bering well Quai, Inc. (BEHRINGWERKE AG) (the supplier or manufacturer such as Germany). 局所化薬物送達のごときこれらの使用では、選択したTSの特定の組成物はそれが望まれるごとく機能する限り臨界的ではない。 In use, such as those localized drug delivery, the particular composition of the selected TS is not critical so long as it functions as it is desired. 商業的に入手可能なFG類には、限定されるものではないが、イン・ビトロ細胞増殖および/または分化;薬物送達;成長因子送達等を含めた、本発明の態様における使用のための成長因子、抗生物質および/または他の薬物を補足することができる。 Commercially available FG include, but are not limited to, in vitro cell proliferation and / or differentiation; drug delivery; including growth factors delivery, etc., growth for use in aspects of the present invention factors, it is possible to supplement the antibiotics and / or other drugs.
本明細書に例示する実験では、FGは、新鮮な凍結した血漿からの低温沈殿から調製した。 In the experiments exemplified herein, FG was prepared from cryoprecipitate from fresh frozen plasma. 使用したFGの成分は:フィブリノーゲン濃縮物;トロンビン;およびカルシウムイオンを含む。 Component of FG used were: fibrinogen concentrate; and a calcium ion; thrombin.
本発明の好ましい態様において、調製したFGにおける合成蛋白質濃度は約0.01ないし500mg/mlFGである。 In a preferred embodiment of the present invention, the synthetic protein concentration in the prepared FG is from about 0.01 to 500mg / mlFG. より好ましい態様において、調製したFGにおける合成蛋白質濃度は約1ないし120mg/FGmlである。 In a more preferred embodiment, the synthetic protein concentration in the prepared FG is from about 1 to 120mg / FGml. 最も好ましい態様において、調製したFGにおける合成蛋白質濃度は約4ないし30mg/FGmlである。 In a most preferred embodiment, the synthetic protein concentration in the prepared FG is from about 4 to 30mg / FGml.
本発明の好ましい態様において、FGを調製するのに使用したフィブリノーゲン濃度は約0.009ないし450mg/ml溶液である。 In a preferred embodiment of the present invention, the fibrinogen concentration used to prepare the FG is from about 0.009 450 mg / ml solution. より好ましい態様において、この調製溶液におけるフィブリノーゲン濃度は約0.9ないし110mg/mlである。 In a more preferred embodiment, the fibrinogen concentration in this preparation solution is from about 0.9 to 110 mg / ml. 最も好ましい態様において、調製溶液におけるフィブリノーゲン濃度は約3ないし30mg/mlである。 In a most preferred embodiment, the fibrinogen concentration in the preparation solution is from about 3 to 30 mg / ml.
好ましい態様において、FGを調製するのに使用したトロンビン濃度は0.01〜350単位(U)/mlである。 In a preferred embodiment, the thrombin concentration used to prepare the FG is from 0.01 to 350 units (U) / ml. より好ましい態様において、トロンビン濃度は1〜175U/mlである。 In a more preferred embodiment, the thrombin concentration is 1~175U / ml. 最も好ましい態様において、トロンビン濃度は2〜4U/mlである。 In a most preferred embodiment, the thrombin concentration is 2~4U / ml.
カルシウムイオン濃度はトロンビンの活性化を可能とするのに十分であることが重要である。 Calcium ion concentration, it is important that it is sufficient to allow the activation of thrombin. 好ましい態様において、USP塩化カルシウム濃度は0〜100mMである。 In a preferred embodiment, USP calcium chloride concentration is 0 to 100 mM. より好ましい態様において、USP塩化カルシウム濃度は1〜40mMである。 In a more preferred embodiment, USP calcium chloride concentration is 1~40MM. 最も好ましい態様において、USP塩化カルシウム濃度は2〜4mMである。 In a most preferred embodiment, USP calcium chloride concentration is 2-4 mm. 本発明のいくつかの態様において、カルシウムは、例えば、創傷包帯剤態様におけるごとく、組織または体液によって供給され得る。 In some embodiments of the present invention, calcium can be, for example, as in wound dressing embodiment, be supplied by the tissue or body fluids.
TSを調製するにおいて、注射用の滅菌水を使用すべきである。 In preparing the TS, one should use sterile water for injection.
成長因子(類)、薬物類および他の化合物類の濃度は所望の目的に応じて変更し得るが、濃度はそれらがそれらの述べた目的を達成するのを可能とするのに十分大きくなければならない。 Growth factor (s), the concentration of the drug acids and other compounds can vary depending on the desired purpose, the concentration to be sufficiently large to allow them to achieve the object mentioned thereof not not. 本発明の好ましい態様において、成長因子濃度は約1ng/mlないし1mg/mlFGである。 In a preferred embodiment of the present invention, the growth factor concentration is to not about 1ng / ml 1mg / mlFG. より好ましい態様において、成長因子濃度は約1μg/mlないし100μg/mlFGである。 In a more preferred embodiment, the growth factor concentration is to not about 1μg / ml 100μg / mlFG. 最も好ましい態様において、成長因子濃度は約5μg/mlないし20μg/mlFGである。 In a most preferred embodiment, the growth factor concentration is to not about 5μg / ml 20μg / mlFG. 本発明の好ましい態様において、TETまたはCIP濃度は0.01ないし300mg/mlFGである。 In a preferred embodiment of the present invention, TET or CIP concentration is to no 0.01 300mg / mlFG. 本発明のより好ましい態様において、TETまたはCIP濃度は0.01〜300mg/mlである。 In a more preferred embodiment of the present invention, TET or CIP concentration is 0.01 to 300 / ml. 本発明の最も好ましい態様において、TETまたはCIP濃度は1〜150mg/mlである。 In a most preferred embodiment of the present invention, TET or CIP concentration is 1 to 150 mg / ml. 添加すべき補足物の濃度は、種々の濃度をテストし、意図する目的および適用部位に効果的なものを選択することによって当業者が実験的に決定できる。 The concentration of the to be added supplements is to test various concentrations, those skilled in the art by selecting the effective ones to the purpose and site of application intended can be determined experimentally.
成長因子の調製成長因子(類)、またはその混合物は当業者に知られた方法によって調製できるか、あるいは商業的に購入できる。 Or preparing growth factor growth factor (s), or mixtures thereof can be prepared by methods known to those skilled in the art or may be purchased commercially. 限定されるものではないが、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、肝細胞およびケラチノサイトのごときある種の細胞型の増殖および/または誘因を刺激する成長因子、および/または同細胞型および平滑筋細胞の増殖を阻害する成長因子を含めたいずれの成長因子も選択できる。 But it is not limited to, endothelial cells, fibroblasts, epithelial cells, smooth muscle cells, growth factors to stimulate proliferation and / or incentives of certain cell types such as hepatocytes and keratinocytes, and / or the cell any growth factors, including growth factors which inhibit the growth of mold and smooth muscle cells can be selected. かかる選択は、成長因子補足TSが適用される特定の組織部位および/または所望の効果の型に依存し得る。 Such selection may be dependent on the type of a particular tissue site and / or the desired effect of growth factors supplements TS is applied. 例えば、EGF補足TSは、眼における創傷への適用に、および胃潰瘍を治療するのに好ましく、他方、オステオゲニン補足TSは、その治癒を促進するために、骨折および骨破損への適用に好ましいであろう。 For example, EGF supplemented TS is applied to the wound in the eye, and preferably to treat gastric ulcers, while osteogenin supplemented TS, in order to promote their healing, preferred for application to bone fractures and bone damage It will allo.
もう1つの好ましい態様において、HBGF−1βを調製し、FGに添加する。 In another preferred embodiment, to prepare the HBGF-l [beta], is added to the FG. HBGF−1βまたはHBGF−1α、あるいはHBGF−1のいずれかの他の活性形を、天然源から、HBGF−1を発現する遺伝子工学で作製した細胞もしくはその誘導体から、または当業者に知られたいずれかの方法によって精製できる。 HBGF-l [beta] or HBGF-l [alpha], or any other active form of HBGF-1, from natural sources, known from the cells or their derivatives were genetically engineered to express HBGF-1, or to the person skilled in the art It can be purified by any method.
HBGF−1βは、組換えDNA法を用いて調製されている(Jayeらの米国特許第4,868,113号;Jayeら.J. Biol. Chem. 262:16612-16617(1987))。 HBGF-l [beta] has been prepared using recombinant DNA methods (Jaye et al., U.S. Pat. No. 4,868,113; Jaye et al. .J Biol Chem 262:... 16612-16617 (1987)). 略言すれば、HBGF−1βをコードするDNAを原核生物発現ベクターpUC9誘導体にクローン化し、イー・コリ(E. coli)において細胞内で発現させた。 If Briefly, cloned DNA encoding HBGF-l [beta] in prokaryotic expression vector pUC9 derivative, and expressed intracellularly in E. coli (E. coli). 発現されたペプチドを、次いで、高圧縮−脱圧縮サイクルで作動させる細胞破壊機を用い、圧力によって細胞から放出させた。 The expressed peptide is then highly compressed - using a cell disrupter for operating in decompression cycles, it was released from the cells by pressure. 破壊後、細胞夾雑物を濾過によって除去し、HBGF−1βを、ヘパリンセファロース(セファロース) TM上のアフィニティークロマトグラフィー、続いてのCM−セファロースTM上でのイオン交換クロマトグラフィーを含めた蛋白質精製の標準的方法を用いて上清から精製した。 After disruption, the cell contaminants were removed by filtration, the HBGF-l [beta], heparin-Sepharose (Sepharose) affinity chromatography on TM, followed by the CM- Sepharose ion exchange chromatography standard protein purification including on TM They were purified from the supernatant using methods.
前記したHBGF−1に加えて、FGに添加することができる他の成長因子は、限定されるものではないが、HBGF−2、IGF−1、EGF、TGF−β、TGF−α、いずれかの血小板由来成長因子または抽出物、MBP類、およびいずれかの成長因子の混合物を含む。 In addition to HBGF-1 described above, other growth factors which can be added to the FG include, but are not limited to, HBGF-2, IGF-1, EGF, TGF-β, TGF-α, or platelet-derived growth factor or extract, MBP acids, and mixtures of any of the growth factors. 例えば、成長因子の豊富な源として供される血小板由来抽出物を、HBGF−1のごとき他の成長因子の外に、またはそれに代えてTSに添加することができる。 For example, it is possible to platelet-derived extract to serve as a rich source of growth factors, in addition to the other growth factors such as HBGF-1, or added to the TS instead.
好ましい態様において、当業者に公知の方法によって調製した血小板由来抽出物をTSに添加する。 In a preferred embodiment, the addition of platelet-derived extracts prepared by methods known to those skilled in the TS. かかる抽出物はFGでの使用のために血漿由来血小板から調製されている。 Such extracts have been prepared from plasma derived platelets for use with FG.
血小板由来創傷治癒因子(PDWHF)を調製し、FGに添加することもできる(Knightonら,Ann. Surg. 204:322-330(1986))。 Platelet-derived wound healing factors (PDWHF) can be prepared and added to FG (Knighton et al., Ann Surg 204:.. 322-330 (1986)). 略言すると、PDWHFを調製するには、血液を吸って抗凝固剤溶液に入れ、冷蔵遠心によって富血小板血漿を調製する。 When Briefly, to prepare the PDWHF sucks blood placed in an anticoagulant solution, to prepare a platelet-rich plasma by refrigerated centrifugation. 血小板を単離し、アルファ顆粒の内容物を放出させるトロンビンで刺激する。 Platelets are isolated and stimulated with thrombin to release the contents of the alpha granules. 血小板を除去し、有効濃度の残存する抽出物をTSに添加する。 Platelets is removed and added to extract the remaining effective concentration TS.
成長因子補足TSのさらなる成分それらは実質的に血漿画分であるので、成長因子での使用に考えられるTS類は多数の成分を含有し、そのうちいくつかは選択した成長因子(類)の生物学的活性に干渉し得る。 Since additional components of growth factors supplements TS thereof are substantially plasma fraction, organisms TS acids contemplated for use in the growth factor will contain a number of components, of which growth factors some selected (s) It can interfere with the biological activity. 例えば、FGの必須成分であるトロンビンは蛋白分解酵素として作用し、HBGF−1βを特異的に切断できる。 For example, thrombin is an essential component of FG acts as proteolytic enzyme may specifically cleave HBGF-l [beta]. 従って、選択した成長因子(類)を、成長因子(類)の生物学的活性に干渉しまたはそれを破壊するTS中の他の成分の作用から保護する、プロテアーゼまたは他の阻害剤のごときさらなる化合物類を含ませることが必要であろう。 Accordingly, the selected growth factor (s), protected from the action of other components in the TS which interfere with the biological activity or to destroy it growth factor (s), further, such as protease or other inhibitors it may be necessary to include compounds.
個々の阻害性化合物(類)の選択は、TS中の成長因子(類)の生物学的活性を評価する後記の方法を用いて経験的に決定できる。 Selection of the individual inhibitory compound (s) may be determined empirically using the methods described later to assess the biological activity of the growth factor in the TS (s). 生物学的活性を評価する方法は当業者に公知である。 How to evaluate the biological activity are known to those skilled in the art.
加えて、ある種の成長因子がそれらの生物学的活性を呈するためには、所望の活性を促進しまたは媒介する化合物を含ませることが必要であろう。 In addition, for certain growth factors exhibit their biological activity, it may be necessary to include a compound which enhances or mediates a desired activity. 例えば、ヘパリンはイン・ビボでHBGF−1の生物学的活性を促進する(例えば、Burgessら,Annu. Rev. Biochem. 58:575-606(1989))。 For example, heparin promotes HBGF-1 biological activity in vivo (e.g., Burgess et al., Annu Rev. Biochem 58:.. 575-606 (1989)).
本発明の補足TSは薬物類、他の化学物質類および蛋白質類のごとき化合物を含有することができる。 Supplement TS of the present invention may contain a drug compound, compounds such as other chemical substances and proteins,. これらは限定されるものではないが、TEt、シプロフロキサシン、アモキシリン、またはメトロニダゾールのごとき抗生物質、活性化プロテインC、ヘパリン、プロスタサイクリン(PGI 2 )、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類、抗トロンビンIIIのごとき抗凝固剤、ADPアーゼ、およびプラスミノーゲンアクチベーター;デキサメタゾンのごときステロイド類、プロスタサイクリン、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類の阻害剤および/または炎症を阻害するキニン類;カルシウムチャンネルブロッカーのごとき心血管薬物類;化学誘因物質:ブピバカインのごとき局所麻酔剤;および5−フルオロウラシル(5−FU)、タキソールおよび/またはタキソテーレのごとき抗増殖性/抗腫瘍薬物類を含み得る。 These are not limited to, Tet, ciprofloxacin, amoxicillin or an antibiotic such as metronidazole, activated protein C, heparin, prostacyclin (PGI 2), prostaglandins, leukotrienes, antithrombin III of such anticoagulants, ADP-ase, and plasminogen activator; calcium channel blockers; such steroids dexamethasone, prostacyclin, prostaglandins, kinins to inhibit inhibitor and / or inflammatory leukotrienes such cardiovascular drugs like; chemoattractant: such as bupivacaine local anesthetic; and 5-fluorouracil (5-FU), may include such as taxol and / or taxotere antiproliferative / antineoplastic drugs such. また、これらの補足化合物類はポリクローナル、モノクローナルまたはキメラ抗体、またはその機能的誘導体または断片を含み得る。 These supplements compounds may include polyclonal, monoclonal or chimeric antibodies, or functional derivatives or fragments thereof. それらは、例えば、PDGF、および/またはTGF−βに対する抗体のごとき平滑筋増殖を阻害する、あるいはTSで処理した領域内またはその回りの他の望まない細胞型の増殖を阻害する抗生物質であり得る。 They are, for example, an antibiotic which inhibits PDGF, and / or inhibit such smooth muscle proliferation of antibodies to TGF-beta, or proliferation of the treated region or other unwanted cell types therearound in TS obtain. また、これらの抗体は、抗癌、抗−血小板または抗炎症活性が必要とされる状況において有用であり得る。 Further, these antibodies, anti-cancer, anti - may be useful in situations where platelets or anti-inflammatory activity is needed. 一般に、その効果が部位特異的送達によって改良され得るいずれの抗体もそのTS送達系で使用する利点を有する。 In general, an advantage that none of the antibodies that effect may be improved by site-specific delivery to use with the TS delivery system.
成長因子補足TSの創傷治癒特性を評価するアッセイ特定の成長因子補足TSが創傷治癒を促進するか否かを確認するために、およびそうするための成長因子(類)の最適濃度を選択するために、当業者に知られたいずれかの手段によってテストすることができる(例えば、Tsuboiら,J. Exp. Med. 172:245-251(1990);Ksanderら,J. Am. Acad. Dermatol. 22:781-791(1990);およびGreenhalghら,Ann. J. Biol. 136:1230(1000)参照)。 To assay specific growth factor supplements TS to evaluate the wound healing properties of the growth factors supplements TS to confirm whether or not promote wound healing, and growth factors to do so in order to select the optimal concentration of (s) a, can be tested by any means known to those skilled in the art (e.g., Tsuboi et al, J Exp Med 172:...... 245-251 (1990); Ksander et al., J Am Acad Dermatol. 22:.. 781-791 (1990); and Greenhalgh et al, Ann J. Biol 136: 1230 (1000) refer). それによってTS組成物における選択した成長因子(類)の活性を評価できるイン・ビボおよびイン・ビトロの両アッセイを含めたいずれかの方法を使用することができる。 Can be used any of the methods whereby, including both assays in vivo and in vitro activity can be evaluated for the selected growth factor (s) in the TS composition. 例えば、HBGF−1βの活性は2つの独立したイン・ビトロアッセイを用いて評価されている。 For example, the activity of HBGF-l [beta] is assessed using two independent in vitro assays. 第1のものにおいて、成長因子補足FGを含浸させたプラスチック表面を覆う狭い流体層に懸濁した内皮細胞の増殖を測定した。 In the first ones, to measure the endothelial cells suspended in the narrow fluid layer covering a plastic surface impregnated with growth factor supplement FG growth. 第2のものにおいて、HBGF−1の存在下における培養線維芽細胞への3 H−チミジンの取込を測定した。 In the second one, to measure the uptake of 3 H- thymidine into cultured fibroblasts in the presence of HBGF-1.
イン・ビボアッセイにおいて、HBGF−1βを補足したFGを、マウスをモデル系として使用するイン・ビボでの治癒を促進するその能力についてテストした。 In vivo assays, the FG supplemented with HBGF-l [beta], was tested for its ability to promote healing in vivo of using mouse as a model system. この方法では、同一のパンチバイオプシーをマウスの背面領域で作製し、次いで、これをテスト群、処理対照群および未処理対照群に分離した。 In this way, the same punch biopsies were prepared in the rear region of the mouse, then this test group were separated into treated control group and untreated control group. テスト群におけるマウスの創傷を成長因子補足TSで処理した。 The wounds of mice in the test group were treated with growth factor supplement TS. 処理対照群におけるマウスの創傷を非補足TSで処理した。 Wounds in mice in the treated control group were treated with unsupplemented TS. 未処理群における創傷はTSで処理しなかった。 Wounds in the untreated group were not treated with TS. 検出可能な創傷治癒が進行するのに十分な時間、一般に1週間ないし10日後に、マウスを犠牲とし、創傷組織を鏡検して、各群における創傷修復の程度を組織学的に評価した。 Sufficient time for detectable wound healing to proceed, generally a week later to 10 days, mice were sacrificed and the wound tissue was microscopically examined to assess the extent of wound repair in each group histologically.
また、成長因子補足TSが細胞増殖を誘導し、細胞を補給する能力も当業者に知られたイン・ビトロ方法によって評価できる。 The growth factor supplemented TS will induce cell proliferation can be assessed by in vitro methods capability known to those skilled in the art to replenish the cell. 例えば、成長因子の生物学的活性を測定するにつき前記した、および実施例にい詳細に記載したイン・ビトロアッセイを用いて、TS組成物中の成長因子の活性をテストすることができる。 For example, the above for measuring the biological activity of growth factors, and examples have been using in vitro assays described in detail, it is possible to test the activity of the growth factor in the TS composition. 加えて、阻害性および/または促進性化合物類を添加する効果も評価できる。 In addition, the effect of the addition of inhibitor and / or promoting compounds can also be evaluated.
一般に、阻害性および/または促進性化合物類を添加する必要性は経験的に決定できる。 In general, the need to the addition of inhibitor and / or accelerating compounds can be determined empirically. 例えば、後記する実験では、HBGF−1補足FGにおけるHBGF−1βは、確立論的方法にて特異的に切断され、これは、FG調製物の成分、最もありそうなのはトロンビンに帰すことができることを示唆する。 For example, in the later experiments, HBGF-l [beta] is the HBGF-1 supplemented FG, is specifically cleaved by stochastic methods, this component of the FG preparation, the most likely is that it can be attributed to thrombin It suggests. HBGF−1に結合し、それをある種の蛋白分解活性から保護するヘパリンをHBGF−1−補足FGに添加した。 Bind to HBGF-1, which was added heparin to protect against certain proteolytic activity HBGF-1-supplemented FG. 比較的低濃度のヘパリンの添加は、HBGF−1βを、FGにおけるその生物学的活性を破壊するであろう切断から保護した。 The addition of relatively low concentrations of heparin, the HBGF-l [beta], and protected from the would will cut destroying its biological activity in FG. 従って、HBGF−1を含むTS組成物はヘパリンまたは、トロンビンまたはFGの他の蛋白分解成分によるHBGF−1の切断を阻害するいくつかの他の物質を含むことができる。 Therefore, TS compositions containing HBGF-1 heparin or may include some other substance that inhibits the cleavage of HBGF-1 by other proteolytic components of thrombin or FG.
同様に、TS成分による分解から成長因子を保護する選択した阻害剤の能力は、当業者に公知のいずれかの方法によって評価できる。 Similarly, the ability of the selected inhibitor to protect a growth factor from degradation by TS components may be assessed by any method known to those skilled in the art. 例えば、ヘパリンは、FGの必須成分であるトロンビンによるHBGF−1の切断を阻害するその能力につきテストした。 For example, heparin, were tested for their ability to inhibit cleavage of HBGF-1 by thrombin is an essential component of FG. そうするために、種々の濃度のヘパリンおよびHBGF−1補足FGの混合物を調製し、種々の時間インキュベートした。 To do so, a mixture of heparin and HBGF-1 supplemented FG of various concentrations were prepared for various times and incubated. 混合物中のHBGF−1の生物学的活性をテストし、SDSゲルのウェスタンブロットを用いてHBGF−1の総体(integrity)を確認した。 The HBGF-1 biological activity in the mixture tested was confirmed HBGF-1 Gross (integrity) using Western blots of SDS gels. 相対的低濃度、約1:1のモル比のヘパリン:HBGF−1がHBGF−1をFGにおける分解から保護するのに十分である。 Relatively low concentration, from about 1: 1 molar ratio of heparin: HBGF-1 is sufficient to protect HBGF-1 from degradation in FG.
また、特定の化合物を、TSにおける成長因子(類)の生物学的活性を促進、媒介または増強するのに使用できるか否かを実験的に決定できる。 Furthermore, certain compounds, promotes biological activity of the growth factor (s) in the TS, whether it can be used to mediate or enhance be determined experimentally.
内部または外部創傷への成長因子補足TSの局所または内部適用臨床的使用に先立ち、成長因子およびTS、または成長因子補足TSを殺菌し、あるいは処理してウイルスのごときその中のいずれの病原体汚染も不活化した。 Prior to topical or internal application clinical use of growth factors supplements TS to an internal or external wounds, growth factor and TS, or sterilized growth factor supplement TS, or treated to such viruses any pathogen contamination therein It was inactivated. 汚染を不活化する方法は当業者によく知られており、限定されるものではないが、溶媒−界面活性剤処理および加熱処理を含む(例えば、Taborら,Thrombosis Res. 22:233-238(1981)およびPiszkiewiczら,Treanfusion 28:198-199(1988))。 How to inactivate contaminating are well known to those skilled in the art, but are not limited to, solvent - containing detergent treatment and heat treatment (see for example, Tabor et al., Thrombosis Res 22:. 233-238 ( 1981) and Piszkiewicz et al., Treanfusion 28: 198-199 (1988)).
補足TSは創傷、他の組織または他の所望の場所に直接適用される。 Supplemental TS is wound, is directly applied to other tissue or other desired location. 典型的には、外部創傷では、創傷の頂部へのスプレイを含むいずれかの手段によって直接適用することができる。 Typically, the external wound, can be applied directly by any means, including spray to the top of the wound. また、それは、外科手術法の間のごとく内部適用できる。 Further, it can internally applied as during surgery methods. 骨のごとき内部適用する場合、血餅は徐々に時間と共に溶解する。 If internal application, such as bone, blood clot is dissolved with gradual time.
内部または外部創傷のための補足または非補足TSの自己含有適用TS類は、FGの必要なトロンビンおよびフィブリノーゲンを含有する自己含有創傷包帯剤、またはフィブリンシーラント包帯として処方できる。 Self contained application TS such supplement or unsupplemented TS for internal or external wounds may be formulated as a self-containing wound dressings, or fibrin sealant bandage containing the necessary thrombin and fibrinogen FG. 自己含有包帯剤または包帯は使用が容易で、使用するために進んだ技術や技量を要しない。 Self-containing dressing or bandage is easy to use, it requires no technical or skill advanced for use. それは、医療助力が利用できるようになるまで生命を維持する緊急の応急手段として自己投与さえできる。 It can even self-administration as an emergency first aid means to sustain life until medical assistance becomes available.
自己含有TS創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯は、実践的調製物を長期間保存でき、かつ成分の可溶化および混合に関連した時間的遅れなくして出血する創傷の迅速なTS処置を供するのに使用できる点で現行技術よりも進んでいる。 Self contained TS wound dressing, or fibrin sealant bandage, used to provide rapid TS treatment of wounds to bleed practical preparations long time can be saved, and eliminates solubilization and time delay associated with the mixing of the components It is ahead of the current technology in that it can. これらの特性は、兵士用の外傷パック、救助労働者、救急車/救急医療士チーム、消防士のごとき野外適用における、および特に災害状況における病院および診療所の緊急室個人による初期外傷および応急治療における使用にそれを理想的とする。 These characteristics, trauma packs for soldiers, rescue workers, ambulance / emergency medical workers team, in the field application, such as firefighters, and especially in the initial trauma and first aid treatment by emergency room personal of hospitals and clinics in the disaster situation the ideal it to use. また、小バージョンは一般公衆によるまたは医療実践者による使用のための応急キットで有用性を有し得る。 Also have utility in first aid kits for use by small version by the general public or medical practitioner.
自己含有TS創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯は、組織シーラントまたは前記したタイプのフィブリン複合体からなる組織シール性組成物を含む。 Self contained TS wound dressing, or fibrin sealant bandage, including tissue sealing composition comprising a fibrin complex of tissue sealant or the type described above. 例えば、組成物は、フィブリン血餅を生じるのに十分に第XIII因子と共に、精製されたフィブリノーゲン、トロンビンおよび塩化カルシウムよりなるものとできる。 For example, the composition may with sufficiently factor XIII to produce a fibrin clot, purified fibrinogen, as consisting of thrombin and calcium chloride. 1の態様において、フィブリノーゲンおよび第XIII因子成分は局所フィブリノーゲン複合体(TFC)の形態で供給される。 In one embodiment, the fibrinogen and Factor XIII component is supplied in the form of topical fibrinogen complex (TFC).
ヒト患者に使用する場合、成分類は、最も好ましくは、ヒト源由来の病原体不活化精製成分類である。 When used in a human patient, ingredients are most preferably pathogen inactivation purified ingredients from human sources. 特に、それへの添加剤を含めた本発明の成分類は界面活性剤/溶媒で処理し、および/または例えば殺菌または限外濾過によって処理してウイルスのごときその中のいずれの病原体汚染も不活化する。 In particular, ingredients of the present invention, including additives thereto is treated with a surfactant / solvent, and / or for example any pathogen contamination therein, such as viruses and treated by sterilization or ultrafiltration unsaturated It is inactivated. 汚染を不活化する方法は当業者によく知られており、限定されるものではないが、溶媒−界面活性剤処理および加熱処理を含む。 How to inactivate contaminating it is well known to those skilled in the art, but are not limited to, solvent - containing detergent treatment and heat treatment. 溶媒−界面活性剤処理は、蛋白質性成分が不可逆的熱変性に暴露されない点で特に有利である。 Solvent - detergent treatment is particularly advantageous in that the protein component is not exposed to irreversible thermal denaturation.
カルシウムおよび/または第XIII因子成分はトロンビンおよび/またはフィブリノーゲン成分類に含有させることができ、および/または創傷から出てくる流体に存在する患者の内因性カルシウムを吸収することができる。 Calcium and / or Factor XIII component can absorb endogenous calcium patients present in the fluid coming out of the thrombin and / or can be contained in the fibrinogen ingredients, and / or wound. また、トロンビンは内因的に供給することもできる。 Also, thrombin may be endogenously supplied. トロンビンまたはフィブリノーゲン成分のいずれかまたは双方には、以下の態様の各々において、(成長因子または薬物の生物学的活性いずれかに干渉し得るシーラントの活性を阻害するための)阻害性化合物類、および(成長因子または薬物の生物学的活性のいずれかを促進し、媒介しまたは増強するための)促進性化合物、フィブリン血餅の破壊を阻害する化合物類、または色素を補足することができるが必ずしもそうする必要はない。 In either or both of the thrombin or fibrinogen components, in each of the following embodiments, (for inhibiting the activity of sealant that may interfere with any biological activity of the growth factor or drug) inhibiting compounds, and (promote any biological activity of the growth factor or drug, mediated or enhance for to) accelerating compound, compounds which inhibit the breakdown of fibrin clots, or dye may be supplemented necessarily it is not necessary to do so.
成長因子は、例えば、線維芽細胞成長因子−1、線維芽細胞成長因子−2および線維芽細胞成長因子−4;血小板由来成長因子;インスリン−結合成長因子−1;インスリン−結合成長因子−2;表皮成長因子;形質転換成長因子−α;形質転換成長因子−β;軟骨−誘導因子−Aおよび−B;類骨−誘導因子;オステオゲニンおよび他の骨成長因子;コラーゲン成長因子;ヘパリン−結合成長因子−1;ヘパリン−結合成長因子−2;および/またはそれらの生物学的に活性な誘導体を含み得る。 Growth factors, e.g., fibroblast growth factor-1, fibroblast growth factor-2 and fibroblast growth factor-4; platelet-derived growth factor; insulin - binding growth factor-1; insulin - binding growth factor-2 ; epidermal growth factor; transforming growth factor-.alpha.; transforming growth factor-beta; cartilage - inducing factor -A and -B; osteoid - inducer; osteogenin and other bone growth factors; collagen growth factors; heparin - binding growth factor-1; -; it may include and / or their biologically active derivatives heparin binding growth factor-2.
薬物は鎮痛剤;防腐剤、抗生物質、または感染を阻害し、創傷治癒を促進しおよび/または瘢痕形成を阻害できるする抗増殖剤のごとき他の薬物(類)であり得る。 Drug analgesics; preservatives, antibiotics or inhibit infection, may be to promote wound healing and / or anti-proliferative agents other drugs, such as that can inhibit scar formation (s). 同時に放出させるために1を超える薬物を組成物に添加することができ、あるいは所定の時間−放出方法にて放出させることができる。 It can be added drug more than 1 in order to release simultaneously to the composition, or a predetermined time - can be released at released method. かかる薬物は、例えば、タキソール、テトラサイクリン遊離塩基、テトラサイクリン塩酸塩、シプロフルキサシン塩酸塩または5−FUを含み得る。 Such drugs may include, for example, taxol, tetracycline free base, tetracycline hydrochloride, the Cipro full ciprofloxacin hydrochloride or 5-FU. タキソールのフィブリンシーラント複合体への添加は特に有利であり得る。 Added to the fibrin sealant complex of taxol may be particularly advantageous. さらに、薬物は血管収縮剤、例えば、エピネフリンであってよく;あるいは他の薬物、例えばアプロチニンを添加して組織シーラントまたはフィブリン血餅を安定化させることもできる。 Furthermore, the drug is a vasoconstrictor, for example, be a epinephrine; may be stabilized or other drugs, for example, aprotinin by the addition of tissue sealant or fibrin clot. 補足物(類)はその意図する目的が効果的となるようなTS中の濃度とし、例えば抗生物質は微生物の増殖を阻害し、鎮痛剤は苦痛等を緩和するであろう。 Supplement (s) to a concentration in the TS such purposes is effective to its intended, for example, antibiotics inhibit the growth of microorganisms, the analgesic will relieve pain, and the like.
色素、マーカーまたはトレーサーを、例えば、フィブリン血餅が創傷に侵入する程度を示すために、あるいはフィブリン血餅の引き続いての吸収を測定するために添加することができるか、あるいは色素を診断目的で所定の時間−方法様式にて組織シーラントから放出させることができる。 Dye, a marker or tracer, for example, to indicate the extent to which the fibrin clot from entering the wound, or it can be added in order to measure the absorption of subsequent of fibrin clot, or dyes diagnostic purposes predetermined time - can be released from the tissue sealant by way fashion. 色素、マーカーまたはトレーサーは生理学的に適合するものでなければならず、トルイジンブルーのごとき水溶性色素を含めた着色色素、および当該分野で知られている放射性または蛍光マーカーまたはトレーサーから選択することができる。 Dyes, markers or tracers must come to physiologically compatible, it is selected colored dyes, including such as toluidine blue water-soluble dye, and a radioactive or fluorescent marker or tracer are known in the art it can. また、色素、マーカーまたはトレーサーは、組織シーラントの1以上の成分に化学的にカップリングできる化合物であり得る。 Also, dyes, markers or tracers may be a compound capable of chemically coupling one or more components of the tissue sealant. 加えて、マーカーは、創傷組織から出てくるプロテアーゼへの暴露に際して起こるごとき蛋白分解への暴露に際して、色を変化させあるいは色を発色し、その強度を定量できる、当該分野で知られている蛋白質性物質の中から選択できる。 In addition, the marker, upon exposure to occur such proteolytic upon exposure to proteases coming out of the wound tissue, and color development is allowed or color change color can be quantified the intensity, proteins known in the art It can be selected from among sexual material.
さらに、TSを使用して創傷または損傷骨または骨化組織を置き換えまたはそれを修復する場合、組成物に有効量の無機質脱落骨マトリックスおよび/または骨形態発生蛋白質、および/またはそれらの生物学的に適合する誘導体を補足することもできる。 Furthermore, if the replacement or repair it wounds or damaged bone or ossified tissues using TS, demineralized bone matrix and / or bone morphogenetic protein effective amount in the composition, and / or biological their biological compatible derivatives can also be supplemented to.
自己含有TS創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯のフィブリノーゲンおよび/またはトロンビン成分の濃度は、最終フィブリンマトリックスの密度および凝固速度に対して有意な効果を有し得る。 Concentration of fibrinogen and / or thrombin component of the self-contained TS wound dressing, or fibrin sealant bandage can have a significant effect on the density and the solidification rate of the final fibrin matrix. この原理を用いて、特殊な状況において、自己含有TS創傷包帯剤またはフィブリンシーラント包帯の特異的使用を満足させることができる。 Using this principle, in special circumstances, it is possible to satisfy the specific use of a self-contained TS wound dressing, or fibrin sealant bandage. 例えば、動脈創傷の治療は、フィブリン血餅が非常に迅速に凝固し、加圧血流に耐えるのに十分な一体性を必要とするであろう。 For example, the treatment of arterial wounds fibrin clot very quickly solidified, would require sufficient integrity to withstand the pressure 圧血 stream. 他方、創傷における深い間隙を充填する場合には、治療は、フィブリン血餅が凝固する前に成分が創傷を完全に満たすことが必要となろう。 On the other hand, in the case of filling the deep gap in the wound, the treatment would ingredients before fibrin clot solidification required to completely fill the wound.
ゲルパック態様自己含有包帯剤のゲルパック態様において、トロンビンおよびフィブリノーゲン成分を独立した素早く蒸発するゲル層(例えば、メチルセルロース/アルコール/水)個々に含有させ、ここに、2のゲル層は不浸透性膜によって相互に分離され、該対は外方の保護のための第2の不浸透性膜で被覆されている。 In the gel pack embodiments of the gel pack embodiments self-containing dressings, gel layer quickly evaporates independent thrombin and fibrinogen components (e.g., methylcellulose / alcohol / water) is contained individually here, the second gel layer by an impermeable membrane are separated from each other, the pair is covered with the second impermeable film for protecting the outside. 該包帯は、ゲルパッドが使用の間に所定の箇所に止まることを保証するためにゲルと接触する表面に被覆することができる(図39参照)。 Dressing may be coated on the surface in contact with the gel in order to ensure that stops at a predetermined position between the gel pad is used (see Figure 39).
使用において、2のゲル層を分離する膜を除去し、2成分を混合させる。 In use, to remove the membrane separating the two gel layer, mixing the two components. 次いで、外方膜を除去し、包帯を創傷部位に適用する。 Then removed outer membrane is applied dressing to the wound site. トロンビンおよびフィブリノーゲン調製物の他の成分の作用は、他のFS適用につき従前に開示されているように、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を引き起こす。 Action of other components of the thrombin and fibrinogen preparation, as disclosed in previously per other FS application, causing the conversion of fibrinogen to the fibrinogen. この結果、血液および流体の創傷からの喪失が自然に阻害され、感染に対して自然のバリアーが確立される。 As a result, the loss from the wound of the blood and fluid is inhibited naturally, natural barrier is established against infection.
同様のゲルパック態様において、トロンビン成分、およびトロンビンゲルおよびフィブリノーゲンゲルを分離するプラスチック膜双方を省くことができる。 In a similar gel pack embodiments, it is possible to omit the plastic film both to separate thrombin component, and thrombin gels and fibrinogen gel. 操作において、外方不浸透プラスチックフィルムを除去し、前記したごとくに、創傷部位に包帯を直接適用する。 In operation, to remove the outer impervious plastic film, in as mentioned above, to apply the bandage to the wound site directly. トロンビンおよびカルシウムは創傷部位に天然に存在し、従って、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を誘導し、前記したごとく血液および流体の創傷からの喪失を阻害する。 Thrombin and calcium naturally present in the wound site, thus, induce the conversion of fibrinogen to fibrin, inhibiting the loss from the blood and fluids wounds as above described.
ゲルパックのこの別の態様は、簡便で、安価で、生産するのが容易であるという利点を有する。 This alternative embodiment of the gel pack is simple, has the advantage of inexpensive and easy to produce. しかしながら、患者の創傷がフィブリノーゲンゲルをフィブリン組織シーラントに効果的に変換するのに不十分なトロンビンを有する状況があり得る。 However, there may be situations where the patient's wound has insufficient thrombin to effectively convert fibrinogen gel fibrin tissue sealant. その場合には、前記した本発明のゲルパック態様におけるごとく、トロンビン成分を外因的に適用しなければならない。 In that case, as in the gel pack embodiments of the present invention described above shall apply thrombin component exogenously.
フィブリンシーラント包帯態様フィブリンシーラント包帯態様は、患者において創傷組織に組織シーラント組成物を適用するために処方され、ここに該包帯は、順番に(1)閉塞性裏打ち;(2)該裏打ちの創傷に面する表面上の生理学的に許容される接着剤層;および(3)(a)乾燥したウイルス不活化精製フィブリノーゲン複合体、(b)乾燥したウイルス不活化精製トロンビンの有効量の組合せ、および必要に応じて(c)水和に際して組織シール性フィブリン血餅を生じるのに有効な量のカルシウムおよび/または第XIII因子からなる乾燥物質の層からなり、ここに、乾燥物質の該層は接着層の創傷に面する表面に付着されている。 Fibrin sealant bandage aspect fibrin sealant bandage embodiment are formulated to apply tissue sealant composition to the wound tissue in a patient, wherein the dressing is sequentially (1) occlusive backing; (2) to said backing wound physiologically acceptable adhesive layer on the surface facing; and (3) (a) dry virus inactivation purified fibrinogen complex, (b) an effective amount of a combination of dry virus inactivation purified thrombin, and optionally made from a layer of dry matter consisting of effective calcium amount and / or factor XIII to produce by the tissue sealing fibrin clot during (c) hydration according to, herein, the layer of dry substance adhesive layer It is attached to a surface facing the wound. 1の態様において、閉塞性裏打ちおよび生理学的に許容される接着剤層は、もし裏打ち層が乾燥物質の層を効果的に結合させるのに十分な位接着性であれば、1つであって同一である。 In one aspect, occlusive backing and physiologically acceptable adhesive layer, if if sufficient position adherent to the backing layer to effectively bond the layers of the dry matter, be one it is the same.
もう1つの態様において、長期間の安定な貯蔵のために、除去可能な耐水性の保護フィルムを乾燥物質の層および包帯の露出した接着剤表面上に置く。 In another embodiment, for long-term stable storage, placing a removable water-resistant protective film on the exposed adhesive surface of the layer and bandages dry matter. 操作において、耐水性の保護フィルムを、創傷組織上の包帯の適用に先立って除去する。 In operation, the water resistance of the protective film is removed prior to application of the dressing on the wound tissue.
1の態様の組織シーラント成分は包帯を創傷組織に適用する時に活性化させて、出血する創傷から出てくる患者の内因性流体によって組織シール性フィブリン血餅を形成させる。 Tissue sealant components 1 aspect dressing by activating when applied to the wound tissue to form a tissue seal fibrin clot by endogenous fluids of the patient coming out of bleeding wounds. 好ましくは、組織シーラントを水和させ、創傷からの流体喪失は創傷組織への包帯の適用の数分内に有意に排除される。 Preferably, hydrated tissue sealant, fluid loss from the wound is significantly eliminated within minutes of application of the dressing to the wound tissue. フィブリン血餅が形成され凝固するスピードは適用によって幾分指示されるが(例えば、動脈創傷および出血する組織損傷にための迅速な凝固、骨組織に対する創傷の処理のための遅い凝固)、好ましくは、フィブリン血餅は適用後20分以内に形成されるであろう。 Although the speed of fibrin clot is formed coagulation is somewhat dictated by the application (e.g., rapid solidification for the tissue damage arterial wounds and hemorrhage, slow coagulation for the treatment of wounds to bone tissue), preferably , fibrin clot will be formed within 20 minutes after application. より好ましくは、この効果は、包帯の適用後10分以内に明らかとなるであろう。 More preferably, this effect will become apparent within 10 minutes after application of the dressing. 最も好ましくは、フィブリン血餅は適用後2ないし5分内に形成されるであろう。 Most preferably, the fibrin clot will be formed in 2 to 5 minutes after application. フィブリン血餅を最も迅速に形成することからなる態様において、組織シールは適用後1−2分内、より好ましくは1分以内、最も好ましくは30秒以内に実質的に形成される。 In embodiments consisting in most rapidly form a fibrin clot, tissue seal is applied after the 1-2 minutes, more preferably within 1 minute, most preferably substantially formed within 30 seconds.
組織シール性フィブリン血餅が創傷部位上に形成されるまでフィブリンシーラント包帯を適用するにおいては圧力を使用する必要があろう。 It may be necessary to use a pressure in the tissue sealing fibrin clot to apply fibrin sealant bandage until formed over the wound site.
別法において、創傷からの流体喪失が乾燥した組織シーラント物質の適当な水和を供するのに不十分である状況、あるいは生命の危険な状況におけるごとく時間が重要な状況において、組織シーラント組成物を、創傷組織への包帯の適用に先立って、適当な生理学的に許容される液体によって水和させる。 In the alternative, in a suitable hydrated it is insufficient to provide the status or the time as in dangerous situations critical conditions of life, the tissue sealant material fluid loss was dried from a wound, a tissue sealant composition , prior to application of the dressing to the wound tissue, thereby hydrated with a suitable physiologically acceptable liquid.
包帯を構成するためには、例えば、凍結乾燥によって乾燥物質を得ることができ、あるいは適当な商業的に入手可能な物質を利用できる。 To configure the bandage, for example, freeze-dried by can be obtained dry substance, or can use a suitable commercially available material. また無水CaCl 2を乾燥TS組成物に添加して、フィブリンシーラント包帯の水和に際してフィブリン形成速度を加速することもできる。 Further by addition of anhydrous CaCl 2 in dry TS composition can also be accelerated fibrin formation rate during hydration of fibrin sealant bandage. 乾燥物質の接着剤または裏打ち層への結合は、結合剤、好ましくは水溶性結合剤を乾燥成分に添加することによって促進することができる。 Binding to the adhesive or backing layer of the dried material, the binder, preferably can be promoted by adding a water-soluble binder to the dry ingredients.
フィブリンシーラント包帯の裏打ちは通常の再吸収可能な材料、例えば、シリコーンパッチまたはプラスチック材料とすることができ、あるいは生分解性の再吸収可能な材料とすることもできる。 Backing normal resorbable material of fibrin sealant bandage, for example, be a silicone patch or plastic material, or may be a biodegradable resorbable material. 裏打ち材料は送達デバイス以上として作用し得る。 Backing material may act as more delivery devices. その好ましい組成物はフィブリンシーラント包帯の所望の適用によって決定される。 Its preferred composition is determined by the desired application of the fibrin sealant bandage. 例えば、非再吸収性裏打ちは、それがフィブリン血餅に強度および保護を供する場合には、多くの外部使用に適する。 For example, non-resorbable backing, it when subjected strength and protection to the fibrin clot is suitable for many external use. 別の態様において、非再吸収性裏打ちは、例えば、繊維で補強して、フィブリン血餅上を被覆する保護のために過剰の強度および持続性を供する。 In another embodiment, non-resorbable backing, for example, reinforced with fibers, subjecting the excess intensity and persistence for protection covering the fibrin Chimochijo.
裏打ちでの血餅の引き続いての除去は、フィブリンシーラント包帯を、医療助力が利用できるようになるまでのか応急手段として使用される場合のごとき、多くの状況では許容される。 Removal of subsequent of clot in the backing, the fibrin sealant bandage, such as if the medical aid is used as the or emergency means to become available, in many situations is permitted. かかる状況において、血餅はその目的を達して、生命を脅かす流体の喪失を防ぎ、創傷の適当な処置または外科的修復を可能とするためにさらなる組織損傷を引き起こすことなく血餅を除去するのが望ましいであろう。 In such a situation, clots reach its purpose to prevent loss of fluid life-threatening, to remove clots without causing further tissue damage in order to allow appropriate treatment or surgical repair of wounds it would be desirable.
別法において、非再吸収性裏打ちを用いて、例えば、動脈創傷におけるごとく出血する流体が加圧下で出てくる場合には、その形成の間に組織シール性フィブリン血餅に強度を与えることができる。 In another method, a non-resorbable backing, for example, when the fluid to bleed as in the arterial wound emerges under pressure, to give strength to the tissue seal fibrin clot during its formation it can. しかし、かかる創傷が内部のものであれば、組織シールを乱すことなくフィブリン血餅から裏打ちを除去するのが有利である。 However, as long as such a wound is internal, it is advantageous to remove the backing from the fibrin clot without disturbing the tissue seal. 従って、フィブリンシーラント包帯は、接着剤層がフィブリン血餅のそれよりも低い勢断強度を有する材料であり、創傷を囲むフィブリン血餅または組織に対する損傷なくして裏打ちを除去するのが可能となる場合に供される。 Therefore, fibrin sealant bandage is a material adhesive layer has a lower Zeidan strength than that of the fibrin clot, if it is possible to remove the lining and without damage to the fibrin clot or tissue surrounding the wound It is subjected to.
比較により、ある種の内部適用は、包帯剤のひき続いての除去の必要性をなくするために、再吸収性裏打ちの使用を要求する。 By comparison, certain internal application, in order to eliminate the pull Subsequently need for removal of the dressings, require the use of resorbable backing. 再吸収性材料は、いずれの他の代謝の乱れも引き起こすことなく、有意には治癒および/または組織の再生または機能と干渉しないように消費されまたは排出される化合物に自然に、または身体によって分解されるものである。 Resorbable materials decompose, without causing even disturbance of any other metabolic naturally to significantly is consumed so as not to interfere with reproduction or function of healing and / or tissue or discharged the compound, or by the body it is intended to be. ホメオスタシスは維持される。 Homeostasis is maintained. 生分解性裏打ちを調製するのに適した材料は、蛋白質性物質、例えば、フィブリン、コラーゲン、ケラチンおよびゼラチン、または炭水化物由来物質、例えば、キチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースまたはセルロース、および/またはそれらの生物学的適合誘導体を含む。 Materials suitable for preparing the biodegradable backing, proteinaceous material, e.g., fibrin, collagen, keratin and gelatin or a carbohydrate derived material, e.g., chitin, chitosan, carboxymethylcellulose or cellulose, and / or their biological including the biological compatible derivatives.
接着剤層は、もし閉塞性裏打ち層から分離していると、フィブリンシーラント包帯の意図した適用に基づいて選択され、通常の接着剤材料よりなるものとできる。 The adhesive layer, when separate from if occlusive backing layer is selected based on the intended application of the fibrin sealant bandage, it is assumed that normally consists of adhesive material. 防腐剤を接着剤層に添加することができる。 It can be added a preservative adhesive layer.
外科手術に先立ってのごとく、組織シール性フィブリン血餅を閉塞性裏打ちにて創傷から除去すべきであれば、接着剤は、乾燥物質層を閉塞性裏打ちに付着させ、フィブリンの剪断強度よりも大きい接着剤の水和後能力を維持するのに十分でなければならない。 As the prior surgery, if should be removed from the wound tissue sealing fibrin clot at obstructive backing, adhesive, dry material layer deposited on occlusive backing, than the shear strength of the fibrin It must be sufficient to maintain hydration after the ability of large adhesive.
もし組織シール性フィブリン血餅を創傷上の所定の箇所に残すべきであるが、閉塞性裏打ちを適用後に除去しなければならないならば、接着剤は、乾燥物質層を閉塞性裏打ちに付着させるのに十分に暗い粘着性でなければならないが、フィブリン血餅の剪断強度よりも小さい接着剤の水和後強度を有しなければならない。 If While tissue sealing fibrin clot should remain in a predetermined position on the wound, if must be removed after application of occlusive backing, the adhesive adhering the dried material layer occlusive backing a must be sufficiently dark sticky, must have a hydration strength after a small adhesive than the shear strength of the fibrin clot. 別法において、接着剤層は、乾燥物質の水和の間に可溶化され、あるいは粘着性が低くなり、フィブリン血餅からの裏打ちの除去を可能とするものでよい。 In the alternative, the adhesive layer is solubilized during the hydration of dry matter, or tackiness is lowered, or those that enable the removal of the backing from the fibrin clot. かかる目的での別法において、乾燥物質層は閉塞性包帯に直接付着させることができる。 In alternative for such purposes, dry material layer may be deposited directly on the occlusive dressing.
もう1つの態様において、接着剤層は組織シール性フィブリン血餅を乱すことなく閉塞性層の水和後の除去を可能とする2つの異なる接着剤よりなる。 In another embodiment, the adhesive layer is composed of two different adhesives to allow removal after hydration of occlusive layer without disturbing the tissue seal fibrin clot. 典型的には、かかる状況においては、乾燥した組織シーラント成分材料は裏打ちの特別の領域、「内方領域」、例えば、中央に付着させ、接着剤の塞がれない領域は乾燥物質の領域、「外方領域」を超えて伸びる。 Typically, in such a situation, dry tissue sealant component materials special area of ​​the backing, "inwardly region", for example, is deposited in the center area not blocked with the adhesive region of the dry matter, It extends beyond the "outer region".
接着剤の外方領域は、包帯の乾燥物質領域が創傷上に直接フィブリン血餅を形成するように、創傷を囲むまたはそれに隣接する皮膚または組織に直接付着させる。 Outer area of ​​the adhesive, drying material region of the dressing to form a direct fibrin clot over the wound, is deposited directly on the skin or tissue adjacent surrounding the wound or to it. 包帯の乾燥物質層によって覆われない裏打ちの領域上の接着剤は、その物理的除去まで、フィブリンシーラント包帯を創傷を囲むフィブリンシーラント包帯を付着させるのに十分なものとする。 Adhesive on the backing of the area not covered by the drying material layer of the dressing, to its physical removal, and sufficient fibrin sealant bandage to deposit fibrin sealant bandage surrounding the wound. 外方領域上の接着剤は、加圧下の創傷、例えば動脈創傷からもし流体が出てきても、包帯を所定の箇所に保持するのに十分なものでなければならない。 Adhesive on the outer region, the wound under pressure, for example, even come if out fluid from the arterial wounds, must be sufficient to hold the dressing in a predetermined position.
接着剤の内方領域は、乾燥物質層を裏打ちに付着させるのに十分な位粘着性であるが、フィブリン血餅の剪断強度よりも小さい接着剤の水和後能力を有するものである。 Inner region of the adhesive is sufficient for position tack for attaching a dry material layer to the backing, and has a capacity after hydration of less adhesive than the shear strength of the fibrin clot. 別法において、接着剤の内方領域は、乾燥物質の水和の間に可溶化されまたは粘着性がより低くなり、裏打ちのフィブリン血餅からの除去を可能とする材料である。 In the alternative, the inner area of ​​the adhesive is solubilized during the hydration of the dry substance or adhesive becomes lower, which is a material that allows removal from the fibrin clot of the backing. かかる目的の別法において、乾燥物質層は、直接閉塞性包帯に内方領域にて付着させることができ、接着剤層は外方層のみに適用される。 In the alternative this purpose, dry material layer may be attached directly to the occlusive dressing at the inner region, the adhesive layer is applied only to the outer layer.
かくして、2つの接着剤態様において、フィブリンシーラント包帯の裏打ちは、包帯を物理的に除去するまで創傷を囲む組織に所定の箇所にて付着させたままとする。 Thus, in the two adhesive embodiment, the backing of the fibrin sealant bandage, and remain adhered at the tissue at predetermined locations surrounding the wound until the physical removal of the dressing. しかし、除去に際しては、組織シールを乱すことなく、裏打ちを組織シール性フィブリン血餅から分離する。 However, upon removal, without disturbing the tissue seal to separate the backing from the tissue seal fibrin clot.
フィブリンシーラント包帯の二重カプセル化態様フィブリンシーラント包帯のなおさらなるもう1つの態様において、有効量の炭酸化水またはPBSのごとき生理学的に許容される緩衝化水和剤、または匹敵するゲルからなる独立した水和層を、破壊可能な液体不浸透性容器内に含有させる。 In still further another embodiment of a dual encapsulation aspect fibrin sealant bandage fibrin sealant bandage, independently comprising an effective amount of a physiologically acceptable buffered water dispersible, such as carbonate Kamizu or PBS or comparable gel, the hydration layer to be contained in a breakable liquid-impermeable container. 水和層をカプセル化する破壊可能な液体不浸透性容器は、前記閉塞性包帯にまたは閉塞性包帯に隣接する前記接着剤層に直接付着させる。 Breakable liquid-impermeable container that encapsulates hydration layer are deposited directly on the adhesive layer adjacent to the occlusive dressing or obstructive dressing. 水和層をカプセル化する破壊可能な液体不浸透性容器の露出側(裏打ちまたは接着剤層に付着させない側)に付着して、前記したごとく、微細に粉砕した粉末化フィブリン成分の乾燥層がある。 Exposed side of the breakable liquid-impermeable container that encapsulates hydration layer adhered to (the side which does not adhere to the backing or adhesive layer), as mentioned above, dry layer of finely ground powder fibrin component is there. 乾燥成分の層は、粉末化フィブリノーゲン、またはフィブリノーゲン複合体、トロンビン、および要すれば、水和に際してフィブリン血餅を形成するのに十分なカルシウムおよび/または第XIII因子を含む。 Layers of dry ingredients, including powdered fibrinogen or fibrinogen complex, thrombin, and optionally, a sufficient calcium and / or Factor XIII to form a fibrin clot during hydration.
二重層(乾燥層および水和層)は、外方の保護のための第2不浸透性膜と共に、閉塞性裏打ちに当該層を付着させる閉塞性裏打ちまたは接着剤物質と接触せずに全ての表面を一緒に覆う。 Bilayer (dry layer and hydration layer), the second impermeable film for the outer protection, all without contacting the occlusive backing or adhesive substance is deposited the layer occlusive backing covering the surface together. かくして、この二重層態様において、内容物は不浸透性容器内に完全にカプセル化され、ここに、一方側は閉塞性裏打ち材料であって、他方側および全てのエッジは外方の保護のための第2不浸透性膜によって形成される。 Thus, in this bilayer embodiment, contents are completely encapsulated in an impermeable container, here, one side is a occlusive backing material, for the other side and all edges of the outer protective It is formed by a second impervious membranes.
操作において、水和層をカプセル化する内方液体不浸透性容器は物理的に破壊されて、そこに含有される水和物質を乾燥フィブリン成分層に放出させ、その結果、十分に水和した組織シール性フィブリン血餅が生じて、創傷からの血液および流体喪失を阻害し、感染に対する天然のバリアーを供する。 In operation, the inner liquid-impermeable containers that encapsulate hydration layer is physically destroyed, hydrated substance contained therein is released to dry fibrin component layer, resulting in sufficiently hydrated caused tissue sealing fibrin clot, inhibit blood and fluid loss from the wound, providing a barrier of natural against infection. 外方の第2不浸透性膜は、放出された水和物質、順応性フィブリン複合体が形成されるまで乾燥成分と接触させておき、その時点で、外方膜は物理的に除去され、包帯は創傷上に置かれて組織シーラントを形成する。 The second impermeable membrane outwardly, released hydrated material, left in contact with the dry ingredients until the flexible fibrin complex is formed, at which time, the outer layer is physically removed, dressing to form a tissue sealant is placed over the wound.
別法において、外方膜を物理的に除去し、組織シール性フィブリン血餅が創傷組織上に直接形成されるように、内方液体不浸透性容器を破壊し、水和剤が乾燥フィブリン成分類に放出される方法で、二重層に力をかけて創傷領域に適用する。 In the alternative, the outer layer physically removed, so that the tissue sealing fibrin clot is formed directly on the wound tissue, destroying the inner liquid-impermeable container, a wettable powder dry fibrin formation in the method that is released to the classification, it applied to the wound area by applying a force to the bilayer.
フィブリンシーラント包帯の他の態様におけるごとく、選択した接着剤および裏打ち材料は、包帯の意図した適用によって決定できる。 As in other aspects of the fibrin sealant bandage, adhesive and backing materials selected it may be determined by the intended application of the dressing. 裏打ちは除去可能であるか、あるいは再吸収性であり、接着剤は包帯の除去に際して組織シーラントを創傷を除去する、または組織シール性フィブリン血餅を乱さないようにしておくという意図した目的を有する。 Backing either be removed or are resorbable, adhesives have intended purpose of advance so as not to disturb the tissue sealant of removing the wound, or tissue sealing fibrin clot upon removal of the dressing . 接着剤は別々に結合した層であるか、あるいは裏打ちがそれ自体乾燥フィブリン成分を付着させる接着剤として作用する。 Or the adhesive is a layer bonded separately or backing acts as an adhesive to adhere itself dry fibrin component.
フィブリン複合体を形成するのに必要であるトロンビン、カルシウムおよび第XIII因子は、乾燥物質層中に乾燥物質(類)として添加しておくか、あるいはそれらは水和層中に液体またはゲル形態で含ませて置くことができる。 Thrombin, calcium, and Factor XIII is required to form a fibrin complex, or previously added in the dry material layer as dry substance (s), or they in liquid or gel form during hydration layer included not can be placed. さらに、それらは、必要なフィブリン形成性成分が存在し、乾燥層が包帯が使用されるまで水和されずにいる限り、2の層の間に分割することができる。 Furthermore, they are instead necessary fibrin forming components, as long as the dry layer is present without being hydrated to bandage is used, it can be divided between the two layers. 加えて、従前に開示したごとき成長因子、抗生物質、防腐剤、抗増殖薬物等のごとき添加剤もフィブリンシーラント包帯の本態様に含ませることができる。 In addition, it is possible to growth factors such as disclosed previously, antibiotics, antiseptics, and additives such as such as an anti-proliferative drug included in the present embodiment of the fibrin sealant bandage.
もし水和層が気体で過飽和した液体を含有するならば、乾燥物質層は発泡性で発泡体を形成するフィブリン組織シーラントとして水和されるであろう。 If containing a liquid hydration layer was supersaturated with gas, dry material layer will be hydrated as fibrin tissue sealant for forming a foam by foaming. 別法において、乾燥物質層に、気体を生じる、かくして水和剤と接触して発泡する物質を補足することができる。 In the alternative, the dry material layer, resulting in gas, thus it is possible to supplement the material which foams in contact with a wettable powder.
もし水和層が速蒸発性ゲル層(例えば、メチルセルロース/アルコール/水)のごときゲルの形態であれば、回りの不浸透性バリアーの破壊は、前記したごとく乾燥物質フィブリン成分を直接水和層に接触させて、組織シール性フィブリン血餅を生じさせる。 If the hydration layer is fast evaporating gel layer (e.g., methylcellulose / alcohol / water), then the form of such gels, destruction around the impermeable barrier is, as mentioned above dry substance fibrin component of direct hydration layer in contact with, causing tissue sealing fibrin clot. 液体水和層につき記載したのと同様に、ゲル層はフィブリン複合体のトロンビン、カルシウムまたは第XIII因子のうちのいずれか1種または全て、および/または前記添加剤のうちのいずれか1種を含むことができる。 In a manner similar to that described for the liquid hydration layer, the gel layer fibrin complex thrombin, calcium, or any one or all of the Factor XIII, and / or any one of the additive it can be included.
別の二重層において、組織シーラントを、裏打ちに付着させる必要のない創傷シーリング包帯剤として送達する。 In another bilayer, delivering tissue sealant, require no wound sealing dressing to adhere to the backing. 成分はカプセル内の実質的にカプセルとして組織され、ここにカプセルなる語は材料というよりもむしろ広い概念を定義するのに用いる。 Component is organized as a substantially capsule inside the capsule, wherein the composed capsule term used to define the broad concept rather than material. 前記カプセル化水和層は、それ自体、乾燥フィブリン成分物質およびカプセル化水和層を共に含有する、第2のカプセル化ユニット内に含有される。 The capsule Kamizu hydration layer may itself contain both dry fibrin component substances and capsules Kamizu hydration layer is contained within the second encapsulation unit.
操作において、水和層をカプセル化する内方液体不浸透性容器を物理的に破壊して、そこに含まれる水和物質を乾燥フィブリン層に放出させ、その両者は外方第2カプセル化ユニット内に完全に含有されたままである。 In operation, the inner liquid-impermeable container that encapsulates hydration layer by physically destroyed, hydrated substance contained therein is released to dry fibrin layer, both the outer second encapsulation unit it remains completely contained within. 水和層をカプセル化する内方容器を物理的に破壊する場合、外方第2カプセル化ユニットの全体が破壊されるのではない。 If you destroy the inner container to encapsulate hydration layer, the entire outer second encapsulation unit not being destroyed.
外方カプセル化ユニット内の水和層と乾燥フィブリン成分との混合の結果、十分に水和されたシーリングフィブリン血餅が得られ、次いで、これは創傷組織へと放出または排出されて組織シールを形成する。 Result of mixing of the hydrated layer of the outer Encapsulation unit and the drying fibrin component, sealing fibrin clot that is fully hydrated is obtained, then the tissue seal which is released or discharged to the wound tissue Form. フィブリン塊を放出させるには、外方カプセル化ユニットを、ランダムにあるいは表面上の特定の位置にて物理的に切断しまたは引き裂いて、流動噴流を形成させ、順応性フィブリン塊の流れを創傷部位に向ける。 To release the fibrin clot, the outer encapsulation unit, randomly or physically cut at a specific location on the surface or tearing, to form a flow jets, the flow of malleable fibrin clot wound site turn to.
もし水和層が気体で過飽和した剤であれば、水和剤と乾燥フィブリン成分との混合の結果、発泡性混合物が得られ、次いで、これを創傷組織に適用する。 If any agent hydration layer was supersaturated with gas, the result of mixing a wettable powder and dry fibrin component, the foamable mixture is obtained, then this is applied to the wound tissue. 別法において、発泡は乾燥成分層の水和によって達成することができる。 In the alternative, foaming may be accomplished by hydration of the dry ingredients layer.
自己発泡性フィブリンシーラント態様患者なおいて創傷組織を治療するための自己発泡性フィブリンシーラント包帯剤態様は、(1)ウイルス不活化精製フィブリノーゲン、(2)ウイルス不活化精製トロンビンのフィブリン形成有効量の組合せ、および必要に応じて(3)カルシウムおよび/または第XIII因子からなる発泡性フォームとして処方され、ここに、該組成物は十分な厚みの皮膚創傷治癒を有意に阻害しない。 Self self-foaming fibrin sealant dressings aspect of expandable fibrin sealant aspect patient dude and for treating wounded tissue is (1) viral inactivation purified fibrinogen, (2) a combination of fibrin formation an effective amount of a virus inactivation purified thrombin , and optionally (3) is formulated as a foaming foam consisting of calcium and / or factor XIII, wherein, the said composition does not significantly inhibit the skin wound healing in a sufficient thickness. 従前に記載されているTS成分は、該成分が発泡性フォームとして創傷部位に送達させ、それが数分内にフィブリンシールを形成するように、圧縮プロペラントを有する容器またはタンク中に貯蔵される。 TS ingredients described previously can be delivered to the wound site said component foamable foam, so that it forms a fibrin seal within a few minutes, it is stored in a container or tank having a compressed propellant .
発泡性フォーム態様の許容される処方は、フィブリン血餅の水和成分を提供し、これは操作において20倍まで発泡する。 Acceptable formulation of expandable foam aspect provides a hydration component of the fibrin clot, which foamed up to 20 times in the operation. しかしながら、組織シール性フィブリン血餅の発泡の程度はその意図した適用によって決定される。 However, the degree of foaming of the tissue sealing fibrin clot is determined by its intended application.
例えば、腹部内での発泡性フォームシーラント包帯剤の使用は、感染に対するバリアーも供しつつ、損傷した内部組織器官または血管からの血液または流体喪失を有意に減少または防止するフィブリン組織シーラントを提供する。 For example, the use of effervescent foam sealant dressings in the abdomen, while subjecting be barrier to infection, providing a fibrin tissue sealant to significantly reduce or prevent blood or fluid loss from a damaged internal tissue organ or vessel. しかしながら、同時に、フォームの発泡は組織、器官または血管に対する有害な圧力を防止するように制御されなければならない。 However, should at the same time, the foam of the foam structure, to be controlled so as to prevent harmful pressure on the organ or vessel. かかる状況は、発泡が1または2倍で5〜10倍以下に限定される発泡性フォーム包帯剤の使用を保証できる。 Such situation can guarantee the use of expandable foam dressing foaming is limited to 5 to 10 times at 1 or 2 times.
比較すると、骨内の間隙を満たすための発泡性フォームフィブリンシーラント包帯剤の使用は、かなり大きい速度で発泡して密で強固なシールを創傷領域上に生じる物質の使用を保証する。 By comparison, the use of effervescent forms fibrin sealant dressings to meet the gap in the bone, the dense firm seal with foamed significantly greater rate to ensure the use of a substance that occurs on the wound area. また、動脈創傷は高圧縮フォーム組織シーラント包帯剤にもよく応答する。 Moreover, arterial wounds respond well to high compression form tissue sealant dressings. かかる物質の発泡の程度は、好ましくは10〜20倍、より好ましくは5〜10倍であるが、20倍を超える範囲であってもよい。 The degree of foaming of such materials, preferably 10 to 20 times, more preferably at 5 to 10 times, may be in the range of more than 20 times. 1ないし2倍を含めた5倍未満の発泡も、例えば、内部耳のごとき小さな領域において血管または損傷骨の修復に適用することができる。 Foaming of less than 1 to 5 times, including twice as, for example, can be applied to blood vessels or injury bone repair in a small region such as the internal ear.
発泡速度と同様に、発泡性フォームフィブリン包帯剤を用いるフィブリンシールの形成のための硬化時間もその意図した適用に関係する。 Like the foaming speed, the curing time for the formation of the fibrin seal using expandable foam fibrin dressings also relates to the intended application. ある状況では、動脈創傷または損傷した心臓組織を患う患者におけるごとく、生命が失われるのが切迫し得る。 In some situations, as in patients suffering from arterial wounds or damaged heart tissue, the life is lost can be imminent. かかる状況では、フィブリン包帯剤を非常に迅速に発泡させ、できるだけ素早くフィブリン組織シールを形成させなければならない。 In such a situation, fibrin dressings very rapidly by foaming, it must be formed as quickly as possible fibrin tissue seal. 好ましくは、該シールは硬化させ、2分以内、より好ましくは1〜2分内に、最も好ましくは1分以内に患者の流体喪失を有意に減少させる。 Preferably, the seal is cured within 2 minutes, more preferably within 1 to 2 minutes, most preferably significantly reduces the fluid loss of a patient within 1 minute.
他方、全ての創傷が直ちに生命を脅かすものではない。 On the other hand, not all of the wound is immediately life-threatening. 例えば、骨組織の組織シーラント修復の強度は迅速な硬化時間よりも重要である。 For example, the strength of the tissue sealant repair of bone tissue is more important than fast curing time. かかる状況では、組織シール性フィブリン血餅の組成物を修飾して、フィブリンフィブリルのより大きな架橋または粘稠化を可能とし、あるいは長期間発泡し続けるより希薄な組成物の送達を可能とする。 In such circumstances, to modify the composition of the tissue sealing fibrin clot, to allow a greater crosslinking or thickening of the fibrin fibrils, or enable the delivery of dilute compositions than continuing a long period of time the foam to. かかる処方は、組織シール性フィブリン血餅を硬化させるのにわずかに長い時間を可能としまたはそれを要する。 Such formulations allow slightly longer time to cure the tissue seal fibrin clot with or require it. 1分以下の硬化時間はかかる適用に適し、1〜2分または5分までの硬化時間が許容されるであろう。 1 minute or less curing time suitable for such applications, the cure time to 1-2 minutes or 5 minutes would be acceptable. 当業者に認識可能な状況において、5〜10分の、あるいは20分までもの長い硬化時間は生命を脅かさない状況で許容されるであろう。 In recognizable situation to those skilled in the art, of 5 to 10 minutes, or longer curing time even up to 20 minutes will be acceptable in situations where life threatening.
送達デバイス、例えば、小型容器、タンク等は特に本適用のために開発することができ、それらは商業的に入手可能である。 Delivery device, for example, small containers, tanks and the like can be developed specifically for this application, which are commercially available. 小型容器は単一または多数の貯蔵器いずれかであってよい。 Small container may be either single or multiple reservoirs. 別々の貯蔵器は、より高価ではあるが、有利には、水和した成分がそれらが適用に際して混合されるまで別々であってかつ安定であるようにする。 Separate reservoirs, albeit more expensive but, advantageously, hydrated component to ensure they are stable and be separate until they are mixed upon application.
プロペラントは生理学的に許容され、薬理学的適用に適するものでなければならず、また、便宜には、加圧下の知られたプロペラント、例えば、CO 2 、N 2 、空気またはフレオンのごとき不活性ガスを含み得る。 Propellant is physiologically acceptable, must those suitable for pharmacological application, also conveniently, known propellant of pressure, for example, CO 2, N 2, such as air or freon It may include inert gas. 別法において、乾燥フィブリン成分には、気体を生成し、それにより、水和剤との接触に際して発泡する物質(類)を補足することができる。 In the alternative, the dry fibrin component generates gas, whereby it is possible to supplement the material (s) which foams upon contact with wettable powder.
送達デバイスからの発泡性フォームフィブリン包帯剤の送達圧は、フィブリン血餅自体の組成およびその硬化時間を組み合わせると、包帯剤の発泡の程度を決定するので、送達圧は処置すべき創傷の性質によって決定される。 Delivery pressure of the foamable foam fibrin dressing from the delivery device, the combination of composition and its cure time of the fibrin clot itself, because it determines the degree of foaming of the dressing, the delivery pressure depending on the nature of the wound to be treated It is determined. 前記したごとく、ある種の創傷は生命の喪失を防止するために組織シール性フィブリン血餅が直ちに形成されるのを必要とし、他方、他の創傷はゆっくりとした送達または組織シール性組成物を強化するために強い架橋を形成する時間を必要とする。 As mentioned above, certain wounds may require the tissue sealing fibrin clot is immediately formed to prevent the loss of life, while the other wound delivery or tissue sealing composition a slow It needs time to form a strong cross-linking in order to strengthen. 従って、送達圧は理想的には状況特異的である。 Accordingly, the delivery pressure is ideal situation specific is.
1気圧またはそれ未満(14.7lbs/インチ2 )の圧力は、低レベルの発泡および遅い速度の送達を提供する。 Pressure of one atmosphere or less (14.7lbs / inch 2) provides a foaming and slow rate of delivery of the low level. しかしながら、ある種の生命を脅かす状況は1〜5気圧またはそれを超える送達圧を是認し得る。 However, situations threatening certain life may admit 1-5 atmospheres or delivery pressure above it. ほとんどの場合、選択した送達圧は、商業的に入手可能な小型容器デバイスのそれに対応する。 In most cases, the selected delivery pressure corresponds to that of a commercially available compact container device. 添加因子として、送達圧は組織シーラント物質が送達系またはデバイス詰まらせないようにするのに重要であろう。 As an additive factor, delivery pressure would be important in such tissue sealant material does not clog the delivery system or device.
自己含有創傷包帯剤およびフィブリンシーラント包帯の組合せ態様最後に、ある種の外傷損傷は、自己含有フィブリンシーラント包帯剤のいくつかの態様を組み合わせることによって最良に処置されるであろう。 The combination aspect last self-containing wound dressings and fibrin sealant bandages, some trauma injury will be treated best by combining some aspects of self-containing fibrin sealant dressings. 例えば、ひどい自動車事故あるいは対人地雷または爆発によって引き起こされたひどい負傷においては、創傷は生命を脅かすのみならず広範なものであり、組織または骨に大きなギザギザの開口を含み、かなりの内部損傷を伴い、しばしば重症の火傷を伴う。 For example, in a terrible injury caused by severe automobile accident or anti-personnel mines or explosive, wounds are those extensive not only life threatening, includes an opening large jagged tissue or bone, with considerable internal injury , often accompanied by severe burns. かかる創傷は、広い面積の創傷組織に加えて、多数の切断された動脈および血管を示す。 Such wounds, in addition to the wound tissue of the large area, numerous severed arteries and vessels. かかる創傷では、まず、迅速に凝固する発泡性フィブリンフォーム包帯剤を惜し気もなく適用して、出血を素早く制御し、次いで、犠牲者を医療機関まで輸送できるまで、あるいは専門家の医療救助が受けられるまで、創傷領域を支持し保護し、例えば、火傷を受けた組織からのゆっくりとした流体喪失をシールするために、フィブリンシーラント包帯の態様にて全領域を包むのが有利である。 In such a wound, first, quickly solidified to be applied without feeling press the effervescent fibrin foam dressings, bleeding and quickly control, then, the victim until it can be transported to a medical institution, or medical rescue experts receiving until the wound area supporting and protecting, for example, to seal the slow fluid loss from burns receiving tissue, it is advantageous wrap the entire region in a manner of fibrin sealant bandage. ほとんどの場合に、次いで、損傷組織の長期間の修復、治療および保護のために、フィブリンシーラント包帯剤のさらなる処方を訓練された者が適用する。 In most cases, then, long-term repair of damaged tissue, for the treatment and protection, to apply a person trained further formulation of the fibrin sealant dressings.
以下の実施例は説明目的で含ませたものであって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。 The following examples are those included for illustrative purposes and are not intended to limit the scope of the present invention.
実施例1 Example 1
FGの補足のためのHBGF−1の調製HBGF−1βをコードするDNAを含んだプラスミドを含有する組換えイー・コリ(E. coli)の培養物800mlを調製した。 Cultures 800ml of recombinant E. coli (E. coli) containing a plasmid that contains DNA encoding HBGF-1 Preparation HBGF-l [beta] for the FG supplement was prepared. 37℃における24時間のインキュベーションおよび培養の後、細胞を遠心し、上清を捨てた。 After 24 hours of incubation and culture in 37 ° C., the cells were centrifuged, the supernatant was discarded. 細胞ペレットを、0.15M NaCl,pH7.3を含有する20mMリン酸緩衝液25mlに再懸濁した。 The cell pellet, 0.15 M NaCl, and resuspended in 20mM phosphate buffer 25ml containing pH 7.3. 懸濁した細胞を細胞破壊機で破壊し、5000gにおける20分間の遠心によって細胞夾雑物を得られた溶液から分離した。 The suspended cells were disrupted with a cell disrupter, were separated from the solution obtained cell contaminants by centrifugation for 20 minutes at 5000 g.
ペレットを捨て、可溶化されたHBGF−1βおよび他の細菌蛋白質を含有する上清を直径2.6cm、高さ10cmのヘパリン−セファロースTMカラム(Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, スウェーデン)に負荷した。 The pellet was discarded solubilized HBGF-l [beta] and other bacteria protein containing the supernatant diameter 2.6 cm, heparin height 10 cm - Sepharose TM column was loaded (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Sweden) on. 20mMリン酸緩衝液、pH7.3中の0.15M NaClの5カラム容量でカラムを洗浄し、次いで、20mMリン酸緩衝液中の0.15M NaClないし2.0M NaClグラジエントで溶出させた。 20mM phosphate buffer, the column was washed with 5 column volumes of 0.15 M NaCl in pH 7.3, then to no 0.15 M NaCl in 20mM phosphate buffer and eluted with 2.0 M NaCl gradient.
溶出物を280nmにおけるUV吸収によってモニターした。 The eluate was monitored by UV absorption at 280 nm. UV吸収性物質の3つのピークが溶出し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。 Three peaks of UV absorbing material eluted and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. ピーク番号3のものは約17,400ダルトンにおける単一のバンドとして電気泳動され、実質的に純粋なHBGF−1βを含有するものであった。 Those peak numbers 3 electrophoresed as a single band at approximately 17,400 daltons, were those containing substantially pure HBGF-l [beta].
HBGF−1βが汚染細菌蛋白質を含まないことをさらに保証するために、成長因子活性を含有するピーク番号3のものを20mMヒスチジン、0.15M NaCl、pH7.5に対して一晩透析した。 To HBGF-l [beta] to further ensure that it does not contain contaminating bacteria protein, 20 mM histidine those growth factors peak numbers 3 containing active, 0.15 M NaCl, and dialyzed overnight against pH 7.5. 2mgの蛋白質を1mlのCM−セファロースTM (Pharmacia, Upsala, スウェーデン)イオン交換カラムに負荷した。 2mg of proteins in 1 ml CM- Sepharose TM (Pharmacia, Upsala, Sweden) was loaded onto an ion exchange column. カラムを10ベッド容量(0.5ml/分)の20mMヒスチジン、0.15M NaCl、pH7,5で洗浄し、20mMヒスチジン、pH7.5中の0.15M NaClないし1.0M NaClのグラジエントで溶出させた。 20mM histidine, 0.15 M NaCl in column 10 bed volumes (0.5 ml / min), washed with PH7,5, 20mM histidine, to no 0.15 M NaCl in pH7.5 and eluted with a gradient of 1.0 M NaCl It was. 溶出物を280nmにおけるUV吸収によってモニターし、HBGF−1βをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。 The eluate was monitored by UV absorption at 280 nm, the HBGF-l [beta] were identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
この精製したHBGF−1を用いて引き続いての実施例でFGを補足した。 Supplemented with FG in the embodiment of subsequently using HBGF-1 The purified.
実施例2 Example 2
HBGF−1の安定性FGの成分である、トロンビンによるHBGF−1βの消化を阻害または防止するFGに成分を添加することが必要であった(Lobb, Biochem. 27:2572-2578(1988))。 Is a component of the HBGF-1 stability FG, it was necessary to add the ingredients to the FG that inhibit or prevent the digestion of HBGF-l [beta] by thrombin (Lobb, Biochem 27:. 2572-2578 (1988)) . HBGF−1に吸収されるヘパリンを選択し、トロンビンおよびFGのいずれかの他の蛋白分解成分による消化からHBGF−1を保護できるか否かを判断するためにテストした。 Select the heparin is absorbed on the HBGF-1, was tested to determine whether it is possible to protect HBGF-1 from digestion by any other proteolytic components of thrombin and FG. 増大させる濃度のヘパリンの存在下におけるHBGF−1の安定性を評価した。 To assess the stability of HBGF-1 in the presence of heparin concentration increasing. HBGF−1β(10μg/ml)、トロンビン(250U/ml)および増大させる濃度のヘパリン(0、0.5、10、20および50U/ml)を含有する溶液を37℃でインキュベートした。 HBGF-1β (10μg / ml), and incubated thrombin (250 U / ml) and that increasing concentrations of heparin (0,0.5,10,20 and 50 U / ml) solution 37 ° C. the containing. インキュベートする溶液からアリコットを周期的に取り出し、凍結し、さらなるテストのために−70℃で保存した。 Aliquots from incubating the solution are removed periodically, frozen, and stored at -70 ° C. for further testing.
インキュベーションが完了した後、試料を解凍し、レムリ(Nature, 227:680(1970))の方法に従って、還元条件下で15%SDSポリアクリルアミドゲルで分離した。 After the incubation is completed, the samples were thawed, Laemmli Following the procedure (Nature, 227 680 (1970)), were separated on 15% SDS polyacrylamide gels under reducing conditions. 次いで、該ゲルをニトロセルロースに電気ブロットし、HBGF−1に対応するバンドを、HBGF−1に対するアフィニティー精製したウキギポリクローナル抗体を用いて同定した。 Then the gel were electroblotted to nitrocellulose, the band corresponding to HBGF-1, was identified using the float formic polyclonal antibodies affinity purified against HBGF-1. ウェスタンブロットを図1に示し、そこでは、17,400mwにおけるHBGF−1βが観察できる。 Western blot is shown in Figure 1, where, HBGF-l [beta] can be observed in 17,400Mw. 結果は、5U/mlもと低い濃度のヘパリンの存在下で、HBGF−1βがトロンビンによる消化から保護されたことを示した。 Results in the presence of 5U / ml original low concentrations of heparin, showed that HBGF-l [beta] were protected from digestion by thrombin. 加えて、実施例3に示すごとく、その生物学的活性は変化されなかった。 In addition, as shown in Example 3, its biological activity was not changed.
実施例3 Example 3
ヘパリンおよびトロンビンの存在下におけるインキュベーション後のHBGF−1βの生物学的活性5U/mlのヘパリンを含有し、実施例2に記載したインキュベーション混合物中のHBGF−1の生物学的活性を、NIH 3T3細胞での3 H−チミジン取込アッセイを用いて測定した。 Containing a biological activity 5U / ml heparin HBGF-l [beta] after incubation in the presence of heparin and thrombin, the HBGF-1 biological activity in the incubation mixture as described in Example 2, NIH 3T3 cells It was measured using a 3 H- thymidine uptake assay in.
NIH 3T3細胞を96ウェルプレートに導入し、細胞が30ないし50%密集に達するまで、0.5%胎児ウシ血清(BCS:GIBCO,Grand Island, New York)を含むダルベッコウの修飾培地(DMEM;GIBCO,Grand Island, New York)中、飢餓条件下で、37℃でインキュベートした。 Introducing NIH 3T3 cells in 96-well plates, until to the cells 30 not reached confluence of 50%, 0.5% fetal calf serum (BCS: GIBCO, Grand Island, New York) modified medium Darubekkou containing (DMEM; GIBCO , Grand Island, in New York), in starvation conditions, and incubated at 37 ° C.. 2日後に、実施例2で調製した試料からの希釈度を変えたHBGF−1を、培地を変化させることなく各ウェルに添加した。 After 2 days, the HBGF-1 by changing the dilution of the sample prepared in Example 2 was added to each well without changing the medium. 希釈剤(インキュベーション緩衝液)を、陰性対照のために成長因子に代えて添加し、増殖のための成長因子を含有する、10%BCSを含むDMEMを、陽性対照のためにHBGF−1試料に代えて添加した。 Diluent (incubation buffer) was added in place of growth factor for the negative control, containing growth factors for growth, DMEM with 10% BCS, the HBGF-1 sample for the positive control instead of by the addition.
37℃における18時間のインキュベーションの後、0.25μCiの3 H−チミジン、特異的活性6.7μCi/モルを各ウェルに添加し、インキュベーションを37℃でさらに4時間継続した。 After 18 hours of incubation at 37 ° C., was added 3 H- thymidine 0.25MyuCi, specific activity 6.7MyuCi / mol to each well and further continued for 4 hours incubation at 37 ° C.. プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、4℃にて10%トリクロロ酢酸(TCA)0.5mlで15分間固定した。 The plates were rinsed with phosphate buffered saline (PBS), fixed for 15 min at 4 ° C. with 10% trichloroacetic acid (TCA) 0.5 ml. TCAを除去し、プレートをPBSですすぎ、酸沈殿物質を室温にて0.5ml/ウェルの0.1N水酸化ナトリウムで1時間可溶化させた。 To remove TCA, plates were rinsed with PBS, and 1 hour solubilized acid precipitated material with 0.1N sodium hydroxide 0.5 ml / well at room temperature. 試料をシンチレーションバイアルに移し、10mlのシンチレーション流体(New England Nyclear, AquasureTM)をバイアル当たりに添加した。 The samples were transferred to scintillation vials, scintillation fluid (New England Nyclear, AquasureTM) of 10ml was added per vial.
図2に示す結果は、トロンビンおよびヘパリンの存在下でインキュベートしたHBGF−1がその生物学的活性を保持したことを示した。 The results shown in Figure 2, showed that HBGF-1 was incubated in the presence of thrombin and heparin was retained its biological activity. チミジン取込の観察された濃度依存性は、インキュベーション時間とは無関係で、成長因子濃度の関数としての細胞の増殖の依存性につき予測されたものに典型的なものであった。 The observed concentration dependence of thymidine uptake is independent of the incubation time, it was typical of that predicted per-dependent cells as a function of growth factor concentration growth. 成長因子は、典型的には、細胞増殖が最大となる最適濃度を示す。 Growth factors typically exhibit an optimal concentration at which cell growth is maximized.
内皮細胞増殖を観察することによって、トロンビンおよびヘパリンの存在下におけるHBGF−1の生物学的活性も測定した。 By observing endothelial cell proliferation, biological activity of HBGF-1 in the presence of thrombin and heparin was also measured. ペトリ皿の表面にHBGF−1補足FGを含浸させた。 On the surface of the Petri dishes were impregnated with HBGF-1 supplemented FG. 内皮細胞の狭い層を添加し、細胞の数を測定した。 It was added narrow endothelial cells layer, to determine the number of cells. 時間が経つと、細胞数は増加した。 Over time, the number of cells was increased. 加えて、細胞は血管へと組織されるようであった。 In addition, the cells appeared to be organized into a blood vessel.
従って、HBGF−1は、トロンビンの分解活性からHBGF−1を保護し、成長因子補足FG中でHBGF−1の生物学的活性を促進もし得るヘパリンを含むFGにおいてその生物学的活性を保持する。 Therefore, HBGF-1 is a HBGF-1 from degradation activity of thrombin were protected, retain their biological activity in FG that includes heparin obtained growth factor supplemented FG If promoting HBGF-1 biological activity in .
実施例4 Example 4
FG血餅からのHBGF−1の拡散10U/mlヘパリンおよびトロンビンを含有するフィブリノーゲン複合体0.3mlおよび40mM CaCl・を混合することによってFG血餅を5mlプラスチック試験管中に形成させた。 The FG clot was formed in 5ml plastic test tubes by mixing the fibrinogen complex 0.3ml and 40 mM CaCl · containing diffusion 10 U / ml heparin and thrombin HBGF-1 from the FG clot. 4本の試験管を以下のごとくに設定した。 Four test tubes were set as follows.
(A)0.5U/mlトロンビンおよび10μg/ml HBGF−1; (A) 0.5U / ml thrombin and 10μg / ml HBGF-1;
(B)0.5U/mlトロンビンおよび50μg/ml HBGF−1; (B) 0.5U / ml thrombin and 50μg / ml HBGF-1;
(C)5U/mlトロンビンおよび10μg/ml HBGF−1;および(D)5U/mlトロンビンおよび50μg/ml HBGF−1 (C) 5U / ml thrombin and 10μg / ml HBGF-1; and (D) 5U / ml thrombin and 50μg / ml HBGF-1
各血餅を0.2Mヒスチジン緩衝液、pH7.3で覆った。 0.2M histidine buffer Kakuchimochi, covered with pH7.3. 重層する緩衝液の30μl試料を各試験管から2時間毎に取り出し、ウェスタンブロットで泳動させた。 Removed 30μl sample buffer layer from each tube every two hours, was run on Western blots.
実験結果は、血餅からのHBGF−1拡散は、時間および血餅中のその濃度の関数であって、血餅中のトロンビンの濃度はHBGF−1が血餅から放出される速度に影響しないことを示した。 Experimental results, HBGF-1 diffusion out of the clot is a function of its concentration time and blood clots, the concentration of thrombin in the clot does not affect the rate at which HBGF-1 is released from the clot It showed that.
実施例5 Example 5
成長因子補足FGにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞の挙動:野生型および突然変異型FGF−1の効果ヒト内皮細胞に対する酸性線維芽細胞成長因子(FGF−1)補足FGのイン・ビトロ効果を調べるために、これらの細胞の懸濁液を、ml当たりほぼ9mgのフィブリノーゲンおよびml当たり0.25NIH単位のトロンビンを含有するFGの2.5mlの均一に塗布した層を含有する10cm直径ペトリ皿に添加した。 Behavior of Human Umbilical Vein Endothelial Cells in Growth Factor Supplement FG: To examine the in vitro effects of wild-type and acidic fibroblast growth factor for effective human endothelial cells mutant FGF-1 (FGF-1) supplemented FG was added a suspension of these cells in 10cm diameter petri dishes containing layer was uniformly applied in 2.5ml of FG containing thrombin of fibrinogen and ml per 0.25NIH units approximately per ml 9 mg. 該FGを以下にように補足した。 The FG was supplemented as follows.
(A)成長因子無添加; (A) growth factor additive-free;
(B)100ng/mlの活性な野生型FGF−1を補足; (B) 100ng / ml of active complement wild-type FGF-1;
(C)100ng/mlの不活性な突然変異体FGF−1を補足;または(D)10ng/mlの活性な野生型FGF−1を補足FG層に撒いた細胞を、10%胎児ウシ血清(FBS)を含有するDMEM中で7日間維持した。 (C) 100 ng / ml of supplemented inactive mutant FGF-1; or (D) a 10 ng / ml of active, wild-type FGF-1 cells were plated in supplemented FG layer with 10% fetal calf serum ( It was maintained for 7 days in DMEM containing FBS).
細胞は細長くなり、生物学的に活性なFGF−1を補足したFGと接触された場合に効果的に増殖した(図3および4)。 Cells become elongated, and effectively proliferation when contacted with FG supplemented with biologically active FGF-1 (Figures 3 and 4). 非補足FGと接触させた場合(図5)、生物学的に不活性な突然変異体FGF−1を補足したFGと接触させた場合(図6)、細胞は細長くなったが比較的ゆっくりと増殖した。 When in contact with unsupplemented FG (Figure 5), when contacted with FG supplemented with biologically inactive mutant FGF-1 (Figure 6), the cells became elongated but relatively slowly It was grown.
実施例6 Example 6
FGF−1補足FG中のヒト臍帯静脈内皮細胞の挙動それらの増殖を比べるために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(ml当たり10 5またはそれ以上)を、その蛋白質濃度が4mg/mlであるFGに埋め込んだ。 To compare the behavior growth of their human umbilical vein endothelial cells in FGF-1 supplemented FG, human umbilical vein endothelial cells (10 5 or more per ml), the protein concentration is embedded in FG is 4 mg / ml I. FG中のトロンビンの濃度は0.6NIH U/mlに調整した。 The concentration of thrombin in the FG was adjusted to 0.6NIH U / ml. 全ての実験で使用した培地は、10%胎児ウシ血清、10μg/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン、1ng/mlFGF−1および10U/mlヘパリンを補足したM199(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)であった。 The medium used in all experiments, 10% fetal bovine serum, 10 [mu] g / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin, M199 supplemented with 1ng / mlFGF-1 and 10 U / ml heparin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO )Met.
FG中での24時間内に、細胞は細長く、多足状態になり、相互に接触するようになると細胞ネットワークを形成した(図7)。 Within 24 hours of in FG, the cell is elongated and become multi-legged state, to form comes to cellular networks into contact with each other (Figure 7). この増殖は少なくとも5日間継続した。 This growth was continued for at least 5 days. 図8は、48時間におけるこの状況を示す。 Figure 8 shows this situation at 48 hours.
対照として、同一の細胞懸濁液を10μg/cm 3のフィブロネクチンで被覆した表面で培養した。 As a control, the same cell suspension were cultured in the surface coated with fibronectin 10 [mu] g / cm 3. 対照細胞は丸石形状を獲得し、この形態を少なくとも5日間維持した。 Control cells acquired cobbles shape and maintain this form for at least 5 days. 図9および10は、各々、24時間および49時間におけるこの状況を示す。 9 and 10, respectively, show this situation at 24 hours and 49 hours.
実施例7 Example 7
FG中のPMEXNEO−3T3−2.2細胞の挙動PMEXNEO−3T3−2.2細胞は、遺伝工学により作製した蛋白質を発現する能力を有する修飾ゲノムを含む線維芽細胞である(Foroughら,J. Biol. Chem. 268:2960-2968(1993))。 Behavior PMEXNEO-3T3-2.2 cells PMEXNEO-3T3-2.2 cells in FG are fibroblast cells that contain a modified genome with the ability to express a protein produced by genetic engineering (Forough et, J. .. Biol Chem 268: 2960-2968 (1993)). FGにおけるこれらの細胞の挙動を測定するために、ウェル当たり10 5細胞を3つの条件下(1)FGに埋め込む;(2)FGの表面上;および(3)FGの不存在下(対照)で培養した。 To measure the behavior of these cells in FG, embed 10 5 cells per well three conditions (1) to FG; (2) on the surface of FG; and (3) the absence of FG (controls) in the culture. 実験は、10%FBSを補足したDMEM培地(Sigma Chemical Co., StるLouis,MO)中、24−ウェルにて二連で行った。 Experiments, DMEM medium supplemented with 10% FBS (Sigma Chemical Co., St Ru Louis, MO) in was performed in duplicate in 24-well. FG蛋白質濃度は4mg/mlであった。 FG protein concentration was 4 mg / ml. 同一の実験において、培地を1.5FBSで補足し、陰性対照として使用した。 In the same experiment, the media is supplemented with 1.5FBS, was used as a negative control.
10%FBSを補足した培地の存在下において、全ての3群の細胞は増殖し、密集した。 In the presence of media supplemented with 10% FBS, all three groups of cells proliferate, dense. 培地に1.5FBSを補足した陰性対照実験において、細胞は増殖し、FGの存在下では少なくとも5日間生存したが、それなしでは生存しなかった。 In a medium negative control experiments supplemented with 1.5FBS, the cells proliferate, but survived at least five days in the presence of FG, it did not survive without it. しかしながら、それらの増殖は、1.5%FBSを補足したそれにおけるよりも、10%FBSを補足したFGでより速かった。 However, their growth, rather than in it supplemented with 1.5% FBS, was faster in FG supplemented with 10% FBS. FGの不存在下では、1.5%FBSを補足した培地では、細胞は38時間内に死滅した。 In the absence of FG, in the media supplemented with 1.5% FBS, cells died within 38 hours. 生存の基準は、10%FBSを補足した新鮮な培地への移行に際して、増殖するテスト細胞の能力である。 Criteria for survival, upon transition to fresh medium supplemented with 10% FBS, is the ability of a test cell to proliferate.
実施例8 Example 8
HBGF−1予備処理による発泡PTFE血管移植体の内皮形成2の実験は、内皮細胞(EC)での、血液含有生体材料の予備処理は内皮形成を増強したことを示した。 Experimental endothelialization 2 of expanded PTFE vascular graft by HBGF-1 Pretreatment is on endothelial cells (EC), pretreatment of blood-containing biological material showed that enhanced endothelialization. 最初の実験では、ウサギ大動脈に移植した発泡PTFE移植体に適用されたHBGF−1補足FGのイン・ビボでの流出特性を調べた。 In the first experiment to investigate the outflow characteristics in vivo of HBGF-1 supplemented FG applied to expanded PTFE grafts implanted into rabbit aortas. 第2の実験では、同様の移植体をイヌの回腸大動脈位置に移植した。 In the second experiment, were implanted similar graft ileum aortic position dog. HBGF−1(血管形成因子)を実験で用いた。 HBGF-1 (the angiogenic factor) used in the experiment. FGF、FGF−4および/またはOP−1のごとき他の成長因子も血管移植片のための補足物(類)として使用した。 FGF, was used as the FGF-4 and / or supplement for other growth factors also vascular grafts, such as OP-1 (s).
A. A. 流出実験一般に、修飾したFGは、ヒト組換え125 I−HBGF−1のほぼ1ng/cm 2面積の内方および外方移植片表面、20μg/cm 2ブタ腸粘膜ヘパリン、および2.86mg/cm 2フィブリノーゲンを2.86×10 -2 U/cm 2の復元した商業的に入手可能なヒトトロンビン(1000U/ml)に添加して重合を誘導することによって滅菌的に調製した。 The outflow experiment general, modified FG is inner and outer graft surfaces of approximately 1 ng / cm 2 area of human recombinant 125 I-HBGF-1, 20μg / cm 2 porcine intestinal mucosa heparin, and 2.86 mg / cm was prepared aseptically by inducing polymerization was added to the 2 fibrinogen was recovered in 2.86 × 10 -2 U / cm 2 commercially available human thrombin (1000U / ml).
125 I−HBGFは以下のごとくに特異的に調製した。 The 125 I-HBGF was specifically prepared as follows. フィブリノーゲンは、500mgのフィブリノーゲンを25mlのPBSに添加して20mg/mlPBSのフィブリノーゲン濃度を生じることによって復元した。 Fibrinogen was restored by the addition of fibrinogen 500mg of PBS 25ml resulting in fibrinogen concentration of 20 mg / ml PBS. 60mgのフィブリノーゲンを含有する3mlのこの溶液を12のエッペンドルフプラスチック製試験管に入れ、−70℃に維持した。 The solution of 3ml containing 60mg of fibrinogen eppendorf plastic tubes 12, was maintained at -70 ° C.. これらのアリコットの各々を個々に使用した。 Each of these aliquots was used individually.
トロンビンは、1000U/mlの濃度の商業的に入手可能なその調製物(Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL)を1:10の率にて滅菌溶液中に希釈して100U/mlの濃度を生じることによって再構成した。 Thrombin produces a concentration of 100 U / ml by diluting commercially available preparations thereof at a concentration of 1000U / ml (Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL) to sterile solution at a rate of 1:10 It was reconstituted by. このトロンビン溶液を再度1:10希釈して10U/mlの溶液を得た。 To obtain a solution of 10 U / ml of thrombin solution was again diluted 1:10.
ウシヘパリン(Upjohn, Kalamazoo, MI)は、1000U/mlの濃度の調製物を1:1000の率で通常の食塩水を用いて希釈することによって再構成した。 Bovine heparin (Upjohn, Kalamazoo, MI) is a preparation of a concentration of 1000 U / ml 1: 1000 ratio of reconstituted by dilution with normal saline.
1および48/100(1.48)mlの復元したフィブリノーゲン、63μLの復元したヘパリン+15.66μLの125 I−HBGF−1をガラス製シンチレーション試験管中で混合した。 1 and 48/100 (1.48) ml of restored fibrinogen, the 125 I-HBGF-1 in the recovered heparin + 15.66MyuL of 63μL were mixed in a glass scintillation tube. 次いで、この混合物を3mlプラスチック製シリンジに吸引した。 Was then aspirated mixture to 3ml plastic syringes. 5mlの復元したトロンビンをガラス製シンチレーション試験管に入れた。 5ml restored thrombin were now in a glass scintillation tube.
発泡PTFE移植片の一端をプラスチック製三方ストップコックノズル上に置き、2−0絹紐でそこに締め付けた。 One end of the expanded PTFE graft placed in a plastic three-way stopcock on the nozzle, fastened thereto 2-0 silk cord. 次いで、PTFEを3×3cm平方のパラフィルム(Parafilm) TMで巻き、次いで、真っすぐな止血材でそこに圧着して水密シールを確立した。 Then, PTFE winding at 3 × 3 cm square parafilm (Parafilm) TM, then establish a watertight seal and pressed there in straight hemostatic material. 第2の2−0絹紐をストップコックに隣接するパラフィルム上に位置させてもう1つのシールを形成させた。 To form another seal is positioned on the parafilm adjacent the second 2-0 Kinuhimo the stopcock. 次いで、真っすぐな止血材を用いて、PTFE/パラフィルムの末端側2mmを圧着させてこの端部をシールした。 Then, using a straight hemostat was sealed the end by crimping the distal 2mm of the PTFE / parafilm.
等容量の前記したごとくに調製したフィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を混合し、ほぼ30秒間反応させ、その時反応が起こる。 Fibrinogen and thrombin solutions were prepared as described above were mixed in equal volume, by reacting approximately 30 seconds, then the reaction takes place. 次いで、トロンビン重合したフィブリンは不透明である。 Then, fibrin and thrombin polymerization is opaque. (この時間因子は近似値であり、トロンビン間で変化する。重合に対するおよその時間は、混合物の不透明性を観察することによって決定できる。)フィブリン/トロンビン混合物を1ccのシリンジに吸引した。 (This time factor is approximate and varies between thrombin. For the approximate time the polymerization can be determined by observing the opacity of the mixture.) Was aspirated fibrin / thrombin mixture to a 1cc syringe. (注意:この移植片の容量は0.42mlであった。より大きい容量の移植片については、より大きいシリンジを使用する必要がある。)該シリンジをストップコックに取り付け、PTFE間隙を通って液体が「発汗」するように見えるまで混合物を手で5秒間にわたって注入し、PTFEとパラフィルムTMの間の間隙を充填した。 (Note:.. The capacity of the graft for implant was 0.42ml larger capacity, it is necessary to use a larger syringe) attached to the syringe to the stopcock through the PTFE gap liquid There the mixture was poured over 5 seconds by hand until appears to "sweating", was filled the gap between the PTFE and the parafilm TM. 三方ストップコックをPTFE移植片に対して3分間閉じ、メスを用いてストップコック上のPTFEの端部の紐を切断した。 Close 3 minutes with a three-way stopcock to the PTFE graft was cut cord ends of the PTFE on the stopcock using a scalpel. PTFE移植片/パラフィルムをストップコックから外し、止血剤を用いて、PTFEをパラフィルム包みから取り出した。 Remove the PTFE graft / parafilm from stopcock, using hemostats were removed PTFE from parafilm wrap. 残存する成長因子補足FGを移植片管腔から取り除くために、移植片管腔が完全に清掃されるまで、No. To remove growth factor supplement FG remaining from the implant lumen, until the graft lumen was completely clean, No. 3の塞栓摘出用カテーテルを移植片に5回通した。 3 of the embolectomy catheter was passed through five times to the graft. 成長因子補足FGで処理したPTFE移植片を層流フード下で一晩約12時間乾燥させた。 The PTFE graft treated with growth factor supplement FG under a laminar flow hood and allowed to dry overnight for about 12 hours. 処理した移植片を次いで移植用に準備した。 Is then treated grafts were prepared for transplantation.
別法として、このHBGF−補足FGを34mm(24mm+5mm各端部)×4mm(内径)の薄壁発泡PTFE移植片に加圧灌流させ、それにより、移植片管腔表面をコートし、節を通って移植片の外方表面まで延ばした。 Alternatively, the HBGF- supplement FG of 34 mm (24 mm + 5 mm at each end) flowed pressurized 圧灌 the thin wall expanded PTFE graft × 4 mm (internal diameter), thereby coating the graft luminal surface, through the section It was extended to the outer surface of the graft Te. 移植片の管腔を前記したごとく清掃した。 The lumen of the graft was cleaned as above described. 次いで、これらの移植片を24匹の3〜5kgニュージーランド白色ウサギの腎臓下腹部大動脈に挿入した。 It was then inserted these graft renal abdominal aorta Twenty four 3~5kg New Zealand White rabbits. 第1の実験において、動物を犠牲にし、検体を0時間(外科的操作による喪失を修正するためのもの)および5、30および60分、および7、14および30日に外植した。 In the first experiment, the animals were sacrificed, the sample 0 hours (intended to correct the loss by surgical manipulation) and 5,30 and 60 min, and were explanted to 7, 14 and 30 days. 残存する放射能をガンマカウンティングによって測定した。 The radioactivity remaining was determined by gamma counting. 自然崩壊につき修正した残存125 I−HBGF−1は、ゼロ時間値のパーセントとして表す。 Residual 125 I-HBGF-1 was modified per natural decay, expressed as a percentage of the zero time value. 循環の再確立を伴う迅速な初期喪失(%/分=−24.1、5および60分の間)、続いて1時間後のゆっくりとした喪失(%/分=−0.03)、1週間後の13.4%±6.9%残存、および30日後の3.8%±1.1%残存という古典的動態に続いて125 I−HBGF−1を流出させた。 Rapid initial loss with the reestablishment of circulation (between% / min = -24.1,5 and 60 minutes), followed by slow loss after 1 hr (% / min = -0.03), 1 13.4% ± 6.9% remaining after week, and drained followed by 125 I-HBGF-1 in the classical dynamics of 3.8% ± 1.1% remaining after 30 days.
B. B. イン・ビボ内皮形成実験第2の実験では、適用されたHBGF−1補足FG懸濁液が、イヌ大動脈−腸骨位置に移植したかなり発泡した60μm節間距離の発泡PTFE移植片の内皮形成速度;時間の関数としてのこれらの内皮細胞の増殖活性;および観察された内皮細胞増殖の刺激におけるHBGF−1およびFGの相対的寄与に対する効果を評価した。 In vivo endothelialization experiment second experiment, the applied HBGF-1 supplemented FG suspension, dog aorta - endothelialization rate of expanded PTFE grafts distance considerably implanted in iliac position foamed 60μm clause ; to evaluate the effect on the relative contributions of HBGF-1 and FG in and observed stimulation of endothelial cell proliferation; the endothelial cell proliferation activity as a function of time. 50×4mm非補強発泡PTFE移植片の3群を12匹のイヌの大動脈腸骨位置に移植した。 Three groups of 50 × 4 mm non-reinforced expanded PTFE grafts were implanted in the aorta iliac position of 12 dogs. 群1(n=6)は20μg/cm 2ヘパリン、2.86mg/cm 2フィブリノーゲンおよび2.86×10 -2 U/cm 2のヒトトロンビン+1ng/cm 2のHBGF−1を含有するものであった。 Group 1 (n = 6) is a one containing HBGF-1 of 20 [mu] g / cm 2 heparin, 2.86 mg / cm 2 fibrinogen and 2.86 × 10 -2 U / cm 2 human thrombin + 1 ng / cm 2 It was. 群2(n=3)はHBGF−1無しで同FGを含有するものであった。 Group 2 (n = 3) were those containing the same FG without HBGF-1. トリチウム化チミジン( 3 H−TdR;0.5μCi/kg)を外植の10時間前に注入した。 Tritiated thymidine (3 H-TdR; 0.5μCi / kg) was injected into 10 hour explanted before. 光学顕微鏡および電子顕微鏡、第VIII因子免疫組織化学、ランダム高出力場における内皮細胞増殖についてのen faceオートラジオグラフィー用に移植片を7および28日に外植した。 Optical and electron microscopy to explanted graft 7 and 28 days Factor VIII immunohistochemistry, for en face autoradiography for endothelial cell proliferation in random high power fields. いずれの処理群から移植片が由来するかを知らない3人の観察者によって各移植片を観察した。 Was observed each graft by 3 observers graft does not know whether derived from any of the treatment groups. 内皮細胞増殖における差異を両側ANOVAおよび独立t検定によって統計学的に解析した。 Differences in endothelial cell proliferation were statistically analyzed by two-way ANOVA and independent t-test.
第7日において、FGおよびHBGF−1補足FG移植片は共に内皮細胞の非接触フォーカスを示した(図11)。 In a seventh day, FG and HBGF-1 supplemented FG grafts both showed a contactless focus of endothelial cells (Figure 11). 最小移植片の表面はフィブリン凝塊を残した。 The surface of the minimum graft left the fibrin clot. 第28日において、各HBGF−1補足FGはかなりの毛細血管の内部増殖および密集内皮形成血液接触表面を示し、これは他の2群のいずれの検体にも観察されなかった(図11および12)。 In the 28 days, the HBGF-1 supplemented FG showed ingrowth and confluent endothelialization blood contacting surface of the considerable capillary, which was not observed in any samples of the other two groups (11 and 12 ). 図12は、第28日における未処理移植片はそれらの表面に目視できる内皮細胞をほとんど有しなかったことを示す(パネルG)。 Figure 12 is the untreated grafts in day 28 indicating that had no endothelial cells visible on their surface most (Panel G). FG単独で処理した移植片は内皮細胞で被覆された約33%のその表面を有し、これは、FG処理単独がいくらかの再内皮形成を刺激したことを示す(パネルH)。 FG alone treated grafts has its surface of about 33% covered with endothelial cells, which indicates that FG treatment alone stimulated some reendothelialization (Panel H). しかしながら、HBGF−1を補足したFGで処理した移植片(パネルI)は、内皮細胞の特徴的な丸石形態を示す内皮細胞で完全に(>95%)覆われているように見えた。 However, grafts treated with FG supplemented with HBGF-1 (Panel I) appeared to have been completely covered (> 95%) in the endothelial cells showing characteristic cobblestone endothelial cell morphology. かくして、FGによって送達された成長因子の組合せは、非トロンボゲン形成性内皮細胞ライニングでの血管移植片の実質的に完全な被覆を刺激できた。 Thus, the combination of growth factors delivered by FG ​​was able to stimulate the substantially complete coverage of the vascular graft with a non-thrombogenic endothelial cell lining. エンファス(en face)オートラジオグラフィーは、28日でのHBGF−1補足FG移植片における内皮細胞のDNAの3 H−TdR取込の統計学的に有意な増加(p<0.05)を明らかとした。 Enfasu (en face) Autoradiography revealed 3 H-TdR statistically significant increase in the uptake of DNA of endothelial cells in HBGF-1 supplemented FG grafts at 28 days (p <0.05) and the. 他方、全ての他の群では、時間および移植片処理の関数であった。 On the other hand, in all other groups, it was a function of time and graft processing.
これらのデータは、60μ節間距離の発泡PTFE移植片へのHBGF−1−補足FG懸濁液の加圧灌流は、毛細血管内部増殖および増大した内皮細胞増殖を介する内皮形成を促進することを示した。 These data, pressurizing 圧灌 flow HBGF-1-supplemented FG suspension into expanded PTFE grafts distance between 60μ clause, to promote endothelialization via capillary ingrowth and increased endothelial cell proliferation Indicated.
これらの実験は、小径血管移植片の増強された自然発生再内皮形成、および移植された内皮細胞のより迅速な密集を刺激する方法を示す。 These experiments show a method of stimulating enhanced spontaneous re-endothelialization of small diameter vascular grafts, and a more rapid confluence of transplanted endothelial cells.
実施例9 Example 9
FGで使用するための血小板由来抽出物の調製血漿由来血小板を調製し、ペレット化した。 Preparation plasma-derived platelet-platelet-derived extract for use in the FG was prepared and pelletized. 上清血漿を除去した。 And the supernatant was removed plasma. ペレット化血小板を洗浄し、pH6.5の50mMヒスチジンおよび0.15M塩化ナトリウムを含有する緩衝液に懸濁させ、ウシトロンビンで処理した。 Pelleted platelets were washed, suspended in buffer containing 50mM histidine and 0.15M sodium chloride pH 6.5, and treated with bovine thrombin. 処理後、上清を遠心によって収集し、アリコットを−80℃で凍結した。 After treatment, the supernatant was collected by centrifugation and frozen aliquots at -80 ° C.. 抽出物を解凍し、FGまたは他のTS類と混合した。 The extract was thawed and mixed with FG or other TS class.
このようにして得た血小板抽出物は、対照と比較して、増殖するNIH 3T3線維芽細胞のDNAへの放射性標識チミジンの取込を増加させるので生物学的に活性であった。 Such platelet extract thus obtained is, compared to the control because it increases the uptake of radiolabeled thymidine into DNA of NIH 3T3 fibroblasts to proliferate a biologically active.
創傷治癒に対する血小板抽出物の効果を評価するために、HBGF−1βにて後記実施例10で行ったものと同一の実験を糖尿病マウスにおける血小板抽出物で行った。 To evaluate the effect of platelet extract on wound healing was performed the same experiments as those conducted in Examples below 10 platelet extract in diabetic mice by HBGF-l [beta]. これらの実験の結果から、血小板抽出物における成長因子が低濃度であれば、創傷当たり血小板抽出物蛋白質の100μgより大きい用量が創傷治癒を促進するのに必要であることが明らかである。 The results of these experiments, if the growth factor is low concentration in the platelet extract, it is clear that 100μg larger doses of the wound per platelet extract protein is needed to promote wound healing.
実施例10 Example 10
イン・ビボにおける皮膚創傷治癒に対するFGの効果材料および方法A. Effect Materials and Methods of FG to the skin wound healing in vivo A. 非補足FGH Unsupplemented FGH
動物雌C57BL/K s J−db/dbマウスをジャクソン・ラバラトリーズ(Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME))から入手し、それらは実験の開始時に8ないし12週齢であった。 Animals Female C57BL / K s J-db / db mice Jackson Rabaratorizu (Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME )) were obtained from, they were 12 weeks of age 8 to at the start of the experiment. それらを動物医療施設での外科的処置の後にケージに収容した。 They were housed in cages after surgery in an animal healthcare facility.
これらのマウスで観察された代謝異常性はヒト糖尿病で見い出されるものに類似しているので、これらのマウスを糖尿病ヒトにおける損傷創傷治癒のモデルとして使用した。 Since the metabolic abnormalities that are observed in these mice are similar to those found in human diabetics, using these mice as a model of injury wound healing in diabetic humans. 加えて、顕著に遅延した細胞浸潤、顆粒組織形成、および創傷癒合に要する時間によって特徴付けられる損傷の治癒は、これらのマウスモデルにおける治癒はヒト糖尿病で観察される損傷治癒に関連し得ることを示唆する。 In addition, significantly delayed cellular infiltration, granulation tissue formation, and the healing of injuries characterized by the time required for wound healing is healing in these mice models that may be associated with wound healing observed in human diabetes It suggests.
フィブリングルー(接着剤) Fibrin glue (adhesive)
この実験で用いた濃縮された局所フィブリノーゲン複合体(TFC)は新鮮な凍結しプールしたヒト血漿から得た。 Concentrated locally fibrinogen complex used in this experiment (TFC) was obtained from human plasma, fresh frozen pooled. TFC産物(米国赤十字-Baxter Hyland Division, Los Angeles, CA)を凍結乾燥形態で供給した。 TFC product (American Red Cross -Baxter Hyland Division, Los Angeles, CA) was supplied in lyophilized form and. 3.3mlの滅菌水での再構成後、本実験で用いたTFC溶液の蛋白質特性は以下のごとくであった:全蛋白質120mg/ml;フィブリノーゲン90mg/ml;フィブロネクチン13.5mg/ml;第XIII因子17U/ml;およびプラスミノーゲン2.2μg/ml。 After reconstitution with sterile water 3.3 ml, protein characteristics of TFC solution used in this experiment were as follows: total protein 120 mg / ml; Fibrinogen 90 mg / ml; fibronectin 13.5 mg / ml; XIII, factor 17U / ml; and plasminogen 2.2μg / ml.
局所用ウシトロンビン(5000単位バイアル、Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL)を5mlの滅菌水で復元し、80mM塩化カルシウム溶液(American Reagent Laboratories, Shirley, NY)中の滅菌的に希釈して15U/mlの濃度とした。 Topical bovine thrombin (5000 units vials, Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL) was reconstituted with sterile water 5 ml, 80 mM calcium chloride solution (American Reagent Laboratories, Shirley, NY) 15U sterilized diluted in / to a concentration of ml.
等容量のTFCおよび復元したトロンビンを混合してFGを得た。 To obtain a FG by mixing TFC and reconstituted thrombin equal volume. 丸い6mm直径の十分な厚さの創傷を満たすために、0.015mlのTFCを0.015mlのトロンビンと混合した。 To meet the sufficient thickness of the wound round 6mm diameter, it was mixed TFC of 0.015 ml thrombin of 0.015 ml. 生成されたFGはほぼ60mg/mlの蛋白質濃度を有していた。 The generated FG had a protein concentration of approximately 60 mg / ml.
ほぼ1mg/mlの蛋白質濃度の希釈FGも用いた。 Diluted FG protein concentration of approximately 1mg / ml was also used.
外科的処置7mlケタミン塩酸塩(100mg/ml;Ketaset, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA)、3mlキシラジン(20mg/ml;Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KA)、および20生理食塩水からなる混合物を、100g体重当たり0.1mlの用量にて筋肉内投与してマウスを麻酔した。 Surgery 7ml ketamine hydrochloride (100mg / ml; Ketaset, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA), 3ml xylazine (20mg / ml; Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KA), and 20 saline the mixture consisting, mice were anesthetized by intramuscular administration at a dose of 100g of body weight per 0.1 ml. 背面毛髪を刈り、皮膚をポビドン−ヨウ素溶液で洗浄し、70%アルコール溶液で拭いた。 Cutting the back hair, skin Povidone - washed with iodine solution and wiped with 70% alcohol solution. 2の十分な厚みの丸い外科的創傷(6mm直径)を、中央線から等距離にて各片側に1つ、マウスの低部背中に作成した。 2 of sufficient thickness round surgical wounds (6mm diameter), one on each side from the center line at the same distance, created lower part backs of mice. 2の創傷の中央エッジを少なくとも1.5cmの非創傷皮膚の縁によって分けた。 A central edge of the second wound was divided by unwounded edge of the skin of at least 1.5 cm.
創傷を行った直後に、FGおよび/または包帯剤を示した創傷上に置いた。 Immediately after the wound, it was placed on a wound showing the FG and / or dressing. 包帯剤は透明な半浸透性接着剤ポリウレタン包帯剤(オプサイト(Opsite) TM , Smith and Nephew, Massillon, OH)であった。 Dressing transparent semi-permeable adhesive polyurethane dressing (optional site (Opsite) TM, Smith and Nephew , Massillon, OH) was. ベンゾイン化合物のチンキ剤(Paddock Laboratories, Minneapolis, MN)を包帯剤の適用に先立って創傷領域の周辺に適用した。 Tincture of benzoin compound (Paddock Laboratories, Minneapolis, MN) was applied to the periphery of the wound area prior to application of the dressing. 創傷エッジを囲む0.5cmの皮膚の余白があり、その上にはベンゾインのチンキ剤は適用せず、生創傷に対するベンゾインの可能な炎症効果を回避した。 A gutter skin 0.5cm surrounding the wound edge, is on its tincture benzoin does not apply, to avoid possible inflammatory effects of benzoin on viable wound. 実験の間に該創傷にはさらに処置を適用しなかった。 It was not further apply the treatment to the wound during the experiment.
処理群マウスを4の処理群に分け、各マウスをそれ自体の対照として供した。 Divided treated group mice in the 4 treatment groups, were subjected to each mouse as its own control.
群I:動物の一方側の創傷をFG(60mg/ml)で処理し、他方、対側性創傷には処理を施さなかった。 Group I: one side of the wound of animals was treated with FG (60mg / ml), while the contralateral wound was not subjected to treatment. 両創傷をオプサイトTMで覆った。 It covered both wound in the option site TM.
群II:希釈したFG(1.0mg/ml)を一方側の創傷に局所適用し、他方、対側性創傷には処理を施さなかった。 Group II: topically applied to the wound of the diluted FG (1.0mg / ml) to one side, while on the contralateral wound was not subjected to treatment. 両創傷をオプサイトTMで覆った。 It covered both wound in the option site TM.
群III:FG(60mg/ml)を両創傷上に局所適用した。 Group III: was applied topically FG to (60 mg / ml) on both wounds. 一方側の創傷を覆わなくて、他方、対側性創傷はオプサイトTMで覆った。 Meanwhile not cover the side of the wound, while contralateral wounds were covered with Opsite TM.
群VI:創傷には局所処理を適用しなかった。 Group VI: The wound was not applied topically process. 動物の一方側の創傷は覆わず、他方、対側性創傷はオプサイトTMで覆った。 One side of the wound of an animal is not covered, while contralateral wounds were covered with Opsite TM.
創傷分析動物を実験の第9日に安楽死させた。 Wound Analysis Animals were euthanized on day 9 experiments. 創傷を、非創傷皮膚の0.5mm縁を含めて、筋肉層まで切除し、緩衝化した10%ホルマリン溶液に入れた。 The wounds, including 0.5mm edge of unwounded skin, excised to the muscle layer, were placed in 10% formalin solution buffered. 検体を加工のために組織学研究所に提出した。 It was submitted to the histology laboratory for the specimen processing. 検体をパラフィンに埋め込み、創傷の中央部分を5μm切片に切断した。 Embedded specimen in paraffin, and cut the central portion of the wound to 5μm sections. 組織学分析のためにスライドをヘマトキシリンおよびエオシン、またはマッソンの三色で染色した。 The slides for histological analysis and stained with three colors of hematoxylin and eosin or Masson.
各スライドに、1ないし15の範囲の組織学的スコアを与え、1は治癒無しに対応し、15は組織化されたコラーゲンファイバーを持つ瘢痕に対応する(表1)。 Each slide, one to give the histological score ranging from 15, 1 corresponds to no healing, 15 corresponds to a scar with collagen fibers organized (Table 1). スコアリング尺度は、従前の研究者が使用した尺度に基づくものであった。 Scoring scale, was based on a measure that previous researchers have used. 従前に使用された基準を修飾し、再上皮形成の程度、細胞侵入の程度、顆粒組織形成、コラーゲン沈着、血管分布、および創傷収縮をより正確に反映するように定義した。 Modifying the criteria used previously, the extent of reepithelialization, degree of cellular invasion, granulation tissue formation, collagen deposition, vascularity, and were defined to more accurately reflect the wound contraction. 少なくとも3種の分析によって組織学的スコアを別々に割り当てた。 Histological scores by at least three analyzes were assigned separately. 創傷処理を記載する規則は全ての観察者によってスコアリングが完全に完了した後に破棄した。 Rules to describe the wound treatment was discarded after the scoring was completed entirely by all observers.
統計学的解析分析者の組織学的スコアの値を平均し、平均値±平均標準誤差として表した。 Averaging the values ​​of the histological scores of statistical analysis analyst were expressed as mean ± standard error of the mean.
異なる処理群における対平均の比較のために対t−検定を用いた。 Using pairs t- test for comparison to average the different treatment groups. 解析は、RS/1 Release 3.0統計学ソウトウェアパッケージ(BBN Software Products Corporation)を用いて行った。 Analysis was performed using the RS / 1 Release 3.0 statistical saw Towea package (BBN Software Products Corporation).
試料の平均的相違を、統計学的解析ソフトウエアシステム(Statistical Analysis Software(SAS)System)を用いる偏差解析につきテストした。 The average differences of the samples were tested for deviation analysis using statistical analysis software system (Statistical Analysis Software (SAS) System).
結果創傷閉鎖に対するFGの効果(群I) Results of FG on Wound closure effect (group I)
群Iにおいては、各マウスの両創傷をオプサイトTMで覆った。 In group I, covered both wounds on each mouse Opsite TM. これらの条件下で、60mg/mlの蛋白質濃度を持つFGを動物の一方側のみに局所適用した結果、未処理創傷(5.26)と比較してFG側につき統計学的に低い平均組織学的スコア(3.06)が得られた(P<0.005)(表2)。 Under these conditions, 60 mg / ml results of FG with a protein concentration was topically applied to only one side of the animal, statistically lower mean histological per compared to FG side with untreated wounds (5.26) score (3.06) was obtained (P <0.005) (Table 2).
創傷閉鎖に対する希薄FGの効果(群II) Effect of dilute FG on Wound closure (group II)
この群では、オプサイトTMで覆った双方の対創傷に希薄FG(1mg/mlの蛋白質濃度)を局所適用した結果、未処理創傷のそれ(4.36)と統計学的に異ならない平均組織学的スコア(4.0)が得られた(P=0.17)(表3)。 In this group, option (protein concentration of 1 mg / ml) diluted FG to both pairs wounds covered with sites TM a result of topical application, the average tissue not statistically different from that of the untreated wounds (4.36) histologic score (4.0) was obtained (P = 0.17) (Table 3).
FG−処理創傷に対するオプサイトTMの効果(群III) Opsite TM effect on FG- treatment wounds (group III)
60mg/mlの蛋白質濃度を持つFGで共に処理した対創傷のこの群において、オプサイトTMを片側に適用した結果、覆わないままとした創傷のそれ(4.93)と統計学的に異ならない平均組織学的スコア(4.2)が得られた(P=0.11)(表4)。 In this group of paired wounds treated together with FG with a protein concentration of 60 mg / ml, the results of applying the Opsite TM on one side, it remains the wounds uncovered (4.93) and not statistically different the average histological score (4.2) was obtained (P = 0.11) (Table 4).
対の未処理創傷の閉鎖に対するオプサイトTMの効果(群IV) Opsite TM effect on the closure of the pair of untreated wounds (Group IV)
FGの局所処理を受けなかった対創傷のこの群において、オプサイトTMを片側に適用した結果、覆わなかったままとした創傷のそれ(6.31)と比較して、統計学的に低い平均組織学的スコア(4.92)が得られた(P<0.0005)(表5)。 In this group receiving no pair wound topical treatment of FG, the result of applying the Opsite TM on one side, and compares it with (6.31) in wounds remain not covered statistically lower mean histological score (4.92) was obtained (P <0.0005) (Table 5).
試料平均の相違に対する処理効果のANOVAは<0.0001で有意であった。 ANOVA of the treatment effects on different samples average was significant at <0.0001.
考察この実験の結果は、マウスにおいて、(1)開いた創傷に適用した場合、止血用に処方した濃度(60mg/ml)のFGの結果、未処理創傷のそれと比較して創傷治癒の遅い速度を示すより低い組織学的スコアが第9日に得られ;(2)1mg/mlへのFG蛋白質濃度の希釈の結果、創傷治癒のより速い速度を示すより高い組織学的スコアが第9日に得られ;および(3)半浸透性包帯剤(オプサイトTM )の適用はそれ自体で本動物モデル自体において創傷閉鎖を有意に遅らせたことを示した。 Discussion The results of this experiment in mice (1) when the open and applied to the wound, the result of the FG concentration formulated for hemostasis (60 mg / ml), slow compared to that of untreated wounds of the wound healing rate the obtained lower histological score 9 days from showing; (2) 1mg / result of dilution of the FG protein concentration to ml, high histologic scores than indicating a faster rate of wound healing at day 9 obtained; the application of and (3) a semi-permeable dressing (Opsite TM) showed that significantly delayed wound closure in this animal model itself by itself.
FGの全蛋白質濃度は、FGを用いる実験の結果を比較すると、重要な変数である。 Total protein concentration of FG, when comparing the results of experiments with FG, is an important variable. 創傷治癒および組織修復の促進におけるフィブリンの有利な効果が報告されたが、市販の製剤で通常見い出されるものよりも低い濃度のフィブノーゲンを本実験で用いた。 Beneficial effects of fibrin in promoting wound healing and tissue repair have been reported, were used Fibunogen lower concentrations than those normally found in commercial preparations in this experiment.
60mg/mlの濃度のFGは創傷閉鎖を遅らせた(群I)。 FG at a concentration of 60 mg / ml is delayed wound closure (Group I). フィブリノーゲンおよびトロンビン成分の混合物の後の、欧州で商業的に入手可能なFGの全蛋白質濃度は37.5ないし57.5mg/mlである。 After mixture of the fibrinogen and thrombin components, the total protein concentration of commercially available FG in Europe is 37.5 to 57.5 mg / ml. これらのデータは、止血および接着適応症用に現在処方されているFGは、開いた皮膚創傷に適用した場合に治癒を遅らせることを示す。 These data, FG being formulated currently hemostatic and adhesive indications show that slow healing when applied to open skin wounds. この効果は、(1)創傷治癒過程に能動的に参加する細胞要素の移動または増殖に対する機械的妨害、(2)創傷縮小の機械的阻害または(3)創傷治癒に対する1以上FG成分の化学的阻害効果によるものであろう。 This effect, (1) mechanical obstruction to movement or proliferation of actively participating cellular elements in the wound healing process, (2) chemical of one or more FG components against mechanical inhibition or (3) a wound healing of wounds contraction It may be due to the inhibitory effect. 創傷閉鎖の機械的妨害および阻害はありそうな説明である。 Mechanical interference and inhibition of wound closure are likely explanation. というのは、第9日において、創傷表面に固形のフィブリノーゲンをベースとする血餅の持続があるからである。 Because, since the in 9 days, there is a persistence of the clot based on solid fibrinogen to the wound surface.
これが原因であるかを判断するのを助けるために、FGの全蛋白質濃度を1mg/mlまで希釈した。 This is to help determine the cause was diluted total protein concentration of FG to 1 mg / ml. この希薄FGの局所適用の結果、未処理創傷のそれと有意に異ならない組織学的スコアが得られ(群II)、これは、低全蛋白質濃度は創傷治癒過程を有意に阻害しないことを示唆する。 Result of topical application of this dilute FG, therewith not significantly different histological scores of the untreated wounds was obtained (group II), which is a low total protein concentration suggests that it does not significantly inhibit the wound healing process .
同濃度のFG(60mg/ml)で処理したが異なる処理群(群IおよびIII)に属する覆った創傷についての平均組織学的スコアは有意に異なる値を有した(群Iにつき3.06に対し群IIIにつき4.2)ことも注目に値する。 3.06 per same concentration of FG (60 mg / ml) treated with but different treatment groups average histologic score for covered wounds belonging to (groups I and III) had different values ​​significantly (Group I 4.2) that per against the group III is also worth noting. これらのデータは、動物間のバラツキが、同一処理変数に付した異なる動物から明確な結論を引き出すのを困難とすることを示す。 These data indicate that the variation between animals, and difficult to draw definite conclusions from different animals subjected to the same process variables. 何故ならば、いくつかの動物は同一処理を受けたにも拘わらず他の動物よりも速いまたは遅いかる知れないからである。 This is because, some of the animals is because it may fast or slow mow than other animals despite receiving the same treatment. これは平均スコアについての標準誤差の範囲に反映されている。 This is reflected in the range of the standard error of the average score. この理由で、各動物はそれ自体の対照として供し、例えば、同一動物における創傷を相互に比較した。 For this reason, each animal was subjected as its own control, for example, to compare the wound in the same animal from each other. テスト創傷として同一動物において対照創傷を有することによって、動物間の変動の効果は最小化された。 By having the control wounds in the same animal as the test wounds, the effects of variation between animals were minimized. また、これらのデータは、オプサイトTMのごとき接着性包帯剤は創傷閉鎖を有意に遅らせたことを示す。 These data also indicate that the adhesive dressing such as Opsite TM indicates that significantly delayed wound closure. しかしながら、ブタでの部分的厚みの皮膚創傷において、FGの蛋白質濃度は創傷治癒の速度に関係しないようであることに注意すべきである。 However, in skin wounds partial thickness in pigs, protein concentration of FG is to be noted that it is not related to the rate of wound healing.
B. B. イン・ビトロにおける創傷治癒に対する成長因子補足FG Growth factor supplement to wound healing in vitro FG
糖尿病マウスにおける創傷修復速度に対するHBGF−1β成長因子補足FGの効果を評価した。 To evaluate the effect of HBGF-l [beta] growth factor supplement FG on Wound repair rate in diabetic mice. 本実験で用いた方法は、前記したものと丁度同様である。 The method used in this experiment is just same as those described above. 6匹のテストマウスの背面部分の2の6mmの十分な厚みの皮膚バイオプシーに、5μgのHBGF−1βを添加したFGを充填した。 A sufficient thickness of the skin biopsies of two 6mm rear portion of the six test mice were filled with FG supplemented with HBGF-l [beta] of 5 [mu] g. 6匹のマウスにおける同一バイオプシーを未処理のままとし、6匹の対照マウスにおいて、非補足FGを充填した。 Left untreated the same biopsy in 6 mice at 6 control mice were filled with unsupplemented FG. 9日後、全てのマウスを犠牲にし、各創傷からの5ミクロン厚みのスライスおよび周囲の皮膚の組織学的調製物を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 After 9 days, at the expense of all mice, histological preparations skin slices and surrounding 5 microns thick from each wound were prepared and stained with hematoxylin and eosin. それが由来する処理群に関して同一ではなかった各試料における創傷修復の程度を、コラーゲン沈着、再上皮形成、顆粒組織の厚みおよび炎症細胞、線維芽細胞および毛細血管の密度を評価した3人の訓練された各分析家が「盲検」により評価した。 The extent of wound repair in each sample was not identical for treated group to which it is derived, collagen deposition, reepithelialization, thickness of the granulation tissue and inflammatory cells, 3 trained evaluating the density of fibroblasts and capillaries each analysis who has been has been evaluated by a "blind". 各動物に、修復無しない完全な修復の範囲の1ないし15のスコアを与えた。 Each animal was given a 1 to 15 score ranging from repair without no complete repair. 非補足FGで処理した創傷からの試料は矛盾なく最低のスコアを与え、未処理創傷または成長因子補足FGで処理した創傷からのものは最高のスコアを与えた。 Samples from wounds treated with unsupplemented FG gives the lowest score consistently, those from the treated wounds untreated wound or growth factor supplemented FG gave the highest score.
実施例11 Example 11
イン・ビボにおける骨誘導性物質の送達ビヒクルとしてのFG FG as a delivery vehicle of the bone-inducing agent in vivo
材料および方法フィブリンシーラント米国赤十字用に、スクリーニングした新鮮で凍結しプールしたヒト血漿から、濃縮されたヒトTFC(Baxter Hyland Division, San Pedro, CA)およびヒトトロンビン(Baxter Hyland Division, Glendale, CA)を製造した。 Materials and methods for fibrin sealant American Red Cross, from fresh and frozen pooled human plasma screened, human TFC enriched (Baxter Hyland Division, San Pedro, CA) and human thrombin (Baxter Hyland Division, Glendale, CA) and It was produced. 両成分はその生産の間に溶媒界面活性剤方法(New York Blood Center)を用いてウイルス不活化を受けた。 Both components underwent viral inactivation using the solvent detergent method (New York Blood Center) during their production. 3.3mlの滅菌水での復元の後、TFC溶液の蛋白質特性は以下の通りであった:全蛋白質=120mg/ml;フィブリノーゲン=90mg/ml;フィブロネクチン=13.5mg/ml;第XIII因子=17U/ml;およびプラスミノーゲン=2.2μg/ml。 After restoration of sterile water 3.3 ml, protein characteristics of TFC solution were: total protein = 120 mg / ml; Fibrinogen = 90 mg / ml; fibronectin = 13.5 mg / ml; Factor XIII = 17U / ml; and plasminogen = 2.2μg / ml.
ヒトトロンビン(1000Uバイアル)は3.3ml滅菌水で復元し、40mM塩化カルシウム溶液(American Laboratories, Shirley, NY)中に系列希釈して15U/mlの濃度とした。 Human thrombin (1000 U vial) was reconstituted with 3.3ml sterile water and 40mM calcium chloride solution (American Laboratories, Shirley, NY) and a concentration of 15U / ml and serially diluted into. ヒトトロンビンは、頭蓋冠欠陥に移植されるディスクを調製するのに使用した。 Human thrombin was used for preparing disks implanted into calvarial defects.
局所用ウシトロンビン(5000Uバイアル、Armour Pharmaceutical Co., Kamkakee, IL)は5mlの滅菌水で復元し、40mM塩化カルシウム溶液中に系列希釈して15U/mlの濃度とした。 Topical bovine thrombin (5000 U vial, Armour Pharmaceutical Co., Kamkakee, IL) was reconstituted with sterile water 5 ml, to a concentration of 15U / ml was serially diluted in 40mM calcium chloride solution. ウシトロンビンは筋肉内バイオアッセイ用のインプラントを調製するのに用いた。 Bovine thrombin was used for preparing implants for intramuscular bioassay.
本発明の本態様を実施するにおいて、フィブリノーゲンは1ないし120mg/mlFG、より好ましくは3ないし60mg/mlFG、最も好ましくは10ないし30mg/mlFGの濃度で存在させるべきである。 In carrying out this aspect of the invention, fibrinogen 1 to 120mg / mlFG, more preferably 3 to 60mg / mlFG, it should be most preferably from 10 present at a concentration of 30mg / mlFG. DBMは約1ないし1000mg/mlFG、より好ましくは50ないし500mg/mlFG、最も好ましくは300−500mg/mlFGのおよその濃度で存在させるべきである。 DBM about 1 to 1000mg / mlFG, more preferably 50 to 500mg / mlFG, and most preferably should be present in approximate concentration of 300-500mg / mlFG. 無機質脱落骨粉末の粒子サイズは0.01ないし1000ミクロン、好ましくは20〜500ミクロン、最も好ましくは70〜250ミクロンとすべきである。 Inorganic particle size of shedding bone powder 0.01 to 1000 microns, preferably 20 to 500 microns, and most preferably should be 70 to 250 microns. 骨誘導性成長因子(類)またはBMP類は約1ないし100μg/mlの濃度で存在させるべきであり、ここに、該濃度は所望の目的を達成するのに十分なものである。 Osteoinductive growth factor (s) or BMP class should be present at a concentration of about 1 to 100 [mu] g / ml, here, the concentration is sufficient to achieve the desired purpose. 本態様で骨誘導性物質として使用できる成長因子は、限定されるものではないが、オステオゲニン(BMP3);BMP−2;OP−1;HBGF−1;HBGF−2;BMP 2A、2Bおよび7;FGF−1;FGF−4;およびTGF−βを含む。 Growth factors which can be used as a bone-inducing agent in the present embodiment, but are not limited to, osteogenin (BMP3); BMP-2; OP-1; HBGF-1; HBGF-2; BMP 2A, 2B and 7 ; and a TGF-β; FGF-1; FGF-4. 加えて、抗生物質のごとき薬物類を用いて骨修復で使用するTSを補足することもできる。 In addition, it is also possible to supplement the TS for use in bone repair using such drug class of antibiotics.
移植体調製ラットDBMを以下のごとくに調製した。 Portability physical condition made rat DBM was prepared as follows. ラットの長骨の骨端を取り出し、骨幹のみを後に残した。 Remove the long bone of the epiphysis of the rat, leaving after the diaphysis only. 要すれば、該骨幹を割り、次いで、骨髄を脱イオン水(Milli-Q Water Purification System TM ,ミリポア社(Millipore Corporation, Bedford, MA)で徹底的にフラッシュした。次いで、該骨幹を室温で洗浄した。4℃で、1000mlの脱イオン水を100gの骨に添加した。混合物を30分間撹拌し、水をデカントした。この工程を2時間反復した。 If necessary, dividing the bone stem, then the bone marrow deionized water (Milli-Q Water Purification System TM , Millipore (Millipore Corporation, Bedford, was thoroughly flushed with MA). Then, wash the bone stem at room temperature in the .4 ° C., the deionized water 1000ml were added to the bone of 100 g. the mixture was stirred for 30 minutes, water was decanted. was this step was repeated two hours.
4℃にて、1リットルの冷無水エタノール(Quantum Chemical Coprporation, US1. Division, Tuscola, IL)を100gの骨毎に添加した。 At 4 ° C., it was added one liter of cold absolute ethanol (Quantum Chemical Coprporation, US1. Division, Tuscola, IL) to each bone 100 g. 15分間撹拌した後、エタノールをデカントした。 After stirring for 15 minutes, decanting the ethanol. これを1時間の全持続の間に4回反復した。 This was repeated 4 times during the total duration of 1 hour.
ヒュームフード下で、500mlのジエチルエーテル(Mallinckrodt Speciality Chemicals, Paris, KY)を骨に添加したそれを覆った。 Under a fume hood, covered diethyl ether 500ml (Mallinckrodt Speciality Chemicals, Paris, KY) it which was added to the bone. これを穏やかに15分間撹拌し、次いで、エーテルをデカントした。 This was stirred gently for 15 minutes, then decanted ether. さらに500mlのエーテルを骨に添加し、混合物を15分間撹拌した。 Further ether was added a 500ml the bone, and the mixture was stirred for 15 min. エーテルを再度デカントした。 It was decanted ether again. エーテルの蒸発が起こるように骨をヒュームフード上に放置した。 It was allowed to stand for a bone on the fume hood so that evaporation of the ether occurs. 脱脂骨は極低温フリーザー(−135℃)中に無期限で貯蔵できる。 Degreasing bone can be stored indefinitely in a cryogenic freezer (-135 ° C.).
次いで、該骨を粉砕して骨粉末を得た。 Then, to obtain a bone powder by grinding bone. 該粉末を分級し、74ないし240ミクロンのサイズの粒子を収集した。 And classified the the powder, were collected 240 micron sized particles to no 74.
該骨粉末の10グラムのアリコットを250ml遠心ビンに入れた。 10 grams aliquot of the bone powder were placed in a 250ml centrifuge bottle. 80mlの0.5N HClを各ビンにゆっくりと添加して、泡立ちを回避した。 By the slow addition of 80ml of 0.5 N HCl to each bin, to avoid foaming. 次いで、各ビンの内容物を穏やかに撹拌した。 It was then stirred gently the contents of each bin. 15分後、さらに100mlの0.5N HClを各ビンに10分間にわたって添加した。 After 15 minutes, further 0.5 N HCl in 100ml was added over 10 minutes to each bin. 次いで、該ビンをさらに35分間穏やかに撹拌した。 Then stirred further gently 35 minutes the bottles. 該粉末をHClに入れた合計時間は1時間を超えなかった。 The total time that takes into HCl and the powder did not exceed one hour.
次いで、各混合物を4℃にて、3000rpmの遠心機で15分間回転させた。 Then, in each mixture 4 ° C., and rotated for 15 minutes at 3000rpm in a centrifuge. 次いで、上清のpHをチェックした。 Then, check the pH of the supernatant. もしpHが2を超えると、ペレットを乱すことなく、上清を化学品の流しに注いだ。 If the pH is more than 2, without disturbing the pellet, poured supernatant flowed chemicals. もし上清のpHが2未満であると、上清を有害廃棄物容器に注いだ。 If the pH of the supernatant is less than 2, it poured into hazardous waste container supernatant. もしペレットがゆるくなると、遠心時間を30分に増やした。 If the pellet is loose, increasing the centrifugation time to 30 minutes. これらの工程は上清のpHが0.5N HClと等しくなるまで反復した。 These steps pH of the supernatant was repeated until equal to 0.5 N HCl.
次いで、撹拌することによってペレットを180mlの脱イオン水で洗浄して、均一な懸濁液を得た。 Then, the pellet was washed with deionized water 180ml by stirring to obtain a homogeneous suspension. 次いで、該懸濁液をさらに15分間遠心した。 Followed by centrifugation for a further 15 minutes the suspension. 次いで、上清を前記のような捨てた。 Then, the supernatant was discarded as described above. 洗浄は上清のpHが脱イオン水のpHと等しくなるまで反復した。 Washing was repeated until the pH of the supernatant equals the pH of the deionized water.
次いで、ペレットをフリーザー中、−180℃で凍結した。 Then, in a freezer and the pellet was frozen at -180 ° C.. 次いで、それらを標準的手法を用いて凍結乾燥した。 Then they were freeze-dried using standard techniques.
厚み1mmで直径8mmのディスク形状移植体を4−ピースアルミニウムモールド(図13)を用いて作製した。 It was prepared using a thickness 1mm disk shaped implant with a diameter of 8 mm 4-piece aluminum mold (Figure 13). 25mgのラットDBM粉末をモールドチャンバーに添加した。 Rats DBM powder 25mg were added to the mold chamber. 次いで、30μlのTFCをピペットでDBMに加え、DBMが全ての溶液を吸収してしまうまで混合した。 Then added to the DBM of 30μl of TFC pipetted and mixed until DBM will absorb all of the solution. 使用したTFCの濃度は10、20、40、80または120mg/mlであった。 The concentration of TFC used was 10,20,40,80 or 120 mg / ml. 次いで、30μlのトロンビン溶液(40mM塩化カルシウム溶液中15U/ml)をDBM−TFC複合体に添加し、混合し、ピストン形状の蓋を用いて圧縮してディスク形状とした。 Then added 30μl of thrombin solution (40 mM calcium chloride solution 15U / ml) in the DBM-TFC complex, mixed and the disk-shaped and compressed by using a lid of the piston shape. 25mgのDBM粉末は20μlの容量を有すると判断された。 DBM powder 25mg was judged to have a 20μl volume. DBMをFGに添加した後、最終蛋白質濃度は以下のようになった。 After addition of DBM in FG, the final protein concentration were as follows.
DBM単独またはFG単独(4、8、15および45mg/ml全蛋白質濃度)からなるディスク移植体を同様に同一モールドを用いて作製した。 To prepare a disc implant consisting of DBM alone or FG alone (4,8,15 and 45 mg / ml total protein concentration) using the same mold as well.
50mgのDBMをアルミニウムモールドに注ぎ、次いで、60μlのTFCを該DBMに添加し、十分に吸収されるまで混合した。 The 50mg of DBM was poured into an aluminum mold, then added TFC of 60μl in the DBM, and mixed until fully absorbed. 次いで、60μlのトロンビンをDBM−TFC複合体に添加し、混合し、ピストン形状の蓋を用いて、1cm直径および2mm厚みのディスク形状に圧縮した。 Then, thrombin was added in 60μl the DBM-TFC complex, mixed, with the lid of the piston shape and compressed into a disk shape of 1cm diameter and 2mm thickness. 次いで、ディスクを手で切断して所望の形状(三角形、四角形またはドーナツ形)とした。 Then a desired shape by cutting by hand disk (triangle, square or donut).
筋肉内バイオアッセイ実験のために、移植体を、70ミクロンのメッシュサイズを有し、1cm×1cmの寸法の滅菌ナイロンバッグに入れた。 For intramuscular bioassay experiment, implants have a mesh size of 70 microns, it was placed in a sterile nylon bag dimensions of 1 cm × 1 cm.
動物雄Long-Evansラットはチャールズ・リバー・ラバラトリーズ(Charles River Laboratories(Willington,MA))から得た。 Animal male Long-Evans rats were obtained from Charles River Rabaratorizu (Charles River Laboratories (Willington, MA)). 筋肉内バイオアッセイのために、28ないし35日齢のラットを用いた。 For intramuscular bioassay was used in 35-day-old rat to no 28. 3月齢のラットを開頭術実験で用いた。 The 3-month-old rats were used in the craniotomy experiment.
外科的処置100gm体重当たり0.1mlの用量にて、10mlのケタミン塩酸塩(Vetalar、100mg/ml、Parke-Davis, Morris Plains, NJ)、5mlのキシラジン(Rompun,20mg/ml,Mobay Corporation, Shawnee,KN)、および1mlの生理食塩水(0.9%NaCl)よりなる混合物を筋肉内投与して動物を麻酔した。 At surgery 100gm of body weight per 0.1ml dose, 10ml of ketamine hydrochloride (Vetalar, 100mg / ml, Parke-Davis, Morris Plains, NJ), xylazine 5ml (Rompun, 20mg / ml, Mobay Corporation, Shawnee , KN), and 1ml of saline (the mixture consisting of 0.9% NaCl) were anesthetized animals were administered intramuscularly. 動物の手術部位を70%アルコール溶液、続いてポビドン−ヨウ素溶液で準備した。 70% alcohol solution surgical site in an animal, followed by povidone - prepared in iodine solution. 次いで、無菌技術を用いて外科的手法を行った。 It was then performed surgical procedure using aseptic technique.
筋肉内バイオアッセイ。 Intramuscular bioassay. 正中腹側切開を施し、平滑切開で胸筋間にスペースをつくった。 Subjected to a midline ventral incision was made the space between the chest muscle in the smooth incision. 示した実験材料を含有するナイロン包みを筋肉内スペースに挿入し、3−0 デクソン(Dexon)縫合で締めた(図14)。 Nylon wrapping containing experimental material shown inserted intramuscularly space was tightened 3-0 Dekuson (Dexon) suture (Figure 14). 次いで、対側性側にて同一手法を反復した。 It was then repeated with the same technique in the contralateral side. 次いで、皮膚をステープルで閉じた。 Then, the skin was closed with staples. 移植体を4週間後に収穫し、X−線処理し、組織学のために調製した。 Harvested grafts after 4 weeks, treated X- lines were prepared for histology.
ディスク形状移植体をランダムに入れ、それは以下のものからなるものであった:DBM単独(n=12);異なる濃度(4mg/ml、n=14;8mg/ml、n=3;15mg/ml、n=3;および45mg/ml、n=12)のFG単独、およびDBM−FG複合体(4mg/ml、n=12;8mg/ml、n=12;15mg/ml、n=12;および45mg/ml、n=12)。 Randomly placed disk-shaped implant, it consisted of the following ones: DBM alone (n = 12); different concentrations (4mg / ml, n = 14; 8mg / ml, n = 3; 15mg / ml , n = 3; and 45mg / ml, n = 12) of the FG alone and DBM-FG complex (4mg / ml, n = 12; 8mg / ml, n = 12; 15mg / ml, n = 12; and 45mg / ml, n = 12). 各々四角形、三角形およびドーナツ形の形状の移植体の4種があった。 Each rectangle had four transplants triangles and donut-shape.
開頭術手法。 Craniotomy technique. 鼻骨から中央−矢状陵まで直線切開を施した。 It was subjected to linear incision until sagittal Ling - from nasal bone central. 軟組織は穏やかに反射し、骨膜を開頭部位から切開した(後頭骨、前頭骨、頭頂骨)。 Soft tissue is gently reflected, it was dissected periosteum from craniotomy site (occipital, frontal, parietal bones). 要すれば多量のセーライン洗浄を用い、低速回転ハンドピース中のトレフィンで8mm開頭を調製した。 Using a large amount of saline washing if necessary, and the 8mm craniotomy was prepared with a trephine in a low speed handpiece. 二重穿孔および上矢状静脈洞侵入を避けつつ、頭蓋冠ディスクを自由に切開した。 While avoiding double perforation and superior sagittal sinus intrusion was dissected free calvarial disk. 8mm頭蓋冠欠陥は対照として処理しないか、あるいは1×8mmのDBMまたはDBM−FGディスクを充填した(図15)。 8mm calvarial defects either not treated as a control, or 1 × filled with DBM or DBM-FG disks in 8mm (Figure 15). 次いで、皮膚ステープルで皮膚を閉じた。 Then, the skin was closed with skin staples.
外科的処置に続き、各ラットを耳パンチによって確認し、そのケージに戻し、2−3時間内そこで歩行させた。 Following the surgical procedure, confirmed by each rat ear punch, back into its cage, it was where walking within 2-3 hours.
頭蓋冠移植体の第1セットは、DBM単独(25mg,n=3)またはFGマトリックス中のDBM(15mg/ml、n=2;30mg/ml、n=3;および45mg/ml、n=3)よりなるものであって、28日後に回収した。 The first set of calvarial implants are, DBM alone (25mg, n = 3) or DBM in FG matrix (15mg / ml, n = 2; 30mg / ml, n = 3; and 45mg / ml, n = 3 ) it is comprised than was recovered after 28 days. 頭蓋冠移植体の第2セットは、30mg/mlFg中の25mgDBMよりなるものであって、異なる手術後時点で回収した(28日、n=10;3カ月、n=9;および4カ月、n=5)。 The second set of calvarial implants may be comprised from 25mgDBM in 30mg / mlFg, were collected at different post surgery (28 days, n = 10; 3 months, n = 9; and 4 months, n = 5).
移植体の回収示した時点で、ラットを二酸化炭素チャンバー中で安楽死させた。 At the indicated time points collected transplant, the rats were euthanized in a carbon dioxide chamber. 実験した受容体ベッド(すなわち、大胸筋または頭蓋冠)の回りに皮膚切開を施し、軟組織は受容体ベッドから反射した。 Experiments with receptor bed (i.e., pectoralis major or calvaria) around the subjected to skin incision, the soft tissues were reflected from the receptor bed. 正常位部位において、3−4mmの隣接骨を持つ開頭を前頭骨−後頭骨−頭頂骨複合体から回収した。 In orthotopic sites, the craniotomy with adjacent bone 3-4mm frontal - recovered from the parietal bone complex - occipital bone. 異所性部位において、鋭く平坦な切開を用いて、移植されたナイロン包みを回収した。 In ectopic sites, using a sharp flat incision was recovered nylon wrapped implanted.
ラジオグラフィー30kvp、3Maおよび10秒において、ミニショット・ベンクトン・キャビネット(Minishot Benchtop Cabinet)X線システム(TFI Corporation, West Haven, CT)にてX−OMATL TM高コントラストコダックX−線フィルム(Eastman Kodak Company, Rochester, NY)を用いて移植体をラジオグラフィーに付した。 Radiography 30 kVp, in 3Ma and 10 seconds, mini-shot Benkuton cabinet (Minishot Benchtop Cabinet) X-ray system (TFI Corporation, West Haven, CT ) at X-OMATL TM high contrast Kodak X- ray film (Eastman Kodak Company It was subjected Rochester, a transplant using a NY) in radiography. ケンブリッジ920イメージ分析システム(Image Analysis System TM (Cambridge Instruments Limited, Cambridge, England)を用いて筋肉内および開頭部位のラジオグラフの灰色レベル密度を分析した。 Cambridge 920 Image Analysis System (Image Analysis System TM (Cambridge Instruments Limited, Cambridge, England) and analyzed gray level density of the radiograph intramuscular and craniotomy part position using.
組織学的分析すべての回収した検体(軟組織および硬組織)を、保存剤溶液を含有する適当に標識したバイアルに直ちに入れ、加工のために組織学研究所に提出した。 Histological analysis of all of the collected specimen (soft and hard tissues), immediately placed in appropriately labeled vials containing preservative solution and submitted to histology laboratory for processing. 組織学的検体は冠直径を通って4.5ミクロン厚みの切片であった。 Histological specimens were sections of 4.5 micron thickness through the crown diameter. 各受容体部位では、1の切片を(細胞および間質の詳細の顕微鏡写真および鏡検用に)ヘマトキシリンおよびエオシン染色で調製し、他の切片をフォンコッサ(von Lossa)染色で調製した。 Each receptor site, one of the sections (for micrographs of cells and stromal details and microscopic examination) were prepared with hematoxylin and eosin staining, were prepared other sections with von Kossa (von lossa) staining.
結果筋肉内プラントのラジオグラフィー全てのDBMディスクは放射線不透明のイメージを示した。 Radiography all of DBM disk results intramuscular plant showed radiation opaque image. 48の移植したDBM−FGディスクのうち45(93.75%)が放射線不透明であった。 45 out of 48 DBM-FG disks implanted in (93.75%) were opaque radiation. 全てのDBM−FGディスクは、蛋白質濃度に拘わらず(4−45mg/ml)、放射線不透明性を誘導した(図16)。 All DBM-FG disks, regardless of protein concentration (4-45mg / ml), to induce radiation opaque (Figure 16). いくつかのDBMディスクの放射線不透明性測定値(図16)は、DBM−FGディスクよりも高かったが、他の測定値は十分にDBM−FGディスクの測定値の範囲内であった。 Some of the radiation opacity measurements of DBM disks (Figure 16) were higher than DBM-FG disks, other measurements were well within the measured value of the DBM-FG disks. DBMを補足しなかった32のFGディスクのうち30(93.75%)が放射線不透明性を示さなかった。 30 of the FG disks 32 that did not supplemented with DBM (93.75%) did not show radiation opaque.
四角形、三角形またはドーナツ形の形態のDBM−FGディスクも、DBMを補足しなかったFGディスクと比較して顕著に放射線不透明であった。 Square, DBM-FG disks triangular or toroidal form were also significantly radiopaque as compared to FG disks which were not supplemented with DBM. 移植体の元の形状は一般に保持されていた。 Original shape of the implant had been generally held.
筋肉内移植体の組織学筋肉内バイオアッセイは、骨髄が充填された中央腔を持つ小骨の形成および従前に移植したDBM粒子の吸収によって示されるごとく、DBMおよびDBM−FG移植体につき陽性であった。 Histology intramuscular bioassay intramuscular transplant, as indicated by the absorption of DBM particles marrow is transplanted into the formation and previous ossicles with a central cavity filled, a positive per DBM and DBM-FG implants It was.
頭蓋冠移植体のラジオグラフィーX−線は、FGマトリックス中のDBMが、DBM単独または未処理対照よりも一般により放射線不透明性であることを示した。 Radiography X- line calvaria transplant, DBM in FG matrix showed that the radiation-opaque by the general than DBM alone or untreated controls. DBMを送達するのに使用した異なる濃度のFG間に顕著な識別できる差異はなかった。 Different concentrations differences can noticeable identified between FG of used to deliver DBM did. 未処理の8−mm直径の頭蓋冠欠陥のラグオグラフィーは、無視できる量の放射線−不透明性を示した。 Raguo Photography calvarial defects 8-mm diameter untreated, radiation negligible amounts - showed opacity.
30mg/mlFGマトリックス中のDBMを用いる頭蓋冠移植体の第2のセットは、28日頭蓋冠よりも3または4カ月頭蓋冠の頭開創傷内で顕著に増大した放射線−不透明性を示した(図17)。 The second set of calvarial implants using DBM in 30mg / mlFG matrix is ​​significantly increased radiation at 3 or 4 months calvaria head open the wound than 28 days calvaria - showed opacity ( Figure 17).
頭蓋冠移植体の組織学未処理8mm頭開創傷は、頭開創傷を横切って発達する繊維状結合組織のみを示した(図18)。 Histology untreated 8mm AtamaHiraki wound calvaria transplant showed only fibrous connective tissue developing across the AtamaHiraki wounds (Figure 18). DBM移植体の組織学は、視野全体に散らばったDBM粒子を示した。 Histology of DBM transplant showed DBM particles scattered throughout the field of view. しかしながら、ほとんどのDBM粒子は頭開創傷の境界内にあり、よく血管が形成された緩い結合組織によって囲まれていた。 However, most of the DBM particles are in the perimeter of the head opening wounds, was surrounded by well loose connective tissue blood vessels are formed. 破骨細胞によるDBMの活性な吸収が認められた。 Active absorption of DBM by osteoclasts was observed. また、多くのDBM粒子は生細胞に存在することが認められた。 Also, many of DBM particles were observed to be present in living cells. 破骨細胞によって作られた新しい類骨および骨は非常に明らかであった。 New osteoid and bone made by osteoclasts was very apparent.
FGマトリックス中のDBM移植体の組織学は、かなり密でより多くの細胞結合組織によって囲まれた頭開創傷内に局在するDBM粒子を示した(図20および21)。 Histology of DBM implants in a FG matrix showed DBM particles localized in quite the AtamaHiraki wound surrounded by more cells connective tissue in dense (FIGS. 20 and 21). 類骨マトリックスおよび骨小柱の形成は明らかであった。 Formation of osteoid matrix and bone trabeculae was evident. ほとんどの骨髄は、DBM移植体単独よりもDBM−FGディスクを移植した頭開創傷において形成されることが認められた。 Most of the bone marrow, were observed to be formed in AtamaHiraki wounds than DBM implants alone were implanted DBM-FG disks. また、DBM移植体単独または未処理対照よりもDBM−FGディスクでより大きい新生血管形成があった。 Moreover, than DBM implants alone or untreated controls had greater neovascularization with DBM-FG disks. 骨再生はDBMを送達するのに用いた全ての濃度のFGで明らかであった。 Bone regeneration was evident in FG of all concentrations used to deliver DBM.
考察FGの天然の生体適合性および生分解性は、それをDBMおよびBMP類用の理想的にビヒクルとする特徴である。 Natural biocompatible and biodegradable considerations FG is a feature that it with ideally vehicle for DBM and BMP class. FGはDBMの所望の形態へ形状変化して骨欠陥を満たすことを容易とし、該欠陥内にDBMを維持し、DBMと相乗的であるらしい。 FG is easy to meet the bone defect and shape change into the desired form of DBM, maintaining the DBM within the defect appears to be synergistic with DBM. さらに、軟組織脱出症は起こらず、骨外形は維持された。 Furthermore, soft tissue prolapse did not occur, Honegaikei was maintained. DBM−補足FGは、骨芽細胞補給および骨再生を支持する適当な微細構造、生分解性プロフィールおよび放出動態を保有していた。 DBM- Supplemental FG is suitable microstructure supporting the osteoblasts supplementation and bone regeneration carried the biodegradability profile and release kinetics.
総じて、データは、テストしたいずれのFG蛋白質濃度においてFGに送達されたDBMもDBM単独と同程度の骨形成を誘導したことを示した。 Overall, the data indicated that even DBM delivered in FG at any of the FG protein concentration tested induced bone formation DBM alone and comparable. さらに、DBMはFGと共に特定の手術前形態とした場合、誘導された骨は手術後に元の形状をかなり保持した。 Furthermore, DBM If a particular preoperative form with FG, induced bone was significantly retain the original shape after surgery.
DBM−FGマトリックスは新しく形成された骨の形態を決定するので、可能ならば、DBM−FGマトリックスは所定の形状から作成すべきである。 Since DBM-FG matrix determined the morphology of the newly formed bone, if possible, DBM-FG matrix should be made from a predetermined shape. しかしながら、液体形態におけるDBM−FGマトリックスは不規則な形状の欠陥に送達または注入でき、そこで、重合し、DBM−FG−充填領域における骨形成を刺激するであろう。 However, DBM-FG matrix in liquid form can delivery or infusion to a defect of irregular shape, where, polymerized, will stimulate bone formation in DBM-FG- filling region.
実施例12 Example 12
FGからの抗生物質(AB)の放出およびAB補足FGの増大した寿命方法A. Increased longevity methods release and AB supplemented FG antibiotics (AB) from FG A. AB−FGの調製1. Preparation of AB-FG 1. TET遊離塩基3・1/2mlの注射用水を、米国赤十字から供給された凍結乾燥ヒト局所用フィブリノーゲン濃縮物(TFC)のバイアルに注入した。 Water for injection TET free base 3 · 1 / 2ml, was injected into vials supplied from American Red Cross lyophilization human topical fibrinogen concentrate (TFC). 得られた溶液の蛋白質濃縮物はほぼ120mg/mlであった。 Protein concentrate of the resulting solution was approximately 120 mg / ml.
米国赤十字/バクスター−ハイランド社(Glendale, CA)によって供給された凍結乾燥トロンビン濃縮物を、注射用水中に調製した塩化ナトリウムの40mM溶液3.5mlで復元した。 American Red Cross / Baxter - Highland Inc. (Glendale, CA) and lyophilized thrombin concentrate supplied by, and recovered in 40mM solution 3.5ml of sodium chloride prepared in water for injection. 得られた溶液はほぼ250U/mlであった。 The resulting solution was approximately 250 U / ml.
TET−FGは、注射品質の塩化カルシウム(American Reagent, Shirley, NYから購入)の存在下で、所望の重量のTETと1mlの復元したTFC溶液および1mlの復元したトロンビン溶液とを混合することによって処方した。 TET-FG are calcium chloride injection quality in the presence of (American Reagent, Shirley, purchased from NY), by mixing the recovered thrombin solution TFC solution and 1ml restored the desired weight of TET with 1ml It was formulated. 該TETは遊離塩基形態であって、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Company(St. Louise, MO))から購入した。 The TET is a free base form, were purchased from Sigma Chemical Co. (Sigma Chemical Company (St. Louise, MO)). 該TET−FGは、TFCおよびトロンビンをデュオフロ(Duoflo) TM分注器(Hamaedics, CA)を通して12mm直径のミリポア培養プレート(ミリポア社,Bedford, MA)中のミリポア膜上に混合することによって形成された。 The TET-FG is formed by mixing TFC and thrombin Deyuofuro (Duoflo) TM dispenser (Hamaedics, CA) Millipore culture plate 12mm diameter through (Millipore, Bedford, MA) on Millipore membrane in It was. 混合物を22℃で1時間凝固させた。 The mixture was allowed to 1 hour solidify at 22 ° C.. TET−FGを含有する6mmディスクおよびミリポア膜を、6mmパンチバイオプシーを用いて後者から切り取った。 The 6mm disks and Millipore membranes containing TET-FG, were cut from the latter using a 6mm punch biopsy. TET−FG含有ディスクをTET放出実験で用いた。 The TET-FG-containing disks were used in TET release experiments.
TET−FGからのTETのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または唾液への放出は、2つの異なるセットの条件下で、24−ウェル細胞培養プレート(Corning Glass Works, Corning, NY)を用いて測定した。 Release of TET phosphate buffered saline from TET-FG (PBS) or saliva under conditions of two different sets, 24-well cell culture plates (Corning Glass Works, Corning, NY) using a It was measured. 1の条件(静的様式)において、2mlのPBSまたは0.75mlの唾液を24−ウェル細胞培養プレート中で毎日取り替えた。 In one condition (static mode), it was changed daily 2ml of PBS or 0.75ml of saliva in 24-well cell culture plates. 他の条件(連続的交換様式)において、TET−FGからのTET放出は、1日当たりほぼ3mlの率で交換されたPBSで測定した。 In other conditions (continuous interchange format), TET release from TET-FG was measured with PBS having been exchanged at a rate of 1 day approximately 3 ml. 試料は分析されるまで−20℃で保存した。 Samples were stored at -20 ° C. until analyzed. 唾液は10人の異なる人から収集し、プールし、5000gにおける遠心によって清澄化した。 Saliva collected from different people with 10 people, pooled and clarified by centrifugation at 5000 g. 次いで、それを0.45μmのポアサイズの膜を通して濾過し、毎日の使用のために4℃で保存した。 It was then filtered through a membrane of 0.45μm pore size and stored at 4 ° C. for daily use.
TET−FGディスクから放出されたTETの濃度および生物学的活性を測定するために、抜き取ったTETを解凍し、320nmにおいて分光光度法によりおよび/または寒天プレート上のイー・コリ(E. coli)増殖の阻害によって生物学的に分析した。 To measure the concentration and biological activity of TET released from TET-FG disks, withdrawn TET was thawed and, spectrophotometrically at 320nm and / or agar plates of E. coli (E. coli) and biologically analyzed by inhibition of growth. これらのアッセイを較正するために、各々、0ないし50および0ないし500μg/mlのTET濃度をカバーする標準曲線を使用した。 To calibrate these assays, respectively, to 50 and 0 to 0 using a standard curve covering the TET concentration of 500 [mu] g / ml.
2. 2. シプロフロキサシンHCl(CIP)−、アモキシシリン(AMO)−およびメトロニダゾール(MET)補足FG Ciprofloxacin HCl (CIP) -, Amoxicillin (AMO) - and metronidazole (MET) supplemented FG
TETにつき前記したごとく、CIP HCl、AMOまたはMETを含有するFGを調製した。 As mentioned above per TET, was prepared FG containing CIP HCl, AMO or MET. 対応するAB−FGからのこれらのABの中間環境への放出をモニターするために、AB−FGディスクを24−ウェル細胞培養プレート中の個々のウェルに入れ、収集したPBS2mlで覆い、毎日取り替え、分析されるまで前記したごとく−20℃で保存した。 To monitor the release into these AB intermediate environment from the corresponding AB-FG, put AB-FG disks into individual wells of 24-well cell culture plates, covered with collected 2 ml PBS, changed daily, until it analyzed and stored at -20 ° C. as described above. 溶出物中のCIP、AMOおよびMETの濃度は各々275、274および320nmにて分光光度法により測定し、対応するABの0ないし50μg/mlを含有する標準曲線と比較した。 CIP in the eluate, the concentration of AMO and MET was measured by each spectrophotometrically at 275,274 and 320 nm, from 0 to the corresponding AB was compared to a standard curve containing 50 [mu] g / ml.
B. B. AB−FGの構造一体性FGおよびTET−FGディスクの構造一体性の維持は、微小スパチュラでディスクを「つつく」ことによる目視観察および物理的検査によって評価した。 Maintenance of structural integrity of the AB-FG structural integrity FG and TET-FG disks was evaluated by visual observation and physical inspection by the "poking" the disks with small spatula. ディスクをTET−FGに付着ままにしつつ切断した多孔性膜を用いて、それらの構造一体性の評価の間ディスクを位置付けるのを助けた。 The disk with a porous membrane which is cut with left attached to the TET-FG, helped position between the evaluation of their structural integrity disk. ディスクの頂面図および側面図の写真も取り、それを評価で用いた。 Also take photographs of the top and side views of the disk, using the same evaluation.
FGおよびTET−FGの構造一体性は滅菌および非滅菌の両条件下で測定した。 Structural integrity of the FG and TET-FG were measured under both sterile and non-sterile. 非滅菌条件では、PBSおよび唾液を分析するまで凍結保存した。 In non-sterile conditions and stored frozen until analysis PBS and saliva. 滅菌条件では、全プロセスを滅菌条件下で行った以外は同一手法を使用した。 In sterile conditions, except that carried out the entire process under sterile conditions using the same technique. 系の一体性は、0.2mlの試料および2mlのブロセスを37℃でインキュベートすることによってテストし、該ブロスの濁度は48時間モニターした。 Integrity of the system, the process' of the sample and 2ml of 0.2ml tested by incubation at 37 ° C., turbidity of the broth was monitored for 48 hours. 濁度の欠如は系の滅菌性を示した。 The lack of turbidity showed the sterility of the system. CIP−、AMO−、およびMET−FGの安定性は非滅菌条件下のみであること以外は前記したごとくに実験した。 CIP-, AMO-, and except that the stability of the MET-FG is only non-sterile conditions and experiment as described above.
C. C. AB−FGから放出されたABのイン・ビトロ抗微生物活性AB−FGから放出された抗微生物活性は、AB−FGを囲む毎日収集したPSBまたは唾液からの6mm直径ディスクからの溶出物によって生じた阻止ゾーンの直径を測定することによって評価した。 AB-FG The antimicrobial activity released from the in vitro antimicrobial activity AB-FG of the released AB from, caused by the eluate from 6mm diameter disks from PSB or saliva collected daily surrounding the AB-FG It was evaluated by measuring the diameter of the blocking zone. 非補足FGからの溶出物は対照として供した。 Eluate from unsupplemented FG were served as controls. 既知濃度のAB溶液は標準として使用した。 Of known concentration AB solution was used as a standard. 寒天プレート上で培養したイー・コリ(E. coli)を用いて、放出されたTET、CIPおよびMETのAB活性を測定した。 Using E. coli cultured on agar plates (E. coli), released TET, it was measured AB activity of CIP and MET. 培養プレートを作成するために、ほぼ10 8細胞/mlを含有する100μlの細菌懸濁液を50℃で3mlの頂部寒天混合し、直ちにプレートの硬い底部寒天上に注いで均一な細胞層を形成させた。 To create a culture plate, a bacterial suspension of 100μl containing approximately 10 8 cells / ml were mixed top agar 3ml at 50 ° C., to form a uniform cell layer poured immediately plate hard bottom agar It was. 該プレートを37℃で18時間インキュベートした。 The plates were incubated for 18 hours at 37 ° C..
結果A. Results A. TET TET
1. 1. TET放出データ「静的」実験における、TET−FGからのTETの回りのPBSへの放出は、毎日取り替えた2mlのPBSで達成されたTET濃度を測定することによって分光光度法によって測定した。 In TET release data "static" experiments, release into surrounding PBS in the TET from TET-FG was measured spectrophotometrically by measuring the TET concentration achieved with PBS 2ml of which was replaced daily. TET−FGに取り込まれたTETの異なる量について得られたTET濃度を図22に示す。 The TET concentration obtained for different amounts of TET-FG has been incorporated into TET shown in FIG. 22. 50mg/ml未満のTET−FG中のTET濃度において、TETの放出は5日以内に完了した。 In TET concentration in the TET-FG of less than 50 mg / ml, the release of TET was completed within 5 days. しかしながら、100および200mg/mlのTET濃度を含有したTET−FGディスクからのTETの放出は、各々、ほぼ2週間、および3週間を超えて起こった。 However, the release of TET from TET-FG disks which contained TET concentrations of 100 and 200 mg / ml, respectively, occurred beyond approximately 2 weeks, and 3 weeks. TET−FGディスクの構造的一体性は3ないし5週間保持された。 Structural integrity of the TET-FG disks was kept 3-5 weeks. これらの結果は、TET放出がFG分解とは独立していること、およびTET放出の速度はTET−FGディスクに残ったTET量に依存することを示した。 These results indicate that the TET release is independent of the FG degradation and the rate of TET release was shown to depend on the TET amount remaining in the TET-FG disks.
連続的交換実験で収集した分光光度法データを図23に示す。 Spectrophotometrically data collected in a continuous exchange experiment are shown in Figure 23. これらのデータは、元々100mg/mlFGのTET濃度を含有したTET−FGディスクからの連続的TET放出は2週間にわたって起こったことを示す。 These data are continuously TET release from TET-FG disks which originally contained TET concentrations of 100mg / mlFG indicates what happened for two weeks. FGディスクはこの2週間の間にその構造的一体性を保持した(後述)。 FG disks retained its structural integrity during this two week (described later). また、連続様式実験で得られたTET放出データは、TET放出機会の率はTET−FGディスクに残ったTETの濃度に依存することを示した。 Further, TET release data obtained in a continuous mode experiment, the rate of TET release opportunity showed that depends on the concentration of TET which remained in TET-FG disks.
理論によって拘束されるつもりはないが、これらの実験で観察された初期の高TET濃度は、恐らくは、ディスク表面またはその近くからのTETの拡散の結果であったであろう。 While not wishing to be bound by theory, the high TET concentrations in the initial observed in these experiments, perhaps, would have been the result of the diffusion of TET from near or disk surface. すなわち、これらの位置に「捕らえられた」TETが消費されると、可溶化および/または拡散の速度が、最もありそうには、TET濃度勾配によるように、およびFGの形状の配置によるように減少した。 That is, when these "trapped" TET on position is consumed, the rate of solubilization and / or diffusion, the most likely, such as by TET concentration gradient, and FG of such as by shape arrangement of Diminished.
温度およびFG蛋白質濃度もTET−FGディスクからのTET拡散速度を決定する役割を演じる(実施例13および14参照)が、これらの2つのパラメーターはこれらの実験では一定に保持した。 Temperature and FG protein concentration also play a role in determining the TET diffusion rate from the TET-FG disks (see Examples 13 and 14), these two parameters were kept constant in these experiments.
50および100mg/mlのTETを含有するTET−FGからのTETの唾液への放出は、毎日取り替えた0.75mlの唾液中のTET濃度を測定することによって静的実験で測定した。 Release of TET into saliva from TET-FG containing 50 and 100 mg / ml of TET was measured in static experiments by determining the TET concentration in saliva of 0.75ml which was replaced daily. これらの結果(図24)は、TETの濃度がより高く、最もありそうには、放出されたTETを収集するのに用いた唾液の小容量を反映する以外は、PBSで得られたものと同様である。 These results (Fig. 24) the concentration of TET is higher, the most likely, except that reflect the small volume of saliva was used to collect the released TET, to those obtained with PBS it is the same. 加えて、FGマトリックス中のTETの存在は、再度、予期せぬことに、9日までに崩壊を開始し、15日までにはほとんど完全に崩壊した対照FGディスクについてのものと比較して、少なくとも15日間はTEt−FGマトリックスの構造的一体性を延長した(図25)。 In addition, the presence of TET in the FG matrix again unexpectedly, started disintegrating day 9, compared to that for the control FG disks which were almost completely disintegrated in 15 days, at least 15 days were prolonged the structural integrity of the Tet-FG matrix (Figure 25).
2. 2. TET抗微生物データPBS中のいくつかのTET濃度におけるイー・コリ(E. coli)増殖に対する抗微生物効果を図26に示す。 E. coli (E. coli) antimicrobial effect on growth in several TET concentrations in TET Antimicrobial Data PBS shown in FIG. 26. この方法によって検出可能な最低TET濃度はほぼ5μg/mlであった。 From TET concentration detectable by this method was approximately 5 [mu] g / ml. これらの結果は、放出されたTETが抗微生物活性を有することを明らかに示す。 These results clearly indicate that the released TET has antimicrobial activity. これらのデータは、分光光度法によってえられたものを確証し、FGに取り込まれたTETの量はTET−FGを囲む溶液中のTET濃度を決定することを示す。 These data confirm what has been example by spectrophotometry, the amount of TET incorporated into the FG indicate that determining the TET concentration in the solution surrounding the TET-FG. また、これらのデータは、FG中のTETの量を調整して、TET−FGを囲む媒体中の所望のTET濃度を最小の所望のTET濃度をまたはそれを超える濃度に維持することを示す。 These data also indicate that by adjusting the amount of TET in the FG, also the desired TET concentration minimum desired TET concentration in the medium surrounding the TET-FG indicates that maintaining the concentration of greater than it.
3. 3. TET−FGマトリックス寿命対照FGおよびAB−FGディスクの寿命は、ディスクの目視評価によって見積もった。 TET-FG Matrix lifetime control FG and lifetime of the AB-FG disks was estimated by visual evaluation of the disc. ディスク作成の間に切断した多孔性膜はFGに付着させたままとし、これは、それらの一体性評価の間にディスクを位置付けるのに助けとなった。 Porous membrane was cut between the discs can be kept adhered to FG, which, helped to position the disks during their integrity evaluation. TETを含有しない(対照)、およびFG1ml当たり50または100mgのTETを含有するディスクの頂面図を、0、9および15日におけるものを図25に示す。 Containing no TET (controls), and a top view of a disk containing the TET of FG1ml per 50 or 100mg, shown in Figure 25 to those in 0,9 and 15 days. この図は典型的結果を示す、すなわち、FG対照ディスクは2週間内で分解し、他方、TET−FGディスクは15日間完全名間々、あるいはほとんど完全なままであった。 This figure shows a typical result, i.e., FG control disks were degraded within two weeks, while, TET-FG disks s between 15 days full name, or remained almost completely. さらなる実験において、TET−FGディスクは、少なくとも5週間は完全なまま、あるいはそれまではほとんど完全なままであった(データは示さず)。 In further experiments, TET-FG disks remained for at least 5 weeks completely, or (data not shown) in which was remained almost completely before. FG寿命における有意な変化が、滅菌および非滅菌TET放出実験の間で観察された。 No significant change in the FG longevity was observed between sterile and non-sterile TET release experiments.
B. B. CIP、AMOおよびMETデータ1. CIP, AMO and MET data 1. CIP、AMOおよびMET放出データCIP−、AMO−およびMET−FGから放出された抗生物質は図27に示す。 CIP, AMO and MET release data CIP-, antibiotic released from AMO- and MET-FG is shown in Figure 27. CIPはほぼ4週間、見掛け上一定速度で放出され、次いで、速度はほぼさらに1週間で徐々に低下した。 CIP is approximately 4 weeks, is released at an apparent constant rate, then the rate was reduced gradually substantially more in a week. AMOおよびMETの放出は3日以内に完了した。 Release of AMO and MET was completed within three days.
2. 2. CIPおよびMET抗微生物活性放出されたCIPおよびMETの抗微生物活性(データは示さず)は、同一のAB−FGディスクにつき分光光度法で測定したプロフィールが類似する。 CIP and MET antimicrobial activity released CIP and MET antimicrobial activity (data not shown), the profile was measured for the same AB-FG disks spectrophotometrically are similar.
3. 3. 補足−FGマトリックスの寿命CIP−FGについての結果はTET−FGのものと同様であった。 Results for life CIP-FG Supplemental -FG matrix were similar to those of the TET-FG. AMO−およびMET−FGについての結果は、FG対照で得られたものと同様であった。 Results for AMO- and MET-FG were similar to those obtained with FG control. FG寿命において有意な変化は滅菌および非滅菌実験間で観察されなかった。 Significant changes in FG longevity was observed between sterile and non-sterile experiments.
考察結果は、CIPおよびTETの貧水溶性形態は、最大AB負荷、放出期間およびそれらを混入したFGマトリックスの寿命を有意に増加させる因子の組合せを提供することを示した。 Discussion The results are poorly water soluble forms of CIP and TET has been shown to provide a combination of maximum AB load, release period and factors that increase significantly the lifetime of the FG matrix which is mixed with them. 別法として、FGディスクは、それらをTETまたはCIPのごときABの溶液に浸漬することによって安定化させることができる。 Alternatively, FG disks can be stabilized by immersing them in a solution of TET or CIP, such as AB.
また、結果は、AB−FGによって送達されたABは、イー・コリ(E. coli)増殖の阻害によって示されるごとく、その抗微生物活性を維持したことを明瞭に示した。 As a result, the AB delivered by AB-FG is, as indicated by the inhibition of E. coli (E. coli) grow, clearly showed that it has maintained its antimicrobial activity. これらの結果は、FGおよび他のTSのTETおよびCIP補足が、それからの薬物送達における限定因子としてのFGの分解を克服できることを示す。 These results indicate that TET and CIP supplementation of FG and other TS can overcome the degradation of FG as a limiting factor in drug delivery therefrom. すなわち、これらのAB類は、それらの放出期間および放出されたAB濃度がFG中のAB濃度を用いて制御できるようにFGを安定化した。 That is, these AB compounds is that their release periods and the released AB concentrations had stabilized the FG so that it can be controlled using AB concentrations in the FG. これらの手法を用い、TETおよびCIPをFGに負荷でき、それらの放出は、効果的抗微生物濃度にて、数日または数週間制御できる。 Using these techniques, can load the TET and CIP in FG, they release at effective antimicrobial concentrations can be controlled several days or weeks.
TET−およびCIP−誘導FG安定化は、その放出速度および/または全放出持続がFGマトリックスの一体性に依存するFGに添加されたこれらのAB類のみならず他の薬物類または「補足物」につき全放出時間を制御するのに利用できる。 TET- and CIP- induced FG stabilization, the release rate and / or total release duration of other drugs such or "complement" not these AB class only added to the FG that depends on the integrity of the FG matrix per can be used to control the total release time.
これらの結果は、FGが局所化薬物送達系として働き得る歯周疾患および他の疾患で臨床的応用を有する。 These results, FG have clinical applications in periodontal and other diseases that can serve as a localized drug delivery system. TET−またはCIP−誘導FG安定化は、TET−FGまたはCIP−FGマトリックスに添加されたTET、CIPおよび他の薬物類または補足物類の全放出時間を制御するのに利用できる。 TET- or CIP- induced FG stabilization can be utilized TET added to TET-FG or CIP-FG matrices, to control the total release time of CIP and other drugs such or supplement such.
実施例13 Example 13
TET補足FGからのTET放出速度に対する温度の効果本実験のために、FGに50mg/mlのTET遊離塩基を補足し、6×2.5mmディスクの形状とした。 For temperature effects this experiment for TET release rate from the TET supplement FG, supplemented with TET free base 50 mg / ml in FG, and the shape of the 6 × 2.5 mm disc. FGの蛋白質濃度は60mg/mlに調整した。 Protein concentration of FG was adjusted to 60 mg / ml. 該ディスクを2mlのPBS、pH7.3に入れ、4、23および37℃で放置した。 The disk of 2 ml PBS, placed in a pH 7.3, was allowed to stand at 4, 23 and 37 ° C.. ディスクを洗浄するために、PBSを10分毎に6回、2mlの新鮮なPBSと取り替えた。 To wash the disks, six times with PBS every 10 minutes and replaced with fresh PBS for 2 ml. しかる後、PBSを4時間の間、1時間毎に取り替えた。 Thereafter, during the 4 hours PBS, and replaced every hour. 収集した試料中のTET濃度は、前記したごとく、標準曲線に対して分光光度法によって測定した。 TET concentration of the collected sample is, as described above, were determined spectrophotometrically against a standard curve.
結果および結論結果は、TET放出の速度が温度に比例したことを示した(図28)。 Results and Conclusions The results showed that the rate of TET release was proportional to the temperature (Figure 28).
実施例14 Example 14
TET補足FGからのTET放出速度に対するFG蛋白質濃度の効果本実験では、1mg/mlのTET HClを補足したFGを調製し、6×2.5mmディスクとしての形状とした。 In effect this experiment FG protein concentration on TET release rate from the TET supplemented FG, the FG supplemented with TET HCl of 1mg / ml was prepared and the shape of the 6 × 2.5 mm disc. FGの蛋白質濃度を60、30および15mg/mlに調整した。 The protein concentration was adjusted to the FG to 60,30 and 15 mg / ml. 各ディスクを3mlの蒸留水に入れた。 Each disk was placed in distilled water of 3ml. 該水を同一容量の水と、10分毎に、合計1時間取り替えた。 And water of the same volume of water, every 10 minutes, was changed a total of 1 hour. 収集した試料中のTET濃度は、前記したごとく、標準曲線に対して分光光度法により測定した。 TET concentration of the collected sample is, as described above, was measured spectrophotometrically against a standard curve.
データ(図29)は、TET放出が最低の全蛋白質濃度を持つFGから最高であり、またその逆が成立することを示す。 Data (Figure 29) shows that TET release was highest from FG with total protein concentration of the lowest, and vice versa is established. すなわち、TET放出はFG蛋白質濃度に反比例する。 That, TET release is inversely proportional to the FG protein concentration.
実施例15 Example 15
AB補足FGから放出されたABのイン・ビボ抗微生物活性TET−およびCIP−FGから放出されたTETおよびCIPの抗微生物活性をテストするために、誘導歯周炎からマウスを保護するこれらのAB補足FG類の能力を評価した。 To test the released TET and CIP antimicrobial activity from AB in vivo antimicrobial activity of AB released from supplemented FG TET-and CIP-FG, these AB to protect mice from induced periodontitis to assess the ability of supplemental FG class. 実験としては、第1日に、群当たり5匹の動物の各々に0.5mlPBS(群−I)、FG(群−II)、TET−FG(群−III)またはCIP−FG(群−IV)を腹腔内注射した。 The experiment, on day 1, 0.5 ml PBS into each of 5 animals per group (group -I), FG (Group -II), TET-FG (Group -III) or CIP-FG (Group -IV ) were injected intraperitoneally. FGおよびAB−FGは、120mg/mlのTFC0.25mlおよび250U/mlのヒトトロンビン0.25mlを含有するハメディクス(Hamaedics)分注器を用いて投与した。 FG and AB-FG was administered using a Hamedikusu (Hamaedics) dispenser containing human thrombin 0.25ml of TFC0.25ml and 250 U / ml of 120 mg / ml. TET−およびCIP−FGの場合、トロンビン溶液は各ABの50mgを含有するものであった。 For TET- and CIP-FG, the thrombin solution was one containing 50mg of each AB. 第2日に、全ての動物に、エス・アウレウス(S, aureus)202Aの2×10 8 (実験1)または4×10 8 (実験2)コロニー形成単位(cfu)を腹腔内注射した。 On day 2, all animals, S. aureus (S, aureus) 202A of 2 × 10 8 (Experiment 1) or 4 × 10 8 (Experiment 2) colony forming units (cfu) were injected intraperitoneally. 結果:(実験1、実験2;動物は注射48時間後に生存):群I、0および1匹の生存;群II、3および1匹;群III、3および5匹;および群IV、5および4匹の生存。 Results :( Experiment 1, Experiment 2; animals surviving after injection 48 hours): Survival of group I, 0 and 1 animal; Group II, 3 and 1 animals; Group III, 3 and 5 mice; and group IV, 5 and 4 survivors. ほとんどの生存動物は実験期間(2週間)生存したが、いくつかの動物は死亡するか、あるいはそれらが病気となったので意図的に殺した。 Most survivors survived the experimental period (2 weeks), several animal death or, or killed intentionally because they became ill.
これらのデータは、TET−FGおよびCIP−FGが、少なくともAB補足FGの投与後48時間、エス・アウレウス202Aによって引き起こされる死亡からマウスを保護したことを示した。 These data, TET-FG and CIP-FG showed that protected mice from death caused by 48 hours, S. aureus 202A after administration of at least AB supplemented FG.
実施例16 Example 16
FGからの細胞毒性/抗増殖薬物の長期間部位特異的送達フィブリノーゲンを滅菌水で、あるいは1の群については17mg/mlの濃度の5−FUで飽和した水で可溶化させた。 Cytotoxic / antiproliferative sterile water for a long time site-specific delivery fibrinogen of the drug from FG, or the first group were solubilized with water saturated with 5-FU at a concentration of 17 mg / ml. トロンビン溶液は滅菌水で作成し、次いで、40mM CaCl 2中に希釈して15U/mlの濃度とした。 Thrombin solution is prepared in sterile water, and then the concentration of 15U / ml diluted in 40 mM CaCl 2. あるいは、トロンビンを17mg/mlの濃度で5−FUを飽和した40mM CaCl 2に溶解させた。 Alternatively, dissolve the thrombin 40 mM CaCl 2 saturated with 5-FU at a concentration of 17 mg / ml.
対照FG血餅は5−FUを含有せず、これは、200μlのTFC溶液(60mg/ml)を200μlのトロンビン溶液(15U/ml)と混合し、20分間乗号させることによって製造した。 Control FG clots did not contain 5-FU, which is, 200 [mu] l of TFC solution (60 mg / ml) was mixed with 200 [mu] l of thrombin solution (15U / ml), were prepared by No. multiply 20 minutes. これらの血餅は、12×75mmのテストチューブ中で作成し、次いで、0.05Mヒスチジン、0.15M NaCl、pH7.3(緩衝液)の10mlに入れた。 These clots are created in the test tube 12 × 75 mm, then, 0.05 M histidine, 0.15 M NaCl, was placed in 10ml of pH 7.3 (buffer).
飽和レベルの液体5−FUを含有するFG血餅は、200μlのTFC(60mg/ml+17mg/ml 5−FU)を200μlのトロンビン溶液(15U/ml+17mg/ml 5−FU)と混合し、血餅を20分間十分重合させることによって製造した。 FG clots containing saturated levels of liquid 5-FU is to mix 200μl of TFC (60mg / ml + 17mg / ml 5-FU) and 200μl of the thrombin solution (15U / ml + 17mg / ml 5-FU), a blood clot It was prepared by sufficiently polymerized for 20 minutes. TFCおよびトロンビン溶液における飽和レベルの5−FUの添加は、かなり不透明であった対照FG血餅と比較して、透明の血餅を生じる血餅形成を幾分改変した。 Addition of 5-FU levels of saturation in the TFC and thrombin solutions, as compared to the control FG clots were pretty opaque and somewhat modified clot formation resulting in transparent clot. 形成された血餅は、色彩を除き、FG単独で作成されたものと物理的に同一であった。 Formed clot, except for color, were physically identical to that created by the FG alone. 血餅は12×75mmのテストチューブ中で形成させ、次いで、10mlの緩衝液に入れた。 Blood clot was formed in a test tube of 12 × 75 mm, then placed in buffer 10 ml.
5−FUの飽和溶液で形成させた血餅に含まれる量と同一の量の固体状無水5−FUを含有する第2群のFG血餅を作成した。 5-FU in creating the FG clot second group containing solid anhydrous 5-FU in an amount identical to the amount included in the clots were formed with a saturated solution. これらの血餅は、7mgの固体状無水5−FUを200μlのTFC(60mg/ml)および200μlのトロンビン(15U/ml)に添加することによって形成させた。 These clots were formed by the addition of 7mg of solid anhydrous 5-FU to 200μl of TFC (60mg / ml) and 200μl of thrombin (15U / ml). 7mgの5−FUを12×75mmのテストチューブに入れた。 The 5-FU of 7mg was placed in a 12 × 75mm test tubes. 次いで、200μlのTFC、続いて200μlのトロンビンを添加した。 Then, 200μl of TFC, followed by the 200μl thrombin was added. 次いで、均一な混合物が観察されるまでピペットで吸上、放出を行うことによって3成分を混合し、さらなる混合は凝集反応のため阻害された。 Then, wicking pipetted until a homogeneous mixture is observed, mixing the 3 components by performing discharge, further mixing was inhibited due to agglutination. 次いで、血餅を10mlのヒスチジン緩衝液に入れた。 Was then placed clot histidine buffer 10 ml.
最後の群は、血餅当たり50mgの固体状無水5−FUを含有するものであった。 The last group was one containing solid anhydrous 5-FU clot per 50 mg. 増大した塊の5−FU(7mgの代わりに50mg)のため、従前に使用した方法は役に立たなかった。 Due to the increased mass of 5-FU (50 mg instead of 7 mg), was useless method used previously. 均一な血餅が生じる代わりに、テストチューブの底に沈降した5−FUの大部分で血餅が形成された。 Instead of uniform clot occurs clot was formed in most of 5-FU which settled to the bottom of the test tube. この問題を回避するために、テストチューブの底をまず100μlのTFC(60mg/ml)および100μlのトロンビン(15U/ml)で覆った。 To avoid this problem, covered first with 100μl of TFC bottom of the test tube (60 mg / ml) and 100μl of thrombin (15U / ml). これにより、テストチューブの凹部を覆った血餅が形成された。 Thus, blood clots are formed to cover the concave portion of the test tube. 次に、50mgの固体状無水5−FUを200μl血餅の表面に添加した。 Then, was added solid anhydrous 5-FU of 50mg on a surface of 200μl clot. これに続き、100μlのTFCを100μlのトロンビンと共に添加した。 This was followed by the addition of TFC of 100μl together with 100μl of thrombin. 蛋白質がゲル化し始めるまで、自動ピペッターを用いて2の溶液を混合した。 Until protein begins to gel, a mixture of two solutions using an automatic pipettor. これが起こると、ピペッティングを終え、血餅を20分間重合させた。 When this occurs, after the pipetting was polymerized clot for 20 minutes. 最終生成物は、ほぼ50mgの5−FUを含有する密なコアを含有する血餅であった。 The final product was a clot that contained a dense core containing the 5-FU approximately 50 mg. 他の血餅については、次いで、これらを10mlの緩衝液に入れた。 For other clot and then placed them in buffer 10 ml. 全ての群におけるFGの最終全蛋白質濃度は30mg/mlであった。 The final total protein concentration of FG in all groups was 30 mg / ml.
各群は10連を含有した。 Each group contained 10 stations. 各連を10mlの緩衝液中、37℃でインキュベートした。 Each communication buffer of 10 ml, and incubated at 37 ° C.. 緩衝液を5、10、22、33、52、75および114時間において新鮮に溶液10mlと交換した。 Buffer was replaced with fresh solution 10ml in a 5,10,22,33,52,75 and 114 hours. 次いで、溶出物緩衝液のアリコットを260に設定した波長で分校光度法により調べた。 Then examined spectrophotometrically at a wavelength set aliquot of the eluate buffer 260. 従前の実験は、5−FUがこの波長強力に吸収し、他方、対照FGからの溶出物はそうではないことを示した。 Previous experiments, the 5-FU strongly absorb this wavelength, while eluates from control FG showed not.
結果を図30に示す。 The results are shown in Figure 30. 5−FUを含有しない対照血餅は有意な読みを与えなかった。 Contrast clot that does not contain the 5-FU did not give a significant reading. 5−FUの飽和溶液の形態または等量の固体状無水5−FUの形態いずれかで5−FUの7mgで作成した血餅は、5ないし10時間の間に5−FUの送達を完了し、他方、50mgの固体状無水5−FUを含有する血餅は少なくとも75時間5−FUを送達し続けた。 5-FU in the form or an equivalent amount of solid anhydrous 5-FU in the form clots created in 7mg of 5-FU either in saturated solution is from 5 to complete the delivery of 5-FU during 10 hours , while clots containing solid anhydrous 5-FU of 50mg continued to deliver at least 75 hours 5-FU. 全ての場合におけるピークレベルは5時間の時点で起こった。 Peak levels in all cases occurred at 5 hours.
理論に拘束されるつもりはないが、5−FU送達の持続は、ゲルに負荷された5−FUの量の関数であるように考えられる。 Without wishing to be bound by theory, the duration of 5-FU delivery is considered to be a function of the amount of 5-FU that was loaded on the gel. その結果、5−FUを溶液中の含有する血餅から送達可能な5−FUの量は薬物の溶解度によって制限された。 As a result, the amount of 5-FU deliverable from the containing clot in solution 5-FU is limited by the solubility of the drug. かくして、5−FUで飽和された液体から形成された血餅に存在する量と等しい量の固体状無水形態を含ませた結果、ほとんど同一の送達動態が得られ、他方、液体形態を用いて可能なものよりも大きい量の固体状形態の5−FUを含ませた結果、送達の合計持続が3倍となり、それにより、所与の濃度の薬物の送達の持続は10倍増加する。 Thus, the result was contained amount equal amounts of solid anhydrous form present in blood clots formed from saturated with 5-FU liquid, nearly identical delivery kinetics obtained with the other, the liquid form possible results moistened with 5-FU large amount of solid-state forms than the total duration of delivery tripled, thereby sustained delivery of a given concentration of the drug is increased 10-fold. さらに多量の固体状無水5−FUを含ませると、さらに長い送達持続が得られると予測される。 Upon further contain a large amount of solid anhydrous 5-FU, longer delivery duration is expected to be obtained. 他の実験において、血餅に含まれる5−FUの量は少なくとも5倍、恐らくはそれ以上増加させることができ、また、5−FU−FG混合物は注射形態に処方できることが判明した(データは示さず)。 In other experiments, the amount of 5-FU included in the clots at least 5-fold, possibly can be increased more, also, 5-FU-FG mixture was found to be formulated into injectable form (data shown not). さらに、無水形態よりも周囲の水性媒体に溶解性が低く、および/またはより遅い溶解速度を有する5−FUの類似体または他の形態の使用の結果、送達時間はさらに増加することが予測された。 Further, low solubility in the surrounding aqueous medium than the anhydrous form, and / or 5-FU analogs or other forms result of the use of having a slower dissolution rate, the delivery time is expected to be further increased It was.
このプロセスの結果は、水性形態の薬物を使用して可能であったものよりも少なくとも10倍長いフィブリン血餅からの抗増殖性/細胞毒性薬物5−FUの持続性送達となる。 The result of this process, the antiproliferative / sustained delivery of a cytotoxic drug 5-FU for at least 10 times longer fibrin clot than was possible using the drug in aqueous form. この技術(すなわち、薬物の固体形態、好ましくは、低溶解度および/または溶解速度を持つものの使用)は、一般に、薬物粒子が懸濁されたマトリックスまたは薬物それ自体に拘わらず、適用可能なはずである。 The technique (i.e., a solid form of the drug, preferably, the use of those having a low solubility and / or dissolution rate) is generally a matrix or drug drug particles are suspended regardless itself, should be applicable is there.
実施例17 Example 17
線維芽細胞成長因子補足FGおよびフィブロネクチンに対する応答における成長因子走化性材料および方法材料ダルベッコウの変性イーグル培地(DMEM)はシグマ・ケミカル(St. Luoise, MO)から購入した。 Modified Eagle's medium growth factors chemotactic Materials and Methods Materials Darubekkou in response to fibroblast growth factor supplemented FG and Fibronectin (DMEM) was purchased from Sigma Chemical (St. Luoise, MO). 抗生物質−抗真菌剤溶液はギブコ(GIBCO)(Grand Island, NY)から購入した。 Antibiotic - antimycotic solution were purchased from GIBCO (GIBCO) (Grand Island, NY). 組換え線維芽細胞増殖因子−1(FGF−1)および−4(FGF−4)は、各々、米国赤十字,ロックビルMDのレジナルド・キッド,プラズマ・デリバティブズ・ラバラトリーズ(Reginald Kidd, Plasma Derivatives Laboratory)およびジェネティクス・インスチチュート(Genetics Institute(Cambridge, MA))から親切にも贈られた。 Recombinant fibroblast growth factor -1 (FGF-1) and -4 (FGF-4), respectively, American Red Cross, Rockville MD Reginald Kidd, Plasma Derivatives Rabaratorizu (Reginald Kidd, Plasma Derivatives Laboratory) and Genetics Institutes (Genetics Institute (Cambridge, MA)) was also presented to the kindness from. 組換え線維芽細胞成長因子−2(FGF−2、塩基性FGFまたはbFGFとしても公知)はアップステート・バイオテクノロジー社(Upstate Biotechnology, Inc.(Lake Placid, NY))から購入した。 Recombinant fibroblast growth factor -2 (FGF-2, also known as basic FGF or bFGF) is Upstate Biotechnology were purchased from (Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY)). 全てのプラスチックは培養の滅菌増殖に必要であり、走化性アッセイはフィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific(Newark, DE))から購入した。 All plastic is required for sterilization growth of the culture, chemotaxis assays were purchased from Fisher Scientific (Fisher Scientific (Newark, DE)). ミリセル(Millicell)-PCF(12.0μm)インサートは、ミリポア社(Bedford, MA)から購入した。 Millicell (Millicell) -PCF (12.0μm) inserts were purchased from Millipore (Bedford, MA). ヘパリンは、アップジョン社(Upjohn Company(Kalamazoo,MI))から購入した。 Heparin was purchased from Upjohn Company (Upjohn Company (Kalamazoo, MI)).
細胞培養126継代のNIH/3T3線維芽細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection, Rickville, MD)から購入した。 NIH / 3T3 fibroblast cell culture 126 passages were purchased from the American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Rickville, MD) from. 継代129−133からの培養を走化性アッセイで使用した。 Cultures from passages 129-133 were used in the chemotaxis assay. 培養は10%ウシ血清およびほぼ1%の抗生物質抗真菌剤溶液を補足したDMEM中で増殖させた。 Cultures were grown in DMEM supplemented with 10% calf serum and approximately 1% antibiotic antimycotic solution. ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)はクローンティクス社(Clonetics, Inc.(San Diego, CA))から継代2にて購入した。 Human dermal fibroblasts (HDF) were purchased Clonetics, Inc. from (Clonetics, Inc. (San Diego, CA)) at passage 2. 培養は20%FBS(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT)およびほぼ1%の抗生物質抗真菌剤溶液(Gibco, Grand Island, NY)を補足したDMEM中で培養させた。 Culture 20% FBS (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) and were approximately 1% antibiotic antimycotic solution (Gibco, Grand Island, NY) were cultured in DMEM supplemented with.
細胞走化性アッセイ細胞走化性を測定するのに使用した手法は、2つの公知の方法の組合せであった。 Method used to measure cell chemotaxis assay cell chemotaxis was a combination of two known methods. ボイデン(Boyden)のチャンバーの修飾を以下のごとく用いた:ミリセル-PCF(ミリポア社,Bedford, MA)(12.0μm)、12.0mm直径インサートを24ウェルプレートの個々のプレートに入れて、上方および下方走化性チャンバーを得た。 The chamber of the modified Boyden (Boyden) were used as follows: Millicell -pcf (Millipore, Bedford, MA) (12.0μm), and placed in individual 24-well plates plates 12.0mm diameter insert, upper and to obtain a lower chemotaxis chambers. 走化性結果は、細胞および成長因子の各組合せにつきチェッカーボード(checkerboard)分析を行うことによって得た。 Chemotaxis results were obtained by performing checkerboard (checkerboard) analysis for each combination of cell and growth factors. 材料セクションで記載した全ての細胞型に関し、ヘパリン(10U/ml)の添加の有り無しにて、0.1、1、10、100ng/mlの範囲の濃度を、FGF−1、FGF−2(ヘパリン無し)およびFGF−4に対して使用した。 For all cell types as described in the material section, in there without the addition of heparin (10 U / ml), the concentration in the range of 0.1,1,10,100ng / ml, FGF-1, FGF-2 ( It was used for no heparin) and FGF-4. 略言すると、培養をトリプシン処理し、5%CO 2湿潤チャンバー中、37℃のDMEM+0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma Chemical Co., St. Luois, MO)にほぼ1時間入れた。 When Briefly, cultures were trypsinized in a 5% CO 2 humid chamber, 37 ° C. of DMEM + 0.1% bovine serum albumin (BSA) (Sigma Chemical Co., St. Luois, MO) was placed approximately 1 hour. インサート当たり50μl中の2ないし2.5×10 5細胞を、24ウェルプレートの構成体の上方チャンバーに添加した。 2 to 2.5 × 10 5 cells in 50μl per insert was added to the upper chamber of the structure of a 24-well plate. 前記したごとくに処理を施した。 It was subjected to a treatment in as described above. アッセイは、5%CO 2湿潤チャンバー中、37℃ら4時間維持した。 Assay, in a 5% CO 2 humid chamber was maintained 37 ° C., et al 4 hours. テストした全ての組合せは三連で行った。 All of the combinations tested were performed in triplicate. 4時間の最後に、プレートをインキュベーターから取り出し、ミリセル−PCFインサートに含まれる染色プロトコルに従ってフィルターを染色した。 At the end of 4 hours, plates were removed from the incubator to stain the filter according to staining protocols included in Millicell -PCF insert. 簡単に述べると、該ミリセルl-PCFインサートの内部および外部を囲む流体を取り出した。 Briefly, it was removed fluid surrounding the inside and outside of the Millicell l-PCF inserts. 3%グルタルアルデヒド(Sigma Chemical Co., St. Louise, MO)を該インサートの内部および外部にほぼ20分間で添加した。 3% glutaraldehyde (Sigma Chemical Co., St. Louise, MO) was added at approximately 20 minutes inside and outside of the insert. 3.0%グルタルアルデヒドの除去に続き、0.5%トリトンX−100(EMScience, Cherry Hill, NJ)を5−7分で添加した。 Following removal of the 3.0% glutaraldehyde was added 0.5% Triton X-100 (EMScience, Cherry Hill, NJ) at 5-7 minutes. 0.5%トリトンX−100の除去に際し、フィシャーのヘマトキシリン溶液のギルの処方(Fisher's Hematoxylin Solution Gill's Formulation)(Fisher Scientific, Newark, DE)No. Upon 0.5% Triton X-100 removal, the formulation of Gill's hematoxylin solution of Fisher (Fisher's Hematoxylin Solution Gill's Formulation) (Fisher Scientific, Newark, DE) No. 1を約10分間で添加した。 It was added 1 in about 10 minutes. この溶液を流しつつある蒸留水中で約5分間洗浄した。 The solution was washed about 5 minutes in distilled water that is being shed. 綿棒を用いて、フィルターの上部を拭いて、移動しなかった細胞を除去した。 Using a cotton swab, wipe the top of the filter to remove cells that had not migrated. クリスタル・マウント(Crystal Mount) TM (Biomeda, Inc., Foster City, CA)溶液中のスライド上に面する下方スライドにフィルターを取り付け、フィルターの下面の細胞の数を自動的に数えるイメージ分析システム(Image Analysing System)を用いて、400倍および200倍の双方にて、スライド当たり10のランダムな視野を計数した。 Crystal Mount (Crystal Mount) TM (Biomeda, Inc., Foster City, CA) fitted with a filter downward slide facing on a slide in the solution, automatically counting image analysis system the number of cells in the lower surface of the filter ( Image Analysing System) with at both 400-fold and 200-fold, were counted random field of view of 10 per slide.
チェッカーボード分析要すれば、チェッカーボード分析を行って、ランダム移動、ならびに陽性および陰性走化性を測定した。 If desired Checkerboard analysis, performed Checkerboard analysis, random movement, as well as to measure the positive and negative chemotaxis. 成長因子を上方および/下方チャンバーに添加して、細胞がGF単独に向けて移動したか否か(走化性)、成長因子を上方または下方チャンバーに添加したにも拘わらず移動がランダムか否か(ケモキネシス)、または細胞移動が走化性グラジエントに抗するものか否か(陰性走化性)を観察した。 By adding growth factors to the upper and / lower chamber, the cells whether (chemotaxis) has moved towards the GF alone, whether moving despite the addition of growth factors upward or downward chamber random or or (chemokinesis), or cell migration was observed whether the (negative chemotaxis) as against the chemotactic gradient.
FGから放出されたFGFに対する細胞移動アッセイ走化性チャンバーおよび細胞を前記してごとくに用いた。 Cell migration assay chemotaxis chamber and cells to the released FGF from FG using your especially in the. 8mg/mlの局所用フィブリノーゲン複合体(Topical Fibrinogen Complex)(TFC,米国赤十字,Rockville, MD)の50μlを24ウェルプレートの底部に添加した。 8 mg / ml of topical fibrinogen complex (Topical Fibrinogen Complex) (TFC, American Red Cross, Rockville, MD) and the 50μl of adding to the bottom of 24-well plates. 終濃度10U/mlのテスト成長因子+/−ヘパリン(ヘパリンを含むFGF−1、FGF−4、FGF−2単独)の50μlをTFCに添加し、徹底的に混合した。 It was added 50μl of final concentration 10 U / ml of test growth factor +/- heparin (FGF-1 containing heparin, FGF-4, FGF-2 alone) to TFC, and mixed thoroughly. 10μlのウシトロンビン(Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL)を添加し、徹底的に混合した。 10μl of bovine thrombin (Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) was added and mixed thoroughly. 成分を室温で30分間ゲル化させた。 The components were allowed to gel for 30 minutes at room temperature. 下方および上方チャンバーの合計容量は0.5mlで、各々、DMEM+0.1%BSAを含んでいた。 The total capacity of the lower and upper chambers in 0.5 ml, respectively, contained DMEM + 0.1% BSA. TFCに添加されたFGF類の濃度を調整して、以下により決定される所望の総濃度とした。 By adjusting the concentration of the FGF compound added to the TFC, and a desired total concentration is determined by the following.
総FGF濃度= TFCに添加されたFGFのmg The total FGF Concentration = mg of FGF added to TFC
上方チャンバーの容量+ Upper chamber volume +
下方チャンバー中のFG&液体の容量アッセイは、5%CO 2湿潤チャンバー中、37℃でほぼ24時間行った。 Capacity assays FG & liquid in lower chamber, in a 5% CO 2 humid chamber was performed approximately 24 hours at 37 ° C.. 24時間の最後に、フィルターを取り出し、固定し、染色し、フィルターの下面の細胞数を前記したごとくに計数した。 At the end of 24 hours, the filters were removed, fixed, stained, and counted the number of cells the lower surface of the filter as described above.
結果線維芽細胞の移動の能力NIH 3T3線維芽細胞が種々のよく知られた走化性剤に向けて移動する能力を測定して、本アッセイで使用した細胞がその能力を保有したことを確認した。 Results The ability NIH 3T3 fibroblasts migration of fibroblasts by measuring the ability to move towards various well known chemotactic agents, confirm that the cells used were retains its ability in this assay did. フィブロネクチンは、NIH 3T3およびHDF類の双方でテストした最も効果的な走化性剤であり、20μg/mlで最大応答が起こった(図31、表7)。 Fibronectin is the most effective chemotactic agent tested for both NIH 3T3 and HDF such, maximum response occurred in 20 [mu] g / ml (Figure 31, Table 7). しかる後、20μg/mlのフィブロネクチンを移動の陽性対照として用いた。 Then, using a 20 [mu] g / ml of fibronectin as a positive control of the movement.
FGF−1に向けてのNIH 3T3線維芽細胞の走化性FGF−1によるNIH 3T3線維芽細胞の移動の最大刺激は、10U/mlのヘパリンの存在下、10ng/mlで観察された。 Maximum stimulation of migration of NIH 3T3 fibroblasts by chemotactic FGF-1 in NIH 3T3 fibroblasts toward FGF-1 in the presence of 10 U / ml of heparin, was observed at 10 ng / ml. チェッカーボード分析は、FGF−1がNIN 3T3細胞を走化させることを明らかとした(表8)。 Checkerboard analysis, FGF-1 has revealed that for chemotaxis of NIN 3T3 cells (Table 8).
FGF−2に向けてのNIH 3T3線維芽細胞の走化性FGF−2によるNIH 3T3線維芽細胞の移動の最大刺激は、FGF−2の1ng/mlで観察された(図33)。 Maximum stimulation of migration of NIH 3T3 fibroblasts by chemotaxis FGF-2 of NIH 3T3 fibroblasts toward FGF-2 was observed at 1 ng / ml of FGF-2 (Figure 33). チェッカーボード分析は、FGF−2がNIH 3T3細胞を走化させることを示した(データは示さず)。 Checkerboard analysis, FGF-2 has been shown to chemotactic the NIH 3T3 cells (data not shown).
FGF−4に向けてのNIH 3T3線維芽細胞の走化性FGF−4によるNIH 3T3線維芽細胞の移動の最大刺激は、10ng/mlで観察された(図34)。 Maximum stimulation of migration of NIH 3T3 fibroblasts by chemotaxis FGF-4 of the NIH 3T3 fibroblasts toward FGF-4 was observed at 10 ng / ml (Figure 34). チェッカーボード分析は、FGF−4がNIH 3T3細胞を走化させることを明らかとした(データは示さず)。 Checkerboard analysis, FGF-4 has revealed that for chemotaxis of NIH 3T3 cells (data not shown).
FGF−1に向けてのHDF類の走化性FGF−1によるHDF類の移動の最大刺激は、10ng/mlで観察された(図35)。 Maximum stimulation of migration of HDF acids by chemotactic FGF-1 of HDF class towards FGF-1 was observed at 10 ng / ml (Figure 35). チェッカーボード分析は、FGF−1がHDF類を走化させることを明らかとした(表9)。 Checkerboard analysis, FGF-1 has revealed that for chemotaxis of HDF acids (Table 9).
FGF−2に向けてのHDF類の走化性FGF−2によるHDF類の移動の最大刺激は、10ng/mlで観察された(図36)。 Maximum stimulation of migration of HDF acids by chemotaxis FGF-2 of HDF such Towards FGF-2 was observed at 10 ng / ml (Figure 36). チェッカーボード分析はFGF−2がHDF類を走化させることを明らかとした(データは示さず)。 Checkerboard analysis was revealed that FGF-2 is to chemotactic an HDF acids (data not shown).
FGF−4に向けてのHDF類の走化性FGF−4によるHDF類の移動の最大刺激は10ng/mlで観察された(図37)。 Maximum stimulation of migration of HDF acids by chemotaxis FGF-4 of HDF such Towards FGF-4 was observed at 10 ng / ml (Figure 37). チェッカーボード分析は、FGF−4がHDF類を走化させることを示した(データは示さず)。 Checkerboard analysis, FGF-4 was shown to chemotactic an HDF acids (data not shown).
FGに取り込んだFGF−1、−2および−4へのヒト皮膚線維芽細胞移動FGから放出されたFGFに対する最大移動応答は、取り込まれたFGにおけるFGF−4の全濃度が1ng/mlで誘導された(図38)。 FGF-1 taken in FG, the maximum travel in response to human dermal fibroblasts movement released from FG FGF to -2 and -4, induced at total concentration of FGF-4 in the captured FG is 1 ng / ml It is (Figure 38). ピーク走化性応答を誘導したFGF−2の濃度は0.01mg/mlであったことを除き、同様の結果が、FGF−1およびFGF−2をFGに取り込んだ場合(データは示さず)に見い出された。 When the concentration of FGF-2 induced the peak chemotactic response to except that was 0.01 mg / ml, similar results were captured FGF-1 and FGF-2 in the FG (data not shown) It was found in.
考察FGF類はHDF類において大きな走化性応答を生じた。 Discussion FGF acids resulted in significant chemotactic response in HDF acids. HDF類で行った各走化性アッセイでは、陰性対照および最大移動応答を誘導したFGFの濃度の間に非常に良好な区別が得られた(各々、FGF−1、−2および−5に応答して18、12および10倍)。 In each chemotaxis assay performed with HDF acids, very good distinction between the concentration of FGF which induced the negative and the maximum movement responses were obtained (each, FGF-1, in response to -2 and -5 18,12 and 10-fold).
成長因子による走化性の刺激は、恐らくは、HDF類と比較してNIH 3T3細胞の利用可能なストック培養の高継代数のため、NIH 3T3細胞ではHDF類ほど高くはなかった。 Stimulation of chemotaxis by growth factors, possibly because of the high passage number of the available stock cultures of the NIH 3T3 cells as compared to HDF acids, in NIH 3T3 cells were not high as HDF acids.
FGF−1、FGF−2およびFGF−4は、線維芽細胞走化性の優れた刺激剤であることが判明した。 FGF-1, FGF-2 and FGF-4 were found to be excellent stimulators of fibroblast chemotaxis. 前記成長因子のうちの1種またはそれらの組合せによる線維芽細胞の指向された移動の結果、損傷部位に線維芽細胞を存在させることができ、それにより、線維増殖ならびにコラーゲンおよび細胞外マトリックスの生成に導かれた。 The growth of one or fibroblasts with their combination of factors directed the movement result, there can be a fibroblast injury site, thereby generating the fibroplasia and collagen and extracellular matrix It led to. かくして、そのよく認識された血管形成特性の他に、FGF類は、創傷治癒で役割を演じ、単独で、あるいはPDGF、IGF−I、TGF−βおよび/または他の因子と組み合わせて作用する。 Thus, in addition to its well-recognized angiogenic properties, FGF acids may play a role in wound healing, either alone or PDGF, acting in combination with IGF-I, TGF-β and / or other factors.
創傷治癒を速めるためのFGF類の使用についての従前の研究は、有意な結果を生じていない(Carterら,1988)。 Previous studies on the use of FGF class to speed wound healing have not produced significant results (Carter et al., 1988). これは、最大応答のためのイン・ビボでの因子に対する細胞の延長された暴露の要件によるものであろう(Prestaら,Cell Regul. 2:719-726(1991)およびRusnatiら,J. Cell. Physiol. 154:152-161(1993))。 This may be due to prolonged exposure requirements of the cells to factors in vivo for the maximum response (Presta et al., Cell Regul 2:.. 719-726 (1991) and Rusnati et al., J Cell . Physiol 154:. 152-161 (1993)). 不運なことに、治癒過程に干渉しない条件下でそのように長期間、成長因子を創傷に送達するのは困難である。 Unfortunately, such a long time under conditions that do not interfere with the healing process, it is difficult to deliver growth factors to the wound.
FGFをFGに取り込む本発明は、細胞のFGF類への延長された暴露を可能とし、創傷に適用できる。 Capturing FGF to FG invention enables a prolonged exposure to cells of the FGF compound can be applied to the wound. 得られたフィブリンコーティングは、成長因子を創傷部位に直接送達しつつ、組織損傷に対する天然応答に似るものである。 The resulting fibrin coating, while delivering the growth factor directly to the wound site, but that is similar to the natural response to tissue injury. 本発明者らるよる従前の研究では、FGF−1を含有するFGを用いて、人工血管移植片を内張りした(本明細書実施例8)。 The present inventors Lal According previous studies, using the FG containing FGF-1, lined with artificial vascular grafts (herein Example 8). これらの移植片をウサギの血管に入れると、FGF−1は28日間まで放出された。 Taking these graft vessels in rabbit, FGF-1 was released until 28 days. イヌ移植片に関するさらなる実験において、FGF−1を移植片壁に取り込んだ効果は、同一期間内における人工移植片の全内皮形成であった(Greslerら,Surgery 112:244-255(1992))。 In further experiments on dogs grafts, the effect of incorporating FGF-1 to the graft wall, and a total endothelialization of the artificial grafts within the same period (Gresler et al, Surgery 112: 244-255 (1992)). かくして、この形態の適用は、イン・ビボにて高い生物学的効果を誘導する。 Thus, application of this embodiment induces a high biological effect in vivo. 線維芽細胞はFGから放出されたFGFに向けて誘因される。 Fibroblasts are incentives towards FGF released from FG. この特性はGF−補足TSで創傷を治療するのに有用であろう。 This property may be useful in treating wounds with GF- supplemented TS.
実施例18 Example 18
血管形成性物質を送達するためのTSを用いる部位特異的血管形成本態様は、体内で制御された方法にて新しい血管の指向された形成を可能とする。 Site-specific angiogenesis present embodiment using the TS for delivering angiogenic substance allows for directed a formation of new blood vessels in a controlled manner in the body. 本態様では、TSは、線維芽細胞成長因子−1(FGF−1)のごとき血管形成性物質を、補足TSから放出されるその濃度が血管形成を誘導するのに効果的である量で含有しそれを放出する。 In this embodiment, TS is contained in an amount which is effective in the angiogenic substance such as fibroblast growth factor -1 (FGF-1), its concentration released from supplemented TS to induce angiogenesis and releasing it.
本態様は、心臓、脳および筋肉組織、ならびに網膜のごとき適当な血液供給が欠乏した身体領域に、制御された方法で血管を再形成するのに使用される。 This aspect, heart, brain and muscle tissue, and the body region appropriate blood supply has been depleted, such as the retina are used to reform the vessel in a controlled manner. 本態様は、移植された器官または再付着された四肢への循環を回復または改善するのに使用される。 This embodiment is used the circulation to implanted organs or re-attached limb to restore or improve. 本態様は、人工器官または小器官の生成、遺伝子治療でまたは遺伝子治療の標的として使用する細胞の送達および/または局所化および/または栄養付与のために、組織増大用の細胞の栄養付与および/または局所化のために、血管ネットワークまたは「血管床」を生成するのに使用できる。 This embodiment is the generation of artificial organs or organelles, for the delivery of cells to be used as a gene therapy or gene therapy targeting and / or local and / or nutritional granted, for tissue augmentation cell nutritive imparting and / or for localization can be used to generate a vascular network or "vascular bed". また、本態様は、血管形成または下層にある器官の機能を危うくしかねない外来身体または他の過剰な炎症反応を誘導し得るデバイスまたは物質の移植の必要性を排除する。 Further, this embodiment eliminates the need for implantation of a device or substance capable of inducing a foreign body or other excessive inflammatory reaction could compromise the function of the organ in angiogenesis or lower.
本発明は、適当な濃度のFGF−1のごとき血管形成性物質を入れた、フィブリノーゲンおよび/またはコラーゲンを含むまたは含まない(フィブリンの形成に適した)フイブリノーゲンの処方からなる。 The present invention was placed an appropriate concentration of FGF-1 in such angiogenic substances, with or without fibrinogen and / or collagen (suitable for the formation of fibrin) consisting formulation fibrinogen. また、該フィブリノーゲンはトロンビンの蛋白分解活性に対して保護するための安定化剤を含有することもできる。 Furthermore, the fibrinogen may also contain stabilizers to protect against proteolytic activity of thrombin. FGF−1の場合、ヘパリン硫酸(1−1000U/ml)を、1ng/mlないし1mg/mlの濃度範囲で安定化剤として使用できる。 For FGF-1, heparin sulfate (1-1000U / ml), to not 1 ng / ml can be used as a stabilizing agent in a concentration range of 1 mg / ml. 別法として、トロンビン、カルシウムまたは水成分に、適当な濃度で、血管形成性物質を含有させる。 Alternatively, thrombin, calcium or water component, in a suitable concentration, to contain angiogenic substance. 次いで、この処方をトロンビンと混合し、所望の部位を結ぶ線状にて、あるいは単一の部位に、身体内に迅速に適用する。 Then the formulation was mixed with thrombin at a linear connecting the desired sites, or to a single site, rapidly applied within the body. 次いで、フィブリノーゲン−トロンビン混合物は重合してFGを形成する。 Then, the fibrinogen - thrombin mixture forms a FG by polymerization. FGF−1または他の血管形成性物質は、遊離形態としてあるいは安定化剤またはマトリックスのもう1つの成分に結合して、FGマトリックスに捕らえられたままとなる。 FGF-1 or other angiogenic substance, bind to another component of the free form or stabilizing or matrix, remain trapped in FG matrix. 1の態様において、TS中のFGF−1の濃度は0.1ng/mlないし1mg/ml、より好ましくは1ng/mlないし100μg/ml、最も好ましくは100ng/mlないし10μg/mlとすべきである。 In one embodiment, FGF-1 concentration in the TS should be between 0.1 ng / ml to 1 mg / ml, more preferably 1 ng / ml to 100 [mu] g / ml, and most preferably to no 100ng / ml 10μg / ml . FGF−1または他の血管形成性物質は移植されたFGの身体内での血管形成を誘導する。 FGF-1 or other angiogenic substance to induce angiogenesis in the body of FG implanted.
実施例19 Example 19
部位特異的軟骨誘導本態様は、身体内での、新しい軟骨の制御された生成ならびに損傷した軟骨の導かれた再生を可能とする。 Site-specific chondroinductive present embodiment, in the body, to enable playback Led controlled product and damaged cartilage new cartilage. 本態様では、TSは、軟骨誘導因子−Aおよび/または−B(各々、TGF−BおよびTGF−B2としても知られている、各々、CIF−AおよびCIF−B)のごとき軟骨促進因子(類)および/または類骨誘導因子(OIF)のごときもう1つの因子(類)を、補足TSから放出される誘導因子(類)の濃度が軟骨形成を誘導するのに効果的である量にて、含有しそれを送達する。 In this embodiment, TS is the cartilage inducing factor -A and / or -B (each, also known as TGF-B and TGF-B2, respectively, CIF-A and CIF-B), such as cartilage promoting factor ( another factor such as s) and / or osteoid-inducing factor (OIF) (s), the amount concentration of inducer (s) is effective to induce cartilage formation released from supplemented TS Te, the content and the delivery of it. 1の態様において、誘導因子類の濃度は、0.1ng/mlないし1mg/ml、より好ましくは1ng/mlないし500ng/ml、最も好ましくは100ないし250ng/mlとすべきである。 In one embodiment, the concentration of the inducing factors, is, 0.1 ng / ml to 1 mg / ml, more preferably 1 ng / ml to 500 ng / ml, and most preferably should be between 100 to 250 ng / ml. また、本態様は、TS中に、抗生物質のごとき薬物類、およびEGF、PDGFおよびbFGFのごとき他の成長因子類を含有することもできる。 The present embodiment can in TS, such as drugs such antibiotics, and EGF, also contain other growth factors, such as PDGF and bFGF. 軟骨誘導物質は、TSを調製するのに使用されるフィブリノーゲンまたはカルシウムまたは水成分(類)に適当な濃度で含有させる。 Cartilage inducer, is contained in a suitable concentration fibrinogen or calcium or water component (s) used to prepare the TS.
補足TSは、移植に先立って所望の最終軟骨形態に予め形状付与しておくか、あるいはTSを混合し重合させるときに、液体形態で受容者の身体に移植することができる。 Supplemental TS can be implanted either in advance shaping to the desired final cartilage form prior to implantation, or when the mixing to polymerize the TS, the recipient's body in liquid form. 次いで、得られた形態を望むように細工して、必要な軟骨の所要形状を得る。 Then crafted as desired resulting form, to obtain the desired shape of the required cartilage. また、軟骨誘導TS(CI−TS)混合物を用いて通常の移植体をプレコートすることもでき、結果は生体軟骨のコーティングを持つ通常の移植体となる。 It is also possible to precoat a conventional implant with a cartilage derived TS (CI-TS) mixture, the result is normal implant having a coating of normal cartilage.
前記したいずれかの技術を用い、次いで、CI−TSを受容者の体内に移植する。 Using any of the techniques described above, then implanting the CI-TS to the body of the recipient. この移植は異所性または正常位性とすることができる。 This port can be an ectopic or normal position of. 適当な間隔の後、元のCI−TS移植体の形態を持つ生体軟骨によってCI−TSは置き換えられる。 After a suitable interval, CI-TS by normal cartilage with the form of the original CI-TS implant is replaced.
かかる移植体を用いて、損傷したまたは失われた軟骨を置き換え、あるいは人工移植体の組織一体性および/または機能を改良することができる。 Using such transplants, replace damaged or lost cartilage, or to improve the tissue integrity and / or function of an artificial implant. かかる使用の例は、鼻または耳組織の置き換えまたは再構築、イン・ビボで成長させた骨移植体上の機能的関節表面の生成、または人工移植体上の同様の表面を含む。 Examples of such use include replacement or reconstruction of nasal or ear tissue, the generation of functional articular surfaces on bone graft material grown in vivo, or a similar surface on an artificial implant. また、関節に対して新しく平滑な軟骨を生じさせるためにCI−TSを用いて、慢性関節リウマチのごとき疾患によって損傷した軟骨の修復を達成することもできる。 Further, by using the CI-TS to produce a new smooth cartilage against the joint, it is also possible to achieve the repair of cartilage damaged by such diseases as rheumatoid arthritis. プラスチック/再構築外科処置におけるスペース充填適用に意図した移植体は、組織一体性を促進し、また外来性身体反応を低下させるために、CI−TSから形成でき、あるいはCI−TSをコートすることができる。 Transplant intended to space filling applications in Plastic / reconstruction surgery may promote tissue integrity, also in order to reduce the foreign body reaction, it can be formed from CI-TS, or coating a CI-TS can.
現在の技術では、軟骨の導かれた再生は不可能であるので、本発明は進んでいる。 In the current art, the playback Led cartilage is impossible, the present invention is proceeding. 何故ならば、本発明は、身体の天然に造りを十分に模擬する必要がある軟骨組織の再生を可能とするからである。 This is because, the present invention is because to allow the regeneration of cartilage tissue where there is a need to fully simulate the build in natural body. この結果、整形外科適用および他の適用にための、改良された関節修復、人工関節および他の移植体が可能となる。 As a result, for orthopedic and other applications, improved joint repair, it allows artificial joints and other implants are.
例えば、本態様は、外傷による、改良された整形外科移植体または改良されたプラスチック/再構築移植体を製造するために:先天的または病理学的に損傷または機能不全の軟骨につき関節修復のために:それらの組織一体性を増加させ、外来性身体反応を低下させるためにペースメーター移植体およびワイア類のコーティングを製造するために使用できる。 For example, this aspect is due to trauma, to produce improved orthopedic implants or improved plastic / reconstruction implant: for joint repair per cartilage congenital or pathologically damaged or dysfunctional to: increase their tissue integrity can be used to produce coatings pace meter graft and wire acids to reduce the foreign body reaction.
実施例20 Example 20
自己含有TS創傷包帯剤本態様は自己含有TS創傷包帯剤または包帯であり、これは、FGのトロンビンおよびフィブリノーゲン両成分を含有する。 Self contained TS wound dressing this aspect is self contained TS wound dressing, or bandage, which contains thrombin and fibrinogen both components of the FG. カルシウムはトロンビンおよび/またはフィブリノーゲン成分(類)に含有させる。 Calcium is contained in the thrombin and / or fibrinogen component (s). トロンビンまたはフィブリノーゲン成分のいずれかまたは双方には、FGFまたはbFGFのごとき成長因子(類)、あるいは感染を阻害でき、創傷治癒を促進できおよび/または瘢痕形成を阻害できる鎮痛剤、抗生物質または他の薬物(類)のごとき薬物(類)を補足できるが、必ずしもそうする必要はない。 In either or both of the thrombin or fibrinogen components, growth factors such as FGF or bFGF (s), or can inhibit infection, analgesic agents that can inhibit possible and / or scarring promote wound healing, an antibiotic or other drugs can supplement (s) of such drug (s), but it is not always necessary to do so. 補足は、意図した目的に効果的なように、例えば抗生物質が微生物の増殖を阻害し、鎮痛剤が苦痛を和らげるようなTS中濃度である。 Supplement, effective manner for the intended purpose, for example, antibiotics inhibit the growth of microorganisms, a TS concentration as analgesics relieve pain.
トロンビンおよびフィブリノーゲンは、不浸透性膜によって相互に離しておき、その対は膜のごとき他のもので覆う。 Thrombin and fibrinogen, keep mutually separated by an impermeable membrane, the pair covered by those such as another film. トロンビンおよびフィブリノーゲンは、速蒸発性ゲル(例えば、メチルセルロース/アルコール/水)に含有させる。 Thrombin and fibrinogen, is contained in the quick evaporation gel (e.g., methylcellulose / alcohol / water). 包帯は表面にコートできる。 The dressing can be coated on the surface. すなわち、ゲルパッドが使用の間に所定の位置に止まることを保証するためにゲルと接触させておくことができる(図39参照)。 That may have been in contact with the gel in order to ensure that stops in a predetermined position between the gel pad is used (see Figure 39).
操作において、2成分を離しておく膜を取り除き、2成分を混合させる。 In operation, remove the film Separated two components, mixing the two components. 次いで、外方膜を取り除き、包帯を創傷部位に適用する。 Then removed outer membrane is applied dressing to the wound site. トロンビンおよびフィブリノーゲン調製物の他の成分類は、丁度それらがFSのいずれかの適用でそうするように、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を引き起こす。 Other ingredients of the thrombin and fibrinogen preparations, just as they do so in any of the application of FS, causing the conversion of fibrinogen to fibrin. この結果、血液および流体の創傷からの喪失が自然に阻止され、感染に対する自然のバリアーが確立される。 As a result, the loss from the wound of the blood and fluid is naturally prevented, natural barrier to infection is established.
同様の態様において、トロンビン成分とトロンビンゲルおよびフィブリノーゲンゲルを分離するプラスチックフィルムとを省くこともできる。 In a similar manner, it may be omitted and the plastic film separating the Thrombin component and thrombin gels and fibrinogen gel. 従前にはトロンビンゲル中に入れたカルシウムは所望ならばフィブリノーゲンゲルに含ませることができ、あるいは含ませなくてもよい。 Calcium placed in the thrombin gel previously can be included in the fibrinogen gel if desired, or may not be included. 操作において、外方不通気性プラスチックフィルムを取り除き、前記したごとくに包帯を創傷部位に直接適用する。 In operation, removing the outer impermeable plastic film, a bandage as described above is applied directly to the wound site. トロンビンおよびカルシウムは当然創傷部位に存在し、次いで、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を誘導し、前記したごとく血液および流体の創傷からの喪失を阻止する。 Thrombin and calcium are present naturally wound site, then induce the conversion of fibrinogen to fibrin, to prevent the loss from the blood and fluids wounds as above described. 本態様は製造が簡便で、安価で容易であるという利点を有する。 This aspect manufacture simple, has the advantage of being inexpensive and readily. しかしながら、患者の創傷は不十分なトロンビンしか有しないという状況があり得る。 However, patients wound there may be situations where only have insufficient thrombin. それらの場合には、本発明の先の態様を使用すべきである。 In those cases, it should be used ahead of the aspects of the present invention.
本態様は現行の技術よりも進んでいる。 This aspect is more advanced than the current state of the art. というのは、成分の可溶化および混合に関する時間的遅延なくしてTSの創傷への迅速な適用を可能とするからである。 That is given because allows rapid application to the TS of the wound without the time delay for solubilization and mixing of the components. また、それは、操作するのに技術的知識または技量を要しない。 Moreover, it does not require technical knowledge or skill to operate. これらの特徴は、兵士用の外傷パック、救助労働者、救急/医療補助員チーム、消防士のごとき野外適用においての使用、一般公衆のための応急キットにおいての使用、および病院の緊急ルーム員による使用を理想的とする。 These features, trauma packs for soldiers, rescue workers, emergency / medical assistant team, use of in outdoor applications, such as firefighters, use of the emergency kit for the general public, and the hospital by the emergency room staff and ideal for use. 小バージョンも一般公衆による使用に有用であり得る。 It may be useful to be used by the general public small version.
実施例21 Example 21
生体材料用の表面コーティングとしての補足TS Supplementary TS as a surface coating for biomaterials
本態様は、動物の身体に移植すべき整形外科デバイスおよび他の生体材料の表面用コーティングとしての補足TSを使用する。 This embodiment uses the supplementary TS as a surface coating of orthopedic devices and other biomaterials to be implanted in the animal's body. これらのデバイスの例は尿カテーテル、縫合、血管補綴、眼内レンズ、コンタクトレンズ、心臓弁、肩/肘/臀部/膝置換デバイス、全人工心臓である。 Examples of these devices are urinary catheters, sutures, vascular prostheses, intraocular lenses, contact lenses, heart valves, shoulder / elbow / hip / knee replacement devices, total artificial heart. 不運なことに、これらの生体材料は細菌の接着およびコロニー化のための部位となり、これは結局は動物の生命を危険とする臨床的感染に導きかねない。 Unfortunately, these biomaterials may become sites for attachment and colonization of bacteria, which eventually can lead to clinical infection and risk of animal life. この問題を最小化するために、生体材料を補足TSでコートする。 To minimize this problem, coated biomaterials Supplemental TS.
本態様では、TSを、成長因子(類);抗生物質のごとき薬物(類);BMP;および/または培養細胞等で補足できる。 In this embodiment, the TS, growth factor (s); such antibiotic drug (s); it supplemented with and / or cultured cells; BMP. TSに取り込むことができる抗生物質の例は、限定されるものではないが、ペニシリン類;セファロスポリン類;テトラサイクリン類;クロラムフェニコール類;メトロニダゾール類;およびアミノグリコシド類を含む。 Examples of antibiotics that can be incorporated into the TS include, but are not limited to, penicillins, including and aminoglycosides; cephalosporins; tetracyclines; chloramphenicol like; metronidazole acids. TSに取り込むことができる成長因子の例は、限定されるものではないが、FGF、PDGF、TGF−βを含む。 Examples of growth factors that can be incorporated into the TS include, but are not limited to, FGF, PDGF, and TGF-beta. TSに取り込むことができるBMP類の例はBMP1ないし8を含む。 Examples of BMP class that can be incorporated into the TS include a BMP1 to 8. DBMをTSに添加することもできる。 It can also be added to the DBM to TS. TSに取り込むことができる培養細胞の例は、限定されるものではないが、内皮細胞、骨芽細胞、線維芽細胞等を含む。 Examples of cultured cells which can be incorporated into the TS include, but are not limited to, endothelial cells, osteoblasts, fibroblasts and the like.
補足物(類)は、トロンビン、フィブリノーゲン、カルシウムまたは水成分(類)に含有させることができる。 Supplement (s) can be contained in the thrombin, fibrinogen, calcium or water component (s). TS中の補足物の濃度は、その意図する目的に効果的であるように適当なものとする。 The concentration of complement in the TS is a suitable value so as to be effective for its intended purpose. 例えば、抗生物質は生体材料上の微生物の増殖を阻止し、成長因子はTS中および/または生体材料の表面の所望の細胞型(類)の増殖を誘導するようなものとする。 For example, antibiotics and prevent the growth of microorganisms on biomaterials, growth factors and such as to induce proliferation of desired cell types TS in and / or on the surface of biomaterials (s).
本発明は、チタンまたはチタン合金デバイス(例えば、固定プレート、肩/肘/臀部/膝置換デバイス、骨一体化歯科インプラント等)、固体シリコーン製品(例えば、Silastic鼻移植体、液体および/またはゲルシリコーン製品(例えば、乳房移植体および精巣移植体)、およびモノフィラメント、繊維集合体(例えば、綿、紙、不織布)、フィルム、スポンジ、バッグ等のごとき種々の形態であってもよい、創傷部位において通常の材料として使用される天然または合成ポリマーを含む、現行の生体材料製品についての改良である。 The present invention, titanium or titanium alloy devices (e.g., fixed plate, shoulder / elbow / hip / knee replacement devices, osseointegration of dental implants and the like), solid silicone products (e.g., Silastic nasal implants, liquid and / or gel silicone products (e.g., breast implant and testis transplant), and monofilament, fiber assembly (e.g., cotton, paper, nonwoven fabric), a film, a sponge, may be in various forms such as such as bags, usually at the wound site including natural or synthetic polymers are used as materials, which is an improvement of existing biomaterial products.
FGは3成分:フィブリノーゲン(例えば、TFC):およびトロンビン(これらは共に凍結乾燥形態であってもよい);ならびにカルシウムから製造される。 FG 3 components: fibrinogen (for example, TFC): and thrombin (or may be they both freeze-dried form); and is produced from calcium. 凍結乾燥フィブリノーゲンは滅菌水で復元され、他方、トロンビン成分は塩化カルシウム溶液で復元される。 Lyophilized fibrinogen is reconstituted with sterile water, while the thrombin component is reconstituted with calcium chloride solution. 補足物は混合に先立って3成分のいずれかに添加することができる。 Supplement may be added to any of the three components prior to mixing. カルシウムを含有する適当な容量のフィブリノーゲンおよびトロンビンを混合してFGを得る。 Get FG by mixing fibrinogen and thrombin suitable volume containing calcium. 次いで、例えば、噴霧、塗布等によって、FGをそのコーティングとして生体材料表面に適用する。 Then, for example, by spraying, coating or the like, applied to the biomaterial surface FG as the coating. 別法として、移植体をFGが依然液体である間にそれに浸漬する。 Alternatively, immersing it grafts between FG is still liquid. 補足物は、FGが生体材料表面にコートされる前または後にFGに添加することができる。 Supplements can FG is added to the FG before or after being coated on the biomaterial surface. 例えば、FG−被覆移植体を、抗生物質がTSに拡散するような時間、抗生物質溶液に浸漬する。 For example, FG- coated implant, antibiotics time as to diffuse the TS, is immersed in an antibiotic solution. もう1つの例はTSでのデバイスのコーティングであり、その後、培養細胞をフィブリンコーティングに接種する。 Another example is the coating of a device with TS, then inoculated with cultured cells to fibrin coating. 動物に移植される生体材料の表面を補足TSでコーティングすると、細菌の生体材料への接着の阻止;生体材料に接着した細菌の増殖の阻止;局所免疫刺激および/または正規化;創傷治癒の促進;および周囲組織への生体材料の移植の促進を含めた種々の目的を達成するであろう。 When coating the surface of the biomaterial to be implanted in animals supplemented TS, prevention of adhesion of bacteria to biomaterials; promotion of wound healing; inhibition of adhered bacterial growth in the biological material; local immune stimulation and / or normalization ; and it would achieve a variety of purposes, including facilitating the implantation of the biomaterial to the surrounding tissue.
実施例22 Example 22
さらなる自己含有TS創傷包帯剤TS類は、FGの必要なトロンビンおよびフィブリノーゲン成分を含有する、自己含有創傷包帯剤、またはフィブリンシーラント包帯として処方できる。 A further self-contained TS wound dressing TS class contains the necessary thrombin and fibrinogen components of the FG, it can be formulated as a self-containing wound dressings, or fibrin sealant bandage. 自己含有包帯剤または包帯は使用が容易で、操作するのに進歩した技術的知識または技量を必要としない。 Self-containing dressing or bandage is easy to use and does not require technical knowledge or skill advanced to operate.
フィブリンシーラント包帯本発明者らは、患者における創傷組織へ組織シール性組成物を適用するためのフィブリンシーラント包帯を調製し、ここに、該包帯は、順に:(1)閉塞性裏打ち;(2)該裏打ちの表面に面する創傷上の薬理学的に許容される接着剤層;および(3)接着剤層または裏打ちの表面に面する創傷に付着させた、有効量の(a)乾燥したウイルス不活化生成組織フィブリノーゲン複合体、(b)乾燥したウイルス不活化トロンビンの組合せ、および(c)塩化カルシウムよりなる乾燥物質の層を包含する。 Fibrin sealant bandage the present inventors have prepared the fibrin sealant bandage for applying tissue sealing composition to the wound tissue in a patient, wherein, the dressing, in turn: (1) occlusive backing; (2) said backing wound on pharmacologically acceptable adhesive layer facing the surface; and (3) was attached to the wound facing surface of the adhesive layer or backing, an effective amount of (a) dry virus It encompasses inactivated generating tissue fibrinogen complex, a layer of (b) dry virus inactivation thrombin combination, and (c) consisting of calcium chloride dry material. 取り外し可能な耐水性軟プラスチック保護フィルムを乾燥物質の層および安定な貯蔵目的の包帯の露出した接着剤表面に置いた。 A removable waterproof soft plastic protective film was placed on the exposed adhesive surface of the dressing layer and stable storage purposes dry matter. 操作において、耐水性保護フィルムを、創傷組織上への包帯の適用に先立って除去する。 In operation, the water-resistant protective film is removed prior to application of the dressing onto the wound tissue. 該包帯を、TSが標的領域上で形成されるまで圧力をかけて適用した。 The dressing, TS is applied under pressure until the formation on the target area.
フィブリンシーラント包帯は、30cm 2の合計面積を有する、6cm×5cmの寸法の通常の接着性シリコーンパッチを用いてテストした。 Fibrin sealant bandage has a total area of 30 cm 2, was tested using a conventional adhesive silicone patch dimensions 6 cm × 5 cm. 水和に際して、TSによって形成されるフィブリンの合計容量が15cc(30cm 2 ×1/2cm)に等しくなるように、乾燥成分を接着性パッチ上に1/2cmの深さまで置いた。 Upon hydration, the total volume of fibrin which is formed by the TS is to be equal to 15cc (30cm 2 × 1 / 2cm ), was placed dry ingredients to a depth of 1/2 cm on adhesive patches. 使用した物質は:前記した局所用フィブリノーゲン複合体(TFC)360mg;やはり前記したほぼ340Uのトロンビン:および88mgのCaCl 2 (40mM)であった。 Substances used were:;: was and 88mg CaCl 2 (40mM) of topical fibrinogen complex described above (TFC) 360 mg again substantially 340U thrombin described above.
乾燥物質層のための包帯の結合能力は、部分的には、均一に粉砕した微細な粉末としての乾燥物質の適用に依存していた。 Binding capacity of the dressing to the dry material layer, in part, it relied on uniform application of dry substance as a fine powder pulverized. 塩化カルシウムは粉砕して微細粉末とし、微細に粉砕した凍結乾燥TFCおよびトロンビンと混合し、粉末としてシリコーンパッチの接着剤層に適用し、接着させてフィブリンシーラントパッチを形成させた。 A fine calcium chloride is milled powder was mixed with lyophilized TFC and thrombin were finely ground powder as was applied to the adhesive layer of the silicone patch was allowed to adhere to form a fibrin sealant patch. フィブリンシーラント包帯のさらなるバージョンにおいて、乾燥物質を混合し、一緒に粉砕した。 In a further version of the fibrin sealant bandage, the dried material was mixed and ground together.
圧力をかけると、有意により多い微粉砕粉末がシリコーンパッチに接着した。 When applying pressure, significantly more finely ground powder is adhered to the silicone patch. しかしながら、フィブリンシーラント包帯に適用した乾燥物質の量は定量可能であった。 However, the amount of dry matter applied to fibrin sealant bandage was quantifiable. 例えば、シリコーンパッチ裏打ちを用いる1の適用において、乾燥フィブリン成分で完全に覆われると、領域2×1cm 2は重量で30mgだけ増加した。 For example, in the application of 1 using a silicone patch backing, if completely covered with dry fibrin component, region 2 × 1 cm 2 it was increased by 30mg in weight. この測定値を、15mg/cm 2の裏打ち上に覆われた面積当たりの乾燥フィブリン成分質量に外挿した。 The measurements were extrapolated to dry fibrin component mass per area covered on the backing of 15 mg / cm 2.
フィブリンシーラントパッチは、該フィブリンシーラント成分をスポンジの表面に隣接するように、組織創傷の見本として湿ったセルローススポンジに適用した。 Fibrin sealant patch, the fibrin sealant components to be adjacent to the surface of the sponge was applied to moist cellulose sponge as a sample of tissue wounds. 該スポンジは室温の蒸留水で従前に湿らせておいたものである。 The sponge is one which has been moistened previously with distilled water at room temperature.
フィブリンの形成は適用の30秒以内に進行し始めた。 The formation of a fibrin began to progress within 30 seconds of application. 適用から3分以内に、フィブリンゲルが形成され、組織シール性フィブリン血餅をスポンジに付着させた。 Applied within 3 minutes from the fibrin gel is formed and allowed to attach tissue sealing fibrin clot sponge. 内因的に利用可能な液体によって水和されたこの第1のパッチはFSB#1と標識した。 The first patch is hydrated endogenously available liquid was labeled with FSB # 1.
従前の工程を反復して、パッチFSB#2ないしFSB#5を調製した。 By repeating the previous step, to patch FSB # 2 not to prepare the FSB # 5. しかしながら、フィブリンシーラント包帯を湿ったセルローススポンジに対して置くに先立って、8mlの暖かいPBSを、パッチに付着した乾燥フィブリン成分に適用した。 However, prior to placing against damp cellulose sponge fibrin sealant bandage, warm PBS of 8 ml, were applied to the dry fibrin component adhering to the patch. 適用したパッチFSB#2ないしFSB#5のインキュベーションは、室温ではなく37℃においてであった。 Applied patches FSB # 2 to incubation FSB # 5 has been in the 37 ° C. instead of room temperature.
表10に記載する結果は、乾燥物質が適用に先立って外因的に水和されるフィブリンシーラント包帯態様の適用を例示する。 Results described in Table 10 illustrates the application of the fibrin sealant bandage manner dry material is exogenously hydrated prior to the application.
パッチFSB#3はトロンビン成分が存在しないことを除きFSB#1と同様に調製した。 Patch FSB # 3 was prepared in the same manner as FSB # 1 except that there is no thrombin component. パッチFSB#4は、TFC成分が存在しないことを除きFSB#1と同様に調製した。 Patch FSB # 4 was prepared in the same manner as FSB # 1 except that there is no TFC component. パッチFSB#5は、塩化カルシウム成分が存在しないことを除きFSB#1と同様に調製した。 Patch FSB # 5 was prepared in the same manner as FSB # 1 except that the calcium chloride component is not present. 各テストの結果は経時的に評価した。 The results of each test was assessed over time. 表10に示すごとく、フィブリン成分をPBSで水和させた場合に形成された凝固ゲルは、フィブリノーゲンまたはトロンビン成分をフィブリンシーラント包帯組成物から除くと溶液のままであった。 As shown in Table 10, coagulation gel fibrin component formed when hydrated with PBS remained solution except fibrinogen or thrombin component fibrin sealant dressing composition. 同様に、カルシウム成分を、フィブリンシーラント包帯から、および水和する流体から除くと、30分後に弱い水っぽいゲルが形成されたが、組成物は組織シール性フィブリン血餅に進展することはできなかった。 Similarly, the calcium component, the fibrin sealant bandages, and except from the hydration fluid, weak watery gel was formed after 30 minutes, the composition was not possible to progress the tissue seal fibrin clot .
フィブリン血餅り形成およびそれが隣接する表面に結合した程度をより明確に可視化するために、少量のトルイジンブルーを粉砕して、色インジケーターとして粉末化フィブリン成分に入れた。 In order to more clearly visualize the extent of fibrin Chimochiri formation and it was bonded to the adjacent surface, by crushing a small amount of toluidine blue it was put into powdered fibrin component as a color indicator.
事実、十分に水和すると、シリコーンパッチは、乾燥フィブリン成分層の水和後に、フィブリン血餅から容易に除去された。 In fact, when fully hydrated, silicone patch, after hydration of the dry fibrin component layer was easily removed from the fibrin clot.
また、前記したごとくシリコーンパッチ上に処方されたフィブリンシーラント包帯は、ゼラチン表面でおよびイン・ビボにてラット組織上でテストすると、フィブリンシールを効果的に形成することが判明した。 Moreover, fibrin sealant bandage formulation onto a silicone patch as mentioned above, when tested on rat tissues at a gelatin surface and in vivo, it was found to effectively form a fibrin seal. 損傷していないラットについての基本的なイン・ビボテストを含めた、種々の材料および組織に対するフィブリンシールの成功した形成に基づき、前記実施例に記載したごとくに動物実験を続け、TS成分を評価して、フィブリンシーラント包帯の止血利用性を最適化し、適用すべき補足成分、例えば、成長ホルモン類、薬物類、抗生物質類、防腐剤等の送達動態を確立した。 Including basic in-Bibotesuto for undamaged rats, based on the successful formation of fibrin seal to a variety of materials and tissue, continued animal experiments as described in the previous example, to assess the TS components Te, optimize hemostatic use of fibrin sealant bandage, supplemental ingredients to be applied, for example, growth hormones, drugs such, antibiotics were established delivery kinetics of such preservatives.
自己発泡性フィブリンシーラント本発明者らは、患者における創傷組織に組織シール性組成物を適用するための自己発泡性フィブリンシーラント包帯剤を調製し、ここに、有効量の(1)ウイルス不活化精製フィブリノーゲン複合体、(2)ウイルス不活化精製トロンビン、(3)カルシウム、および(4)生理学上許容される水和剤の組合せよりなる発泡性フォームとして包帯剤を適用し、ここに、該組成物は十分な厚みの皮膚創傷治癒を有意には阻害しない。 Self-foaming fibrin sealant inventors, the self-foaming fibrin sealant dressings for applying tissue sealing composition to the wound tissue was prepared in a patient, wherein, the effective amount of (1) viral inactivation purification fibrinogen complex, (2) viral inactivated purified thrombin, (3) calcium, and (4) applying a dressing as expanding foams made of a combination of a physiologically acceptable hydrating agent, where the composition not significantly inhibit skin wound healing of sufficient thickness. 実施において、成分が発泡性フォームとして創傷部位に送達され、それが数分内にフィブリンシールを形成するように、従前に記載したTS成分は、加圧プロペラントと共に小型容器またはタンクに貯蔵されるであろう。 In practice, the component is delivered to the wound site as a foaming foam, so that it forms a fibrin seal within a few minutes, TS components described previously is stored in a small container or tank with pressurized propellant Will.
ベンチモデルテスト系を標準アミコン(Amicon)圧力チャンバーから調製して最適粒子サイズを決定する。 The bench model test systems were prepared from a standard Amicon (Amicon) pressure chamber to determine the optimal particle size. 粒子サイズは重要であることが判明した。 It was found particle size is important. 予備実験により、TFC、フィブリンおよびカルシウム成分の粒子サイズの減少の結果、試薬を水和するのに要する時間が有意に減少することが明らかにされた。 Preliminary experiments were TFC, the results of the particle size reduction of fibrin and calcium components, revealed that the time required to hydrate the reagent is reduced significantly.
また、テストは、全ての試薬を単一貯蔵器内で合する可能性、あるいは各成分を適用まで別々の貯蔵器中に維持するのが有利か否かを決定することにも関連する。 Further, the test is also associated with to maintain all reagents possibilities if in a single reservoir, or in a separate reservoir until application of each component to determine advantageous or not.
恐らくはより高価ではあるが、後者の(多数の別々の貯蔵器を有する)小型容器の試作品は安定性および長期貯蔵の点で有利と判明するであろう。 While it is perhaps more expensive, (having a number of separate reservoirs) the latter small containers prototype will prove advantageous in terms of stability and long term storage.
テスト系は、医薬上許容される水和剤(例えば、水またはPBS)、および加圧圧縮ガスシリンダーを含有する加圧貯蔵器によって駆動される1または2の圧力容器よりなる。 Test system, pharmaceutically acceptable hydrating agent (e.g., water or PBS), and consisting of 1 or 2 of the pressure vessel which is driven by the pressurized storage vessel containing pressurized compressed gas cylinders. 試薬は、適当なチャンバー(類)に入れ、貯蔵器には所望の圧力にてプロペラントで飽和させた水和剤を充填する。 Reagent is placed in an appropriate chamber (s), the reservoir filling wettable powder saturated with propellant at the desired pressure. それらの貯蔵器中の水および試薬の混合は結合バルブを開くことによって達成される。 Mixing of water and reagents in their reservoirs is accomplished by opening the coupling valve. 出力は単一のラインに向けられるか、あるいは成分が別々のままである場合には、ヘメデイクス・シーラント・ディスペンサー(Hemedics Fibrin Sealant Dispenser)の連結ピースに向けられる。 Output when either be directed to a single line, or component remains separate is directed to connecting piece Hemedeikusu sealant dispenser (Hemedics Fibrin Sealant Dispenser).
本ケースでは、TFCを3ccの水で再水和させ、37℃まで加温して表11に示す濃度とした。 In this case, rehydrated the TFC of water 3 cc, was warmed to 37 ° C. with concentrations shown in Table 11. トロンビンは0.5ccのCaCl 2溶液(100mM)で再水和させて表11に示した濃度とした。 Thrombin to a concentration shown in Table 11 was re-hydrated with CaCl 2 solution of 0.5 cc (100 mM). 水和させた成分を混合し、炭酸水(10cc)を添加して、表11に示した容量を得た。 Hydrated allowed ingredients were mixed, with the addition of carbonated water (10 cc), to obtain a capacitor as shown in Table 11. 得られた発泡性混合物を真空ジャーに入れ、発泡を増大させた。 The resulting effervescent mixture was placed in a vacuum jar, it increased the foam. フォームが乾燥するまで真空圧をかけた。 Form is multiplied by the vacuum pressure to dryness. その結果、永久的一体性のフィブリンの発泡性塊となり、これはほぼ5倍発砲し、自己接着性であって隣接する組織表面にも接着性であった。 As a result, the foaming mass permanent integrity of fibrin, which is almost five times fire was adherent to the tissue surface adjacent to a self-adhesive.
また、フォームを較正したプラスチックビーカー中で定量的に測定した。 Was also quantitatively measured in a plastic beaker were calibrated form. 2分後、フォームの容量を測定し、質量を穏やかに精査して、それが凝固したことを判断した。 After 2 minutes, measure the volume of foam, and gently scrutinize mass was determined that it was solidified. 自己発泡性フィブリンシーラントの発泡の定量的測定は表11に示す。 Quantitative determination of foaming of self-foaming fibrin sealant are shown in Table 11. 一旦凝固したら、発泡性フォームはもはや新しい表面に対して接着性ではなかった。 Once solidified, was not in the adhesion to the effervescent form is no longer new surface.
自己発泡性フィブリン包帯剤の成功した形成に基づき、前記実施例のごとく動物実験を行って、TS組成物を評価し、自己発泡フィブリンシーラント包帯剤の止血利用性を最適化し、添加すべき補足成分、例えば、成長ホルモン類、薬物類、抗生物質類の送達動態が確立されるであろう。 Based on the self-foaming fibrin dressings successful formation, tested on animals as described in Example evaluates the TS composition, to optimize the hemostatic use of self-foaming fibrin sealant dressings, supplemental components to be added , for example, growth hormones would drug compound, the delivery kinetics of antibiotics is established.
本明細書およびここに開示した本発明の実施を考慮することより、本発明の他の態様は当業者に明らかであろう。 Than considering the implementation of the present specification and the present invention disclosed herein, other aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art. 修飾は当業者に明らかであるので、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されることを意図する。 Since modifications will be apparent to those skilled in the art, the present invention is intended to be limited only by the appended claims.

Claims (27)

  1. (i)閉塞性の吸収性または非吸収性の裏打ち、(ii)生理学上許容される接着剤層、および(iii)第XIII因子、トロンビンおよびCa ++の存在下でフィブリンマトリックスを形成できる量のフィブリノーゲンを含む、 止血性を有する乾燥物質の成分層を包含し、該接着剤層が、第XIII因子、トロンビンおよびCa ++の存在下でフィブリノーゲンから形成されるフィブリンマトリックスよりも低い剪断または引張強度を有する少なくとも1種の物質を含み、それにより、フィブリンマトリックスまたは創傷を囲む組織に対する損傷なくして裏打ちの除去を可能とすることを特徴とするフィブリンシーラント包帯。 (I) blockage of the absorbent or non-absorbent backing, (ii) a physiologically acceptable adhesive layer, and (iii) an amount capable of forming a fibrin matrix in the presence of Factor XIII, thrombin and Ca ++ of containing fibrinogen, it includes components layers of dry substance having a hemostatic, adhesive layer, factor XIII, low tensile shear or than fibrin matrix formed from fibrinogen in the presence of thrombin and Ca ++ It comprises at least one material having a strength, whereby fibrin sealant bandage, characterized in that to allow removal of the backing and without damage to tissue surrounding the fibrin matrix or wound.
  2. 第XIII因子、トロンビンおよびCa ++よりなる群から選択される少なくとも1の成分をさらに含む請求項1記載のフィブリンシーラント包帯。 Factor XIII, fibrin sealant bandage further comprising claim 1, wherein at least one component selected from the group consisting of thrombin and Ca ++.
  3. 第XIII因子、トロンビンおよびCa ++を含む請求項1記載のフィブリンシーラント包帯。 Factor XIII, fibrin sealant bandage according to claim 1 comprising thrombin and Ca ++.
  4. 該成分層が、該接着剤層の創傷に面する表面に付着されている請求項1ないし3のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 It said component layers, fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 and is attached to a surface facing the wound of the adhesive layer 3.
  5. 該生理学上許容される接着剤層が、裏打ちの特定の領域に付着されている請求項1ないし4のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Biological pharmacologically acceptable adhesive layer, the fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 is attached to a specific region of the backing 4.
  6. 患者への該包帯の適用に際して、妨害のない(unencumbered)接着剤層を創傷に隣接する組織に直接適用し得、成分層を創傷の上に置くように、接着剤層が成分層を越えて伸びる請求項5記載のフィブリンシーラント包帯。 Upon application of the dressing to the patient, resulting applying an unimpeded (unencumbered) adhesive layer directly into the tissue adjacent to the wound, to place the component layer over the wound, the adhesive layer is beyond the component layer extending according to claim 5, wherein the fibrin sealant bandage.
  7. 該接着剤層が適用に際して可溶化されあるいは粘着性が低くなり、それにより、フィブリンマトリックスからの裏打ちの除去を可能とするものである請求項1ないし6のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Adhesive layer is solubilized in the application or tackiness is lowered, whereby the fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 and makes it possible to remove the backing from the fibrin matrix 6.
  8. 該裏打ちが、生理学的に許容される接着剤層であり、これに成分層が創傷に面する表面において付着されている請求項1ないし7のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Said backing is a glue layer which is physiologically acceptable, this fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 is attached on the surface of the component layer facing the wound 7.
  9. 成分層および該接着剤の露出表面上に取り外し可能で耐水性の保護フィルムをさらに含み、該フイルムは該包帯の適用に先立って除去されるものである請求項1ないし8のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Component layer and further includes a possible water resistance of the protective film removal on the exposed surface of the adhesive, the film is any one of claims of claims 1 and is removed prior to application of the dressing 8 fibrin sealant bandage.
  10. 該マトリックスまたは成分層が、以下の補足物類:鎮痛剤類、抗微生物組成物類、抗生物質類、抗凝固剤類、抗炎症剤組成物類、抗増殖剤、サイトカイン類、細胞毒類、細胞増殖阻害剤類、化学治療剤類、成長因子類、ホルモン類、インターフェロン類、脂質類、オリゴヌクレオチド類、骨誘導剤類、ポリマー類、多糖類、プロテオグリカン類、ポリペプチド類、プロテアーゼ阻害剤類、ステロイド類、血管収縮剤類、血管拡張剤類、ビタミン類、ミネラル類および安定化剤類よりなる群から選択される少なくとも1種の化合物をさらに含む請求項1ないし9のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 The matrix or component layers, the following supplements such: analgesic agents, anti-microbial compositions, antibiotics, anticoagulants such, anti-inflammatory agent compositions, antiproliferative agents, cytokines, cytotoxins such, cytostatic agents, chemotherapeutic agents, growth factors, hormones, interferons, lipids, oligonucleotides, osteoinductive agents, polymers, polysaccharides, proteoglycans, polypeptides, protease inhibitors such , steroids, vasoconstrictors include, vasodilators, vitamins, any one of claims of claims 1 further comprising at least one compound selected from the group consisting of minerals and stabilizing agents 9 fibrin sealant bandage.
  11. 該成長因子が、線維芽細胞成長因子−1、線維芽細胞成長因子−2および線維芽細胞成長因子−4等の線維芽細胞成長因子類;血小板由来成長因子;インスリン結合成長因子−1およびインスリン結合成長因子−2等のインスリン結合成長因子類;表皮細胞成長因子;形質転換成長因子−αおよび形質転換成長因子−β等の形質転換成長因子類;軟骨誘導因子−Aおよび軟骨誘導因子−B等の軟骨誘導因子類;類骨誘導因子;オステオゲニンおよび他の骨成長因子;骨形態発生成長因子;コラーゲン成長因子;ヘパリン結合成長因子−1およびヘパリン結合成長因子−2等のヘパリン結合成長因子類;サイトカイン類;インターフェロン類;ホルモン類および該成長因子類の生物学的に活性な誘導体類よりなる群から選択される請求項10記載 The growth factor, fibroblast growth factor-1, fibroblast growth factor-2 and fibroblast growth factor fibroblast growth factor such as -4, platelet-derived growth factor; insulin-binding growth factor-1 and insulin insulin binding growth factors such as binding growth factor-2; epidermal growth factor; transforming growth factors such as transforming growth factor -α and transforming growth factor-beta; cartilage inducing factor -A and cartilage inducing factor -B cartilage induction factors, and the like; osteoid-inducing factors; osteogenin and other bone growth factors; bone morphogenetic growth factor; collagen growth factors; heparin binding growth factors such as heparin-binding growth factor-1 and heparin-binding growth factor-2 s; cytokines; interferons; hormones and claim 10 selected from biologically group consisting active derivatives of the growth factors, のフィブリンシーラント包帯。 Fibrin sealant bandage.
  12. 該マトリックスまたは成分層が、さらに、有効量の1種以上の阻害性化合物類、1種以上の促進性化合物類、およびその生物学的適合誘導体類よりなる群から選択される少なくとも1種以上の化合物を含み、該阻害性化合物類は該成長因子の生物学的機能に干渉する因子類の生化学的活性を阻害し、他方、該促進性化合物類は該成長因子の生物学的活性を促進しおよび/または媒介するものである請求項10または11記載のフィブリンシーラント包帯。 The matrix or component layer further comprises one or more inhibitory compounds effective amount of one or more promoting compounds, and at least one or more selected from the group consisting of a biologically compatible derivatives comprise a compound, the inhibitory compounds can inhibit the biochemical activity of the interfering factors, the biological function of the growth factor, while the promoting compounds are promoting the biological activity of the growth factor and / or those that mediate claim 10 or 11 fibrin sealant bandage according.
  13. 該細胞毒性または細胞増殖阻害性組成物が、アルキル化剤類、酵素阻害剤類、増殖阻害剤類、溶解剤類、DNA合成阻害剤類、膜浸透性修飾剤類、DNAインターカレーター類、代謝物類、マスタード誘導体類、蛋白質生産阻害剤類、リボソーム阻害剤類、アポトーシスのインデューサー類、インスリン類、ステロイド類、エテトロゲン、テストステロン、ホルモン類似体類、インスリン類、タキソール、タキソテーレ、ゲンタマイシン、リシン、ジフテリア毒素、神経毒素類、ヘビ毒およびそれらの機能的等価類似体よりなる群から選択される化学療法で用いる少なくとも1種の組成物を含む請求項10記載のフィブリンシーラント包帯。 The cytotoxic or growth inhibitory composition, alkylating agents, enzyme inhibitors include, growth inhibitory agents, dissolution agents, DNA synthesis inhibitors include, membrane permeability modifying agents, DNA intercalators such, metabolism things such, mustard derivatives, protein production inhibitor include, ribosome inhibitors include, inducers such apoptosis, insulin, steroids, Etetorogen, testosterone, hormone analogs, insulins, taxol, taxotere, gentamicin, lysine, diphtheria toxin, neurotoxins such, snake venom and their functional equivalents analogues used in chemotherapy is selected from the group consisting of fibrin sealant bandage of claim 10 further comprising at least one composition.
  14. 該化合物が長期間放出される請求項1ないし13のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 to 13 wherein the compound is released over time.
  15. 該化合物が固体形態にある請求項1ないし14のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Fibrin sealant bandage according to any one of from the compound claims 1 in solid form 14.
  16. 適用に際して、該化合物が担体中の溶液中の該マトリックスに導入され、該担体はそこに含有される該化合物よりも高い溶解速度を有して、それにより該化合物は固体沈殿としてマトリックス内に沈積される請求項15記載のフィブリンシーラント包帯。 Upon application, the compound is introduced into the matrix in solution in the carrier, the carrier has a higher dissolution rate than the compound contained therein, whereby the compound deposited in the matrix as a solid precipitate 15. fibrin sealant bandage according to be.
  17. 該化合物が該フィブリンマトリックスと相互作用する請求項14記載のフィブリンシーラント包帯。 Fibrin sealant bandage of claim 14 wherein said compound interacts with the fibrin matrix.
  18. 該化合物が十分に低溶解度のものであって、該フィブリンマトリックスからの局所化された持続性放出を可能とする請求項14記載のフィブリンシーラント包帯。 The compound be of sufficiently low solubility, fibrin sealant bandage of claim 14 wherein enabling localized sustained release from the fibrin matrix.
  19. 該化合物の質量が、該フィブリンマトリックスの容量に溶解する量を超え、それにより、該フィブリンマトリックスからの局所化された持続性放出を可能とする請求項14記載のフィブリンシーラント包帯。 Weight of the compound, more than the amount that is soluble in the capacity of the fibrin matrices, whereby fibrin sealant bandage of claim 14 wherein enabling localized sustained release from the fibrin matrix.
  20. 適用に際して、該化合物がエマルジョンとして該マトリックスに導入される請求項19記載のフィブリンシーラント包帯。 Upon application, the fibrin sealant bandage of claim 19 wherein the compound is introduced into the matrix as an emulsion.
  21. 該マトリックスまたは成分層が、さらに、以下の:ヒト無機質脱落骨マトリックスを含めた無機質脱落骨マトリックス;骨形態発生蛋白質1ないし8;およびそれらの生物学的適合誘導体類のうちの少なくとも1種を含む請求項1ないし20のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 The matrix or component layer further following: human demineralization bone matrix demineralization bone matrix including; containing at least one of and their biocompatible derivatives; no bone morphogenetic protein 1 to 8 fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 to 20.
  22. 該マトリックスおよび/または成分層がフィブリン、コラーゲン、ゼラチン、キチンまたはキトサン、あるいはそれらの生物学的適合誘導体を含む請求項1ないし21のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 The matrix and / or component layers fibrin, collagen, gelatin, chitin or chitosan, or fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 to 21 including their biocompatible derivatives.
  23. 吸収性裏打ちがフィブリン、コラーゲン、ゼラチン、キチンまたはキトサン、あるいはそれらの生物学的適合誘導体を含む請求項1ないし22のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 The absorbent backing fibrin, collagen, gelatin, chitin or chitosan, or fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 include those biocompatible derivatives 22.
  24. 生理学上許容される水和剤が該包帯の別の層に含有される請求項1ないし23のいずれか1項記載のフィブリンシーラント包帯。 Physiologically acceptable fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 to 23 wettable powder is contained in another layer of the dressing.
  25. 該成分類が、水和に際して気体を生じる少なくとも1種の物質を含む請求項1ないし24のいずれか1項に記載のフィブリンシーラント包帯。 Molded classification, fibrin sealant bandage according to any one of claims 1 comprises at least one substance causing gas upon hydration 24.
  26. 化学発泡剤および/または水和剤を含む請求項25記載のフィブリンシーラント包帯。 Chemical blowing agents and / or fibrin sealant bandage of claim 25 further comprising a wettable powder.
  27. 発泡が、発泡を引き起こすのに十分な量の水和に際しての成分物質;活性化または放出に際して、フィブリン形成性成分類の発泡を引き起こす、気体で過飽和された水和剤;または活性化または放出に際してフィブリン形成性成分類の発泡を引き起こすプロペラントから生じた気体に由来する請求項25または26記載のフィブリンシーラント包帯。 Upon or activation or release; foaming, component materials when a sufficient amount of hydration to cause foaming; upon activation or release, causing foaming of the fibrin-forming ingredients, wettable powder, which is supersaturated with gas fibrin sealant bandage according to claim 25 or 26 wherein from a gas resulting from propellant that causes foaming of the fibrin-forming ingredients.
JP51775396A 1994-12-07 1995-12-06 Supplement or non-supplemented tissue sealant, their preparation and use Expired - Lifetime JP4223548B2 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35100694A true 1994-12-07 1994-12-07
US08/351,006 1994-12-07
PCT/US1995/015876 WO1996017633A1 (en) 1994-12-07 1995-12-06 Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH10510183A JPH10510183A (en) 1998-10-06
JP4223548B2 true JP4223548B2 (en) 2009-02-12

Family

ID=23379191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51775396A Expired - Lifetime JP4223548B2 (en) 1994-12-07 1995-12-06 Supplement or non-supplemented tissue sealant, their preparation and use

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0796115A1 (en)
JP (1) JP4223548B2 (en)
AU (1) AU717906B2 (en)
CA (1) CA2207289C (en)
WO (1) WO1996017633A1 (en)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39321E1 (en) 1990-11-27 2006-10-03 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US7189410B1 (en) 1990-11-27 2007-03-13 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
WO1996040174A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
USRE39298E1 (en) 1990-11-27 2006-09-19 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
USRE39192E1 (en) 1990-11-27 2006-07-18 American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US7247609B2 (en) 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
EP0993311B1 (en) 1997-06-18 2012-11-14 Angiotech Pharmaceuticals (US), Inc. Compositions containing thrombin and microfibrillar collagen, and methods for preparation and use thereof
AT407117B (en) 1997-09-19 2000-12-27 Immuno Ag fibrin sponge
AT439150T (en) * 1997-11-17 2009-08-15 Haemacure Corp A hyaluronic acid derivative containing fibrinsiegel or fibrinklebmasse
US6056970A (en) * 1998-05-07 2000-05-02 Genzyme Corporation Compositions comprising hemostatic compounds and bioabsorbable polymers
US7601685B2 (en) 1998-08-27 2009-10-13 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US7241730B2 (en) 1998-08-27 2007-07-10 Universitat Zurich Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering: fibrin formulations with peptides
JP2003026673A (en) * 1999-03-05 2003-01-29 Asahi Kasei Corp Osteoplasty accelerator
JP3576063B2 (en) * 2000-02-22 2004-10-13 株式会社ホギメディカル Method of manufacturing a soluble wound healing hemostatic cellulose fiber containing coagulation protein
US6921532B1 (en) 2000-06-22 2005-07-26 Spinal Restoration, Inc. Biological Bioadhesive composition and methods of preparation and use
WO2001097872A1 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 Austin Sam L Bioadhesive compositions and methods of preparation and use
US8124075B2 (en) 2004-07-16 2012-02-28 Spinal Restoration, Inc. Enhanced biological autologous tissue adhesive composition and methods of preparation and use
US9358318B2 (en) 2004-10-20 2016-06-07 Ethicon, Inc. Method of making a reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing
AU2005295368B2 (en) * 2004-10-20 2011-06-09 Ethicon, Inc. A reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing and method of making
US7597687B2 (en) 2004-10-29 2009-10-06 Spinal Restoration, Inc. Injection of fibrin sealant including an anesthetic in spinal applications
US8206448B2 (en) 2004-10-29 2012-06-26 Spinal Restoration, Inc. Injection of fibrin sealant using reconstituted components in spinal applications
US8419722B2 (en) 2004-10-29 2013-04-16 Spinal Restoration, Inc. Apparatus and method for injection of fibrin sealant in spinal applications
US8403923B2 (en) 2004-10-29 2013-03-26 Spinal Restoration, Inc. Injection of fibrin sealant in the absence of corticosteroids in spinal applications
US8575101B2 (en) 2005-01-06 2013-11-05 Kuros Biosurgery Ag Supplemented matrices for the repair of bone fractures
WO2006073711A2 (en) 2005-01-06 2006-07-13 Kuros Biosurgery Ag Use of a matrix comprising a contrast agent in soft tissues
CA2604493C (en) 2005-04-12 2015-12-22 Angioblast Systems, Inc. Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase
US7429241B2 (en) 2005-09-29 2008-09-30 Codman & Shurtleff, Inc. Dural graft and method of preparing the same
KR100701552B1 (en) * 2006-06-23 2007-03-30 한국과학기술연구원 Method for manufacturing biodegradable polyester polymer material in the form of filament and sheet using compressed gas
GB0623607D0 (en) * 2006-11-27 2007-01-03 Haemostatix Ltd Tissue adhesive
AU2007334394B2 (en) 2006-12-15 2013-06-06 Lifebond Ltd. Gelatin-transglutaminase hemostatic dressings and sealants
ES2381639T3 (en) 2007-04-13 2012-05-30 Kuros Biosurgery Ag Sealant polymeric fabric
KR20150021587A (en) 2007-08-06 2015-03-02 메소블라스트, 아이엔씨. Methods of generating, repairing and/or maintaining connective tissue in vivo
CA2710798A1 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
JP5450612B2 (en) 2008-06-18 2014-03-26 ライフボンド リミテッドLifebond Ltd Improved crosslinking composition
CN104678106B (en) 2008-08-18 2016-12-07 中胚有限公司 Stro-4 monoclonal antibody
US9827205B2 (en) 2008-12-12 2017-11-28 Mallinckrodt Pharma Ip Trading D.A.C. Dry powder fibrin sealant
JP5796860B2 (en) 2009-12-22 2015-10-21 ライフボンド リミテッドLifebond Ltd Modification of enzymatic crosslinking agent to adjust the properties of the crosslinked matrix
NZ600812A (en) 2010-01-08 2014-08-29 Profibrix Bv Dry powder fibrin sealant
CN103118713B (en) 2010-08-05 2016-06-01 生命连结有限公司 Dry composition and adhesive wound dressing
US8999376B2 (en) 2012-02-03 2015-04-07 Xcede Technologies, Inc. Tissue patch
US9833538B2 (en) 2015-08-07 2017-12-05 Xcede Technologies, Inc. Adhesive compositions and related methods
KR101878769B1 (en) 2017-04-03 2018-08-16 조석형 Low molecular CM-β-1,3-Glucan calcium salt hemostatic agent powder
DE102017126149A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-09 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Active substance-containing layer composite and method for its production

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4706662A (en) * 1981-12-11 1987-11-17 Johnson & Johnson Products, Inc. Film dressing with fabric backing
FR2589737B1 (en) * 1985-11-12 1994-04-22 Dow Corning France Sa
JP3604688B2 (en) * 1990-11-27 2004-12-22 アメリカ合衆国The United States of America Tissue sealant promotes healing of accelerated wound and growth factor-containing compositions
US5206023A (en) * 1991-01-31 1993-04-27 Robert F. Shaw Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage
GB9206509D0 (en) * 1992-03-25 1992-05-06 Jevco Ltd Heteromorphic sponges containing active agents
AU696691C (en) * 1993-03-12 2003-09-18 American National Red Cross, The Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use

Also Published As

Publication number Publication date
CA2207289A1 (en) 1996-06-13
CA2207289C (en) 2005-04-12
JPH10510183A (en) 1998-10-06
AU717906B2 (en) 2000-04-06
EP0796115A1 (en) 1997-09-24
AU4510096A (en) 1996-06-26
WO1996017633A1 (en) 1996-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kimura et al. Adipose tissue engineering based on human preadipocytes combined with gelatin microspheres containing basic fibroblast growth factor
Corkhill et al. Synthetic hydrogels VI. Hydrogel composites as wound dressings and implant materials
Ruszczak Effect of collagen matrices on dermal wound healing
El‐Sharkawy et al. Platelet‐rich plasma: growth factors and pro‐and anti‐inflammatory properties
JP3591837B2 (en) Biological bioadhesive composition comprising fibrin glue and liposomes, their preparation and use
KR100235391B1 (en) Growth factor containing matrix for the treatment of lesions in cartilage
EP0265906B1 (en) Wound dressing
JP4477702B2 (en) Osteogenic device and its use for bone repair
CA2169362C (en) Formulations for delivery of osteogenic proteins
CA2627907C (en) Osteoinductive composition comprising osteoinductive factors recovered from mineralized bone and a carrier
EP0726749B1 (en) Hemostatic patch
CA2201526C (en) Differentially biodegradable biomedical implants
EP1731175B1 (en) Hemostatic cross-linked dextran beads useful for rapid blood coagulation and hemostatis
Lionelli et al. Wound dressings
EP0790823B1 (en) Drug releasing surgical implant or dressing material
US5290552A (en) Surgical adhesive material
EP0928206B1 (en) A hydrocolloid wound gel
EP0608313B1 (en) Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins
EP0428541B1 (en) Collagen wound healing matrices and process for their production
CA1336405C (en) Biocompatible synthetic and collagen compositions for treatment of wounds and pressure ulcers and therapeutic methods
JP3602145B2 (en) New pharmaceuticals based on a polymer composed of methacrylamide modified gelatin
ES2267145T3 (en) Compositions for treatment and repair of cartilage defects using a functional barrier.
Anitua et al. Perspectives and challenges in regenerative medicine using plasma rich in growth factors
US5158934A (en) Method of inducing bone growth using TGF-β
AU2002362932B2 (en) Remodeling of tissues and organs

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060718

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20061018

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20061204

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070118

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070313

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070613

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070730

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070713

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070820

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070813

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20081021

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20081120

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111128

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121128

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131128

Year of fee payment: 5

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term