JP4219711B2 - ストレス耐性遺伝子を用いた発根率や切花の花持ちが改善された植物の製造 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子で植物を形質転換することを含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物を作成する方法ならびにストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物に関する。
【０００２】
本発明は、さらに発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された植物を作成するための乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAをストレス応答性プロモーターの下流に連結した遺伝子（ストレス耐性遺伝子）の使用に関する。
【０００３】
【従来の技術】
栽培植物は、種子繁殖や球根などの植物本来の機構による増殖と、挿し木（挿し芽、挿し穂）、組織培養などのクローン技術によって増殖が行われている。特に３大切花であるキク、カーネーション、バラは優良品種が作出されると、その枝や穂を挿し木（挿し芽・挿し穂）で増やし切花生産やその植物体の維持に使われている。この増殖の生産性を高めるためには、挿し木増殖の効率を上げる必要があり、最も製品率を上げるためには挿し木の発根性を上げる必要がある。これを解決するため商品名ルートン等に代表されるオーキシン類による薬剤処理が行われるが決して十分ではなく、コストや手間がかかるのが現状である。一方、切花において花持ちという性質は大変重要な形質であることはいうまでもない。花持ちに関する生化学的な検討がされ、老化ホルモンであるエチレンを物理的に吸収するなどの手法がとられている。しかしこの方法においても、エチレンで制御される花持ちは、切花の本体的な改善ではなく、部分的な改善に過ぎない。またエチレンの吸収や発生の抑制で改善される植物は限られた品種であり、もっとより広範囲かつ植物自体の状態の改善が望まれていた。しかも発根性と切花延命性を同時に向上させるような手段は知られていなかった。
【０００４】
これまで、人為的にクローン増殖性や花持ちが改善された植物を作出する場合、それぞれに優良な形質を示す系統の選抜や交配などの手法が用いられてきたが、選抜法には多くの時間が必要であり、一方、交配法は限られた種間にしか用いることができないため、挿し木増殖効率および花持ちが改善された植物の作出は困難であった。
【０００５】
近年のバイオテクノロジーの進歩に伴い、植物に異種生物由来の特定の遺伝子を導入する形質転換技術などの手法を用いて、様々な植物の作出が試みられている。これまでに、発根促進についてはrolC遺伝子を導入したカーネーションの例があるが、rolC遺伝子自身さまざまな植物で矮化や分枝性をあげることが知られており実用性は難しいと考えられる [J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126：13-18(2001)]。遺伝子組換えによるエチレン発生の抑制やエチレン受容機構に不感受性にするなどの試みがされており、作出された植物が、部分的な花持ちの向上（花弁等の老化の抑制）につながった報告も見うけられる[HortScience 30: 970-972(1995), Mol.Breed. 5: 301-308(1999)]。
【０００６】
一方、植物は、自然界において、乾燥、高温、低温又は塩などの様々な環境ストレスに曝されて生息している。植物は、動物のように移動によってストレスから身を守る行動をとることができないため、進化の過程で、様々なストレス耐性機構を獲得してきた。例えば、低温耐性植物(シロイヌナズナ、ホウレンソウ、レタス、エンドウ、オオムギ、テンサイなど)は、低温感受性植物(トウモロコシ、イネ、カボチャ、キュウリ、バナナ、トマトなど)よりも、生体膜脂質中の不飽和脂肪酸の含有割合が低く、そのため、低温に曝されても、生体膜脂質の相転移が起こりにくく、低温障害が生じにくい。これまで、人為的に環境ストレス耐性植物を作出する場合、乾燥、低温又は耐塩性の系統の選抜や交配などの手法が用いられてきたが、選抜法には多くの時間が必要であり、一方、交配法は限られた種間にしか用いることができないため、高い環境ストレス耐性を有する植物の作出は困難であった。
【０００７】
近年のバイオテクノロジーの進歩に伴い、植物に異種生物由来の特定の遺伝子を導入する形質転換技術などの手法を用いて、乾燥、低温、塩などに耐性の植物の作出が試みられている。もっとも実用性の高いとされる植物としてはストレス応答性プロモーターの下流に乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNA(DREB遺伝子という)が連結された遺伝子を導入することにより作出した、環境ストレス耐性の形質転換植物がある[特許第3178672号公報と特許第3183458号公報]。本方法により環境ストレス(乾燥ストレス、低温ストレス、塩ストレスなど)に対する耐性が向上し且つ矮化の起こらない形質転換植物が作出されている。しかしこれらストレス耐性の付与は特殊な条件下（継続的に砂漠地域、塩害地域、低温地域等）で栽培されることを想定した場合やあくまで植物が極度の環境ストレスに一時的に晒された場合の話であり、通常の栽培形態である挿し木増殖の発根率や通常の商品流通や消費形態である切り花にした際の花持ち（切花延命性）に好影響を与えるという報告はなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特許第3178672号公報
【特許文献２】
特許第3183458号公報
【非特許文献１】
J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126：13-18(2001)
【非特許文献２】
HortScience 30: 970-972(1995), Mol.Breed. 5: 301-308(1999)
【非特許文献３】
Mol.Breed. 5: 301-308(1999)
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発根率を高めることにより挿し木増殖での効率を高め、切花の花持ちが改善された植物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた実験を行っていた。ストレス耐性付与の目的で作成された特許第3178672号公報の実施例５に記載されている植物プラスミドpBI29AP:DREB1Aで形質転換したキクを得て、これをクローン増殖後に、切花を生産し、その花持ちを検定したところ、遺伝子導入前の品種と比較し、発根率、挿し木増殖性、花持ち（切花延命性）において明らかな優位性を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
（１） ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を用いて植物を形質転換することを含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物を作成する方法、
（２） ストレス応答性プロモーターが、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（３） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAがDREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（４） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが、
(a) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるDNAであってストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(b) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、ならびに
(c) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（５） ストレス応答性プロモーターのDNAが、
(a) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入されたものであってストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、
(b) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、ならびに
(c) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（６） ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物、
（７） ストレス応答性プロモーターが、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである（６）の形質転換植物、
（８） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAがDREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである（６）の形質転換植物、
（９） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが、
(a) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるDNAであってストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(b) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、ならびに
(c) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（６）の形質転換植物、ならびに
（１０） ストレス応答性プロモーターのDNAが、
(a) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入されたものであってストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、
(b) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、ならびに
(c) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（６）の形質転換植物。さらに、上記（４）および（９）のDNAには、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAと実質的に同等の活性を有するDNAが、上記（５）および（１０）のDNAには、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAと実質的に同等の活性を有するDNAが含まれる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の形質転換植物は、ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれる乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNA(DREB遺伝子という)が連結された遺伝子（本明細書においてストレス耐性遺伝子と呼ぶこともある）を導入することにより作出した、発根率を高めることにより挿し木増殖での効率を高め、切花の花持ち（切花延命性）が向上された植物である。一例として、rd29Aプロモーターを用いた構成の遺伝子を示す（図１）。
【００１３】
（１）DREB遺伝子
本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子があり、これらを適宜使用することができる。DREB1A遺伝子は、DREB1A遺伝子[Kazuko Yamaguchi-Shinozaki and Kazuo Shinozaki：Plant Cell 6：251-264(1994)]のcDNA領域を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCRともいう)を行い、増幅することにより得ることができる。ここでPCRに用いることができる鋳型mRNAとしては、シロイヌナズナでMS培地 [Murashige and Skoog: Physiol. Plant. 15：473-497 (1962)] などの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体を乾燥ストレス(例えば、脱水状態にする)に曝露した状態から調製したmRNAが挙げられる。
【００１４】
またこれらの遺伝子は、特許第3178672号公報に記載されており、同公報の記載に従って取得することができる。また、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子、およびDREB2H遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７に示す。また、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子、およびDREB2H遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８に示す。さらに、DREB1A又はDREB2A遺伝子を含む組換えベクターは、大腸菌K-12株に導入され、DREB1A遺伝子を含む大腸菌は、受託番号FERM P-16936として、DREB2A遺伝子を含む大腸菌は、受託番号FERM P-16937として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６)に、平成10年８月11日付けで寄託されている。さらに、DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図２に、DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図３に、DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図４に、DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図５に示した。このアラインメントは解析ソフトウェアとしてGENETYX-MAC version 12.0.0 を用いた。また、DREB1DからDREB1FおよびDREB2CからDREB2Hの塩基配列およびアミノ酸配列ならびにそれらの発現解析については Biochem.Biophys.Res.Comm, 290: 998-1009(2002)に記載されており、本願発明のDREB遺伝子を得るに当たって該文献を参照することもできる。
【００１５】
図２のDREB1A遺伝子からDREB1F遺伝子の塩基配列レベルでの配列比較より、DREB1AとDREB1BからDREB1Fの間の相同性は最も低くて54.7％である。また、DREB1BからDREB1Fの間で相同性が最も低いのはDREB1DとDREB1Eとの間で51.2％である。さらに、DREB1AからDREB1Fの間ではDREB1Aの約100位の塩基から約400位の塩基までの配列に相当する配列部分に共通配列が多く、DREB1Aの100位から400位の間の塩基配列に相当する部分の相同性が最も低いのはDREB1DとDREB1Eの間で約65％である。
【００１６】
従って、DREB1AからDREB1Fのいずれかの塩基配列と50％以上の相同性を有する塩基配列からなり、DREB1ファミリーの遺伝子のDNAであるDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB1Aの第100位から第400位の塩基配列部分またはDREB1BからDREB1Fの塩基配列のうち上記方法によりDREB1Aの塩基配列とアラインメントさせたときにDREB1Aの第100位から第400位の塩基配列部分に相当する塩基配列部分と相同性の高い塩基配列部分を有するDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB1AからDREB1Fの何れかとの相同性が少なくとも60％、好ましくは65％以上のDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記塩基配列部分を含むDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００１７】
図２のDREB1Aタンパク質からDREB1Fタンパク質のアミノ酸配列レベルでの配列比較より、DREB1AとDREB1BからDREB1Fの間の相同性は最も低くて43.9％である。また、DREB1BからDREB1Fの間で相同性が最も低いのはDREB1DとDREB1Eとの間で41.9％である。
【００１８】
従って、DREB1AからDREB1Fのいずれかのアミノ酸配列と40％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるDREB1ファミリーに属するタンパク質をコードするDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB1Aタンパク質の約31番目のアミノ酸から約120番目のアミノ酸配列部分またはDREB1Bタンパク質からDREB1Fタンパク質のアミノ酸配列のうち上記方法によりDREB1Aタンパク質のアミノ酸配列とアラインメントさせたときにDREB1Aの31番目のアミノ酸から120番目のアミノ酸配列部分に相当するアミノ酸配列部分と相同性の高いアミノ酸配列部分を有するタンパク質をコードするDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB1AからDREB1Fの何れかとの相同性が少なくとも60％、好ましくは70％以上のタンパク質をコードするDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記アミノ酸配列部分を含むタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、DREB1Aタンパク質からDREB1Fタンパク質のアミノ酸配列のうち、DREB1Aタンパク質の85番目から93番目のアミノ酸配列(MAARAHDVA)および95番目から105番目のアミノ酸配列(ALRGRSACLNF)はDREB1Aタンパク質からDREB1Fタンパク質に共通であり、この共通配列部分のすべてまたは一個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加された配列を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００１９】
図４のDREB2A遺伝子からDREB2H遺伝子の塩基配列レベルでの配列比較より、DREB2AとDREB2BからDREB2Hの間の相同性は最も低くて39.4％である。また、DREB2BからDREB2Hの間で相同性が最も低いのはDREB2GとDREB2Hとの間で38.4％である。さらに、DREB2AからDREB2Hの間では約180位の塩基から約400位の塩基までの配列部分に共通配列が多い。
【００２０】
従って、DREB2AからDREB2Hのいずれかの塩基配列と50％以上の相同性を有する塩基配列からなり、DREB2ファミリーの遺伝子のDNAであるDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB2Aの第180位から第400位の塩基配列部分またはDREB2BからDREB2Hの塩基配列のうち上記方法によりDREB2Aの塩基配列とアラインメントさせたときにDREB2Aの第180位から第400位の塩基配列部分に相当する塩基配列部分と相同性の高い塩基配列部分を有するDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB2AからDREB2Hの何れかとの相同性が少なくとも40％、好ましくは50％以上のDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記塩基配列部分を含むDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００２１】
図５のDREB2Aタンパク質からDREB2Hタンパク質のアミノ酸配列レベルでの配列比較より、DREB2AとDREB2BからDREB2Hの間の相同性は最も低くて26.1％である。また、DREB2BからDREB2Hの間で相同性が最も低いのはDREB2FとDREB2Gとの間で21.5％である。
【００２２】
従って、DREB2AからDREB2Hのいずれかのアミノ酸配列と20％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるDREB2ファミリーに属するタンパク質をコードするDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB2Aタンパク質の約61番目のアミノ酸から約130番目のアミノ酸配列部分またはDREB2Bタンパク質からDREB2Hタンパク質のアミノ酸配列のうち上記方法によりDREB2Aタンパク質のアミノ酸配列とアラインメントさせたときにDREB2Aの61番目のアミノ酸から130番目のアミノ酸配列部分に相当するアミノ酸配列部分と相同性の高いアミノ酸配列部分を有するタンパク質をコードするDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB2AからDREB2Hの何れかとの相同性が少なくとも20％、好ましくは30％以上のタンパク質をコードするDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記アミノ酸配列部分を含むタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、DREB2Aタンパク質からDREB2Hタンパク質のアミノ酸配列のうち、DREB2Aタンパク質の88番目から98番目のアミノ酸配列(WGKWVAEIREP)はDREB2Aタンパク質からDREB2Hタンパク質に共通であり、この共通配列部分のすべてまたは一個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加された配列を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００２３】
なお、ファミリーとはDREB1A〜FおよびDREB2A〜Hと分子系統的に関連がありアミノ酸配列レベルで一定の相同性を有する分子群に属する分子をいい、DREB1A〜FおよびDREB2A〜H以外のものを含む。
【００２４】
また、図６にDREB1Aを基軸としたDREB1BからDREB1Fとの塩基配列レベルでのアラインメントを、図７にDREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとの塩基配列レベルでのアラインメントを、図８にDREB1Aを基軸とした場合のDREB1BからDREB1Fとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントを、図９にDREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントをそれぞれ示した。上記のようなDREB1AやDREB2Aを基軸とした場合の各共通塩基配列、当該配列の縮重異性体、当該配列との相同性が80％以上のもの、当該配列に相補的なDNAからなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするもののうちのいずれからなるDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。また、上記のようなDREB1AやDREB2Aを基軸とした場合の共通アミノ酸配列、当該配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入された配列のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００２５】
以下に、DREB1A〜１Fの間のアミノ酸レベルでの共通配列、DREB2A〜2Hの間のアミノ酸レベルでの共通配列、DREB1A〜１Fの間の塩基レベルでの共通配列、DREB2A〜2Hの間の塩基配列レベルでの共通配列を示す。
【００２６】
【００２７】
上記各種遺伝子をコードするアミノ酸配列からなるタンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個またはそれ以上（複数個、数個）のアミノ酸に欠失、置換、付加などの変異が生じたタンパク質をコードするDREB1かDREB2のファミリー以外の変異型遺伝子は各々の遺伝子と同等のものとして本発明に用いることができる。
【００２８】
例えば、これらのアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質をコードする遺伝子も、当該タンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、本発明に用いることができる。
【００２９】
また、上記各種遺伝子のDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAも、当該DNAがコードするタンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、各々の遺伝子と同等のものとして本発明に用いることができる。ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう[Molecular Cloning（Sambrookら編集(1989)Cold Spring Harbor Lab. Press, New York）]。
【００３０】
なお、変異型遺伝子は、Kunkel法や Gapped duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)など）を用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて作製することができる。上記突然変異誘発法については、DREB遺伝子の塩基配列を参照すれば、Molecular Cloning（Sambrookら編集(1989) 15 Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA, 15.3〜15.113 Cold Spring Harbor Lab. Press, New York）等の文献の記載に従って当業者であれば格別の困難性なしに選択し実施することにより、上記変異型遺伝子を製造することができることは明らかである。さらに当業者であれば、DREB遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上（１または数個以上）の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)5662-5666、WO85/00817、Nature 316(1985)601-605、Gene 34(1985)315-323、Nucleic Acids Res. 13(1985)4431-4442、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982)6409-6413、Science 224(1984)1431-1433等に記載の技術に従って変異体を取得し、これを利用することができる。
【００３１】
さらに、本発明のDREB遺伝子には、DREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、上記のDREB各遺伝子の塩基配列やそれらの各共通塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列（変異体）も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：例えばGENETYX-MAC version 12.0.0を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
【００３２】
このようなDREB遺伝子の塩基配列を含むDNA又はその部分の変異体は、DREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、該塩基配列を含むDNA又はその部分のDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する活性と同等の活性を実質的に有することが好ましい。ここで、これらのDNA又はその部分の「DREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する活性と同等の活性を実質的に有する」とは、該活性を利用した実際の使用態様において、これらのDNA又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいう該活性は、例えば植物細胞や植物体、好ましくは双子葉植物の細胞や植物体における活性、より好ましくはキク植物の細胞や植物体における活性、最も好ましくはキク栽培品種リネカー（Chrysanthemum morifolium cv. Lineker又はDendranthema grandiflorum cv. Lineker）植物の細胞や植物体における活性をいう。これらの活性の測定は、特許第3178672号公報記載の方法に従って行うことができる。
【００３３】
一旦DREB遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNAもしくはゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、DREB遺伝子を得ることができる。
【００３４】
DREB遺伝子は、転写を活性化するタンパク質をコードする遺伝子であるため、該遺伝子を導入した植物は、発現されたDREBタンパク質の作用で種々の遺伝子が活性化され、それに伴うエネルギー消費の増大や代謝の活性化により植物自身の生育が抑制される場合がある。これを防止するため、ストレス負荷時にのみDREB遺伝子が発現されるように、ストレス応答性プロモーターをDREB遺伝子上流に連結することが考えられる。例えば、そのようなプロモーターとしては、例えば以下のものが挙げられる。
rd29A遺伝子プロモーター[Yamaguchi-Shinozaki,K. et al.：Plant Cell,6:251-264 (1994)]、rd29B遺伝子プロモーター[Yamaguchi-Shinozaki,K. et al.： Plant Cell, 6:251-264 (1994)]、rd17遺伝子プロモーター[Iwasaki,T. et al.：Plant Physiol.,115:1287(1997)]、rd22遺伝子プロモーター[Iwasaki,T. et al.：Mol. Gen. Genet.,247:391-398(1995)]、 DREB1A遺伝子プロモーター[Shinwari,Z.K. et al.：Biochem. Biophys. Res. Com. 250:161-170(1998)]、cor6.6遺伝子プロモーター[Wang, H. et al.：Plant Mol. Biol. 28:619-634(1995)]、cor15a遺伝子プロモーター[Baker, S.S. et al.：Plant Mol. Biol. 24:701-713(1994)]、erd1遺伝子プロモーター[Nakashima K. et al.：Plant J. 12:851-861(1997)]、およびkin1遺伝子プロモーター[Wang,H．et al.：Plant Mol. Biol.28:605-617(1995)]である。
【００３５】
但し、ストレス応答性であり、且つ植物細胞や植物体内で機能するものであれば、上記プロモーターに限定されるものではない。なお、これらのプロモーターは、該プロモーターを含むDNAの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムDNAを鋳型として、PCRによる増幅反応によって得ることができる。具体的には、乾燥ストレス耐性遺伝子の１つであるrd29A遺伝子[Kazuko Yamaguchi-Shinozaki and Kazuo Shinozaki： Plant Cell 6：251-264(1994)]のプロモーター領域(rd29A遺伝子の翻訳開始点から-215〜-145の領域)を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、増幅することにより得ることができる。ここでPCRに用いることができる鋳型DNAとしては、例えばシロイヌナズナのゲノムDNAが挙げられるが、何等これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明に使用されるストレス応答性プロモーターにDREB遺伝子が連結した遺伝子として例えばrd29A-DREB1Aが挙げられるが、該遺伝子は特許第3178672号公報の実施例５に記載されている植物プラスミドpBI29AP:DREB1Aに由来するもので Kasugaらの報告[Nature Biotech., 17 287-291(1999)]でも報告されているストレス耐性遺伝子である。
【００３７】
このようなプロモーターについても上記DREB遺伝子同様、プロモーター活性を有する限りにおいて種々の変異体のものを用いることが出来る。該変異体の作成は、上記DREB遺伝子の記載同様、上記各種プロモーターに関わる文献に記載の塩基配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに実施できる。上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか否か、さらには、プロモーターを含むDNA又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、以下の実施例の記載に従って有用なDREB遺伝子を繋いで宿主細胞内で発現させることにより、各種バイオアッセイ（耐塩性、発根性、切花延命性等）により確かめることができ、このような方法は当業者であれば適宜行うことができる。
【００３８】
従って各種の植物細胞や植物体での使用目的に応じて、上記の各種ストレス応答性プロモーターや各種DREB遺伝子を適宜組合わせて選択使用し活性確認することができる。
【００３９】
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターをDREB遺伝子の下流に連結することもできる。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどが挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られているターミネーターであればこれに限定されるものではない。
【００４０】
また、必要に応じてプロモーター配列とDREB遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ(Adh1)のイントロン[Genes＆ Development 1:1183-1200(1987)]を導入することができる。
【００４１】
（２）形質転換植物を作成するためのDNA鎖
本発明の形質転換植物を作成するために、本発明のストレス応答性プロモーターとDREB遺伝子が連結したDNAを含んでなるDNA鎖が用いられる。本発明によるDNA鎖の具体的形態は、例えばプラスミド又はファージDNA中の構成要素の一部として、本発明のストレス応答性プロモーターとDREB遺伝子が連結したDNAが挿入された形態であってよい。
【００４２】
本発明のDNA鎖はさらに、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター等の構成要素を含むことができる。翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン及びターミネーターとしては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスRNA４、ブロモモザイクウイルスRNA３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる[Gallieら、Nuc. Acids Res., 15 (1987) 8693-8711]。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Glu）由来の配列[石田功、三沢典彦著、講談社サイエンティフィク編、細胞工学実験操作入門、講談社、p.119、1992]やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（PsaDb）由来の配列[Yamamotoら、J. Biol. Chem., 270 (1995) 12466-12470]などが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはTAA，TAG，TGAなどの配列が挙げられる[Molecular Cloning 前出等の記載]。ターミネーターとしては、例えば、nos遺伝子のターミネーター、ocs遺伝子のターミネーターなどが挙げられる[Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44 (1993) 985-994、"Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual"前出]。また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、35Sのエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており[Plant Cell, 1 (1989) 141-150]、この部分をDNA鎖の一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形でDNA鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
【００４３】
上記DNA鎖は、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のDNA鎖は、天然の供給源から単離されたものに限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、人工的な構築物であってもよい。該DNA鎖は、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。
【００４４】
（３）植物の形質転換
上記(１)において得られた遺伝子によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、ストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質を発現することができ、植物苗の増殖効率および切花の花持ちが改善された形質転換植物体を作製することができる。
【００４５】
形質転換後の本発明の前記DNA鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノムDNAの中に挿入された形で、微生物（特に細菌）、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のDNA鎖は、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物体中で安定に発現し得るように、本発明のDNA（プロモーター）、翻訳エンハンサー、構造遺伝子DNA、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
【００４７】
宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、世界での生産流通消費数量が多い３大切花であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニア等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。
【００４８】
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウイルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション["Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual"前出]、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー[Euphytica 85(1995)75-80、In Vitro Cell. Dev. Biol. 31(1995) 101-104、Plant Science 132(1998)31-43]によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
【００４９】
さらに、本発明のDNA鎖で形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作成することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、[植物細胞培養マニュアル]や[山田康之編著、講談社サイエンティフィク、1984]等の文献を参照されたい。
【００５０】
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。導入遺伝子がより強く発現している形質転換体は、導入遺伝子のDNA断片をプローブとして用いるノーザン法により宿主植物中に発現しているmRNAレベルを検定することによって選抜することができる。
【００５１】
本発明に用いる遺伝子を導入した形質転換体植物に目的の遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってDNAを抽出し、公知のPCR法又はサザン分析を用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。
【００５２】
（４）本発明の形質転換植物
本発明は、ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモータに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物体を提供する。イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物が挙げられ、特に好ましい具体例としては、世界での生産流通消費数量が多い３大切花であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニア等がある。本発明は増殖効率および発根率が非形質転換植物に比較して向上した上記植物の形質転換植物体の挿し穂、ならびに花持ち（切花延命性）が非形質転換植物に比較して向上した上記植物の形質転換植物体の切り花をも提供する。ここで、「挿し穂」とは挿木の目的で、植物体から切り取って挿すようにした枝、梢、茎および葉等をいい、「切花」とは枝、茎をつけたまま切り取った花をいう。
【００５３】
（５）挿し穂増殖効率および花持ち試験
本発明の形質転換植物は、挿し穂増殖効率、発根率および花持（切花延命性）が非形質転換植物に比較して向上している。
形質転換体植物の挿し穂増殖効率、発根率および花持ち（切花延命性）の評価は、植物生産の状態と同じ条件で効率を測定することによって評価することができる。例えば、キクにおける挿し穂増殖効率や発根率は、挿し穂を挿し穂用土に挿し2〜4週間後の生育状態を調べること、またその後鉢上げをしその成長は茎長などを測ることにより評価することができる。花持ちについては、鉢上げ後約４週間長日栽培し、その後約８週短日栽培を行い開花させる。キクを刈り取り１日暗所に放置後、水に生けその後の状態を観察することにより評価することができる。キクの一般的栽培法は、船越桂市編[切り花栽培の新技術 改訂キク1989誠文堂新光社]を参照されたい。
【００５４】
【実施例】
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 DREB1A 遺伝子を発現するキク植物体の作製
Kasugaらの報告[Nature Biotech., 17 (1999) 287-291]に記述されているrd29A-DREB1A発現ベクターを図１に記述する。このベクターをエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株に導入した。rd29A-DREB1Aを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株を下記のYEB-Km培地３mlに接種し、28℃で16時間、暗所で培養した後、遠心により集菌し、下記の感染培地10mlに懸濁して、これを感染液とした。YEB-Km培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。
【００５５】
【００５６】
キクの栽培品種である、リネカー（Chrysanthemum morifolium cv. Lineker又はDendranthema grandiflorum cv. Lineker）の無菌個体の葉を5-7mm角に切断し、rd29A-DREB1A発現ベクターを導入したアグロバクテリウム感染液に10分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して25℃の暗所で培養した。3日間培養した後、下記の選択培地に移植して３週間培養することにより、Km耐性のカルスを得た。選択培地での培養は25℃、16時間照明（光密度32μE/m2ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
【００５７】
【００５８】
得られたKm耐性のカルスからKmを含む選択培地で、植物体を再生させた。さらに、発根を促進するために、選択培地から植物生長調節物質（ナフタレン酢酸、ベンジルアデニン）を除いた発根促進培地で生長させた。
【００５９】
生長した植物体の中からDREB遺伝子を含有する個体を、PCRを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、DREB遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、GAGTCTTCGGTTTCCTCA（配列番号２９）、及びCGATACGTCGTCATCATC（配列番号３０）を用いた。PCRの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
これにより、同遺伝子が導入されたキク13系統が取得できた。
【００６０】
〔実施例２〕 耐塩性試験
非形質転換体リネカーと実施例１で得られた形質転換体リネカーすべてを下記（in vitro）の生育培地にNaClを0.1, 0.2, 0.4M添加したものに2-3枚の展開した葉をもつ頂芽を置床し２週間後の発根を観察した。rd29A-DREB1A遺伝子を導入していないものは0.2Mで発根が見られなくなったが、DREB遺伝子を導入したものは、系統14を除きすべて0.2Mで発根が認められ系統９では0.4Mでも発根が認められた。非形質転換体、系統番号９、系統番号10について以下の表１に示す。
【００６１】
【００６２】
【表１】
【００６３】
〔実施例３〕 挿し穂増殖およびその後の成長試験
非形質転換体リネカーと〔実施例１〕で得られた形質転換体リネカーのうち系統９と系統１０を温室で馴化し、挿し穂をとるための母株を作成した。それぞれから20本ずつの挿し穂をとり、十分湿らせた発根用土（赤玉土：鹿沼土＝１：１）に挿して通気性のある保湿カバーをし温室内で栽培した。21日後、発根用土から根を痛めないように回収し発根状態を観察した。発根が認められないもの（無）、発根量の大きいものから少なく小さいものを順に（大・中・小）で分類しその数を記述した結果を以下の表２と図１０に示す。驚くべきことにrd29A-DREB1A遺伝子の導入された系統９と系統10については非形質転換体リネカーに比べ、発根性が著しく向上した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
また、別に上記と同様の方法で挿し穂を18-20個体取得し、そのうち発根が良好なもの（上記区分で大と中）から10個体を選びビニールポットに定植した。その後の成長を検討するために茎長をはかることで記録したものが図１１である。この図からもわかるように、rd29A-DREB1A遺伝子の導入された系統９と系統10については非形質転換体リネカーに比べ、発根性がよいだけではなくその後の生育も良好であることが示された。
【００６６】
〔実施例４〕 花持ち試験
実施例３で得られた非形質転換体リネカーと形質転換体リネカーの系統９と系統１０のそれぞれ10個体を、その後、長日（明期18時間暗期6時間）条件で４週間長日栽培し、その後短日条件（明期10時間暗期14時間）で開花させた。先端の4-5輪開花した後、地上部を切断した。2時間30分、水道水の入ったバケツに挿し冷暗所に保存した。その後、17時間出荷用のダンボールにいれ室温で放置したのち水道水で生け、花持ち試験を行った。条件は11時間30分間、室内の蛍光灯を連続点灯した場所に放置し、2-3日ごとに生けている水道水を交換した。
【００６７】
花持ち試験開始、約２週間においては、非形質転換体リネカーと形質転換体リネカーでは差は認められなかったが、16日後に両形質転換系統では、切口の数センチ上部の茎より発根を認め、22日後では、非形質転換系統では全く見られなかった発根が、形質転換系統の大部分の個体で発根が観察できた（図１２、表３）。それに従い、発根した個体は発根していない個体と比較して明らかに植物の状態（花や茎・葉においての勢い・しおれ）が良く花持ちの延長が見られた（表４）。
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
いずれも良好な状態を示した個体は発根していた。
【００７０】
【発明の効果】
実施例に示すように、乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAをストレス応答性プロモーターの下流に連結した遺伝子（ストレス耐性遺伝子）を用いて形質転換を行った植物は、非形質転換植物に比較して発根率が向上し、および／または切花の花持ちが延長されている。また、該形質転換植物は発根後の生長も良好である。従って、本発明のDREB遺伝子を植物に導入する方法は、挿し木増殖での効率や発根率を高め、切花の花持ちが延長された植物の開発に有用である。
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２９：プライマー
配列番号３０：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】 ベクターrd29A-DREB1AのRBからLB間の構造を示す図である。
【図２−１】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図２−２】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１の続き）。
【図２−３】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-２の続き）。
【図２−４】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-３の続き）。
【図２−５】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-４の続き）。
【図２−６】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-５の続き）。
【図２−７】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-６の続き）。
【図２−８】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-７の続き）。
【図２−９】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-８の続き）。
【図２−１０】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-９の続き）。
【図２−１１】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１０の続き）。
【図２−１２】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１１の続き）。
【図２−１３】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１２の続き）。
【図２−１４】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１３の続き）。
【図２−１５】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１４の続き）。
【図２−１６】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１５の続き）。
【図３−１】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図３−２】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-１の続き）。
【図３−３】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-２の続き）。
【図３−４】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-３の続き）。
【図３−５】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-４の続き）。
【図３−６】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-５の続き）。
【図３−７】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-６の続き）。
【図３−８】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-７の続き）。
【図３−９】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-８の続き）。
【図４−１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図４−２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１の続き）。
【図４−３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２の続き）。
【図４−４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３の続き）。
【図４−５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-４の続き）。
【図４−６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-５の続き）。
【図４−７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-６の続き）。
【図４−８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-７の続き）。
【図４−９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-８の続き）。
【図４−１０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-９の続き）。
【図４−１１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１０の続き）。
【図４−１２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１１の続き）。
【図４−１３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１２の続き）。
【図４−１４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１３の続き）。
【図４−１５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１４の続き）。
【図４−１６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１５の続き）。
【図４−１７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１６の続き）。
【図４−１８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１７の続き）。
【図４−１９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１８の続き）。
【図４−２０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１９の続き）。
【図４−２１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２０の続き）。
【図４−２２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２１の続き）。
【図４−２３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２２の続き）。
【図４−２４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２３の続き）。
【図４−２５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２４の続き）。
【図４−２６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２５の続き）。
【図４−２７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２６の続き）。
【図４−２８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２７の続き）。
【図４−２９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２８の続き）。
【図４−３０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２９の続き）。
【図４−３１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３０の続き）。
【図４−３２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３１の続き）。
【図４−３３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３２の続き）。
【図４−３４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３３の続き）。
【図４−３５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３４の続き）。
【図４−３６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３５の続き）。
【図４−３７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３６の続き）。
【図４−３８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３７の続き）。
【図４−３９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３８の続き）。
【図４−４０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３９の続き）。
【図５−１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図５−２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１の続き）。
【図５−３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-２の続き）。
【図５−４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-３の続き）。
【図５−５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-４の続き）。
【図５−６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-５の続き）。
【図５−７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-６の続き）。
【図５−８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-７の続き）。
【図５−９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-８の続き）。
【図５−１０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-９の続き）。
【図５−１１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１０の続き）。
【図５−１２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１１の続き）。
【図５−１３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１２の続き）。
【図５−１４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１３の続き）。
【図５−１５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１４の続き）。
【図５−１６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１５の続き）。
【図５−１７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１６の続き）。
【図５−１８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１７の続き）。
【図５−１９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１８の続き）。
【図５−２０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１９の続き）。
【図６】 DREB1Aを基軸としたDREB1BからDREB1Fとの塩基配列レベルでのアラインメントを示す図である。
【図７−１】 DREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとの塩基配列レベルでのアラインメントを示す図である（DREB2Aの第518位まで）。
【図７−２】 DREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとの塩基配列レベルでのアラインメントを示す図である（DREB2Aの第519位から）。
【図８】 DREB1Aを基軸とした場合のDREB1BからDREB1Fとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントを示す図である。
【図９】 DREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントを示す図である。
【図１０】 挿し穂生産時の発根性試験の非形質転換体と系統9と系統10の発根性を示す写真である。
【図１１】 定植後の非形質転換体と系統9と系統10の茎長を示すグラフである。
【図１２】 花持ち試験開始後22日の非形質転換体と系統9と系統10の切口の近傍を示す写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子で植物を形質転換することを含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物を作成する方法ならびにストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物に関する。
【０００２】
本発明は、さらに発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された植物を作成するための乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAをストレス応答性プロモーターの下流に連結した遺伝子（ストレス耐性遺伝子）の使用に関する。
【０００３】
【従来の技術】
栽培植物は、種子繁殖や球根などの植物本来の機構による増殖と、挿し木（挿し芽、挿し穂）、組織培養などのクローン技術によって増殖が行われている。特に３大切花であるキク、カーネーション、バラは優良品種が作出されると、その枝や穂を挿し木（挿し芽・挿し穂）で増やし切花生産やその植物体の維持に使われている。この増殖の生産性を高めるためには、挿し木増殖の効率を上げる必要があり、最も製品率を上げるためには挿し木の発根性を上げる必要がある。これを解決するため商品名ルートン等に代表されるオーキシン類による薬剤処理が行われるが決して十分ではなく、コストや手間がかかるのが現状である。一方、切花において花持ちという性質は大変重要な形質であることはいうまでもない。花持ちに関する生化学的な検討がされ、老化ホルモンであるエチレンを物理的に吸収するなどの手法がとられている。しかしこの方法においても、エチレンで制御される花持ちは、切花の本体的な改善ではなく、部分的な改善に過ぎない。またエチレンの吸収や発生の抑制で改善される植物は限られた品種であり、もっとより広範囲かつ植物自体の状態の改善が望まれていた。しかも発根性と切花延命性を同時に向上させるような手段は知られていなかった。
【０００４】
これまで、人為的にクローン増殖性や花持ちが改善された植物を作出する場合、それぞれに優良な形質を示す系統の選抜や交配などの手法が用いられてきたが、選抜法には多くの時間が必要であり、一方、交配法は限られた種間にしか用いることができないため、挿し木増殖効率および花持ちが改善された植物の作出は困難であった。
【０００５】
近年のバイオテクノロジーの進歩に伴い、植物に異種生物由来の特定の遺伝子を導入する形質転換技術などの手法を用いて、様々な植物の作出が試みられている。これまでに、発根促進についてはrolC遺伝子を導入したカーネーションの例があるが、rolC遺伝子自身さまざまな植物で矮化や分枝性をあげることが知られており実用性は難しいと考えられる [J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126：13-18(2001)]。遺伝子組換えによるエチレン発生の抑制やエチレン受容機構に不感受性にするなどの試みがされており、作出された植物が、部分的な花持ちの向上（花弁等の老化の抑制）につながった報告も見うけられる[HortScience 30: 970-972(1995), Mol.Breed. 5: 301-308(1999)]。
【０００６】
一方、植物は、自然界において、乾燥、高温、低温又は塩などの様々な環境ストレスに曝されて生息している。植物は、動物のように移動によってストレスから身を守る行動をとることができないため、進化の過程で、様々なストレス耐性機構を獲得してきた。例えば、低温耐性植物(シロイヌナズナ、ホウレンソウ、レタス、エンドウ、オオムギ、テンサイなど)は、低温感受性植物(トウモロコシ、イネ、カボチャ、キュウリ、バナナ、トマトなど)よりも、生体膜脂質中の不飽和脂肪酸の含有割合が低く、そのため、低温に曝されても、生体膜脂質の相転移が起こりにくく、低温障害が生じにくい。これまで、人為的に環境ストレス耐性植物を作出する場合、乾燥、低温又は耐塩性の系統の選抜や交配などの手法が用いられてきたが、選抜法には多くの時間が必要であり、一方、交配法は限られた種間にしか用いることができないため、高い環境ストレス耐性を有する植物の作出は困難であった。
【０００７】
近年のバイオテクノロジーの進歩に伴い、植物に異種生物由来の特定の遺伝子を導入する形質転換技術などの手法を用いて、乾燥、低温、塩などに耐性の植物の作出が試みられている。もっとも実用性の高いとされる植物としてはストレス応答性プロモーターの下流に乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNA(DREB遺伝子という)が連結された遺伝子を導入することにより作出した、環境ストレス耐性の形質転換植物がある[特許第3178672号公報と特許第3183458号公報]。本方法により環境ストレス(乾燥ストレス、低温ストレス、塩ストレスなど)に対する耐性が向上し且つ矮化の起こらない形質転換植物が作出されている。しかしこれらストレス耐性の付与は特殊な条件下（継続的に砂漠地域、塩害地域、低温地域等）で栽培されることを想定した場合やあくまで植物が極度の環境ストレスに一時的に晒された場合の話であり、通常の栽培形態である挿し木増殖の発根率や通常の商品流通や消費形態である切り花にした際の花持ち（切花延命性）に好影響を与えるという報告はなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特許第3178672号公報
【特許文献２】
特許第3183458号公報
【非特許文献１】
J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126：13-18(2001)
【非特許文献２】
HortScience 30: 970-972(1995), Mol.Breed. 5: 301-308(1999)
【非特許文献３】
Mol.Breed. 5: 301-308(1999)
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発根率を高めることにより挿し木増殖での効率を高め、切花の花持ちが改善された植物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた実験を行っていた。ストレス耐性付与の目的で作成された特許第3178672号公報の実施例５に記載されている植物プラスミドpBI29AP:DREB1Aで形質転換したキクを得て、これをクローン増殖後に、切花を生産し、その花持ちを検定したところ、遺伝子導入前の品種と比較し、発根率、挿し木増殖性、花持ち（切花延命性）において明らかな優位性を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
（１） ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を用いて植物を形質転換することを含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物を作成する方法、
（２） ストレス応答性プロモーターが、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（３） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAがDREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（４） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが、
(a) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるDNAであってストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(b) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、ならびに
(c) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（５） ストレス応答性プロモーターのDNAが、
(a) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入されたものであってストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、
(b) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、ならびに
(c) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（１）の形質転換植物を作成する方法、
（６） ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物、
（７） ストレス応答性プロモーターが、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである（６）の形質転換植物、
（８） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAがDREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである（６）の形質転換植物、
（９） ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが、
(a) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるDNAであってストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(b) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、ならびに
(c) DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（６）の形質転換植物、ならびに
（１０） ストレス応答性プロモーターのDNAが、
(a) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入されたものであってストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、
(b) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA、ならびに
(c) rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性プロモーターのDNAとしての活性を有するDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである（６）の形質転換植物。さらに、上記（４）および（９）のDNAには、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAと実質的に同等の活性を有するDNAが、上記（５）および（１０）のDNAには、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1遺伝子プロモーターのうち少なくとも一つのDNAと実質的に同等の活性を有するDNAが含まれる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の形質転換植物は、ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれる乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNA(DREB遺伝子という)が連結された遺伝子（本明細書においてストレス耐性遺伝子と呼ぶこともある）を導入することにより作出した、発根率を高めることにより挿し木増殖での効率を高め、切花の花持ち（切花延命性）が向上された植物である。一例として、rd29Aプロモーターを用いた構成の遺伝子を示す（図１）。
【００１３】
（１）DREB遺伝子
本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子があり、これらを適宜使用することができる。DREB1A遺伝子は、DREB1A遺伝子[Kazuko Yamaguchi-Shinozaki and Kazuo Shinozaki：Plant Cell 6：251-264(1994)]のcDNA領域を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCRともいう)を行い、増幅することにより得ることができる。ここでPCRに用いることができる鋳型mRNAとしては、シロイヌナズナでMS培地 [Murashige and Skoog: Physiol. Plant. 15：473-497 (1962)] などの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体を乾燥ストレス(例えば、脱水状態にする)に曝露した状態から調製したmRNAが挙げられる。
【００１４】
またこれらの遺伝子は、特許第3178672号公報に記載されており、同公報の記載に従って取得することができる。また、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子、およびDREB2H遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７に示す。また、DREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子、およびDREB2H遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８に示す。さらに、DREB1A又はDREB2A遺伝子を含む組換えベクターは、大腸菌K-12株に導入され、DREB1A遺伝子を含む大腸菌は、受託番号FERM P-16936として、DREB2A遺伝子を含む大腸菌は、受託番号FERM P-16937として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６)に、平成10年８月11日付けで寄託されている。さらに、DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図２に、DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図３に、DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図４に、DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を図５に示した。このアラインメントは解析ソフトウェアとしてGENETYX-MAC version 12.0.0 を用いた。また、DREB1DからDREB1FおよびDREB2CからDREB2Hの塩基配列およびアミノ酸配列ならびにそれらの発現解析については Biochem.Biophys.Res.Comm, 290: 998-1009(2002)に記載されており、本願発明のDREB遺伝子を得るに当たって該文献を参照することもできる。
【００１５】
図２のDREB1A遺伝子からDREB1F遺伝子の塩基配列レベルでの配列比較より、DREB1AとDREB1BからDREB1Fの間の相同性は最も低くて54.7％である。また、DREB1BからDREB1Fの間で相同性が最も低いのはDREB1DとDREB1Eとの間で51.2％である。さらに、DREB1AからDREB1Fの間ではDREB1Aの約100位の塩基から約400位の塩基までの配列に相当する配列部分に共通配列が多く、DREB1Aの100位から400位の間の塩基配列に相当する部分の相同性が最も低いのはDREB1DとDREB1Eの間で約65％である。
【００１６】
従って、DREB1AからDREB1Fのいずれかの塩基配列と50％以上の相同性を有する塩基配列からなり、DREB1ファミリーの遺伝子のDNAであるDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB1Aの第100位から第400位の塩基配列部分またはDREB1BからDREB1Fの塩基配列のうち上記方法によりDREB1Aの塩基配列とアラインメントさせたときにDREB1Aの第100位から第400位の塩基配列部分に相当する塩基配列部分と相同性の高い塩基配列部分を有するDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB1AからDREB1Fの何れかとの相同性が少なくとも60％、好ましくは65％以上のDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記塩基配列部分を含むDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００１７】
図２のDREB1Aタンパク質からDREB1Fタンパク質のアミノ酸配列レベルでの配列比較より、DREB1AとDREB1BからDREB1Fの間の相同性は最も低くて43.9％である。また、DREB1BからDREB1Fの間で相同性が最も低いのはDREB1DとDREB1Eとの間で41.9％である。
【００１８】
従って、DREB1AからDREB1Fのいずれかのアミノ酸配列と40％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるDREB1ファミリーに属するタンパク質をコードするDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB1Aタンパク質の約31番目のアミノ酸から約120番目のアミノ酸配列部分またはDREB1Bタンパク質からDREB1Fタンパク質のアミノ酸配列のうち上記方法によりDREB1Aタンパク質のアミノ酸配列とアラインメントさせたときにDREB1Aの31番目のアミノ酸から120番目のアミノ酸配列部分に相当するアミノ酸配列部分と相同性の高いアミノ酸配列部分を有するタンパク質をコードするDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB1AからDREB1Fの何れかとの相同性が少なくとも60％、好ましくは70％以上のタンパク質をコードするDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記アミノ酸配列部分を含むタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、DREB1Aタンパク質からDREB1Fタンパク質のアミノ酸配列のうち、DREB1Aタンパク質の85番目から93番目のアミノ酸配列(MAARAHDVA)および95番目から105番目のアミノ酸配列(ALRGRSACLNF)はDREB1Aタンパク質からDREB1Fタンパク質に共通であり、この共通配列部分のすべてまたは一個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加された配列を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００１９】
図４のDREB2A遺伝子からDREB2H遺伝子の塩基配列レベルでの配列比較より、DREB2AとDREB2BからDREB2Hの間の相同性は最も低くて39.4％である。また、DREB2BからDREB2Hの間で相同性が最も低いのはDREB2GとDREB2Hとの間で38.4％である。さらに、DREB2AからDREB2Hの間では約180位の塩基から約400位の塩基までの配列部分に共通配列が多い。
【００２０】
従って、DREB2AからDREB2Hのいずれかの塩基配列と50％以上の相同性を有する塩基配列からなり、DREB2ファミリーの遺伝子のDNAであるDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB2Aの第180位から第400位の塩基配列部分またはDREB2BからDREB2Hの塩基配列のうち上記方法によりDREB2Aの塩基配列とアラインメントさせたときにDREB2Aの第180位から第400位の塩基配列部分に相当する塩基配列部分と相同性の高い塩基配列部分を有するDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB2AからDREB2Hの何れかとの相同性が少なくとも40％、好ましくは50％以上のDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記塩基配列部分を含むDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００２１】
図５のDREB2Aタンパク質からDREB2Hタンパク質のアミノ酸配列レベルでの配列比較より、DREB2AとDREB2BからDREB2Hの間の相同性は最も低くて26.1％である。また、DREB2BからDREB2Hの間で相同性が最も低いのはDREB2FとDREB2Gとの間で21.5％である。
【００２２】
従って、DREB2AからDREB2Hのいずれかのアミノ酸配列と20％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるDREB2ファミリーに属するタンパク質をコードするDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。このようなDNAの中でも特にDREB2Aタンパク質の約61番目のアミノ酸から約130番目のアミノ酸配列部分またはDREB2Bタンパク質からDREB2Hタンパク質のアミノ酸配列のうち上記方法によりDREB2Aタンパク質のアミノ酸配列とアラインメントさせたときにDREB2Aの61番目のアミノ酸から130番目のアミノ酸配列部分に相当するアミノ酸配列部分と相同性の高いアミノ酸配列部分を有するタンパク質をコードするDNAを好適に用いることができ、該部分のDREB2AからDREB2Hの何れかとの相同性が少なくとも20％、好ましくは30％以上のタンパク質をコードするDNAを本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、少なくとも上記アミノ酸配列部分を含むタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。さらに、DREB2Aタンパク質からDREB2Hタンパク質のアミノ酸配列のうち、DREB2Aタンパク質の88番目から98番目のアミノ酸配列(WGKWVAEIREP)はDREB2Aタンパク質からDREB2Hタンパク質に共通であり、この共通配列部分のすべてまたは一個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加された配列を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００２３】
なお、ファミリーとはDREB1A〜FおよびDREB2A〜Hと分子系統的に関連がありアミノ酸配列レベルで一定の相同性を有する分子群に属する分子をいい、DREB1A〜FおよびDREB2A〜H以外のものを含む。
【００２４】
また、図６にDREB1Aを基軸としたDREB1BからDREB1Fとの塩基配列レベルでのアラインメントを、図７にDREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとの塩基配列レベルでのアラインメントを、図８にDREB1Aを基軸とした場合のDREB1BからDREB1Fとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントを、図９にDREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントをそれぞれ示した。上記のようなDREB1AやDREB2Aを基軸とした場合の各共通塩基配列、当該配列の縮重異性体、当該配列との相同性が80％以上のもの、当該配列に相補的なDNAからなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするもののうちのいずれからなるDNAは本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。また、上記のようなDREB1AやDREB2Aを基軸とした場合の共通アミノ酸配列、当該配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入された配列のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の乾燥ストレス応答性エレメント（DRE）に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する転写因子をコードするDNAとして用いることができる。
【００２５】
以下に、DREB1A〜１Fの間のアミノ酸レベルでの共通配列、DREB2A〜2Hの間のアミノ酸レベルでの共通配列、DREB1A〜１Fの間の塩基レベルでの共通配列、DREB2A〜2Hの間の塩基配列レベルでの共通配列を示す。
【００２６】
上記各種遺伝子をコードするアミノ酸配列からなるタンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個またはそれ以上（複数個、数個）のアミノ酸に欠失、置換、付加などの変異が生じたタンパク質をコードするDREB1かDREB2のファミリー以外の変異型遺伝子は各々の遺伝子と同等のものとして本発明に用いることができる。
【００２８】
例えば、これらのアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質をコードする遺伝子も、当該タンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、本発明に用いることができる。
【００２９】
また、上記各種遺伝子のDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAも、当該DNAがコードするタンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、各々の遺伝子と同等のものとして本発明に用いることができる。ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう[Molecular Cloning（Sambrookら編集(1989)Cold Spring Harbor Lab. Press, New York）]。
【００３０】
なお、変異型遺伝子は、Kunkel法や Gapped duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)など）を用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて作製することができる。上記突然変異誘発法については、DREB遺伝子の塩基配列を参照すれば、Molecular Cloning（Sambrookら編集(1989) 15 Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA, 15.3〜15.113 Cold Spring Harbor Lab. Press, New York）等の文献の記載に従って当業者であれば格別の困難性なしに選択し実施することにより、上記変異型遺伝子を製造することができることは明らかである。さらに当業者であれば、DREB遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上（１または数個以上）の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)5662-5666、WO85/00817、Nature 316(1985)601-605、Gene 34(1985)315-323、Nucleic Acids Res. 13(1985)4431-4442、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982)6409-6413、Science 224(1984)1431-1433等に記載の技術に従って変異体を取得し、これを利用することができる。
【００３１】
さらに、本発明のDREB遺伝子には、DREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する限り、上記のDREB各遺伝子の塩基配列やそれらの各共通塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列（変異体）も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：例えばGENETYX-MAC version 12.0.0を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
【００３２】
このようなDREB遺伝子の塩基配列を含むDNA又はその部分の変異体は、DREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、該塩基配列を含むDNA又はその部分のDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する活性と同等の活性を実質的に有することが好ましい。ここで、これらのDNA又はその部分の「DREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する活性と同等の活性を実質的に有する」とは、該活性を利用した実際の使用態様において、これらのDNA又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいう該活性は、例えば植物細胞や植物体、好ましくは双子葉植物の細胞や植物体における活性、より好ましくはキク植物の細胞や植物体における活性、最も好ましくはキク栽培品種リネカー（Chrysanthemum morifolium cv. Lineker又はDendranthema grandiflorum cv. Lineker）植物の細胞や植物体における活性をいう。これらの活性の測定は、特許第3178672号公報記載の方法に従って行うことができる。
【００３３】
一旦DREB遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNAもしくはゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、DREB遺伝子を得ることができる。
【００３４】
DREB遺伝子は、転写を活性化するタンパク質をコードする遺伝子であるため、該遺伝子を導入した植物は、発現されたDREBタンパク質の作用で種々の遺伝子が活性化され、それに伴うエネルギー消費の増大や代謝の活性化により植物自身の生育が抑制される場合がある。これを防止するため、ストレス負荷時にのみDREB遺伝子が発現されるように、ストレス応答性プロモーターをDREB遺伝子上流に連結することが考えられる。例えば、そのようなプロモーターとしては、例えば以下のものが挙げられる。
rd29A遺伝子プロモーター[Yamaguchi-Shinozaki,K. et al.：Plant Cell,6:251-264 (1994)]、rd29B遺伝子プロモーター[Yamaguchi-Shinozaki,K. et al.： Plant Cell, 6:251-264 (1994)]、rd17遺伝子プロモーター[Iwasaki,T. et al.：Plant Physiol.,115:1287(1997)]、rd22遺伝子プロモーター[Iwasaki,T. et al.：Mol. Gen. Genet.,247:391-398(1995)]、 DREB1A遺伝子プロモーター[Shinwari,Z.K. et al.：Biochem. Biophys. Res. Com. 250:161-170(1998)]、cor6.6遺伝子プロモーター[Wang, H. et al.：Plant Mol. Biol. 28:619-634(1995)]、cor15a遺伝子プロモーター[Baker, S.S. et al.：Plant Mol. Biol. 24:701-713(1994)]、erd1遺伝子プロモーター[Nakashima K. et al.：Plant J. 12:851-861(1997)]、およびkin1遺伝子プロモーター[Wang,H．et al.：Plant Mol. Biol.28:605-617(1995)]である。
【００３５】
但し、ストレス応答性であり、且つ植物細胞や植物体内で機能するものであれば、上記プロモーターに限定されるものではない。なお、これらのプロモーターは、該プロモーターを含むDNAの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムDNAを鋳型として、PCRによる増幅反応によって得ることができる。具体的には、乾燥ストレス耐性遺伝子の１つであるrd29A遺伝子[Kazuko Yamaguchi-Shinozaki and Kazuo Shinozaki： Plant Cell 6：251-264(1994)]のプロモーター領域(rd29A遺伝子の翻訳開始点から-215〜-145の領域)を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、増幅することにより得ることができる。ここでPCRに用いることができる鋳型DNAとしては、例えばシロイヌナズナのゲノムDNAが挙げられるが、何等これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明に使用されるストレス応答性プロモーターにDREB遺伝子が連結した遺伝子として例えばrd29A-DREB1Aが挙げられるが、該遺伝子は特許第3178672号公報の実施例５に記載されている植物プラスミドpBI29AP:DREB1Aに由来するもので Kasugaらの報告[Nature Biotech., 17 287-291(1999)]でも報告されているストレス耐性遺伝子である。
【００３７】
このようなプロモーターについても上記DREB遺伝子同様、プロモーター活性を有する限りにおいて種々の変異体のものを用いることが出来る。該変異体の作成は、上記DREB遺伝子の記載同様、上記各種プロモーターに関わる文献に記載の塩基配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに実施できる。上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか否か、さらには、プロモーターを含むDNA又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、以下の実施例の記載に従って有用なDREB遺伝子を繋いで宿主細胞内で発現させることにより、各種バイオアッセイ（耐塩性、発根性、切花延命性等）により確かめることができ、このような方法は当業者であれば適宜行うことができる。
【００３８】
従って各種の植物細胞や植物体での使用目的に応じて、上記の各種ストレス応答性プロモーターや各種DREB遺伝子を適宜組合わせて選択使用し活性確認することができる。
【００３９】
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターをDREB遺伝子の下流に連結することもできる。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどが挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られているターミネーターであればこれに限定されるものではない。
【００４０】
また、必要に応じてプロモーター配列とDREB遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ(Adh1)のイントロン[Genes＆ Development 1:1183-1200(1987)]を導入することができる。
【００４１】
（２）形質転換植物を作成するためのDNA鎖
本発明の形質転換植物を作成するために、本発明のストレス応答性プロモーターとDREB遺伝子が連結したDNAを含んでなるDNA鎖が用いられる。本発明によるDNA鎖の具体的形態は、例えばプラスミド又はファージDNA中の構成要素の一部として、本発明のストレス応答性プロモーターとDREB遺伝子が連結したDNAが挿入された形態であってよい。
【００４２】
本発明のDNA鎖はさらに、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、ターミネーター等の構成要素を含むことができる。翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン及びターミネーターとしては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスRNA４、ブロモモザイクウイルスRNA３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる[Gallieら、Nuc. Acids Res., 15 (1987) 8693-8711]。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Glu）由来の配列[石田功、三沢典彦著、講談社サイエンティフィク編、細胞工学実験操作入門、講談社、p.119、1992]やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（PsaDb）由来の配列[Yamamotoら、J. Biol. Chem., 270 (1995) 12466-12470]などが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはTAA，TAG，TGAなどの配列が挙げられる[Molecular Cloning 前出等の記載]。ターミネーターとしては、例えば、nos遺伝子のターミネーター、ocs遺伝子のターミネーターなどが挙げられる[Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44 (1993) 985-994、"Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual"前出]。また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、35Sのエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており[Plant Cell, 1 (1989) 141-150]、この部分をDNA鎖の一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形でDNA鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
【００４３】
上記DNA鎖は、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のDNA鎖は、天然の供給源から単離されたものに限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、人工的な構築物であってもよい。該DNA鎖は、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。
【００４４】
（３）植物の形質転換
上記(１)において得られた遺伝子によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、ストレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質を発現することができ、植物苗の増殖効率および切花の花持ちが改善された形質転換植物体を作製することができる。
【００４５】
形質転換後の本発明の前記DNA鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノムDNAの中に挿入された形で、微生物（特に細菌）、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のDNA鎖は、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物体中で安定に発現し得るように、本発明のDNA（プロモーター）、翻訳エンハンサー、構造遺伝子DNA、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
【００４７】
宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、世界での生産流通消費数量が多い３大切花であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニア等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。
【００４８】
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウイルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション["Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual"前出]、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー[Euphytica 85(1995)75-80、In Vitro Cell. Dev. Biol. 31(1995) 101-104、Plant Science 132(1998)31-43]によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
【００４９】
さらに、本発明のDNA鎖で形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作成することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、[植物細胞培養マニュアル]や[山田康之編著、講談社サイエンティフィク、1984]等の文献を参照されたい。
【００５０】
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。導入遺伝子がより強く発現している形質転換体は、導入遺伝子のDNA断片をプローブとして用いるノーザン法により宿主植物中に発現しているmRNAレベルを検定することによって選抜することができる。
【００５１】
本発明に用いる遺伝子を導入した形質転換体植物に目的の遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってDNAを抽出し、公知のPCR法又はサザン分析を用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。
【００５２】
（４）本発明の形質転換植物
本発明は、ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモータに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物体を提供する。イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物が挙げられ、特に好ましい具体例としては、世界での生産流通消費数量が多い３大切花であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニア等がある。本発明は増殖効率および発根率が非形質転換植物に比較して向上した上記植物の形質転換植物体の挿し穂、ならびに花持ち（切花延命性）が非形質転換植物に比較して向上した上記植物の形質転換植物体の切り花をも提供する。ここで、「挿し穂」とは挿木の目的で、植物体から切り取って挿すようにした枝、梢、茎および葉等をいい、「切花」とは枝、茎をつけたまま切り取った花をいう。
【００５３】
（５）挿し穂増殖効率および花持ち試験
本発明の形質転換植物は、挿し穂増殖効率、発根率および花持（切花延命性）が非形質転換植物に比較して向上している。
形質転換体植物の挿し穂増殖効率、発根率および花持ち（切花延命性）の評価は、植物生産の状態と同じ条件で効率を測定することによって評価することができる。例えば、キクにおける挿し穂増殖効率や発根率は、挿し穂を挿し穂用土に挿し2〜4週間後の生育状態を調べること、またその後鉢上げをしその成長は茎長などを測ることにより評価することができる。花持ちについては、鉢上げ後約４週間長日栽培し、その後約８週短日栽培を行い開花させる。キクを刈り取り１日暗所に放置後、水に生けその後の状態を観察することにより評価することができる。キクの一般的栽培法は、船越桂市編[切り花栽培の新技術 改訂キク1989誠文堂新光社]を参照されたい。
【００５４】
【実施例】
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 DREB1A 遺伝子を発現するキク植物体の作製
Kasugaらの報告[Nature Biotech., 17 (1999) 287-291]に記述されているrd29A-DREB1A発現ベクターを図１に記述する。このベクターをエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株に導入した。rd29A-DREB1Aを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株を下記のYEB-Km培地３mlに接種し、28℃で16時間、暗所で培養した後、遠心により集菌し、下記の感染培地10mlに懸濁して、これを感染液とした。YEB-Km培地及び感染培地の培地組成は、以下の通りである。
【００５５】
キクの栽培品種である、リネカー（Chrysanthemum morifolium cv. Lineker又はDendranthema grandiflorum cv. Lineker）の無菌個体の葉を5-7mm角に切断し、rd29A-DREB1A発現ベクターを導入したアグロバクテリウム感染液に10分間浸し、過剰な感染液を濾紙上で拭き取った後、下記の共存培地に移植して25℃の暗所で培養した。3日間培養した後、下記の選択培地に移植して３週間培養することにより、Km耐性のカルスを得た。選択培地での培養は25℃、16時間照明（光密度32μE/m2ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
【００５７】
得られたKm耐性のカルスからKmを含む選択培地で、植物体を再生させた。さらに、発根を促進するために、選択培地から植物生長調節物質（ナフタレン酢酸、ベンジルアデニン）を除いた発根促進培地で生長させた。
【００５９】
生長した植物体の中からDREB遺伝子を含有する個体を、PCRを行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換体であることを確認した。ここで、DREB遺伝子特有の配列を特異的に増幅するプライマーとして、GAGTCTTCGGTTTCCTCA（配列番号２９）、及びCGATACGTCGTCATCATC（配列番号３０）を用いた。PCRの反応条件は、９４℃で５分間の加熱後、９４℃（３０秒）−５５℃（１分）−７２℃（１分）のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間反応させた。この反応では、酵素としてTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
これにより、同遺伝子が導入されたキク13系統が取得できた。
【００６０】
〔実施例２〕 耐塩性試験
非形質転換体リネカーと実施例１で得られた形質転換体リネカーすべてを下記（in vitro）の生育培地にNaClを0.1, 0.2, 0.4M添加したものに2-3枚の展開した葉をもつ頂芽を置床し２週間後の発根を観察した。rd29A-DREB1A遺伝子を導入していないものは0.2Mで発根が見られなくなったが、DREB遺伝子を導入したものは、系統14を除きすべて0.2Mで発根が認められ系統９では0.4Mでも発根が認められた。非形質転換体、系統番号９、系統番号10について以下の表１に示す。
【００６１】
【表１】
〔実施例３〕 挿し穂増殖およびその後の成長試験
非形質転換体リネカーと〔実施例１〕で得られた形質転換体リネカーのうち系統９と系統１０を温室で馴化し、挿し穂をとるための母株を作成した。それぞれから20本ずつの挿し穂をとり、十分湿らせた発根用土（赤玉土：鹿沼土＝１：１）に挿して通気性のある保湿カバーをし温室内で栽培した。21日後、発根用土から根を痛めないように回収し発根状態を観察した。発根が認められないもの（無）、発根量の大きいものから少なく小さいものを順に（大・中・小）で分類しその数を記述した結果を以下の表２と図１０に示す。驚くべきことにrd29A-DREB1A遺伝子の導入された系統９と系統10については非形質転換体リネカーに比べ、発根性が著しく向上した。
【００６４】
【表２】
また、別に上記と同様の方法で挿し穂を18-20個体取得し、そのうち発根が良好なもの（上記区分で大と中）から10個体を選びビニールポットに定植した。その後の成長を検討するために茎長をはかることで記録したものが図１１である。この図からもわかるように、rd29A-DREB1A遺伝子の導入された系統９と系統10については非形質転換体リネカーに比べ、発根性がよいだけではなくその後の生育も良好であることが示された。
【００６６】
〔実施例４〕 花持ち試験
実施例３で得られた非形質転換体リネカーと形質転換体リネカーの系統９と系統１０のそれぞれ10個体を、その後、長日（明期18時間暗期6時間）条件で４週間長日栽培し、その後短日条件（明期10時間暗期14時間）で開花させた。先端の4-5輪開花した後、地上部を切断した。2時間30分、水道水の入ったバケツに挿し冷暗所に保存した。その後、17時間出荷用のダンボールにいれ室温で放置したのち水道水で生け、花持ち試験を行った。条件は11時間30分間、室内の蛍光灯を連続点灯した場所に放置し、2-3日ごとに生けている水道水を交換した。
【００６７】
花持ち試験開始、約２週間においては、非形質転換体リネカーと形質転換体リネカーでは差は認められなかったが、16日後に両形質転換系統では、切口の数センチ上部の茎より発根を認め、22日後では、非形質転換系統では全く見られなかった発根が、形質転換系統の大部分の個体で発根が観察できた（図１２、表３）。それに従い、発根した個体は発根していない個体と比較して明らかに植物の状態（花や茎・葉においての勢い・しおれ）が良く花持ちの延長が見られた（表４）。
【００６８】
【表３】
【表４】
【００７０】
【発明の効果】
実施例に示すように、乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration responsive element)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAをストレス応答性プロモーターの下流に連結した遺伝子（ストレス耐性遺伝子）を用いて形質転換を行った植物は、非形質転換植物に比較して発根率が向上し、および／または切花の花持ちが延長されている。また、該形質転換植物は発根後の生長も良好である。従って、本発明のDREB遺伝子を植物に導入する方法は、挿し木増殖での効率や発根率を高め、切花の花持ちが延長された植物の開発に有用である。
【配列表】
配列番号２９：プライマー
配列番号３０：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】 ベクターrd29A-DREB1AのRBからLB間の構造を示す図である。
【図２−１】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図２−２】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１の続き）。
【図２−３】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-２の続き）。
【図２−４】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-３の続き）。
【図２−５】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-４の続き）。
【図２−６】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-５の続き）。
【図２−７】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-６の続き）。
【図２−８】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-７の続き）。
【図２−９】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-８の続き）。
【図２−１０】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-９の続き）。
【図２−１１】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１０の続き）。
【図２−１２】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１１の続き）。
【図２−１３】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１２の続き）。
【図２−１４】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１３の続き）。
【図２−１５】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１４の続き）。
【図２−１６】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図２-１５の続き）。
【図３−１】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図３−２】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-１の続き）。
【図３−３】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-２の続き）。
【図３−４】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-３の続き）。
【図３−５】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-４の続き）。
【図３−６】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-５の続き）。
【図３−７】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-６の続き）。
【図３−８】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-７の続き）。
【図３−９】 DREB1Aを基軸とした、DREB1BからDREB1Fとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図３-８の続き）。
【図４−１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図４−２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１の続き）。
【図４−３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２の続き）。
【図４−４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３の続き）。
【図４−５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-４の続き）。
【図４−６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-５の続き）。
【図４−７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-６の続き）。
【図４−８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-７の続き）。
【図４−９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-８の続き）。
【図４−１０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-９の続き）。
【図４−１１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１０の続き）。
【図４−１２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１１の続き）。
【図４−１３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１２の続き）。
【図４−１４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１３の続き）。
【図４−１５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１４の続き）。
【図４−１６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１５の続き）。
【図４−１７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１６の続き）。
【図４−１８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１７の続き）。
【図４−１９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１８の続き）。
【図４−２０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-１９の続き）。
【図４−２１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２０の続き）。
【図４−２２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２１の続き）。
【図４−２３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２２の続き）。
【図４−２４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２３の続き）。
【図４−２５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２４の続き）。
【図４−２６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２５の続き）。
【図４−２７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２６の続き）。
【図４−２８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２７の続き）。
【図４−２９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２８の続き）。
【図４−３０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-２９の続き）。
【図４−３１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３０の続き）。
【図４−３２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３１の続き）。
【図４−３３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３２の続き）。
【図４−３４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３３の続き）。
【図４−３５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３４の続き）。
【図４−３６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３５の続き）。
【図４−３７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３６の続き）。
【図４−３８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３７の続き）。
【図４−３９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３８の続き）。
【図４−４０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１での塩基配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図４-３９の続き）。
【図５−１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である。
【図５−２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１の続き）。
【図５−３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-２の続き）。
【図５−４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-３の続き）。
【図５−５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-４の続き）。
【図５−６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-５の続き）。
【図５−７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-６の続き）。
【図５−８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-７の続き）。
【図５−９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-８の続き）。
【図５−１０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-９の続き）。
【図５−１１】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１０の続き）。
【図５−１２】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１１の続き）。
【図５−１３】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１２の続き）。
【図５−１４】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１３の続き）。
【図５−１５】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１４の続き）。
【図５−１６】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１５の続き）。
【図５−１７】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１６の続き）。
【図５−１８】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１７の続き）。
【図５−１９】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１８の続き）。
【図５−２０】 DREB2Aを基軸とした、DREB2BからDREB2Hとの１対１でのアミノ酸配列レベルでのアラインメント、共通配列および相同性％を示す図である（図５-１９の続き）。
【図６】 DREB1Aを基軸としたDREB1BからDREB1Fとの塩基配列レベルでのアラインメントを示す図である。
【図７−１】 DREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとの塩基配列レベルでのアラインメントを示す図である（DREB2Aの第518位まで）。
【図７−２】 DREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとの塩基配列レベルでのアラインメントを示す図である（DREB2Aの第519位から）。
【図８】 DREB1Aを基軸とした場合のDREB1BからDREB1Fとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントを示す図である。
【図９】 DREB2Aを基軸とした場合のDREB2BからDREB2Hとのアミノ酸配列レベルでのアラインメントを示す図である。
【図１０】 挿し穂生産時の発根性試験の非形質転換体と系統9と系統10の発根性を示す写真である。
【図１１】 定植後の非形質転換体と系統9と系統10の茎長を示すグラフである。
【図１２】 花持ち試験開始後22日の非形質転換体と系統9と系統10の切口の近傍を示す写真である。
Claims (2)
- ストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性プロモーターに含まれるストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を用いて植物を形質転換することを含み、ストレス応答性プロモーターが、 rd29A 遺伝子プロモーター、 rd29B 遺伝子プロモーター、 rd17 遺伝子プロモーター、 rd22 遺伝子プロモーター、 DREB1A 遺伝子プロモーター、 cor6.6 遺伝子プロモーター、 cor15a 遺伝子プロモーター、 erd1 遺伝子プロモーターおよび kin1 遺伝子プロモーターからなる群から選択され、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードする DNA が DREB1A 遺伝子、 DREB1B 遺伝子、 DREB1C 遺伝子、 DREB1D 遺伝子、 DREB1E 遺伝子、 DREB1F 遺伝子、 DREB2A 遺伝子、 DREB2B 遺伝子、 DREB2C 遺伝子、 DREB2D 遺伝子、 DREB2E 遺伝子、 DREB2F 遺伝子、 DREB2G 遺伝子および DREB2H 遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、発根率が向上された、および／または切花の花持ちが延長された形質転換植物を作成する方法。
- ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするDNAが、
(a) DREB1A 遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、付加、もしくは挿入された塩基配列からなるDNAであってストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(b) DREB1A 遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAの塩基配列と少なくとも９４％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA、ならびに
(c) DREB1A 遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB1D遺伝子、DREB1E遺伝子、DREB1F遺伝子、DREB2A遺伝子、DREB2B遺伝子、DREB2C遺伝子、DREB2D遺伝子、DREB2E遺伝子、DREB2F遺伝子、DREB2G遺伝子およびDREB2H遺伝子のうち少なくとも一つのDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメントの下流の遺伝子の転写を制御する活性を有するタンパク質をコードするDNA
からなる群から選択される少なくとも１つのDNAである請求項１に記載の形質転換植物を作成する方法。
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