JP4168137B2 - 分子加工用部材 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブ先端に酵素が固定化されていることを特徴とする分子加工用部材、および該加工用部材を使用して分子を加工する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、ナノテクノロジー技術の発展により、様々な機能を持つチップの開発が進み、例えば、プロテインチップやμTAS(Micro Total Analysisi System)センサーチップ などが開発され、生体試料の解析、あるいは疾病の診断等に用いられているが、これら試料を大量にかつより短時間で処理するためには、さらにこれらチップの微細化が必要となるほか、チップの感度を高めるために、チップ表面の分子修飾も必要になる。これらのためには、分子レベルでの超細密加工が必要であり、チップ基板上の決められた位置において、分子の分解、連結あるいは修飾等を行うための技術が必要である。
【0003】
従来の基板上での分子配列を行う方法としては DPN法があげられる。この方法では溶液中で操作を行うことが困難であり、溶液中での操作が必要となる生体分子を扱うには現段階では適している方法ではない。他の方法として、基板を鋭利な探針で引っ掻くなどして、基板上の物質を削り取った後、その領域に配列させる手段が報告されている。この方法では自己組織化膜を使用するために、試料の安定性と固定する物質に制限をうけることになる。また、基板上に酵素を固定化し、その基質を溶液中に添加することにより、分解された物質が基板に固定化させるような方法もあるが、基板に酵素が残ってしまう問題点がある。
【0004】
【発明の課題】
本発明の課題は、上記実情に鑑み、分子レベルでの超細密加工が可能で、基板上の決められた位置で、分子の分解、連結あるいは修飾等を行うための手段を新たに提供しようとするものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は鋭意研究の結果、位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブ、具体的には原子間力顕微鏡あるいは分子間力測定装置のプローブ先端に、酵素を固定化することにより、分子加工用部材を構成し、これを使用することにより、分子の
加工をナノスケールで行うことが可能であることを見いだし、本発明を完成させたものである。
【0006】
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(5)に関する。
(1)位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブ先端に酵素が固定化されているタンパク質分子加工用部材であって、上記プローブがシリコン製あるいは窒化シリコン製であり、上記酵素が V8 セリンプロテアーゼであり、該プローブを酸化処理し、チオール基を有するシラン化剤でプローブ表面を処理した後、ヘテロ架橋化試薬により、 V8 セリンプロテアーゼが該プローブ先端に固定化されたものであることを特徴とする、上記タンパク質分子加工用部材。
(2)位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブが原子間力顕微鏡又は分子間力測定装置のプローブである上記(1)に記載のタンパク質分子加工用部材。
(3)基材上に配置したタンパク質分子を上記(1)に記載のタンパク質分子加工用部材を用いて加工することを特徴とする、タンパク質分子の加工方法。
(4)基材上のタンパク質分子表面に、上記(1)に記載のタンパク質分子加工用部材を接触させて局所的に反応を生じさせることにより、タンパク質分子表面に該反応に対応するパターンを形成させることを特徴とする、タンパク質分子の加工方法。
(5)タンパク質分子が、表面走査用プローブ先端に固定されたV8 セリンプロテアーゼにより分解されるものであり、基質表面に形成されるパターンが、タンパク質分子の酵素分解反応に基づくエッチングによるものである。上記(4)に記載のタンパク質分子の加工方法。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明は、位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブ先端に酵素が固定化されていることを特徴とする分子加工用部材およびこれを使用して分子の加工を行うものである。
本発明において用いる表面走査用プローブは、位置決め手段により位置決め可能なものであればどのようなものであっても使用できるが、特に原子間力顕微鏡又は分子間力測定装置の表面走査用プローブを用いるのが簡便で好ましい。
【0008】
また、これら原子間力顕微鏡又は分子間力測定装置は、プローブの位置検出手段、その移動手段および位置制御手段等からなる位置決め手段、被観察対象の画像化手段等を内蔵しており、これらは本発明においてそのまま利用できる。酵素のプローブ先端への固定化は常法により行う。例えば、最も簡便な方法としては、プローブ表面に物理吸着により固定化する方法があるが、酵素の失活、脱離などの問題を含む。プローブがシリコン製乃至窒化シリコン製の場合、酸化処理を行い、チオール基を有するシラン化剤で、プローブ表面を処理した後、(N-(6Maleimidocaproxy)succinimide)等のヘテロ架橋化試薬等を使用してプローブ表面に形成したチオール基と該試薬の一方の官能基とを結合させ、該試薬の他方の官能基と酵素のアミノ基を結合させて、酵素をプローブに固定化する。他にもシラン化剤は、アミノ基を有するもの、カルボキシル基を有するものなどを使用でき、適した架橋化試薬を用いることで、酵素を固定化することが可能である。また、プローブ表面が金などの薄膜で被覆されている場合は、アルカンチオールを持つ分子の自己集合膜を形成させ、更にこの自己集合膜形成分子と酵素を、架橋化試薬を用いて結合させる方法を用いることが出来る。ポリスチレンなどからなる微小なビーズ上に酵素を固定化し、そのビーズをプローブ先端に接着剤等を用いて固定化する方法がある。ビーズを用いた場合は、プローブ先端と比べ半径が大きく、接触面積が大きいためマイクロメートルスケールの加工となるが、大量に加工したい場合は有効である。
【0009】
例えば、本発明による基材表面の分子に対する加工精度は、基本的にプローブ先端の曲率半径に依存するが、現在のプローブ作製技術では数十ナノメートルの曲率半径のものを作製できる。すなわち本方法では、数十ナノメートルの加工精度で分子加工することが可能である。したがって、例えば基材表面に複数種類の分子を配置する場合、その異種分子同士の間隔は極めて小さく出来る。
本発明においては、酵素および酵素反応の対象となる基質分子については特に限定されず。様々な酵素反応を用いて分子を加工できる。これら酵素と基質について、その組み合わせを例示する。
【0010】
【表】
【0011】
上記分解反応による分子加工においては、例えばタンパク質を基材表面に固定化した後プロテアーゼ固定化プローブを、基材表面を接触させながら適宜設定したパターンで移動させる。これにより基材表面のタンパク質は、上記プローブが接触した部分のみが分解され、上記パターンがエッチングされる。この微小な空間に目的機能を持ったタンパク質をナノスケールの高精度で配列させる技術は、微細加工された流路や、送液システムなどを設計し開発されるμTASなどの技術と組み合わせることによって、高機能なマイクロリアクタ、マイクロセンサー、マイクロチップなどの開発に応用される。
【0012】
上記分子修飾による分子加工においては、例えば、キナーゼによるタンパク質のリン酸化修飾を行ったチップなどを作製することが出来る。このようなチップは細胞内のシグナルトランスダクションの詳細な解析を行うツールとして利用することが出来る。
上記分子連結による加工においては、DNAリガーゼなどの酵素を使って、DNAを1種類ずつ非常に小さな面積で結合させ、超高密度DNAチップを作製することが出来る。現在のDNAチップ技術では、通常DNAチップなどで用いられるスポットの外径は50-300mmである。マイクロコンタクトプリンティングの手法では、50nmのパターン形成が報告されているが、1種類のDNA分子の転写しかできない。米国AFFYMETRIX社の開発した光脱保護技術による固相合成DNAチップでは、光リソグラフィー技術の精度に依存した高密度のDNAチップが作製可能であるが、任意のDNA配列をアレイ化することは出来ない。これらに対し、本技術では、数十ナノメートルのスポット精度で多種で、任意の配列のDNA分子をアレイ化させたチップの作製が可能であり、超高密度チップ加工技術となる。
【0013】
上記、合成による加工においては、糖転移酵素などを用いた微小平面での糖鎖合成、糖鎖表面修飾が考えられる。これによって、細胞接着因子を、表面で合成加工し、超小型ガン細胞センサーや、細胞組織モジュールの構築などが可能になると考えられる。
複数の酵素固定化プローブの組み合わせにより、パターンに基づいてタンパク質やペプチドなど機能性生体分子を配列させることが可能で、その配列に基づいて、細胞やオルガネラなどのマクロな生体由来物質、構造体も任意に配列することが可能となる。このような技術により、3次元的に細胞を積み上げた組織形成などが可能になると考えられる。また、分解、修飾、連結、合成を区別して使用するだけでなく、組み合わせて使用することも可能であり、生体分子の観察場の調製、高機能な生体分子構造体の作製も可能となる。例えば、脂質とタンパク質からなる生体模擬構造体を作製し、電極材料や光学観察装置と組み合わせ、生体機能を完全に模倣したマイクロリアクタを作製するなどが考えられる。
【0014】
本発明の分子加工手段は、特に他種類の分子を同一基材表面上に整然と配置し、これらに正確に分子修飾を行う場合に有利であり、また、これにより、一度に他種類の試料分析も可能となる。また、本発明によれば、ナノスケールで表面加工、分子配列を行うことが可能になり、マイクロリアクタ、マイクロセンサー、マイクロチップ等に広く利用され得る技術である。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により特に限定されるものではない。
【0015】
【実施例】
以下の実施例は、原子間力顕微鏡(AFM)のプローブ探針に酵素V8セリンプロテアーゼを固定し、基板上に固定化されたペプチドのレイヤーに対してプロテアーゼ修飾探針で接触操作を行い、ペプチドの切断を試みたものである。V8プロテアーゼは、一本鎖ペプチドから形成され変性しにくく、グルタミン酸またはアスパラギン酸のC末を特異的に切断するものである。
【0016】
〔プロテアーゼ固定化探針の作製〕
探針は窒化シリコン (Si3N4)製のコンタクトモード用の針(バネ定数 0.12N/m)を用いた。オゾンクリーナーで洗浄を含め酸化し、市販のシラン化試薬(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane)により表面をチオール基で修飾した。ヘテロ架橋化試薬(N-(6Maleimidocaproxy)succinimide)で探針表面に修飾したのち、V8プロテアーゼの表面のアミノ基を用いて架橋化試薬のsuccinimideと反応させ探針に固定化した。未反応の架橋化試薬をセリンでブロックした。V8プロテアーゼの代わりにセリンのみを固定化した探針を対照として用いた。
【0017】
〔ペプチド固定化基板の作製〕
アラニンを基本としたグルタミン酸とリジンを含むペプチド配列(A(AEAAKA)5AC)を合成した。N末端にはビオチンをアミド結合で導入した。シラン化試薬(3-Aminopropyltriethoxysilane)でアミノ基を提示させたmica基板にヘテロ架橋化剤を固定化し、このペプチドを基板に固定化した。
【0018】
〔AFMによる接触操作〕
酵素を固定化した探針、または、固定化していない探針は、AFM(NanoscopeIIIa)に装着し、操作を行った。ペプチド固定化基板上のある領域をなぞる操作を50-100 pNの力で行い(走査速度0.05 μm/s)、ペプチドの切断反応を行った。その後、ストレプトアビジンを添加し、ペプチドN末端のビオチンと結合させ、高さイメージを拡大表示することによって、プロテアーゼ切断の評価を行った。ストレプトアビジン添加前後に高さに関するイメージ測定(走査速度2 μm/s)を行った。
【0019】
〔結果〕
上記接触操作の結果を図1に示す。なお、以下の図1および4は、酵素修飾したAFM探針をそのまま使い、表面をイメージングしたAFM画像の写真である。図1aは、プロテアーゼ固定化探針で特定領域をなぞった後の高さに関するイメージ像であり、図中の実線で囲った部分は探針で走査した領域を示す。図1aの結果によれば、リソグラフ実行後のイメージ像からでは、ペプチドが切断されることによって、高さが変化したことを確認出来ないが。これは切断されたペプチドの長さが短いことによると考えられる。図1bには、ストレプトアビジン添加後の高さに関するイメージ像を示した。この図では、走査した領域を高さ情報で明らかに認識することが可能であった。図2には、図1b内の2つの矢印を結ぶ直線で切った断面図を示した。探針でなぞった領域はなぞっていない領域よりも約4〜5nmの差の窪みがあることがわかる。図3に示すように、この窪みの深さは文献値のストレプトアビシンの大きさとほぼ一致し、この段差は非走査領域すなわち切断を受けていないペプチドのビオチンにストレプトアビジンが結合したことにより形成されたことを示している。すなわち、プロテアーゼ固定化探針により操作された領域は、ペプチドが分解されていることが確認できた。
【0020】
【比較例】
酵素を固定化していない探針を用いる他は、実施例と同様の操作を行った。結果を図4に示す。図4a及び図4bでは特定領域をなぞった直後とストレプトアビジンを添加して後の高さに関するイメージ像をそれぞれ示した。この場合は、なぞった領域はストレプトアビジン添加後も認識することはできないことがわかる。以上のことより、酵素を固定化した探針によって、緩衝溶液中で生体分子の加工が可能であることが示された。
【0021】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明によれば、酵素固定化プローブの使用により、生体分子等の切断、組み立て等の加工をナノスケールで行うことを可能にするものであり、マイクロリアクター、マイクロセンサー、マイクロチップ等に広く利用され得るものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】酵素固定化探針でリソグラフを行った結果を示すAFM画像写真である。
a)ストレプトアビジン添加前b)ストレプトアビジン添加後
【図2】図1bのAFM画像から得られる断面を示すグラフである。断面は、図1b中の矢印部分を繋ぐ直線で、画像に対して垂直の断面。
【図3】実施例の操作において、ストレプトアビジンを添加後の基板上の分子の状態を示す模式図である。
【図4】セリン固定化探針でリソグラフを行った結果を示すAFM画像写真である。
a)ストレプトアビジン添加前b)ストレプトアビジン添加後
Claims (5)
- 位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブ先端に酵素が固定化されているタンパク質分子加工用部材であって、上記プローブがシリコン製あるいは窒化シリコン製であり、上記酵素が V8 セリンプロテアーゼであり、該プローブを酸化処理し、チオール基を有するシラン化剤でプローブ表面を処理した後、ヘテロ架橋化試薬により、 V8 セリンプロテアーゼが該プローブ先端に固定化されたものであることを特徴とする、上記タンパク質分子加工用部材。
- 位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブが原子間力顕微鏡又は分子間力測定装置のプローブである請求項1に記載のタンパク質分子加工用部材。
- 基材上に配置したタンパク質分子を請求項1に記載のタンパク質分子加工用部材を用いて加工することを特徴とする、タンパク質分子の加工方法。
- 基材上のタンパク質分子表面に、請求項1に記載のタンパク質分子加工用部材を接触させて局所的に反応を生じさせることにより、タンパク質分子表面に該反応に対応するパターンを形成させることを特徴とする、タンパク質分子の加工方法。
- タンパク質分子が、表面走査用プローブ先端に固定されたV8 プロテアーゼにより分解されるものであり、基質表面に形成されるパターンが、タンパク質分子の酵素分解反応に基づくエッチングによるものである。請求項4に記載のタンパク質分子の加工方法。
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