JP4151094B2

JP4151094B2 - Method for producing L-cysteine

Info

Publication number: JP4151094B2
Application number: JP32321097A
Authority: JP
Inventors: 茂中森; 博史高木
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-11-25
Filing date: 1997-11-25
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: JPH11155571A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−システインの製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な新エシェリヒア属細菌、及びそれを用いたＬ−システインの製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システインの誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。
【０００３】
Ｌ−システインの生合成について、エシェリヒア・コリ等の細菌では詳細に研究されており（Kredich, N. M. et al., J. Biol. Chem., 241, 4955-4965 (1966), Kredich, N. M. et al., 1987, Biosynthesis of Cysteine. In: Neidhardt, F.C., et al., (eds) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, Vol.1, American Society for Microbiology, Washington D.C., 419-428）、Ｌ−セリンから２段階の反応によりＬ−システインが生成することがわかっている。エシェリヒア・コリでは、第一の反応は、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化であり、セリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「ＳＡＴ」ともいう）により触媒される。第二の反応は、上記反応により生成するＯ−アセチルセリンからＬ−システインが生成する反応であり、Ｏ−アセチルセリン（チオール）リアーゼにより触媒される。
【０００４】
ＳＡＴをコードする遺伝子（ｃｙｓＥ）は、エシェリヒア・コリにおいては、野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされている（Denk, D. and Bock, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。また、これらのｃｙｓＥの塩基配列が決定され、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が減少したＳＡＴは、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換されていたことが報告されている。さらに、上記変異とは異なる変異によりＬ−システインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴをコードするＤＮＡを用いて、Ｌ−システイン等を製造する方法が開示されている（WO 97/15673号国際公開パンフレット）。このＳＡＴは、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減したＳＡＴをコードする遺伝子を利用してＬ−システインを製造する技術が知られているが、未だ改良の余地が残されている。すなわち、本発明者は、エシェリヒア属細菌のＬ−システイン生合成について研究を行ったところ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴを保持するエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システインの生産性が不安定であることを見出した。
本発明は、エシェリヒア属細菌を用いたＬ−システインの改良された製造法及びこの方法に用いるエシェリヒア属細菌を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記のＬ−システイン生産の不安定性は、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性を低下させることにより安定化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌である。
前記エシェリヒア細菌としては、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ（cystein desulfhydrase：以下、「ＣＤａｓｅ」ともいう）活性の低下によりＬ−システイン分解系が抑制されたエシェリヒア属細菌が挙げられる。
【０００８】
前記Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼとしては、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するセリンアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０００９】
また本発明は、前記エシェリヒア属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することを特徴とするＬ−システインの製造法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられる。
【００１２】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴ（以下、「変異型ＳＡＴ」ともいう）を保持するものであり、Ｌ−システイン分解系が抑制されたエシェリヒア属細菌（以下、「Ｌ−システイン分解系抑制株」ともいう）に変異型ＳＡＴを保持させるか、あるいは変異型ＳＡＴを保持するエシェリヒア属細菌に、細胞中のＬ−システイン分解系が抑制されるような変異を生じさせることにより得ることができる。尚、「Ｌ−システイン分解系の抑制」とは、システインの分解に関与する酵素のうち少なくとも一つの活性が低下又は消失していることをいう。また、「フィードバック阻害の低減」とは、低減されたフィードバック阻害が残存している場合の他、フィードバック阻害が実質的に解除されている場合を含む。
前記Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、ＣＤａｓｅ及びシスタチオンβリアーゼが挙げられる。
ＣＤａｓｅ活性が低下又は消失した株（以下、「ＣＤａｓｅ活性低下株」ともいう）は、野生型ＣＤａｓｅを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、Ｌ−システインを唯一の窒素源とする培地で生育できず、かつ、通常の窒素源を含む培地で生育できる変異株を選択することによって取得することができる。変異処理としては、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常の突然変異に用いられている変異剤による処理が挙げられる。得られた候補株のＣＤａｓｅ活性が低下していることは、候補株の菌体抽出液について、Kredichらの方法（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）等により、ＣＤａｓｅ活性を測定し、親株のＣＤａｓｅ活性と比較することにより確認することができる。
同様に、野生型シスタチオンβリアーゼを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、シスタチオンβリアーゼ活性が低下又は消失している株を選択することにより、シスタチオンβリアーゼ活性低下株を取得することができる。
【００１３】
エシェリヒア属細菌に変異型ＳＡＴを保持させるには、野生型ＳＡＴを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、変異型ＳＡＴを保持する変異株を選択するか、あるいは、変異型ＳＡＴをコードするＤＮＡ（以下、「変異型ｃｙｓＥ」ともいう）をエシェリヒア属細菌に導入することによって行うことができる。変異型ｃｙｓＥは、野生型ｃｙｓＥに、コードするＳＡＴがＬ−システインによるフィードバック阻害が解除されるような変異を導入することによって得られる。このような変異としては、コードされるＳＡＴのアセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないものであれば特に制限されないが、具体的には、野生型ＳＡＴの２５６位のメチオニン残基又はこのメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異が挙げられる。前記他のアミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基及びロイシン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられる。また、変異型ｃｙｓＥが有する変異としては、WO 97/15673号国際公開パンフレットに記載されている変異であってもよい。
【００１４】
本発明における変異型ＳＡＴとしては、上記のＬ−システインによるフィードバック阻害を低減する変異に加えて、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。そのような変異を有するＳＡＴにおいては、２５６位のメチオニン残基の位置が変わっている場合もあるが、そのような場合であっても、２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換することによって、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減した変異型ＳＡＴが取得され得る。
【００１５】
野生型ｃｙｓＥは、デンクらによって報告されている方法（Denk, D. and Bock, A., J. general Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、あるいはこの報告に記載されているｃｙｓＥの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片を増幅することによって得られる。前記プライマーとして具体的には、配列番号１及び２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。参考として、配列番号５及び６に、デンクらによって報告されている野生型ｃｙｓＥの塩基配列及びコードされるアミノ酸配列を示す。
【００１６】
得られたｃｙｓＥに所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異が挙げられる。部位特異的変異に用いるプライマーとしては、例えば、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。変異が導入されたｃｙｓＥ断片から変異が導入された部位を含む領域を切り出し、野生型ｃｙｓＥと、相当する領域を入れ換えることにより、変異型ｃｙｓＥを得ることができる。
【００１７】
上記のようにして得られる変異型ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するには、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いることができる。その際、変異型ｃｙｓＥ遺伝子を自律複製可能なベクターに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主エシェリヒア属細菌に保持させてもよいが、変異型ｃｙｓＥ遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で宿主エシェリヒア属細菌の染色体に組み込んでもよい。
【００１８】
プロモーターとしては、ｃｙｓＥ固有のプロモーターを用いてもよいが、発現ベクターに含まれているプロモーターを用いて、これにｃｙｓＥコード領域を連結してもよい。発現ベクターとしては、pBluescriptII SK+（STRATAGENE社）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pUC系（宝酒造（株）等）、pPROK系（クロンテック製）、pKK233-2（クロンテック製）等、市販のベクターを使用することができる。
【００１９】
ｃｙｓＥを含む発現ベクターをエシェリヒア属細菌に導入するには、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用いられている方法により行うことができる。
【００２０】
＜２＞Ｌ−システインの製造法
上記のようにして細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性が低下又は消失し、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−システインを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することにより、Ｌ−システインを効率よく、かつ、安定に製造することができる。尚、本発明の方法により製造されるＬ−システインには、還元型のシステインに加えてシスチンも含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシスチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も含まれる。
【００２１】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００２２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００２３】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００２４】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
＜１＞変異型ｃｙｓＥ遺伝子の及び該遺伝子導入用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリJM240（Hfr ProC47 Cys-54 supE42）から染色体ＤＮＡを常法により調製し、これを鋳型として用い、公知のｃｙｓＥの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチド（配列番号１、２）をプライマーとするＰＣＲによって、ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片を増幅した。プライマーは、増幅される配列がコード領域及びプロモーター配列を含むように設計した。ＰＣＲ反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、Taq DNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行なった。
【００２７】
増幅された１．２ｋｂのＤＮＡ断片について、EcoRVで切断したpBluescriptII SK+を用いてＴＡクローニングを行い、４．２ｋｂのプラスミドを得た。このプラスミドをｐＣＥと名付けた。得られたクローニング断片の塩基配列を決定し、野生型のｃｙｓＥと同一の塩基配列を含むことを確認した。
【００２８】
上記のようにして得られたｃｙｓＥに、コードされるＳＡＴの２５６位のメチオニン残基を他の１９種類のアミノ酸残基又は終止コドンに置換する変異を、配列番号３及び４に示す塩基配列を有する相補的なオリゴヌクレオチド対を用い、ｐＣＥを鋳型とする部位特異的変異により導入した。変異が導入されたｃｙｓＥの一部を含む断片とｐＣＥをPstIとBstEIIで消化し、生じた0.31kbの断片を入れ換え、変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを得た（図１）。得られたプラスミドについて塩基配列決定を行い、変異型ｃｙｓＥの目的の部位に変異が導入されたこと、及び目的部位以外の部位にミスマッチ変異が生じていないことを確認した。但し、２５６位のメチオニン残基をリジン残基に置換したものは、２２４位のセリン残基がプロリン残基に置換されるミスマッチ変異が生じていた。こうして得られたプラスミドのシリーズを総称してｐＣＥＭ２５６＊と名付けた。尚、「＊」はメチオニン残基以外のアミノ酸残基を表す記号を代表し、例えば、ｐＣＥＭ２５６Ａは、２５６位のメチオニン残基がアラニン残基に置換されたＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを表す。
【００２９】
プラスミドｐＣＥ及び上記のようにして得られたｐＣＥＭ２５６＊で、ｃｙｓＥ欠損株であるエシェリヒア・コリJM39（F⁺ cysＥ51 tfr-8）（Denk, D. and Bock, A., J. Gene. Microbiol, 133, 515-525(1987)）を形質転換し、得られた形質転換株をそれぞれJM39(pCE)及びJM39(pCEM256*)と名付けた。
【００３０】
アンピシリン 50mg/Lを含むＬＢ（Bacto-Tryptone 10g/L、Bacto-Yeast Extract 5g/L、NaCl 5g/L、pH7.0）プレート培地で３０℃、２４時間培養した各形質転換体１白金耳を、アンピシリン 50mg/Lを添加した下記液体培地（組成は下記のとおり）３ｍｌを入れた試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間培養した。培養は、各形質転換体について２連で行った。培養後、生育、ｐＨ及びシステイン蓄積量を調べた。生育は、培養液を0.1N HClで２６倍希釈し、５６２ｎｍにおける吸光度（OD₅₆₂）を測定することにより調べた。Ｌ−システインの蓄積量は、沈澱したシスチンを溶かすため培養液をO.5N HClで希釈したものを、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）を用いるバイオアッセイ（Tsunoda, T. et al., Amino acids, 3, 7-13 (1961)）により、還元型システイン及びシスチンの総量として測定した。その結果を表１に示す。表中の「256th」は、２５６位のアミノ酸残基を示す。また、「stop」は、２５６位が終止コドンに置換されたことを示す。
【００３１】
野生型ｃｙｓＥを含むプラスミドを保持するJM39(pCE)に比べて、変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを保持するJM39(pCEM256*)では、２５６位のメチオニン残基がロイシン残基又はリジン残基に置換されたもの（JM39(pCEM256L、JM39(pCEM256K）を除いて、システイン蓄積量が大幅に増加したが、結果にばらつきがあり、システイン生産性は不安定であった。
【００３２】
（培地組成）
グルコース 30g/L
塩化アンモニウム 10g/L
KH₂PO₄ 2g/L
MgSO₄・7H₂O 1g/L
FeSO₄・7H₂O 10mg/L
MnCl₂・4H₂O 10mg/L
CaCO₃ 20g/L
【００３３】
【表１】

【００３４】
＜２＞ＣＤａｓｅ低下株の取得
エシェリヒア・コリJM39を、0.1mg/mlのＮＴＧ溶液中で１５分変異処理し、塩化アンモニウムをＬ−システイン（0.3g/L）に置換したＭ９培地（組成は下記のとおり）プレートでは生育できず、Ｌ−シテステイン0.1g/Lを含むＭ９培地で生育する変異株、39-8株を選択した。
【００３５】
（培地組成）
Na₂HPO₄ 6g/L
KH₂PO₄ 3g/L
NaCl 0.5g/L
MgSO₄・7H₂O 0.25g/L
CaCl₂・4H₂O 0.015mg/L
グルコース 4g/L
チアミン・HCl 0.001g/L
【００３６】
次に、得られたＬ−システイン非資化性株である39-8株のＣＤａｓｅ活性を次のようにして測定した。39-8株を、ＬＢ培地にＬ−システイン−ＨＣｌ1mg/mlを添加した培地で３７℃、８時間培養し、菌体を超音波処理し、30,000×ｇで３０分遠心し、上清を採取して粗酵素液とした。この粗酵素液について、Kredichらの方法（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）でＣＤａｓｅ活性を測定した。すなわち、0.1M Tris-HCl、5mM ピリドキサールリン酸、2mM Ｌ−システイン・ＨＣｌ、0.3ml粗酵素液からなる反応液1.5mlを３７℃で３０分反応させ、生成するピルビン酸を定量し、タンパク当たりの生成量をＣＤａｓｅ活性とした。結果を表２に示す。
39-8株のＣＤａｓｅ活性は、親株に比べて明らかに低下していた。
【００３７】
【表２】

【００３８】
＜３＞ＣＤＡｓｅ低下株への変異型ｃｙｓＥ遺伝子の導入及びＬ−システインの生産
上記で得られたＣＤａｓｅ低下株である39-8株を、ｐＣＥ及びｐＣＥＭ２５６＊で形質転換した。得られた形質転換株をそれぞれ39-8(pCE)及び39-8(pCEM256*)と名付けた。これらの形質転換株を、アンピシリン 50mg/Lを含むＬＢプレート培地で３０℃、２４時間培養した各形質転換体１白金耳を、アンピシリン 50mg/Lを添加したＣ１培地（組成は下記のとおり）２０ｍｌを入れた坂口フラスコにそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養は、各形質転換体について２連で行った。培養後、生育、培養液のｐＨ、残糖、Ｌ−システインの蓄積量、及び対糖収率を調べた。生育及びＬ−システイン量は、前記と同様にして行った。結果を表３に示す。
【００３９】
また、JM39(pCE)及びJM39(pCEM256*)を上記と同様にして培養し、Ｌ−システインの蓄積量を調べた結果を表４に示す。この結果から、変異型ｃｙｓＥをＣＤａｓｅ低下株に導入することによって、Ｌ−システイン生産量が増加し、かつ、安定した生産性を示すことが明らかである。
【００４０】
【表３】

【００４１】
【表４】

【００４２】
２５６位のメチオニン残基をグルタミン酸残基に置換したＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを含むｐＣＥＭ２５６Ｅを保持する39-8株（E. coli 39-8(pCEM256 )、プライベートナンバー：ＡＪ１３３９１）は、平成９年１１月２０日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭＰ−１６５２７の受託番号のもとで寄託されている。
上記寄託菌株よりｐＣＥＭ２５６Ｅを取得し、部位特異的変異を導入することによって、２５６位のメチオニン残基を所望のアミノ酸残基に置換したＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを得ることができる。
【００４３】
＜４＞変異型ｃｙｓＥ遺伝子を導入したＣＤａｓｅ低下株のＳＡＴ活性の測定
39-8(pCE)及び39-8(pCEM256*)株を、アンピシリン 50mg/Lを添加したＣ１培地（組成は下記のとおり）２０ｍｌを入れた坂口フラスコに接種し、３０℃で４８時間振盪培養した後、集菌した。菌体を、氷冷した50mM Tris-HCl(pH7.5)で２回洗浄し、2mM ジチオスレイトールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。破砕物を30,000×ｇで３０分遠心し、上清を粗抽出液としてＳＡＴ活性の測定に用いた。
【００４４】
ＳＡＴ活性の測定は、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM Ｌ−セリン、0.1mM アセチル−ＣｏＡ及び粗酵素液を含む１ｍｌの反応液を３０℃で１５分反応させ、アセチル−ＣｏＡのチオエステル結合の開裂による232nmの吸光度の減少を測定することによって行った。前記反応液からＬ−セリンを除いたものをブランクとした。また、前記反応液にＬ−システイン10μMを加えて同様に反応を行い、Ｌ−システインによるフィードバック阻害の程度を調べた。尚、アセチル−ＣｏＡのε値は6.5×10³M^-1cm^-1である。Ｌ−システインを添加しない場合のＳＡＴ比活性及びＬ−システインを加えたときの残存活性（％）を表５に示す。
【００４５】
２５６位のメチオニン残基を他のアミノ酸残基に置換したＳＡＴは、いずれもＬ−システインによるフィードバック阻害が低減されていた。尚、２５６位のメチオニン残基をロイシン残基又はリジン残基に置換したＳＡＴは、ＳＡＴ活性が認められなかった。
【００４６】
【表５】

【００４７】
【発明の効果】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システインを高効率かつ安定に生産する能力を有している。
【００４８】
【配列表】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＣＥＭ２５６＊の構築の概略を示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing L-cysteine, and more particularly to a novel Escherichia bacterium suitable for producing L-cysteine, and a method for producing L-cysteine using the same. L-cysteine and L-cysteine derivatives are used in the fields of pharmaceuticals, cosmetics and foods.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, L-cysteine has been obtained by extraction from keratin-containing substances such as hair, horns and feathers, or by microbial enzyme conversion using DL-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid as a precursor. In addition, mass production of L-cysteine by an immobilized enzyme method using a novel enzyme is also planned. Furthermore, production of L-cysteine by fermentation using microorganisms has also been attempted.
[0003]
The biosynthesis of L-cysteine has been studied in detail in bacteria such as Escherichia coli (Kredich, NM et al., J. Biol. Chem., 241, 4955-4965 (1966), Kredich, NM et al. ., 1987, Biosynthesis of Cysteine. In: Neidhardt, FC, et al., (Eds) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, Vol. 1, American Society for Microbiology, Washington DC, 419-428), L -It has been found that L-cysteine is produced from serine in a two-step reaction. In Escherichia coli, the first reaction is activation of L-serine by acetyl-CoA, which is catalyzed by serine acetyltransferase (EC 2.3.1.30) (hereinafter also referred to as “SAT”). The second reaction is a reaction in which L-cysteine is produced from O-acetylserine produced by the above reaction, and is catalyzed by O-acetylserine (thiol) lyase.
[0004]
The gene encoding SAT (cysE) has been cloned from wild-type and L-cysteine secreting mutants in Escherichia coli (Denk, D. and Bock, A., J. General Microbiol., 133, 515). -525 (1987)). In addition, it has been reported that the methionine residue at position 256 is substituted with an isoleucine residue in SAT in which the base sequence of these cysE has been determined and feedback inhibition by L-cysteine has been reduced. Furthermore, a method for producing L-cysteine or the like using a DNA encoding SAT in which feedback inhibition by L-cysteine is reduced by a mutation different from the above mutation is disclosed (WO 97/15673 International Publication Pamphlet) ). This SAT has a mutation in the region from the amino acid residue at position 97 to the amino acid residue at position 273, or a deletion of the C-terminal region from the amino acid residue at position 227.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, a technique for producing L-cysteine using a gene encoding SAT with reduced feedback inhibition by L-cysteine is known, but there is still room for improvement. That is, the present inventor conducted research on L-cysteine biosynthesis of Escherichia bacteria. As a result, Escherichia bacteria having SAT with reduced feedback inhibition by L-cysteine have low L-cysteine productivity. It was found to be stable.
An object of the present invention is to provide an improved method for producing L-cysteine using an Escherichia bacterium and an Escherichia bacterium used in this method.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the instability of L-cysteine production is stabilized by reducing the cysteine desulfhydrase activity in the cells. As a result, the present invention has been completed.
[0007]
That is, the present invention is an Escherichia bacterium that retains a serine acetyltransferase in which the L-cysteine degradation system is suppressed and feedback inhibition by L-cysteine is reduced.
Examples of the Escherichia bacterium include bacteria belonging to the genus Escherichia in which the L-cysteine decomposition system is suppressed by a decrease in cysteine desulfhydrase (hereinafter also referred to as “CDase”) activity in cells.
[0008]
As serine acetyltransferase with reduced feedback inhibition by L-cysteine, an amino acid residue corresponding to the methionine residue at position 256 of wild-type serine acetyltransferase is substituted with an amino acid residue other than lysine residue and leucine residue. Or a serine acetyltransferase having a mutation that deletes the C-terminal region from the amino acid residue corresponding to the methionine residue at position 256.
[0009]
The present invention also provides a method for producing L-cysteine, comprising culturing the Escherichia bacterium in a medium, producing and accumulating L-cysteine in the culture, and collecting L-cysteine from the culture. provide.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0011]
<1> Escherichia bacterium of the present invention Examples of the Escherichia bacterium of the present invention include, for example, Escherichia coli (E. coli).
[0012]
The Escherichia bacterium of the present invention retains SAT (hereinafter also referred to as “mutant SAT”) in which the L-cysteine degradation system is suppressed and feedback inhibition by L-cysteine is reduced. A bacterium belonging to the genus Escherichia in which the cysteine decomposition system is suppressed (hereinafter also referred to as “L-cysteine decomposition system-suppressing strain”) is allowed to retain the mutant SAT, or the Escherichia bacterium that retains the mutant SAT is allowed to -It can be obtained by causing a mutation that suppresses the cysteine degradation system. The “suppression of the L-cysteine degradation system” means that at least one activity among enzymes involved in cysteine degradation is reduced or eliminated. In addition, “reduction of feedback inhibition” includes a case where the feedback inhibition is substantially canceled in addition to the case where the reduced feedback inhibition remains.
Examples of the enzyme involved in the degradation of L-cysteine include CDase and cystathion β-lyase.
Strains with reduced or eliminated CDase activity (hereinafter also referred to as “CDase activity-reduced strains”) can grow on a medium containing L-cysteine as the only nitrogen source by mutating Escherichia bacteria that retain wild-type CDase. And a mutant strain that can grow on a medium containing a normal nitrogen source. Examples of the mutation treatment include ultraviolet irradiation or treatment with a mutagen used for normal mutation such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrous acid. The decrease in CDase activity of the obtained candidate strain is confirmed by the method of Kredich et al. (J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)) etc. It can be confirmed by measuring the activity and comparing it with the CDase activity of the parent strain.
Similarly, a cystathione β lyase activity-reduced strain can be obtained by mutating an Escherichia bacterium carrying wild-type cystathione β lyase and selecting a strain in which the cystathione β lyase activity is reduced or eliminated.
[0013]
In order to allow the bacterium belonging to the genus Escherichia to retain the mutant SAT, the bacterium belonging to the genus Escherichia that retains the wild-type SAT is mutated and a mutant strain that retains the mutant SAT is selected, or a DNA encoding the mutant SAT ( (Hereinafter also referred to as “mutant cysE”) can be carried out by introducing the bacterium into the genus Escherichia. Mutant cysE is obtained by introducing a mutation into wild-type cysE such that feedback inhibition by L-cysteine is released in the encoded SAT. Such mutation is not particularly limited as long as it does not substantially impair the activity of catalyzing the activation of L-serine by acetyl-CoA of the encoded SAT. A mutation that replaces the methionine residue at position 256 or an amino acid residue corresponding to this methionine residue with an amino acid residue other than a lysine residue or leucine residue, or an amino acid residue corresponding to a methionine residue at position 256 Examples include mutations that delete the terminal region. Examples of the other amino acid residues include 17 types of amino acid residues other than methionine residues, lysine residues and leucine residues among amino acids constituting normal proteins. Further, the mutation possessed by the mutant cysE may be a mutation described in WO 97/15673 International Publication Pamphlet.
[0014]
As the mutant SAT in the present invention, in addition to the mutation that reduces the feedback inhibition by L-cysteine, one or a number that does not substantially impair the activity of catalyzing the activation of L-serine by acetyl-CoA. It may have an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one amino acid residue. In the SAT having such a mutation, the position of the methionine residue at position 256 may be changed. Even in such a case, the amino acid residue corresponding to the methionine residue at position 256 is changed to lysine. By substituting amino acid residues other than residues and leucine residues, a mutant SAT with reduced feedback inhibition by L-cysteine can be obtained.
[0015]
Wild-type cysE can be obtained by the method reported by Denk et al. (Denk, D. and Bock, A., J. general Microbiol., 133, 515-525 (1987)) or the cysE described in this report. CysE is included by PCR (polymerase chain reaction; see White, TJ et al; Trends Genet. 5,185 (1989)) using an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence as a primer and Escherichia bacterial chromosomal DNA as a template. It is obtained by amplifying a DNA fragment. Specific examples of the primer include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2. For reference, SEQ ID NOs: 5 and 6 show the base sequence and encoded amino acid sequence of wild-type cysE reported by Denk et al.
[0016]
Examples of a method for introducing a desired mutation into the obtained cysE include site-specific mutation. Examples of the primer used for site-specific mutation include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4. A mutant cysE can be obtained by excising a region containing a mutation-introduced site from the mutation-introduced cysE fragment and replacing the corresponding region with the wild-type cysE.
[0017]
In order to introduce a DNA fragment containing the mutant cysE obtained as described above into a bacterium belonging to the genus Escherichia, various vectors used for normal protein expression can be used. At that time, the mutant cysE gene inserted into a vector capable of autonomous replication may be introduced into the host and retained in the host Escherichia bacterium as extrachromosomal DNA like a plasmid. Daction, transposon (Berg, DE and Berg, CM, Bio / Technol., 1,417 (1983)), Mu phage (JP-A-2-109985) or homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972) )) May be incorporated into the chromosome of the host Escherichia bacterium.
[0018]
As a promoter, a promoter specific to cysE may be used, but a cysE coding region may be linked to this using a promoter contained in an expression vector. Expression vectors such as pBluescriptII SK + (STRATAGENE), pGEMEX-1 (Promega), pUC (Takara Shuzo), pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech), etc. Can be used.
[0019]
To introduce an expression vector containing cysE into a bacterium belonging to the genus Escherichia, the method of DM Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or the method of increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) and the like, can be performed by a method usually used for transformation of bacteria belonging to the genus Escherichia.
[0020]
<2> Method for producing L-cysteine Escherichia bacteria having serine acetyltransferase in which cysteine desulfhydrase activity in cells is reduced or eliminated and feedback inhibition by L-cysteine is reduced as described above Is cultured in a suitable medium, L-cysteine is produced and accumulated in the culture, and L-cysteine is collected from the culture, whereby L-cysteine can be produced efficiently and stably. . The L-cysteine produced by the method of the present invention may contain cystine in addition to the reduced cysteine, but the object of the production method of the present invention includes cystine or reduced cysteine and cystine. A mixture of
[0021]
Examples of the medium to be used include a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and other organic components as required.
As the carbon source, saccharides such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysate, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid can be used.
[0022]
As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used.
[0023]
Examples of the sulfur source include inorganic sulfur compounds such as sulfate, sulfite, sulfide, hyposulfite, and thiosulfate.
As an organic trace nutrient source, it is desirable to contain a required substance such as vitamin B1 or a yeast extract. In addition to these, potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added in small amounts as necessary.
[0024]
Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions for 30 to 90 hours. The culture temperature is preferably controlled at 25 ° C. to 37 ° C., and the pH during culture is preferably controlled at 5 to 8. In addition, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment. Collection of L-cysteine from the culture can be carried out by a combination of ordinary ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
[0025]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0026]
<1> Construction of mutated cysE gene and plasmid for introducing the gene Chromosomal DNA is prepared from Escherichia coli JM240 (Hfr ProC47 Cys-54 supE42) by a conventional method, and this is used as a template, and a known cysE base sequence is prepared. A DNA fragment containing cysE was amplified by PCR using oligonucleotides (SEQ ID NOs: 1 and 2) synthesized based on the above as primers. The primers were designed so that the sequence to be amplified contains a coding region and a promoter sequence. The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler type PJ2000 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., using Taq DNA polymerase according to the method specified by the supplier.
[0027]
The amplified 1.2 kb DNA fragment was TA cloned using pBluescriptII SK + cut with EcoRV to obtain a 4.2 kb plasmid. This plasmid was named pCE. The base sequence of the obtained cloned fragment was determined and confirmed to contain the same base sequence as wild-type cysE.
[0028]
In the cysE obtained as described above, the mutations that replace the methionine residue at position 256 of the encoded SAT with other 19 types of amino acid residues or stop codons are represented by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4. A pair of complementary oligonucleotides was used and introduced by site-directed mutagenesis using pCE as a template. A fragment containing a part of cysE into which mutation was introduced and pCE were digested with PstI and BstEII, and the resulting 0.31 kb fragment was exchanged to obtain a plasmid containing mutant cysE (FIG. 1). The nucleotide sequence of the obtained plasmid was determined, and it was confirmed that the mutation was introduced into the target site of the mutant cysE and that there was no mismatch mutation at a site other than the target site. However, when the methionine residue at position 256 was replaced with a lysine residue, a mismatch mutation occurred in which the serine residue at position 224 was replaced with a proline residue. The series of plasmids thus obtained was generically named pCEM256 *. “*” Represents a symbol representing an amino acid residue other than a methionine residue. For example, pCEM256A is a plasmid containing a mutant cysE encoding SAT in which the methionine residue at position 256 is substituted with an alanine residue. Represents.
[0029]
The plasmid pCE and pCEM256 * obtained as described above were used as a cysE-deficient strain, Escherichia coli JM39 (F ⁺ cysE51 tfr-8) (Denk, D. and Bock, A., J. Gene. Microbiol, 133). , 515-525 (1987)), and the resulting transformants were named JM39 (pCE) and JM39 (pCEM256 *), respectively.
[0030]
1 platinum loop of each transformant cultured at 30 ° C. for 24 hours in LB (Bacto-Tryptone 10 g / L, Bacto-Yeast Extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, pH 7.0) containing ampicillin 50 mg / L Each test tube containing 3 ml of the following liquid medium (composition as described below) supplemented with 50 mg / L of ampicillin was inoculated and cultured at 30 ° C. for 72 hours. Culture was performed in duplicate for each transformant. After culture, growth, pH and cysteine accumulation were examined. Growth was examined by diluting the culture solution 26-fold with 0.1 N HCl and measuring the absorbance at 562 nm (OD ₅₆₂ ). The amount of L-cysteine accumulated was determined by using a bioassay (Tsunoda, T. et al., Amino) using Leuconostoc mesenteroides prepared by diluting the culture solution with O.5N HCl to dissolve the precipitated cystine. acids, 3, 7-13 (1961)), and measured as the total amount of reduced cysteine and cystine. The results are shown in Table 1. “256th” in the table indicates the amino acid residue at position 256. “Stop” indicates that position 256 is replaced with a stop codon.
[0031]
Compared to JM39 (pCE) carrying a plasmid containing wild-type cysE, in JM39 (pCEM256 *) carrying a plasmid containing a mutant cysE, the methionine residue at position 256 is substituted with a leucine residue or a lysine residue. The amount of cysteine accumulated was greatly increased except for those (JM39 (pCEM256L, JM39 (pCEM256K)), but the results varied and the cysteine productivity was unstable.
[0032]
(Medium composition)
Glucose 30g / L
Ammonium chloride 10g / L
KH ₂ PO ₄ 2g / L
MgSO ₄・ 7H ₂ O 1g / L
FeSO ₄・ 7H ₂ O 10mg / L
MnCl ₂・ 4H ₂ O 10mg / L
CaCO ₃ 20g / L
[0033]
[Table 1]

[0034]
<2> Acquisition of CDase-reduced strain M9 medium in which Escherichia coli JM39 was mutated for 15 minutes in a 0.1 mg / ml NTG solution and ammonium chloride was replaced with L-cysteine (0.3 g / L) (the composition is as follows) As described above), a mutant strain, 39-8, which could not grow on the plate but grew on M9 medium containing 0.1 g / L of L-cysteine was selected.
[0035]
(Medium composition)
Na ₂ HPO ₄ 6g / L
KH ₂ PO ₄ 3g / L
NaCl 0.5g / L
MgSO ₄・ 7H ₂ O 0.25g / L
CaCl ₂・ 4H ₂ O 0.015mg / L
Glucose 4g / L
Thiamine ・ HCl 0.001g / L
[0036]
Next, the CDase activity of the obtained 39-8 strain, which is an L-cysteine non-assimilating strain, was measured as follows. Strain 39-8 was cultured in LB medium supplemented with L-cysteine-HCl 1 mg / ml at 37 ° C. for 8 hours, the cells were sonicated, centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was collected. Thus, a crude enzyme solution was obtained. With respect to this crude enzyme solution, CDase activity was measured by the method of Kredich et al. (J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)). That is, 1.5 ml of a reaction solution consisting of 0.1 M Tris-HCl, 5 mM pyridoxal phosphate, 2 mM L-cysteine / HCl, 0.3 ml crude enzyme solution was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and the amount of pyruvic acid produced was determined. Was the CDase activity. The results are shown in Table 2.
The CDase activity of the 39-8 strain was clearly reduced compared to the parent strain.
[0037]
[Table 2]

[0038]
<3> Introduction of mutant cysE gene into CDAse-reduced strain and production of L-cysteine The 39-8 strain, which is the CDase-reduced strain obtained above, was transformed with pCE and pCEM256 *. The obtained transformants were named 39-8 (pCE) and 39-8 (pCEM256 *), respectively. Each transformant 1 platinum loop obtained by culturing these transformed strains in an LB plate medium containing ampicillin 50 mg / L at 30 ° C. for 24 hours was added to 20 ml of C1 medium (composition is as follows) to which ampicillin 50 mg / L was added. Was inoculated into each of the Sakaguchi flasks, and cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours. Culture was performed in duplicate for each transformant. After the cultivation, growth, pH of the culture solution, residual sugar, L-cysteine accumulation amount, and yield to sugar were examined. Growth and the amount of L-cysteine were carried out in the same manner as described above. The results are shown in Table 3.
[0039]
Further, JM 39 (pCE) and JM 39 a (pCEM256 *) were cultured in the same manner as described above, are shown in Table 4 the results of examining the accumulated amount of L- cysteine. From this result, it is clear that L-cysteine production amount is increased and stable productivity is exhibited by introducing mutant cysE into a CDase-lowering strain.
[0040]
[Table 3]

[0041]
[Table 4]

[0042]
The 39-8 strain (E. coli 39-8 (pCEM256), private number: AJ13391) carrying pCEM256E containing a mutant cysE encoding SAT in which the methionine residue at position 256 is substituted with a glutamic acid residue is Since November 20, 2000, it has been deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal Code 305 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) under the accession number of FERM P-16527.
By obtaining pCEM256E from the deposited strain and introducing a site-specific mutation, a mutant cysE encoding SAT in which the methionine residue at position 256 is substituted with a desired amino acid residue can be obtained.
[0043]
<4> Measurement of SAT activity of CDase-reduced strain introduced with mutant cysE gene
Strain 39-8 (pCE) and 39-8 (pCEM256 *) were inoculated into a Sakaguchi flask containing 20 ml of C1 medium (composition as shown below) supplemented with 50 mg / L of ampicillin, and cultured at 30 ° C. for 48 hours with shaking. And then collected. The cells were washed twice with ice-cold 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 2 mM dithiothreitol, and disrupted by sonication. . The crushed material was centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was used as a crude extract for measurement of SAT activity.
[0044]
The SAT activity was measured by reacting 1 ml of a reaction solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM L-serine, 0.1 mM acetyl-CoA and a crude enzyme solution at 30 ° C. for 15 minutes, and then thioester of acetyl-CoA. This was done by measuring the decrease in absorbance at 232 nm due to bond cleavage. A blank obtained by removing L-serine from the reaction solution was used. In addition, L-cysteine 10 μM was added to the reaction solution and reacted in the same manner, and the degree of feedback inhibition by L-cysteine was examined. The ε value of acetyl-CoA is 6.5 × 10 ³ M ⁻¹ cm ⁻¹ . Table 5 shows the SAT specific activity when L-cysteine is not added and the residual activity (%) when L-cysteine is added.
[0045]
Any of the SATs in which the methionine residue at position 256 was substituted with other amino acid residues had reduced feedback inhibition by L-cysteine. In addition, SAT activity in which the methionine residue at position 256 was substituted with a leucine residue or a lysine residue did not show SAT activity.
[0046]
[Table 5]

[0047]
【The invention's effect】
The bacterium belonging to the genus Escherichia of the present invention has the ability to stably and efficiently produce L-cysteine.
[0048]
[Sequence Listing]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the construction of pCEM256 *.

Claims

A bacterium belonging to the genus Escherichia, which retains a serine acetyltransferase in which the L-cysteine degradation system is suppressed by reducing the cysteine desulfhydrase activity in the cell and the feedback inhibition by L-cysteine is reduced.

Serine acetyltransferase with reduced feedback inhibition by L-cysteine replaces the amino acid residue corresponding to methionine residue at position 256 of wild-type serine acetyltransferase with an amino acid residue other than lysine residue and leucine residue. The bacterium belonging to the genus Escherichia according to claim 1, which has a mutation or a mutation that deletes a C-terminal region from an amino acid residue corresponding to a methionine residue at position 256.

3. Production of L-cysteine characterized by culturing the Escherichia bacterium according to claim 1 or 2 in a medium, producing and accumulating L-cysteine in the culture, and collecting L-cysteine from the culture. Law.