JP3616091B2 - Autoimmune diseases and inflammatory diseases - Google Patents

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    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum


発明の背景 Background of the Invention
自己免疫疾患の原因となっている自己抗原の性質については不明であり、自己免疫応答を引き起こす作用についても知られていない。 It is unknown about the nature of self-antigens that are causing autoimmune disease, not even known about the effect of causing an autoimmune response. ウイルスタンパク質が自己抗原と類似性を有しているので自己反応性T細胞やB細胞が自己抗原を認識するようになるという説が広く支持されている。 Because viral proteins has similarity to self antigens autoreactive T cells and B cells are theories widely held that it becomes to recognize the self-antigen. Bリンパ球が抗体を産生するのに対し、胸腺由来細胞、すなわち「T細胞」は細胞性免疫機能と関連がある。 While B lymphocytes produce antibodies, thymus-derived cells, or "T cell" is associated with cellular immune function. T細胞は、細胞表面提示される抗原を認識し、これらの「抗原提示」細胞とともにその機能を発現する。 T cells recognize antigens which are cell surface display, express its function with these "antigen-presenting" cells.
ヒトT細胞群を判定するために様々なマーカーが使われている。 It is used various markers to determine the human T cell populations. たとえばCD4は、免疫グロブリンと配列が部分的に同一の非多形性表面糖タンパク質受容体である。 For example CD4 an immunoglobulin sequence to be partially identical non-polymorphic surface glycoprotein receptor. CD4受容体は、明確な成熟末梢T細胞サブセットを定義づける。 CD4 receptors characterizing define distinct mature peripheral T cell subsets. 一般に、ヘルパー機能や調節機能を発現するCD4T細胞は免疫応答においてB細胞と相互作用を示すが、CD8表面抗原発現T細胞は細胞傷害性T細胞として機能し、免疫応答を調節する作用を示す。 In general, CD4 T cells expressing helper functions and regulatory functions exhibit B cell and interacts in the immune response, CD8 surface antigen expression T cells function as cytotoxic T cells, shows the effect of modulating the immune response. T細胞受容体は、T細胞応答を強化または調節する刺激の経路となっているので、免疫介入の標的となりうる。 T cell receptor, since a path of reinforcing or modulating to stimulate T cell responses, could be targeted by the immune intervention.
細胞相互作用のうち、CD4+T細胞と抗原提示細胞(APC)の相互作用は免疫応答の根源に位置するものである。 Among cell interaction, interaction of CD4 + T cells and antigen presenting cells (APC) are those located in the root of the immune response. 自己免疫応答は多くの点で正常免疫応答と本質的に同様である。 Autoimmune response are essentially similar to the normal immune response in a number of respects. したがって、CD4+自己免疫反応性T細胞は、結合グルーブに自己抗原と結合したクラスIIを発現するAPCによって再刺激される。 Thus, CD4 + autoimmune reactive T cells are restimulated by APC expressing class II bound self antigen binding groove. ある種のヒトの疾患においてこの現象が起きることを示す証拠が示されている。 This phenomenon in diseases certain human have shown evidence that occurs. たとえば、甲状腺のグレーブズ病では、難治の場合に摘出される甲状腺にイン・ビボ活性化T細胞が存在し、これらの細胞の多くがクローニング後に、外部からいかなる抗原も付与されていない自己甲状腺細胞(APCとして)、あるいは甲状腺特異抗原である甲状腺ペルオキシダーゼやサイログロブリンが付与されているAPCを認識することを示すことができる[ロンデイら(Londei, al.)、 Science 228: 85−89(1985);デイアンら(Dayan,CMet al.)、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 7415−7419(1991)]。 For example, the thyroid Graves disease, there is in vivo activated T cells in the thyroid is removed in the case of intractable, many after cloning of these cells, self thyrocytes not any antigen also externally applied ( as APC), or it can be shown that the thyroid peroxidase and thyroglobulin thyroid specific antigen recognizes APC granted [Rondei et al (Londei, al), Science 228:. 85-89 (1985 .); Deian et al. (Dayan, CMet al), Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 7415-7419 (1991)]. 同様に、リウマチ様関節炎(RA)では、3年の経過期間中の連続3回の手術においてRA患者の間接からコラーゲンII型を認識するイン・ビボ活性化T細胞が単離されている[ロンデイら(Londei, al.)、 Proc.Natl.Acad.Sci. 86:636−640(1989)]。 Similarly, in rheumatoid arthritis (RA), three consecutive three recognizing collagen type II from indirect RA patients in vivo activated T cells in surgery during the course period have been isolated [Rondei Luo, Proc.Natl.Acad.Sci 86 (Londei, al .):. 636-640 (1989)]. 自己免疫特性を示すその他のヒトの疾患においては、重症筋無力症におけるアセチルコリン受容体[ホホルフェルドら(Hohlfeld, al.)、 Nature 310 :224−246(1984)]、多発性硬化症におけるミエリン基礎タンパク質[ハフラーら(Hafler,DAet al.)、 J.Imm unol.139: 68−72(1987)]、またはインスリン依存性糖尿病における膵島細胞膜[デ・ベラルディニスら(De Berardinis, al.)、 Lancet II: 823−824(1988);コンティアイネンら(Kontiainen, al.)、 Au toimmunity 8 :193−197(1991)]を認識するCD4+細胞などの血液由来CD4+T細胞がクローン化されている。 In other person showing the autoimmune properties disease, acetylcholine receptor in myasthenia gravis [Hohoruferudo et al, Nature 310 (Hohlfeld, al .): 224-246 (1984)] in, multiple sclerosis myelin basic protein [Hafura et al, J.Imm unol.139 (Hafler, DAet al .): 68-72 (1987)], or islet cell membranes in insulin dependent diabetes mellitus [de Berarudinisu et (de Berardinis, al), Lancet II:.. 823-824 (1988); Conti eye Nene et al (Kontiainen, al), Au toimmunity 8: 193-197 (1991)] blood such CD4 + cells recognizing derived CD4 + T cells There has been cloned.
CD4特異性抗体による処理は様々な実験誘導自己免疫疾患および自然発生自己免疫疾患の両者の予防に有効である。 Treatment with CD4 specific antibodies are effective in preventing both the various experimental induction autoimmune diseases and spontaneous autoimmune diseases. たとえば、抗CD4または抗MHCクラスII抗体による処理は、ネズミのコラーゲン誘導関節炎ならびにネズミの連鎖球菌細胞壁誘導関節炎を有効に予防することがわかった[ランゲスら(Ranges,GEet al.)、 J.Exp.Me d.162 :1105−1110(1985);ホムら(Hom,JTet al.)、 Eur.J.Immunol.18: 881−888(1988);ウーリーら(Wooley,PHet al.)、 J.Immunol.134: 2366−2374(1985);クーパーら(Cooper,SMet al.)、 J.Immun ol.141: 1958−1962(1988);バン・デン・ブロエクら(Van den Broek,MFet al.)、 Eur.J.Immunol.22: 57−61(1992)]。 For example, the treatment with anti-CD4 or anti-MHC class II antibodies was found to effectively prevent the streptococcal cell wall-induced arthritis in collagen-induced arthritis and rat Rat [Rangesu et al (Ranges, GEet al.), J.Exp .Me d.162: 1105-1110 (1985); flame, Eur.J.Immunol.18 (Hom, JTet al. ):; (. Wooley, PHet al) 881-888 (1988) Woolley et al, J. Immunol.134: 2366-2374 (1985); Cooper et al., J.Immun ol.141 (Cooper, SMet al .): 1958-1962 (1988); Van den Buroeku et (Van den Broek, MFet al. ) , Eur.J.Immunol.22: 57-61 (1992)] . 抗CD4処理は、NZB/NZW F1(B/W)マウスおよびBXSBマウスの全身性紅斑性狼瘡も予防した[ウォフシーら(Wofsy, al.)、 J.Immunol.134: 852−857(1985);ウォフシーら(Wofsy, al.)、 J. Immunol.136: 4554−4560(1986);エルマークら(Ermak,TJet al.)、 Laboratory Investigation 61: 447−456(1989)]。 Anti-CD4 treatment, NZB / NZW F1 (B / W) mice and systemic lupus erythematosus in BXSB mice were also preventing [Wofushi et al, J.Immunol.134 (Wofsy, al. ): 852-857 ( 1985); Wofushi al (Wofsy, al), J. Immunol.136:.. 4554-4560 (1986); El mark et al (Ermak, TJet al), Laboratory Investigation 61: 447-456 (1989)] . ところが、抗T細胞/APC処理は確定した疾患(すなわち発症後)の重症度を下げる効果が低いか全く無効である。 However, anti-T cell / APC treatment is little or less effective to reduce the severity of established disease (i.e., after onset) invalid. たとえば、抗CD4処理と抗MHCクラスII処理はいずれも、マウスの確定したコラーゲン誘導関節炎の重症度を下げる効果がなかった[ホムら(Hom,JTet al.)、 Eur.J.Immunol.18: 881−888(1988);クーパーら(Cooper,SMet al.)、 J.Immunol.141: 1958−1962(1988)]。 (. Hom, JTet al) For example, any anti-CD4 treatment and anti-MHC class II treatment had no effect of lowering the severity of established collagen-induced arthritis in mice [flame, Eur.J.Immunol.18: (. Cooper, SMet al); 881-888 (1988) Cooper et al., J.Immunol.141: 1958-1962 (1988)] . ヒトにおける実際の治療で求められるのは発症後の治療と予防である。 What is needed in the actual treatment in humans is the prevention and treatment of post-onset. したがって、CD4T細胞/APC相互作用をブロックすること自体は最適な治療法ではないかもしれず、他の手段によってその効果を増強することができる可能性が示唆されている。 Accordingly, itself blocking the CD4T cell / APC interactions has been suggested may be able to enhance the effect by be Shirezu, other means not an optimal treatment.
CD4以外の因子も細胞性免疫応答に影響を及ぼす。 Factors other than CD4 also influence cellular immune response. サイトカインの1種である腫瘍壊死因子−α(TNFα、カケクチンともいう)は、炎症、組織傷害、免疫応答、および病変部への細胞侵入に多様な影響を及ぼすので、リウマチ様関節炎をはじめとする炎症性関節疾患の発生に何らかの役割を果たしている[ブレナンら(Brennan,FMet al.)、 Lancet 11, 244−247(1989);フェルドマンら(Feldmann, al.)、 Ann.Rheumatic Dis.51 :480−486(1990)]。 Tumor necrosis factor -α 1 cytokines (TNF [alpha], also called cachectin) inflammation, tissue injury, immune response, and so diverse affect cellular penetration into the lesion, including rheumatoid arthritis play a role in the development of inflammatory joint diseases [Brennan et al., Lancet 11, 244-247 (1989) (Brennan, FMet al.); (. Feldmann, al) Feldmann et al., Ann.Rheumatic Dis. 51: 480-486 (1990)]. TNFαは、エンドトキシンやその他の刺激に反応して主に単核球とマクロファージによって17kDのタンパク質サブユニットの可溶性ホモトリマーとして分泌されるタンパク質である[スミスら(Smith,RAet al.)、 J.Biol.Chem.262 :6951−6954(1987)]。 TNFα is a protein secreted primarily by monocytes and macrophages in response to endotoxin or other stimuli as a soluble homotrimer of protein subunits of 17 kD [Smith et al (Smith, RAet al.), J.Biol .Chem.262: 6951-6954 (1987)]. 膜に結合した26kDのTNF前駆体も記載されている[クリーグラーら(Kriegler, al.)、 Cell 53: 45−53(1988)]。 TNF precursor 26kD membrane bound also been described [Kurigura et al, Cell 53 (Kriegler, al .): 45-53 (1988)]. TNFαをコードする遺伝子の発現は単核球/マクロファージファミリーの細胞に限定されない。 Expression of the gene encoding TNFα is not limited to monocytes / macrophages family of cell. TNFはCD4+およびCD8+の末梢血Tリンパ球や様々な培養T細胞系およびB細胞系によっても産生される[クチュリら(Cuturi,MCet al.)、 J.Exp.Med.165 :1581(1987);スングら(Sung,S.−SJet al.)、 J.Exp.Med.16 8 :1539(1988);ターナーら(Turner, al.)、 Eu rJImmunol.17: 1807−1814(1987)]。 TNF is also produced by CD4 + and CD8 + peripheral blood T lymphocytes and various cultured T cell lines and B cell-based [Kuchuri et al, J.Exp.Med.165 (Cuturi, MCet al. ): 1581 (1987) ; Sungura, J.Exp.Med.16 8 (Sung, S.- SJet al.):; (. Turner, al) 1539 (1988) Turner et al., Eu rJImmunol.17: 1807-1814 (1987 )]. 最近の証拠から、自己免疫病理および移植片対宿主病理におけるTNFの関与が示唆されている[ピグエットら(Piguet,P.− al.)、 J.Exp.Med.166 :1280(1987)]。 Recent evidence, the involvement of TNF in autoimmune pathologies and graft-versus-host pathology has been suggested [Piguetto et al, J.Exp.Med.166 (Piguet, al. ): 1280 (1987 )]. TNFαと反応し、TNFβとも反応すると考えられるハムスター抗TNFモノクローナル抗体TN3.19.2は、処理を関節炎発症前に開始するか後に開始するかに関わらず、DBA/1マウスの関節破壊の程度を顕著に低下させるとともに、コラーゲンII型誘導関節炎に伴う炎症を軽減しうることが証明されている[ウイリアムスら(Williams,ROet al.)、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 9784−9788(1992)]。 React with TNF [alpha], a hamster anti-TNF monoclonal antibodies TN3.19.2 believed to react with TNFβ may process whether to start or after start before the onset arthritis, significantly the degree of joint destruction in DBA / 1 mice with lowering, that may reduce the inflammation associated with type II collagen-induced arthritis have proven [Williams et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 (Williams, ROet al .): 9784-9788 (1992) ]. ところが、抗TNF療法は関節炎を完全には除去しなかったことから、TNF以外の因子の病理への関与が示唆される。 However, anti-TNF therapy because it did not completely remove the arthritis, involvement in the pathology of factors other than TNF is suggested.
WO 89/08460は、ショック関連状態を予防または治療する、抗TNF抗体と抗リンパ球抗体の混合物を記載している。 WO 89/08460 is to prevent or treat shock-related conditions, describes a mixture of anti-TNF antibody and anti-lymphocyte antibody.
これらをはじめとする進歩にも関わらず、依然として自己免疫疾患および炎症性疾患のより良い治療が大いに求められている。 Despite the advances, including these, still better treatment of autoimmune and inflammatory diseases has been a great need.
発明の概要 Summary of the Invention
本発明は、自己免疫疾患や炎症性疾患、とくにリウマチ様関節炎の治療において、抗CD4抗体と抗TNF抗体を組み合わせて使用する併用療法が、各薬剤を単独で使用する場合よりはるかに優れた結果が得られるという発見に関する。 The present invention, autoimmune diseases and inflammatory diseases, in particular the treatment of rheumatoid arthritis, results combination therapy using a combination of anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, much better than using each agent alone It relates to the discovery that can be obtained. 抗CD4抗体は、抗TNF抗体と同時または連続的に対象に投与される。 Anti-CD4 antibody is administered to an anti-TNF antibody and simultaneously or sequentially subject. 抗体は薬学的に許容されるビーイクルとともに投与することができ、投与は単回投与でもよいし、数日ないし数週の間隔をおいて連続的に投与してもよい。 Antibodies can be administered with Biikuru pharmaceutically acceptable, administration may be a single dose may be administered at intervals of several days to several weeks continuously.
併用療法は、CD4+細胞の活性化や抗原提示細胞との相互作用に影響を及ぼす抗CD4抗体以外の薬剤を、抗TNF抗体以外の炎症メディエーターとともに組み合わせて用いることもできる。 Combination therapy, an agent other than influencing anti-CD4 antibody interaction with the activation and antigen presenting cells CD4 + cells, can also be used in combination with inflammatory mediators other than anti-TNF antibody.
抗CD4抗体と抗TNF抗体の併用療法の利点としては、各治療薬を別々に使用する治療の効果より優れた結果が得られることなどが挙げられる。 The advantages of the combination therapy of anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, better results than the effect of treatment using the therapeutics separately and the like can be obtained. また、同程度の免疫応答および炎症応答の低下をもたらすのに用量が少なくて済むので、治療ウィンドウ(therapeutic window)が広がる。 Moreover, since fewer doses to effect a reduction in comparable immune and inflammatory responses, therapeutic window (Therapeutic window) is increased. 用量が少なくて済むということは、患者の出費を減らし、副作用の発現も減る可能性がある。 That fewer doses can reduce the patient's expense, it could also reduced adverse reactions.
図1は、それぞれ図1Aおよび図1Bとした1組のグラフであり、50μgの抗TNF(ハムスターTN3.19.2)および200μgの抗CD4をDBA/1雄性マウスに投与後の臨床スコア(図1A)および足蹠腫大測定値(図1B)によって関節炎抑制を評価した実験結果を示す。 Figure 1 is a set of graphs was figures 1A and 1B, the anti-TNF clinical score after administration of anti-CD4 of (hamster TN3.19.2) and 200μg to DBA / 1 male mice 50 [mu] g (Figure 1A) and it shows the experimental results of evaluating arthritis suppressed by foot 蹠腫 atmospheric measurements (Fig. 1B). 白抜き四角=対照、ダイアモンド=抗CD4、三角=抗TNF(50μg)、黒塗り四角=抗CD4/抗TNF(50μg)。 Open squares = control, diamonds = anti-CD4, triangular = anti TNF (50 [mu] g), black squares = anti-CD4 / anti-TNF (50μg).
図2は、それぞれ図2A、図2B、図2C、および図2Dとした一連のグラフであり、臨床スコアおよび足蹠腫大測定値に対する低用量(50μg)抗TNFまたは高用量(300μg)抗TNFによる抗CD4の作用の強化を評価した第2の実験結果を示す。 2, respectively Figure 2A, Figure 2B, a series of graph as FIG. 2C, and 2D, the low dose on clinical score and paw 蹠腫 atmospheric measurements (50 [mu] g) anti-TNF or high dose (300 [mu] g) anti-TNF showing a second experimental result of the evaluation of the strengthening effect of anti-CD4 by. 図2Aは低用量抗TNFの場合の臨床スコアであり、図2Bは高用量抗TNFの場合の臨床スコア、図2Cは低用量抗TNFの場合の足蹠腫大測定値、図2Dは高用量抗TNFの場合の足蹠腫大測定値である。 2A is a clinical score in the case of low-dose anti-TNF, Figure 2B clinical score in the case of high-dose anti-TNF, Figure 2C foot 蹠腫 large measurements in the case of the low dose anti-TNF, Figure 2D is a high-dose a foot 蹠腫 large measurement value in the case of anti-TNF. 白抜き四角=対照、ダイアモンド=抗CD4、三角=抗TNF(50μg)、黒塗り四角=抗CD4/抗TNF(50μg)。 Open squares = control, diamonds = anti-CD4, triangular = anti TNF (50 [mu] g), black squares = anti-CD4 / anti-TNF (50μg).
発明の詳細な説明 Detailed Description of the Invention
本発明は、抗CD4抗体を抗TNF抗体と併用投与することによるリウマチ様関節炎などの自己免疫疾患または炎症性疾患の治療に関する。 The present invention relates to the treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis caused by co-administration of anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody. 抗体という用語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者を包含するものとする。 The term antibody is intended to encompass both polyclonal and monoclonal antibodies. 抗体という用語は、CD4またはTNFと反応する2つ以上の抗体の混合物(たとえば異なるタイプのCD4またはTNF反応性モノクローナル抗体の混合物)を包含するものである。 The term antibody is intended to encompass mixtures of more than one antibody reactive with CD4 or TNF (e.g. mixtures of different types of CD4 or TNF reactive monoclonal antibodies). さらに、抗体という用語は、抗体全体、それらの生物学的機能を持つ断片、および2つ以上の種、二重機能性抗体などの一部分を含んでなるキメラ抗体を包含する。 Moreover, the term antibody encompasses whole antibodies, fragments with their biological function, and more than one species, the chimeric antibody comprising a portion of such bifunctional antibodies. 使用可能な生物学的機能を持つ抗体断片とは、CD4またはTNFへの抗体断片の結合に十分な断片である。 The antibody fragments with available biological function, it is sufficient fragments for binding of the antibody fragment to CD4 or TNF.
キメラ抗体は、2つの異なる種(たとえばヒトの定常領域とネズミの可変または結合領域)に由来する部分からなるものであってよい。 Chimeric antibodies may consist of portions derived from two different species (e.g. variable or binding regions of the constant region and murine human). 2つの異なる種に由来する部分は、従来の方法によって化学的に結合させてもよいし、遺伝子操作技術を用いて単一の連続タンパク質として調製してもよい。 Portions derived from two different species may be chemically coupled to form by conventional methods, it may be prepared as single contiguous proteins using genetic engineering techniques. キメラ抗体の軽鎖と重鎖の両部分のタンパク質をコードするDNAを連続タンパク質として発現させることができる。 The DNA encoding the protein of both parts of the light chain and heavy chain of a chimeric antibody can be expressed as a contiguous protein.
体細胞ハイブリダイゼーション技術[ケーラーとミルスタイン(Kohler and Milstein)、 Nature 256 :495−497(1975)]やその他の技術により、CD4またはTNFと反応するモノクローナル抗体を製造することができる。 Somatic cell hybridization technique [Kohler and Milstein (Kohler and Milstein), Nature 256 : 495-497 (1975)] by and other techniques can be used to produce monoclonal antibodies reactive with CD4 or TNF. 代表的なハイブリダイゼーション法では、少なくともCD4またはTNFの一部分からなる粗製または精製タンパク質またはペプチドを免疫原として使うことができる。 In a typical hybridization procedure, a crude or purified protein or peptide consisting of at least a portion of CD4 or TNF can be used as an immunogen. 動物に免疫原を接種して、抗CD4抗体または抗TNF抗体産生脾臓細胞を得る。 Animals inoculated with the immunogen to obtain anti-CD4 antibody or anti-TNF antibody-producing spleen cells. 免疫される動物の種類は、目的のモノクローナル抗体の種類によって異なる。 Type of animal to be immunized will vary depending on the type of monoclonal antibody of interest. 抗体産生細胞を不滅化細胞(たとえば黒色腫細胞)と融合させて、抗CD4抗体または抗TNF抗体を分泌する能力を有するハイブリドーマを作成する。 The antibody-producing cells are fused with immortalized cells (e.g. melanoma cells) to create a hybridoma having the ability to secrete anti-CD4 antibody or anti-TNF antibody. 融合しなかった残りの抗体産生細胞と不滅化細胞は除去される。 The remaining antibody-producing cells and immortalized cells not fused is removed. 目的の抗体を産生するハイブリドーマを従来の方法を用いて選択し、選んだハイブリドーマをクローン化し、培養する。 Hybridomas producing antibody of interest selected using conventional methods, the hybridoma selected cloned and cultured.
動物に少なくともCD4またはTNFの一部分からなる粗製または精製タンパク質またはペプチドを免疫投与することによって、ポリクローナル抗体を製造することができる。 The crude or purified protein or peptide consisting of at least a portion of CD4 or TNF in an animal by immunizing dose, it is possible to produce a polyclonal antibody. 動物は、CD4またはTNFと反応する抗体が産生される条件下で飼育される。 Animals, antibodies reactive with CD4 or TNF are bred under conditions produced. 目標の抗体値に達したら、動物から採血する。 Once you reached the antibody value of the target, it bled from the animal. ポリクローナル抗体含有血清(抗血清)を他の血液成分から分離する。 Separating the polyclonal antibody-containing serum (antiserum) from other blood components. ポリクローナル抗体含有血清をさらに分離して、特定タイプの抗体(たとえばIgG、IgM)の画分に分けることができる。 Further separating the polyclonal antibody-containing serum can be divided into fractions of particular types of antibodies (e.g. IgG, IgM).
抗CD4抗体およびそれらの疾患治療用途に関するさらに詳細な説明が下記文献に記載されており、それらの記載内容は引例として本発明に含まれるものとする。 A more detailed description of anti-CD4 antibodies and their disease therapeutic use have been described in the following document, the contents thereof described are intended to be included in the present invention by reference. [米国特許出願第07/867,100号、1992年6月25日出願;グレイヘブら(Grayheb, al.)、 J.of Autoimmunity 2 :627−642(1989);ランゲスら(Ranges,GEet al.)、 J.Exp.Med.162 :1105−1110(1985);ホムら(Hom,JTet al.)、 Eur.J.Immunol.18: 881−888(1988);ウーリーら(Wooley,PHet al.)、 J.Immunol.13 4: 2366−2374(1985);クーパーら(Cooper,SMet al.)、 J.Immunol.141: 1958−1962(1988);バン・デン・ブロエクら(Van den Broek,MFet al.)、 Eur.J.Im munol.22: 57−61(1992);ウォフシーら(Wofsy, al.)、 J.Immunol.134: 852−857(1985);ウォフシーら(Wofsy, al.)、 J.Immunol.136: 4554−4560(1986);エルマークら(Ermak,TJet al.)、 Laboratory Investigation 61: 447−456(1989);レイテルら(Reiter, al.)、34:525−532(1991);ヘルゾーグら(Herzog, al.)、 J.Autoimmun.2: 627(1989);オウヤンら(Ouyang, al.)、 Di [US patent application Ser. No. 07 / 867,100, June 25, 1992, filed; Gureihebu et al., J.of Autoimmunity 2 (Grayheb, al.): 627-642 (1989); Rangesu et al. (Ranges, GEet al .), J.Exp.Med.162: 1105-1110 (1985 ); flame (Hom, JTet al), Eur.J.Immunol.18 :. 881-888 (1988); Woolley et al. (Wooley, PHet al .), J.Immunol.13 4: 2366-2374 ( 1985); Cooper et al. (Cooper, SMet al), J.Immunol.141 :. 1958-1962 (1988); Van den Buroeku et (Van den Broek , MFet al), Eur.J.Im munol.22: . 57-61 (1992); Wofushi et al. (Wofsy, al), J.Immunol.134 :. 852-857 (1985); Wofushi et al. ( Wofsy, al), J.Immunol.136: . 4554-4560 (1986); El mark et al (Ermak, TJet al), Laboratory Investigation 61:. 447-456 (1989); Reiteru al (Reiter, C .et al), 34:. 525-532 (1991); Heruzogu al (Herzog, al), J.Autoimmun.2 :. 627 (1989); Ouyang et al (Ouyang, al),. Di g.Dis.Sci.33: 1528−1536(1988);ヘルトゾーグら(Hertzog, al.)、 Lancet, p.1461(December 19,1987);エムリッヒら(Emmrich, al.)、 Lancet 338:570−571(August 31,1991)]。 g.Dis.Sci.33: 1528-1536 (1988); Herutozogu et al., Lancet, p.1461 (December 19,1987) ; Emurihhira (Hertzog, al.) ( Emmrich, al.) , Lancet 338: 570-571 (August 31,1991 )].
抗TNF抗体およびそれらの疾患治療用途に関するさらに詳細な説明が下記文献に記載されており、それらの記載内容は引例として本発明に含まれるものとする。 A more detailed description of anti-TNF antibodies and their disease therapeutic use have been described in the following document, the contents thereof described are intended to be included in the present invention by reference. [米国特許出願第07/943,852号、1992年9月11日出願;ルビンら(Rubin et al.)、EPO特許公開第0218868号、1987年4月22日公開;ヨネら(Yone et al.)、EPO特許公開第0288088号、1988年10月26日公開;リアングら(Liang,C.− al.)、 Biochem.Biophys.Res.Comm. 137:847−854(1986);ミーガーら(Meager, al.)、 Hybr idoma 6:305−311(1987);フェンドリーら(Fendly et al.)、 Hybridoma 6:359−369(1987);ブリングマンら(Bringman,TSet al.)、 Hybridoma 6:489−507(1987);ブリングマンら(Bringman,TSet al.)、 H ybridoma 6:489−507(1987);ヒライら(Hirai, al.)、 J.Immunol.Meth. 96:57−62(1987);モラーら(Moller, al.)、 Cytokine 2:162−169(1990);マティソンら(Mathison,JCet al.)、 J.Clin.Inves t. 81:1925−1937(1988);ベウトラーら(Beutler, al.)、 Sciences 229:869−871(1985);トレーシーら(Tracey,KJ [US patent application Ser. No. 07 / 943,852, September 11, filed 1992; Rubin et al., EPO Patent Publication No. 0,218,868, published Apr. 22, 1987 (Rubin et al.); Yonera (Yone et al.) , EPO Patent Publication No. 0288088, published Oct. 26, 1988; Riangura, Biochem.Biophys.Res.Comm 137 (Liang, al .):. 847-854 (1986); meager et al. (. Meager, al), Hybr idoma 6: 305-311 (1987); Fen Dolly et al., Hybridoma 6 (Fendly et al. ): 359-369 (1987); Bring Mann et al. (Bringman, TSet al. ), Hybridoma 6: 489-507 (1987 ); Bring Mann et al (Bringman, TSet al), H ybridoma 6:.. 489-507 (1987); Hirai et al. (Hirai, al), J.Immunol . Meth 96:. 57-62 (1987) ; Moller et al., Cytokine 2 (Moller, al .):; (. Mathison, JCet al) 162-169 (1990) Mathison et al., J.Clin.Inves t. 81: 1925-1937 (1988); Beutora et al, Sciences 229 (Beutler, al .): 869-871 (1985); Tracy et al. (Tracey, KJ et al.)、 Nature 330:662−664(1987);シマモトら(Shimamoto, al.)、 Immunol.Let t. 17:311−318(1988);シルバら(Silva,ATet al.)、 J.Infect.Dis. 162:421−427(1990);オパールら(Opal,SMet al.)、 J.Infect.Dis. 161:1148−1152(1990);ヒンショーら(Hinshaw,LBet al.)、 Cir c.Shock 30:279−292(1990)]。 . et al), Nature 330: 662-664 (1987); Shimamoto et al (Shimamoto, al), Immunol.Let t 17:.. 311-318 (1988); Silva et al. (Silva, ATet al). , J.Infect.Dis 162:. 421-427 (1990 ); opal et al., J.Infect.Dis 161 (opal, SMet al .):. 1148-1152 (1990); Hinsho al (Hinshaw, LBet al.) , Cir c.Shock 30: 279-292 (1990 )].
抗体は、従来の無毒の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビーイクルを含む処方として、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経口投与、直腸内投与、経鼻的投与、経頬的投与、経膣的投与、吸入噴霧投与、または留置片(implanted reservoir)投与することができる。 Antibodies, pharmaceutically acceptable carriers conventional non-toxic, as formulations containing adjuvants, and Biikuru, subcutaneous, intravenous, intramuscular, topical, oral, rectal, nasal administration, buccal administration, vaginal administration, by inhalation spray administration or placement piece (an implanted reservoir) can be administered. 抗体が投与される剤形(たとえばカプセル、錠剤、溶液、乳剤)は、少なくとも部分的には投与経路によって決まる。 Dosage form antibody is administered (e.g. capsules, tablets, solutions, emulsions) are is determined by the route of administration at least in part.
抗CD4抗体と抗TNF抗体を組み合わせたものの治療有効量とは、ある自己免疫疾患または炎症性疾患に伴う症状を有意に抑制または除去するのに要する量をいう。 The therapeutically effective amount of the combination of anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, refers to an amount required to significantly inhibit or eliminate symptoms associated with certain autoimmune or inflammatory diseases. 好ましい治療有効量とは、各抗体について投与1回あたり0.1〜10mg/kgである。 The preferred therapeutically effective amount is administered once per 0.1 to 10 mg / kg for each antibody. 治療有効量は個体ベースで決定され、少なくとも一部はその個体のサイズ、治療しようとする症状の程度、目標とする効果などを考慮して決められる。 A therapeutically effective amount is determined by an individual basis, at least a portion the size of the individual, the degree of symptoms to be treated is determined by considering the effect of the target. したがって、治療有効量は、通常の技術を有する者であれば上記因子を用いて常法による実験を行なうことによって決定することができる。 Therefore, the therapeutically effective amount can be determined by performing experiments with a conventional method using the above factors it would be appreciated by those of ordinary skill.
治療有効量は、単回投与または数日ないし数週の間隔を置いて連続投与することができる。 A therapeutically effective amount can be administered continuously at intervals of a single dose or several days to several weeks. 治療有効量を投与したら、維持量の抗CD4抗体または抗TNF抗体または抗CD4抗体と抗TNF抗体の組み合わせを投与することができる。 After administering a therapeutically effective amount can be administered a combination of maintenance dose of anti-CD4 antibody or anti-TNF antibody or anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody. 維持量とは、治療有効量によって達成された症状の抑制または除去を維持するのに要する抗CD4抗体、抗TNF抗体、または抗CD4抗体と抗TNF抗体の組み合わせの量をいう。 The maintenance dose refers to that amount of the combination of anti-CD4 antibodies required to maintain the suppression or elimination of symptoms achieved, an anti-TNF antibody or anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, the therapeutically effective amount. この維持量は、単回投与または数日ないし数週の間隔を置いて連続投与することができる。 This maintenance dose can be administered continuously at intervals of a single dose or several days to several weeks. 治療有効量と同様に、維持量も個体ベースで決定される。 Like the therapeutically effective amount, the maintenance dose is also determined by the individual base.
抗リウマチ薬のメトトレキセートやシクロスポリンAなどその他の抗炎症薬を抗CD4抗体または抗TNF抗体と併用投与することができる。 Other anti-inflammatory drugs such as methotrexate or cyclosporin A for anti-rheumatic drugs can be administered in combination with anti-CD4 antibody or anti-TNF antibody.
本明細書で検討する実験データは抗CD4抗体と抗TNF抗体の組み合わせに関しているが、抗CD4抗体以外の薬剤でCD4+細胞の活性化または抗原提示細胞(APC)との相互作用に影響を及ぼすものあるいはこれをさらに抗CD4抗体に加えて、抗TNF抗体以外の炎症メディエーターあるいはこれを抗TNF抗体にさらに加えたものと組み合わせて使用する併用療法も、自己免疫疾患や炎症性疾患の治療に使うことができる。 Experimental data discussed herein are concerns a combination of anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, affects stuff the interaction of the activation or antigen presenting cells CD4 + cells with an agent other than anti-CD4 antibody (APC) or which in addition to the anti-CD4 antibody, combination therapy used in combination with those further added inflammatory mediators other than anti-TNF antibodies or this to anti-TNF antibodies, it is used in the treatment of autoimmune diseases and inflammatory diseases can.
CD4+に影響を及ぼす薬剤としては、抗CD4、抗CD28、抗CD52(たとえばCAMPATH−1H)、抗IL−2RなどT細胞またはそれらの受容体に対する抗体;抗クラスII、抗ICAM−1、抗LFA−3、抗LFA−1などAPCまたはそれらの受容体に対する抗体;シクロスポリンやFK−506などHLAクラスIIグループをブロックするかT細胞活性化におけるシグナル伝達をブロックするものをはじめとするT細胞/APC相互作用をブロックするペプチドおよび小型分子;およびCD19、20、21、23、およびBB/7またはB1、CD28リガンドなどのCD5+B細胞などのB細胞に対する抗体が挙げられる。 The agents that affect CD4 +, anti-CD4, anti-CD28, anti-CD52 (e.g. CAMPATH-IH), antibodies to anti-IL-2R such T cells or their receptors; anti Class II, anti-ICAM-1, anti-LFA -3, anti LFA-1 such as APC or antibodies thereto receptors; cyclosporine and including those that block signaling in either T cell activation blocking HLA class II group, such as FK-506 T cells / APC peptides and small molecules that block the interaction; and CD19,20,21,23, and antibodies like on B cells, such as CD5 + B cells, such as BB / 7 or B1, CD28 ligand. CD5+B細胞などのB細胞は、疾患進行において重要なタイプのAPCであると考えられている[プラター−ザイベルクら(Plater−Zyberk, al.)、 Ann.NYAcad.Sci. 651:540−555(1992)]。 (. Plater-Zyberk, al ). - CD5 + B B cells, such as cells, is believed to be the APC important types in disease progression [platter Zaiberuku et al, Ann.NYAcad.Sci 651: 540- 555 (1992)]. したがって、本発明においては抗B細胞抗体がとくに有用である。 Thus, anti-B cell antibodies are especially useful in the present invention.
炎症メディエーターとしては、TNFを阻害する抗TNF抗体、可溶性TNF−R(モノマー性、IgG融合タンパク質など)、ペントキシフィリンやサリドマイドなどTNF受容体シグナル化またはTNF合成を阻害するブロッキングペプチドおよび小型分子;IL−1を阻害する抗IL−1抗体、可溶性IL−1R、IL−1受容体拮抗剤、またはIL−1合成またはIL−1受容体シグナル化に影響を及ぼすブロッキングペプチドおよび小型分子;IL−6を阻害する抗IL−6抗体、抗gp130、またはIL−6の合成または受容体シグナル化に影響を及ぼすブロッキングペプチドおよび小型分子;GM−CSFおよびヘモカイン(IL−8)ファミリーのメンバーなどその他の炎症メディエーターに影響を及ぼす薬剤;およびIL−4、IL−10、TGFβなど抗炎症性を有するサイトカインなどが挙げられる。 Inflammatory mediators, anti-TNF antibodies which inhibit TNF, soluble TNF-R (monomeric, such as IgG fusion proteins), pentoxifylline blocking peptide to inhibit the phosphorylation and thalidomide such as TNF receptor signaling or TNF synthesis and small molecules; anti IL-1 antibody that inhibits IL-1, soluble IL-1R, IL-1 receptor antagonist affect or IL-1 synthesis or IL-1 receptor signaling, blocking peptides and small molecules; IL- anti-IL-6 antibody to inhibit 6, anti-gp130, or IL-6 synthesis or receptor signaling affects blocking peptides and small molecules,; GM-CSF and Hemokain (IL-8), such as members of the family other agents that affect inflammatory mediators; and IL-4, IL-10, such as a cytokine with a TGFβ such as anti-inflammatory and the like.
したがって、本発明の併用療法はヒトおよび動物の多くの自己免疫疾患や炎症性疾患の治療に有用である。 Therefore, the combination therapies of the invention are useful for the treatment of many autoimmune diseases and inflammatory diseases in humans and animals. ヒトにおいては、本療法が適している疾患としては、リウマチ様関節炎(RA)および若年性慢性関節炎(JCA)などが挙げられる。 In humans, diseases that present therapy is appropriate, and the like rheumatoid arthritis (RA) and juvenile chronic arthritis (JCA). 併用療法に適したその他の疾患としては、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、炎症性腹症関連関節炎などの脊椎関節症;結節性多発性動脈炎、ベーゲナー肉芽腫症、巨細胞性動脈炎、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、腎臓の顕微脈管炎などの脈管障害;シェーグレン症候群;全身性狼瘡;クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腹症;慢性滑動性肝炎;原発性胆汁性肝硬変;原因不明繊維形成肺胞炎およびその他の繊維形成肺疾患;ブドウ膜炎;多発性硬化症;重症筋無力症;溶血性貧血;強皮症;移植片対宿主疾患(graft versus host disease);アレルギー;および腎臓、肝臓、心臓、肺、骨髄、皮膚、その他器官の移植などが挙げられる。 Other diseases suitable for combination therapy, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, spondyloarthropathies such as inflammatory abdomen associated arthritis; nodosa, Begena granulomatosis, giant cell arteritis, Sjogren's syndrome; systemic lupus; Crohn's disease and inflammatory abdominal diseases such as ulcerative colitis; chronic sliding hepatitis; primary biliary cirrhosis - Henoch Schonlein purpura, vascular disorders such as microscopic vasculitis of the kidney ; unexplained fibrosis alveolitis and other fiber forming pulmonary disease; uveitis; multiple sclerosis; myasthenia gravis; hemolytic anemia; scleroderma; graft-versus-host disease (graft versus host disease); allergies; and kidney, liver, heart, lung, bone marrow, skin, and other organ transplantation and the like.
以下、実施例により本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。 Hereinafter, more detailed and specific description of the present invention through examples.
実施例 :ネズミモデルにおける誘導関節炎の治療コラーゲンII型誘導関節炎のネズミモデルは、顕著なMHCクラスII素因、ならびに組織学的特徴、免疫組織学的特徴、軟骨および骨の侵食、および抗TNF療法応答性の点でリウマチ様関節炎(RA)と類似性がある。 Example: a murine model of therapeutic collagen type II-induced arthritis induction arthritis in murine models, significant MHC class II predisposition, as well as histologic features, immunohistological features, cartilage and bone erosion, and anti-TNF therapy response there is a similarity with rheumatoid arthritis (RA) in terms of gender. したがって、この動物モデルはヒトの疾患によく近似したモデルとして使用することができる。 Thus, this animal model can be used as a model that approximates well to human disease. 本実施例で使用したリウマチ様関節炎モデルは、ウイリアムスら[(Williams,ROet al.)、 PNAS 89: 9784−9788(1992)]によって記載されているDBA/1マウスのコラーゲンII型誘導関節炎である。 Rheumatoid arthritis model used in this example, Williams et al. [, PNAS 89 (Williams, ROet al.): 9784-9788 (1992)] is DBA / 1 mice of collagen type II induced arthritis has been described by . II型コラーゲンは、ミラーが述べるように[Miller、 Biochemistry 11:4903−4909(1972)]、限定的ペプシン可溶化と塩分画法によってウシ関節軟骨から精製した。 Type II collagen, as mirrors described [Miller, Biochemistry 11: 4903-4909 ( 1972)], were purified from bovine articular cartilage by limited pepsin solubilization and salt fractionation method.
試験1 Test 1
8〜12週齢の雄性DBA/1マウスに、フロインドの完全アジュバントに乳化した100μgのウシII型コラーゲンを免疫投与し、21日後に100μgのコラーゲンを腹腔内(ip)に免疫投与した。 8-12 week-old male DBA / 1 mice were administered immunized with bovine type II collagen 100μg emulsified in Freund's complete adjuvant were immunized administered collagen 100μg intraperitoneally (ip) after 21 days. 最初の注射から約35日目に臨床的に明白な関節炎症状(1肢以上に赤変と腫脹の両方または一方が見られる)が発現した直後に、マウスに抗CD4、抗TNF、抗CD4と抗TNFの両方、またはイソタイプ対照をip注射した。 Immediately after the first clinically apparent arthritis symptoms about 35 days after injection (both or either of reddening and swelling in more than one limb is observed) is expressed, mouse anti-CD4, anti-TNF, anti-CD4 both anti-TNF or isotype control were injected ip. 関節炎の臨床スコアと足蹠腫大測定値を10日間モニターした。 The clinical score and feet 蹠腫 large measure of arthritis was monitored for 10 days. 抗体投与は1日目(発症時)、4日目、および7日目に行なった。 Antibody administration day 1 (onset), it was performed on day 4, and 7 days.
2つの実験を行ない、臨床スコアと足蹠腫大を評価した。 We carried out two experiments to evaluate the clinical score and feet 蹠腫 large. 各実験では、注射1回あたり200μgの抗CD4(ラットYTS191およびYTA3.1)を使用した。 Each experiment used anti-CD4 (the rat YTS191 and YTA3.1) injections per 200 [mu] g. 臨床スコアは以下の基準で評価した。 Clinical score was evaluated according to the following criteria. 0=正常、1=軽度の腫大と紅斑の両方または一方、2=顕著な水腫、3=関節硬直。 0 = normal, 1 = both mild swelling and erythema or other hand, 2 = pronounced edema, 3 = joint rigidity. 各肢について等級評価し、マウス1匹あたり最高12点のスコアを与えた。 And grade evaluated for each limb, was given a score of up to 12 points per mouse. 足蹠腫脹は、障害を有する後足蹠の厚みをキャリパーで測定することによってモニターした。 Footpad swelling was monitored by measuring the thickness of the hind footpad with a disorder in caliper. 結果は、関節炎発症前の足蹠幅に対する足蹠幅の増大率で示した。 The results are shown in the increased rate of foot 蹠幅 against arthritogenic front foot 蹠幅.
第1の実験では、注射1回あたり50μgの抗TNF(ハムスターTN3.19.2)を1群あたり5匹のマウスそれぞれに単回投与した。 In the first experiment, a single dose anti-TNF (hamster TN3.19.2) each 5 mice per group the injection once per 50 [mu] g. 抗CD4または抗TNF(TN3.19を50μg/マウスの用量で3回投与)の有意な作用はみられなかった。 Significant effect of anti-CD4 or anti-TNF (three doses TN3.19 at a dose of 50 [mu] g / mouse) was observed. 臨床スコアと足蹠腫脹のいずれについても併用療法の利点が明白に認められる(図1Aと図1B参照)。 For any of the clinical score and paw swelling advantage of the combination therapy it is observed clearly (see FIGS. 1A and 1B).
第2の実験では、50μgまたは300μgの抗TNFを1群あたり7匹のマウスそれぞれに投与した。 In the second experiment, were administered anti-TNF of 50μg or 300μg each 7 mice per group. 抗CD4と低濃度(50μg)の抗TNFはいずれもいくらかの作用を示し、この2つの濃度の併用療法の利点は、足蹠腫脹については認められたが、臨床スコアでは認められなかった。 And anti-CD4 showed some effect both anti-TNF is the low concentration (50 [mu] g), the advantages of combination therapy of these two concentrations was observed for the paw swelling was not observed in the clinical score. しかし、抗TNFを300μg/マウスの用量で投与したところ、抗CD4との併用療法の利点が臨床スコアと足蹠腫脹の両方で見られ、足蹠腫脹でより明白であった(図2A、図2B、図2C、図2D参照)。 However, were administered anti-TNF at a dose of 300 [mu] g / mouse, the advantages of combination therapy with anti-CD4 was seen in both clinical score and footpad swelling was more evident in footpad swelling (FIGS. 2A, 2B, FIG. 2C, see Fig. 2D).
上記実験の結果は、抗TNF抗体と抗CD4抗体を組み合わせて用いる併用療法は臨床スコアと足蹠腫脹で評価できる明白な利点があることを示すものである。 Results of the above experiments, combination therapy using a combination of anti-TNF antibody and anti-CD4 antibody is indicative that there is a distinct advantage that can be evaluated in clinical score and footpad swelling.
試験2 Test 2
8〜12週齢の雄性DBA/1マウスに、フロインドの完全アジュバントに乳化した100μgのII型コラーゲンを皮内免疫投与した。 8-12 week-old male DBA / 1 mice, type II collagen 100μg emulsified in Freund's complete adjuvant was administered intracutaneously immunized. 1肢以上で紅斑と腫脹の両方または一方が初めて見られた日を関節炎発症1日目とした。 The date on which one or both of erythema and swelling was observed for the first time in one limb more than was arthritis onset of the first day. 関節炎は、II型コラーゲン免疫後30日目ごろに臨床的に明白となった。 Arthritis, became clinically obvious in 30 days around after the type II collagen immunization. 各マウスにつき、関節炎が初めて見られた日に処理を開始し、10日にわたり処理を続け、その後マウスを屠殺し、関節を組織検査用に処理した。 For each mouse, to start the process on the day of arthritis was observed for the first time, continue the process over a period of 10 days, then the mice were sacrificed and treated the joint for histological examination. 1日目、4日目、および7日目にモノクローナル抗体処理を行なった。 Day 1 was subjected to monoclonal antibody treatment on day 4, and 7 days. まず、50μgという最適用量以下(sub−optimal dose)の抗TNF(TN3−19.12、ハムスターIgG1抗TNFα/βmAb)を単独で投与した場合を、同用量で200μgの抗CD4(ラットIgG2b、YTS191.1.2とYTA3.1.2の混合物)と併用投与した場合と比較した。 First, optimal dose hereinafter referred 50μg (sub-optimal dose) of anti-TNF (TN3-19.12, hamster IgG1 anti-TNFα / βmAb) a when administered alone, at the same dosage of 200μg anti-CD4 (rat IgG2b, YTS191.1.2 compared with the case where the mixture of YTA3.1.2) and coadministered. 結果を確認するために、上記と同一内容の2つの実験を別に行なった(それぞれマウス11〜12匹/群および7〜8匹/群)。 To confirm the results, the two experiments described above the same content were performed separately (each mouse 11-12 animals / group and 7-8 mice / group). 抗CD4単独でも最適用量以下の抗TNF単独でも、足蹠腫大を有意に低下させることはできなかった(データは示さない)。 Even at optimal doses following anti-TNF alone or anti-CD4 alone, it was not possible to significantly reduce paw 蹠腫 large (data not shown). 抗TNFと抗CD4の併用処理は、対照mAbを投与された群と比べて、足蹠腫大が一貫して統計的に有意な低下を引き起こした(P<0.001)。 The combination treatment of anti-TNF and anti-CD4, in comparison with the group administered a control mAb, foot 蹠腫 University has caused a statistically significant reduction consistently (P <0.001). さらに、いずれの実験においても、抗TNF/抗CD4併用処理(本明細書では抗CD4/抗TNF処理ともいう)は、抗CD4単独および抗TNF単独と比べて足蹠腫大を有意に低下させた(P<0.05)。 Further, in any of the experiments, (also referred to herein as anti-CD4 / anti-TNF treatment) anti TNF / anti-CD4 combination treatment significantly decreased the paw 蹠腫 large compared to anti-CD4 alone and anti-TNF alone It was (P <0.05).
次に、最適用量の抗TNF(300μg)を単独投与した場合と、同用量で抗CD4と併用投与した場合を、同一内容の別の2つの実験(それぞれマウス7〜7匹/群およびマウス6〜7匹/群)と比較した。 Next, a case of single administration of optimal doses of anti-TNF (300 [mu] g), a when administered in combination with anti-CD4 at the same dosage, another two experiments of the same content (each mouse 7 to 7 / group and mice 6 It was compared to 7 animals / group) and. 前記試験同様、抗TNF/抗CD4併用処理は、対照mAbを投与された群と比べて足蹠腫大を有意に低下させた(P<0.005、データは示さない)。 Similarly the test, the anti-TNF / anti-CD4 combination treatment, compared to the group administered control mAb significantly reduced the paw 蹠腫 large (P <0.005, data not shown). 第1の実験では、抗CD4単独または抗TNF単独を投与された群と比べても、足蹠腫大は抗CD4/抗TNF併用処理群で有意に低下した(P<0.05)。 In the first experiment, even compared to the group administered the anti-CD4 alone or anti-TNF alone, foot 蹠腫 University was significantly reduced in anti-CD4 / anti-TNF combined treatment group (P <0.05). 有意差はなかったが、抗TNF単独または抗CD4単独の投与を受けたマウスで足蹠腫大がある程度低下したが、これはおそらく群サイズが小さいことによるものであろう(1群あたり6匹)。 There was no significant difference, but the foot 蹠腫 size in mice that received anti-TNF alone or anti-CD4 alone is decreased to some extent, probably due to the group size is small (6 per group ). 第2の実験では、抗CD4/抗TNF併用投与は抗CD4単独投与と比べて足蹠腫大を有意に低下させたが(P<0.05)、抗TNF単独と比べると有意な低下はなかった。 In the second experiment, the anti-CD4 / anti-TNF administered in combination is significantly reduced the paw 蹠腫 large compared to anti-CD4 alone (P <0.05), there was no significant reduction when compared to anti-TNF alone . これは、過去の研究[ウイリアムスら(Williams,ROet al.)、 PNAS 89: 9784−9788(1992)]から予想されたように、抗TNF自体が足蹠腫大の有意な低下を引き起こしたからである。 This previous study [Williams et al., PNAS 89 (Williams, ROet al .): 9784-9788 (1992)] as expected from, because the anti-TNF itself caused a significant reduction in paw蹠腫large is there. 実験では、抗TNF単独に起因する足蹠腫大低下率はそれぞれ23%と33%であった。 In the experiment, the paw 蹠腫 large reduction rate due to anti-TNF alone was 23% and 33%, respectively. したがって、抗TNF処理による足蹠腫脹低下は、TN3−119.12(300μg/マウス)による処理が処理期間を通じて対照と比べて平均約34%の足蹠腫大測定値の低下をもたらした既報の知見にほぼ匹敵するものである[ウイリアムスら(Williams,ROet al.)、 PNAS 89: 9784−9788(1992)]。 Therefore, reduction paw swelling by anti-TNF treatment, the TN3-119.12 (300μg / mouse) by the process previously reported findings lead to a reduction in average about 34% of the foot 蹠腫 large measure as compared to the control throughout the treatment period it is intended to substantially comparable [Williams et al., PNAS 89 (Williams, ROet al .): 9784-9788 (1992)].
四肢への影響 Impact on the limb
コラーゲン誘導関節炎では、RAの場合と同様に、臨床疾患が最初に発現してから新たに別の四肢が影響を受けるのが普通であり、新たな四肢への影響はこの疾患の進行の重要な指標である。 The collagen-induced arthritis, as in the case of RA, clinical disease is normal to first new another limb after expression is affected, such impact on new limb important in the progression of the disease it is an indicator. 新たな四肢への影響に及ぼす抗CD4抗/TNF処理の影響を調べるために、10日間の処理期間の最終日に臨床的に検出可能な関節炎を有する四肢の数を処理前の関節炎四肢数と比較した。 To investigate the effect of anti-CD4 anti / TNF treatment on the impact of the new limb, the number of arthritis limbs before treatment the number of limbs with clinically detectable arthritis on the last day of the treatment period of 10 days They were compared. 対照mAbを投与されたマウスでは、症状を有する肢が10日間に約50%増加した。 In mice treated with the control mAb, limbs with symptoms was increased about 50% in 10 days. 上記2つの実験の結果をまとめて表1に示す。 Table 1 shows the results of the two experiments.
抗CD4単独および最適用量以下の抗TNF単独の投与を受けた群において四肢への新たな影響が減ったが、その差は有意でなかった。 In anti-CD4 alone and optimal dose following anti-TNF alone group receiving administration of decreased a new impact on the limbs, but the difference was not significant. 最適用量の抗TNFを投与された群では、四肢への影響の増加率は10%未満であった(P<0.05)。 In the group administered the anti-TNF optimal dosage rate of increase of the influence of the limbs was less than 10% (P <0.05). しかし、さらに注目すべき点は、抗CD4/抗TNFの併用投与を受けた群で四肢への新たな影響がほとんどなかったことである。 However, further notable is that there was almost no new impact on the limbs in the group receiving the combined administration of anti-CD4 / anti-TNF. 新たな四肢への影響の増加は、抗CD4と最適用量以下の抗TNFの投与を受けたマウスではわずか3%であり(P<0.05)、抗CD4と最適用量の抗TNFの投与を受けたマウスでは0%(P<0.005)であった。 Increase impact on new limb, in mice that received anti-CD4 and optimal dose following anti-TNF is only 3% (P <0.05), received a dose of anti-TNF anti-CD4 and optimal dose in mice it was 0% (P <0.005).
組織学的特徴 Histological features
10日後、マウスを屠殺し、最初に関節炎の臨床症状を示した四肢を各マウスから切除し、ホルマリン固定し、脱カルシウム化し、ワックス埋入した後、切片を作成し、ヘマトキシリンとエオジンで染色した。 After 10 days, mice were sacrificed, first limb showing clinical symptoms of arthritis were excised from each mouse, fixed in formalin, de-calcified, after wax embedded and sectioned, and stained with hematoxylin and eosin . 中指近位指節間(PIP)関節の矢状切片について、軟骨と骨のいずれかに侵食があるかどうかを盲検的に調べた(炎症組織が充満した軟骨または骨の分界欠損(demarcated defects)として判定)。 For sagittal sections of the middle finger between the proximal phalangeal (PIP) joint, whether there is erosion in any of cartilage and bone were examined blindly (inflamed tissue is cartilage or demarcation bone defects filled (demarcated defects ) determined as). 比較は同一関節についてのみ行ない、関節炎は同一継続期間のものとした。 Comparison performed only for the same joint, arthritis was of the same duration. 侵食は対照群のPIP関節のほぼ100%で見られ、抗CD4単独または最適用量以下の抗TNF単独の投与を受けた関節の約70〜80%で見られた。 Erosion is found in almost 100% of the control group of the PIP joint, seen in about 70-80% of the anti-CD4 alone or optimal dose following anti-TNF alone received joint administration. 上記2つの実験の結果をまとめ、表2に示す。 It summarizes the results of the two experiments are shown in Table 2.
最適用量の抗TNF単独を投与した場合、既報[ウイリアムスら(Williams,ROet al.)、 PNAS 89:9784−9788(1992)]の通り病変が有意に低下した。 When administered anti-TNF alone optimal dose, previously reported [Williams et al., PNAS 89 (Williams, ROet al .): 9784-9788 (1992)] as lesions was significantly reduced. したがって、最適用量の抗TNF単独の投与を受けたマウスでは、侵食変化を示した関節の割合は54%に低下し(P<0.001)、抗CD4と最適用量以下または最適用量の抗TNFを投与された群ではそれぞれ関節の22%(P<0.01)と31%(P>0.01)のみが侵食された。 Therefore, in the mice that received anti-TNF alone the optimum dose, the percentage of indicated erosion change joints decreased to 54% (P <0.001), and anti-CD4 and anti-TNF optimal dosage below or optimal dose 22% respectively in by the group joint only (P <0.01) and 31% (P> 0.01) were eroded. このように、300μgの抗TNF単独投与により関節侵食からある程度保護されたが、抗CD4/抗TNFを併用投与すると保護の程度が有意に高くなった。 Thus, although a certain degree protected from the joint erosion by anti-TNF administered alone 300 [mu] g, the degree of protection that combined administration of anti-CD4 / anti-TNF was significantly higher.
CD4+T細胞の減少 CD4 + T decrease in cell
抗CD4処理がどの程度まで末梢CD4+T細胞を減少させるかをフローサイトメトリー法によって測定した。 Or decreasing peripheral CD4 + T cells Anti CD4 treatment to what extent was measured by flow cytometry. 解離脾臓細胞または末梢血におけるCD4+リンパ球の比率を計算するために、細胞をフィコエリスリン−コンジュゲート化抗CD4(Becton Dickinson,Oxford,UK)とともにインキュベーションした後、リンパ球画分上にスキャッターゲートを設定するフローサイトメトリー法(FACScan,Becton Dickinson)によって分析した。 To calculate the ratio of CD4 + lymphocytes in dissociated spleen cells, or peripheral blood, cells phycoerythrin - Sukya' conjugated anti CD4 (Becton Dickinson, Oxford, UK) was incubated with, on the lymphocyte fraction flow cytometry method for setting the Tageto (FACScan, Becton Dickinson) and analyzed by. 抗CD4処理によって、脾臓のCD4+細胞は98%(±1%)減少し、血液中のCD4+T細胞は96%(±3%)減少した。 By anti-CD4 treatment, CD4 + cells in the spleen was reduced 98% (± 1%), CD4 + T cells in the blood 96% (± 3%) was reduced.
免疫組織化学 Immunohistochemistry
末梢CD4+T細胞が実質的に全て除去されても関節内にCD4+T細胞が残存している可能性があるかどうか、処理済み関節炎マウスから採取した切片の免疫組織化学的分析によって調べた。 Peripheral CD4 + T cells was examined by a substantially whether all be removed in the joint CD4 + T cells might be remaining, immunohistochemical analysis of sections were collected from the treated arthritic mice. ワックス埋入切片を脱ワックス処理し、トリプシン消化した後、抗CD4mAb(YTS191.1.2/YTA3.1.2)とともにインキュベーションした。 Wax implantation sections were dewaxed process, after trypsin digestion, and incubated with anti CD4mAb (YTS191.1.2 / YTA3.1.2). CD4+細胞のT細胞同一性(T cell identity)を確認するために、一連の切片を抗Thy−1mAb(YTS154.7)で染色した[コッブボルドら(Cobbold,SPet al.)、 Nature 31 2 :548−551(1984)]。 To confirm CD4 + T cell identity of the cells (T cell identity), and stained with a series of sections were anti Thy-1mAb (YTS154.7) [Kobbuborudo et al, Nature 31 2 (Cobbold, SPet al.): 548 -551 (1984)]. 対照切片は、HRPN11/12aとともにインキュベーションした。 Control sections were incubated with HRPN11 / 12a. 結合抗体の検出は、既報[デレウランら(Deleuran,BWet al.)、 Arthritis & Rheumatism 34: 1125−1132(1991)]に従い、アルカリホスファターゼ/ラット抗アルカリホスファターゼ複合体(APAAP、Dako,High Wycombe,UK)および高速赤色基質(fast red substrate)によっておこなった。 Detection of bound antibody, previously reported [Dereuran et al, Arthritis & Rheumatism 34 (Deleuran, BWet al.): 1125-1132 (1991)] in accordance with alkaline phosphatase / rat anti-alkaline phosphatase conjugate (APAAP, Dako, High Wycombe, UK ) and it was carried out by high-speed red substrate (fast red substrate). 対照mAb投与マウスだけでなく、抗CD4処理マウスの関節からも少数のCD4+細胞が検出された(データは示さない)。 Not only control mAb treated mice a small number of CD4 + cells from anti-CD4-treated mice joints were detected (data not shown). さらに、調べた少数のマウス(1処理群あたり4匹)の範囲内では、抗CD4単独投与または抗CD4と抗TNFの併用投与を受けた群にCD4+T細胞数の有意な減少は見られなかった(データは示さない)。 Furthermore, examined Within few range of the mice (four mice per treatment group) were, significant decrease in CD4 + T cell count in the group receiving the anti-CD4 alone or anti-CD4 and co-administration of the anti-TNF was observed (data not shown). したがって、抗CD4処理は関節からCD4+T細胞を除去しなかったことになる。 Thus, anti-CD4 treatment would not remove CD4 + T cells from the joint.
抗コラーゲンIgG値 Anti-collagen IgG values
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって血清抗コラーゲンIgG値を測定した。 It was measured serum anti-collagen IgG value by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). マイクロタイタープレートにウシII型コラーゲン(2μg/ml)を被覆し、ブロックした後、段階的に希釈した一連の試験血清とともにインキュベーションした。 Bovine type II collagen (2μg / ml) was coated into microtiter plates, after blocking, was incubated with a series of test sera were serially diluted. 結合IgGの検出は、アルカリホスファターゼ−コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgGとともにインキュベーションし、次いで基質(ジニトロフェニルホスフェート)を加えることによって行なった。 Detection of bound IgG alkaline phosphatase - incubation with conjugated goat anti-mouse IgG, and then was performed by addition of substrate (dinitrophenyl phosphate). 405nmで光学密度を読み取った。 The optical density was read at 405 nm. アフィニティー精製マウス抗II型コラーゲン抗体からなる参照試料を各プレートに加えた。 The reference sample consisting of affinity-purified mouse anti-type II collagen antibody was added to each plate. 抗CD4単独、抗TNF単独、あるいは抗CD4と抗TNFを組み合わせたものを投与しても、10日間の処理期間中に抗II型コラーゲンIgGの血清値は有意な変化を示さなかった(表3)。 Anti-CD4 alone may be administered a combination of anti-TNF alone or anti-CD4 and anti-TNF, serum levels of anti-type II collagen IgG during the processing period of 10 days showed no significant change (Table 3 ).
グロブリン応答 Globulin response
抗CD4処理が抗TNFmAbに対する中和性抗グロブリン応答を防止するかどうかを調べるために、ELISAで測定した10日目のIgM抗TN4−19.12値を比較した。 To determine whether anti-CD4 treatment prevented a neutralizing anti-globulin response against the anti-TNF mAb, compared with 10 days of IgM anti-TN4-19.12 values ​​measured by ELISA. この時点では、IgG抗TN3−19.12応答は検出されなかった。 At this point, IgG anti-TN3-19.12 response was not detected. マイクロタイタープレートにTN3−19.12(5μg/ml)を被覆し、ブロックした後、一連の希釈試験血清とともにインキュベーションした。 Microtiter plates coated with TN3-19.12 (5μg / ml), after blocking, it was incubated with a series of diluted test sera. ヤギ抗マウスIgMアルカリホスファターゼコンジュゲートを加え、次いで基質を加えることによって、結合IgMを検出した。 Goat anti-mouse IgM-alkaline phosphatase conjugate was added, followed by addition of substrate binding was detected IgM. その結果、抗CD4は、抗TN3−19.12抗体応答の発現の防止に非常に有効であることがわかった(表4)。 As a result, anti-CD4, it has been found very effective in preventing the expression of an anti-TN3-19.12 antibody response (Table 4). 次に、抗CD4処理が循環抗TNF−α値の上昇をもたらす(ハムスター抗TNFに対する抗体応答を低下させることによって)かどうかを調べるために、実験10日目に組替えネズミTNF−αを用いて、マウス血清中遊離TN3−19.12を検出するELISAを行なった。 Next, in order to anti-CD4 treatment test whether results in an increase in circulating anti TNF-alpha value (by reducing the antibody response to the hamster anti-TNF), using a murine TNF-alpha reclassified to experimental day 10 It was performed ELISA to detect the mouse serum free TN3-19.12. マイクロタイタープレートに組替えネズミTNF−αを被覆し、ブロックした後、試験血清とともにインキュベーションした。 Coated with murine TNF-alpha reclassified into microtiter plates, after blocking, it was incubated with the test serum. 次いで、ヤギ抗ハムスターIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(ネズミIgGに吸着させたもの)を加え、次いで基質を加えた。 Then, a goat anti-hamster IgG alkaline phosphatase conjugate (which was adsorbed to the murine IgG) was added, followed by addition of substrate. 既知濃度のTN3−19.12試料と比較することで定量を行なった。 It was performed quantified by comparing with TN3-19.12 samples of known concentration. TN3−19.12値は、抗TNF単独投与の場合と比べて、抗CD4と抗TNFを併用投与した群でやや上昇したが、その差は統計的に有意ではなかった(表4)。 TN3-19.12 value, compared with the case of anti-TNF alone, although slightly increased in the group coadministered anti-CD4 and anti-TNF, but the difference was not statistically significant (Table 4).
産業の利用分野 Field of industry
本発明は、特にリウマチ様関節炎のような自己免疫疾患あるいは炎症性疾患の治療における併用療法に有用な物質および薬剤に主として利用される。 The present invention is primarily utilized to useful materials and agents for combination therapy in particular in the treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis.

Claims (10)

  1. 乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患の治療のための、抗CD4抗体と抗腫瘍壊死因子(TNF)抗体を含む組成物。 For the treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases in mammals animals, anti-CD4 antibody and anti-tumor necrosis factor (TNF) a composition comprising an antibody.
  2. 抗CD4抗体および抗TNF抗体が、同時あるいは連続投与される請求項1の組成物。 Anti-CD4 antibody and anti-TNF antibodies, simultaneously or composition according to claim 1 are administered sequentially.
  3. 抗CD4抗体および抗TNF抗体が、皮下、静脈内、あるいは筋肉内投与される請求項1の組成物。 Anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, subcutaneous, intravenous, or intramuscular administration compositions of claim 1.
  4. さらに薬学的に許容されるビーイクルを含 請求項1の組成物。 Further pharmaceutically acceptable Biikuru the including claim 1 of the composition.
  5. さらに抗炎症剤を含む請求項1又は請求項4の組成物。 Furthermore according to claim 1 or composition of claim 4 comprising an anti-inflammatory agent.
  6. 哺乳動物における自己免疫疾患または炎症性疾患の治療のための治療薬剤を製造するための抗CD4抗体および抗腫瘍壊死因子(TNF)抗体の使用方法 Anti-CD4 antibodies and anti-tumor necrosis factor (TNF) Using antibodies for the manufacture of a therapeutic agent for the treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases in a mammal.
  7. 抗CD4抗体および抗TNF抗体が、同時あるいは連続投与される請求項6の方法 Anti-CD4 antibody and anti-TNF antibodies, simultaneously or method of claim 6 which is continuously administered.
  8. 抗CD4抗体および抗TNF抗体が、皮下、静脈内、あるいは筋肉内投与される請求項6の方法 Anti-CD4 antibody and anti-TNF antibody, subcutaneous method of claim 6, intravenous, or is administered intramuscularly.
  9. 学的に許容されるビーイクルをさらに使 用する請求項6の方法 The method of claim 6, for further use the Biikuru to be drug histological acceptable.
  10. 抗炎症剤をさらに使用する請求項6又は請求項9の方法 Claim 6 or method of claim 9 further use of anti-inflammatory agents.
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