JP3520874B1 - Colorimetric method - Google Patents

Colorimetric method

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JP3520874B1
JP3520874B1 JP2003380986A JP2003380986A JP3520874B1 JP 3520874 B1 JP3520874 B1 JP 3520874B1 JP 2003380986 A JP2003380986 A JP 2003380986A JP 2003380986 A JP2003380986 A JP 2003380986A JP 3520874 B1 JP3520874 B1 JP 3520874B1
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reagent
reaction
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creatinine
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賢 塚本
秀次郎 榊
俊介 竹嶋
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Abstract

【要約】 【課題】H2O2を介する定量において検体中のビリルビン
等の還元物質の影響の少ない比色定量方法、測定試薬安
定化方法、ビリルビン影響抑制方法、及び当該定量のた
めの長期間保存可能な試薬。 【解決手段】検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿
酸を酵素反応により過酸化水素に導きパーオキシダーゼ
の存在下で発色色素を生成させる比色定量方法で、反応
系に式(I): 【化1】 (R:H又はメチル基)及び式(II): 【化2】 (R:H又はメチル基。X:C12〜20アルキル。)の単量体に基
く単位からなる分子量5,000〜5,000,000の重合体を存在
させる比色定量方法、保存安定化方法及びビリルビン影
響抑制方法、並びに該重合体を含む試薬。
Kind Code: A1 Abstract: A method for colorimetric quantification, a method for stabilizing a measurement reagent, a method for suppressing the effect of bilirubin, and a long-term method for the quantification, which are less affected by a reducing substance such as bilirubin in a sample in quantification via H 2 O 2. A storable reagent. Kind Code: A1 A colorimetric method in which creatinine, creatine or uric acid in a sample is led to hydrogen peroxide by an enzymatic reaction to generate a coloring dye in the presence of peroxidase, wherein the reaction system is represented by the formula (I): (R: H or methyl group) and formula (II):

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention 【技術分野】【Technical field】
【0001】本発明は、臨床診断等のための比色定量方
法に関する。
The present invention relates to a colorimetric method for clinical diagnosis and the like.
【背景技術】[Background technology]
【0002】臨床検査における生化学項目の測定方法に
は大きく分けると化学法と酵素法が存在する。このうち
酵素法には、例えば、デヒドロゲナーゼを用いてNADH等
の補酵素を検出する方法と、オキシダーゼを用いて測定
対象物質から定量的に発生させた過酸化水素を検出する
方法がある。オキシダーゼを用いる方法は、他法より高
感度であるため微量の物質を測定するのに適するが、過
酸化水素を介する測定系であるため、試料中に還元作用
を有する物質が存在すると、それらにより過酸化水素が
還元され、測定結果に影響を及ぼし、正確な測定を妨害
するという問題点がある(以下、このように定量のため
のものではない還元作用を示す物質を、単に「還元物
質」という)。
The methods for measuring biochemical items in clinical tests are roughly divided into chemical methods and enzyme methods. Among them, the enzyme method includes, for example, a method of detecting a coenzyme such as NADH using dehydrogenase, and a method of detecting hydrogen peroxide quantitatively generated from a substance to be measured using an oxidase. The method using oxidase is more sensitive than other methods and is suitable for measuring a small amount of substance.However, since it is a measurement system mediated by hydrogen peroxide, if a substance having a reducing action exists in the sample, There is a problem that hydrogen peroxide is reduced, which affects the measurement results and interferes with accurate measurement (hereinafter, a substance that exhibits a reducing action that is not for quantitative determination is simply referred to as a “reducing substance”). That).
【0003】前記還元物質としては、具体的には採血時
の溶血により遊離するヘモグロビンや、肝疾患患者の血
中に高濃度で存在するビリルビン、あるいは栄養剤とし
て服用されるアスコルビン酸、肝臓や赤血球、白血球等
の溶液に存在する還元型グルタチオン(GSH)等が挙げら
れる。
Specific examples of the reducing substance include hemoglobin released by hemolysis during blood collection, bilirubin present at a high concentration in blood of patients with liver disease, or ascorbic acid taken as a nutritional supplement, liver or red blood cells. , Reduced glutathione (GSH) existing in a solution of white blood cells and the like.
【0004】これらの還元物質は、比較的高濃度の対象
物質の濃度を測定する場合にはあまり問題とはならない
が、低濃度の対象物質の濃度を測定する場合には多大な
測定誤差を生じる原因となる。換言すればこれらの還元
物質により消去される過酸化水素が一定量である場合、
測定対象物質の濃度が低いほど大きな影響を受ける。
These reducing substances are not a serious problem when measuring the concentration of a target substance having a relatively high concentration, but cause a large measurement error when measuring the concentration of a target substance having a low concentration. Cause. In other words, if the amount of hydrogen peroxide eliminated by these reducing substances is constant,
The lower the concentration of the substance to be measured, the greater the effect.
【0005】例えば腎機能のマーカーであるクレアチニ
ンは正確な測定が要求される測定項目の1つであるが、
他の生化学項目と比較して検体中の存在量は微量であ
る。このため還元物質によって過酸化水素が僅かに消去
されても測定値に著しい影響を与える。しかしクレアチ
ニンはその臨床上の意義から正確な測定が求められるた
め、還元物質による影響を極力回避して低濃度おいても
正確に測定することが求められる。
[0005] For example, creatinine, which is a marker of renal function, is one of the measurement items that requires accurate measurement.
The abundance in the sample is very small compared to other biochemical items. Therefore, even if hydrogen peroxide is slightly erased by the reducing substance, the measured value is significantly affected. However, since creatinine is required to be accurately measured because of its clinical significance, it is necessary to avoid the influence of reducing substances as much as possible and accurately measure even at low concentrations.
【0006】過酸化水素を介する測定系において還元物
質の影響を回避する手段としては、カチオン性界面活性
剤又は両性界面活性剤を試薬に添加する方法(特許文献
4)、及びベタイン系界面活性剤を試薬に添加する方法
(特許文献5)が提案されている。しかしながら、これら
の方法においてもビリルビン等の還元物質の影響を完全
に解決しているとは言い難く、特にクレアチニンの測定
においては依然として十分であるとは言い難い。
As a means for avoiding the influence of reducing substances in a measurement system mediated by hydrogen peroxide, a method of adding a cationic surfactant or an amphoteric surfactant to a reagent (Patent Document)
4), and a method of adding a betaine surfactant to the reagent
(Patent Document 5) has been proposed. However, it is hard to say that these methods completely solve the influence of reducing substances such as bilirubin, and it is hard to say that they are still sufficient especially for the measurement of creatinine.
【0007】さらにイオン性界面活性剤は、酵素等の他
の成分と共に溶液とした場合、当該他の成分を経時的に
変性、若しくは沈殿させる性質があるため、性能に対す
る影響、特に他の成分の保存安定性に対する影響が大き
い。このことは、臨床検査用の上記反応のための試薬の
大半が液状試薬として提供されている現状では大きな問
題となる。還元物質の影響を回避するのに十分な量のイ
オン性界面活性剤を添加すると、それだけ酵素等の反応
を妨げることになる。この問題を解決する手段として、
酵素等の反応に関与する成分を過剰量配合することが考
えられるが、その場合製造コストがかかるという問題点
がある。
Further, when an ionic surfactant is made into a solution together with other components such as an enzyme, it has a property of denaturing or precipitating the other components over time, so that the influence on the performance, especially of other components, It has a great impact on storage stability. This poses a serious problem in the present situation where most of the reagents for the above-mentioned reactions for clinical tests are provided as liquid reagents. If the ionic surfactant is added in an amount sufficient to avoid the influence of the reducing substance, the reaction of the enzyme or the like will be hindered. As a means to solve this problem,
It is conceivable to add an excessive amount of a component such as an enzyme involved in the reaction, but in that case, there is a problem that the manufacturing cost is high.
【0008】ところで、臨床診断において、(メタ)アク
リロイルホスホリルコリンに基づく構成単位を有する重
合体を共存させて測定する方法は、例えば特許文献1〜3
に開示されている。特許文献1には、抗原-抗体反応、酵
素-基質反応、DNA-DNA反応等における反応促進剤が開示
されている。特許文献2には、ラテックスを用いる凝集
方法において、免疫学的な凝集促進剤としての(メタ)ア
クリロイルホスホリルコリンの用途が開示されている。
特許文献3には、(メタ)アクリロイルホスホリルコリン
等の重合体を用いて、ラテックスを用いる測定で希釈す
ることなくプロゾーン現象を回避してC-反応性蛋白質を
測定する方法が開示されている。
[0008] By the way, in clinical diagnosis, a method of coexisting and measuring a polymer having a structural unit based on (meth) acryloylphosphorylcholine is disclosed in Patent Documents 1 to 3, for example.
Is disclosed in. Patent Document 1 discloses a reaction accelerator in an antigen-antibody reaction, an enzyme-substrate reaction, a DNA-DNA reaction and the like. Patent Document 2 discloses the use of (meth) acryloylphosphorylcholine as an immunological aggregation promoter in an aggregation method using latex.
Patent Document 3 discloses a method of measuring a C-reactive protein by using a polymer such as (meth) acryloylphosphorylcholine and avoiding the prozone phenomenon without dilution in a measurement using a latex.
【0009】しかしながら、検体中の測定対象物質をオ
キシダーゼにより過酸化水素に導き、これをパーオキシ
ダーゼの存在下で発色色素を生成させる比色定量方法に
おいて、ビリルビン等の還元物質の影響を抑制して、測
定対象物質が低濃度であっても高精度の測定を可能とす
る方法は開示されていない。
However, in a colorimetric method in which a substance to be measured in a sample is introduced into hydrogen peroxide by an oxidase, and this is formed into a coloring dye in the presence of peroxidase, the influence of a reducing substance such as bilirubin is suppressed. However, there is no disclosure of a method that enables highly accurate measurement even if the substance to be measured has a low concentration.
【特許文献1】特開2002-22740号公報(第2頁)[Patent Document 1] Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-22740 (page 2)
【特許文献2】特開2002-365296号公報(第2頁)[Patent Document 2] Japanese Patent Laid-Open No. 2002-365296 (page 2)
【特許文献3】特開2001-318099号公報(第2頁)[Patent Document 3] Japanese Patent Laid-Open No. 2001-318099 (page 2)
【特許文献4】特開平3-10696号公報[Patent Document 4] Japanese Patent Laid-Open No. 3-10696
【特許文献5】特開平7-39394号公報[Patent Document 5] JP-A-7-39394
【発明の開示】DISCLOSURE OF THE INVENTION 【発明が解決しようとする課題】[Problems to be Solved by the Invention]
【0010】本発明の目的は、過酸化水素を介する測定
対象物質の定量において、検体中に含まれるビリルビン
等の還元物質の存在による影響の少ない比色定量方法、
測定試薬の安定化方法又はビリルビンの影響を抑制する
方法を提供することにある。
An object of the present invention is to provide a colorimetric quantification method which is less affected by the presence of a reducing substance such as bilirubin contained in a sample in quantifying a substance to be measured through hydrogen peroxide,
It is intended to provide a method for stabilizing a measurement reagent or a method for suppressing the influence of bilirubin.
【0011】本発明の別の目的は、過酸化水素を介する
測定対象物質の定量に用いる試薬であって、長期間保存
することができ、酵素の反応性、特異性、安定性等を損
なうことなく、且つ検体中に含まれるビリルビン等の還
元物質の存在による影響の少ない定量を行なうことがで
きる試薬を提供することにある。
Another object of the present invention is a reagent used for quantifying a substance to be measured through hydrogen peroxide, which can be stored for a long period of time and impairs reactivity, specificity, stability, etc. of an enzyme. It is an object of the present invention to provide a reagent which can be quantified without the presence of a reducing substance such as bilirubin contained in a sample.
【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]
【0012】本発明者らは、前記の問題点に鑑み鋭意検
討した結果、特定の重合体を反応系に存在させると、ビ
リルビン等の還元物質が混在していてもその影響を抑制
することができることを見出し、本発明を完成するに至
った。
The inventors of the present invention have made extensive studies in view of the above-mentioned problems, and as a result, when a specific polymer is present in the reaction system, even if a reducing substance such as bilirubin is mixed, its influence can be suppressed. They have found that they can do so and have completed the present invention.
【0013】すなわち、本発明によれば、検体中のクレ
アチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象物質とし、酵
素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存
在下で発色色素を生成させるクレアチニン、クレアチン
又は尿酸の比色定量方法において、反応系に下記式
(I):
That is, according to the present invention, creatinine, creatine or uric acid which is a creatinine, creatine or uric acid in a sample as a substance to be measured and leads hydrogen peroxide by an enzymatic reaction to form a coloring pigment in the presence of peroxidase. In the colorimetric method of
(I):
【0014】[0014]
【化7】 [Chemical 7]
【0015】(ここで、Rは水素原子またはメチル基を示
す。)及び式(II):
(Wherein R represents a hydrogen atom or a methyl group) and the formula (II):
【0016】[0016]
【化8】 (ここで、Rは水素原子又はメチル基を示す。Xは、炭素
数12〜20のアルキル基を示す。)で表される単量体に基
く単位からなる、重量平均分子量5,000〜5,000,000の重
合体(以下、重合体Aという。)を存在させることを特徴
とする、クレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量
方法が提供される。
[Chemical 8] (Wherein R represents a hydrogen atom or a methyl group, X represents an alkyl group having 12 to 20 carbon atoms), and a weight-average molecular weight of 5,000 to 5,000,000 There is provided a method for colorimetric determination of creatinine, creatine or uric acid, characterized in that a combined product (hereinafter referred to as polymer A) is present.
【0017】さらに、本発明によれば、前記比色定量の
ための比色定量試薬であって、溶媒と、酵素と、前記重
合体Aとを含む比色定量試薬が提供される。
Further, according to the present invention, there is provided a colorimetric assay reagent for the colorimetric assay, which comprises a solvent, an enzyme and the polymer A.
【0018】さらに、本発明によれば、ビリルビンを含
む検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対
象とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシ
ダーゼの存在下で発色色素を生成させる、クレアチニ
ン、クレアチン又は尿酸の比色定量において検体中のビ
リルビンの影響を抑制する方法であって、反応系に前記
重合体Aを存在させることを特徴とする抑制方法が提供
される。
Further, according to the present invention, creatinine, creatine or uric acid in a sample containing bilirubin is measured, and hydrogen peroxide is introduced by an enzymatic reaction to produce a coloring pigment in the presence of peroxidase, creatinine, There is provided a method for suppressing the influence of bilirubin in a sample in the colorimetric determination of creatine or uric acid, wherein the method comprises the presence of the polymer A in a reaction system.
【0019】さらに、本発明によれば、検体中のクレア
チニン、クレアチン又は尿酸を測定対象とし、酵素反応
により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で
発色色素を生成させるクレアチニン、クレアチン又は尿
酸の比色定量における測定試薬の保存安定化方法であっ
て、反応系に前記重合体Aを存在させることを特徴とす
る保存安定化方法が提供される。
Further, according to the present invention, creatinine, creatine or uric acid in a sample is measured, and creatinine, creatine or uric acid which leads to hydrogen peroxide by an enzymatic reaction and produces a coloring dye in the presence of peroxidase is produced. There is provided a method for storage stabilization of a measuring reagent in colorimetric quantification, which comprises allowing the polymer A to be present in a reaction system.
【発明の効果】【The invention's effect】
【0020】本発明の比色定量方法、本発明の安定化方
法及び本発明の抑制方法では、反応系に特定の重合体を
存在させることにより、酵素の反応性、特異性、安定性
等を損なうことなく、還元物質の影響を軽減することが
できる。例えば、本来は50%以上受ける負の影響を5%以
下に抑えうる。したがって、本発明の比色定量方法で
は、検体中の測定対象物質が低濃度である場合であって
も、真値に近い正確な定量を簡便に行なうことができ
る。
In the colorimetric quantification method of the present invention, the stabilization method of the present invention and the suppression method of the present invention, the reactivity, specificity, stability, etc. of the enzyme can be improved by allowing a specific polymer to be present in the reaction system. The effect of the reducing substance can be reduced without impairing it. For example, it is possible to reduce the negative impact of 50% or more to 5% or less. Therefore, according to the colorimetric quantification method of the present invention, accurate quantification close to the true value can be easily performed even when the measurement target substance in the sample has a low concentration.
【0021】本発明の比色定量試薬は、酵素等の成分に
加えて特定の重合体を含むので、長期間保存することが
でき、酵素の反応性、特異性、安定性等を損なうことな
く、検体中の測定対象物質が低濃度である場合であって
も、真値に近い正確な定量を簡便に行なうことを可能と
する。
Since the colorimetric assay reagent of the present invention contains a specific polymer in addition to components such as an enzyme, it can be stored for a long period of time without impairing the reactivity, specificity, stability, etc. of the enzyme. Even if the substance to be measured in the sample has a low concentration, it is possible to easily perform accurate quantification close to the true value.
【発明を実施するための最良の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
【0022】本発明の比色定量方法、本発明の安定化方
法又は本発明の抑制方法では、反応系に特定の重合体
(重合体A)を存在させることを特徴とする。重合体Aは、
前記式(I)で表される単量体(以下、単量体A1という。)
及び前記式(II)で表される単量体(以下、単量体A2とい
う。)に基く単位からなる。具体的には、下記式(III)で
表わされる単位及び(IV)で表される単位を含むことがで
きる。下記式(III)及び(IV)において、R及びXは、式(I)
及び(II)中のものと同じものを示す。
In the colorimetric quantification method of the present invention, the stabilization method of the present invention or the suppression method of the present invention, a polymer specific to the reaction system is used.
(Polymer A) is present. Polymer A is
The monomer represented by the formula (I) (hereinafter referred to as the monomer A1)
And a unit based on the monomer represented by the formula (II) (hereinafter referred to as the monomer A2). Specifically, it may include a unit represented by the following formula (III) and a unit represented by (IV). In the following formulas (III) and (IV), R and X are represented by the formula (I)
And the same as in (II).
【0023】[0023]
【化9】 [Chemical 9]
【0024】[0024]
【化10】 [Chemical 10]
【0025】式(II)又は(IV)において、Xで表されるア
ルキル基を炭素数12以上のものとすることにより、反応
系中に存在する還元物質の影響を良好に軽減することが
できる。単量体A2としては、具体的には例えば、ラウリ
ル(メタ)アクリレート及びステアリル(メタ)アクリレー
ト等の直鎖又は分岐アルキル(メタ)アクリレート等が挙
げられる。重合体Aにおいて、式(III)の単位及び式(IV)
の単位は、ランダム重合、交互重合、ブロック共重合等
のいずれの形態をとって共重合していてもよい。
In the formula (II) or (IV), the influence of the reducing substance present in the reaction system can be satisfactorily reduced by making the alkyl group represented by X have a carbon number of 12 or more. . Specific examples of the monomer A2 include linear or branched alkyl (meth) acrylates such as lauryl (meth) acrylate and stearyl (meth) acrylate. In the polymer A, the unit of the formula (III) and the formula (IV)
The units may be copolymerized in any form such as random polymerization, alternating polymerization and block copolymerization.
【0026】重合体Aは、単量体A1及びA2を通常のラジ
カル共重合等により共重合し、さらに必要に応じて溶媒
等に溶解し精製することにより製造することができる。
具体的には、特許文献1〜3記載の方法に準じて製造する
ことができる。
The polymer A can be produced by copolymerizing the monomers A1 and A2 by an ordinary radical copolymerization, etc., and further dissolving them in a solvent or the like as necessary for purification.
Specifically, it can be produced according to the methods described in Patent Documents 1 to 3.
【0027】単量体A1及び単量体A2を共重合させる際の
これらの比は、特に限定されないが、通常、モル比で単
量体A1/単量体A2=99/1〜10/90、好ましくは90/10〜20/8
0、さらに好ましくは80/20〜30/70とすることができ
る。単量体A1及び単量体A2の合計に対する単量体Aの割
合を10モル%以上とすることにより、ホスホリルコリン
基による効果を十分に発揮することができる。
The ratio of these in copolymerizing the monomer A1 and the monomer A2 is not particularly limited, but is usually monomer A1 / monomer A2 = 99/1 to 10/90 in molar ratio. , Preferably 90/10 to 20/8
It can be 0, more preferably 80/20 to 30/70. When the ratio of the monomer A to the total of the monomer A1 and the monomer A2 is 10 mol% or more, the effect of the phosphorylcholine group can be sufficiently exhibited.
【0028】重合体Aの分子量は、重量平均分子量とし
て5,000〜5,000,000の範囲であり、10,000〜1,000,000
の範囲であることが好ましい。重合体Aの分子量を5,000
以上とすることにより十分に生化学的反応を促進するこ
とでき、5,000,000以下とすることにより重合体Aの粘性
による生化学的反応の阻害を避けることができる。
The molecular weight of the polymer A is in the range of 5,000 to 5,000,000 as a weight average molecular weight, and 10,000 to 1,000,000.
It is preferably in the range of. Polymer A has a molecular weight of 5,000
By setting the above, the biochemical reaction can be sufficiently promoted, and by setting it to be 5,000,000 or less, the inhibition of the biochemical reaction due to the viscosity of the polymer A can be avoided.
【0029】本発明の比色定量方法、本発明の安定化方
法又は本発明の抑制方法では、前記の重合体Aの存在
下、検体中の測定対象物質を酵素反応により過酸化水素
に導き、これからパーオキシダーゼの存在下で発色色素
を生成させる。
In the colorimetric quantification method of the present invention, the stabilization method of the present invention or the suppression method of the present invention, in the presence of the polymer A, the substance to be measured in the sample is introduced into hydrogen peroxide by an enzymatic reaction, From this, a coloring pigment is produced in the presence of peroxidase.
【0030】前記測定対象物質は、クレアチニン、クレ
アチン又は尿酸である。
The substance to be measured is creatinine, creatine or uric acid.
【0031】前記酵素反応としては、前記測定対象物質
から過酸化水素を導く反応を適宜選択することができ
る。前記酵素反応は、1段階の反応でもよく、複数段階
の反応でもよい。前記酵素反応は、その少なくとも1段
階において、前記測定対象物質又は前記測定対象物質と
他の物質との反応物から過酸化水素を発生させる反応を
含む。当該過酸化水素を発生させる反応としては、具体
的には例えば、ウリカーゼ、ザルコシンオキシダーゼ等
のオキシダーゼによる反応を挙げることができる。
As the enzyme reaction, a reaction for introducing hydrogen peroxide from the substance to be measured can be appropriately selected. The enzymatic reaction may be a one-step reaction or a multi-step reaction. The enzyme reaction includes, in at least one stage thereof, a reaction of generating hydrogen peroxide from the measurement target substance or a reaction product of the measurement target substance and another substance. Specific examples of the reaction for generating hydrogen peroxide include reactions with oxidases such as uricase and sarcosine oxidase.
【0032】前記パーオキシダーゼは、過酸化水素を水
に還元し発色色素を生成させうるものであれば特に限定
されないが、具体的には例えば、西洋ワサビ由来、又は
大豆由来のパーオキシダーゼを用いることができる。
The peroxidase is not particularly limited as long as it can reduce hydrogen peroxide to water to form a coloring pigment. Specifically, for example, horseradish-derived or soybean-derived peroxidase is used. You can
【0033】前記発色色素は、パーオキシダーゼにより
過酸化水素量に応じて発生することができるものであれ
ば特に限定されず、各種のキノン系色素等を発生させる
ことができる。前記発色色素は、パーオキシダーゼと組
み合わせて過酸化水素量に応じて前記発色色素を発生さ
せる発色色素生成物質を反応系に存在させることにより
発生させることができる。前記発色色素生成物質として
は、ロイコ体又は各種のトリンダー試薬等を用いること
ができる。前記トリンダー試薬は、4-アミノアンチピリ
ン等の発色色素生成を補助する物質と組み合わせて用い
ることができる。前記発色色素生成物質のうちの前記ロ
イコ体としては、具体的には例えば、N-(カルボキシメ
チルアミノカルボニル)-4,4'-ビス(ジメチルアミノ)-ジ
フェニルアミン、及び10-(カルボキシメチルアミノカル
ボニル)-3,7'-ビス(ジメチルアミノ)-フェノシアジン等
が挙げられる。また前記発色色素生成物質のうちの前記
トリンダー試薬としては、具体的には例えば、N-エチル
-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリ
ン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-
メトキシアニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スル
ホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-(2-ヒドロキ
シ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、3-ヒ
ドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸等が挙げられる。
The coloring dye is not particularly limited as long as it can be generated by peroxidase depending on the amount of hydrogen peroxide, and various quinone dyes can be generated. The color-developing dye can be generated by allowing a color-developing dye-forming substance, which is combined with peroxidase to generate the color-developing dye depending on the amount of hydrogen peroxide, to be present in the reaction system. As the color-forming dye-forming substance, a leuco body or various Trinder's reagents can be used. The Trinder reagent can be used in combination with a substance such as 4-aminoantipyrine which assists in the formation of a coloring dye. The leuco form of the color-forming dye-forming substance, specifically, for example, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) -diphenylamine, and 10- (carboxymethylaminocarbonyl) ) -3,7'-bis (dimethylamino) -phenocyanazine and the like. Further, as the Trinder reagent of the color forming dye-forming substance, specifically, for example, N-ethyl
-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-
Methoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, 3-hydroxy -2,4,6-triiodobenzoic acid and the like can be mentioned.
【0034】本発明の比色定量の測定対象物質及びその
測定に用いる酵素の組み合わせの具体例を下記表1に示
す。
Specific examples of the combination of the substance to be measured for colorimetric determination of the present invention and the enzyme used for the measurement are shown in Table 1 below.
【0035】[0035]
【表1】 [Table 1]
【0036】本発明の比色定量方法は、測定対象物質、
各種酵素、発色色素生成物質及び重合体A等を水等の溶
媒中において混合し、反応させることにより行なうこと
ができる。具体的には例えば、測定対象物質を含む検体
と、各種酵素、発色色素生成物質及び重合体A等を含む
溶液とを混合することにより行なうことができる。各種
酵素、発色色素生成物質及び重合体Aを含む溶液は、こ
れらを別々に含む2以上の溶液として別々に調製し、反
応を開始するにあたりそれらを混合することにより反応
を行なうことができる。また、かかる溶液は、必要に応
じて、前記発色色素の生成を補助する物質、緩衝剤等の
他の物質を適宜含むことができる。
The colorimetric quantification method of the present invention comprises a substance to be measured,
It can be carried out by mixing various enzymes, a color-developing dye forming substance, polymer A and the like in a solvent such as water and reacting them. Specifically, for example, it can be performed by mixing a sample containing the substance to be measured with a solution containing various enzymes, a color-pigment forming substance, polymer A and the like. A solution containing various enzymes, a color-developing dye-forming substance and polymer A can be prepared separately as two or more solutions containing them separately, and the reaction can be carried out by mixing them when starting the reaction. In addition, such a solution can appropriately contain other substances such as a substance that assists the formation of the color forming dye and a buffering agent, if necessary.
【0037】本発明の比色定量方法における反応系中の
各成分の濃度は、測定対象物質、各種酵素、発色色素生
成物質及び重合体Aを含む混合液中の終濃度として、以
下の濃度とすることができる。測定対象物質の濃度は、
例えばクレアチニンの場合、0.0008〜1.6mg/dL、尿酸の
場合0.002〜2.0mg/dLとすることができるが、特に、ク
レアチニンの場合0.016mg/dL(約1.4μmol/L)以下、尿酸
の場合0.06mg/dL(3.6μmol/L)以下程度の低濃度である
場合でも、還元物質の影響を受けずに正確な測定ができ
る。オキシダーゼの濃度は1〜100u/mL、好ましくは5〜2
0u/mLとすることができる。パーオキシダーゼの濃度は1
〜100u/mL、好ましくは5〜20u/mLとすることができる。
オキシダーゼの添加割合に対するパーオキシダーゼの添
加割合は、オキシダーゼ1uに対してパーオキシダーゼ0.
3〜100uとすることができる。発色色素生成物質の濃度
は0.5〜10mmol/L、好ましくは1〜5mmol/Lとすることが
できる。さらに、発色色素生成物質と共に4-アミノアン
チピリン等の発色色素の生成を補助する物質を用いる場
合、その濃度は、0.5〜10mmol/L、好ましくは1〜5mmol/
Lとすることができる。
The concentration of each component in the reaction system in the colorimetric determination method of the present invention is the following concentration as the final concentration in the mixed solution containing the substance to be measured, various enzymes, the color-pigment forming substance and the polymer A. can do. The concentration of the substance to be measured is
For example, in the case of creatinine, it can be 0.0008 to 1.6 mg / dL, and in the case of uric acid it can be 0.002 to 2.0 mg / dL, but especially 0.016 mg / dL (about 1.4 μmol / L) or less in the case of creatinine, 0.06 in the case of uric acid. Even when the concentration is as low as mg / dL (3.6 μmol / L) or less, accurate measurement can be performed without being affected by the reducing substance. The concentration of oxidase is 1 to 100 u / mL, preferably 5 to 2
It can be 0 u / mL. Peroxidase concentration is 1
It can be -100 u / mL, preferably 5-20 u / mL.
The addition ratio of peroxidase to the addition ratio of oxidase is 0.
It can be 3-100u. The concentration of the color-forming dye forming substance can be 0.5 to 10 mmol / L, preferably 1 to 5 mmol / L. Furthermore, when a substance that assists the production of a color-forming dye such as 4-aminoantipyrine is used together with the color-forming dye forming substance, the concentration thereof is 0.5 to 10 mmol / L, preferably 1 to 5 mmol / L.
It can be L.
【0038】反応系中の重合体Aの濃度は、反応系に含
まれる測定対象物質、還元物質及び他の試薬の量に応じ
て適宜選択することができるが、具体的には例えば終濃
度として概ね0.05〜0.75w/v%であることが好ましい。
The concentration of the polymer A in the reaction system can be appropriately selected according to the amounts of the substance to be measured, the reducing substance and the other reagents contained in the reaction system. It is preferably about 0.05 to 0.75 w / v%.
【0039】反応系に重合体Aを存在させることによ
り、還元物質による影響を抑制することができる。重合
体Aは、生体膜の成分であるリン脂質と類似の構造を持
ち、タンパク質を変性、失活、沈殿させる等の悪影響が
少なく、したがって酵素に対する影響が少なく酵素の反
応性、特異性、安定性を損なうことが無い。そのため、
酵素を含む反応系に高濃度添加することも可能であり、
ビリルビンの影響回避に十分な濃度を添加することが可
能である。また予め調製した比色定量用の試薬に重合体
Aを配合してから長期間経過しても試薬の劣化が少ない
ので、予め調製した試薬による簡便な定量の操作を行な
うことができる。
The presence of the polymer A in the reaction system can suppress the influence of the reducing substance. Polymer A has a structure similar to that of phospholipid, which is a component of biological membrane, and has less adverse effects such as denaturation, inactivation, and precipitation of proteins, and therefore has less effect on enzymes, reactivity, specificity, and stability of enzymes. There is no loss of sex. for that reason,
It is also possible to add a high concentration to the reaction system containing the enzyme,
It is possible to add a concentration sufficient to avoid the effects of bilirubin. In addition, the polymer was added to the previously prepared colorimetric reagent.
Since the reagent does not deteriorate much even after a long period of time since A was added, a simple quantitative operation can be performed using the reagent prepared in advance.
【0040】本発明の比色定量方法の好ましい例とし
て、還元物質としてビリルビンを含む検体中のクレアチ
ニン、クレアチン又は尿酸を測定する方法が挙げられ
る。本発明によるクレアチニン、クレアチン及び尿酸の
比色定量は、それぞれ下記反応式(i)〜(iii)に示される
反応に基いて行なうことができる:
A preferred example of the colorimetric quantification method of the present invention is a method for measuring creatinine, creatine or uric acid in a sample containing bilirubin as a reducing substance. The colorimetric determination of creatinine, creatine and uric acid according to the present invention can be carried out based on the reactions shown in the following reaction formulas (i) to (iii):
【0041】[0041]
【化11】 [Chemical 11]
【0042】[0042]
【化12】 [Chemical 12]
【0043】[0043]
【化13】 [Chemical 13]
【0044】略号は次のものを示す。 CRN:クレアチニナーゼ CR:クレアチナーゼ SOD:ザルコシンオキシダーゼ POD:パーオキシダーゼ TODB:N,N-ビス(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン 4AAP:4-アミノアンチピリンThe abbreviations indicate the following. CRN: Creatininase CR: Creatinase SOD: Sarcosine oxidase POD: Peroxidase TODB: N, N-bis (4-sulfobutyl) -3-methylaniline 4AAP: 4-aminoantipyrine
【0045】上記反応による比色定量は、各成分を適宜
混合することにより発色させ、吸光度の変化を測定する
ことにより行なうことができる。各成分の混合の手順は
特に限定されないが、具体的には例えばクレアチニンの
定量の場合、以下の手順により行なうことができる:
The colorimetric determination by the above reaction can be carried out by appropriately mixing the respecti