JP3365474B2 - Polarizing imaging device - Google Patents
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Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、照射光が照射され
た試料から発生する被測定光（蛍光、ラマン散乱光）の
偏光性の２次元画像を検出する偏光性イメージング技術
に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a polarization imaging technique for detecting a polarization two-dimensional image of light to be measured (fluorescence, Raman scattered light) generated from a sample irradiated with irradiation light.
【０００２】[0002]
【従来の技術】試料に照射光が照射されると、その試料
から蛍光やラマン散乱光等の被測定光が発生し、その被
測定光の偏光性を測定することにより、試料に関する様
々な情報を得ることができる。被測定光が蛍光である場
合、その偏光性を測定することにより、蛍光分子あるい
は蛍光分子が標識された分子の配向や回転ブラウン運動
に関する情報が得られる。例えば、蛍光分子が蛍光プロ
ーブである場合、蛍光プローブがフリーな場合とターゲ
ットに結合した場合とで回転ブラウン運動が異なること
から、その蛍光の偏光性を測定することにより、フリー
な蛍光プローブとターゲットに結合した蛍光プローブと
の識別が可能になる。一方、被測定光がラマン散乱光で
ある場合、その偏光性を測定することにより、試料中の
分子の対称性や配向に関する情報を得ることができる。2. Description of the Related Art When a sample is irradiated with irradiation light, light under measurement such as fluorescence or Raman scattered light is generated from the sample, and various information about the sample is measured by measuring the polarization of the light under measurement. Can be obtained. When the light to be measured is fluorescence, its polarization is measured to obtain information about the orientation and rotational Brownian motion of the fluorescent molecule or the molecule labeled with the fluorescent molecule. For example, when the fluorescent molecule is a fluorescent probe, the rotational Brownian motion is different between when the fluorescent probe is free and when it is bound to the target. It is possible to distinguish from the fluorescent probe bound to. On the other hand, when the light to be measured is Raman scattered light, information on the symmetry and orientation of the molecules in the sample can be obtained by measuring the polarization property thereof.
【０００３】従来、蛍光およびラマン散乱光の偏光測定
は、分光光度計タイプ（図７）による測定か、或いは、
落射照明方式（図８）による顕微鏡下での測定であっ
た。分光光度計タイプ（図７）のものは、直線偏光の照
射光（励起光）を試料に照射し、その照射方向とは９０
度異なる受光方向から被測定光（蛍光、ラマン散乱光）
を検出するものである。また、落射照明方式（図８）に
よるものでは、照射光（励起光）は、偏光子１１０およ
び１／２波長板１１１により所定の方位の直線偏光とさ
れた後、ダイクロイックミラー１１２および対物レンズ
１１３を経て、ステージ１２１上の試料１２０に照射さ
れ、試料１２０で発生した被測定光（蛍光、ラマン散乱
光）は、対物レンズ１１３、ダイクロイックミラー１１
２、照射光カットフィルタ１３０およびバンドパスフィ
ルタ１３１を経た後、偏光ビームスプリッタ１３２によ
りｓ偏光成分およびｐ偏光成分とに分岐され、その被測
定光のｓ偏光成分およびｐ偏光成分それぞれの画像が検
出される。Conventionally, polarization measurement of fluorescence and Raman scattered light is performed by a spectrophotometer type (FIG. 7), or
It was a measurement under a microscope by the epi-illumination method (FIG. 8). The spectrophotometer type (Fig. 7) irradiates the sample with linearly polarized irradiation light (excitation light), and the irradiation direction is 90
Light to be measured (fluorescence, Raman scattered light) from different light receiving directions
Is to detect. In the case of the epi-illumination method (FIG. 8), the irradiation light (excitation light) is linearly polarized in a predetermined direction by the polarizer 110 and the half-wave plate 111, and then the dichroic mirror 112 and the objective lens 113. After that, the light to be measured (fluorescence, Raman scattered light) emitted from the sample 120 on the stage 121 is irradiated onto the objective lens 113 and the dichroic mirror 11.
2. After passing through the irradiation light cut filter 130 and the bandpass filter 131, the polarized beam splitter 132 splits the light into an s-polarized component and a p-polarized component, and images of the s-polarized component and the p-polarized component of the measured light are detected. To be done.
【０００４】落射照明方式で蛍光の偏光性を顕微鏡下で
測定した例として、D.Axelrod, "Carbocyanine Dye Ori
entation in Red Cell Membrane studied by Microscop
ic Fluorescence Polarization", Biophys.J., Vol.26,
pp.557-574 (1979) およびK.Suzuki, et al, "Spatiot
emporal Relationships Among Early Events of Fertil
ization in Sea Urchin Eggs Revealed by Multiview M
icroscopy", Biophys.J., Vol.68, pp.739-748 (1995)
の報告がある。As an example of measuring the polarization of fluorescence under a microscope by the epi-illumination method, D. Axelrod, "Carbocyanine Dye Ori
entation in Red Cell Membrane studied by Microscop
ic Fluorescence Polarization ", Biophys.J., Vol.26,
pp.557-574 (1979) and K. Suzuki, et al, "Spatiot
emporal Relationships Among Early Events of Fertil
ization in Sea Urchin Eggs Revealed by Multiview M
icroscopy ", Biophys.J., Vol.68, pp.739-748 (1995)
There is a report.
【０００５】D.Axelrod の論文に記載されている技術
は、顕微鏡下で直線偏光の定常光を落射照明方式により
試料に照射し、発生した蛍光の偏光性を測定することに
より、生体膜に導入された蛍光プローブの配向および運
動性を調べるものである。ここで用いられている光検出
器は光電子増倍管であり、蛍光像画面上の絞りを走査す
ることにより２次元的な蛍光偏光画像を得ている。ま
た、K.Suzukiの論文に記載されている技術は、非偏光の
定常光を落射照明方式により試料に照射し、発生した蛍
光を偏光ビームスプリッタにより互いに直交する直線偏
光成分に分岐し、その２分岐された蛍光画像を単一のカ
メラにより同時に撮像することにより、卵の受精過程に
おける膜の配向性を解析するものである。The technique described in the article by D. Axelrod is introduced into a biological membrane by irradiating a sample with linearly polarized stationary light under a microscope by an epi-illumination method and measuring the polarization of the generated fluorescence. The orientation and mobility of the fluorescent probe thus prepared are investigated. The photodetector used here is a photomultiplier tube, and a two-dimensional fluorescence polarization image is obtained by scanning the diaphragm on the fluorescence image screen. The technique described in K. Suzuki's paper irradiates a sample with non-polarized stationary light by the epi-illumination method and splits the generated fluorescence into linearly polarized light components orthogonal to each other by a polarization beam splitter. By capturing the branched fluorescence images with a single camera at the same time, the orientation of the membrane during the fertilization process of the egg is analyzed.
【０００６】蛍光およびラマン散乱光の偏光性の測定に
おいて重要になるのは、受光光学系および光検出器の偏
光応答補正である。受光光学系および光検出器は、異な
る偏光方位の光に対しても等しく応答するのが理想であ
るが、実際の光学素子や光電変換面は、異なる偏光方位
の光に対して異なる応答をする。したがって、真の蛍光
やラマン散乱光の偏光性を測定するためには、その補正
が必要となる。In measuring the polarization of fluorescence and Raman scattered light, it is important to correct the polarization response of the receiving optical system and the photodetector. Ideally, the receiving optical system and the photodetector should respond equally to light of different polarization directions, but the actual optical element and photoelectric conversion surface respond differently to light of different polarization directions. . Therefore, in order to measure the polarization of true fluorescence or Raman scattered light, its correction is necessary.
【０００７】従来の分光光度計タイプの偏光測定におい
ては、図７に示すように、水平偏光励起光に対して９０
度方向で受光される蛍光の水平成分強度と垂直成分強度
とは等しくなるべきことから偏光応答補正を行ってい
る。また、顕微鏡下での偏光測定において、D.Axelrod
の論文に記載されている技術では、全くの非偏光の光を
受光光学系（試料から光検出器までの光学系）および光
検出器に通すことにより偏光応答補正を行っている。さ
らに、K.Suzukiの論文に記載されている技術では、均一
で等方的な試料を非偏光の励起光で照射し、その試料か
ら発生する蛍光が全く無偏光であることを利用して偏光
応答補正を行っている。In a conventional spectrophotometer-type polarization measurement, as shown in FIG.
The polarization response is corrected because the horizontal component intensity and the vertical component intensity of the fluorescence received in the degree direction should be equal. Also, in polarization measurement under a microscope, D. Axelrod
In the technique described in the above article, polarization response correction is performed by passing completely unpolarized light through a light receiving optical system (optical system from the sample to the photodetector) and a photodetector. Furthermore, in the technique described in K. Suzuki's paper, a uniform and isotropic sample is irradiated with unpolarized excitation light, and the fact that the fluorescence emitted from that sample is completely unpolarized Response is being corrected.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
分光光度計タイプの偏光性の測定では、空間的な分解能
がない。また、上記の落射照明方式による顕微鏡下での
偏光性の測定では、空間分解能はあるものの、落射照明
方式であるため受光光軸方向についての分解能が十分で
はない。すなわち、フォーカス面上の注目している分子
から発生する蛍光またはラマン散乱光だけでなく、デフ
ォーカス領域にある注目していない分子から発生する蛍
光またはラマン散乱光も受光され検出されるため、この
デフォーカス領域にある分子から発生する蛍光またはラ
マン散乱光はノイズとなる。さらに、落射照明方式の場
合、図８に示すようにダイクロイックミラー１１２およ
び対物レンズ１１３を照明光が通過するため、それらに
より散乱光および自家蛍光が発生し、これらがバックグ
ラウンドノイズとなる。However, the above-mentioned spectrophotometer-type polarizability measurement has no spatial resolution. Further, in the measurement of the polarization property under the microscope by the above-mentioned epi-illumination method, although there is a spatial resolution, since it is the epi-illumination method, the resolution in the light receiving optical axis direction is not sufficient. That is, not only the fluorescence or Raman scattered light generated from the molecule of interest on the focus surface but also the fluorescence or Raman scattered light generated from the molecule of no interest in the defocus area is received and detected. Fluorescence or Raman scattered light generated from molecules in the defocus area becomes noise. Further, in the case of the epi-illumination method, the illumination light passes through the dichroic mirror 112 and the objective lens 113 as shown in FIG. 8, so that scattered light and autofluorescence are generated by them, and these become background noise.
【０００９】さらに、D.Axelrod の論文や K.Suzuki の
論文に記載されている技術では、装置の偏光応答補正に
おいて非偏光の光を用いているが、この非偏光の光は本
来観察すべき被測定光とは異なっており補正精度が低
い。また、理想的な非偏光の光を作成するのは困難であ
る。Further, in the technique described in D. Axelrod's paper and K. Suzuki's paper, non-polarized light is used for correcting the polarization response of the device, but this non-polarized light should be observed originally. It is different from the measured light and the correction accuracy is low. Also, it is difficult to create ideal unpolarized light.
【００１０】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、試料のうち所定の領域のみについて、
照射光の照射に伴って発生した被測定光（蛍光、ラマン
散乱光）の偏光性を２次元的に測定して、試料中の分子
の状態を高精度に検出することができる偏光性イメージ
ング装置を提供することを目的とする。The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and only in a predetermined region of a sample,
A polarimetric imaging device capable of highly accurately detecting the state of molecules in a sample by two-dimensionally measuring the polarizability of light under measurement (fluorescence, Raman scattered light) generated by the irradiation of irradiation light. The purpose is to provide.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明に係る偏光性イメ
ージング装置は、直線偏光の照射光を出力する光源部
と、直線偏光の照射光を試料に照射する照射光学系と、
試料から生じる被測定光を第１偏光方位及びこれに直交
する第２偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐して、
撮像手段の結像面に結像する受光光学系とを備え、撮像
手段によって第１および第２の偏光方位の直線偏光成分
をそれぞれ検出し、試料の状態を検出する偏光性イメー
ジング装置において、透明部材を試料に接して配置し、
透明部材と試料との境界面を受光光学系の光軸に垂直に
配置し、照射光学系は、その境界面へ透明部材の側から
照射光を入射させる第１の入射面と、第１の入射面に直
交する第２の入射面とを有し、第１および第２の入射面
のうちの選択された一方の面に沿ってｓ偏光入射させて
境界面で全反射させ、試料をエバネセント照射する構成
とし、試料から生じる被測定光である蛍光の偏光を検出
することを特徴とする。A polarizable imaging apparatus according to the present invention comprises a light source section for outputting linearly polarized irradiation light, an irradiation optical system for irradiating a sample with linearly polarized irradiation light,
The measured light generated from the sample is split into linear polarization components of the first polarization direction and the second polarization direction orthogonal to the first polarization direction,
And a light receiving optical system for forming an image on an image forming plane of the image pickup means, wherein the image pickup means detects linearly polarized light components of the first and second polarization directions to detect the state of the sample. Place the member in contact with the sample,
Make the interface between the transparent member and the sample perpendicular to the optical axis of the light receiving optical system.
The irradiation optical system has a first incident surface on which the irradiation light is incident on the boundary surface from the transparent member side, and a second incident surface orthogonal to the first incident surface. The s-polarized light is made incident along one selected surface of the second incident surfaces and is totally reflected at the boundary surface to illuminate the sample evanescently, and the polarization of fluorescence which is the measured light generated from the sample is detected. It is characterized by doing.
【００１２】この偏光性イメージング装置によれば、光
源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光およびパ
ルス光の何れでもよい）は、照射光学系により、試料に
接して配される透明部材の側から透明部材と試料との境
界面へ、第１の入射面および第２の入射面の何れかに沿
ってｓ偏光入射され、その境界面で全反射され、これに
伴い、試料はエバネセント照射される。エバネセント照
射された試料から発生した被測定光（蛍光）は、受光光
学系により、第１の入射面と平行な第１の偏光方位およ
びこれに直交する第２の偏光方位それぞれの直線偏光成
分に分岐されて、各々が撮像手段より撮像される。この
撮像に基づいて、試料から発生する蛍光の偏光が検出さ
れる。According to this polarization imaging apparatus, the linearly polarized irradiation light (which may be either CW light or pulsed light) emitted from the light source section is arranged in contact with the sample by the irradiation optical system. From the side of the transparent member to the interface between the transparent member and the sample along either the first incident surface or the second incident surface, s-polarized light is totally reflected at the interface, and the sample is evanescent. Is irradiated. The light to be measured (fluorescence) generated from the evanescently irradiated sample is converted by the light receiving optical system into linear polarization components of the first polarization direction parallel to the first incident plane and the second polarization direction orthogonal to the first polarization direction. It is branched and each imaged by the imaging means. The polarization of the fluorescence emitted from the sample is detected based on this imaging.
【００１３】また、本発明に係る偏光性イメージング装
置は、(1) 直線偏光の照射光を出力する光源部と、(2)
試料に接して配される透明部材と、(3) 照射光を透明部
材の側から透明部材と試料との境界面へ第１の入射面に
沿ってｓ偏光入射させて境界面で全反射させ、試料をエ
バネセント照射する照射光学系と、(4) 境界面に垂直な
入射光軸を有し、エバネセント照射された試料から発生
した蛍光を入力し、第１の入射面と平行な第１の偏光方
位およびこれに直交する第２の偏光方位それぞれの直線
偏光成分に分岐して、互いに異なる第１および第２の結
像面それぞれに結像する受光光学系と、(5) 第１の結像
面に結像された蛍光の第１の偏光方位の直線偏光成分を
撮像する第１の撮像手段と、(6) 第２の結像面に結像さ
れた蛍光の第２の偏光方位の直線偏光成分を撮像する第
２の撮像手段と、(7) 第１および第２の撮像手段それぞ
れにより撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の偏光蛍光画像に基づいて、試料
上の位置変数及び時間変数の関数で表される蛍光の偏光
性の２次元画像を求める画像演算手段とを備えることを
特徴とする。さらに、照射光学系は、第１の入射面に直
交する第２の入射面を更に有し、第１および第２の入射
面のうちの選択された一方の面に沿って照射光をｓ偏光
入射させることを特徴とする。Further, the polarization imaging apparatus according to the present invention comprises (1) a light source section for outputting linearly polarized irradiation light, and (2)
A transparent member placed in contact with the sample, and (3) irradiating the s-polarized light from the transparent member side to the boundary surface between the transparent member and the sample along the first incident surface for s-polarized light to be totally reflected at the boundary surface. , An irradiation optical system that irradiates the sample with evanescent light, and (4) an incident optical axis that is perpendicular to the boundary surface, inputs the fluorescence generated from the evanescently irradiated sample, and is parallel to the first incident surface. A light-receiving optical system that splits linearly polarized light components of a polarization azimuth and a second polarization azimuth orthogonal to the polarization azimuth and forms images on different first and second imaging planes, respectively, and (5) the first connection. First imaging means for imaging the linearly polarized light component of the first polarization direction of the fluorescence imaged on the image plane, and (6) the second polarization direction of the fluorescence imaged on the second image plane. Second imaging means for imaging the linearly polarized light component, and (7) Fluorescence imaged by the first and second imaging means, respectively. And an image calculation means for obtaining a two-dimensional image of the fluorescence polarization represented by the function of the position variable and the time variable on the sample, based on the polarized fluorescence images of the linear polarization components of the first and second polarization directions. It is characterized by being provided. Further, the irradiation optical system further has a second incident surface orthogonal to the first incident surface, and the irradiation light is s-polarized along the selected one of the first and second incident surfaces. It is characterized by being incident.
【００１４】この偏光性イメージング装置によれば、光
源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光およびパ
ルス光の何れでもよい）は、照射光学系により、試料に
接して配される透明部材の側から透明部材と試料との境
界面へ、第１の入射面および第２の入射面の何れかに沿
ってｓ偏光入射され、その境界面で全反射され、これに
伴い、試料はエバネセント照射される。エバネセント照
射された試料から発生した被測定光（蛍光）は、その境
界面に垂直な入射光軸を有する受光光学系に入力し、第
１の入射面と平行な第１の偏光方位およびこれに直交す
る第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐され
て、互いに異なる第１および第２の結像面それぞれに結
像される。その結像された蛍光の第１および第２の偏光
方位それぞれの直線偏光成分は、第１および第２の撮像
手段それぞれにより撮像される。この撮像に基づいて、
試料上の位置変数及び時間変数の関数で表される蛍光の
偏光性の２次元画像が画像演算手段により求められる。According to this polarization imaging device, the linearly polarized irradiation light (either CW light or pulsed light) emitted from the light source section is arranged in contact with the sample by the irradiation optical system. From the side of the transparent member to the interface between the transparent member and the sample along either the first incident surface or the second incident surface, s-polarized light is totally reflected at the interface, and the sample is evanescent. Is irradiated. The light to be measured (fluorescence) generated from the evanescently irradiated sample is input to the light receiving optical system having an incident optical axis perpendicular to the boundary surface thereof, and the first polarization direction parallel to the first incident surface and the It is branched into linearly polarized light components of the respective second polarization directions that are orthogonal to each other, and images are formed on the first and second image planes that are different from each other. The linearly polarized light components of the first and second polarization directions of the imaged fluorescence are imaged by the first and second imaging means, respectively. Based on this imaging,
A two-dimensional image of fluorescence polarization, which is represented by a function of a position variable and a time variable on the sample, is obtained by the image calculation means.
【００１５】また、本発明に係る偏光性イメージング装
置は、(1) 光源部は、照射光としてパルス光を出射する
とともに、(2) パルス光の出射タイミングに同期して撮
像手段の撮像タイミングを制御する制御手段を更に備え
る、のが好適である。この場合には、撮像手段の撮像タ
イミングは、制御手段により、光源部から照射光として
出射されるパルス光の出射タイミングに同期して制御さ
れる。Further, in the polarization imaging apparatus according to the present invention, (1) the light source section emits pulsed light as irradiation light, and (2) the imaging timing of the imaging means is synchronized with the emission timing of the pulsed light. It is preferable to further include a control means for controlling. In this case, the image pickup timing of the image pickup means is controlled by the control means in synchronization with the emission timing of the pulsed light emitted as the irradiation light from the light source section.
【００１６】また、本発明に係る偏光性イメージング装
置は、照射光が第１の入射面に沿って入射したときに発
生する蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線
偏光成分、ならびに、照射光が第２の入射面に沿って入
射したときに発生する蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏光応答補正因子
を算出する偏光応答補正因子獲得手段を備え、蛍光の偏
光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏光応
答補正して求める、のが好適である。この場合には、等
方的な試料について、偏光応答補正因子獲得手段によ
り、照射光が第１の入射面に沿って入射したときに発生
する蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏
光成分、ならびに、照射光が第２の入射面に沿って入射
したときに発生する蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分に基づいて、偏光応答補正因子が
算出され、蛍光の偏光性の２次元画像は、偏光応答補正
因子に基づいて偏光応答補正されて求められる。Further, in the polarization imaging apparatus according to the present invention, linearly polarized light components of the first and second polarization directions of fluorescence generated when the irradiation light is incident along the first incident surface, and Polarization response correction factor acquisition means for calculating a polarization response correction factor based on the linearly polarized light components of the first and second polarization directions of the fluorescence generated when the irradiation light is incident along the second incident surface is provided. It is preferable that the two-dimensional image of the polarization of fluorescence is obtained by polarization response correction based on the polarization response correction factor. In this case, with respect to an isotropic sample, the polarization response correction factor acquisition means obtains the straight lines of the first and second polarization directions of the fluorescence generated when the irradiation light is incident along the first incident surface. The polarization response correction factor is calculated based on the polarization component and the linear polarization components of the first and second polarization directions of the fluorescence generated when the irradiation light is incident along the second incident surface, and the fluorescence response correction factor is calculated. The two-dimensional polarizable image of is obtained by polarization response correction based on the polarization response correction factor.
【００１７】また、本発明に係る偏光性イメージング装
置は、試料を境界面に平行な面上で回転させる回転手段
を更に備え、偏光応答補正因子獲得手段は、照射光が第
１の入射面に沿って入射したときに発生する蛍光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分、ならび
に、回転手段により試料が９０度回転された後に照射光
が第２の入射面に沿って入射したときに発生する蛍光の
第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基
づいて、偏光応答補正因子を算出する、のが好適であ
る。この場合には、非等方的な試料についても、偏光応
答補正因子獲得手段により、照射光が第１の入射面に沿
って入射したときに発生する蛍光の第１および第２の偏
光方位それぞれの直線偏光成分、ならびに、回転手段に
より境界面に平行な面上で試料が９０度回転された後に
照射光が第２の入射面に沿って入射したときに発生する
蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成
分に基づいて、偏光応答補正因子が算出され、蛍光の偏
光性の２次元画像は、偏光応答補正因子に基づいて偏光
応答補正されて求められる。Further, the polarization imaging apparatus according to the present invention further comprises a rotating means for rotating the sample on a plane parallel to the boundary surface, and the polarization response correction factor acquiring means is such that the irradiation light is incident on the first incident surface. First of fluorescence emitted when incident along
Linear polarization components of the respective second and second polarization directions, and the first and second fluorescence generated when the irradiation light enters along the second incident surface after the sample is rotated by 90 degrees by the rotating means. It is preferable to calculate the polarization response correction factor based on the linearly polarized light component of each polarization direction. In this case, even for an anisotropic sample, the polarization response correction factor acquisition means obtains the first and second polarization directions of the fluorescence generated when the irradiation light is incident along the first incident surface, respectively. Of the linearly polarized light component, and the first and second fluorescence generated when the irradiation light is incident along the second incident surface after the sample is rotated by 90 degrees on the surface parallel to the boundary surface by the rotating means. The polarization response correction factor is calculated based on the linearly polarized light components of the respective polarization azimuths, and the two-dimensional image of the fluorescence polarization is obtained by polarization response correction based on the polarization response correction factor.
【００１８】[0018]
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。また、本発明は、蛍光の偏光性イメージングだ
けでなく、ラマン散乱光の偏光性イメージングにも適用
可能であるが、以下では前者の場合について説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiments of the present invention will be described in detail below with reference to the accompanying drawings. In the description of the drawings, the same elements will be denoted by the same reference symbols, without redundant description. Further, the present invention can be applied not only to fluorescence polarization imaging but also to Raman scattered light polarization imaging, but the former case will be described below.
【００１９】先ず、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の構成の説明に先立って、本発明に係る偏光性イ
メージング装置が採用する蛍光偏光解消法について説明
する。蛍光偏光解消法は、蛍光分子または蛍光分子によ
り標識された分子（例えば、蛋白など）の運動を知る上
で有効な手段である。すなわち、励起光により励起され
た蛍光分子が蛍光を発生するまでの励起寿命中に回転ブ
ラウン運動により不規則な回転を行うと、その励起され
た蛍光分子の分子軸が乱れ、発生する蛍光の偏光性が解
消される。First, prior to the description of the configuration of the polarization imaging apparatus according to this embodiment, the fluorescence depolarization method adopted by the polarization imaging apparatus according to the present invention will be described. The fluorescence depolarization method is an effective means for knowing the movement of a fluorescent molecule or a molecule (for example, protein) labeled with a fluorescent molecule. That is, if the fluorescent molecule excited by the excitation light rotates irregularly by the rotating Brownian motion during the excitation lifetime until the fluorescence is generated, the molecular axis of the excited fluorescent molecule is disturbed, and the polarization of the generated fluorescence is increased. Sex is eliminated.
【００２０】この蛍光偏光解消の度合いは、蛍光分子ま
たは蛍光分子により標識された分子のブラウン運動の速
さによって決まるので、逆に蛍光偏光解消の度合いから
蛍光分子の励起寿命つまり蛍光寿命を時間基準として蛍
光分子または蛍光分子により標識された分子の運動を知
ることができる。例えば、ターゲットに結合している蛍
光プローブとフリーな蛍光プローブとを考えたとき、フ
リーな蛍光プローブは、ターゲットに結合した蛍光プロ
ーブより速いブラウン運動を行うので、偏光解消が速
い。したがって、蛍光偏光解消法により、ターゲットに
結合した蛍光プローブとフリーな蛍光プローブとの識別
が可能となる。すなわち、蛍光プローブが結合している
ターゲットのみを検出することが可能となる。Since the degree of depolarization of fluorescence is determined by the speed of Brownian motion of the fluorescent molecule or the molecule labeled with the fluorescent molecule, conversely, the excitation life of the fluorescent molecule, that is, the fluorescence life is based on the time of the depolarization of fluorescence. As a result, the movement of the fluorescent molecule or the molecule labeled with the fluorescent molecule can be known. For example, when considering a fluorescent probe bound to the target and a free fluorescent probe, the free fluorescent probe performs Brownian motion faster than the fluorescent probe bound to the target, and thus depolarization is fast. Therefore, by the fluorescence depolarization method, it becomes possible to distinguish between the fluorescent probe bound to the target and the free fluorescent probe. That is, it becomes possible to detect only the target to which the fluorescent probe is bound.
【００２１】この蛍光偏光解消法の考え方に基づいて、
定常光（ＣＷ光）励起により発生した蛍光の偏光解消を
測定することで蛍光プローブがターゲットに結合してい
るか否かを識別することも可能であるが、フリーな蛍光
プローブの数がターゲットに結合した蛍光プローブの数
に比べて圧倒的に多い場合（これは極めて一般的な場合
である）には検出感度が悪い。Based on this concept of the fluorescence depolarization method,
It is also possible to identify whether or not the fluorescent probe is bound to the target by measuring the depolarization of the fluorescence generated by the excitation of the constant light (CW light), but the number of free fluorescent probes binds to the target. When the number of fluorescent probes is overwhelmingly large compared to the number of fluorescent probes (which is a very general case), the detection sensitivity is poor.
【００２２】そこで、以下に述べる本実施形態に係る偏
光性イメージング装置では、図１に示すように、フリー
な蛍光プローブがターゲットに結合した蛍光プローブよ
り速く偏光解消を起こすことを利用して、パルス励起光
を照射して発生した蛍光のうち偏光解消の速い成分を時
間ゲート法により取り除いて光検出器により撮像するこ
とにより、フリーな蛍光プローブの数がターゲットに結
合した蛍光プローブの数に比べて圧倒的に多い場合であ
っても、ターゲットに結合した蛍光プローブの存在する
試料中の位置を検出するものである。なお、本発明は、
定常光（ＣＷ光）照射の場合にも適用可能である。Therefore, in the polarization imaging apparatus according to the present embodiment described below, as shown in FIG. 1, by utilizing the fact that the free fluorescent probe depolarizes faster than the fluorescent probe bound to the target, The number of free fluorescent probes compared to the number of fluorescent probes bound to the target was determined by removing the components of fast depolarization from the fluorescence generated by irradiating the excitation light with the time gate method and imaging with a photodetector. Even in the overwhelming majority, the position where the fluorescent probe bound to the target is present in the sample is detected. The present invention is
It can also be applied to the case of constant light (CW light) irradiation.
【００２３】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の構成について、図２および図３を参照しながら
説明する。図２は、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の全体を側方（励起側カバーガラス４２と試料４
０との境界面に平行な方向）から見た構成図であり、図
３は、本実施形態に係る偏光性イメージング装置のうち
の光源部および照射光学系を上方（励起側カバーガラス
４２と試料４０との境界面に垂直な方向）から見た構成
図である。Next, the configuration of the polarization imaging apparatus according to this embodiment will be described with reference to FIGS. 2 and 3. FIG. 2 shows the entire polarization imaging apparatus according to the present embodiment laterally (excitation side cover glass 42 and sample 4).
FIG. 3 is a configuration diagram viewed from the direction parallel to the boundary surface with 0), and FIG. 3 shows the light source unit and the irradiation optical system in the polarization imaging apparatus according to the present embodiment from above (excitation side cover glass 42 and sample). It is a block diagram seen from the direction perpendicular to the boundary surface with 40).
【００２４】試料４０中の蛍光プローブを励起する直線
偏光のパルス励起光を出力する光源部は、パルスレーザ
光源１０、偏光子１１および１／２波長板１２を備えて
構成される。すなわち、パルスレーザ光源１０は、試料
４０中の蛍光プローブを励起し得る波長のパルス励起光
を一定繰り返し周波数で出射する。偏光子１１は、その
パルス励起光を直線偏光とし、１／２波長板１２は、そ
の直線偏光とされたパルス励起光をｓ偏光とする。な
お、パルス励起光について言うｓ偏光とは、後述する励
起側カバーガラス４２と試料４０との境界面でパルス励
起光が全反射する際に、そのパルス励起光の偏光方位が
入射面に垂直であることを意味する。The light source section for outputting the linearly polarized pulsed excitation light for exciting the fluorescent probe in the sample 40 comprises a pulsed laser light source 10, a polarizer 11 and a half-wave plate 12. That is, the pulsed laser light source 10 emits pulsed excitation light having a wavelength capable of exciting the fluorescent probe in the sample 40 at a constant repetition frequency. The polarizer 11 makes the pulsed excitation light linearly polarized, and the ½ wavelength plate 12 makes the linearly polarized pulsed excitation light s-polarized. The s-polarized light referred to as the pulsed excitation light means that, when the pulsed excitation light is totally reflected at the interface between the excitation-side cover glass 42 and the sample 40, which will be described later, the polarization direction of the pulsed excitation light is perpendicular to the incident surface. Means there is.
【００２５】１／２波長板１２から出射されたパルス励
起光をプリズム３０に入射させる照射光学系は、光路切
替ミラー２０、ミラー２１，２２およびステアリングミ
ラー２３，２４を備えて構成される。すなわち、１／２
波長板１２から出射されたパルス励起光は、先ず、光路
切替ミラー２０に入射する。この光路切替ミラー２０
は、着脱自在のものであって、装着されているか否かに
依ってパルス励起光のその後の光路を切り換えるもので
ある。すなわち、パルス励起光は、光路切替ミラー２０
が装着されているときには、光路切替ミラー２０により
反射されてミラー２１に入射するが、光路切替ミラー２
０が装着されていないときには、ミラー２２に入射す
る。The irradiation optical system for making the pulse excitation light emitted from the half-wave plate 12 incident on the prism 30 comprises an optical path switching mirror 20, mirrors 21 and 22, and steering mirrors 23 and 24. That is, 1/2
The pulsed excitation light emitted from the wave plate 12 first enters the optical path switching mirror 20. This optical path switching mirror 20
Is detachable and switches the subsequent optical path of the pulsed excitation light depending on whether it is attached or not. That is, the pulsed excitation light is transmitted to the optical path switching mirror 20.
, Is reflected by the optical path switching mirror 20 and enters the mirror 21, the optical path switching mirror 2
When 0 is not attached, it is incident on the mirror 22.
【００２６】ミラー２１に入射したパルス励起光は、ミ
ラー２１により反射され、ステアリングミラー２３に入
射する。このステアリングミラー２３は、パルス励起光
をプリズム３０に入射させるべく、そのパルス励起光の
進行方向を変えるものである。ステアリングミラー２４
も同様に、ミラー２２により反射されたパルス励起光を
プリズム３０に入射させるべく、そのパルス励起光の進
行方向を変えるものである。The pulsed excitation light that has entered the mirror 21 is reflected by the mirror 21 and enters the steering mirror 23. The steering mirror 23 changes the traveling direction of the pulse excitation light so that the pulse excitation light enters the prism 30. Steering mirror 24
Similarly, the traveling direction of the pulsed excitation light is changed so that the pulsed excitation light reflected by the mirror 22 is incident on the prism 30.
【００２７】ここで、光路切替ミラー２０、ミラー２
１，２２およびステアリングミラー２３，２４からなる
照射光学系は、ステアリングミラー２３で反射され試料
４０の境界面に入射するパルス励起光の入射面と、ステ
アリングミラー２４で反射され試料４０の境界面に入射
するパルス励起光の入射面とが互いに直交するよう配さ
れる。Here, the optical path switching mirror 20 and the mirror 2
1 and 22 and steering mirrors 23 and 24 are arranged on the boundary surface of the sample 40 reflected by the steering mirror 23 and on the boundary surface of the sample 40. The planes of incidence of the incident pulsed excitation light are arranged so as to be orthogonal to each other.
【００２８】ステアリングミラー２３および２４の何れ
かにより反射されたパルス励起光が入射するプリズム３
０は、その底面が励起側カバーガラス４２と実質的に接
しており、また、この励起側カバーガラス４２は、試料
４０と接している。ステアリングミラー２３および２４
の何れかにより反射されたパルス励起光は、プリズム３
０の側面に入射し、さらに励起側カバーガラス４２に入
射し、この励起側カバーガラス４２と試料４０との境界
面で全反射する。このようにパルス励起光が試料４０の
境界面で全反射すると、境界面近傍の試料４０の領域に
エバネセント波が生じる。このエバネセント波の強度分
布は、境界面からの距離に依存して指数関数的に減衰
し、その深さ（境界面からの距離）は、パルス励起光の
波長における励起側カバーガラス４２および試料４０そ
れぞれの屈折率ならびに入射角度に応じた値である。こ
のエバネセント波が生じ得る試料４０中の領域がエバネ
セント励起され、その領域にある蛍光プローブから蛍光
が生じる。The prism 3 on which the pulsed excitation light reflected by one of the steering mirrors 23 and 24 is incident
0 has its bottom surface substantially in contact with the excitation-side cover glass 42, and this excitation-side cover glass 42 is in contact with the sample 40. Steering mirrors 23 and 24
The pulsed excitation light reflected by any of the
The light enters the side surface of 0, further enters the excitation-side cover glass 42, and is totally reflected by the boundary surface between the excitation-side cover glass 42 and the sample 40. When the pulsed excitation light is totally reflected on the boundary surface of the sample 40 in this way, an evanescent wave is generated in the region of the sample 40 near the boundary surface. The intensity distribution of the evanescent wave exponentially attenuates depending on the distance from the boundary surface, and the depth (distance from the boundary surface) of the intensity distribution is the excitation side cover glass 42 and the sample 40 at the wavelength of the pulsed excitation light. It is a value corresponding to each refractive index and incident angle. A region in the sample 40 where this evanescent wave can be generated is evanescently excited, and fluorescence is generated from the fluorescent probe in that region.
【００２９】また、プリズム３０、励起側カバーガラス
４２および試料４０は、回転ステージ３１に配置されて
いる。回転ステージ３１は、中央部に開口が設けられ、
後述する対物レンズ５０の光軸に直交する平面上に、プ
リズム３０、励起側カバーガラス４２および試料４０等
を配置するものであり、また、対物レンズ５０の光軸を
中心にして回転自在なものである。なお、プリズム３０
は、回転ステージ３１により光軸を中心として９０度回
転しても、回転前と同一形状となることが好ましい。す
なわち、プリズム３０は、例えば底面形状が正方形であ
る立方体、直方体あるいは正四角錐であって、その底面
の中心点が回転ステージ３１の回転中心線上にあること
が好ましい。The prism 30, the excitation side cover glass 42 and the sample 40 are arranged on the rotary stage 31. The rotary stage 31 has an opening at the center,
The prism 30, the excitation side cover glass 42, the sample 40, and the like are arranged on a plane orthogonal to the optical axis of the objective lens 50, which will be described later, and are rotatable about the optical axis of the objective lens 50. Is. The prism 30
Is preferably in the same shape as before the rotation even when it is rotated 90 degrees about the optical axis by the rotation stage 31. That is, it is preferable that the prism 30 is, for example, a cube, a rectangular parallelepiped, or a regular pyramid having a square bottom surface, and the center point of the bottom surface is on the rotation center line of the rotary stage 31.
【００３０】エバネセント励起された試料４０から発生
する蛍光は、対物レンズ５０、励起光カットフィルタ５
１、バンドパスフィルタ５２、偏光ビームスプリッタ５
３および結像レンズ５４，５５を備えて構成される受光
光学系により、撮像手段であるゲート機能付きイメージ
インテンシファイア６０，６１それぞれの受光面に結像
される。すなわち、対物レンズ５０は、試料４０につい
てプリズム３０と反対側に配されており、その視野内で
発生した蛍光を入力する。励起光カットフィルタ５１
は、対物レンズ５０から出力された蛍光を透過させる一
方、パルス励起光の散乱成分を遮断し、バンドパスフィ
ルタ５２は、励起光カットフィルタ５１を透過した蛍光
の波長を含む所定帯域の光のみを透過させ、偏光ビーム
スプリッタ５３は、バンドパスフィルタ５２を透過した
蛍光をｓ偏光成分とｐ偏光成分とに分岐する。結像レン
ズ５４は、蛍光のｐ偏光成分を入力して、ゲート機能付
きイメージインテンシファイア６０の撮像面に結像す
る。結像レンズ５５は、蛍光のｓ偏光成分を入力して、
ゲート機能付きイメージインテンシファイア６１の撮像
面に結像する。なお、蛍光について言うｐ偏光およびｓ
偏光それぞれは、偏光ビームスプリッタ５３の偏光膜へ
蛍光が入射する際における入射面に平行および垂直それ
ぞれを意味する。Fluorescence emitted from the sample 40 that has been evanescently excited is the objective lens 50 and the excitation light cut filter 5.
1, bandpass filter 52, polarization beam splitter 5
An image is formed on the light-receiving surface of each of the image intensifiers 60 and 61 with a gate function, which is an image pickup means, by a light-receiving optical system configured by including 3 and the image-forming lenses 54 and 55. That is, the objective lens 50 is arranged on the side of the sample 40 opposite to the prism 30, and inputs the fluorescence generated in the field of view. Excitation light cut filter 51
While transmitting the fluorescence output from the objective lens 50 while blocking the scattered component of the pulsed excitation light, the bandpass filter 52 transmits only the light in a predetermined band including the wavelength of the fluorescence transmitted through the excitation light cut filter 51. The polarization beam splitter 53 transmits the fluorescence, and the fluorescence transmitted through the bandpass filter 52 is split into an s-polarized component and a p-polarized component. The imaging lens 54 inputs the p-polarized component of fluorescence and forms an image on the imaging surface of the image intensifier 60 with a gate function. The imaging lens 55 inputs the s-polarized component of fluorescence,
An image is formed on the imaging surface of the image intensifier 61 with a gate function. It should be noted that p-polarized light and s referred to fluorescence
The polarized lights mean parallel and perpendicular to the incident surface when the fluorescent light enters the polarizing film of the polarization beam splitter 53.
【００３１】ゲート機能付きイメージインテンシファイ
ア６０は、その撮像面に結像された蛍光のｐ偏光成分の
画像を、また、ゲート機能付きイメージインテンシファ
イア６１は、その撮像面に結像された蛍光のｓ偏光成分
の画像を、それぞれ、ゲートコントローラ６２から出力
されるゲート信号が指示するタイミングで撮像する。ゲ
ートコントローラ６２は、パルスレーザ光源１０から出
力されるパルス励起光出射タイミングを示すタイミング
信号を入力し、そのタイミング信号に同期して、パルス
励起光出射時刻を基準として或時刻ｔから或時刻ｔ＋Δ
ｔまでの一定時間Δｔを示すゲート信号を出力する。し
たがって、ゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０および６１それぞれは、ゲートコントローラ６２か
ら出力されるゲート信号の指示に基づいて、時刻ｔから
の一定時間Δｔだけ、それぞれの撮像面に結像されてい
る蛍光を撮像する。The image intensifier 60 with a gate function forms an image of the p-polarized component of the fluorescence imaged on its image pickup surface, and the image intensifier 61 with a gate function forms an image on its image pickup surface. An image of the s-polarized component of fluorescence is captured at the timing indicated by the gate signal output from the gate controller 62. The gate controller 62 inputs a timing signal indicating the pulse excitation light emission timing output from the pulse laser light source 10, and in synchronization with the timing signal, the pulse excitation light emission time is used as a reference from a certain time t to a certain time t + Δ.
A gate signal indicating a constant time Δt until t is output. Therefore, each of the image intensifiers 60 and 61 with a gate function, based on the instruction of the gate signal output from the gate controller 62, the fluorescence imaged on each image pickup surface for a fixed time Δt from the time t. Image.
【００３２】画像演算部６３は、ゲート機能付きイメー
ジインテンシファイア６０および６１それぞれにより撮
像されたｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの蛍光画
像を入力する。そして、画像演算部６３は、これらの蛍
光画像に基づいて、蛍光異方性比の２次元画像を求め、
更に偏光応答補正を行い、試料４０における偏光性の２
次元画像を獲得する。蛍光異方性比および偏光応答補正
については後述する。The image calculation unit 63 inputs the fluorescence images of the p-polarized component and the s-polarized component respectively imaged by the image intensifiers 60 and 61 with a gate function. Then, the image calculation unit 63 obtains a two-dimensional image of the fluorescence anisotropy ratio based on these fluorescence images,
Further, the polarization response of the sample 40 is corrected, and
Acquire a three-dimensional image. The fluorescence anisotropy ratio and polarization response correction will be described later.
【００３３】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置におけるプリズム３０、回転ステージ３１および
対物レンズ５０等について、図４に示す断面図を参照し
て詳細に説明する。この図に示すように、試料４０は、
スペーサ４４を挟んで互いに平行に配された励起側カバ
ーガラス４２と受光側カバーガラス４３との間の空隙に
満たされた外液４０Ａ中にあって、励起側カバーガラス
４２に接している。励起側カバーガラス４２の上面は、
プリズム３０の底面と対向しており、これらの面の間に
はオイル４１が満たされている。このオイル４１は、プ
リズム３０の底面と励起側カバーガラス４２の上面との
間に空気層が存在すると、プリズム３０の底面でパルス
励起光が全反射するので、これを防止するために設けら
れたものである。また、受光側カバーガラス４３の下方
に、対物レンズ５０が配されている。Next, the prism 30, the rotary stage 31, the objective lens 50 and the like in the polarization imaging apparatus according to this embodiment will be described in detail with reference to the sectional view shown in FIG. As shown in this figure, the sample 40 is
It is in the external liquid 40A filled in the space between the excitation-side cover glass 42 and the light-receiving-side cover glass 43 that are arranged in parallel with each other with the spacer 44 interposed therebetween, and is in contact with the excitation-side cover glass 42. The upper surface of the excitation side cover glass 42 is
It faces the bottom surface of the prism 30, and oil 41 is filled between these surfaces. The oil 41 is provided to prevent the pulse excitation light from being totally reflected by the bottom surface of the prism 30 when an air layer is present between the bottom surface of the prism 30 and the top surface of the excitation side cover glass 42. It is a thing. The objective lens 50 is arranged below the light-receiving side cover glass 43.
【００３４】したがって、プリズム３０およびオイル４
１を経て励起側カバーガラス４２に入射したｓ偏光のパ
ルス励起光は、励起側カバーガラス４２と試料４０との
間の境界面に所定の入射角度で入射して、その境界面で
全反射する。パルス励起光の全反射の際に生じたエバネ
セント波により、境界面近傍の試料４０はエバネセント
励起され、試料４０から発生した蛍光は、受光側カバー
ガラス４３を透過して、対物レンズ５０に入射する。Therefore, the prism 30 and the oil 4
The s-polarized pulsed excitation light that has entered the excitation-side cover glass 42 via 1 is incident on the interface between the excitation-side cover glass 42 and the sample 40 at a predetermined incident angle, and is totally reflected at the interface. . The sample 40 near the boundary surface is evanescently excited by the evanescent wave generated during the total reflection of the pulsed excitation light, and the fluorescence generated from the sample 40 passes through the light-receiving side cover glass 43 and enters the objective lens 50. .
【００３５】次に、励起側カバーガラス４２と試料４０
との境界面におけるパルス励起光の全反射に伴い発生す
るエバネセント波の偏光状態について、図５を参照して
説明する。ｓ偏光の直線偏光のパルス励起光が励起側カ
バーガラス４２側から境界面に入射して全反射する際に
は、試料４０中に発生するエバネセント波はｓ偏光成分
のみである（図５（ａ））。しかし、ｐ偏光の直線偏光
のパルス励起光が励起側カバーガラス４２側から境界面
に入射して全反射する際には、試料４０中に発生するエ
バネセント波は、その電場ベクトルが入射面に平行な面
上にある楕円偏光となる（図５（ｂ））。したがって、
偏光性イメージングに際しては、励起光が受光光軸に垂
直な面内にのみ偏光成分をもつ直線偏光であることが望
ましいから、図５（ａ）に示すようにパルス励起光をｓ
偏光入射させる必要がある。Next, the excitation side cover glass 42 and the sample 40
The polarization state of the evanescent wave generated along with the total reflection of the pulsed excitation light on the boundary surface of and will be described with reference to FIG. When the s-polarized linearly polarized pulse excitation light is incident on the boundary surface from the excitation-side cover glass 42 side and is totally reflected, the evanescent wave generated in the sample 40 is only the s-polarized component (FIG. )). However, when the p-polarized linearly polarized pulse excitation light is incident on the boundary surface from the excitation-side cover glass 42 side and is totally reflected, the evanescent wave generated in the sample 40 has an electric field vector parallel to the incident surface. It becomes elliptically polarized light on a certain plane (FIG. 5 (b)). Therefore,
In polarization imaging, it is desirable that the excitation light be linearly polarized light having a polarization component only in a plane perpendicular to the light receiving optical axis. Therefore, as shown in FIG.
It is necessary to enter polarized light.
【００３６】なお、図２および図３で、パルス励起光が
ステアリングミラー２３により反射されて境界面にｓ偏
光入射すると、これに伴い試料４０中に発生するエバネ
セント波は、偏光ビームスプリッタ５３に関してｓ偏光
となる。このようにして試料４０を励起することを、ｓ
偏光励起という。一方、パルス励起光がステアリングミ
ラー２４により反射されて境界面にｓ偏光入射すると、
これに伴い試料４０中に発生するエバネセント波は、偏
光ビームスプリッタ５３に関してｐ偏光となる。このよ
うにして試料４０を励起することを、ｐ偏光励起とい
う。In FIG. 2 and FIG. 3, when the pulsed excitation light is reflected by the steering mirror 23 and is incident on the boundary surface by s-polarized light, the evanescent wave generated in the sample 40 is s-polarized by the polarization beam splitter 53. It becomes polarized light. Exciting the sample 40 in this manner
This is called polarization excitation. On the other hand, when the pulsed excitation light is reflected by the steering mirror 24 and enters the boundary surface with s-polarized light,
Along with this, the evanescent wave generated in the sample 40 becomes p-polarized with respect to the polarization beam splitter 53. Exciting the sample 40 in this manner is called p-polarized light excitation.
【００３７】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の動作を説明するとともに、蛍光異方性比の２次
元画像を取得する方法について説明する。Next, the operation of the polarization imaging apparatus according to this embodiment will be described, and a method for acquiring a two-dimensional image of fluorescence anisotropy ratio will be described.
【００３８】光路切替ミラー２０を装着して、直線偏光
のパルス励起光を、光路切替ミラー２０、ミラー２１お
よびステアリングミラー２３により順次反射させてプリ
ズム３０に入射させ、試料４０の境界面で全反射させ
て、試料４０をｓ偏光励起する。これにより試料４０の
境界面近傍で発生した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成
分の画像を、ゲート機能付きイメージインテンシファイ
ア６０および６１それぞれにより、ゲートコントローラ
６２から出力されるゲート信号の指示のもとに時刻ｔか
ら一定時間Δｔに亘り撮像する。このようにして得られ
たｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、Ｉ
spおよびＩssそれぞれで表す。The optical path switching mirror 20 is attached, and the linearly polarized pulse excitation light is sequentially reflected by the optical path switching mirror 20, the mirror 21 and the steering mirror 23 to enter the prism 30, and is totally reflected at the boundary surface of the sample 40. Then, the sample 40 is excited by s-polarized light. As a result, the images of the p-polarized component and the s-polarized component of the fluorescence generated near the boundary surface of the sample 40 are also instructed by the gate intensifiers 60 and 61 as the gate signal output from the gate controller 62. Further, the image is taken from time t for a certain time Δt. Each of the p-polarized fluorescence image and the s-polarized fluorescence image thus obtained is I
Represented by sp and I ss, respectively.
【００３９】また、光路切替ミラー２０を取り外して、
直線偏光のパルス励起光を、ミラー２２およびステアリ
ングミラー２４により順次反射させてプリズム３０に入
射させ、試料４０の境界面で全反射させて、試料４０を
ｐ偏光励起する。これにより試料４０の境界面近傍で発
生した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分の画像を、ゲ
ート機能付きイメージインテンシファイア６０および６
１それぞれにより、ゲートコントローラ６２から出力さ
れるゲート信号の指示のもとに時刻ｔから一定時間Δｔ
に亘り撮像する。このようにして得られたｐ偏光蛍光画
像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、ＩppおよびＩpsそ
れぞれで表す。Also, by removing the optical path switching mirror 20,
The linearly polarized pulsed excitation light is sequentially reflected by the mirror 22 and the steering mirror 24 to enter the prism 30, and is totally reflected by the boundary surface of the sample 40 to excite the sample 40 with p-polarized light. As a result, the images of the p-polarized component and the s-polarized component of fluorescence generated near the boundary surface of the sample 40 are converted into image intensifiers 60 and 6 with a gate function.
1 according to the instruction of the gate signal output from the gate controller 62, a predetermined time Δt from the time t.
The image is taken over. The p-polarized fluorescence image and the s-polarized fluorescence image thus obtained are represented by I pp and I ps, respectively.
【００４０】画像演算部６３は、このようにして撮像さ
れた蛍光画像Ｉsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsを入力し、こ
れらに基づいて、ｓ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒs
を、
rs＝(Iss−Isp)／(Iss＋2Isp) …(1a)
なる式で、また、ｐ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒp
を、
rp＝(Ipp−Ips)／(Ipp＋2Ips) …(1b)
なる式で、それぞれ求める。この蛍光異方性比ｒsおよ
びｒpそれぞれは、試料４０上の位置変数および時間変
数ｔの関数であり、偏光性の２次元画像を表すものであ
る。The image calculation unit 63 inputs the fluorescence images I sp , I ss , I pp and I ps thus captured, and based on these, the fluorescence anisotropy ratio r s for s-polarized light excitation.
Is expressed as r s = (I ss −I sp ) / (I ss + 2I sp ) ... (1a), and the fluorescence anisotropy ratio r p for p-polarized light excitation is
Are calculated by the equations r p = (I pp −I ps ) / (I pp + 2I ps ) ... (1b). The fluorescence anisotropy ratios r s and r p are functions of the position variable and the time variable t on the sample 40, and represent a two-dimensional polarizing image.
【００４１】しかし、実際には、受光光学系（対物レン
ズ５０からゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０，６１それぞれの撮像面に到るまでの光学系）およ
びゲート機能付きイメージインテンシファイア６０，６
１は、蛍光の偏光方位に依って異なる応答を示す。すな
わち、試料４０で発生する真の蛍光画像をＩsp，Ｉss，
ＩppおよびＩpsで表し、また、受光光学系を経てゲート
機能付きイメージインテンシファイア６０，６１それぞ
れにより実際に撮像される蛍光画像をＩsp'，Ｉss'，Ｉ
pp'およびＩps'で表すと、
Isp'＝Tp・Isp …(2a)
Iss'＝Ts・Iss …(2b)
Ipp'＝Tp・Ipp …(2c)
Ips'＝Ts・Ips …(2d)
なる関係が成立する。However, in reality, the light receiving optical system (the optical system from the objective lens 50 to the image intensifiers 60 and 61 with the gate function to reach the image pickup surface of each) and the image intensifiers 60 and 6 with the gate function.
1 shows different responses depending on the polarization direction of fluorescence. That is, the true fluorescence image generated in the sample 40 is represented by I sp , I ss ,
The fluorescence images are represented by I pp and I ps , and the fluorescence images actually captured by the image intensifiers 60 and 61 with the gate function via the light receiving optical system are I sp ′, I ss ′, I s.
Expressed by pp 'and I ps ', I sp '= T p · I sp … (2a) I ss ' ＝ T s · I ss … (2b) I pp ′ ＝ T p · I pp … (2c) I The relation ps ' = T s · I ps (2d) holds.
【００４２】ここで、Ｔp は、対物レンズ５０からゲー
ト機能付きイメージインテンシファイア６０の撮像面に
到るまでの受光光学系およびゲート機能付きイメージイ
ンテンシファイア６０のｐ偏光の蛍光に対する応答を表
し、また、Ｔs は、対物レンズ５０からゲート機能付き
イメージインテンシファイア６１の撮像面に到るまでの
受光光学系およびゲート機能付きイメージインテンシフ
ァイア６１のｓ偏光の蛍光に対する応答を表す。Here, T p is the light-receiving optical system from the objective lens 50 to the image pickup surface of the image intensifier 60 with a gate function, and the response of the image intensifier 60 with a gate function to fluorescence of p-polarized light. Also, T s represents the response of the light receiving optical system from the objective lens 50 to the image pickup surface of the image intensifier 61 with a gate function and the response of the s-polarized fluorescence of the image intensifier 61 with a gate function.
【００４３】したがって、蛍光異方性比ｒsおよびｒpそ
れぞれは、ゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０，６１それぞれにより実際に撮像された蛍光画像Ｉ
sp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'で表すと、
rs＝(G・Iss'−Isp')／(G・Iss'＋2Isp') …(3a)
rp＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋2G・Ips') …(3b)
で表される。ここで、Ｇは、
G＝Tp／Ts …(4)
で定義される偏光応答補正因子である。すなわち、画像
演算部６３は、ゲート機能付きイメージインテンシファ
イア６０および６１それぞれにより実際に撮像された蛍
光画像に基づいて、 (4)式で定義される偏光応答補正因
子Ｇを用い、(3a)式および(3b)式により蛍光異方性比ｒ
sおよびｒpの偏光応答補正を行うことで、真の偏光性の
２次元画像を求めることができる。Therefore, the fluorescence anisotropy ratios r s and r p are the fluorescence images I actually taken by the image intensifiers 60 and 61 with a gate function, respectively.
Expressed by sp ', I ss ', I pp 'and I ps ', r s = (G · I ss'− I sp ′) / (G · I ss ′ + 2I sp ′) (3a) r p ＝ (I pp '−G · I ps ') / (I pp '＋ 2G · I ps ')… (3b) Here, G is a polarization response correction factor defined by G = T p / T s ... (4). That is, the image calculation unit 63 uses the polarization response correction factor G defined by the equation (4) on the basis of the fluorescence images actually taken by the image intensifiers 60 and 61 with the gate function, and (3a) Fluorescence anisotropy ratio r
By performing polarization response correction of s and r p , a two-dimensional image having true polarization can be obtained.
【００４４】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置における偏光応答補正因子Ｇの算出方法を説明す
る。最も好適には、この偏光応答補正因子Ｇの算出に際
して、本来の偏光性イメージングを測定しようとする試
料に標識される蛍光プローブと同一の蛍光プローブの溶
液を標準試料として用意し、これを試料４０として用い
る。Next, a method of calculating the polarization response correction factor G in the polarization imaging apparatus according to this embodiment will be described. Most preferably, when calculating the polarization response correction factor G, a solution of the same fluorescent probe as the fluorescent probe labeled on the sample for which the original polarization imaging is to be measured is prepared as a standard sample, and this is used as the sample 40. Used as.
【００４５】このような標準試料を用いれば、本来の蛍
光標識された試料から発生する蛍光と同一スペクトルの
蛍光が発生することに加え、さらに、蛍光プローブがフ
リーな状態で存在するために蛍光の偏光性が速く解消す
るので、図６に示すようにゲート機能付きイメージイン
テンシファイア６０および６１それぞれにおいてゲート
を開く時間を十分に長くすることができ、したがって、
精度のよい偏光応答補正因子Ｇを求めることができるの
で好適である。When such a standard sample is used, in addition to the fluorescence having the same spectrum as the fluorescence generated from the original fluorescence-labeled sample, the fluorescence of the fluorescent probe is present in a free state. Since the polarizability is eliminated quickly, the gate opening time can be made sufficiently long in each of the gated image intensifiers 60 and 61 as shown in FIG.
This is preferable because the polarization response correction factor G can be obtained with high accuracy.
【００４６】また、光路切替ミラー２０を取り外して、
パルス励起光をミラー２２およびステアリングミラー２
４を経てプリズム３０に入射させ、試料４０の境界面で
パルス励起光を全反射させて、試料４０をｐ偏光励起す
る。ゲートコントローラ６２は、試料４０から発生した
蛍光の偏光性が十分に解消された時刻ｔから始まるゲー
ト時間Δｔを示すゲート信号を出力する（図６）。Also, by removing the optical path switching mirror 20,
The pulse excitation light is mirror 22 and steering mirror 2
The light is incident on the prism 30 via 4 and the pulse excitation light is totally reflected at the boundary surface of the sample 40 to excite the sample 40 with p-polarized light. The gate controller 62 outputs a gate signal indicating the gate time Δt starting from the time t when the polarization of the fluorescence generated from the sample 40 is sufficiently eliminated (FIG. 6).
【００４７】このとき、試料４０は等方的であるので、
時刻ｔから時間Δｔの間に試料４０から発生する真の蛍
光のｐ偏光成分Ｉppおよびｓ偏光成分Ｉpsそれぞれは互
いに等しく、
Ipp＝Ips …(5)
なる関係が成立する。したがって、偏光応答補正因子Ｇ
は、
G＝Ipp'／Ips' …(6)
なる式で得られ、また、真の蛍光異方性比ｒsおよびｒp
すなわち真の偏光性の２次元画像は、この (6)式で表さ
れる偏光応答補正因子Ｇを(3a)式または(3b)式に代入し
て得られる。このようにして、偏光性の２次元画像を高
精度に検出することができ、蛍光プローブが結合したタ
ーゲットを高精度に検出することができる。At this time, since the sample 40 is isotropic,
The p-polarized light component I pp and the s-polarized light component I ps of the true fluorescence generated from the sample 40 from the time t to the time Δt are equal to each other, and the relationship of I pp = I ps (5) is established. Therefore, the polarization response correction factor G
Is obtained by the equation G = I pp ′ / I ps ′ (6), and the true fluorescence anisotropy ratios r s and r p are obtained.
That is, a true polarization two-dimensional image is obtained by substituting the polarization response correction factor G represented by the equation (6) into the equation (3a) or the equation (3b). In this way, the polarizable two-dimensional image can be detected with high accuracy, and the target to which the fluorescent probe is bound can be detected with high accuracy.
【００４８】以上のように、偏光応答補正因子Ｇの算出
に際して標準試料を用いる場合、照射光学系は、パルス
励起光をプリズム３０に対して１方向のみから入射させ
るだけでよく、光路切替ミラー２０、ミラー２１および
ステアリングミラー２３は不要である。As described above, when the standard sample is used for calculating the polarization response correction factor G, the irradiation optical system only needs to make the pulsed excitation light incident on the prism 30 from only one direction, and the optical path switching mirror 20. , The mirror 21 and the steering mirror 23 are unnecessary.
【００４９】しかし、このような蛍光の偏光性が速く解
消し且つ等方的な理想的な標準試料ではなく、一般の試
料（測定対象である試料）を用いてより高精度に偏光応
答補正因子Ｇを求める場合には、上記の求め方は採用で
きない。このような場合には、以下のようにして偏光応
答補正因子Ｇを求める。以下では、偏光応答補正因子Ｇ
の求め方を、試料４０中の蛍光プローブの分子軸が配向
しておらず全くランダムに分布している場合と、試料４
０中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場
合とに分けて説明する。However, the polarization response correction factor can be more accurately obtained by using a general sample (sample to be measured), instead of an ideal isotropic standard sample in which the polarization property of fluorescence is quickly eliminated. When obtaining G, the above method cannot be adopted. In such a case, the polarization response correction factor G is obtained as follows. Below, the polarization response correction factor G
The method of obtaining the values is as follows: the case where the molecular axes of the fluorescent probes in the sample 40 are not oriented and are distributed at random;
The case where the molecular axes of the fluorescent probe in 0 are oriented and distributed will be described separately.
【００５０】試料４０中の蛍光プローブの分子軸が配向
しておらず全くランダムに分布している場合における偏
光応答補正因子Ｇは以下のようにして求める。この場合
には、試料４０が等方的であるので、ｐ偏光励起により
発生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比
は、ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssと
ｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく、
Ips／Ipp＝Isp／Iss …(7)
となる。そして、この (7)式および(2a)式乃至(2d)式か
ら、偏光応答補正因子Ｇを表す式として、
G＝[(Ipp'・Isp')／(Ips'・Iss')]1/2 …(8)
が得られる。The polarization response correction factor G in the case where the molecular axes of the fluorescent probes in the sample 40 are not oriented and are distributed at random is determined as follows. In this case, since the sample 40 is isotropic, the ratio of the p-polarized component I pp of fluorescence generated by p-polarized light excitation to the s-polarized component I ps is the s-polarized component of fluorescence generated by s-polarized light excitation. The ratio of I ss to the p-polarized light component I sp is equal to I ps / I pp = I sp / I ss (7). Then, from the equations (7) and (2a) to (2d), G = [(I pp ' .I sp ') / (I ps ' .I ss ') is given as an equation expressing the polarization response correction factor G. )] 1/2 … (8) is obtained.
【００５１】また、試料４０中の蛍光プローブの分子軸
が配向して分布している場合における偏光応答補正因子
Ｇは以下のようにして求める。なお、細胞膜等、実際の
測定対象はこのような系に近い場合が多い。この場合に
は、ｐ偏光励起時における試料４０の方位とｓ偏光励起
時における試料４０の方位とを、回転ステージ３１を回
転させることにより、９０度異なるものとする。このよ
うにすれば、試料４０が或方位にあるときにｐ偏光励起
により試料４０中に発生するエバネセント波と、回転ス
テージ３１により試料４０を９０度回転した後にｓ偏光
励起により試料４０中に発生するエバネセント波とは、
試料４０中では同一の偏光方位となる。したがって、試
料４０が或方位にあるときにｐ偏光励起により発生する
蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比は、試料
４０を９０度回転した後にｓ偏光励起により発生する蛍
光のｓ偏光成分Ｉssとｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく
なり、結局、 (7)式と同様の関係式が成り立ち、偏光応
答補正因子Ｇは (8)式で表される。The polarization response correction factor G when the molecular axes of the fluorescent probes in the sample 40 are oriented and distributed is determined as follows. In addition, an actual measurement target such as a cell membrane is often close to such a system. In this case, the orientation of the sample 40 at the time of exciting the p-polarized light and the orientation of the sample 40 at the time of exciting the s-polarized light are made to differ by 90 degrees by rotating the rotary stage 31. By doing so, the evanescent wave generated in the sample 40 by the p-polarized light excitation when the sample 40 is in a certain orientation and the evanescent wave generated in the sample 40 by the s-polarized light excitation after rotating the sample 40 by 90 degrees by the rotary stage 31. What is an evanescent wave?
In the sample 40, the polarization directions are the same. Therefore, the ratio of the p-polarized component I pp and the s-polarized component I ps of the fluorescence generated by the p-polarized light excitation when the sample 40 is in a certain orientation is the fluorescence generated by the s-polarized light excitation after the sample 40 is rotated 90 degrees. Of the s-polarized light component I ss and the p-polarized light component I sp are equal to each other, and the relational expression similar to the expression (7) is satisfied, and the polarization response correction factor G is expressed by the expression (8).
【００５２】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、上記実施形
態では、試料４０に照射する励起光はパルス励起光とし
たが、これに限られるものではなく、励起光は定常光
（ＣＷ光）であってもよい。この場合には、その定常光
である励起光をｓ偏光入射させて境界面で全反射させ
て、蛍光をも定常的に発生させる。そして、その蛍光の
偏光方位に応じて２分岐し、ｐ偏光成分およびｓ偏光成
分それぞれの画像を撮像する。このようにして得られた
ｐ偏光成分とｓ偏光成分との比は、偏光解消の度合いに
応じたものとなり、したがって、蛍光プローブが結合さ
れたターゲットを検出することができる。なお、この場
合には、ゲートコントローラは不要であり、撮像手段は
ゲート機能付きである必要はない。The present invention is not limited to the above embodiment, but various modifications can be made. For example, in the above-described embodiment, the excitation light with which the sample 40 is irradiated is pulse excitation light, but the excitation light is not limited to this, and the excitation light may be constant light (CW light). In this case, the excitation light, which is the stationary light, is incident on the s-polarized light and totally reflected at the boundary surface, and the fluorescence is also constantly generated. Then, depending on the polarization direction of the fluorescence, the light is branched into two, and images of the p-polarized component and the s-polarized component are captured. The ratio of the p-polarized light component and the s-polarized light component thus obtained depends on the degree of depolarization, and therefore the target to which the fluorescent probe is bound can be detected. In this case, the gate controller is not necessary, and the image pickup means need not have a gate function.
【００５３】また、上記実施形態では、偏光性を示す指
標として蛍光異方性比ｒを用いたが、これに限られるも
のではない。例えば、
p＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋G・Ips') …(9)
で定義される偏光度ｐ、あるいは、
q＝(Ipp'／Ips')−G …(10)
で定義される偏光度合いｑを用いて、これを偏光性すな
わち偏光解消の度合いを示す指標としてもよい。Further, in the above embodiment, the fluorescence anisotropy ratio r is used as the index showing the polarization property, but it is not limited to this. For example, p = (I pp '−G ・ I ps ') / (I pp '+ G ・ I ps ')… (9) The degree of polarization p, or q ＝ (I pp ′ / I ps ′) ) −G ... The polarization degree q defined by (10) may be used as an index indicating the polarization property, that is, the degree of depolarization.
【００５４】また、上記実施形態は、試料４０に励起光
をエバネセント照射して発生する蛍光の偏光性の２次元
画像を得るものであったが、蛍光検出に限られるもので
はなく、ラマン散乱光の偏光性の２次元画像の獲得にも
適用可能である。この場合にも同様の構成であり同様の
作用である。ただし、その性質上、上述した標準試料を
用いた偏光応答補正因子Ｇの獲得方法は採用できない。In the above embodiment, the two-dimensional image of the polarization of fluorescence generated by irradiating the sample 40 with the excitation light evanescently is obtained, but the invention is not limited to the fluorescence detection and the Raman scattered light is used. It can also be applied to the acquisition of a two-dimensional image having a polarizability. In this case as well, the configuration is similar and the operation is similar. However, due to its nature, the method of acquiring the polarization response correction factor G using the standard sample described above cannot be adopted.
【００５５】[0055]
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、光源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光
およびパルス光の何れでもよい）は、照射光学系によ
り、試料に接して配される透明部材の側から透明部材と
試料との境界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射さ
れ、その境界面で全反射され、これに伴い、試料はエバ
ネセント照射される。エバネセント照射された試料から
発生した被測定光（蛍光、ラマン散乱光）は、その境界
面に垂直な入射光軸を有する受光光学系に入力し、第１
の入射面と平行な第１の偏光方位およびこれに直交する
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐されて、
互いに異なる第１および第２の結像面それぞれに結像さ
れる。その結像された被測定光の第１および第２の偏光
方位それぞれの直線偏光成分は、第１および第２の撮像
手段それぞれにより撮像され、被測定光の偏光性の２次
元画像は、画像演算手段により、その画像に基づいて求
められる。As described above in detail, according to the present invention, the linearly polarized irradiation light (either CW light or pulsed light) emitted from the light source unit comes into contact with the sample by the irradiation optical system. The s-polarized light is incident on the boundary surface between the transparent member and the sample along the first incident surface from the side of the transparent member arranged as described above, and is totally reflected at the boundary surface. The measured light (fluorescence, Raman scattered light) generated from the evanescently irradiated sample is input to a light receiving optical system having an incident optical axis perpendicular to the boundary surface,
Is split into linearly polarized light components of a first polarization azimuth parallel to the plane of incidence and a second polarization azimuth orthogonal to the first polarization azimuth,
An image is formed on each of the first and second image planes that are different from each other. The linearly polarized light components of the first and second polarization directions of the imaged light to be measured are imaged by the first and second imaging means, respectively, and the two-dimensional image of the polarization of the light to be measured is an image. It is calculated by the calculation means based on the image.
【００５６】このような構成としたので、照射光が照射
された試料の特定領域のみから発生する被測定光の偏光
性の２次元画像を検出することができるので、空間分解
能が優れ、また、その特定領域以外の領域から発生する
被測定光が無い或いは微弱であるので、試料中の目的と
するターゲットの位置をＳ／Ｂ比よく特定することがで
きる。また、照射光は境界面で全反射するので直接には
受光光学系に入力せず、受光光学系で自家蛍光が発生し
ないので、この点でもＳ／Ｂ比が優れる。したがって、
試料中のターゲットの挙動等を高分解能かつ高精度に解
析することができるので、例えば細胞における諸機能の
解明に貢献し得るものである。With this structure, it is possible to detect a two-dimensional polarization image of the measured light generated only from a specific region of the sample irradiated with the irradiation light, so that the spatial resolution is excellent and Since the light to be measured generated from a region other than the specific region is absent or weak, the position of the target of interest in the sample can be specified with a good S / B ratio. Further, since the irradiation light is totally reflected by the boundary surface, it is not directly input to the light receiving optical system, and autofluorescence is not generated in the light receiving optical system. Therefore, the S / B ratio is also excellent in this respect. Therefore,
Since the behavior of the target in the sample can be analyzed with high resolution and high accuracy, it can contribute to elucidation of various functions in cells, for example.
【００５７】また、特に、照射光としてパルス光を出射
するとともに、第１および第２の撮像手段それぞれの撮
像タイミングをパルス光出射タイミングに同期して制御
する場合には、被測定光の偏光性の検出感度が高い。す
なわち、蛍光の偏光性イメージングの場合には、散乱光
および自家蛍光を除去できるので、偏光画像のコントラ
ストが向上する。一方、ラマン散乱光の偏光性イメージ
ングの場合には、ノイズとなる蛍光成分を除去できるの
で、偏光画像のコントラストが向上するだけでなく、ま
た、短寿命の過渡的状態のラマン偏光性イメージングを
得ることができる。Further, in particular, when the pulsed light is emitted as the irradiation light and the image pickup timings of the first and second image pickup means are controlled in synchronization with the pulsed light emission timing, the polarization property of the measured light is increased. The detection sensitivity of is high. That is, in the case of polarization imaging of fluorescence, scattered light and autofluorescence can be removed, so that the contrast of a polarization image is improved. On the other hand, in the case of polarimetric imaging of Raman scattered light, it is possible to remove the fluorescent component that becomes noise, so that not only the contrast of the polarization image is improved, but also Raman polarimetric imaging in a transient state with a short life is obtained. be able to.
【００５８】また、被測定試料とは別に速やかに偏光解
消する等方的な標準試料について、照射光が第１の入射
面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１およ
び第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて偏
光応答補正因子を算出し、被測定試料からの被測定光の
偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏光
応答補正して求める場合には、更に精度が良い偏光性イ
メージングが可能となる。Further, apart from the sample to be measured, for the isotropic standard sample which depolarizes rapidly, the first and second samples of the beam to be measured generated when the irradiation light is incident along the first incident surface. When the polarization response correction factor is calculated based on the linear polarization components of the respective polarization directions of, and the two-dimensional image of the polarization of the measured light from the measured sample is obtained by correcting the polarization response based on the polarization response correction factor. Enables more accurate polarimetric imaging.
【００５９】また、照射光学系が第１の入射面に直交す
る第２の入射面を更に有し、第１および第２の入射面の
うちの選択された一方の面に沿って照射光をｓ偏光入射
させる場合には、第１および第２の入射面それぞれに沿
ってｓ偏光入射した照射光によりエバネセント照射され
た試料から発生した被測定光の偏光性の２次元画像が得
られるので、非等方的な試料の測定に好適である。Further, the irradiation optical system further has a second incident surface orthogonal to the first incident surface, and the irradiation light is irradiated along one selected surface of the first and second incident surfaces. When s-polarized light is made incident, a polarization two-dimensional image of the measured light generated from the sample evanescently irradiated by the s-polarized light incident along the first and second incident surfaces is obtained. It is suitable for measuring anisotropic samples.
【００６０】また、被測定試料に対して照射光が第１の
入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分ならびに
照射光が第２の入射面に沿って入射したときに発生する
被測定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏
光成分に基づいて偏光応答補正因子を算出し、被測定光
の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏
光応答補正して求める場合には、等方的な試料について
更に精度の良い偏光性イメージングが可能となる。The first of the measured light generated when the irradiation light is incident on the measured sample along the first incident surface.
And second polarization directions, and polarization based on the respective linear polarization components of the first and second polarization directions of the measured light generated when the irradiation light is incident along the second incident surface. When a response correction factor is calculated and a two-dimensional image of the polarization of the measured light is obtained by polarization response correction based on the polarization response correction factor, more accurate polarization imaging can be performed on an isotropic sample. Becomes
【００６１】また、被測定試料に対して照射光が第１の
入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分ならびに
回転手段により境界面に平行な面上で試料が９０度回転
された後に照射光が第２の入射面に沿って入射したとき
に発生する被測定光の第１および第２の偏光方位それぞ
れの直線偏光成分に基づいて偏光応答補正因子を算出
し、被測定光の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子
に基づいて偏光応答補正して求める場合には、非等方的
な試料についても更に精度の良い偏光性イメージングが
可能となる。The first of the measured light generated when the irradiated light is incident on the measured sample along the first incident surface.
And the second polarization direction of the second polarization direction and the measured object generated when the irradiation light is incident along the second incident surface after the sample is rotated by 90 degrees on the surface parallel to the boundary surface by the rotating means. A polarization response correction factor is calculated based on the linear polarization components of each of the first and second polarization directions of light, and a two-dimensional image of the polarization of the measured light is obtained by polarization response correction based on the polarization response correction factor. In this case, more accurate polarimetric imaging can be performed even on an anisotropic sample.
【図１】フリーな蛍光プローブおよびターゲットに結合
した蛍光プローブそれぞれの偏光解消の説明図である。FIG. 1 is an explanatory diagram of depolarization of a free fluorescent probe and a fluorescent probe bound to a target.
【図２】本実施形態に係る偏光性イメージング装置の全
体を側方（励起側カバーガラス４２と試料４０との境界
面に平行な方向）から見た構成図である。FIG. 2 is a configuration diagram of the entire polarization imaging apparatus according to the present embodiment as viewed from the side (direction parallel to the boundary surface between the excitation side cover glass 42 and the sample 40).
【図３】本実施形態に係る偏光性イメージング装置のう
ちの光源部および照射光学系を上方（励起側カバーガラ
ス４２と試料４０との境界面に垂直な方向）から見た構
成図である。FIG. 3 is a configuration diagram of a light source unit and an irradiation optical system in the polarization imaging apparatus according to the present embodiment as viewed from above (a direction perpendicular to a boundary surface between the excitation side cover glass 42 and the sample 40).
【図４】本実施形態に係る偏光性イメージング装置にお
けるプリズム３０、回転ステージ３１および対物レンズ
５０等の断面図である。FIG. 4 is a cross-sectional view of a prism 30, a rotary stage 31, an objective lens 50 and the like in the polarization imaging apparatus according to this embodiment.
【図５】励起側カバーガラス４２と試料４０との境界面
におけるパルス励起光の全反射に伴い発生するエバネセ
ント波の偏光状態の説明図である。5 is an explanatory diagram of a polarization state of an evanescent wave generated due to total reflection of pulsed excitation light at a boundary surface between the excitation side cover glass 42 and the sample 40. FIG.
【図６】偏光応答補正因子Ｇの算出方法の説明図であ
る。FIG. 6 is an explanatory diagram of a method of calculating a polarization response correction factor G.
【図７】分光光度計タイプの蛍光の偏光性測定装置の構
成図である。FIG. 7 is a configuration diagram of a spectrophotometer type fluorescence polarization measuring apparatus.
【図８】落射照明方式による顕微鏡下での蛍光またはラ
マン散乱光の偏光性測定装置の構成図である。FIG. 8 is a configuration diagram of an apparatus for measuring polarization of fluorescence or Raman scattered light under a microscope by an epi-illumination method.
１０…パルスレーザ光源、１１…偏光子、１２…１／２
波長板、２０…光路切替ミラー、２１，２２…ミラー、
２３，２４…ステアリングミラー、３０…プリズム、３
１…回転ステージ、４０…試料、４１…オイル、４２…
励起側カバーガラス、４３…受光側カバーガラス、４４
…スペーサ、５０…対物レンズ、５１…励起光カットフ
ィルタ、５２…バンドパスフィルタ、５３…偏光ビーム
スプリッタ、５４，５５…結像レンズ、６０，６１…ゲ
ート機能付イメージインテンシファイア、６２…ゲート
コントローラ、６３…画像演算部。10 ... Pulsed laser light source, 11 ... Polarizer, 12 ... 1/2
Wave plate, 20 ... Optical path switching mirror 21, 22, ... Mirror,
23, 24 ... Steering mirror, 30 ... Prism, 3
1 ... Rotating stage, 40 ... Sample, 41 ... Oil, 42 ...
Excitation side cover glass, 43 ... Light receiving side cover glass, 44
... Spacer, 50 ... Objective lens, 51 ... Excitation light cut filter, 52 ... Bandpass filter, 53 ... Polarization beam splitter, 54, 55 ... Imaging lens, 60, 61 ... Image intensifier with gate function, 62 ... Gate Controller, 63 ... Image calculation unit.
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−149826（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−127004（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／2814（ＷＯ，Ａ１) Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ，米 国，1997年 １月 １日，36〔１〕, 150〜155 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01J 3/443 G01J 4/00 G01M 11/00 G01N 21/21 G01N 21/64 Front Page Continuation (56) References JP-A-5-149826 (JP, A) JP-A-4-127004 (JP, A) International Publication 95/2814 (WO, A1) Applied Optics, US, 1997 1 January 1st, 36 [1], 150-155 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) G01J 3/443 G01J 4/00 G01M 11/00 G01N 21/21 G01N 21/64
Claims (5)
直交する第２偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐し
て、撮像手段の結像面に結像する受光光学系とを備え、 前記撮像手段によって前記第１および前記第２の偏光方
位の直線偏光成分をそれぞれ検出し、前記試料の状態を
検出する偏光性イメージング装置において、 透明部材を前記試料に接して配置し、前記透明部材と前記試料との境界面を前記受光光学系の
光軸に垂直に配置し、 前記照射光学系は、前記境界面へ前記透明部材の側から
前記照射光を入射させる第１の入射面と、前記第１の入
射面に直交する第２の入射面とを有し、前記第１および
前記第２の入射面のうちの選択された一方の面に沿って
ｓ偏光入射させて前記境界面で全反射させ、前記試料を
エバネセント照射する構成とし、 前記試料から生じる被測定光である蛍光の偏光を検出す
ることを特徴とする偏光性イメージング装置。1. A light source unit for outputting linearly polarized irradiation light, an irradiation optical system for irradiating the sample with the linearly polarized irradiation light, and light to be measured generated from the sample is orthogonal to a first polarization direction. A light-receiving optical system that splits linearly polarized light components of respective second polarization azimuths and forms an image on an image forming plane of the image pickup means, and the image pickup means converts linearly polarized light components of the first and second polarization azimuths. In a polarimetric imaging apparatus that detects the state of each sample and detects the state of the sample, a transparent member is placed in contact with the sample, and a boundary surface between the transparent member and the sample is disposed in the light receiving optical system.
The irradiation optical system is arranged perpendicularly to the optical axis, and the irradiation optical system has a first incident surface on which the irradiation light is incident on the boundary surface from the transparent member side, and a second incident surface orthogonal to the first incident surface. A surface, and s-polarized light is incident along one selected surface of the first and second incident surfaces to be totally reflected at the boundary surface, and the sample is evanescently irradiated. A polarization imaging apparatus, which detects polarization of fluorescence, which is light under measurement, generated from the sample.
試料との境界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射させ
て前記境界面で全反射させ、前記試料をエバネセント照
射する照射光学系と、 前記境界面に垂直な入射光軸を有し、エバネセント照射
された前記試料から発生した蛍光を入力し、前記第１の
入射面と平行な第１の偏光方位およびこれに直交する第
２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐して、互い
に異なる第１および第２の結像面それぞれに結像する受
光光学系と、 前記第１の結像面に結像された前記蛍光の前記第１の偏
光方位の直線偏光成分を撮像する第１の撮像手段と、 前記第２の結像面に結像された前記蛍光の前記第２の偏
光方位の直線偏光成分を撮像する第２の撮像手段と、 前記第１および前記第２の撮像手段それぞれにより撮像
された前記蛍光の前記第１および前記第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の偏光蛍光画像に基づいて、前記
試料上の位置変数及び時間変数の関数で表される蛍光の
偏光性の２次元画像を求める画像演算手段とを備え、 前記照射光学系は、前記第１の入射面に直交する第２の
入射面を更に有し、前記第１および前記第２の入射面の
うちの選択された一方の面に沿って前記照射光をｓ偏光
入射させることを特徴とする偏光性イメージング装置。2. A light source section for outputting linearly polarized irradiation light, a transparent member arranged in contact with the sample, and the irradiation light from the transparent member side to the boundary surface between the transparent member and the sample. 1. An irradiation optical system for s-polarized light incident along one incident surface to be totally reflected by the boundary surface and irradiate the sample evanescently; and an evanescently irradiated sample having an incident optical axis perpendicular to the boundary surface. From the first polarization direction parallel to the first plane of incidence and a second polarization direction orthogonal to the first polarization direction parallel to the first plane of incidence, and is branched into first and second different polarization components. A light-receiving optical system that forms an image on each of the image planes; a first image capturing unit that captures an image of a linearly polarized light component of the first polarization direction of the fluorescence imaged on the first image plane; The second polarization of the fluorescence imaged on the second imaging plane Second imaging means for imaging the linearly polarized light component of the second order, and polarization of the linearly polarized light component of each of the first and second polarization directions of the fluorescence imaged by the first and second imaging means, respectively. Image irradiation means for obtaining a two-dimensional image of polarization of fluorescence represented by a function of a position variable and a time variable on the sample, based on the fluorescence image, and the irradiation optical system includes the first incident surface. And a second incident surface orthogonal to the plane of incidence, and the s-polarized light is incident on the irradiation light along one selected surface of the first and second incident surfaces. Imaging equipment.
光を出射するとともに、 前記パルス光の出射タイミングに同期して前記撮像手段
の撮像タイミングを制御する制御手段を更に備える、 ことを特徴とする請求項１又は２記載の偏光性イメージ
ング装置。3. The light source unit further includes a control unit that emits pulsed light as the irradiation light and controls the image pickup timing of the image pickup unit in synchronization with the emission timing of the pulsed light. The polarizable imaging device according to claim 1 or 2.
入射したときに発生する蛍光の前記第１および前記第２
の偏光方位それぞれの直線偏光成分、ならびに、前記照
射光が前記第２の入射面に沿って入射したときに発生す
る蛍光の前記第１および前記第２の偏光方位それぞれの
直線偏光成分に基づいて、偏光応答補正因子を算出する
偏光応答補正因子獲得手段を備え、 前記蛍光の偏光性の２次元画像を前記偏光応答補正因子
に基づいて偏光応答補正して求める、 ことを特徴とする請求項２又は３に記載の偏光性イメー
ジング装置。4. The first and second fluorescence generated when the irradiation light is incident along the first incident surface.
Linear polarization components of the respective polarization azimuths, and linear polarization components of the respective first and second polarization azimuths of the fluorescence generated when the irradiation light is incident along the second incident surface. The polarization response correction factor acquisition means for calculating a polarization response correction factor is provided, and the polarization two-dimensional image of the fluorescence polarization is obtained by performing polarization response correction on the basis of the polarization response correction factor. Alternatively, the polarizable imaging device according to Item 3.
転させる回転手段を更に備え、 前記偏光応答補正因子獲得手段は、前記照射光が前記第
１の入射面に沿って入射したときに発生する蛍光の前記
第１および前記第２の偏光方位それぞれの直線偏光成
分、ならびに、前記回転手段により前記試料が９０度回
転された後に前記照射光が前記第２の入射面に沿って入
射したときに発生する蛍光の前記第１および前記第２の
偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏光応答
補正因子を算出する、 ことを特徴とする請求項４記載の偏光性イメージング装
置。5. A rotation means for rotating the sample on a plane parallel to the boundary surface, wherein the polarization response correction factor acquisition means is provided when the irradiation light is incident along the first incident surface. Linearly polarized light components of the first and second polarization directions of the fluorescent light generated in the above, and the irradiation light is incident along the second incident surface after the sample is rotated by 90 degrees by the rotating means. 5. The polarization imaging apparatus according to claim 4, wherein a polarization response correction factor is calculated based on linearly polarized light components of each of the first and second polarization directions of the fluorescence generated when the polarization response correction factor is calculated.
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| JPH10281876A JPH10281876A (en) | 1998-10-23 |
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-
1997
- 1997-04-09 JP JP9110697A patent/JP3365474B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ，米国，１９９７年 １月 １日，３６〔１〕，１５０〜１５５ |
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