JP3347480B2 - ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

ヘモグロビンの測定方法

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みさと 松本
洋 岸岡
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用方法】本発明は便潜血検査等のヘモグロ
ビン含有試料中のヘモグロビンの分解抑制方法に関す
る。該分解抑制方法を、ヘモグロビン含有試料の保存を
必要とする臨床検査法に適用することにより、正確なヘ
モグロビンの測定方法が提供される。
【0002】
【従来の技術】大腸癌等の消化器癌を検査する方法とし
て、消化管からの出血に起因する糞便中の潜血成分(ヘ
モグロビン)を、抗ヘモグロビン抗体を用いた免疫学的
測定法により測定する方法が行われている。これらの臨
床検査法において、ヘモグロビンを含有した被検試料は
測定までに数日間放置されることが多くあり、保存期間
中に試料中のヘモグロビンが分解し、正確にヘモグロビ
ンを測定できないことがある。
【0003】被検試料中のヘモグロビンの分解を抑制す
る目的でチメロサール、クロルヘキシジン、アジ化ナト
リウム等一般的抗菌剤が用いられている。また、動物血
清を被検液に添加する方法(特開平4−145366号
公報)、含窒素複素環化合物を被検液に添加する方法
(特開昭60−35270号公報)、鉄プロトポルフィ
リンを添加する方法(特開平5−281227号公
報)、動物ヘモグロビンを添加する方法(特開平2−2
96149号公報)が知られているが、鉄輸送タンパク
質を用いる方法は知られていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】郵送検便試料による大
腸癌の検診等が普及するのに伴い、公知の方法よりも強
力な被検試料中のヘモグロビンの分解抑制方法の開発が
望まれている。本発明の分解抑制方法をヘモグロビン含
有試料の保存を必要とする臨床検査法に適用することに
より、正確なヘモグロビンの測定が可能な臨床検査法が
提供される。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明はヘモグロビン含
有試料に鉄輸送タンパク質を含有することを特徴とする
ヘモグロビンの分解抑制方法に関する。さらに本発明に
より、該ヘモグロビンの分解抑制方法を適用し、被検試
料中に鉄輸送タンパク質を含有することを特徴とするヘ
モグロビンの測定法を提供することができる。
【0006】鉄輸送タンパク質は、ヘモグロビンの分解
抑制作用を有するヒト、ウシ、ブタ、馬、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ヤギ等哺乳動物の鉄輸送タンパク質であれ
ばどのようなものでもよく、血液のトランスフェリン、
乳汁のラクトフェリン、子宮液のウテロフェリンまたは
これらを遺伝子工学等で改変したものが用いられる。ヘ
モグロビン含有試料に含有される鉄輸送タンパク質は、
ヘモグロビン1に対して0.00002〜200万の重
量比で用いられるが、ヘモグロビン1に対して0.00
08〜100万の重量比で用いることが好ましい。鉄輸
送タンパク質として純度95%以上、鉄含有量90%以
上の精製トランスフェリン標品を用いる場合は、試料中
の濃度が0.5〜2000μg/ml、好ましくは20
〜1000μg/mlであるように含有されればよい。
【0007】ヘモグロビン含有試料としては、ヘモグロ
ビンを含有する試料であればどのようなものでもよい
が、糞便、血液、尿、痰等があげられる。
【0008】被検試料は通常緩衝液等に溶解した状態
で、ヘモグロビンの測定に供せられる。緩衝液としては
リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが用いられ、これ
らの緩衝液はpH6.0〜9.0、好ましくは6.5〜
8.5の範囲がよく、緩衝液中には塩化ナトリウム、抗
生物質、アジ化ナトリウム等の抗菌剤、乳酸またはアル
ブミンを1種以上含んでいてもよい。
【0009】抗生物質としては、ペニシリン、アセチル
スピラマイシン、ミノサイクリン等があげられ、アルブ
ミンとしては、ヒト、ウサギ、羊、山羊、馬、牛、ブタ
等の動物アルブミン、卵白アルブミン等があげられる。
【0010】鉄輸送タンパク質の効果を増強するため、
緩衝液中に抗生物質、アルブミン、アジ化ナトリウム、
乳酸等を加えるときは、抗生物質0.005〜0.5重
量%、好ましくは0.01〜0.2重量%、アルブミン
0.05〜5重量%、好ましくは0.1〜2重量%、ア
ジ化ナトリウム0.05〜0.5重量%、好ましくは
0.1〜0.3重量%、乳酸0.1〜15重量%、好ま
しくは0.5〜5.0重量%の濃度で加える。これらの
添加剤は試料中のヘモグロビンに対しては、ヘモグロビ
ン1に対して重量比で、抗生物質0.002〜500
万、アルブミン0.02〜5000万、アジ化ナトリウ
ム0.02〜500万、乳酸0.04〜1億5000万
の比で用いればよい。該緩衝液を用いた試料の保存条件
は0〜45℃、好ましくは4〜10℃である。
【0011】本発明におけるヘモグロビンの測定方法と
しては、ヘモグロビンの検出方法または定量法であれば
いずれでもよいが、例えば抗ヘモグロビン抗体を用いた
免疫学的測定法等があげられる。
【0012】ヘモグロビンの免疫学的測定法としては、
抗ヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定法であればど
のようなものでもよく、例えば、寒天平板上で抗ヘモグ
ロビン抗体と被検試料中のヘモグロビンとを反応させる
単純免疫拡散法、二重免疫拡散法等の免疫拡散法、抗ヘ
モグロビン抗体を感作した動物血球を用いる逆受身赤血
球凝集法、酵素で標識した抗ヘモグロビン抗体を用いる
酵素免疫法、抗ヘモグロビン抗体を感作したラテックス
粒子を用いるラテックス凝集法、ラテックス凝集阻止
法、抗ヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用
いる金コロイド凝集法等があげられる。
【0013】以下にラテックス凝集法を用いた免疫学的
測定法について例示する。
【0014】通常のポリクローナル抗体の作製方法(実
験生物学講座14,「免疫生物学」,村松繁ら編,19
85年,丸善刊)に従い、ヒトヘモグロビンを抗原とし
てウサギ、羊、山羊、等の抗体産生能のある動物に該抗
原で免疫した後、採血する。採血後、通常用いられる精
製方法(例えば、硫酸アンモニウムによる塩析、DEA
EセルロースでのIgG分画)で精製して抗ヒトヘモグ
ロビン抗体を得る。なお抗ヒトヘモグロビン抗体は常法
(モノクローナルとがん,谷内昭ら編,1985年,サ
イエンスフォーラム社刊;単クローン抗体,岩崎辰夫ら
編,1984年,講談社サイエンティフィック社刊)等
により作製したモノクローナル抗体を用いてもよいし、
市販の抗ヒトヘモグロビン抗体を用いてもよい。
【0015】得られた抗体を物理吸着法または共有結合
法[タンパク質化学1(アミノ酸、ペプチド),赤堀四
郎ら編,1969年,共立出版刊]等の常法によりラテ
ックス粒子(0.1〜0.6μm)に結合させ、牛血清
アルブミン等を含む緩衝液などで遠心分離洗浄を行い抗
ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬を作製する。
【0016】この様にして得られたラテックス試薬を用
い、スライド板法によりスライド板上での凝集像を判定
する方法や、凝集反応の速度を分光光度計、濁度計等に
より光学的または電気的に測定する方法によってヒトヘ
モグロビンを測定する。
【0017】以下、本発明の実施例を示す。
【0018】
【実施例】
実施例1 (1)抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬の調
製 ヒトヘモグロビンをウサギに免疫して作製したポリクロ
ーナルの抗ヒトヘモグロビン抗体2mgを含む0.2M
トリス塩酸緩衝液(pH8.2)2mlと1%のポリス
チレンラテックス〔粒径0.35μm;協和発酵工業社
製〕を懸濁させた0.2Mトリス塩酸緩衝液(pH8.
2)2mlとを混合し、4℃で24時間撹拌してラテッ
クスに抗体を吸着させた。その後、遠心分離機を用いて
ラテックスを上記のトリス塩酸緩衝液で洗い、ラテック
スが1%になるように0.5%牛血清アルブミン(BS
A)を含む0.2Mトリス塩酸緩衝液(pH8.2)に
懸濁させ、抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬
を調製した。
【0019】(2)糞便溶解用緩衝液 ジ化ナトリウム0.1%、BSA0.2%、塩化ナト
リウム0.85%が入った0.05Mホウ酸緩衝液(p
H8.0)に、ウシトランスフェリン〔生化学工業社
製、純度95%以上、鉄含有量90%以上〕を溶解さ
せ、ウシトランスフェリン濃度0.5、20、100、
1000μg/mlの糞便溶解用緩衝液を作成した。
【0020】(3)対照用糞便溶解用緩衝液 (2)で作製した糞便溶解用緩衝液の対照としてアジ化
ナトリウム0.1%、BSA0.2%、塩化ナトリウム
0.85%が入った0.05Mホウ酸緩衝液(pH8.
0)を作製した。
【0021】(4)即時検出操作 (2)で調製した糞便溶解用緩衝液または(3)で作製
した対照用糞便溶解用緩衝液にヒトヘモグロビンの濃度
を変えて溶解し、更に健常人の糞便を6mg/ml濃度
で溶解させた。この被検液100μlと前記ラテックス
試薬25μlをスライド板上に滴下し、撹拌棒で両液を
混和してスライド板の円一杯に広げた。スライド板を前
後左右に3分間ゆるやかに動かした後、ラテックス試薬
の凝集像を観察した。その結果を第1表に示した。
【0022】
【表1】
【0023】第1表の即時検出操作では本発明法と対照
法どちらもヒトヘモグロビン125ng/mlまで測定
可能であった。
【0024】(7日保存後の検出)(2)で調製した糞
便溶解用緩衝液または(3)で作製した対照用糞便溶解
用緩衝液にヒトヘモグロビンを濃度を変えて溶解し、更
に健常人の糞便を6mg/ml濃度で溶解させた。得ら
れた溶液を23℃で7日間保存した後、(4)と同様の
方法で前記ラテックス試薬を滴下し凝集像を観察した。
結果を第2表に示した。
【0025】
【表2】
【0026】第2表によれば、23℃で7日間保存して
も本発明法は高い感度を有し、ヒトヘモグロビンの分解
を抑制した。
【0027】(6)高温保存後の検出 (2)で調製した糞便溶解用緩衝液または(3)で作製
した対照用糞便溶解用緩衝液にヒトヘモグロビンを濃度
を変えて溶解し、更に健常人の糞便を6mg/ml濃度
で溶解させた。得られた溶液を37℃で1日間保存した
後、(4)と同様の方法で前記ラテックス試薬を滴下し
凝集像を観察した。結果を第3表に示した。
【0028】
【表3】
【0029】第3表によれば、37℃の高温保存におい
ても本発明法は高い感度を有し、ヒトヘモグロビンの分
解を抑制した。
【0030】実施例2 0.05Mホウ酸緩衝液(pH8.0)に前記のウシト
ランスフェリンを0.01%、BSAを0.2%もしく
はアジ化ナトリウムを0.1%溶解させた溶液または無
添加の溶液を糞便溶解用緩衝液として用いる以外は、実
施例1と同様の方法により、ヘモグロビン溶液を23℃
で7日保存後のヘモグロビンを測定した。結果を第4表
に示した。
【0031】
【表4】
【0032】第4表によれば、本願発明方法が最も高い
感度を有し、ヒトヘモグロビンの分解を抑制した。
【0033】
【発明の効果】本発明により、糞便中のヘモグロビンの
分解が抑制され、大腸癌の診断に用いられる臨床検査法
において、ヘモグロビンの高精度測定が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平5−281227(JP,A) 特開 平8−29430(JP,A) 特開 平7−72154(JP,A) 特開 平6−281654(JP,A) 特開 平4−145366(JP,A) 特開 平2−296149(JP,A) 特開 昭60−35270(JP,A) 特開 平2−141665(JP,A) 特開 平6−66810(JP,A) 特開 昭63−246669(JP,A) 特開 平5−281226(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 33/48 - 33/98 CA(STN)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 鉄輸送タンパク質を含有することを特徴
    とするヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの分解抑
    制用試薬。
  2. 【請求項2】 緩衝液を含む請求項1記載の試薬。
  3. 【請求項3】 鉄輸送タンパク質を含有することを特徴
    とするヘモグロビン含有試料保存用試薬。
  4. 【請求項4】 緩衝液を含む請求項3記載の試薬。
  5. 【請求項5】 鉄輸送タンパク質を含有する緩衝液から
    なるヘモグロビン含有試料溶解用試薬。
  6. 【請求項6】 鉄輸送タンパク質を含有することを特徴
    とするヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの測定用
    試薬。
  7. 【請求項7】 抗ヘモグロビン抗体を含有する請求項6
    記載の試薬。
  8. 【請求項8】 ヘモグロビン含有試料が糞便である請求
    項1〜7のいずれかに記載の試薬。
  9. 【請求項9】 鉄輸送タンパク質がトランスフェリンで
    ある請求項1〜8のいずれかに記載の試薬。
  10. 【請求項10】 鉄輸送タンパク質を含有させることを
    特徴とするヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの分
    解抑制方法。
  11. 【請求項11】 鉄輸送タンパク質を含有させることを
    特徴とするヘモグロビン含有試料の保存方法。
  12. 【請求項12】 鉄輸送タンパク質を含有させることを
    特徴とするヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの測
    定方法。
  13. 【請求項13】 ヘモグロビン含有試料が糞便である請
    求項10〜12のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項14】 鉄輸送タンパク質がトランスフェリン
    である請求項10〜13のいずれかに記載の方法。
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