JP3328696B2 - Cell for electrochemical measurement in the presence of cells and electrochemical measurement method in the presence of cells - Google Patents
Cell for electrochemical measurement in the presence of cells and electrochemical measurement method in the presence of cellsInfo
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Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、細胞存在
下における電気化学測定方法に関するものである。さら
に詳しくは、この出願の発明は、試料表面で細胞を培養
することと該試料の電気化学測定を行うことを同一セル
中で行うことが可能な電気化学測定用セルに関するもの
である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for electrochemical measurement in the presence of cells. More specifically, the invention of this application relates to a cell for electrochemical measurement in which culturing cells on the surface of a sample and performing electrochemical measurement of the sample can be performed in the same cell.
【０００２】[0002]
【従来の技術とその課題】生体内の体液はＮａ＋、
Ｋ＋、Ｃｌ−などの様々なイオンやアルブミン、グロブ
リンなどの各種の蛋白質を含んだ一種の電解質液であ
る。体液のｐＨは通常は７．３５とややアルカリ側にあ
るが、手術後や外傷などの存在により５．３〜５．６と
酸性側になることもある。したがって、従来より、歯
科、整形外科材料として金属が使用されているが、生体
内は、金属材料にとって厳しい環境であるといえる。顎
の骨などに埋植して使用する人工歯根や、骨折箇所など
の固定具に使用されるボーンプレートなどのインプラン
ト材料は、生体内特有の腐食が生じやすく、これらの材
料を選定する上で、腐食機構の解明や生体内での材料の
耐食性評価は重要な課題である。2. Description of the Related Art The body fluid in a living body is Na + ,
It is a kind of electrolyte solution containing various ions such as K + and Cl − and various proteins such as albumin and globulin. The pH of the body fluid is usually on the slightly alkaline side of 7.35, but may be on the acidic side of 5.3 to 5.6 due to post-operation or the presence of trauma. Therefore, metals have been conventionally used as dental and orthopedic materials. However, it can be said that the inside of a living body is a severe environment for metal materials. Implant materials such as artificial dental roots implanted in jaw bones and bone plates used for fixing devices such as fractures are prone to corrosion peculiar to the living body. Elucidation of corrosion mechanisms and evaluation of corrosion resistance of materials in vivo are important issues.
【０００３】このような事情から、従来より、生体用金
属材料の耐食性評価が電気化学的に行われている。生体
用金属材料の電気化学測定における疑似生体内環境とし
ては、リン酸緩衝液や細胞培養液が用いられてきた。こ
れらの溶液中では、金属材料の評価を、一般的な電気化
学測定用容器を用いて行うことができ、簡便である。一
方、生体に埋入して用いる材料は、実際には常に周辺組
織、つまり細胞と接触しており、溶液を疑似生体内環境
として用いたこれまでの方法では、正確な評価を行うこ
とは、ほとんど不可能であった。[0003] Under such circumstances, the evaluation of corrosion resistance of metallic materials for living bodies has been conventionally performed electrochemically. Phosphate buffer solutions and cell culture solutions have been used as simulated in vivo environments in electrochemical measurements of metallic materials for living bodies. In these solutions, evaluation of the metal material can be performed using a general electrochemical measurement container, which is simple. On the other hand, the material used by being implanted in the living body is actually always in contact with the surrounding tissue, that is, the cells.According to the conventional method using the solution as a simulated in vivo environment, accurate evaluation is not possible. It was almost impossible.
【０００４】また、現在生体用に最も多く使用されてい
るのは、ステンレス鋼（とくにＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３
１６Ｌ）であり、次いでＣｏ−Ｃｒ合金、Ｔｉ合金の順
になっている。これらの材料において生体内で最も起こ
りやすい腐食は、すきま腐食である。すきま腐食とは、
Ｃｌ−などの攻撃性アニオンを含む水環境において、金
属同士、または金属と非金属よりなるすきまが存在する
場合に、その内部で発生する腐食である。すきまの内部
では酸素が消費され、酸素不足となった領域近傍にアノ
ード環境ができることにより、徐々にｐＨが低下し、腐
食箇所中のＣｌ−濃度が上昇して、金属腐食箇所が拡大
する。[0004] The most widely used biomedical materials are stainless steel (especially SUS316, SUS3).
16L), followed by a Co—Cr alloy and a Ti alloy. The most susceptible corrosion in vivo of these materials is crevice corrosion. What is crevice corrosion?
In a water environment containing an aggressive anion such as Cl −, when a gap is formed between metals or between a metal and a nonmetal, the corrosion occurs inside the gap. Oxygen is consumed inside the gap, and an anode environment is created near the oxygen-deficient region, whereby the pH gradually decreases, the Cl − concentration in the corroded portion increases, and the metal corroded portion expands.
【０００５】生体内には、前述のとおり、Ｃｌ−を含む
様々なイオンが存在しており、生体細胞と金属材料の間
ですきま腐食や濃度差電池の生成による腐食が進行しや
すい。また、細胞の存在により、細胞の代謝物が生体用
金属材料の腐食に影響を与えることや、細胞と材料の間
ですきま腐食が進行することなどがわかっている。さら
に、人工関節のように、２個以上の生体用金属材料部品
からなるものでは、すきま腐食が進行しやすいだけでな
く、部品の原料が異種合金であれば、体液中で電池を生
じ、腐食が起こることがある。このような腐食は、生体
用金属材料部品の劣化とともに、周囲の細胞を損傷する
恐れがあるという点で問題である。生体用金属材料を評
価するためには、生体内に近い環境を再現する必要があ
り、そのためには、細胞の共存が必要条件の一つである
といえる。[0005] In vivo, as described above, Cl - are present various ions including, corrosion due to generation of crevice corrosion and density differences battery is likely to proceed at between living cells and metallic materials. In addition, it is known that metabolites of cells affect the corrosion of metallic materials for living organisms, and that crevice corrosion progresses between cells and materials due to the presence of cells. Furthermore, in the case of a joint made of two or more metallic materials for a living body such as an artificial joint, not only is crevice corrosion easy to progress, but if the material of the part is a dissimilar alloy, a battery is formed in the body fluid to cause corrosion. May occur. Such corrosion is a problem in that it may damage surrounding cells as well as deterioration of the metallic material part for living body. In order to evaluate a metallic material for a living body, it is necessary to reproduce an environment close to the inside of a living body. To that end, coexistence of cells is one of the necessary conditions.
【０００６】細胞を金属材料表面に共存させた状態で金
属材料の評価を行うためには、従来より動物に材料を埋
め込む試験が行われているが、手間、時間、コストがか
かる上、再現性の確認が難しいという問題があった。ま
た、ガラス電極上で荷電しながら細胞を培養することが
行われているものの、細胞存在下における金属上での電
気化学的測定を行なえる細胞培養器は、これまで知られ
ていなかった。[0006] In order to evaluate a metal material in a state where cells coexist on the surface of the metal material, a test for embedding the material in an animal has been conventionally performed. However, it takes time, cost, and reproducibility. There was a problem that it was difficult to confirm. Although cells are cultured while being charged on a glass electrode, a cell incubator capable of performing electrochemical measurement on a metal in the presence of cells has not been known so far.
【０００７】そこで、この出願の発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を
解消し、生体外において、材料表面で細胞を培養し、同
時に、あるいは続けて、該材料の電気化学測定を行うた
めの電気化学測定用セルと、このセルを用いての細胞存
在下での電気化学測定方法を提供することを課題として
いる。Therefore, the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and solves the problems of the prior art, culturing cells on the surface of a material outside a living body, and simultaneously or continuously. It is another object of the present invention to provide an electrochemical measurement cell for performing an electrochemical measurement of the material, and an electrochemical measurement method using the cell in the presence of a cell.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】そこで、この出願の発明
は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従
来技術の問題点を解消するために、以下の通りの発明を
提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The invention of this application has been made in view of the above circumstances, and in order to solve the problems of the prior art, the following invention is provided. .
【０００９】すなわち、まず第１には、この出願の発明
は、細胞培養液導入部（Ａ）と、試料台部（Ｂ）とを備
え、細胞培養液導入部（Ａ）は、（ａ）側壁と、（ｂ）
細胞培養液を固体試料に接触させるための穴部を持つ底
面と、（ｃ）蓋を有し、試料台部（Ｂ）は、試料の装脱
着部を有している電気化学測定用セルを提供する。That is, first of all, the invention of the present application includes a cell culture solution introduction section (A) and a sample stage (B), and the cell culture solution introduction section (A) comprises (a) A side wall, and (b)
A bottom surface having a hole for bringing the cell culture solution into contact with the solid sample, (c) a lid, and a sample stage (B) is provided with an electrochemical measurement cell having a sample loading / unloading portion. provide.
【００１０】また、この出願の発明は、第２には、細胞
培養液導入部（Ａ）において、底面（ｂ）の穴部が試料
の装脱着部方向に向かうにしたがって小さくなる、すり
鉢状の構造を有すること、第３には、細胞培養液導入部
（Ａ）において、蓋（ｃ）に、対極および参照電極を差
し込むための差し込み口があること、第４には、試料台
部（Ｂ）において、試料の装脱着のための昇降機構が設
けられていることを特徴とする上記電気化学測定用セル
を提供する。[0010] Secondly, the invention of this application relates to a mortar-like shape in which the hole in the bottom surface (b) of the cell culture solution introduction part (A) becomes smaller toward the sample loading / unloading part. Thirdly, in the cell culture solution introduction part (A), the lid (c) has an insertion hole for inserting a counter electrode and a reference electrode, and fourthly, the sample table part (B The present invention provides the electrochemical measurement cell described above, wherein an elevating mechanism for loading and unloading a sample is provided.
【００１１】さらに、この出願の発明では、第５には、
固体試料を装着して、高温高圧下で滅菌した後、培養液
を導入して、細胞培養および電気化学測定を行うことが
可能とされている上記の電気化学測定用セルを提供し、
第６には、固体試料、培養液、電極を含めて恒温するこ
とが可能とされている電気化学測定用セルを提供する。Further, in the invention of this application, fifthly,
After mounting the solid sample and sterilizing under high temperature and pressure, a culture solution is introduced, and the cell for cell culture and electrochemical measurement is provided to provide the above-mentioned cell for electrochemical measurement,
Sixth, the present invention provides an electrochemical measurement cell that can be kept at a constant temperature including a solid sample, a culture solution, and an electrode.
【００１２】そして、この出願の発明は、第７には、前
記の電気化学測定用セルを、高温高圧下で滅菌し、細胞
培養液を導入して、試料表面域で細胞を培養し、同時
に、またはその後に、電気化学測定を行う、細胞存在下
における電気化学測定方法を、第８には、前記の電気化
学測定用セルを、高温高圧下で滅菌し、細胞培養液を導
入して、試料に荷電しながら試料表面域に細胞を培養す
る、細胞存在下における電気化学測定方法をも提供す
る。The invention of this application is, in the seventh aspect, sterilizing the above-mentioned cell for electrochemical measurement under high temperature and high pressure, introducing a cell culture solution, culturing the cells on the sample surface area, and simultaneously Or, thereafter, perform an electrochemical measurement, an electrochemical measurement method in the presence of a cell, eighthly, the electrochemical measurement cell is sterilized under high temperature and high pressure, and a cell culture solution is introduced. Also provided is a method for electrochemical measurement in the presence of cells, wherein the cells are cultured on the surface area of the sample while charging the sample.
【００１３】[0013]
【発明の実施の形態】この出願の発明は、試料表面で細
胞を培養すると同時に、該試料の電気化学測定を行うこ
とを可能とするための電気化学測定用セルを提供する。
このとき、試料とは、金属材料等の固体試料を示し、ア
ルミニウム、ニッケル、白金などの単一元素から成る金
属、ステンレス（ＳＵＳ）、Ｔｉ合金などの合金など、
各種のものであってもよい。さらには、これまでに生体
内で使用された例のある金属材料に限らず、新規な材料
等であってもよい。また、細胞とは、生物の細胞であれ
ばどのようなものであってもよいが、生体用金属材料の
評価においては、動物の筋細胞などを使用することが好
ましい。細胞を培養するにあたっては、培養液をセル内
に導入する必要があるが、この培養液は、目的の細胞を
培養するために好ましい条件に調整されていればよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The invention of this application provides a cell for electrochemical measurement, which makes it possible to culture cells on the surface of a sample and at the same time perform an electrochemical measurement of the sample.
At this time, the sample refers to a solid sample such as a metal material or the like, a metal composed of a single element such as aluminum, nickel, and platinum; an alloy such as stainless steel (SUS) and a Ti alloy;
Various types may be used. Further, the material is not limited to a metal material which has been used in vivo until now, and may be a new material. The cell may be any cell as long as it is a biological cell. In the evaluation of a metallic material for a living body, it is preferable to use an animal muscle cell or the like. When culturing cells, it is necessary to introduce a culture solution into the cells, but this culture solution may be adjusted to conditions suitable for culturing target cells.
【００１４】この出願の発明の細胞存在下での電気化学
測定において、電気化学測定とは、細胞存在下で電池反
応を起こし、確認する、電圧印加時の電流変化、あるい
は電流印加時の電圧変化を測定する、荷電しながら細胞
を培養させる、などの様々な方法があげられる。In the electrochemical measurement in the presence of a cell according to the invention of the present application, the electrochemical measurement means that a battery reaction is caused and confirmed in the presence of a cell, a current change when a voltage is applied, or a voltage change when a current is applied. And various methods such as culturing cells while being charged.
【００１５】そして、この出願の発明の電気化学測定用
セルは、これらの様々な電気化学測定に対応できるもの
であり、必要に応じて、試料、細胞、溶液、参照電極、
対極、試料通電用電極などを変更することが可能な構造
を有している。The electrochemical measurement cell of the invention of the present application is capable of responding to these various electrochemical measurements. If necessary, a sample, a cell, a solution, a reference electrode,
It has a structure that can change the counter electrode, the electrode for energizing the sample, and the like.
【００１６】図１は、この出願の発明の電気化学測定用
セルを例示した概略図である。また、図２は、この出願
の発明の電気化学測定用セルの鳥瞰図である。この出願
の発明の電気化学測定用セルは、たとえば図１および図
２に示したように、少なくとも、細胞培養液導入部
（Ａ）と試料台部（Ｂ）とを備えているが、試料台部
（Ｂ）の下に、細胞培養液導入部（Ａ）を支える脚部
（Ｃ）があってもよい。FIG. 1 is a schematic view illustrating the electrochemical measurement cell of the invention of this application. FIG. 2 is a bird's-eye view of the electrochemical measurement cell of the invention of this application. The electrochemical measurement cell according to the invention of this application includes at least a cell culture solution introduction part (A) and a sample stage (B) as shown in FIGS. 1 and 2, for example. Below the part (B), there may be a leg (C) supporting the cell culture solution introduction part (A).
【００１７】細胞培養液導入部（Ａ）は、少なくとも側
壁（１）、細胞培養液を試料に接触させるための穴部
（２）を有する底面（３）、および蓋（４）から構成さ
れている。これら側壁（１）、底面（３）、および蓋
（４）は、各々別の部品からなり、組み立てることによ
って、細胞培養液導入部（Ａ）が得られる分離型であっ
てもよいし、底に穴部（２）を有するフラスコのような
一体型の形状や、側壁（１）と底面（３）のみが一体化
した、底に穴を有するビーカーの如き形状であってもよ
い。好ましくは、使用前後の洗浄等、取り扱いが容易で
ある分離型である。つまり、細胞培養液導入部分（Ａ）
の側壁（１）は、筒であり、底面（３）は、細胞培養液
を固体試料に接触させるための穴部（２）の開いた板と
なる。また、蓋（４）は、側壁（１）の筒の断面と同じ
か筒の断面よりも大きな面積を有する板、あるいは縁を
有する板である。また、分離型の細胞培養液導入部
（Ａ）では、側壁（１）と底面（３）の接続部分は、は
め込み式、ねじ込み式など、どのような構造であっても
よいが、密閉可能な構造である。接続部には、パッキン
グａ（５）が挿入され、液漏れを防ぐことができる。The cell culture solution introduction section (A) is composed of at least a side wall (1), a bottom surface (3) having a hole (2) for bringing the cell culture solution into contact with a sample, and a lid (4). I have. The side wall (1), the bottom surface (3), and the lid (4) are made of different parts, and may be of a separated type in which the cell culture solution introduction part (A) is obtained by assembling. The shape may be an integral type such as a flask having a hole (2), or a shape such as a beaker having a hole at the bottom where only the side wall (1) and the bottom surface (3) are integrated. Preferably, the separation type is easy to handle such as washing before and after use. That is, the cell culture solution introduction part (A)
The side wall (1) is a cylinder, and the bottom surface (3) is a plate with an opening (2) for allowing the cell culture solution to come into contact with the solid sample. The lid (4) is a plate having the same area as or larger than the cross section of the tube of the side wall (1), or a plate having an edge. Further, in the separation type cell culture solution introducing portion (A), the connection portion between the side wall (1) and the bottom surface (3) may have any structure such as a fitting type or a screw type, but can be sealed. Structure. Packing a (5) is inserted into the connection part, so that liquid leakage can be prevented.
【００１８】底面（３）には、細胞培養液（６）と固体
試料（７）を接触させるための穴部（２）が開いてい
る。また、側壁（１）あるいは蓋（４）には、対極
（８）および参照電極（９）を差し込むための電極差し
込み口（１０）が開いていることが好ましい。取り扱い
の容易さから考えれば、蓋（４）に対極（８）および参
照電極（９）の電極差し込み口（１０）があることが特
に好ましい。対極（８）および参照電極（９）を取り付
ける際には、穴明き栓（１１）に各電極を差し込み、こ
れらの電極差し込み口（１０）にはめ込んでもよいし、
電極をそのまま差し込み口（１０）に入れてもよい。も
ちろん、側壁（１）に電極差し込み口（１０）を設けて
もよいし、対極（８）および参照電極（９）を側壁
（１）と蓋（４）の隙間から入れるような構造として、
電極差し込み口（１０）を設けなくてもよい。The bottom (3) has a hole (2) for contacting the cell culture solution (6) with the solid sample (7). Further, it is preferable that an electrode insertion opening (10) for inserting the counter electrode (8) and the reference electrode (9) is opened in the side wall (1) or the lid (4). Considering ease of handling, it is particularly preferable that the lid (4) has the counter electrode (8) and the electrode insertion port (10) for the reference electrode (9). When attaching the counter electrode (8) and the reference electrode (9), each electrode may be inserted into a perforated plug (11), and may be inserted into these electrode insertion ports (10).
The electrode may be directly inserted into the insertion port (10). Of course, the side wall (1) may be provided with an electrode insertion port (10), or the counter electrode (8) and the reference electrode (9) may be inserted through the gap between the side wall (1) and the lid (4).
The electrode insertion port (10) may not be provided.
【００１９】側壁（１）、底面（３）、および蓋（４）
の材質は、高温高圧、酸性などの環境に耐性があり、細
胞培養時に妨げとならず、電気化学測定に影響を及ぼさ
ないものであればどのようなものであってもよい。例え
ば、フッ素樹脂などの耐熱性、耐薬品性、強度などが高
いプラスチック、フッ素樹脂などの耐熱、耐薬品性の高
い樹脂で被覆されたステンレス鋼、ガラスなどが材料と
して例示できる。もちろん、それぞれの部品ごとに異な
る材質を選択しても、すべての部品を同じ材質から成る
ものとしてもよい。とくに側壁（１）および蓋（４）の
材質としては、透明でセル中の様子を観察しやすく、洗
浄も容易であるガラスやプラスチックが好ましい。底面
（３）の材質は、細胞培養後に交換したり、条件に応じ
て穴部（２）の形状を変更したりしやすいように、加工
がしやすく、耐熱、耐薬品性等の高いフッ素樹脂が好ま
しい。また、側壁（１）および底面（３）を接続する際
には、パッキングａ（５）を挟んでおくことが好まし
く、その材質は、細胞培養液（６）に耐性があり、高温
高圧処理にも耐えうるものであればどのようなものであ
ってもよい。特に耐熱性、耐薬品性の高いフッ素樹脂や
フッ素ゴムが好ましい。[0019] Side wall (1), bottom surface (3), and lid (4)
Any material may be used as long as it is resistant to environments such as high temperature, high pressure, and acidity, does not disturb the cell culture, and does not affect the electrochemical measurement. Examples of the material include plastics having high heat resistance, chemical resistance, and strength such as fluororesin, and stainless steel and glass coated with a resin having high heat and chemical resistance such as fluororesin. Of course, different materials may be selected for each component, or all components may be made of the same material. In particular, the material of the side wall (1) and the lid (4) is preferably glass or plastic which is transparent, makes it easy to observe the state in the cell, and is easy to clean. The material of the bottom surface (3) is a fluororesin that is easy to process and has high heat resistance and chemical resistance, so that it can be easily replaced after cell culture or the shape of the hole (2) can be easily changed according to conditions. Is preferred. When connecting the side wall (1) and the bottom surface (3), it is preferable to sandwich the packing a (5), and the material thereof is resistant to the cell culture solution (6) and is suitable for high-temperature and high-pressure treatment. Any material can be used as long as it can endure. Particularly, a fluororesin or fluororubber having high heat resistance and chemical resistance is preferable.
【００２０】また、底面（３）の穴部（２）の形状は、
細胞培養液（６）と接触する面の穴部（２）の径が大き
く、試料（７）と接触する面に向かうにしたがい、厚み
方向に穴部（２）の径が小さくなってゆく、すり鉢状で
あることが好ましい。これにより、細胞を培養する際
に、細胞を試料（７）の表面に集中させ、より効率的に
細胞を培養することが可能となるのである。The shape of the hole (2) in the bottom surface (3) is as follows:
The diameter of the hole (2) on the surface that comes into contact with the cell culture solution (6) is large, and the diameter of the hole (2) decreases in the thickness direction toward the surface that comes into contact with the sample (7). It is preferably a mortar shape. Thereby, when culturing the cells, the cells can be concentrated on the surface of the sample (7), and the cells can be cultured more efficiently.
【００２１】この出願の発明の電気化学測定用セルにお
いては、試料台部（Ｂ）は、たとえば、試料（７）を載
せるための試料台（１２）を有し、この試料台（１２）
は、固体試料の装脱着が可能となる昇降構造をしている
ものが好ましい。固体試料（７）の装脱着が可能となる
構造としては、図１に例示されるネジ（１３）の他に、
バネ、ジャッキなどがあげられる。さらに、試料台（１
２）を引き出し型としたり、細胞培養液導入部（Ａ）の
底面（３）の穴部（２）に直接試料台をねじ込む構造で
あってもよい。試料台（１２）の構造としては、試料
（７）の大きさ、厚み、形状に左右されずに、試料
（７）を底面（３）の穴部（２）に密着させることがで
きることから、ネジ（１３）や、ばね、ジャッキなどが
好ましく、特に部品が少なく簡便なネジ（１３）が最も
好ましい。また、試料（７）と細胞培養液導入部（Ａ）
の底面（３）の穴部（２）を密着させ、細胞培養液
（６）の漏洩を防ぐために、パッキングｂ（１４）を試
料と底面（３）の穴部（２）の間に挟むとよい。このパ
ッキングｂ（１４）は、細胞培養液（６）に対して耐食
性があり、高温高圧条件下でも十分に細胞培養液（６）
を密閉できるものであれば、どのような材質であっても
よい。好ましくは、耐熱性、耐薬品性が高く、熱による
膨張が少ないフッ素ゴムやフッ素樹脂を使用するとよ
い。測定を行う際には、試料（７）と試料台（１２）の
間に、通電用の電極（１５）を挟む。通電用の電極（１
５）は、試料（７）へ、または試料（７）から、電気を
導通させるために設置するものであり、どのような形状
のものであってもよく、材質は、白金、ステンレスな
ど、通常電極として使用される様々な材料から選択でき
る。もちろん、試料（７）に導線などを直接取り付け、
電気化学測定装置に接続してもよく、この場合、通電用
の電極（１５）はなくてよい。In the electrochemical measurement cell of the present invention, the sample stage (B) has, for example, a sample stage (12) on which a sample (7) is placed, and the sample stage (12).
It is preferable that the substrate has an elevating structure capable of attaching and detaching a solid sample. As a structure that allows attachment / detachment of the solid sample (7), in addition to the screw (13) illustrated in FIG.
Springs, jacks and the like. In addition, the sample stage (1
2) may be of a drawer type, or a structure in which the sample stage is directly screwed into the hole (2) of the bottom surface (3) of the cell culture solution introduction part (A). As the structure of the sample stage (12), the sample (7) can be brought into close contact with the hole (2) of the bottom surface (3) regardless of the size, thickness, and shape of the sample (7). A screw (13), a spring, a jack, or the like is preferable, and a simple screw (13) with few components is particularly preferable. In addition, the sample (7) and the cell culture solution introduction part (A)
When the packing b (14) is sandwiched between the sample and the hole (2) on the bottom surface (3) in order to make the hole (2) on the bottom surface (3) of the sample closely contact and prevent the cell culture solution (6) from leaking. Good. This packing b (14) has corrosion resistance to the cell culture medium (6) and is sufficiently resistant to cell culture medium (6) even under high temperature and high pressure conditions.
Any material may be used as long as the material can be sealed. Preferably, a fluororubber or a fluororesin having high heat resistance and chemical resistance and little expansion due to heat is preferably used. When the measurement is performed, a current-carrying electrode (15) is sandwiched between the sample (7) and the sample stage (12). Electrode for energization (1
5) is provided for conducting electricity to or from the sample (7), and may be of any shape. You can choose from a variety of materials used as electrodes. Of course, a lead wire is directly attached to the sample (7),
It may be connected to an electrochemical measurement device, in which case the electrode (15) for energization may be omitted.
【００２２】上記以外の試料台部（Ｂ）の各部品の材質
は、高温高圧によって変形したり膨張したりせず、電気
化学測定に影響を与えないものであれば、とくに限定さ
れない。好ましくは、耐熱性、耐薬品性、強度などが高
いフッ素樹脂である。The material of each component of the sample stage (B) other than the above is not particularly limited as long as it does not deform or expand due to high temperature and high pressure and does not affect the electrochemical measurement. Preferably, it is a fluororesin having high heat resistance, chemical resistance, strength and the like.
【００２３】この出願の発明の電気化学測定用セルは、
少なくとも上記の細胞培養液導入部（Ａ）と試料台部
（Ｂ）から構成されるものであるが、さらに、細胞培養
液導入部（Ａ）を支える脚部（Ｃ）を有することが好ま
しい。とくに試料台（１２）の下部にネジ（１３）があ
り、このネジ（１３）で試料を上下させる場合には、ネ
ジの移動距離分の脚（１６、１７）と、ネジの穴（１
８）を有する板（１９）が必要となる。脚（１６、１
７）、板（１９）の材質は、この出願の発明の電気化学
測定用セルの他の部品と同様に、高温高圧条件に耐え、
細胞培養液に万一触れた場合にも劣化しないものであれ
ば、ステンレス鋼などの金属、フッ素樹脂などのプラス
チックなど、どのようなものであってもよい。組み立て
や解体を容易とするためには、脚（１６、１７）がステ
ンレス製ボルトやフッ素樹脂製の柱であり、板（１８）
がフッ素樹脂性の厚板であることが好ましい。さらに、
脚部（Ｃ）の各構成部品の形状は、電気化学測定用セル
本体を安定に支え、試料台の動きを妨げなければ、どの
ような形状、構造であってもよい。The cell for electrochemical measurement of the invention of this application is:
It comprises at least the above-mentioned cell culture solution introduction part (A) and the sample stage part (B), but preferably further has a leg (C) for supporting the cell culture solution introduction part (A). In particular, a screw (13) is provided below the sample table (12). When the sample is moved up and down by the screw (13), the feet (16, 17) for the distance the screw moves and the screw hole (1) are provided.
A plate (19) having 8) is required. Legs (16, 1
7) The material of the plate (19) withstands high-temperature and high-pressure conditions, like other parts of the electrochemical measurement cell of the invention of this application.
Any material such as a metal such as stainless steel, a plastic such as fluororesin, or the like may be used as long as it does not deteriorate even in the event that the cell culture solution is touched. In order to facilitate assembly and disassembly, the legs (16, 17) are stainless steel bolts or fluororesin pillars, and the plate (18)
Is preferably a fluoroplastic thick plate. further,
The shape of each component of the leg (C) may be any shape and structure as long as it stably supports the electrochemical measurement cell main body and does not hinder the movement of the sample stage.
【００２４】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail.
【００２５】[0025]
【実施例】実施例１ ＜Ｉ＞ 電気化学測定用セルの組み立て 図１に示した概略図に基づき、電気化学測定用セルを組
み立てた。 Example 1 <I> Assembly of Cell for Electrochemical Measurement A cell for electrochemical measurement was assembled based on the schematic diagram shown in FIG.
【００２６】細胞培養液導入部（Ａ）の側壁（１）は直
径１０ｃｍのガラス製の円筒、底面（３）は細胞培養液
（６）接触面の直径が４．８ｃｍ、試料（７）面の直径
が１ｃｍのすり鉢状の穴部（２）を中央に有する厚さ
１．５ｃｍのＰＴＦＥ製板とし、側壁（１）と底面
（３）の接触部にはフッ素ゴム製のＯリングをパッキン
グ（５）として挟んだ。また、蓋（４）は、対極（８）
および参照電極（９）を差し込むための差し込み口（１
０ａ、１０ｂ）を有するプラスチック製とした。The side wall (1) of the cell culture solution introduction part (A) is a glass cylinder having a diameter of 10 cm, the bottom surface (3) is a cell culture solution (6) having a contact surface of 4.8 cm, and the sample (7) surface. A 1.5 cm thick PTFE plate having a mortar-shaped hole (2) at the center with a diameter of 1 cm, and an O-ring made of fluoro rubber at the contact portion between the side wall (1) and the bottom surface (3) (5). The lid (4) is the counter electrode (8)
And an insertion port (1) for inserting the reference electrode (9).
0a, 10b).
【００２７】試料台部（Ｂ）は、試料台（１２）そのも
のをＰＴＦＥ製のネジ（１３）とした。さらに、脚部
（Ｃ）では、試料（７）の細胞培養液導入部（Ａ）底面
（３）への密着性向上のために、ステンレス製ボルトを
脚（１６）とし、ＰＴＦＥ製の板（１９）に固定した。
試料台（１２）の支えもこの板（１９）とし、板（１
９）に試料台（１２）がねじ込まれるようにした。さら
に板（１９）にも脚（１７）を付け、これはＰＴＦＥ製
とした。 ＜ＩＩ＞ 細胞の培養 組み立てた電気化学測定用セルを１２０℃、飽和蒸気圧
下で滅菌し、細胞培養液導入部（Ａ）にマウス線維芽細
胞（Ｌ９２９）を播種し、７．５ｍｌのＥ−ＭＥＭ＋１
０％ＦＢＳ（血清）培養液を入れた。試料は純チタン板
（９９．５％）とし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベ
ーター内で１週間培養した。試料の通電用の電極として
はステンレス板を用いた。 ＜ＩＩＩ＞ 細胞存在下での電気化学測定 ＜ＩＩ＞で細胞を培養した電気化学測定用セルを保温箱
に入れ、３７℃に恒温して対極（Ｐｔ）、参照電極（飽
和カロメル電極：ＳＣＥ）を設置し、各電極を電気化学
測定装置に接続して、１０５〜１０−３Ｈｚの周波数範
囲におけるチタンの交流インピーダンス測定を行なっ
た。比較例１ 実施例１と同様に組み立てた電気化学測定用セルを滅菌
し、純チタン板を試料として、細胞培養を行なわずに
７．５ｍｌの培養液のみを細胞培養液導入部（Ａ）に入
れた。この電気化学測定用セルを３７℃のインキュベー
ター内に１週間放置した。実施例１と同じ電極を用い
て、チタンの交流インピーダンス測定を行なった。In the sample stage (B), the sample stage (12) itself was a PTFE screw (13). Further, in the leg (C), in order to improve the adhesion of the sample (7) to the cell culture solution introduction part (A) and the bottom surface (3), a stainless steel bolt is used as the leg (16), and a PTFE plate ( 19).
The support for the sample stage (12) is also this plate (19), and the plate (1)
The sample stage (12) was screwed into 9). Further, a leg (17) was attached to the plate (19), which was made of PTFE. <II> Cell Culture The assembled cell for electrochemical measurement was sterilized at 120 ° C. under a saturated vapor pressure, and mouse fibroblasts (L929) were seeded in the cell culture solution introduction part (A), and 7.5 ml of E-cell MEM + 1
A 0% FBS (serum) culture was added. The sample was a pure titanium plate (99.5%), and cultured for one week in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 . A stainless plate was used as an electrode for energizing the sample. <III> Electrochemical Measurement in the Presence of Cells The cell for electrochemical measurement obtained by culturing the cells in <II> is placed in a warm box, and the temperature is kept at 37 ° C., and the counter electrode (Pt) and the reference electrode (saturated calomel electrode: SCE) Was installed, and each electrode was connected to an electrochemical measurement device to measure the AC impedance of titanium in a frequency range of 10 5 to 10 −3 Hz. Comparative Example 1 The cell for electrochemical measurement assembled in the same manner as in Example 1 was sterilized, and a pure titanium plate was used as a sample, and only 7.5 ml of the culture solution was introduced into the cell culture solution introduction part (A) without cell culture. I put it. This electrochemical measurement cell was left in a 37 ° C. incubator for one week. Using the same electrodes as in Example 1, the AC impedance of titanium was measured.
【００２８】図３に自然電位における交流インピーダン
ス測定の結果を示した。ここでＺはインピーダンスを、
Ａは試料面積を、ｆは周波数を表わす。したがって、｜
Ｚ｜／Ａは、単位面積当たりのインピーダンスの絶対値
である。FIG. 3 shows the result of the AC impedance measurement at the natural potential. Where Z is the impedance,
A represents the sample area, and f represents the frequency. Therefore, |
Z | / A is the absolute value of the impedance per unit area.
【００２９】細胞の存在、不在に関わらず周波数が１０
５〜１０３Ｈｚの領域では、インピーダンスはほぼ一定
であった。１０３〜１０−１Ｈｚではインピーダンスは
細胞存在下、不在下で、ともに直線的に増加し、１０
−１〜１０−２Ｈｚでは再びほぼ一定となった。さらに
１０−２以下では、測定限界である１０−３Ｈｚ以下の
領域でも、直線的な増加を見せた。The frequency is 10 regardless of the presence or absence of cells.
In 5 to 10 3 Hz region, the impedance was substantially constant. At 10 3 to 10 -1 Hz, the impedance increases linearly in the presence and absence of cells,
It became almost constant again at -1 to 10 -2 Hz. Further, at 10 −2 or less, a linear increase was observed even in the measurement limit of 10 −3 Hz or less.
【００３０】これらの結果から、１０５〜１０３Ｈｚの
周波数領域では、溶液抵抗が現れており、１０−１〜１
０−２Ｈｚの範囲では、チタン上に電気容量を有する層
が形成されたことが分かる。また、測定限界である１０
−３Ｈｚ以下でも直線的なインピーダンスの増加が見ら
れることから、純チタン側に非常に電気抵抗の高い層が
形成された可能性を示している。つまり純チタン上に
は、少なくとも２つの層が形成されていると考えられ
る。From these results, in the frequency range of 10 5 to 10 3 Hz, solution resistance appears, and 10 −1 to 1
It can be seen that a layer having an electric capacity was formed on titanium in the range of 0 -2 Hz. In addition, the measurement limit of 10
Since a linear increase in impedance is observed even at −3 Hz or less, it is possible that a layer having extremely high electric resistance was formed on the pure titanium side. That is, it is considered that at least two layers are formed on pure titanium.
【００３１】純チタン全体の耐食性は、細胞の存在、非
存在にほとんど依存しないと考えられる。しかし、細胞
存在下（実施例１）でのインピーダンス値が１０−１〜
１０−２Ｈｚの領域で細胞非存在（比較例１）の値より
も高いことから、細胞が純チタンの外側の層の電気化学
的性質に影響を及ぼしていると考えられる。It is considered that the corrosion resistance of pure titanium as a whole hardly depends on the presence or absence of cells. However, the impedance value in the presence of the cell (Example 1) is 10 -1 to 10 -1 .
Since the value is higher than the value of the absence of cells (Comparative Example 1) in the region of 10 −2 Hz, it is considered that the cells influence the electrochemical properties of the outer layer of pure titanium.
【００３２】[0032]
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、試料材料を導入した状態での高温高圧での滅菌が
可能であり、該試料材料の表面で細胞を培養し、同時
に、あるいは続けて電気化学測定を行うことのできる電
気化学測定用セルが提供される。したがって、生体用金
属材料の耐食性評価を、これまでの緩衝液のみからなる
疑似生体内環境よりも実際の生体内環境に近い細胞存在
下において行うことが可能となった。As described above in detail, according to the present invention, it is possible to sterilize a sample material at a high temperature and a high pressure in a state where the sample material is introduced, and to cultivate cells on the surface of the sample material, and simultaneously or continuously. An electrochemical measurement cell capable of performing a chemical measurement is provided. Therefore, it has become possible to evaluate the corrosion resistance of the metallic material for living body in the presence of cells closer to the actual living body environment than the simulated living body environment consisting only of a buffer solution up to now.
【図１】この出願の発明の電気化学測定用セルを例示し
た概略図である。FIG. 1 is a schematic view illustrating an electrochemical measurement cell of the invention of this application.
【図２】この出願の発明の電気化学測定用セルの鳥瞰図
である。FIG. 2 is a bird's-eye view of the electrochemical measurement cell of the invention of this application.
【図３】この出願の発明の実施例であり、電気化学測定
用セルを用いて細胞を培養し、交流インピーダンス測定
を行なった際の、周波数に対する｜Ｚ｜／Ａを表わすグ
ラフである。（黒丸：Ｌ９２９存在下、白丸：Ｌ９２９
非存在下）FIG. 3 is a graph showing | Z | / A with respect to frequency when cells are cultured using an electrochemical measurement cell and AC impedance is measured, which is an example of the invention of this application. (Black circle: in the presence of L929, open circle: L929
Non-existent)
Ａ 細胞培養液導入部 Ｂ 試料台部 Ｃ 脚部 １ 側壁 ２ 穴部 ３ 底面 ４ 蓋 ５ パッキングａ ６ 細胞培養液 ７ 試料 ８ 対極 ９ 参照電極 １０ 電極差し込み口 １１ 穴明き栓 １２ 試料台 １３ ネジ １４ パッキングｂ １５ 電極 １６ 脚 １７ 脚 １８ ネジ穴 １９ 板 A Cell culture solution introduction part B Sample stand C Leg 1 Side wall 2 Hole 3 Bottom 4 Lid 5 Packing a 6 Cell culture solution 7 Sample 8 Counter electrode 9 Reference electrode 10 Electrode insertion port 11 Perforated plug 12 Sample stand 13 Screw 14 Packing b 15 Electrode 16 Leg 17 Leg 18 Screw hole 19 Plate
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−264497（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/30 C12Q 1/00 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-5-264497 (JP, A) (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 27/30 C12Q 1/00 JICST file ( JOIS)
Claims (8)
（Ｂ）を備え、細胞培養液導入部（Ａ）は、（ａ）側壁
と、（ｂ）細胞培養液を固体試料に接触させるための穴
部を持つ底面と、（ｃ）蓋を有し、試料台部（Ｂ）は、
試料の装脱着部を有していることを特徴とする電気化学
測定用セル。1. A cell culture solution introduction part (A) and a sample stage part (B) are provided, wherein the cell culture solution introduction part (A) comprises: (a) a side wall; A bottom surface having a hole for contacting the sample, and (c) a lid.
An electrochemical measurement cell having a sample attachment / detachment portion.
（ｂ）底面の穴部が固体試料の装脱着部方向に向かうに
したがって小さくなるような、すり鉢状の構造を有して
いることを特徴とする請求項１の電気化学測定用セル。2. In the cell culture solution introduction section (A),
(B) The cell for electrochemical measurements according to claim 1, wherein the cell has a mortar-like structure such that a hole portion on the bottom surface becomes smaller in a direction toward the attachment / detachment portion of the solid sample.
（ｃ）蓋に、対極および参照電極を差し込むための差し
込み口があることを特徴とする請求項１または２記載の
電気化学測定用セル。3. In the cell culture solution introduction section (A),
(C) The electrochemical measurement cell according to claim 1 or 2, wherein the lid has an insertion hole for inserting a counter electrode and a reference electrode.
脱着のための昇降機構が設けられていることを特徴とす
る請求項１ないし３のいずれかの電気化学測定用セル。4. The electrochemical measurement cell according to claim 1, wherein an elevation mechanism for loading and unloading a solid sample is provided in the sample stage (B).
した後、培養液を導入して、細胞培養および電気化学測
定を行なうことが可能とされていることを特徴とする１
ないし４のいずれかの電気化学測定用セル。5. A method comprising: mounting a solid sample; sterilizing the sample under high temperature and pressure; introducing a culture solution; and performing cell culture and electrochemical measurement.
Any one of the cells for electrochemical measurement according to any one of the above-described items 4 to 4.
ることが可能とされていることを特徴とする請求項１な
いし５のいずれかの電気化学測定用セル。6. The electrochemical measurement cell according to claim 1, wherein the cell can be kept at a constant temperature including the solid sample, the culture solution, and the electrodes.
測定用セルを、高温高圧下で滅菌し、細胞培養液を導入
して、試料表面域で細胞を培養し、同時に、またはその
後に、電気化学測定を行うことを特徴とする、細胞存在
下における電気化学測定方法。7. The cell for electrochemical measurements according to claim 1 is sterilized under high temperature and high pressure, a cell culture solution is introduced, and the cells are cultured on a surface area of the sample. Performing an electrochemical measurement in the presence of cells.
測定用セルを、高温高圧下で滅菌し、細胞培養液を導入
して、試料に荷電しながら試料表面域で細胞を培養する
ことを特徴とする細胞存在下における電気化学測定方
法。8. The method according to claim 1, wherein the cell for electrochemical measurement is sterilized under a high temperature and a high pressure, a cell culture solution is introduced, and the cell is cultured in a surface area of the sample while charging the sample. A method for electrochemical measurement in the presence of cells, characterized by the following.
Priority Applications (1)
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| JP35960999A JP3328696B2 (en) | 1999-11-12 | 1999-11-12 | Cell for electrochemical measurement in the presence of cells and electrochemical measurement method in the presence of cells |
Applications Claiming Priority (1)
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