JP3253633B2 - 哺乳動物ｃｔｌａ−８および関連薬剤の新規使用 - Google Patents

哺乳動物ｃｔｌａ−８および関連薬剤の新規使用

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 脊椎動物の免疫系は、多くの器官およびいくつかの異
なるタイプの細胞から構成される。２つの主要なタイプ
の細胞は、骨髄系統およびリンパ球系統を含む。リンパ
細胞系統においては、Ｂ細胞（胎児の肝臓または成人の
骨髄での分化として本来特徴付けられている）およびＴ
細胞（胸腺での分化として本来特徴付けられている）が
ある。例えば、Paul（編）（1993）Fundamental Immuno
logy（第３版）、Raven Press、New Yorkを参照のこ
と。
免疫応答または細胞分化の発達の多くの局面におい
て、サイトカインとして公知の可溶性タンパク質が、細
胞相互作用の調節において重要な役割を担う。これらの
サイトカインはまた、多くの方法で細胞の活性を媒介す
る。多くの場合、それらは、莫大な数の前駆細胞（prog
enitor）（免疫応答を担う系統を構成する）への造血幹
細胞の増殖、成長、および分化を調整することが示され
ている。それらはまた、免疫応答および生理において極
めて重要である。
しかし、これらの成熟経路において、異なる発達段階
の細胞により発現される細胞分子は、まだ完全には同定
されていない。さらに、シグナル分子の作用の役割およ
び機構（これらの細胞の種々の生理学的状態、発達状
態、または増殖状態を、誘導、維持、または調整する）
は、わずかしか理解されていない。明らかに、免疫系お
よび種々のストレスに対するその応答は、医薬に関連し
ている（例えば、感染症、ガン関連応答および処置、ア
レルギー応答ならびに移植拒絶反応）。例えば、Thorn
ら、Harrison's Principles of Internal Medicine、Mc
Graw/Hill、New Yorkを参照のこと。
医科学は、環境要因に対する不十分なまたは不都合な
生理学的応答についての治療に作用することにおいて、
免疫系の適切な動員または抑制に大きく依存している。
しかし、免疫系がどのように調節されるか、またはどの
ように分化するかについての理解の欠如は、生物学的攻
撃（すなわち、細菌、真菌、またはウイルス）に対する
免疫機構を有利に調整する能力を妨げてきた。従って、
関連細胞の発達または生理の、異常なまたは不適切な調
節により特徴付けられる医学的状態は、処理不能のまま
である。特定のサイトカインおよびそれらの生理学的効
果の発見および特徴付けは、免疫系、造血細胞、ならび
に他のタイプの細胞に影響を与える広範囲の変性状態ま
たは他の状態についての治療法の開発に貢献する。本発
明は、これらの問題および多くの他の問題のいくつかに
対する解決を提供する。
発明の要旨 本発明は、部分的に、免疫応答の種々のモデルにおけ
るCTLA−８の生理学的役割の発見に基づいている。特
に、CTLA−８の役割は、感染症、造血の発達、およびウ
イルス感染に関与する経路において説明されている。
本発明は哺乳動物Ｇ−CSF、ならびにCTLA−８および
／またはIL−６を含む組成物を包含する。好ましくは、
Ｇ−CSF、CTLA−８、およびIL−６は組換えヒトタンパ
ク質である。受容可能なキャリアを含む薬学的組成物も
また、意図される。
本発明はまた、例えば、微生物感染；敗血症；または
異常造血を羅患している動物を処置するために、組成物
を投与する方法を提供する。また、例えば、微生物感
染；敗血症；または異常造血を処置するために、単独で
CTLA−８を投与する方法を含む。特定の実施態様におい
て、CTLA−８は、末梢血液において好中球のレベルを増
加させ、および／またはCD34＋前駆細胞の好中球または
単球への分化を誘導する。
本発明は、胸部または腹部の外科手術に起因するグラ
ム陰性細菌感染（例えば、敗血症）から動物を防御する
ために、CTLA−８の有効量を投与する方法を含む。ま
た、例えば、細胞切除（cyto−ablative）治療；胸部外
科手術；または腹部外科手術前に、CTLA−８を投与する
方法が含まれる。
図面の簡単な説明 図１および図２は、造血前駆細胞におけるCTLA−８の
効果を示す。５μｇのCTLA−８を、C57BL6/Nマウスの１
組に７日間毎日注射した。同様に、マウスの別の組をＧ
−CSFで処置した。７日目に、処置したマウスから分離
した白血球を、照射したレシピエントに移動した。８日
目に、脾臓をcfu−ｓアッセイのために採取し、そして1
2日目に白血球をcfu−ｃアッセイのために集めた。これ
らの両方は、Johnsonら（1977）Proc.Nat'l.Acad.Sci.7
4:3879−3884に記載されている。
好適な実施態様の詳細な説明 I.一般原理 本発明は、機能的に重要なＴ細胞が発現した分子に特
徴的な特性を示す種々の哺乳動物のタンパク質をコード
するDNA配列を利用する。cDNA配列は、サイトカイン、
成長因子、および腫瘍遺伝子をコードするmRNAに特徴的
である種々の特徴を示す。本来、マウス（しかし、ここ
で、本明細書に記載のようにラットとして認識された）
由来であると思われるマウス遺伝子は、推定150アミノ
酸タンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ムを含む。このタンパク質は、ウイルス遺伝子（ヘルペ
スウイルス サイミリ（Saimiri）ORF13）によりコード
された推定タンパク質に57％相同である。メッセージ
を、Ｔ細胞に適用した差引きハイブリダイゼーション方
法を使用して単離した。
これらのタンパク質は、CTLA−８タンパク質と称され
る。天然のタンパク質は、標的細胞において生物学的ま
たは生理的応答を導く種々の生理学的応答を媒介し得る
はずである。最初の研究は、このタンパク質をコードす
るメッセージを、造血細胞の種々の細胞株に局在化し
た。抗原をコードする遺伝子を、マウス染色体1Aおよび
ヒト染色体2q31にマップした。マウスCTLA−８（ラッ
ト）の元の特徴付けは、Rouvierら（1993）J.Immunol.1
50:5445−5456に報告されている。他の哺乳動物種にお
けるタンパク質についての同様の配列もまた、利用可能
であるはずである（特に、マウスおよびヒト）。米国特
許出願第08/250,846号（WO95/18826の優先権の基礎出
願）；米国特許出願第08/177,747号（WO95/18826の優先
権の基礎出願）；および米国特許出願第08/077,203号を
参照のこと。
CTLA−８と共に粘着性ヒト滑液細胞（synovial cel
l）を培養することは、IL−６およびIL−８の産生をも
たらす。マウスに対する特定の細菌の攻撃は、敗血状態
についての受け入れられたモデルである。組換えIL−６
のIL−６ノックアウトマウスへの投与は、細菌の攻撃の
間、十分な防御効果を与える。従って、CTLA−８は、こ
のIL−６が媒介した防御の誘導において、重要な要因で
ある。いくつかの通常タイプの細菌感染に対する抵抗力
はまた、好中球の存在に強く依存する。動物のCTLA−８
を用いる予備処置（好中球増加を誘導することが可能で
ある）により、致死E.coli感染から完全に防御される。
Ｇ−CSFは、好中球の骨髄から末梢への放出を誘導する
が、これは比較的遅い効果である（例えば、数日に渡
る）。さらに、有意な数の患者（細胞切除治療に続いて
骨髄移植を受けた）は、Ｇ−CSFの末梢血液移動に関し
て屈折性であった。他方、CTLA−８およびIL−６は、好
中球の末梢上皮から循環系への放出を刺激する。これ
は、非常に早い効果である（例えば、数時間に渡る）。
CTLA−8/IL−６経路による好中球の移動は、より迅速
である。これは、早い回復が必要とされる疾患状態にお
いて明らかに有益である。例えば、外科手術（すなわ
ち、胸部または腹部手術）を受けた何人かの患者は、グ
ラム陰性細菌の感染またはグラム陰性細菌のクリアラン
スにより引き起こされる術後の敗血症発症を受ける。Be
rkow（編）The Merck Manual of Diagnosis and Therap
y、Merck ＆ Co.、Rahway、N.J.。処置は、敗血症性シ
ョックを避けるために、積極的でなければならず、かつ
結果は迅速でなければならない（例えば、数時間以
内）。CTLA−８およびＧ−CSF、IL−６およびＧ−CSFの
組合せの治療、またはCTLA−８単独の治療は、この迅速
な治癒を提供し得る。これらの組合せはまた、細胞切除
または外科的治療を受ける個体を、手順が実際に行われ
る恐らく数日前に、予備処置することにより、感染また
は敗血症に対する防御を付与することにおいて有用であ
り得る。
CTLA−８はまた、リウマチ様骨液球および腎臓上皮癌
腫細胞株による顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）の
分泌を誘導することが可能である（好中球における役割
を示唆する）。CTLA−８は、CD34＋前駆細胞の優勢的な
好中球集団への増殖および分化において著しい効果（表
面抗原の形態および発現パターンに基づく）を有する。
ガンの処置のために細胞切除治療を受ける患者は、しば
しばもたらされる好中球減少症の程度により制限される
投薬を受ける。これは、これらの患者を微生物（すなわ
ち、細菌または真菌）の感染に対して影響を受けやすく
し得る。従って、CTLA−８およびＧ−CSF、またはIL−
６およびＧ−CSFの組合せは、有効な造血細胞の再集団
形成を促進し得る。組合せは、効果が異なる経路を介し
て媒介されるようにみえるように、いずれか単独よりも
大きな効果を有する。
繊維芽細胞によるサイトカインの分泌の一般のアクチ
ベーターとして、CTLA−８は繊維芽細胞INF−βの分泌
を増強するようである。従って、これは、ウイルス感染
を制限する抗ウイルス状態の発達をもたらし得る。
以下の説明は、例示を目的として、マウス（ラットま
たはマウス）またはヒトCTLA−８タンパク質に関連して
いるが、さらに、他の種からの関連した実施態様に適用
可能である。
II.核酸 核酸の一般的な説明、それらの操作、およびそれらの
使用は、以下の参考文献において提供される：米国特許
出願第08/250,846号（WO95/18826の優先権の基礎出
願）；米国特許出願第08/177,747号（WO95/18826の優先
権の基礎出願）；米国特許出願第08/077,203号;PCT/US9
5/00001（WO95/18826）;Goodnow（1992）「トランスジ
ェニック動物」、Roitt（編）Encyclopedia of Immunol
ogy Academic Press、San Diego、1502−1504頁;Travis
（1992）Science 256:1392−1394;Kuhnら（1991）Scien
ce 254:707−710;Capecchi（1989）Science 244:1288;R
obertson（1987）（編）Teratocarcinomas and Embryon
ic Stem Cells:A Practical Approach IRL Press、Oxfo
rd;Rosenberg（1992）J.Clinical Oncology 10:180−19
9;ならびに、CournoyerおよびCaskey（1993）Ann.Rev.I
mmunol.11:297−329;WetmurおよびDavidson（1968）J.M
ol.Biol.31:349−370;これらのいずれも参考として引用
する。さらなる局面は、本明細書中で提供される技術を
参照すると、当業者には明らかである。
III.精製CTLA−８タンパク質 薬学的または生化学的背景において、タンパク質およ
びポリペプチドの一般的な説明は、例えば:Goodmanら
（編）（1990）Goodman ＆ Gilman's:The Pharmacologi
cal Bases of Therapeutics（第８版）、Pergamon Pres
s;Freifelder（1982）Physical Biochemistry（第２
版）、W.H.Freeman;CantorおよびSchimmel（1980）Biop
hysical Chemistry、パート１−３、W.H.Freeman ＆ C
o.、San Francisco、において見出され得る。ラットCTL
A−８、マウスCTLA−８、およびヒトCTLA−８の特定の
説明は、例えば、Rouvierら（1993）J.Immunol.150:544
5−5456;米国特許出願第08/250,846号（WO95/18826の優
先権の基礎出願）；米国特許出願第08/177,747号（WO95
/18826の優先権の基礎出願）；米国特許出願第08/077,2
03号;PCT/US95/00001（WO95/18826）に見出される。
IV.CTLA−８タンパク質の作製；模擬体 CTLA−８タンパク質またはそのフラグメントをコード
するDNAは、化学合成、cDNAライブラリーのスクリーニ
ングによって、または広範囲の種々の細胞株または組織
サンプルから調製されたゲノムライブラリーをスクリー
ニングすることによって得られ得る。
このDNAは、以下の文献に記載のように広範囲の種々
の発現系において発現され得る。例えば、米国特許出願
第08/250,846号（WO95/18826の優先権の基礎出願）；米
国特許出願第08/177,747号（WO95/18826の優先権の基礎
出願）；米国特許出願第08/077,203号;PCT/US95/00001
（WO95/18826）;Kaufmanら（1985）Molec.and Cell.Bio
l.5:1750−1759;Pouwelsら（1985および増刊）Cloning
Vectors:A Laboratory Manual、Elsevier、N.Y.、Rodri
quezら（1988）（編）Vectors:A Survey of Molecular
Cloning Vectors and Their Uses、Buttersworth、Bost
on、MA;RodriguezおよびDenhardt（編）Vectors:A Surv
ey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses、Bu
ttersworth、Boston、第10章、205−236頁;Okayamaら
（1985）Mol.Cell Biol.5:1136−1142;pMClneo Poly−
Ａ、Thomasら（1987）Cell 51:503−512;O'Reillyら（1
992）Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory M
anual Freeman and Co.、CRC Press、Boca Raton、Fla;
Low（1989）Biochim.Biophys.Acta 988:427−454;Tseら
（1985）Science 230:1003−1008;およびBrunnerら（19
91）J.Cell Biol.114:1275−1283を参照のこと；これら
のいずれも、参考として援用する。
CTLA−８タンパク質が特徴付けられているので、その
フラグメントまたはその誘導体は、ペプチド合成のため
の従来のプロセスにより調製され得る。これらは、以下
の文献に記載のようなプロセスを含む。例えば、Stewar
tおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesi
s、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL;Bodanszkyおよ
びBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthes
is、Springer−Verlag、New York;Bodanszky（1984）Th
e Principles of Peptide Synthesis、Springer−Verla
g、New York;および、Merrifieldら（1963）J.Am.Chem.
Soc.85:2149−2156;これらのいずれも、参考として援用
する。さらなる局面は、本明細書中で提供される技術を
参照すると、当業者には明らかである。
V.物理的改変体 CTLA−８タンパク質のアミノ酸配列と実質的なアミノ
酸配列相同性を有するタンパク質またはペプチドもま
た、意図される。改変体は、種改変体または対立遺伝子
改変体を含む。相同性または配列の同一性は、以下の文
献において定義される。例えば、米国特許出願第08/25
0,846号（WO95/18826の優先権の基礎出願）；米国特許
出願第08/177,747号（WO95/18826の優先権の基礎出
願）；米国特許出願第08/077,203号;PCT/US95/00001（W
O95/18826）;Needlehamら（1970）J.Mol.Biol.48:443−
453;Sankoffら（1983）Time Warps、String Edits、and
Macromolecules:The Theory and Practice of Sequenc
e Comparison、第１章、Addison−Wesley、Reading、M
A;IntelliGenetics、Mountain View、CAからのソフトウ
ェアパッケージ；および、Wisconsin Genetics Compute
r Group大学、Madison、WIのソウトウェアパッケージ。
CTLA−８タンパク質をコードする単離されたDNAは、
以下の文献に記載のように容易に改変され得る。例え
ば、米国特許出願第08/250,846号（WO95/18826の優先権
の基礎出願）；米国特許出願第08/177,747号（WO95/188
26の優先権の基礎出願）；米国特許出願第08/077,203
号;PCT/US95/00001（WO95/18826）;Sambrookら（1989）
およびAusubelら（1987および増刊）;Cunninghamら（19
89）Science 243:1330−1336;O'Dowdら（1988）J.Biol.
Chem.263:15985−15992;および、Carruthers（1981）Te
tra.Letts.22:1859−1862;これらのいずれも、参考とし
て援用する。さらなる方法は、本明細書中で提供される
技術を参照すると、当業者には明らかである。
VI.機能的改変体 CTLA−８タンパク質に対する生理学的応答のブロック
キングは、天然CTLA−８の改変体による抗原のその天然
の結合パートナーへの結合の阻害からもたらされ得る。
このような改変体を作製するための方法は、以下の文献
に記載されている。例えば、米国特許出願第08/250,846
号（WO95/18826の優先権の基礎出願）；米国特許出願第
08/177,747号（WO95/18826の優先権の基礎出願）；米国
特許出願第08/077,203号;PCT/US95/00001（WO95/1882
6）;Godowskiら（1988）Science 241:812−816;Beaucag
eおよびCarruthers（1981）Tetra.Letts.22:1859−186
2;Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory
Manual（第２版）、第１−３巻、Cold Spring Harbor
Laboratory;Merrifield（1963）J.Amer.Chem.Soc.85:21
49−2156;Merrifield（1986）Science 232:342−347;At
hertonら（1989）Solid Phase Peptide Synthesis:A Pr
actical Approach、IRL Press、Oxford;Cunninghamら
（1989）Science 243:1339−1336;O'Dowdら（1988）J.B
iol.Chem.263:15985−15992;および、Lechleiterら（19
90）EMBO J.9:4381−4390;これらのいずれも、参考とし
て援用する。さらなる方法は、本明細書中で提供される
技術を参照すると、当業者には明らかである。
VII.抗体 抗体は、種々のCTLA−８タンパク質（種改変体または
対立遺伝子改変体、およびそのフラグメントを、それら
の天然に存在する形態およびそれらの組換え形態の両方
を含む）に対して惹起され得る。さらに、抗体は、CTLA
−８タンパク質のそれらの活性形態か、または不活性形
態のいずれかに対して惹起され得る。抗イディオタイプ
抗体もまた、意図される。抗体を産生するための方法、
結合組成物およびそれらを使用するための方法は、以下
の文献に記載されている。例えば、米国特許出願第08/2
50,846号（WO95/18826の優先権の基礎出願）；米国特許
出願第08/177,747号（WO95/18826の優先権の基礎出
願）；米国特許出願第08/077,203号;PCT/US95/00001（W
O95/18826）;Coligan（1991）Current Protocols in Im
munology Wiley/Greene;HarlowおよびLane（1989）Anti
bodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Pres
s;Chan（編）（1987）Immunoassay:A Practical Guide
Academic Press、Orlando、Fla.;Ngo（編）（1988）Non
isotopic Immunoassay Plenum Press、NY;PriceおよびN
ewman（編）（1991）Principles and Practice of Immu
noassay Stockton Press、NY;Microbiology Hoeber Med
ical Division、HarperおよびRow、1969;Landsteiner
（1962）Specificity of Serological Reactions、Dove
r Publications、New York、Williamsら（1967）Method
s in Immunology and Immunochemistry、第１巻、Acade
mic Press、New York;Stitesら（編）Basic and Clinic
al Immunology（第４版）、Lange Medical Publication
s、Los Altos、CA、および本明細書中で引用される参考
文献;HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Laborato
ry Manual、CSH Press;Goding（1986）Monoclonal Anti
bodies:Principles and Practice（第２版）Academic P
ress、New York;KohlerおよびMilstein（1975）Nature
256:495−497;Huseら（1989）「λファージにおけるイ
ムノグロブリンレパートリーの大コンビナトリアルライ
ブラリーの生成」、Science 246:1275−1281;Wardら（1
989）Nature 341:544−546;米国特許第3,817,837;同第
3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同
第4,277,437号；同第4.275,149号；および同第4,366,24
1号；ならびに、Cabilly、米国特許第4,816,567号；こ
れらのいずれも、参考として援用する。さらなる方法
は、本明細書中で提供される技術を参照すると、当業者
には明らかである。
VIII.使用 哺乳動物CTLA−８は、種々の治療的使用（すなわち、
敗血症の処置；造血の発達；またはウイルス状態の処
置）を有する。CTLA−８の有効量の投与は、代表的に
は、少なくとも約100ng/kg体重；通常は、少なくとも約
１μg/kg体重；および、しばしば約1mg/kg体重未満；ま
たは、好ましくは約10mg/kg体重未満である。有効量
は、代表的に、少なくとも約10％；通常は、少なくとも
約20％；好ましくは、少なくとも約30％；または、より
好ましくは、少なくとも約50％、症状を減退させる。本
発明は、さらなる診断および治療の適用（本明細書中の
他の箇所に、例えば、生理学的もしくは発生学的な異常
性についての一般的な記載、または以下の診断のための
キットの説明において記載される）において使用が見出
される薬剤を提供する。以下の文献を参照のこと。例え
ば、米国特許出願第08/250,846号（WO95/18826の優先権
の基礎出願）；米国特許出願第08/177,747号（WO95/188
26の優先権の基礎出願）；米国特許出願第08/077,203
号;PCT/US95/00001（WO95/18826）;Berkow（編）The Me
rck Manual of Diagnosis and Therapy、Marck ＆ C
o.、Rahway、N.J.;Thornら、Harrison's Principles of
Internal Medicine、McGraw−Hill、NY;Gilmanら
（編）（1990）Goodman and Gilman's:The Pharmacolog
ical Bases of Therapeutics、第８版、Pergamon Pres
s;Remington's Pharmaceutical Sciences、第17版（199
0）Mack Publishing Co.、Easton、Penn;Langer（199
0）Science 249:1527−1533;Merck Index、Merck ＆ C
o.、Rahway、New Jersey;Avisら（編）（1993）Pharmac
eutical Dosage Forms:Parenteral Medications、第２
版、Dekker、NY;Liebermanら（編）（1990）Pharmaceut
ical Dosage Forms:Tablets、第２版、Dekker、NY;Lieb
ermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:D
isperse Systems Dekker、NY;Fodorら（1991）Science
251:767−773、Coligan、Current Protocols in Immuno
logy;Hoodら、Immunology Benjamin/Cummings;Paul
（編）Fundamental Immunology;Methods in Enzymology
Academic Press;Parceら（1989）Science 246:243−24
7;Owickiら（1990）Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 87:4007
−4011;ならびに、BlundellおよびJohnson（1976）Prot
ein Crystallography、Academic Press、New York;これ
らのいずれも、参考として援用する。さらなる使用は、
本明細書中で提供される技術を参照すると、当業者には
明らかである。
IX.キット 本発明はまた、CTLA−８タンパク質の使用、そのフラ
グメントの使用、ペプチドの使用を意図しており、そし
てそれらの融合産物もまた、以下の参考文献に記載され
るように、結合組成物の存在を検出するための種々の診
断キットおよび方法において使用され得る。例えば、米
国特許出願第08/250,846号（WO95/18826の優先権の基礎
出願）；米国特許出願第08/177,747号（WO95/18826の優
先権の基礎出願）；米国特許出願第08/077,203号;PCT/U
S95/00001（WO95/18826）;HarlowおよびLane（1988）An
tibodies:A Laboratory Manual、CSH;米国特許第3,645,
090号；米国特許第3,940,475号;Rattleら（1984）Clin.
Chem.30:1457−1461:米国特許第4,659,678;およびViall
etら（1989）Progress in Growth Factor Res.1:89−9
7;これらのいずれも、参考として援用する。
本発明の大まかな範囲が以下の実施例に関して最も理
解されるが、これらは本発明を特定の実施態様に限定す
ることを意図しない。
実施例 I.一般的方法 標準方法のいくつかは、例えば、以下の文献に記載ま
たは参照される。Maniatisら（1982）Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborato
ry、Cold Spring Harbor Press;Sambrookら（1989）Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual、（第２版）、第
１〜３巻、CSH Press、NY;Ausubelら、Biology、Greene
Publishing Associates、Brooklyn、NY;または、Ausub
elら（1987および増刊）Current Protocols in Molecul
ar Biology Greene/Wiley、New York;Innisら（編）（1
990）PCR Protocols:A Guide to Methods and Applicat
ions Academic Press、N.Y.。タンパク質の精製方法
は、硫酸アンモニウム沈澱、カラムクロマトグラフィ
ー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法を含
む。例えば、以下を参照のこと。Ausubelら（1987およ
び定期的増刊）;Deutscher（1990）「タンパク質精製の
手引き」、Methods in Enzymology、第182巻、およびこ
のシリーズにおける他の巻；ならびに製造業者のタンパ
ク質精製製品の使用説明書、例えば、Pharmacia（Pisca
taway、N.J.）またはBio−Rad（Richmond、CA）。組換
え技術との組合せは、適切なセグメント（例えば、FLAG
配列またはプロテアーゼによって除去可能な配列を介し
て融合され得る等価物）への融合を可能にする。例え
ば、以下を参照のこと。Hochuli（1989）Chemische Ind
ustrie 12:69−70;Hochuli（1990）「金属キレート吸収
剤を用いる組換えタンパク質の精製」Setlow（編）Gene
tic Engineering,Principle and Methods 12:87−98、P
lenum Press、N.Y.;およびCroweら（1992）QIAexpress:
The High Level Expression ＆ Protein Purification
System、QUIAGEN、Inc.、Chatsworth、CA。
FACS解析は、以下に記載されている。Melamedら（199
0）Flow Cytometry and Sorting Wiley−Liss、Inc.、N
ew York、NY;Shapiro（1988）Practical Flow Cytometr
y Liss、New York、NY;およびRobinsonら（1993）Handb
ook of Flow Cytometry Methods Wiley−Liss、New Yor
k、NY。
II.CTLA−８タンパク質をコードするDNAクローンの単離 マウスCTLA−８の単離は、Rouvierら（1993）J.Immun
ol.150:5445−5456に記載されている。また、米国特許
出願第08/077,203号を参照のこと。
CTLA−８メッセージの供給源 種々の細胞株を、適切なプローブを用いて、高いレベ
ルのメッセージの発現についてスクリーニングをする。
適切な細胞株を、CTLA−８メッセージの発現レベルに基
づいて選択する。出願人らは、活性化された細胞傷害性
Ｔ細胞について差引きハイブリダイゼーション方法を使
用した。
CTLA−８をコードするクローンの単離 標準PCR技術を使用して、ゲノムライブラリーまたはc
DNAライブラリーからの、あるいはmRNAからのCTLA−８
遺伝子配列を増幅する。適切なプライマーを、記載され
た配列から選択し、そして完全長のクローンを単離す
る。種々の長さの、そしておそらく配列において差異を
有する、種々の組合せのプライマーが調製され得る。完
全長のクローンがハイブリダイゼーションプローブとし
て使用され得、ストリンジェントなまたはストリンジェ
ンシーがより低いハイブリダイゼーションの条件を使用
して、他の相同遺伝子に対してスクリーニングされる。
別の方法において、オリゴヌクレオチドはライブラリ
ーをスクリーニングするために使用される。ポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）技術と組み合わせて、適切な配向の
合成オリゴヌクレオチドがライブラリーから適当なクロ
ーンを選択するためのプライマーとして使用される。
III.ヒトCTLA−８の単離 ヒトゲノムライブラリーを、Clontech（カタログ番号
HL1006d）から入手し、マウスCTLA−８の配列を完全に
コードする453塩基対からなるcDNAプローブを用いてス
クリーニングした。多くの独立したλクローンが、マウ
スCTLA−８プローブと強くハイブリダイズすることが見
出された。１つのクローンは、およそ2000塩基対のハイ
ブリダイズしているXba Iフラグメント（これは、ヒト
ゲノムDNAのサザンブロットで同様のプローブを使用し
て以前に検出されたフラグメントとに対応する）を含
む。この2000塩基対のフラグメントをBluescript（Stra
tagene）にサブクローンし、そして配列決定した。これ
は、マウスCTLA−８に83.8％相同である240塩基対領域
を示した。この領域の翻訳は、マウスCTLA−８推定タン
パク質の79個のカルボキシ未満アミノ酸に70.8％相同で
あるアミノ酸配列を生じた。エキソンをプローブとして
使用し、コードする領域の最後の21個のヌクレオチドに
対応するプライマーで作製されたcDNAライブラリーをス
クリーニングした。３つの独立したcDNAクローンが、ヒ
トCTLA−８を完全にコードする領域を含んで得られた。
468塩基対のオープンリーディングフレームは、理論的
分子量17,100ダルトンを有する155アミノ酸ポリペプチ
ドをコードする。このヒトCTLA−８は、ウイルスのORF
−13に66.4％相同であり、そしてマウスCTLA−８がコー
ドされるタンパク質に58.3％相同である。さらに、６個
のシステインが、３つの遺伝子の間で保存されており、
ならびに推定されるグリコシル化およりリン酸化部位も
保存されている。
ヒトCTLA−８のアミノ酸配列の分析は、シグナルペプ
チドに類似する、アミノ末端の19残基（７から約25ま
で）の疎水的ストレッチを明らかにした。ヒトCTLA−８
は、サイトカインに類似する分子量の分泌タンパク質で
ある可能性が高い。米国特許出願第08/077,203号を参照
のこと。
IV.CTLA−８タンパク質の生化学的特徴付け ２つのヒトCTLA−８の形態を、異種細胞において発現
した；天然形態、およびカルボキシ末端でFLAGペプチド
を示す組換え形態。例えば、Croweら（1992）QIAexpres
s:The High Expression and Protein Purification Sys
tem QIAGEN、Inc.Chatsworth、CA;およびHoppら（198
8）Bio/Technology 6:1204−1210を参照のこと。これら
の２つのヒトCTLA−８タンパク質の形態を、発現ベクタ
ーpME18SまたはpEE12に導入し、次いでエレクトロポー
レーションによりCOS−７細胞またはNSO細胞にそれぞれ
トランスフェクトした。エレクトロポーレートされた細
胞を、次いで10％ウシ胎児血清を補充したRPMI培地で48
時間培養した。次いで、細胞のタンパク質を標識するた
めに、細胞を35S−メチオニンおよび35S−システインと
共にインキュベートした。還元条件下のSDS−PAGEでの
タンパク質の比較は、ヒトCTLA−８によってトランスフ
ェクトされた細胞が15,000ダルトンのポリペプチドを分
泌することを示した。非還元のSDS−PAGEは、28,000ダ
ルトン付近および33,000ダルトン付近の２つの特異的バ
ンドを示した。エンドグリコシダーゼＦ（Boehringer M
annheim）処理は、より高い分子量種が、ヒトCTLA−８
のＮ−グリコシル化された形態を表すことを証明した。
活性化CD4＋Ｔ細胞により産生されたヒトCTLA−８の
天然形態もまた、トランスフェクトされたCOS−７細胞
またはNSO細胞のものと同様に二量体として分泌される
かどうかを決定するために、末梢血液単核細胞（PBMC）
を、Ficoll勾配で500mlのヒト血液から精製した、Ｂ細
胞、CD8＋Ｔ細胞、単球、およびNK細胞を、抗CD19、抗C
D8、抗CD14、および25μｇのNKH1モノクローナル抗体
（Coulter、Hialeah、FL）を含む100μｌの腹水液（asc
itic fluid）を使用して涸渇した。４℃で30分間のイン
キュベーションの後、PBMCを10％ウシ胎児血清（FCS）
を含むRPMIで２回洗浄した。マウスIgGに対するヤギ抗
体でコートされた常磁性ビーズ（Dynabeads M450、Dyna
l、Oslo、Norway）を、最終濃度５ビーズ／涸渇される
細胞で添加した。次いで、所望でない細胞を、磁石に３
回通して除去した。残留する細胞は、87％純度のCD4＋
細胞であって、これを10％FCS、10ng/mlのPMA（Sigma、
St.Louis、MO）および500ng/mlのイオノマイシン（Sigm
a、St.Louis、MO）を含むDMEM F12（Gibco、Gaithersbu
rg、MD）で107細胞/mlに希釈した。５％のCO2中、37℃
で４時間のインキュベーションの後、培地を、透析され
た１％FCS、10ng/mlのPMAおよび500ng/mlのイオノマイ
シンを補充したメチオニンおよびシステイン非含有のDM
EM（ICN Biomedicals、Costa Mesa、CA）に変更し、５
％のCO2中、37℃で１時間インキュベーションした。100
μCi/mlの35S−メチオニンおよび35S−システイン（Ame
rsham）を添加し、代謝的標識を、５％のCO2中、37℃で
18時間行った。抗IFN−γ Mab B27および0.5mlのProtei
n−G Sepharose（Sigma St.Louis、MO）による上清の予
備洗浄に続いて、上清をヒトCTLA−８に対するモノクロ
ーナル抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降したタン
パク質をSDS−PAGEで分析した。CD4＋Ｔ細胞およびトラ
ンスフェクトされたNSO細胞は、それぞれヒトCTLA−８
二量体の非Ｎ−グリコシル化形態およびＮ−グリコシル
化形態に対応する28,000ダルトンおよび33,000ダルトン
の２つのバンドを示した。それゆえ、トランスフェクト
されたNSO細胞由来のヒトCTLA−８および活性化された
Ｔ細胞から単離したCTLA−８は、同一の生物学的特徴を
示す。
V.ヒトCTLA−８の大量産生 生物学的アッセイのために、ヒトCTLA−８およびヒト
CTLA−８−FLAGを、１％Nutridoma HU（Boeringer Mann
heim、Mannheim、Germany）を補充したRPMI培地で増殖
したトランスフェクトされたCOS−７細胞を用いて大量
に産生し、次いで精製した。
天然のヒトCTLA−８またはヒトCTLA−８−FLAGをより
大量に産生するために、NSO細胞の安定な形質転換体をC
elltechにより開発された方法論（Slough、Berkshire、
UK;国際特許出願第WO86/05807号、同第WO87/04462号、
同第WO89/01036号、および同第WO89/10404号）に従って
調製した。CTLA−８およびCTLA−８−FLAGの両方をpEE1
2にサブクローンし、次いでエレクトロポーレーション
によりNSO細胞にトランスフェクトした。トランスフェ
クトされたNSO細胞を、Celltechのプロトコルに記載の
ように、10％ウシ胎児血清を補充したグルタミン非含有
の選択培地に播種した。最もよく産出している細胞株由
来の上清を、ヒトCTLA−８およびヒトCTLA−８−FLAGの
生物学的アッセイおよび精製に使用した。
ヒトCTLA−８タンパク質の精製 代表的に、ヒトCTLA−８またはヒトCTLA−８−FLAGを
含む上清1lを、Chelating Sepharose Fast Flow matrix
（Pharmacia、Upsalla、Sweden）にZn++イオンを吸着さ
せたカラム（60ml）に通した。10倍容量の結合緩衝液
（His−Bind Buffer kit、Novagen、Madison、WI）を用
いて洗浄後、金属イオンにより保持されたタンパク質
を、20〜100mMのイミダゾール勾配を用いて溶出した。
溶出画分中のヒトCTLA−８−FLAG含量を、抗FLAGモノク
ローナル抗体M2を使用するドットブロット（Eastman Ko
dak、New Haven、CT）により測定した。一方、ヒトCTLA
−８の含量を、非還元SDS−PAGEの銀染色により評価し
た。次いで、CTLA−８含有画分をプールし、そしてPBS
に対して透析した。そして、これらを、生物学的アッセ
イにおいて使用するかまたはDEAEカラムでの陰イオン交
換HPLCによるさらなる精製に使用した。ゲル濾過クロマ
トグラフによる第３工程を、SUPERDEX G−75 HRD30カラ
ム（Pharmacia Uppsala、Sweden）で実施し、そして銀
染色したSDS−PAGEにより分析した限り実質的に純水な
ヒトCTLA−８を得た。
CTLA−８に特異的な抗体の調製 純系のBalb/cマウスを、０日目にFreund完全アジュバ
ンド中に乳化した1mlの精製ヒトCTLA−８−FLAGによっ
て、および15日目および22日目にFreund不完全アジュバ
ンド中に乳化した1mlの精製ヒトCTLA−８−FLAGによっ
て腹腔内面免疫した。このマウスを、0.5mlの精製ヒトC
TLA−８−８を静脈内に投与することによって追加免疫
した。
ハイブリドーマを、非分泌ミエローマ細胞株SP2/0−A
g8および融合剤としてポリエチレングリコール1000（Si
gma、St.Louis、MO）を使用して作製した。ハイブリド
ーマ細胞を96ウェルのFalcon組織培養プレート（Becton
Dickinson、NJ）に入れ、そして80μg/mlのゲンタマイ
シン、2mMのグルタミン、10％ウマ血清（Gibco、Gaithe
rsburg、MD）、１％ADCM（CRTS、Lyon、France）、10-5
Mのアザセリン（Sigma、St.Louis、MO）および５×10-5
Mのヒポキサンチンで補充したDMEM F12（Gibco、Gaithe
rsburg、MD）を与えた。ハイブリドーマ上清を、ヒトCT
LA−８に対する抗体産生について、アセトン固定化ヒト
CTLA−８トランスフェクトCOS−７細胞を使用する免疫
組織化学（ICC）により、およびコーティング抗原とし
てCOS−７上清から精製したヒトCTLA−８−FLAGを使用
するELISAにより、スクリーニングした。陽性細胞クロ
ーンのアリコートを、６日目拡大して低温保存し、なら
びに、プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン、Sigma、St.Louis、MO）処理したBalb/cマウス（1
5日前にプリスタンの腹腔内注射を受けた）由来の腹水
中で増殖させた。1mlのPBS中の約105のハイブリドーマ
細胞を腹腔内に投与し、そして10日後、腹水を各マウス
から集めた。
腹水の遠心分離後、抗体画分を硫酸アンモニウム沈澱
および20mM Tris（pH8.0）で平衡化したZephyr−Ｄケイ
素カラム（IBF Sepracor）での陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより単離した。タンパク質をNaCl勾配（０〜
1MのNaCl範囲）を用いて溶出した。2mlの画分を集め、
そして抗CTLA−８抗体の存在についてELISAにより試験
した。特異的な抗CTLA−８活性を含む画分をプールし、
透析し、そして凍結した。精製モノクローナル抗体のア
リコートを、ペルオキシダーゼ標識した。
ヒトCTLA−８の定量 CTLA−８に特異的な抗体の中で、Ab25およびペルオキ
シダーゼ標識したAb16を選択し、サンドイッチアッセイ
を使用してヒトCTLA−８のレベルを定量した。精製Ab25
を、コーティング緩衝液（炭酸塩緩衝液、pH9.6、15mM
Na2CO3、35mM NaHCO3）中で２μg/mlに希釈した。この
希釈溶液を、96ウェルELISAプレート（Immunoplate Max
isorp F96 certified、NUNC、Denmark）のウェル上で室
温で終夜コートした。次いで、このプレートを、リン酸
緩衝化生理食塩水および0.05％Tween20（Technicon Dia
gnositics、USA）からなる洗浄緩衝液を用いて手で１回
洗浄した。TBS−Ｂ−Ｔ緩衝液（20mM Tris、150mM NaC
l、１％BSA（Sigma、St.Louis、MO）、および0.05％Twe
en 20）で希釈した110μｌの精製ヒトCTLA−８を各ウェ
ルに添加した。37℃で３時間インキュベーションした
後、プレートを１回洗浄した。TBS−Ｂ−Ｔ緩衝液にお
いて５μg/mlまで希釈した100μｌのペルオキシダーゼ
標識Ab16を各ウェルに添加し、そして２時間、37℃でイ
ンキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液で３回
洗浄した。クエン酸／リン酸緩衝液において1mg/mlまで
希釈した100μｌのペルオキシダーゼの基質（2,2'アジ
ノ−ビス（３エチルベンズチアゾイン−６−スルホン
酸）（ABTS））を各ウェルに添加し、そして比色反応物
を405nmで読み取った。検出されたヒトCTLA−８の最低
濃度は、0.015ng/mlであった。
V.CTLA−８を有する種々のタイプの細胞の処理によるIL
−６分泌の誘導 腎臓上皮癌腫細胞株（TUMTおよびCHA）もまた、2mM L
−グルタミン、100U/mlペニシリン、50μg/mlゲンタマ
イシン、20mM Hepes緩衝液および加熱不活性化された10
％FCSを補充したRPMI 1640完全培地（Gibco BRL、Grand
Island、NY）で培養した。細胞（104細胞／ウェル）
を、96ウェルプレート（Falcon）において最終容量250
μｌの完全培養培地でインキュベートした。増加する濃
度のヒトCTLA−８を、培養の開始に添加した。細胞非含
有上清を、48時間後に集め、そしてサイトカインアッセ
イまで−20℃で保存した。IL−６レベルを、Abramsら
（1992）Immunol.Rev.127:5−24に記載のように２部位
サンドイッチELISA（two−site sandwich ELISA）によ
り測定した。両方の細胞株は、IL−６の分泌において、
増加する濃度のCTLA−８による用量依存性の増加を示し
た。これらの結果を考慮すると、他の細胞株もまた、CT
LA−８の他の改変体種に対する応答について、スクリー
ニングされる。
ヒト肺繊維芽細胞MRC−５をATCC（Rockville、MD）か
ら入手し、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、50
mg/mlゲンタマイシン、20mM Hepes緩衝液および加熱不
活性化された10％FCSを補充したRPMI 1640完全培地（Gi
bco BRL、Grand Isiand、NY）で培養した。細胞（104細
胞／ウェル）を、96ウェルプレート（Falcon）において
最終容量250μｌの完全培養培地でインキュベートし
た。増加する濃度のヒトCTLA−８−８を、培養の開始に
添加した。48時間後に細胞非含有上清を集め、そしてサ
イトカインアッセイまで−20℃で保存した。IL−６レベ
ルをELISAにより測定した。IL−６の用量依存性の誘導
が観察された。
同様の結果を、成人および子供の真皮繊維芽細胞、ヒ
ト脳上皮細胞、およびヒト気管支誌上皮細胞を使用して
得られた。腎臓糸球体細胞は同様に応答するはずであ
る。
VI.造血におけるCTLA−８の効果 ヒトCD34＋前駆細胞を、通常送達の間に集めた索血液
から得た。光密度単核細胞を、Ficoll−Hypaque勾配で
濃厚にした。次いで、CD34抗原を有する細胞を、パンニ
ング工程を除く例えば、Saelandら（1988）Blood 72:15
80−1588の記載のように陽性選択により単離した。パン
ニング工程は、MACSマグネチックマイクロビーズに結合
した抗CD34mAbおよびミニMACSマグネット（Miltenyi Bi
otec、Inc.Sunnyvale、CA）により置換された。
リウマチ様骨液球を、96ウェルプレートにおいて10％
FCSを補充したRPMI 1640完全培地に10,000細胞／ウェル
の密度で播種した。５％のCO2中、37℃で１日培養した
後、これらの細胞を4000ラドにて照射した。次いで、精
製hCTLA−８または対応するタンパク質標準を最終濃度1
00ng/mlで添加した。精製CD34＋細胞を、同時に添加
し、そして21日目まで同時培養（co−culture）した。
８から21日間の同時培養の後、hCTLA−８は、CD34＋
の好中球への増殖および分化を有意に増強した。May−G
rnwald−Giemsa染色は、好中球に特有な多形核細胞の
出現を示した。これらの細胞のFACS解析もまた、好中球
の表現型と一致する表面抗原（すなわち、CD14、CD15、
CD16、およびCD33）の発現を示した。単球様細胞もま
た、May−Grnwald−Giemsa染色、およびFACS解析によ
るCD14＋細胞の存在によって示されるように検出され
た。
VII.CTLA−８はＧ−CSFの分泌を誘導する 関節炎リウマチの患者由来の骨液球および腎臓癌腫細
胞（104細胞／ウェル）を、増加する濃度のヒトCTLA−
８とともにインキュベートした。48時間後、Ｇ−CSFの
濃度を標準的なELISA技術（ＲおよびＤシステム）によ
り測定した。Ｇ−CSFの分泌は、両方のタイプの細胞に
おいて有意に増強された。このように、CTLA−８の一部
の効果もまた、Ｇ−CSF誘導の機構を通して作用し得る
（効果の動力学は異なることもあり得るが）。
VIII.CTLA−８のインビボ活性 組換え、精製、エンドトキシン非含有マウスCTLA−８
を、通常のC57BL/6マウスに、３日間毎日10μg/マウス
の濃度で皮下投与した。血液パラメーターを日々評価し
た。末梢血液の好中球に生じる用量依存性は、CTLA−８
処理された動物において観察された。
細菌の攻撃からの防御 凍結乾燥した病原性ヒトE.coli単離物（American Typ
e Culture Collection、バッチ番号93−10SV）を、1ml
の無菌LBブロスに再構成した。1:10希釈物を、37℃で終
夜培養し、1:20に希釈し、そして４時間培養し、対数細
菌増殖期を得た。次いで、培養物を2000rpmで10分間遠
心分離し、ペレットを凍結培地（すなわち、10％グリセ
ロールを有するPBS）中に再懸濁した。培養物を低温用
バイアルにアリコートし、そしてフラッシュ凍結（flas
h freeze）した。１つのバイアルを融解し、1:10に希釈
し、そして細菌力価を得るためにプレートし、細菌力価
をコロニー形成単位（cfu）で測定した。さらに、細菌
を通常C57BL6/Nマウスで力価測定し、致死量（LD）を決
定した。
CTLA−８の防御能力を10μｇのCTLA−８を用いた予備
処理により評価し、次いで３時間後に２×107cfuの細菌
を腹腔内注射した。マウスを18時間後に屠殺し、そして
肝臓の同じ部分を取り出し、プールし、そして10mlの無
菌PBS中でホモジナイズした。ホモジネートを10-1〜10
-7に希釈し、次いでLB寒天プレート上に、２連で、プレ
ートした。37℃で終夜インキュベーションした後、細菌
総数を評価した。CTLA−８予備処理マウスは、非処理の
標準動物よりも２〜３オーダー低い細菌総数を与えた、
平行して、マウスの第２群を上記のように処理し、そし
て死亡率を測定した。変化する濃度のCTLA−８（すなわ
ち、１μｇ、５μｇ、および10μｇで）もまた、評価し
た。致死細菌感染に対する用量依存性防御効果を、CTLA
−８を用いて処理したマウスにおいて観察した。
末梢血液の移動 ５μｇのCTLA−８を、C57BL6/Nマウスの１組に７日間
毎日注射した。同様に、マウスの別の組をＧ−CSFによ
って処理した。７日目に、処理したマウス由来の分離し
た白血球を、照射したレシピエントに移した。８日目
に、脾臓をcfu−ｓアッセイのために採取した。Johnson
ら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.74:3879−3884を参照のこ
と。２つのアッセイは、CTLA−８がＧ−CSFと同一経路
において骨髄前駆細胞を移動するかどうかを決定し得
る。
IX.CTLA−８の抗ウイルス活性 ウイルス学および組織培養における標準技術を、CTLA
−８の抗ウイルス活性を決定するために使用し得る。Ha
rper（編）（1993）Virology LabFax、Academic Pres
s、NY;およびFieldsら（編）（1986）Fundamental Viro
logy、Raven Press、NYを参照のこと。適切な組織培養
細胞を、適切な量（プラーク形成単位、pfu）のウイル
スストックによって感染させた。感染後、CTLA−８を種
々の時間で添加し、そしてプラークアッセイを行ってウ
イルスの荷重減少を決定した。
あるいは、適切な動物ウイルスモデルに、数日に渡っ
て有効投与量のCTLA−８を注射する。ウイルス感染のレ
ベルを、上記のように決定する。IFN−βのレベルもま
た、標準的なELISA技術によりアッセイする。
X.CTLA−８ホモログの単離 結合組成物を、CTLA−８タンパク質を発現する細胞株
から作製された発現ライブラリーのスクリーニングのた
めに使用する。標準染色技術を使用して、細胞内または
表面に発現した抗原を検出または分類し、あるいは表面
発現形質転換細胞は、パンニングによりスクリーニング
される。細胞内発現のスクリーニングは、種々の染色ま
たは免疫蛍光手順により行われる。McMahanら（1991）E
MBO J.、10:2821−2832を参照のこと。
例えば、０日目に、２チャンバーパーマノックススラ
イド（permanox slide）を、1ml/チャンバーのフィブロ
ネクチン（PBS中、10ng/ml）で、30分間、室温で予備コ
ートする。PBSで一度リンスする。次いで、COS細胞を２
〜３×５細胞／チャンバーで1.5mlの増殖培地中にプレ
ートする。37℃で終夜インキュベートする。
１日目に、それぞれのサンプルについて、血清非含有
DME溶液中に66μg/mlのDEAE−デキストラン、66μＭの
クロロキン、および４μｇのDNAの0.5mlの溶液を調製す
る。それぞれの組について、陽性標準（例えば、huIL−
10−FLAG cDNAの１および1/200希釈物、ならびに偽陰性
（negative mock））を調製する。血清非含有DMEで細胞
をリンスする。DNA溶液を添加し、そして37℃で５時間
インキュベートする。培地を除去し、そしてDME中の0.5
mlの10％DMSOを2.5分間で添加する。除去およびDMEを用
いて１回洗浄する。増殖培地を1.5ml添加し、そして終
夜インキュベートする。
２日目に、培地を変更する。３または４日目に、細胞
を固定し、そして染色する。細胞をHankの緩衝化生理食
塩水（HBSS）で２回リンスし、そして４％パラホルムア
ルデヒド（PFA）／グルコース中で５分間固定する。HBS
Sで３回洗浄する。スライドは、全ての液体を除去した
後、−80℃で保存され得る。それぞれのチャンバーにつ
いて、0.5mlのインキュベーションを以下のように行っ
た。32μl/mlの1M NaN3とともにHBSS/サポニン（0.1
％）を20分間で添加する。次いで、細胞をHBSS/サポニ
ンで１回洗浄する。可溶性抗体を細胞に添加し、そして
30分間インキュベートする。細胞をHBSS/サポニンで２
回洗浄する。第２の抗体（例えば、Vector抗マウス抗
体、1/200希釈物）を添加し、そして30分間インキュベ
ートする。ELISA溶液（例えば、Vector Elite ABC西洋
ワサビペルオキシダーゼ溶液）を調製し、そして30分間
予備インキュベートする。例えば、溶液Ａ（アビジン）
１滴および溶液Ｂ（ビオチン）１滴/2.5ml HBSS/サポニ
ンを使用する。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。A
BC HRP溶液を添加し、そして30分間インキュベートす
る。細胞をHBSSで２回洗浄する（２回目の洗浄は２分間
行う。これは細胞を結集する）。次いで、Vectorジアミ
ノ安息香酸（DAB）を５〜10分間で添加する。緩衝液２
滴＋DAB4滴＋H2O22滴/5mlガラス器具で蒸留された水（g
lass distilled water）を使用した。注意深くチャンバ
ーを除去し、そして水中でスライドをリンスする。数分
間空気乾燥し、次いでCrystal Mount 1滴およびカバー
スリップ（cover slip）を加える。５分間、85〜90℃で
焼成する。
あるいは、結合組成物を使用して、抗原を発現してい
る細胞をアフィニティー精製するかまたは分類する。例
えば、SambrookらまたはAusubelらを参照のこと。
同様の方法が、種改変体かまたは対立遺伝子改変体か
のいずれかを単離するために適用可能である。種改変体
を、プローブのような１つの種または適切な種由来の完
全長単離物またはフラグメントに基づく交差種（cross
−species）ハイブリダイゼーション技術を使用して単
離する。
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、それぞ
れの個々の出版物または特許出願が参考として援用され
るために詳細におよび個々に示されている程度に、参考
として本明細書中で援用される。
本発明の多くの改変および変更が、当業者に明らかで
あるように、その精神および範囲を逸脱することなくな
され得る。本明細書中に記載する特定の実施態様は例示
のみのために提供され、そして本発明は、添付の請求の
範囲の用語、ならびにこのような請求の範囲が請求する
ものと等しいもののすべての範囲によってのみ限定され
るべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バンシュロ，ジャック フランス国 エフ−69130 エキュイ, アベニュ ポール−サンティ，25 (72)発明者 ジョス，オディール フランス国 エフ−69340 フランシュ ヴィル，シュマン ドゥ カルザン （番地なし) (72)発明者 フロレス−ロモ，レオポルド アメリカ合衆国 テキサス 77054，ヒ ューストン，ファンニン ストリート 8181，アパートメント 811 (72)発明者 フォシエ，フランソワ フランス国 エフ−69280 メルシ−ル エトール，リュ ドゥ ベルゲル，111 (72)発明者 ゴルスタン，ピエール フランス国 エフ−13009 マルセイユ, シュマン ジョセフ−エキエール，34, ヴィラ 41 (72)発明者 クリシュナ，マラ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94034，ロス アルトス，アルタメイド ドライブ 1290 (72)発明者 ルベック，セルジュ ジー． ウー. フランス国 エフ−69380 シャゼ−ダ ゼルク，リュ モリス−ラヴェル，11 (72)発明者 ムレイ，リチャード アメリカ合衆国 カリフォルニア 94043， マウンテン ビュー，ライト アベニュー ナンバー1003 928 (56)参考文献 特表 平11−510045（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】微生物感染、敗血症、CD34＋前駆細胞の好
    中球および／または単球への分化の誘導、IL−６分泌の
    誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群より選択さ
    れる少なくとも１つの型の誘導を必要とする異常造血、
    または敗血症性ショックについて哺乳動物を処置するた
    めの、哺乳動物Ｇ−CSFおよび哺乳動物GTLA−８を含む
    薬学的組成物。
  2. 【請求項２】微生物感染、敗血症、CD34＋前駆細胞の好
    中球および／または単球への分化の誘導、IL−６分泌の
    誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群より選択さ
    れる少なくとも１つの型の誘導を必要とする異常造血、
    または敗血症性ショックについて哺乳動物を処置するた
    めの、哺乳動物Ｇ−CSF、哺乳動物GTLA−８、および哺
    乳動物IL−６を含む薬学的組成物。
  3. 【請求項３】前記哺乳動物Ｇ−CSFが、ヒトＧ−CSFであ
    る、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
  4. 【請求項４】前記哺乳動物CTLA−８が、ヒトCTLA−８で
    ある、請求項１に記載の薬学的組成物。
  5. 【請求項５】請求項２に記載の薬学的組成物であって、 ａ）前記哺乳動物CTLA−８が、ヒトCTLA−８であり；お
    よび ｂ）前記哺乳動物IL−６が、ヒトIL−６である、 薬学的組成物。
  6. 【請求項６】前記CTLA−８、および前記Ｇ−CSFが、組
    換えタンパク質である、請求項１に記載の薬学的組成
    物。
  7. 【請求項７】前記CTLA−８、前記Ｇ−CSF、および前記I
    L−６が組換えタンパク質である、請求項２に記載の薬
    学的組成物。
  8. 【請求項８】薬学的に受容可能なキャリアをさらに含
    む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
  9. 【請求項９】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆細
    胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−６
    分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群より
    選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異常
    造血について哺乳動物を処置するための有効量の請求項
    １または２に記載の薬学的組成物。
  10. 【請求項１０】微生物感染、敗血症、CD34＋前駆細胞の
    好中球および／または単球への分化の誘導、IL−６分泌
    の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群より選択
    される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異常造
    血、または敗血症性ショックについて哺乳動物を処置す
    るための有効量のCTLA−８を含む薬学的組成物。
  11. 【請求項１１】前記CTLA−８が、前記哺乳動物の末梢血
    液において、好中球のレベルを増加する、請求項10に記
    載の薬学的組成物。
  12. 【請求項１２】前記CTLA−８が、CD34＋前駆細胞の好中
    球および／または単球への分化を誘導する、請求項10に
    記載の薬学的組成物。
  13. 【請求項１３】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆
    細胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−
    ６分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群よ
    り選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異
    常造血を処置するための組成物である、Ｇ−CSFおよびC
    TLA−８を含む薬学的組成物。
  14. 【請求項１４】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆
    細胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−
    ６分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群よ
    り選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異
    常造血を処置するための組成物である、Ｇ−CSF、CTLA
    −８、およびIL−６を含む薬学的組成物。
  15. 【請求項１５】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆
    細胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−
    ６分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群よ
    り選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異
    常造血を処置するための薬物を製造するための、Ｇ−CS
    FおよびCTLA−８の使用。
  16. 【請求項１６】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆
    細胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−
    ６分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群よ
    り選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異
    常造血を処置するための薬物を製造するための、Ｇ−CS
    F、CTLA−８およびIL−６の使用。
  17. 【請求項１７】微生物感染、敗血症、CD34＋前駆細胞の
    好中球および／または単球への分化の誘導、IL−６分泌
    の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群より選択
    される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異常造
    血、または敗血症性ショックを処置するための薬物を製
    造するためのCTLA−８の使用。
  18. 【請求項１８】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆
    細胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−
    ６分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群よ
    り選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異
    常造血を処置するための、Ｇ−CSFと組合せて使用する
    ための、薬物を製造するためのCTLA−８の使用。
  19. 【請求項１９】微生物感染、敗血症、またはCD34＋前駆
    細胞の好中球および／または単球への分化の誘導、IL−
    ６分泌の誘導ならびにＧ−CSF分泌の誘導からなる群よ
    り選択される少なくとも１つの型の誘導を必要とする異
    常造血を処置するための、Ｇ−CSFおよびIL−６と組合
    せて使用するための、薬物を製造するためのCTLA−８の
    使用。
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