JP3211941B2 - And methods for obtaining human small hepatocytes, the method of primary culture and subculture the cells - Google Patents

And methods for obtaining human small hepatocytes, the method of primary culture and subculture the cells

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JP3211941B2 JP34889896A JP34889896A JP3211941B2 JP 3211941 B2 JP3211941 B2 JP 3211941B2 JP 34889896 A JP34889896 A JP 34889896A JP 34889896 A JP34889896 A JP 34889896A JP 3211941 B2 JP3211941 B2 JP 3211941B2
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勝利 吉里
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科学技術振興事業団
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Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】この発明は、ヒト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養および継代培養方法に関するものである。 BACKGROUND OF THE INVENTION This invention includes a method of acquiring the human small hepatocytes, it relates to this cell method of primary culture and subculture. さらに詳しくは、この発明は、ヒト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその癌化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的研究の材料として、あるいはハイブリッド型人工肝臓等の医療材料として有用なヒト小型肝細胞を取得する方法と、このヒト小型肝細胞を大量に得るための培養方法に関するものである。 More particularly, the present invention is development, differentiation and division and proliferation processes of human hepatocytes or medical materials such as cell biological, as a material for molecular biological studies or hybrid artificial liver, their cancerization mechanism or the like, how to get useful human small hepatocytes as relates culture method for obtaining the human small hepatocytes in large quantities.

【0002】 [0002]

【従来の技術とその課題】動物個体は、一つの受精卵が分裂を繰り返し、異なる機能を分担する各種の組織(細胞集合体)へと分化した多細胞生物である。 [Its challenges conventional technology and animal individuals, one of the fertilized egg is repeated division, is a multi-cellular organism that differentiate into a variety of organizations to share the different functions (cell aggregates). そして、身体を構成する各組織の場合には、それぞれの細胞が常に分裂増殖し、活発は分化機能発現能を有する細胞を次々と産生することによって個体が維持されている。 In the case of each tissue that make up the body, always divide growth each cell, active individuals is maintained by producing successively the cells that have differentiated functional expression ability. 従って、ヒトをはじめとする動物個体の生物学的実体を理解し、あるいは発癌のメカニズム等を解明してその治療法を開発するためには、各組織を構成する細胞を細胞生物学的、分子生物学的に詳細に分析し、その発生・分化過程や分裂増殖の機構を明らかにすることが重要であると考えられる。 Therefore, to understand the biological entities animal, including humans, or for in elucidating the oncogenic mechanisms such as the development of the therapy, the cells cell biological constituting each tissue, molecular biologically analyzed in detail, it is believed to be important to clarify the mechanism of development and differentiation processes and division and proliferation.

【0003】従来より、生体組織の細胞を詳細に分析するための手段として、生体外へ取り出した細胞を培養し、さらには培養細胞を分裂増殖させて継代的に生存させる方法が確立している。 Conventionally, as means for analyzing cells in living tissues in detail, by culturing the cells removed to ex vivo, and further established a method to survive passaged manner by division and proliferation of cultured cells there. ところが、ラットやヒトの肝細胞については、これまで成熟個体から単離した初代細胞を継代的に培養することは不可能であるとされてきた。 However, for the liver cells of rats and humans, it has been that it is impossible to cultivation of primary cells isolated from mature individual to this passaged manner. すなわち、接着依存性の成熟肝細胞は、その継代操作のために培養基質から剥離する際に大きく損傷し、また培養基質に再接着させることも困難であるなどの理由から、継代培養系において肝細胞の発生過程や分裂増殖状態を研究することは不可能であった。 That is, the adhesion-dependent mature hepatocytes, from reasons such as the severely damaged when detached from the culture substrate for subculture operation and, also it is difficult to re-adhere to the culture substrate, subculture system it has not been possible to study the developmental processes and division and proliferation state of hepatocytes in.

【0004】この発明の発明者等は、培養培地の成分等を工夫することによって上記の困難性を克服し、成熟ラットの肝臓から採取した初代細胞を継代培養することに成功し、その培養方法を既に特許出願している(特願平6−89056号)。 [0004] The inventors of the present invention is to overcome the difficulties of the by devising the components or the like of the culture medium, the primary cells taken from the liver of adult rat successfully subcultured, resulting culture already patent a method (Japanese Patent application No. Hei 6-89056). さらにこの発明の発明者等は、従来その存在が確認されていなかった肝前駆細胞(progen Further the inventors of this invention, conventional its presence has not been confirmed hepatic progenitors (progen
itor cells)を含むと考えられるクローン性増殖能を有する肝実質細胞とその取得方法、並びにそれらの細胞を継代的に培養するための方法を発明し、既に特許出願している(特願平7−213686号)。 Hepatocytes and a method obtaining its having clonal proliferative potential suspected of containing itor cells), and invented a method for culturing the cells passaged manner, has already filed a patent application (Japanese Patent Application No. No. 7-213686). 特に、この先願発明における継代培養方法は、成熟哺乳動物の肝臓から肝細胞を分取し、この肝細胞を低速遠心して重量画分と軽量画分とに分離し、軽量画分中の小型細胞を牛胎児血清およびアスコルビン酸類を必須として含有する培地で初代培養して小型細胞に属する肝実質細胞にコロニーを形成させ、EDTA溶液またはEDTA/トリプシン溶液によってコロニーの細胞を培地から剥がし、この剥がした細胞を上記初代培養培地と同様の組成からなる培地で再培養するか、または、上記初代培養の初期に用いた培地(コンディションドメディウム)で再培養することを特徴とするものである。 In particular, the method subculture in the prior invention, a sample was collected hepatocytes from the liver of a mature mammal, separated into a weight fraction and light fraction The hepatocytes were low speed centrifugation, a small lightweight fraction cells were colonize the hepatocytes belong to small cells and primary culture in a medium containing as essential fetal bovine serum and ascorbic acids, peeled cells colony from the medium by EDTA solution or EDTA / trypsin solution, peeled this cells or to re-cultured in a medium having the composition similar to the above primary culture medium, or, is characterized in that re-cultured in a medium (conditioned medium) was used to initially the primary culture.

【0005】そして、さらにこの発明の発明者等は、上記のクローン性増殖能を有する肝実質細胞を、少ない細胞播種数で培養する方法として、小型肝細胞を上記の初代培養に用いた培地と3T3細胞のコンディションドメディウムとの混合培地で培養するか、または小型肝細胞を3T3細胞と共培養することを特徴とする方法を開発し、既に特許出願している(特願平8−133985 [0005] Then, further the inventors of this invention, the hepatocytes with clonal growth ability described above, as a method of culturing a small cell seeding number, and the medium with small hepatocytes in primary cultures of the or cultured in mixed media with conditioned medium of 3T3 cells, or small hepatocytes developed a method, which comprises co-cultured with 3T3 cells, has already filed a patent application (Japanese Patent application No. 8-133985
号)。 issue).

【0006】 [0006]

【発明が解決しようとする課題】近年、培養肝細胞を組み込んだ人工肝臓(ハイブリッド型人工肝臓)の開発が活発に検討されているが、これまでに提案されたハイブリッド型人工肝臓には、ブタ等の異種動物から単離した肝細胞や、癌細胞由来の株化細胞が用いられてきた。 THE INVENTION Problems to be Solved] In recent years, the development of artificial liver incorporating the cultured hepatocytes (hybrid type artificial liver) has been actively studied, the hybrid type artificial liver that has been proposed so far, swine liver cells and isolated from different animal species etc., cell lines derived from cancer cells have been used. しかしながら、これらの肝細胞をヒトの体内に埋め込んだ場合には、異種動物細胞の侵入に対する免疫反応や、癌細胞の活性化による他臓器の発癌といった問題が存在した。 However, these hepatocytes when embedded in the body of a human, and immune response to heterologous animal cell invasion, there was a problem carcinogenic other organs due to activation of cancer cells.

【0007】このため、ハイブリッド型人工肝臓の用いる培養肝細胞として、ヒトの正常肝細胞の利用が期待されているが、正常なヒト肝細胞を大量に得ることが困難であり、またヒト肝細胞を装置に組み込むための培養方法が確率していないことが、ヒト肝細胞を利用したハイブリッド型人工肝臓の開発の障害の一つとなっていた。 [0007] As Therefore, cultured hepatocytes used the hybrid artificial liver, the use of human normal liver cells is expected, it is difficult to obtain a normal human hepatocytes in large quantities, also human hepatocytes the culture methods for incorporation into the device is not probability, had become one of the obstacles in the development of hybrid artificial liver using human hepatocytes.

【0008】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、この発明者等が既に開発したラット肝細胞についての知見を発展させ、少量のヒト正常肝組織からコロニー形成能を有する小型肝細胞を取得する方法と、この細胞を効率良く継代培養する方法を提供することを目的としている。 [0008] This invention was made in view of the circumstances as described above, findings evolved for rat hepatocytes the inventors have already developed, colony forming ability from a small amount of normal human liver tissue it is an object and how to obtain the small hepatocytes with, to provide a method for efficiently subculture the cells.

【0009】 [0009]

【課題を解決するための手段】 この出願の発明は、上記 SUMMARY OF THE INVENTION The claimed invention is the
の課題を解決するものとして、ヒトの肝臓から分取した In order to solve the problems, and fractionated from human liver
正常肝細胞をディスパーゼ含有コラゲナーゼ溶液で処理 Handle normal hepatocytes in dispase containing collagenase solution
したのち、分散させた肝細胞を低速遠心して重量画分と After the, the weight fraction of hepatocytes were dispersed by low speed centrifugation
軽量画分とに分離し、軽量画分中の小型肝細胞を採取す It is separated into a lighter fraction, to collect the small hepatocytes in the lightweight fraction
ることにより得られたヒト小型肝細胞を、ヒト血清およ Human small hepatocytes obtained by Rukoto, Oyo human serum
びアスコルビン酸類を必須として含む培地と3T3細胞 Medium and 3T3 cells containing the fine ascorbic acid as an essential
のコンディションドメディウムとの混合培地で培養して And cultured in a mixed medium of the conditioned medium of
コロニーを形成させることを特徴とするヒト小型肝細胞 Human small hepatocytes, characterized in that to form colonies
の初代培養方法(請求項1)を提供する。 A method of primary culture (claim 1).

【0010】また、この出願の発明は、上記のヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地がヒト血清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンアミド類およびDMSOを含有するDMEM培地であること(請求項2)、および3T3細胞のコンディションド [0010] The invention of this application, it is DMEM medium medium containing the human serum and ascorbic acids as essential contains human serum, ascorbic acid, epidermal growth factor, nicotinamide compounds and DMSO (according section 2), and 3T3 cells conditioned for
メディウムが、牛胎児血清を必須として含むDMEM培 Medium is, DMEM culture containing fetal bovine serum as required
地で3T3細胞を培養した後の培養上清であること(請 It is a culture supernatant after culturing 3T3 cells in the land (請
求項3)を上記ヒト小型肝細胞の初代培養方法の態様と Motomeko 3) and aspects of the primary culture method of the human small hepatocytes
して提供する。 And it provides the.

【0011】さらに、 この出願の発明は、以上のいずれ Furthermore, the invention of this application, any more
かの初代培養方法によってコロニーを形成するヒト小型 Human small to colonize by Kano primary culture method
肝細胞(請求項4)と、コロニー形成能を有する前記ヒト小型肝細胞を、EDTA/トリプシン溶液によって培地から剥がし、これらの小型肝細胞を、ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地と3T3細胞のコンディションメディドメディウムとの混合培地で培養することによってコロニーを形成させることを特徴とするヒト小型肝細胞の継代培養方法(請求項5)をも提供する。 And hepatocytes (Claim 4), the human small hepatocytes with colonization ability, peeled from the medium by EDTA / trypsin solution, medium and 3T3 cells containing these small hepatocytes, as an essential human serum and ascorbic acids providing human small hepatocytes method passages, characterized in that to form colonies by culturing a mixed medium of conditioned media de medium of (claim 5).

【0012】 この出願の発明は、さらには、ヒト血清お [0012] The invention of this application is more, your human serum
よびアスコルビン酸類を必須として含む培地が、ヒト血 Medium, human blood, including ascorbic acid as an essential and
清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンア Kiyoshi, ascorbic acid, epidermal growth factor, Nikochin'a
ミド類およびDMSOを含有するDMEM培地であるこ This is a DMEM medium containing bromide compound and DMSO
と(請求項6)、および3T3細胞のコンディションド And (claim 6), and 3T3 cells conditioned for
メディウムが、牛胎児血清を必須として含むDMEM培 Medium is, DMEM culture containing fetal bovine serum as required
地で3T3細胞を培養した後の培養上清であること(請 It is a culture supernatant after culturing 3T3 cells in the land (請
求項7)を上記継代培養方法の態様として提供する。 The Motomeko 7) provided as an aspect of the subculture method.

【0013】 [0013]

【発明の実施の形態】この発明のヒト小型肝細胞は、たとえば、外科手術により摘出した肝癌組織から、非腫瘍部正常組織を一部採取し、これをコラゲナーゼおよびディスパーゼの混合溶液で処理したのち、分散させた肝細胞を低速遠心して重量画分と計量画分とに分離し、計量画分中の小型肝細胞を採取することによって取得することができる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human small hepatocytes of the present invention, for example, from liver cancer tissue excised by surgery, the non-tumor part normal tissues partially collected, after which was treated with a mixture of collagenase and dispase can be obtained by the hepatocytes were dispersed low speed centrifugation and separated into a metering fraction and weight fraction, collecting the small hepatocytes in the metering fraction. より具体的には、採取した肝組織を公知の灌流液により処理したのち、ディスパーゼ (100 〜10,0 More specifically, after the collected liver tissue treated by a known perfusate, dispase (100 ~10,0
00PU/ml)を加えた0.01〜1%コラゲナーゼ溶液により灌流処理し、さらに0.01〜1%コラゲナーゼ溶液によって肝組織を消化させる。 00PU / ml) were perfused treated with 0.01% to 1% collagenase solution added and allowed to digest the liver tissue by further 0.01% to 1% collagenase solution. 各溶液の注入時間は、肝組織の状態によって異なるため、灌流液による組織の膨化を観察しながら、適宜に設定すればよい。 Injection time of each solution is different depending on the state of the liver tissue, while observing the swelling of tissue by perfusion fluid, it may be set appropriately. ついで、消化した組織を洗浄液でピペッティングして細胞を分散し、滅菌したガーゼ、メッシュ等によって未消化の組織を除去、濾過したのち、低速遠心法(50G)による軽量画分を分離し、この画分に含まれる細胞を採取する。 Then, digested tissue by pipetting a washing solution to disperse the cells, sterile gauze, remove undigested tissue by a mesh or the like, after filtration, to separate the lightweight fraction by low speed centrifugation (50G), the harvesting the cells contained in the fraction.

【0014】この方法によって、手術摘出組織等に含まれる少量の正常肝組織から、効率よくヒト正常小型肝細胞を得ることができる。 [0014] This method can be obtained from a small amount of the normal liver tissue included in the surgical isolated tissue or the like, efficiently normal human small hepatocytes. 次に、このようにして取得したヒト小型肝細胞を、上記の初代培養方法、すなわち培養培地として、ヒト血清およびアスコルビン酸類(例えばL−アスコルビン酸リン酸塩)を必須として含む培地と、3T3細胞のコンディションドメディウム(3T3 Then, such a human small hepatocytes obtained in the above method of primary culture, i.e. a culture medium, a medium containing as essential human serum and ascorbic acid (e.g. L- ascorbic acid phosphate), 3T3 cells of conditioned medium (3T3
CM)との混合培地を用いる方法により培養する。 Cultured by a method of using a mixed medium with CM). この混合培地の使用によって、少数の小型肝細胞からでも効率よくコロニーを形成させることができる。 The use of the mixed medium can be efficiently formed colonies even from a small number of small hepatocytes.

【0015】3T3細胞は、スイス系マウス胎児から得られた公知の株細胞、あるいはBalb/C系マウス由来の [0015] 3T3 cells, known cell lines derived from Swiss mouse embryos, or Balb / C mice derived,
Balb3T3細胞を用いることができ、そのコンディションドメディウムは、牛胎児血清を必須として含有するD Can be used Balb3T3 cells, the conditioned medium is, D containing fetal bovine serum as the essential
MEM培地で3T3細胞(5×10 5 cells /10cm dis 3T3 cells in MEM medium (5 × 10 5 cells / 10cm dis
h 程度)を3日間程度培養した後の培養上清として得ることができる。 It can be obtained as the culture supernatant after about three days of culture the degree of h). そして、このコンディションドメディウムは、上記FBSおよびアスコルビン酸類を必須として含む培地と1:9から9:1の割合、より好ましくは、 Then, the conditioned medium, the medium and 1 including the FBS and ascorbic acid as essential: 9 to 9: 1 ratio, more preferably,
ほぼ等量の割合で混合して小型肝細胞の培養に用いることができる。 It can be used for culturing the small hepatocytes were mixed substantially in the ratio of equivalent amounts.

【0016】また、ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地としては、具体的には、ヒト血清、 [0016] As a medium containing as essential human serum and ascorbic acids, particularly a human serum,
アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンアミド類およびDMSOを含有するDMEM培地を用いることができる。 Ascorbic acids, epidermal growth factor, can be used DMEM medium containing nicotinamide acids and DMSO. すなわち、ヒト血清およびアスコルビン酸類によって小型肝細胞のコロニー形成が生じる。 That is, colony formation of the small hepatocytes is caused by human serum and ascorbic acids. また、上皮細胞成長因子(EGF)およびDMSOは、コロニーの形成に必須ではないが、コロニーの形成促進作用を有し、ニコチンアミド類は肝細胞の分化を抑えると考えられるため、培養培地に添加する成分として好ましい。 Also, epidermal growth factor (EGF) and DMSO is not essential to the formation of colonies, has a formation promoting effect of colonies, because nicotine amide is believed to suppress differentiation of hepatocytes, added to the culture medium preferred components. さらに、低速遠心による軽量画分には、小型肝細胞以外にも、内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、胆管上皮細胞等が含まれ、小型肝細胞に特殊な環境を提供していると考えられるが、上記のニコチンアミド類、アスコルビン酸類およびDMSOはそれらの非実質細胞の増殖を抑制し、小型の肝実質細胞を選択的に培養増殖させることを可能にする。 Furthermore, the lightweight fraction by low speed centrifugation, in addition to small hepatocytes, include endothelial cells, Kupffer cells, stellate cells, biliary epithelial cells, etc., is believed to small hepatocytes provide a special environment but nicotine amides of the above, ascorbic acids and DMSO inhibit the growth of those non-parenchymal cells, it makes it possible to selectively culture growth of small hepatocytes.

【0017】これらの成分の培地中への添加量は、例えば、ヒト血清は5〜20%、アスコルビン酸類は0.1 〜 [0017] The addition amount of the culture medium of these components, for example, human serum from 5 to 20% ascorbic acid from 0.1 to
1.0 mM、EGFは1〜100ng/ml、ニコチンアミド類は1〜20mM、そしてDMSOは0.1 〜2%程度とすることが出来る。 1.0 mM, EGF is 1-100 ng / ml, nicotine amides 1 to 20 mM, and the DMSO can be about 0.1 to 2%. 培養は、5%CO 2条件下で、 Cultures under 5% CO 2,
37℃前後の温度で行う。 37 ℃ carried out before and after the temperature. 以上の通りの培養によって、 By the culture of the street above,
ヒト小型肝細胞を含む肝細胞コロニーが得られる。 Hepatocyte colonies containing the human small hepatocytes can be obtained. さらに、これらのコロニーを形成する細胞に対しては、例えば、ペルオキシゾームの有無、肝細胞マーカーへの反応性、癌化肝細胞マーカーへの反応性、未分化肝細胞マーカーへの反応性、およびオーバルセルの表面抗原に対する抗体への反応性の少なくとも一つを指標としてスクリーニングすることによって、肝細胞としての分化機能発現を確認することができる。 Moreover, for cells forming these colonies, for example, the presence of peroxisomes, reactivity to the liver cell markers, reactivity to malignant transformation hepatocyte markers, reactivity to undifferentiated hepatocyte markers, and by screening as an indicator at least one reactive to the antibodies against surface antigens of the oval cell, it is possible to confirm the differentiation function expression as hepatocytes. このうち、ペルオキシゾームの有無は、透過型電子顕微鏡観察により確認することができる。 Of these, the presence of peroxisomes can be confirmed by transmission electron microscopy. 肝細胞マーカーとしてはアルブミン、α 1 The liver cell markers albumin, α 1 -
アンチトリプシン、トランスフェリン等の抗体を、癌化または未分化な肝細胞のマーカーとしてはGST−P、 Antitrypsin, an antibody of transferrin such as the marker for cancerous or undifferentiated hepatocellular GST-P,
α−フェトプロテインの抗体、γ−GTP染色等を、またオーバルセルの表面抗原に対する抗体としては公知の抗体(OC2、OC3)を用いることができる。 Fetoprotein antibody alpha-, the gamma-GTP Senshokuto, As the antibodies to the surface antigens of oval cells may be a known antibody (OC2, OC3). さらに、胆管上皮細胞のマーカーや星細胞のマーカー等を用いることによって、培養中の非実質細胞を同定することもできる。 Furthermore, by using a marker such as a marker or stellate cells biliary epithelial cells, it may also be used to identify non-parenchymal cells in culture.

【0018】次に、この発明の小型肝細胞の継代培養方法について説明する。 Next, a description will be given subculture method of small hepatocytes of the present invention. すなわち、この方法は、初代培養によって得たヒト小型肝細胞のコロニー(初代培養細胞)をシャーレから剥がし、別のシャーレにおいて再培養し、増殖させる方法である。 That is, this method is peeled colonies of human small hepatocytes obtained by primary culture (the primary cells) from the Petri dish, and re-cultured in another Petri dish is a method of growing. コロニーを剥がす際には、シャーレから培地を取り除いた後、コロニーにED Upon the release of the colonies, after removing the medium from the dish, ED colony
TA(0.002〜0.2%)およびトリプシン(0.0 TA (0.002 to 0.2%) and trypsin (0.0
05〜0.5%)の溶液を添加して約10分間処理することによって、コロニーを小型肝細胞と非実質細胞とに分離することができる。 By treating about 10 minutes with a solution of 05 to 0.5%), can be separated colonies and small hepatocytes and non-parenchymal cells.

【0019】そして、このようにして分散させた小型細胞を、ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地と3T3CMとの混合培地で再培養する。 [0019] Then, such a small cells dispersed in the re-cultured in a mixed culture of media and 3T3CM containing as essential human serum and ascorbic acids. 3T3 3T3
CMおよびこれと混合する培地の具体的成分等は、上記初代培養方法のものと同様とすることができる。 CM and specific components, such as the medium to be mixed therewith, may be similar to those of the primary culture method. 以上の通りのこの発明の各方法は、少量のヒト正常肝組織からコロニー形成能を有する小型肝細胞を効率よく、しかも大量に取得することを可能とする。 Each method of the invention as described above, the small hepatocytes with colony forming ability from a small amount of normal human liver tissues efficiently, moreover makes it possible to obtain a large amount. これらの肝細胞は、 These liver cells,
ヒト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその癌化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的研究の材料としてばかりでなく、ハイブリッド型人工肝臓等の材料としても有用であり、肝疾患の治療技術の開発にも新たな展開をもたらすものと期待される。 Development and differentiation and division and proliferation processes of human hepatocytes or cell biological to their malignant transformation mechanism, etc., not only as a material for molecular biological studies, are also useful as a material such as a hybrid artificial liver, liver the development of therapeutic techniques of diseases is expected to bring a new development.

【0020】以下、実施例を示して、この発明の継代培養方法をさらに詳細かつ具体的に説明する。 The following by referring to Examples, illustrating the subculture method of the present invention in more detail and specifically. もちろん、 of course,
この発明は以下の例に限定されるものではない。 The invention is not limited to the following examples.

【0021】 [0021]

【実施例】 【Example】

実施例1:ヒト肝細胞の取得 ヒトの手術摘出肝組織から非腫瘍部正常組織を一部採取し、37℃に加温した0.5mM ethylene glycol-bis (2-a Example 1: a non-tumor part normal tissues from human hepatocytes acquisition human surgical resected liver tissue was partially collected, 0.5 mM warmed to 37 ℃ ethylene glycol-bis (2-a
minoethylene ether) tetraacetic acidを含むHanks 液を約10分間、肝切離面の脈管断端から挿入したシリンジを介して気泡が入らないように注入したのち、1,000U minoethylene ether) tetraacetic acid Hanks solution for about 10 minutes including, after implantation not to enter air bubbles through a syringe inserted from vascular stump hepatectomy Hanaremen, 1,000 U
P/mlディスパーゼを加えた0.05% コラゲナーゼ溶液(3 P / ml dispase 0.05% collagenase solution was added (3
7℃)を同シリンジから3分間注入し、さらに0.05% コラゲナーゼ溶液(37℃)を単独で15分間注入して肝組織を消化した。 The 7 ° C.) was injected 3 minutes after the syringe was digested liver tissue was further injected 15 min 0.05% collagenase solution (37 ° C.) alone.

【0022】次いで、消化した組織は、メスで肝皮膜を切開し、10%牛血清アルブミン(BSA)に0.4U/ml [0022] Then, digested tissue was dissected liver film with a scalpel, 0.4 U / ml in 10% bovine serum albumin (BSA)
のDNase を添加した洗浄液でピペッティングして肝細胞を分散させのち、滅菌したガーゼで未消化の組織片を除去し、さらに70μm のナイロンメッシュで濾過した。 Later by pipetting a washing solution with the addition of DNase to disperse the hepatocytes were removed tissue pieces undigested with sterile gauze and further filtered through a nylon mesh 70 [mu] m. 得られた濾過液を低速遠心(50 G:1分間×3回) The resulting filtrate to low speed centrifugation (50 G: 1 minute × 3 times)
し、成熟肝細胞を多く含む実質画分の沈殿を除き、計量画分を含む遠心上清を得た。 And, except for the precipitation of substantial fraction rich in mature hepatocytes, to obtain a supernatant containing the metering fraction. この非実質細胞画分をさらに低速遠心(150 G:5分間×3回)し、非実質細胞を含むヒト小型肝細胞を取得した。 The non-parenchymal cell fraction further low speed centrifugation (150 G: 5 minutes × 3 times), and obtains the human small hepatocytes comprising the non-parenchymal cells. 実施例2:小型肝細胞の初代培養 3T3細胞 (5×10 5 cells/10cm dish)を10%牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むD Example 2: Primary Culture 3T3 cells small hepatocytes (5 × 10 5 cells / 10cm dish) with 10% fetal calf serum, D with penicillin and streptomycin
MEM培地中で、37℃、5%Co 2条件下で培養した。 In MEM medium, 37 ° C., were cultured in 5% Co 2 conditions. そして、この培養に用いた培地の培養上清をコノディションドメディウム(3T3CM)とした。 And, it was the culture supernatant of the culture medium used in this culture Kono Rendition de medium (3T3CM).

【0023】実施例1で得たヒト小型肝細胞を、3.5 [0023] Human small hepatocytes obtained in Example 1, 3.5
cm径の培養皿に9×10 5個ずつ播き、DMEM培地(10% ヒト血清, 44mM NaHCO 3 , 20mM HEPES, 0.5mg/lインシュリン,10 -7 M デキサメタゾン,30mg/lL−プロリン,ペニシリンおよびストレプトマイシン含有)と3T seeded in culture dishes cm diameter by 9 × 10 5 cells, DMEM medium (10% human serum, 44mM NaHCO 3, 20mM HEPES, 0.5mg / l insulin, 10 -7 M dexamethasone, 30 mg / l L-proline, penicillin and streptomycin containing) and 3T
3CMとを等量混合した培地(50%3T3CM)で、 A 3CM an equal volume mixed medium (50% 3T3CM),
37℃、5%CO 2条件下で2〜3時間培養した。 37 ° C., and 2-3 hour incubation under 5% CO 2. 次いで、培養培地を、上記混合培地に 10mM ニコチンアミド、10ng/ml EGFおよび0.2mM L−アスコルビン酸リン酸塩を加えたDMEM培地に交換し、さらに4日目からは1%DMSOを培地に加え、35日間培養を続け、 Then, the culture medium, 10 mM nicotinamide to the mixed medium was replaced with DMEM medium supplemented with 10 ng / ml EGF and 0.2 mM L-ascorbic acid phosphate, added to the medium 1% DMSO from further 4 days , it continued to 35 days of culture,
形成されたコロニー数を計測した。 The number of colonies formed was counted. また、対照として、 In addition, as a control,
3T3CMを含まないDMEM培地で培養した場合のコロニー数も計測した。 The number of colonies when cultured in DMEM medium without 3T3CM was also measured.

【0024】結果は図1(A)(B)に示したとおりであり、3T3CMを含まないDMEM培地で培養した場合(図1:A)び比べ、50%3T3CM培地で培養した場合(図1:B)にには、より多くのコロニーが形成されることが観察された。 [0024] The results are as shown in FIG. 1 (A) (B), when cultured in DMEM medium without 3T3CM (Figure 1: A) than the fine, when cultured in 50% 3T3CM medium (Fig. 1 : to the B), that more colonies are formed was observed. 実施例3:小型肝細胞の継代培養 実施例2の小型肝細胞を含む肝細胞コロニーが形成されたシャーレから培地を取り除き、コロニーを0.02% Example 3: medium was removed from the dish hepatocytes colonized containing the small hepatocytes subculture Example 2 of small hepatocytes, colonies 0.02%
EDTAおよび0.05%トリプシンで処理し、コロニーの小型肝細胞と非実質細胞とを溶液中に分散させた。 It was treated with EDTA and 0.05% trypsin to disperse the small hepatocytes and non-parenchymal cells of the colonies in the solution.
こ細胞分散液をピペッティングし、コロニー周囲の非実質細胞と、小型肝細胞の各々の分散液を得た。 Concentrated cell suspension was pipetted to obtain a non-parenchymal cells surrounding the colonies, a dispersion of each of the small hepatocytes. 次いで、 Then,
上記の3T3CMとDMAEM培地との混合培地(50 Mixed media of 3T3CM and DMAEM medium of (50
%3T3CM)で再培養した。 It was re-cultured in% 3T3CM).

【0025】その結果、多数の細胞によって構成されたコロニーが形成されることが確認された。 [0025] As a result, the colony constituted by a number of cells formed was confirmed.

【0026】 [0026]

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によって、少量のヒト正常肝組織からコロニー生計能を有する小型肝細胞を効率よく、しかも大量に取得することを可能となる。 As described [Effect Invention above in detail, the present invention, the small hepatocytes with colonies living ability from a small amount of normal human liver tissues efficiently, and which yet are to be mass acquire. これらの肝細胞は、ヒト肝細胞の発生・分化や分裂増殖過程、あるいはその癌化メカニズム等に関する細胞生物学的、分子生物学的研究の材料としてばかりでなく、ハイブリッド型人工肝臓等の材料としても有用であり、肝疾患の治療技術の開発にも新たな展開をもたらすものと期待される。 These hepatocytes, development, differentiation and division and proliferation processes of human hepatocytes or cell biological to their malignant transformation mechanism, etc., not only as a material for molecular biological studies, as a material for such a hybrid artificial liver also useful, it is expected to result in even new developments in the development of therapeutic techniques of liver disease.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】Aは、3T3CMを含まないDMEM培地で培養したヒト小型肝細胞のコロニー数を示したヒストグラムであり、Bは50%3T3CM培地で培養したヒト小型肝細胞のコロニー数を示したヒストグラムである。 [1] A is a histogram showing the number of colonies of human small hepatocytes cultured in DMEM medium without 3T3CM, B showed a number of colonies of human small hepatocytes cultured in 50% 3T3CM medium histogram it is.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平4−158786(JP,A) 特開 平8−112092(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl. 7 ,DB名) C12N 5/06 BIOSIS(DIALOG) CA(STN) WPIDS(STN) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (56) reference Patent flat 4-158786 (JP, a) JP flat 8-112092 (JP, a) (58 ) investigated the field (Int.Cl. 7, DB name) C12N 5/06 BIOSIS (DIALOG) CA (STN) WPIDS (STN)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】 ヒトの肝臓から分取した正常肝細胞をデ 1. A de-normal hepatocytes were collected from human liver min
    ィスパーゼ含有コラゲナーゼ溶液で処理したのち、分散 After treatment with Isupaze containing collagenase solution, dispersion
    させた肝細胞を低速遠心して重量画分と軽量画分とに分 The hepatocytes were then centrifuged at a low speed the weight fraction and lighter fraction and a half
    離し、軽量画分中の小型肝細胞を採取することにより得 Release, obtained by taking the small hepatocytes in the lightweight fraction
    られたヒト小型肝細胞を、ヒト血清およびアスコルビン Human small hepatocytes are human serum and ascorbic
    酸類を必須として含む培地と3T3細胞のコンディショ Conditionality of the medium and the 3T3 cells containing the acid as an essential
    ンドメディウムとの混合培地で培養してコロニーを形成 Form colonies were cultured in mixed media with command medium
    させることを特徴とするヒト小型肝細胞の初代培養方 Primary cultures side of human small hepatocytes, characterized in that to
    Law.
  2. 【請求項2】 ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地がヒト血清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンアミド類およびDMSOを含有するDMEM培地である請求項1のヒト小型肝細胞の初代培養方法。 2. A medium human serum containing as essential to human serum, and ascorbic acids, ascorbic acids, epidermal growth factor, primary cultures of human small hepatocytes according to claim 1 which is DMEM medium containing nicotinamide acids and DMSO Method.
  3. 【請求項3】 3T3細胞のコンディションドメディウムが、牛胎児血清を必須として含むDMEM培地で3T Conditioned medium as claimed in claim 1, wherein 3T3 cells, 3T in DMEM medium containing fetal calf serum as required
    3細胞を培養した後の培養上清である請求項1または2 3 cells are culture supernatants after culturing claim 1 or 2
    のいずれかの小型肝細胞の初代培養方法。 Primary culture method of any of the small hepatocytes.
  4. 【請求項4】 請求項1ないし3のいずれかの初代培養 Wherein any of the primary cultures of claims 1 to 3
    方法によってコロニーを形成するヒト小型肝細胞。 Human small hepatocytes to form colonies by the method.
  5. 【請求項5】 コロニーを形成した請求項4のヒト小型 Human small 5. The method of claim 4 in which formed colonies
    肝細胞を、 EDTA/トリプシン溶液によって培地から剥がし、これらの小型肝細胞を、ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地と3T3細胞のコンディションメディドメディウムとの混合培地で培養することによってコロニーを形成させることを特徴とするヒト小型肝細胞の継代培養方法。 Hepatocytes peeled from the medium by EDTA / trypsin solution, formed colonies by these small hepatocytes are cultured in mixed media with media and 3T3 cells conditioned media de medium containing as essential human serum and ascorbic acids the method of subculture human small hepatocytes, characterized in that to.
  6. 【請求項6】 ヒト血清およびアスコルビン酸類を必須として含む培地が、ヒト血清、アスコルビン酸類、上皮細胞成長因子、ニコチンアミド類およびDMSOを含有するDMEM培地である請求項5のヒト小型肝細胞の継代培養方法。 6. A medium containing as essential human serum and ascorbic acids, human serum, ascorbic acid, epidermal growth factor, splicing of human small hepatocytes according to claim 5 which is DMEM medium containing nicotinamide acids and DMSO algebraic culture method.
  7. 【請求項7】 3T3細胞のコンディションドメディウムが、牛胎児血清を必須として含むDMEM培地で3T Conditioned medium according to claim 7] 3T3 cells, 3T in DMEM medium containing fetal calf serum as required
    3細胞を培養した後の培養上清である請求項5または6 3 is a culture supernatant after culturing the cells according to claim 5 or 6
    のいずれかのヒト小型肝細胞の継代培養方法。 Subculture method of any of the human small hepatocytes.
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