JP3127298B2 - ストレプトキナーゼをコードする遺伝子の単離および発現方法、得られるヌクレオチド配列、組換体ｄｎａおよび形質転換微生物 - Google Patents
ストレプトキナーゼをコードする遺伝子の単離および発現方法、得られるヌクレオチド配列、組換体ｄｎａおよび形質転換微生物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はバイオテクノロジーおよび遺伝子工学に関す
る。更に詳細には、本発明はストレプトキナーゼをコー
ドする新規なヌクレオチド配列の遺伝子をクローニング
する方法、および異種の宿主生物の形質転換に用いられ
るところの該遺伝子より得られる組換体DNAに関する。
る。更に詳細には、本発明はストレプトキナーゼをコー
ドする新規なヌクレオチド配列の遺伝子をクローニング
する方法、および異種の宿主生物の形質転換に用いられ
るところの該遺伝子より得られる組換体DNAに関する。
（従来技術とその問題点） ストレプトキナーゼは原該生物由来のプラスミノーゲ
ン活性化因子（プラスミノーゲン アクチベーター）で
あって、普通、多くの異なった血清型の溶血性ストレプ
トコッカスにより培地中に分泌される。細菌を起源とす
る蛋白質であって、それらに対する抗原応答が検出され
ている（Dykewicz,M.S.et al.,1985およびMcGrath,K.G.
et al.,1985）。それらの分子量は約47,000ダルトンで
ある。
ン活性化因子（プラスミノーゲン アクチベーター）で
あって、普通、多くの異なった血清型の溶血性ストレプ
トコッカスにより培地中に分泌される。細菌を起源とす
る蛋白質であって、それらに対する抗原応答が検出され
ている（Dykewicz,M.S.et al.,1985およびMcGrath,K.G.
et al.,1985）。それらの分子量は約47,000ダルトンで
ある。
ストレプトコッカスの病原性における機能は正確には
解明されていないが、ストレプトキナーゼは恐らく感染
部の周囲のフィブリン バリアーの生成を除去したり防
いだりすることに寄与していると考えられる。
解明されていないが、ストレプトキナーゼは恐らく感染
部の周囲のフィブリン バリアーの生成を除去したり防
いだりすることに寄与していると考えられる。
ストレプトキナーゼとヒトの血漿中のプラスミノーゲ
ンとの相互反応により、この蛋白質は、プラスミノーゲ
ンを、蛋白質加水分解活性を有していてフィブリン凝固
物を可溶性物に分解することのできるプラスミンに変換
することができるものである。
ンとの相互反応により、この蛋白質は、プラスミノーゲ
ンを、蛋白質加水分解活性を有していてフィブリン凝固
物を可溶性物に分解することのできるプラスミンに変換
することができるものである。
現在、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織
プラスミノーゲン アクチベーターは、心筋炎、梗塞、
肺動脈、静脈の血栓塞栓症、他の血栓症などのような世
界で最も大きな死亡原因である障害において血栓溶解剤
として用いられている。
プラスミノーゲン アクチベーターは、心筋炎、梗塞、
肺動脈、静脈の血栓塞栓症、他の血栓症などのような世
界で最も大きな死亡原因である障害において血栓溶解剤
として用いられている。
ストレプトキナーゼは、その起源により、分子的な不
均一さの故に、物理化学的、免疫学的差異のみならず基
質特異性にも差異があるが、その機能においてはすべて
密接に関連している。
均一さの故に、物理化学的、免疫学的差異のみならず基
質特異性にも差異があるが、その機能においてはすべて
密接に関連している。
ストレプトコッカスの工業的生産に用いられている株
は、その収率が低いのとその天然宿主の病原性に加え、
デオキシリボヌクレアーゼ、ストレプトコッカス溶血
素、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼなどの他の産生物
を培地に分泌するので、所望の蛋白質の精製が困難にな
る。他方、これらの宿主から遺伝子学的に改良された株
を得ることは、遺伝子転移のための方法が開発されてい
ないために不可能であった。
は、その収率が低いのとその天然宿主の病原性に加え、
デオキシリボヌクレアーゼ、ストレプトコッカス溶血
素、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼなどの他の産生物
を培地に分泌するので、所望の蛋白質の精製が困難にな
る。他方、これらの宿主から遺伝子学的に改良された株
を得ることは、遺伝子転移のための方法が開発されてい
ないために不可能であった。
これらの欠点が、原核生物および真核生物を用いて、
ストレプトキナーゼ蛋白質をコードする単離された異な
った遺伝子のクローニングがいろいろと試みられてきて
いる理由である。
ストレプトキナーゼ蛋白質をコードする単離された異な
った遺伝子のクローニングがいろいろと試みられてきて
いる理由である。
西独特許第249493号（国際特許分類:C12 N15/00）に
は、Ｃ型ストレプトコッカス属のストレプトコッカス・
エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）の株H46
A由来のストレプトキナーゼをコードする遺伝子につい
て、大腸菌（E.coli）を宿主として用いて、クローニン
グと発現を行ない、培養世代によっては0.1〜1.8mg/
（培地）のレベルで目的物が培地中に分泌されたことが
記載されている。
は、Ｃ型ストレプトコッカス属のストレプトコッカス・
エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）の株H46
A由来のストレプトキナーゼをコードする遺伝子につい
て、大腸菌（E.coli）を宿主として用いて、クローニン
グと発現を行ない、培養世代によっては0.1〜1.8mg/
（培地）のレベルで目的物が培地中に分泌されたことが
記載されている。
この遺伝子（SKCと命名された）をコードする配列
は、その後、転写および翻訳に関与する隣接帯域の構造
およびシグナルペプチドも含めて決定された（Malke,H.
et al.,1985）。
は、その後、転写および翻訳に関与する隣接帯域の構造
およびシグナルペプチドも含めて決定された（Malke,H.
et al.,1985）。
Ｇ型およびＡ型ストレプトコッカス由来のストレプト
キナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列もその
後決定された（Walter,F.et al.,1985）。特に、ストレ
プトコッカス パイオジェネス（Streptococcus pyogen
es）のＭ型株49由来のＡ型ストレプトキナーゼの遺伝子
（SKA遺伝子）について、大腸菌JM109株およびストレプ
トコッカス サングイス（Streptococcus sanguis）チ
ャリス57E（Challis 57E）のそれぞれを用いて、クロー
ニングと発現を行なったことが報告されている（Huang,
T.T.et al.,1989）。そして、それぞれ、0.64mg/およ
び40μg/の蛋白収率を得ている。大腸菌の場合には、
回収蛋白質の94％が細胞周辺腔中に得られ、６％が細胞
質ゾル中に得られたのに対し、ストレプトコッカス サ
ングイス（S.sanguis）の場合には全部の酵素が細胞外
に得られた。更に、大腸菌中でストレプトキナーゼを産
生する多くのクローンは不安定であり、或る場合には、
SKA遺伝が除かれてしまったり、遺伝子産物の致死活性
のために宿主細胞が死んでしまったりする。
キナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列もその
後決定された（Walter,F.et al.,1985）。特に、ストレ
プトコッカス パイオジェネス（Streptococcus pyogen
es）のＭ型株49由来のＡ型ストレプトキナーゼの遺伝子
（SKA遺伝子）について、大腸菌JM109株およびストレプ
トコッカス サングイス（Streptococcus sanguis）チ
ャリス57E（Challis 57E）のそれぞれを用いて、クロー
ニングと発現を行なったことが報告されている（Huang,
T.T.et al.,1989）。そして、それぞれ、0.64mg/およ
び40μg/の蛋白収率を得ている。大腸菌の場合には、
回収蛋白質の94％が細胞周辺腔中に得られ、６％が細胞
質ゾル中に得られたのに対し、ストレプトコッカス サ
ングイス（S.sanguis）の場合には全部の酵素が細胞外
に得られた。更に、大腸菌中でストレプトキナーゼを産
生する多くのクローンは不安定であり、或る場合には、
SKA遺伝が除かれてしまったり、遺伝子産物の致死活性
のために宿主細胞が死んでしまったりする。
ストレプトコッカス サングイス（S.sanguis）の場
合には、得られる蛋白質分子は天然のストレプトキナー
ゼより約3,000ダルトン小さく、Ｃ末端から32個のアミ
ノ酸が欠落していることが検知されたが、しかし、生物
活性は影響されない（Huang,T.T.et al.,1989）。
合には、得られる蛋白質分子は天然のストレプトキナー
ゼより約3,000ダルトン小さく、Ｃ末端から32個のアミ
ノ酸が欠落していることが検知されたが、しかし、生物
活性は影響されない（Huang,T.T.et al.,1989）。
次いで、単離されたSKC遺伝子を大腸菌中でクローニ
ングと発現を行なうことの困難性についての決定的な結
果が得られた。即ち、得られた遺伝子は宿主の正常な生
理と干渉することが分かった。そのことは、この遺伝を
保持する細胞が粘液性を示すこと、細胞周辺腔へのスト
レプトキナーゼの輸送が不安定であること、SKC遺伝子
を保有して該蛋白質の高度の発現をするためのプラスミ
ドが構造的に不安定であること、また、大腸菌のプラス
ミドを用いて更なる血清型のストレプトコッカス由来の
ストレプトキナーゼ遺伝子のクローニングの際に種々の
問題に遭遇すること、ならびにSKG遺伝子自信の発現−
分泌シグナルの制御下に異種遺伝子の発現を試みたが不
成功に終わったことにより明らかである（Muller,J.et
al.,1989）。
ングと発現を行なうことの困難性についての決定的な結
果が得られた。即ち、得られた遺伝子は宿主の正常な生
理と干渉することが分かった。そのことは、この遺伝を
保持する細胞が粘液性を示すこと、細胞周辺腔へのスト
レプトキナーゼの輸送が不安定であること、SKC遺伝子
を保有して該蛋白質の高度の発現をするためのプラスミ
ドが構造的に不安定であること、また、大腸菌のプラス
ミドを用いて更なる血清型のストレプトコッカス由来の
ストレプトキナーゼ遺伝子のクローニングの際に種々の
問題に遭遇すること、ならびにSKG遺伝子自信の発現−
分泌シグナルの制御下に異種遺伝子の発現を試みたが不
成功に終わったことにより明らかである（Muller,J.et
al.,1989）。
もっと最近では、フィリップス ペトロリアム社（Ph
illips Petroleum）〔東独特許第257646号（国際特許分
類:C12N15/00）およびHaggenson,M.J.et al.,1989）
が、アルコール オキシダーゼの調節遺伝子の配列の制
御下にメタノール資化酵母（チロトローフ酵母ピヒア
パストリス（Pichia pastoris）中でストレプトキナー
ゼの発現を行ない、連続発酵法により目的物を77〜250m
l/g（培地）の収率で得、その際の中間細胞密度は46g/
であった。この系に用いた発現ベクターにおいては、
米国オクラホマ大学のJ.J.Ferretti博士より許諾された
プラスミドpMF5に含まれたSKC遺伝子が用いられてい
る。
illips Petroleum）〔東独特許第257646号（国際特許分
類:C12N15/00）およびHaggenson,M.J.et al.,1989）
が、アルコール オキシダーゼの調節遺伝子の配列の制
御下にメタノール資化酵母（チロトローフ酵母ピヒア
パストリス（Pichia pastoris）中でストレプトキナー
ゼの発現を行ない、連続発酵法により目的物を77〜250m
l/g（培地）の収率で得、その際の中間細胞密度は46g/
であった。この系に用いた発現ベクターにおいては、
米国オクラホマ大学のJ.J.Ferretti博士より許諾された
プラスミドpMF5に含まれたSKC遺伝子が用いられてい
る。
この系は、グルコースまたはグリセロールにより抑制
することができ、またメタノールにより誘導することが
でき、制御可能性の点において魅力のあるものだが、し
かし、その応用はこの宿主のみに限定される。
することができ、またメタノールにより誘導することが
でき、制御可能性の点において魅力のあるものだが、し
かし、その応用はこの宿主のみに限定される。
（問題を解決するための手段および作用） 本発明の目的は、Ｃ型ストレプトコッカス エクイシ
ミリス（Streptococcus equisimilis）ATCC−9542株由
来のストレプトキナーゼに対応する活性部分を含有する
生物学的に活性なストレプトキナーゼをコードするこれ
まで知られていない遺伝子変異体を表わす新規なヌクレ
オチド配列を含む発現ベクターを用いて、異種の種々の
宿主系にてストレプトキナーゼを高収率で得ることであ
る。この新規な遺伝子はSKC−２と命名されたが、SKCが
コードするものと同じ分子量の蛋白質をコードする。こ
れは、大腸菌および酵母類のベクターにおいて安定であ
るという基本的特性を有しており、細胞の成長や生存性
に対して悪影響はみられない。それ故、上記の両方の宿
主をそれぞれ用いて、これまで報告されている収率より
高い収率で目的とする蛋白質を得ることが可能になる。
上記のことは、このストレプトキナーゼが所望の生物学
的活性を有し、これ迄知られているものとは異なるスト
レプトキナーゼであることを示している。
ミリス（Streptococcus equisimilis）ATCC−9542株由
来のストレプトキナーゼに対応する活性部分を含有する
生物学的に活性なストレプトキナーゼをコードするこれ
まで知られていない遺伝子変異体を表わす新規なヌクレ
オチド配列を含む発現ベクターを用いて、異種の種々の
宿主系にてストレプトキナーゼを高収率で得ることであ
る。この新規な遺伝子はSKC−２と命名されたが、SKCが
コードするものと同じ分子量の蛋白質をコードする。こ
れは、大腸菌および酵母類のベクターにおいて安定であ
るという基本的特性を有しており、細胞の成長や生存性
に対して悪影響はみられない。それ故、上記の両方の宿
主をそれぞれ用いて、これまで報告されている収率より
高い収率で目的とする蛋白質を得ることが可能になる。
上記のことは、このストレプトキナーゼが所望の生物学
的活性を有し、これ迄知られているものとは異なるスト
レプトキナーゼであることを示している。
本発明によれば、SKC−２遺伝子である、その発現物
が約47,000ダルトンの蛋白であるところの新規なヌクレ
オチド配列の発現方法が提供される。この蛋白はストレ
プトキナーゼに属し、それは繊維素溶解活性によって特
徴づけられるものである。
が約47,000ダルトンの蛋白であるところの新規なヌクレ
オチド配列の発現方法が提供される。この蛋白はストレ
プトキナーゼに属し、それは繊維素溶解活性によって特
徴づけられるものである。
本発明はまた此の遺伝子に関するものであり、その配
列は次式のものからなる。
列は次式のものからなる。
この遺伝子は、Ｃ型ストレプトコッカス エクイシミ
リス（Streptococcus equisimilis）（ATCC−9542）の
ゲノムから遺伝子増幅により得られ、その際、次の配列
をそれぞれ有するSK1、SK2およびSK3と命名された合成
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラ
ーゼ チェイン反応（polymerase chain reaction）
（以下PCRと略記する）を利用する。
リス（Streptococcus equisimilis）（ATCC−9542）の
ゲノムから遺伝子増幅により得られ、その際、次の配列
をそれぞれ有するSK1、SK2およびSK3と命名された合成
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラ
ーゼ チェイン反応（polymerase chain reaction）
（以下PCRと略記する）を利用する。
これらは、本発明における新規な特徴を示す。これら
３種のプライマーは遺伝子には無い制限部位をそれぞれ
有しており、これらが発現ベクターによる直接のクロー
ニングを可能にする。一方、５′端にハイブリダイズす
るSK2はATGを有しており、これが翻訳開始部位として作
用し、またSKC−２のシグナルペプチドを除去する。こ
れらの３種のオリゴヌクレオチドは、Malke et al、198
5が開示したSKC配列から合成され、成熟蛋白質をコード
する遺伝子またはシグナルペプチドを含む完全遺伝子の
正確な断片の境界がこれらによってマークされる。
３種のプライマーは遺伝子には無い制限部位をそれぞれ
有しており、これらが発現ベクターによる直接のクロー
ニングを可能にする。一方、５′端にハイブリダイズす
るSK2はATGを有しており、これが翻訳開始部位として作
用し、またSKC−２のシグナルペプチドを除去する。こ
れらの３種のオリゴヌクレオチドは、Malke et al、198
5が開示したSKC配列から合成され、成熟蛋白質をコード
する遺伝子またはシグナルペプチドを含む完全遺伝子の
正確な断片の境界がこれらによってマークされる。
この方法のもう一つの特徴は、単離された遺伝子を、
細菌および酵母の両者のいずれを用いても、高い発現能
をもって発現することができることである。
細菌および酵母の両者のいずれを用いても、高い発現能
をもって発現することができることである。
本発明は又、SKC−２遺伝子を含む組換体DNAに関す
る。その例は、細菌での発現に適したベクターpEKG3
（第１図参照）、ならびに酵母での発現に適したpPESKC
−４およびpPISKC−６（第３図参照）である。更に詳細
には、大腸菌での発現のためには、シグナルペプチドを
含むかまたは含まないSKC−２遺伝子を、トリプトファ
ン プロモーターの制御下で且つファージT4の転写終始
シグナル付きで、クローニングする。酵母での発現のた
めには、キューバ国発明者証願第7/90号に記載されてい
る発現ベクターを用いる。その発現ベクターにおいて
は、細胞外発現変異体として、ピヒア パストリス（Pi
chia pastoris）のアルコール オキシダーゼ遺伝子プ
ロモーター（AOX1）により制御されるスクローゼ イン
ベルターゼ（SUC2）のシグナルペプチドの後にSKC−２
が位置しており、且つ該発現ベクターは、サッカロマイ
セス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のグリ
セラルデヒド−３−フォスフェート デヒドロギナーゼ
（GAPt）の終止シグナルを含んでいる。この発現ベクタ
ーをpPESKC−４と命名する。SKC−２の細胞内発現のた
めにはベクターpPISKC−６を用い、このベクターはAOX1
プロモーターの後にSUC2のシグナルペプチドを含まな
い。このベクターは、SKC−２遺伝子を発現ベクターpNA
O（キューバ国ハバナ、GIGB、Muzioから入手できる）
（第３図参照）に挿入することにより得られる。サッカ
ロマイセス セレビシエ（S.cerevisiae）のHIS3遺伝子
は上記の両ベクターにおいて選択マーカーとして用いら
れる。上記した発現部分（expression cassette）に
は、組込みのために、ピヒア パストリス（Pichia pas
toris）のAOX遺伝子の５′および３′配列が隣接してい
る。
る。その例は、細菌での発現に適したベクターpEKG3
（第１図参照）、ならびに酵母での発現に適したpPESKC
−４およびpPISKC−６（第３図参照）である。更に詳細
には、大腸菌での発現のためには、シグナルペプチドを
含むかまたは含まないSKC−２遺伝子を、トリプトファ
ン プロモーターの制御下で且つファージT4の転写終始
シグナル付きで、クローニングする。酵母での発現のた
めには、キューバ国発明者証願第7/90号に記載されてい
る発現ベクターを用いる。その発現ベクターにおいて
は、細胞外発現変異体として、ピヒア パストリス（Pi
chia pastoris）のアルコール オキシダーゼ遺伝子プ
ロモーター（AOX1）により制御されるスクローゼ イン
ベルターゼ（SUC2）のシグナルペプチドの後にSKC−２
が位置しており、且つ該発現ベクターは、サッカロマイ
セス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のグリ
セラルデヒド−３−フォスフェート デヒドロギナーゼ
（GAPt）の終止シグナルを含んでいる。この発現ベクタ
ーをpPESKC−４と命名する。SKC−２の細胞内発現のた
めにはベクターpPISKC−６を用い、このベクターはAOX1
プロモーターの後にSUC2のシグナルペプチドを含まな
い。このベクターは、SKC−２遺伝子を発現ベクターpNA
O（キューバ国ハバナ、GIGB、Muzioから入手できる）
（第３図参照）に挿入することにより得られる。サッカ
ロマイセス セレビシエ（S.cerevisiae）のHIS3遺伝子
は上記の両ベクターにおいて選択マーカーとして用いら
れる。上記した発現部分（expression cassette）に
は、組込みのために、ピヒア パストリス（Pichia pas
toris）のAOX遺伝子の５′および３′配列が隣接してい
る。
本発明は又、大腸菌W3110株をベクターpEKG3で形質転
換して得られる微生物、ピヒア パストリス（Pichia p
astoris）の変異株MP−36（キューバ国発明者証願第7/9
0号に記載されている）を発現ベクターpPESKCP−４およ
びpPISKC−６で形質転換して得られる微生物にも関す
る。これらの微生物は、ストレプトキナーゼを高度の発
現能で産生することができ、かつ形質転換された株は高
い生存性（発現物が細胞の生長に悪影響を与えない）と
高い安定性を有するものである。
換して得られる微生物、ピヒア パストリス（Pichia p
astoris）の変異株MP−36（キューバ国発明者証願第7/9
0号に記載されている）を発現ベクターpPESKCP−４およ
びpPISKC−６で形質転換して得られる微生物にも関す
る。これらの微生物は、ストレプトキナーゼを高度の発
現能で産生することができ、かつ形質転換された株は高
い生存性（発現物が細胞の生長に悪影響を与えない）と
高い安定性を有するものである。
上記の形質転換された大腸菌株は、HSK−Ｍと命名さ
れ、SKC−２遺伝子の発現を350mg/（培地）以上の高
収率で行なう。
れ、SKC−２遺伝子の発現を350mg/（培地）以上の高
収率で行なう。
また、上記の形質転換されたピヒア パストリス（Pi
chia pastoris）の２種の株はそれぞれMSK−M4とMSK−M
6と命名され、それぞれ細胞内的および細胞外的に、1.0
〜1.2g/（培地）の高い収率でストレプトキナーゼを
産生する。
chia pastoris）の２種の株はそれぞれMSK−M4とMSK−M
6と命名され、それぞれ細胞内的および細胞外的に、1.0
〜1.2g/（培地）の高い収率でストレプトキナーゼを
産生する。
本発明の方法によれば、これまでに報告されたどの発
現能よりも高い発現能でもってストレプトキナーゼが産
生されるのみならず、得られる産生物は、複数のコスト
のかかる精製を特に必要とせずに、ヒトおよび動物への
投与に適した好ましい純度にすることができる。
現能よりも高い発現能でもってストレプトキナーゼが産
生されるのみならず、得られる産生物は、複数のコスト
のかかる精製を特に必要とせずに、ヒトおよび動物への
投与に適した好ましい純度にすることができる。
（実施例） 次に述べる実施例により本発明を更に詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、次の実施例では宿主系としてイー．コリ（E.co
li）およびピヒア パストリス（Pichia pastoris）を
用いたが、他の真核生物および原核生物も本発明に用い
ることができる。
li）およびピヒア パストリス（Pichia pastoris）を
用いたが、他の真核生物および原核生物も本発明に用い
ることができる。
実施例１ Ｃ型ストレプトコッカス エクイシミリス（Streptoc
occus equisimilis）のゲノムDNAを単離するために、株
ATCC−9542をSK遺伝子のクローニングのための源として
用いた。ストレプトコッカス エクイシミリスの細胞を
ブレイン ハート インフュージョン メディアム（Br
ain Heart Infusuion Medium）（GIBCO）で、37℃で12
時間回転数240r.p.m.で成長させ、その際イノキュラム
（inoculum）として作用する前培養物（pre−culture
s）（300mlのエルレンマイヤー フラスコで12時間成長
させたもの）5mlを用いた。3,000r.p.m.の遠心分離によ
り細胞を集め、8mlのライス（lyse）（グルコース4.5
g、EDTA 1.86gおよびトリス塩酸1.51gを5,000ml無菌水
に溶解したものでpH＝８）に再懸濁させ、リゾチーム80
を10mg/mlの濃度で加え、懸濁液を37℃で30分間インキ
ュベートした。次に、細胞を十分に破砕するために、50
μのプロナーゼ〔ベーリンガー社（Boehringer）〕、
1mlの10％SDSおよび200μのEDTA（0.5M pH＝８）を加
え、懸濁液をゆるやかに撹拌しながら50℃で２時間イン
キュベートした。次に、フェノール、フェノール−クロ
ロホルム、およびクロロホルムで処理し、ゲノムDNAを
無水アルコールとNH4Ac（7.5M）により沈殿させた。
occus equisimilis）のゲノムDNAを単離するために、株
ATCC−9542をSK遺伝子のクローニングのための源として
用いた。ストレプトコッカス エクイシミリスの細胞を
ブレイン ハート インフュージョン メディアム（Br
ain Heart Infusuion Medium）（GIBCO）で、37℃で12
時間回転数240r.p.m.で成長させ、その際イノキュラム
（inoculum）として作用する前培養物（pre−culture
s）（300mlのエルレンマイヤー フラスコで12時間成長
させたもの）5mlを用いた。3,000r.p.m.の遠心分離によ
り細胞を集め、8mlのライス（lyse）（グルコース4.5
g、EDTA 1.86gおよびトリス塩酸1.51gを5,000ml無菌水
に溶解したものでpH＝８）に再懸濁させ、リゾチーム80
を10mg/mlの濃度で加え、懸濁液を37℃で30分間インキ
ュベートした。次に、細胞を十分に破砕するために、50
μのプロナーゼ〔ベーリンガー社（Boehringer）〕、
1mlの10％SDSおよび200μのEDTA（0.5M pH＝８）を加
え、懸濁液をゆるやかに撹拌しながら50℃で２時間イン
キュベートした。次に、フェノール、フェノール−クロ
ロホルム、およびクロロホルムで処理し、ゲノムDNAを
無水アルコールとNH4Ac（7.5M）により沈殿させた。
得られた収率は300mlのエルレンマイアー培養フラス
コ当り100μｇであった。ストレプトキナーゼをコード
する遺伝子の存在はサザーン ブロット法（Maniatis e
t al.,1982）により確認した。
コ当り100μｇであった。ストレプトキナーゼをコード
する遺伝子の存在はサザーン ブロット法（Maniatis e
t al.,1982）により確認した。
実施例２ 細菌でサブクローニングするために、Ｃ型ストレプト
コッカス エクイシミリス（Streptococcus equisimili
s）株ATCC−9542のゲノムDNA1μｇを取り、SCK−２遺伝
子をコードする遺伝子をPCR（Randall et al.,1988）に
より増幅した。その際シグナルペプチドのある遺伝子を
クローニングするためにはオリゴヌクレオチドSK1およ
びSK2を用い、シグナルペプチドの無い遺伝子をクロー
ニングするためにはSK2およびSK3を用いた。
コッカス エクイシミリス（Streptococcus equisimili
s）株ATCC−9542のゲノムDNA1μｇを取り、SCK−２遺伝
子をコードする遺伝子をPCR（Randall et al.,1988）に
より増幅した。その際シグナルペプチドのある遺伝子を
クローニングするためにはオリゴヌクレオチドSK1およ
びSK2を用い、シグナルペプチドの無い遺伝子をクロー
ニングするためにはSK2およびSK3を用いた。
各反応において、各オリゴヌクレオチドを100pmol、T
aqポリメラーゼ（Teq polymerase）〔米国パーキン エ
ルマー社（Perkin Elmer）〕を２単位および各dNTPを20
0μmolを用いた。反応は、10mM NaClおよび100μg/mlゼ
ラチン中で行なった。
aqポリメラーゼ（Teq polymerase）〔米国パーキン エ
ルマー社（Perkin Elmer）〕を２単位および各dNTPを20
0μmolを用いた。反応は、10mM NaClおよび100μg/mlゼ
ラチン中で行なった。
30回の増幅サイクルを行ない、各サイクルにおいて、
インキュベートは95℃で１分間行なって変性させ、52℃
で45秒間行なってオリゴヌクレオチドをハイブリダイズ
させ、70℃で80秒行なって延長（extension）させた。
増幅は５％以上の効率で行なわれた。
インキュベートは95℃で１分間行なって変性させ、52℃
で45秒間行なってオリゴヌクレオチドをハイブリダイズ
させ、70℃で80秒行なって延長（extension）させた。
増幅は５％以上の効率で行なわれた。
細菌（大腸菌）でクローニングするために、これ迄報
告されていない遺伝子構造、すなわち、大腸菌のトリプ
トファン プロモーターとバクテリオファージT4の終止
シグナルを有しているものを用いた。PORで増幅した断
片をBamH Iで消化し、ベクターptrip−Nco I−S1−BamH
I（Estrada et al.,1988）に組込んだ。この遺伝子構
造体を、大腸菌（E.coli）株HB101｛（rB-mB-）、supE
44、ara−14、galK−２、lacY1、proA2、rpsL20、（St
r）、xy1−５、mt1−５、mt1−１、recA13｝の細胞にDa
gert et al.,（1974）およびHanahan et al.（1983）の
方法に従って感染させたところ、DNAg当り107以上の度
数で形質転換体を得た。
告されていない遺伝子構造、すなわち、大腸菌のトリプ
トファン プロモーターとバクテリオファージT4の終止
シグナルを有しているものを用いた。PORで増幅した断
片をBamH Iで消化し、ベクターptrip−Nco I−S1−BamH
I（Estrada et al.,1988）に組込んだ。この遺伝子構
造体を、大腸菌（E.coli）株HB101｛（rB-mB-）、supE
44、ara−14、galK−２、lacY1、proA2、rpsL20、（St
r）、xy1−５、mt1−５、mt1−１、recA13｝の細胞にDa
gert et al.,（1974）およびHanahan et al.（1983）の
方法に従って感染させたところ、DNAg当り107以上の度
数で形質転換体を得た。
得られたコロニーをLB培地（10g/トリプトファン、
5g/酵母エキストラクトおよび10g/塩化ナトリウ
ム）および50μg/mlのアンピシリンのプレートに移し、
Maniatis et al.（1982）の方法に従って、ハイブリダ
イズしたが、その後プロープとしてdATP32（英国、Amer
sham社）で標識したPCRによる増幅で得られた断片およ
び大腸菌のDNA−ポリメラーゼのクレノウ断片（Klenow
fragment）（Maniatis et al.,1982）を用い、ホアット
マン541フィルター（Whatman 541 filters）により37℃
で行なった。反応はEDTAと加熱により終止させた。コロ
ニーの４％が陽性コロニーであり、制限分析により調べ
たところ10以上の制限酵素で同じ消化パターンを有して
いた。更に、該陽性クローンを、２重鎖DNAシークェン
シング（Senger et al.,1977）により、プロモーターの
３′端にハイブリダイズする17塩基のオリゴヌクレオチ
ド（５′…ATCATCGAACTAGTTAA…３′）を用いて調べた
結果、これが望み通りSKC−２遺伝子に結合しているこ
とが分かった。
5g/酵母エキストラクトおよび10g/塩化ナトリウ
ム）および50μg/mlのアンピシリンのプレートに移し、
Maniatis et al.（1982）の方法に従って、ハイブリダ
イズしたが、その後プロープとしてdATP32（英国、Amer
sham社）で標識したPCRによる増幅で得られた断片およ
び大腸菌のDNA−ポリメラーゼのクレノウ断片（Klenow
fragment）（Maniatis et al.,1982）を用い、ホアット
マン541フィルター（Whatman 541 filters）により37℃
で行なった。反応はEDTAと加熱により終止させた。コロ
ニーの４％が陽性コロニーであり、制限分析により調べ
たところ10以上の制限酵素で同じ消化パターンを有して
いた。更に、該陽性クローンを、２重鎖DNAシークェン
シング（Senger et al.,1977）により、プロモーターの
３′端にハイブリダイズする17塩基のオリゴヌクレオチ
ド（５′…ATCATCGAACTAGTTAA…３′）を用いて調べた
結果、これが望み通りSKC−２遺伝子に結合しているこ
とが分かった。
選択されたクローンをpEKG−３（第３図参照）と命名
し、これを発酵にかけて産物物の同定を行なった。
し、これを発酵にかけて産物物の同定を行なった。
クローンpEKG3のプラスミドをCsClグレディエントを
用いて精製し、SKC−２遺伝子の配列を決定したが、そ
の際プラスミドは2g用い、また下記に示すオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いた。
用いて精製し、SKC−２遺伝子の配列を決定したが、そ
の際プラスミドは2g用い、また下記に示すオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いた。
その具体的な方法はサンガー等〔Sanger et al.（197
7）〕の方法に従い、dATP32およびS35dATP（英国、Amer
sham社）を用いた。
7）〕の方法に従い、dATP32およびS35dATP（英国、Amer
sham社）を用いた。
第２図に、SKC−２の塩基配列から誘導されたアミノ
酸配列と、SKC（Malke et al,1986）ならびに、SKAおよ
びSKG（Water,F.et al.,1989）の各遺伝子によってコー
ドされる各アミノ酸配列とを比較して示す。
酸配列と、SKC（Malke et al,1986）ならびに、SKAおよ
びSKG（Water,F.et al.,1989）の各遺伝子によってコー
ドされる各アミノ酸配列とを比較して示す。
プラスミドpEKG3を種々のイー．コリ（E.coli）株（W
3110、JM101、LE392およびMC−1061）に移植し、ストレ
プトキナーゼの発現を比較したところ、株W3110（F-sup
F supE hsdR galK TrpR metB lacY tonA）が最も良好な
結果を示した。従って、これを選んで発酵にかけたとこ
ろ、細胞の全蛋白質含有量が20％以上という高い収率が
得られ、350〜400mg/（培地）のストレプトキナーゼ
を得た。
3110、JM101、LE392およびMC−1061）に移植し、ストレ
プトキナーゼの発現を比較したところ、株W3110（F-sup
F supE hsdR galK TrpR metB lacY tonA）が最も良好な
結果を示した。従って、これを選んで発酵にかけたとこ
ろ、細胞の全蛋白質含有量が20％以上という高い収率が
得られ、350〜400mg/（培地）のストレプトキナーゼ
を得た。
実施例３ 酵母でSKC1−２をサブクローニングするために、ピヒ
ハ パストリス（Pichia pastoris）の株MP36を宿主と
して用いた。細胞内発現および細胞外発現のための変異
体をプラスミドpNA0およびpPS7（第３図参照）から作成
したが、細胞外発現のためにはスクロース インベルダ
ーゼのシグナルペプチドを用い、細胞内外のどちらの場
合にも、遺伝子のサブクローニングは、プロモーターと
してはアルコール オキシダーゼ（AOX）プロモーター
を用い、３′端でのターミネーターとしてはエス．セレ
ビシエ（S.cerevisiae）のグリセラルデハイド−３−フ
ォスフェート デヒドロギナーゼ遺伝子の終止シグナル
を用いて、また酵母のゲノムの相同性による組込のため
にAOX遺伝の非コード３′−領域（non−coding 3′regi
on）を用い、更にまた株MP36his-での選択のためにヒス
チジン３をコードする遺伝子を用いた。
ハ パストリス（Pichia pastoris）の株MP36を宿主と
して用いた。細胞内発現および細胞外発現のための変異
体をプラスミドpNA0およびpPS7（第３図参照）から作成
したが、細胞外発現のためにはスクロース インベルダ
ーゼのシグナルペプチドを用い、細胞内外のどちらの場
合にも、遺伝子のサブクローニングは、プロモーターと
してはアルコール オキシダーゼ（AOX）プロモーター
を用い、３′端でのターミネーターとしてはエス．セレ
ビシエ（S.cerevisiae）のグリセラルデハイド−３−フ
ォスフェート デヒドロギナーゼ遺伝子の終止シグナル
を用いて、また酵母のゲノムの相同性による組込のため
にAOX遺伝の非コード３′−領域（non−coding 3′regi
on）を用い、更にまた株MP36his-での選択のためにヒス
チジン３をコードする遺伝子を用いた。
ベクターpPESKC−４（蛋白質の細胞外発現のためのプ
ラスミド）はSKC−２遺伝子を挿入したベクター構造体p
PS−Nco I−S1ヌクレアーゼ−フォスファターゼから得
られた。該SKC−２遺伝子は、PCRによりpEKG3から得ら
れ、その際、プライマーとしては、オリゴヌクレオチド
SK2と、また遺伝子の５′端とハイブリダイズし且つATG
（細胞での発現のために挿入してあったもの）を除く新
しいプライマーとを用いて増幅したものである。細胞内
発現の場合には、SKC−２のバンドを挿入したベクターp
NA0−Nco I−EcoR I−S1ヌクレアーゼ−フォスファター
ゼからpPISKC−６を得た。該SKC−２は、PCRにより、プ
ライマーとしてSK2およびSK3を用いて増幅したものであ
る。こうして、ストレプトキナーゼをコードしかつ５′
端にATGを有する正確な遺伝子が得られる（第３図参
照）。両プラスミドでもって、クレッグ等（Cregg,J.et
al.,1985）の方法により株MP36his-を形質転換した。
ラスミド）はSKC−２遺伝子を挿入したベクター構造体p
PS−Nco I−S1ヌクレアーゼ−フォスファターゼから得
られた。該SKC−２遺伝子は、PCRによりpEKG3から得ら
れ、その際、プライマーとしては、オリゴヌクレオチド
SK2と、また遺伝子の５′端とハイブリダイズし且つATG
（細胞での発現のために挿入してあったもの）を除く新
しいプライマーとを用いて増幅したものである。細胞内
発現の場合には、SKC−２のバンドを挿入したベクターp
NA0−Nco I−EcoR I−S1ヌクレアーゼ−フォスファター
ゼからpPISKC−６を得た。該SKC−２は、PCRにより、プ
ライマーとしてSK2およびSK3を用いて増幅したものであ
る。こうして、ストレプトキナーゼをコードしかつ５′
端にATGを有する正確な遺伝子が得られる（第３図参
照）。両プラスミドでもって、クレッグ等（Cregg,J.et
al.,1985）の方法により株MP36his-を形質転換した。
陽性クローンをサザーン ブロット法（Maniatis et
al.,1982）により調べ、正しい組込みを有しているもの
から最も生産性の高いものを選択して用いた。
al.,1982）により調べ、正しい組込みを有しているもの
から最も生産性の高いものを選択して用いた。
ピー．パストリス（P.pastoris）を用いて細胞外に組
換体ストレプトキナーゼを発現させたところその発現能
は１〜1.2g/（培地の上清）であり、細胞内発現のベ
クター構成体の場合にはその発現能は1.0g/（培地）
であった。
換体ストレプトキナーゼを発現させたところその発現能
は１〜1.2g/（培地の上清）であり、細胞内発現のベ
クター構成体の場合にはその発現能は1.0g/（培地）
であった。
細胞外発現の場合には、分子量が67,000ダルトン以上
の糖蛋白質が得られ、ウェスターン プロットにより調
べたところ、エンドグリコシダーゼＨで消化すると天然
ストレプトキナーゼの分子量に減少することが確認され
た。これは９次のようにして行なった。クエン酸ナトリ
ウム溶液中1mg/濃度の試料（0.05モル、pH＝5.5）を
とり、SDS（最終濃度0.02％）を加え、100℃で10分加熱
した。次いで、周囲温度に放置、冷却し、20ミリ単位
（mU）のエンドグリコシダーゼＨ（endo H）を加えて37
℃で16時間放置した。その終り頃に、100℃で５分間加
熱し、10mUのendo Hを加え、その後、30℃で12時間イン
キュベートしてから、12.5％ポリアクリルアミド ゲル
にかけ、もとの糖蛋白試料と比較した。
の糖蛋白質が得られ、ウェスターン プロットにより調
べたところ、エンドグリコシダーゼＨで消化すると天然
ストレプトキナーゼの分子量に減少することが確認され
た。これは９次のようにして行なった。クエン酸ナトリ
ウム溶液中1mg/濃度の試料（0.05モル、pH＝5.5）を
とり、SDS（最終濃度0.02％）を加え、100℃で10分加熱
した。次いで、周囲温度に放置、冷却し、20ミリ単位
（mU）のエンドグリコシダーゼＨ（endo H）を加えて37
℃で16時間放置した。その終り頃に、100℃で５分間加
熱し、10mUのendo Hを加え、その後、30℃で12時間イン
キュベートしてから、12.5％ポリアクリルアミド ゲル
にかけ、もとの糖蛋白試料と比較した。
細胞外発現性ベクターおよび細胞内発現性ベクターの
両方の場合において、ピヒア パストリス（Pichia pas
toris）が産生したストレプトキナーゼは生理活性を有
し、そのプラスミノーゲンへの親和性も変らず、臨床医
薬として有用な変異体であった。
両方の場合において、ピヒア パストリス（Pichia pas
toris）が産生したストレプトキナーゼは生理活性を有
し、そのプラスミノーゲンへの親和性も変らず、臨床医
薬として有用な変異体であった。
実施例４ SKC−２遺伝子の産生物の生理活性を調べるために、
細菌および酵母のそれぞれから得られた純粋の組換スト
レプトキナーゼを用いて、急性および亜急性毒性試験を
ラットについて行なった。その結果、ヒトおよび動物の
治療に使用するに十分の満足な結果が得られた。そのin
vivo繊維素溶解活性を動物について臨床試験をした結
果、犬の冠状動脈および大腿動脈での血餅を溶解し、こ
の種の蛋白質についてこれまで報告されているのと同様
の血液パラメーターを維持した。
細菌および酵母のそれぞれから得られた純粋の組換スト
レプトキナーゼを用いて、急性および亜急性毒性試験を
ラットについて行なった。その結果、ヒトおよび動物の
治療に使用するに十分の満足な結果が得られた。そのin
vivo繊維素溶解活性を動物について臨床試験をした結
果、犬の冠状動脈および大腿動脈での血餅を溶解し、こ
の種の蛋白質についてこれまで報告されているのと同様
の血液パラメーターを維持した。
SKC−２遺伝子の産生物は、アガロース−フィブリン
のプレート（Astrup et al.,1952）、クロモジェニック
基質（chromogenic substrate）（Friberger et al.,19
82）およびin vitro血餅溶解（Westlund et al.,1985）
について測定したところ、50,000〜100,000IU/mgの比活
性を示した。
のプレート（Astrup et al.,1952）、クロモジェニック
基質（chromogenic substrate）（Friberger et al.,19
82）およびin vitro血餅溶解（Westlund et al.,1985）
について測定したところ、50,000〜100,000IU/mgの比活
性を示した。
実施例５ SKC−２遺伝子の塩基配列から演繹されるアミノ酸配
列を確認するために、高速逆相液体クロマトグラフィー
（HPLC−RP）による分析〔C8 4.6×250mmカラム（米国
ベーカー社）〕を行なった。分析においては、バッファ
ーＡ〔トリフルオロ錯酸（TFA）（Pierce社、米国）の
１％蒸留水溶液〕とバッファーＢ（TFAの0.5％アセトニ
トリル溶液（Lichrosoly）（メルク社、西独）を用い、
５分はバッファーB0％で55分でバッファーB90％までと
なる勾配を用い、流速は0.8ml/分とした。
列を確認するために、高速逆相液体クロマトグラフィー
（HPLC−RP）による分析〔C8 4.6×250mmカラム（米国
ベーカー社）〕を行なった。分析においては、バッファ
ーＡ〔トリフルオロ錯酸（TFA）（Pierce社、米国）の
１％蒸留水溶液〕とバッファーＢ（TFAの0.5％アセトニ
トリル溶液（Lichrosoly）（メルク社、西独）を用い、
５分はバッファーB0％で55分でバッファーB90％までと
なる勾配を用い、流速は0.8ml/分とした。
高純度のものを用いて、SKC−２遺伝子について得ら
れた塩基配列より演繹されたアミノ酸配列が正しいかど
うかについて、質量スペクトログラフィーにより調べ
た。そのために、得られた蛋白質を異種の酵素およびそ
の組合せにより消化した。用いた酵素は、キモトリプシ
ン、エンドプロテイナーゼGlue−Ｃ、エンドプロテイナ
ーゼLys−Ｃおよびトリプシンである。
れた塩基配列より演繹されたアミノ酸配列が正しいかど
うかについて、質量スペクトログラフィーにより調べ
た。そのために、得られた蛋白質を異種の酵素およびそ
の組合せにより消化した。用いた酵素は、キモトリプシ
ン、エンドプロテイナーゼGlue−Ｃ、エンドプロテイナ
ーゼLys−Ｃおよびトリプシンである。
異種の酵素で種々の消化によって得られたペプチドの
質量スペクトログラフ分析から、蛋白質のアミノ酸配列
地図を重疊によって作成したところ、SKC−２遺伝子の
塩基配列と得られたアミノ酸配列は100％符号してい
た。
質量スペクトログラフ分析から、蛋白質のアミノ酸配列
地図を重疊によって作成したところ、SKC−２遺伝子の
塩基配列と得られたアミノ酸配列は100％符号してい
た。
株の寄託 大腸菌株Ｗ−3110に基づきかつプラスミドpEKG3を含
有するイー．コリ（E.coli）HSK−Ｍ〔pEKG3〕株は1990
年６月11日にオランダ国バールンのセントラルビューロ
ー ブア シメルカルチャーズ（the Centraalbureau v
oor Schimmelcultures）（CBS）にCBS243.90の番号で寄
託されている。
有するイー．コリ（E.coli）HSK−Ｍ〔pEKG3〕株は1990
年６月11日にオランダ国バールンのセントラルビューロ
ー ブア シメルカルチャーズ（the Centraalbureau v
oor Schimmelcultures）（CBS）にCBS243.90の番号で寄
託されている。
同様に、ピヒア パストリス（Pichia pastoris）株M
P−36に基づきかつプラスミドpPESKG−４を含有するピ
ヒア パストリス（Pichia pastoris）MSK−M4〔pPESKC
−４〕株は、1990年６月11日にオランダ国CBSにCBS244.
90の番号で寄託されている。
P−36に基づきかつプラスミドpPESKG−４を含有するピ
ヒア パストリス（Pichia pastoris）MSK−M4〔pPESKC
−４〕株は、1990年６月11日にオランダ国CBSにCBS244.
90の番号で寄託されている。
次に、本発明で略記引用された参考文献を列挙する。
（１）Astrup,T.,and Mullertz,S.,1952,Arch.Biochem.
Biophys.40:46−351; （２）Burnett,N.N.,1981,Anal.Biochemistry 112:195
−203; （３）Gregg,J.M.,Barringer,K.J.,Hessler,A.Y.,and M
adden,K.R.,1985,Mol.Cell.Biol.5:3376−3385; （４）Dagert,M.,and Ehrlich,S.D.,1974,Gene 6:23p2
8; （５）Dykewicz,M.S.,McGrath,K.G.,Harris,K.E.,and P
atterson,R.,1985,Int,Arch.Allergy Appl.Immun.78:38
6−390; （６）Estrada,M.P.,Hernandez,O.,and de la Fuente,
J.,Interferon y Biotecnologia 5:152−156; （７）Friberger.P.,1982,J.Clin.Lab.Invest.42,Supp
l.162:49−54; （８）Hanahan,D.,1983,J.Mol.Biol.166:557−580; （９）Huang,T.T.,Malke,H.,and Ferretti,J.J.,1989,M
olec.Microb.3（２）:197−205; （10）Malke,H.,and Ferretti,J.J.,1984,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,81:3557−3561; （11）Melke,H.,Roe,B.,and Ferretti,J.J.,1985,Gene
34:357−362; （12）Maniatis,T.,Frisch,E.F.,and Sambrook,J.,198
2,Cold Spring Harbor Laboratry,USA; （13）Mcgrath,K.G.,Zeffren,B.,Alexander,J.,Kaplan,
K.,and Patterson,R.J.,1985,Allergy Clin.Immunol.7
6:453−457; （14）Muller,j.,Reinert,H.,and Malke,H.,1989,Hourn
al of Bacteriology,Apr.:2202−2208; （15）Randall,K.,Gelfond,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,
S.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.,and Eylich,H.
A.,1988,Science 239:487−491; （16）Sanger,F.,Nickler,S.,and Coulson,A.K.,1977,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467; （17）Tombin,H.,Stahelin,T.,and Grodon,J.,1979,Pro
c,Natl.Acad.Sci.USA 76:4350−4354; （18）Walter,F.,Siegel,M.,and Malke,H.,1989,Nucl.A
cids Res.17（３）:1262;および （19）Westlund,L.E.,and Anderson,L.O.,1985,Thrombo
sis Research 37:213−223。
Biophys.40:46−351; （２）Burnett,N.N.,1981,Anal.Biochemistry 112:195
−203; （３）Gregg,J.M.,Barringer,K.J.,Hessler,A.Y.,and M
adden,K.R.,1985,Mol.Cell.Biol.5:3376−3385; （４）Dagert,M.,and Ehrlich,S.D.,1974,Gene 6:23p2
8; （５）Dykewicz,M.S.,McGrath,K.G.,Harris,K.E.,and P
atterson,R.,1985,Int,Arch.Allergy Appl.Immun.78:38
6−390; （６）Estrada,M.P.,Hernandez,O.,and de la Fuente,
J.,Interferon y Biotecnologia 5:152−156; （７）Friberger.P.,1982,J.Clin.Lab.Invest.42,Supp
l.162:49−54; （８）Hanahan,D.,1983,J.Mol.Biol.166:557−580; （９）Huang,T.T.,Malke,H.,and Ferretti,J.J.,1989,M
olec.Microb.3（２）:197−205; （10）Malke,H.,and Ferretti,J.J.,1984,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,81:3557−3561; （11）Melke,H.,Roe,B.,and Ferretti,J.J.,1985,Gene
34:357−362; （12）Maniatis,T.,Frisch,E.F.,and Sambrook,J.,198
2,Cold Spring Harbor Laboratry,USA; （13）Mcgrath,K.G.,Zeffren,B.,Alexander,J.,Kaplan,
K.,and Patterson,R.J.,1985,Allergy Clin.Immunol.7
6:453−457; （14）Muller,j.,Reinert,H.,and Malke,H.,1989,Hourn
al of Bacteriology,Apr.:2202−2208; （15）Randall,K.,Gelfond,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,
S.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.,and Eylich,H.
A.,1988,Science 239:487−491; （16）Sanger,F.,Nickler,S.,and Coulson,A.K.,1977,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467; （17）Tombin,H.,Stahelin,T.,and Grodon,J.,1979,Pro
c,Natl.Acad.Sci.USA 76:4350−4354; （18）Walter,F.,Siegel,M.,and Malke,H.,1989,Nucl.A
cids Res.17（３）:1262;および （19）Westlund,L.E.,and Anderson,L.O.,1985,Thrombo
sis Research 37:213−223。
第１図はSKC−２遺伝子を組込んだプラスミドpEKG−３
であり、大腸菌のトリプトファン プロモーターを有し
ており、また該遺伝子の３′端にはバクテリオファージ
T4の終止シグナルを持っていて、発現に対して高い安定
性を示す。第２図はSKC−２、SKC、SKGおよびSKAの各遺
伝子の塩基配列より演繹されるアミノ酸配列（１文字式
略記号により表示したもの）の比較を示す。第３図は、
ピヒア パストリス（Pichia pastoris）での細胞外お
よび細胞内の発現にそれぞれ適合したプラスミドpPESKC
−４およびプラスミドpPISKC−６を示す。
であり、大腸菌のトリプトファン プロモーターを有し
ており、また該遺伝子の３′端にはバクテリオファージ
T4の終止シグナルを持っていて、発現に対して高い安定
性を示す。第２図はSKC−２、SKC、SKGおよびSKAの各遺
伝子の塩基配列より演繹されるアミノ酸配列（１文字式
略記号により表示したもの）の比較を示す。第３図は、
ピヒア パストリス（Pichia pastoris）での細胞外お
よび細胞内の発現にそれぞれ適合したプラスミドpPESKC
−４およびプラスミドpPISKC−６を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/70 Ａ６１Ｋ 37/54 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/70 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 アイメー ペーレス フェリペ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ラ リサ、エントレ 220 イ 222、アベ 73 22005 (72)発明者 ロヘール ルビエラ チャープレン キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、エントレ パセーオ イ ア、ベダ ード、カッレ ５ アー 455 (72)発明者 リカルド セリャーノ ドーセ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ベダード、エントレ 10 イ 12、 カッレ 17 1004 (72)発明者 ルシアーノ フランシスコ ヘルナンデ ス マリェーロ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ハバナ デル エステ、グアナー ボ、エントレ 476 イ 478、カッレ ５ アー デ 47608 (72)発明者 ペドロ ロドリゲス コリャーソ キューバ国、ラ ハバナ、アルテミサ、 アプト ２、カッレ 33 ５ (72)発明者 アナイセル カストロ ラミーレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ラウトン、アプト ９、エントレ ボウサ イ アギレラ、カッレ ポルベ ニール 106 (72)発明者 エミリオ アマーブレ ムニョース・ム ニョース キューバ国、シエゴ デ アビラ、モロ ーン．レパルト バケリート、カッレ フランク パイース 64 (72)発明者 ワルフリード ブラーボ マルティーネ ス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、10 デ オクトゥーブレ、ヴィーヴ ォラ、サン ベニーグノ 710 (72)発明者 マガリィス カンポス ソマビッラ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、コヒーマル、エントレ 24 イ 25、カッレ ホタ １‐エヘ05 (72)発明者 アリシタ ペドラーサ フェルナンデス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、アプト 38、エントレ 31 イ 33、カッレ 28 968 (72)発明者 ホセ デ ヘスース デ ラ フエンテ ガルシア キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、アプト 38、エントレ 31 イ 33、カッレ 184 3112 (72)発明者 ルイス サトゥルニーノ エレラ マル ティネス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ ３ アー イ ３ アー ア、カッレ 96 (56)参考文献 特開 昭62−296881（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，81（1984），ｐ．3557− 3561 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅｓｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】ストレプトキナーゼをコードする遺伝子の
発現方法にして、遺伝子として、Ｃ型のストレプトコッ
カス エクイシミリス（Streptococcus equisimiuis）
のATCC−9542株から単離されてSKC−２と命名された、
次式： で表され、合成オリゴヌクレオチドSK1、SK2およびSK3
をプライマーとする遺伝子増幅により得られる遺伝子を
用いることを特徴とし、かつ、該遺伝子の細菌中でのク
ローニングはシグナルペプチドの存在または不存在下で
行ない、又その発現は酵母中にて細胞内的または細胞外
的に行ない、かつ形質転換微生物は高度の発現能を高い
安定性をもって示すことを特徴とする発現方法。 - 【請求項２】上記式で表されるSKC−２遺伝子の断片
が、合成オリゴヌクレオチドSK1、SK2およびSK3をプラ
イマーとする遺伝子増幅により得られ、該SK1、SK2およ
びSK3が各々次式： で表わされることを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項３】シグナルペプチドの存在または不存在下に
上記式で表されるSKC−２遺伝子を、宿主細胞でのその
形質転換および発現のために適したプロモーターの制御
下でDNA分子中でクローニングすることを特徴とする請
求項１の方法。 - 【請求項４】上記細胞が細菌である請求項３の方法。
- 【請求項５】上記細胞が酵母である請求項３の方法。
- 【請求項６】次式： からなることを特徴とする、ストレプトキナーゼをコー
ドするSKC−２遺伝子のヌクレオチド配列。 - 【請求項７】細菌中での発現のためのトリプトファンプ
ロモーターおよびT4ターミネーターの間に挿入された請
求項６のヌクレオチド配列からなるSKC−２遺伝子を含
有するベクタープラスミドpEKG3であることを特徴とす
る組換体DNA。 - 【請求項８】酵母発現ベクターpPS−７又はpNA0のそれ
ぞれに請求項６のヌクレオチド配列からなるSKC−２遺
伝子を挿入することによって得られ、発現産生物が細胞
内的または細胞外的に得られるところの、ベクター プ
ラスミドpPESKC−４又はpPISKC−６であることを特徴と
する組換体DNA。 - 【請求項９】大腸菌W3110株を宿主として請求項７の組
換体DNAであるプラスミドpEKG3で形質転換することによ
って得られ、350mg/l（培地）より大きいストレプトキ
ナーゼ発現能を高い安定性をもって示すことを特徴とす
る、セントラルビューロー ブア シメルカルチャーズ
にCBS243.90の番号で寄託されている形質転換微生物HSK
−Ｍ。 - 【請求項１０】ピヒア パストリス（Pichia pastori
s）MP−36変異株を宿主として細胞外発現できるように
請求項８組換体DNAであるプラスミドpPESKC−４で形質
転換することによって得られ、1.2g/l（培地）より大き
いストレプトキナーゼ発現能を示すことを特徴とする、
セントラルビューロー ブア シメルカルチャーズにCB
S244.90の番号で寄託されている形質転換微生物MSK−M
4。 - 【請求項１１】細菌または酵母中でSKC−２遺伝子を発
現することにより得られる、 次式： の１文字記号で記載したアミノ酸配列で表される産生
物。 - 【請求項１２】次式： で表わされるヌクレオチド配列を包含する組換体DNA。
- 【請求項１３】請求項12に定義される組換体DNAの発現
産生物。 - 【請求項１４】請求項12に定義される組換体DNAの発現
によって得られるストレプトキナーゼ活性を有する発現
産生物と、少なくとも１種の薬学的に許容される希釈
剤、担体または賦形剤とを含有してなる血栓溶解剤組成
物。
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0430794A JPH0430794A (ja) | 1992-02-03 |
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