JP3085409B2 - Detection methods and reagent kit therefor of the target nucleic acid sequence - Google Patents

Detection methods and reagent kit therefor of the target nucleic acid sequence

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JP3085409B2
JP3085409B2 JP03093260A JP9326091A JP3085409B2 JP 3085409 B2 JP3085409 B2 JP 3085409B2 JP 03093260 A JP03093260 A JP 03093260A JP 9326091 A JP9326091 A JP 9326091A JP 3085409 B2 JP3085409 B2 JP 3085409B2
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【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は標的核酸配列の検出方法およびそのための試薬キットに関する。 The present invention relates to a detection method and a reagent kit therefor of the target nucleic acid sequence. この発明は特に、塩基配列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比較して、より大量に生成させることにより検体試料中から検出する方法に関する。 The invention is particularly, nucleotide sequences of known nucleic acid, as compared to the amount present in the initial, relates to a method of detecting the analyte in a sample by a larger amount produced. 本発明を実施することにより遺伝病、癌、感染症などの診断を行うことが容易となる。 Genetic diseases by practicing the present invention, cancer, it becomes easy to perform the diagnosis of infectious diseases.

【0002】 [0002]

【従来技術】近年、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な手段として汎用されるようになってきた。 BACKGROUND ART In recent years, the detection of a nucleic acid by hybridization genetic diseases, cancer, has come to be widely used as effective means for the diagnosis of infectious diseases. 核酸検出法において、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほんのわずかな部分である場合があり、非放射性標識プローブや末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその検出が困難である。 In the nucleic acid detection methods, the nucleotide sequence targeting, may be only a small portion of the nucleic acid of interest, the detection method using an oligonucleotide probe to non-radiolabeled probe and terminus was labeled with a radioactive isotope, the detection by the sensitivity problems such as it is difficult. そのため、プローブ検出システムの感度を向上させるための努力が多くなされている(WO Therefore, it has been made many efforts to improve the sensitivity of probe detection system (WO
87/03622など)。 Etc. 87/03622). また、感度向上の手段として、目的とする核酸をDNAポリメラーゼにより増幅させる方法(特開昭61-274697 号公報;以下「PCR」と略すことがある)が開示された。 As a means of improving sensitivity, a method for the nucleic acid of interest is amplified by DNA polymerase (JP 61-274697 JP; may be abbreviated to the "PCR") has been disclosed. しかしこの方法では、複雑な温度の調節が必要であり、専用の機器を必要とするという欠点がある。 In this method, however, requires adjustment of complicated temperature, there is a disadvantage of requiring dedicated equipment. DNAリガーゼを用いる増幅法も開示されている(WO89/12696、特開平2-2934号公報など)。 Also amplification method using a DNA ligase is disclosed (WO89 / 12696, such as JP-A 2-2934 Patent Publication). しかし、この方法ではDNAリガーゼが平滑末端を連結する反応(blunt end ligation)により非特異的増幅が起こる。 However, non-specific amplification occurs by a reaction is DNA ligase connects the blunt end in this way (blunt end ligation). これの回避法として、WO89/12696では3組以上のプローブを用いているが、プローブ数が多くコスト高となってしまう欠点がある。 As a workaround for this, but with WO89 / 12,696 in three or more sets of probes, there is a disadvantage that a number of probes is more costly. また、RNAポリメラーゼを用いてDNAよりRNAが生成されることは周知であり、 Further, it is well known that RNA is produced from DNA using RNA polymerase,
RNAポリメラーゼを用いて核酸の増幅を行う方法も開示されている(WO89/01050)。 Method for performing amplification of nucleic acids using RNA polymerase has also been disclosed (WO89 / 01050). しかしながら、この方法ではRNAポリメラーゼによる転写増幅のみでは充分な増幅は困難である。 However, sufficient amplification only transcription amplification by RNA polymerase in this process is difficult. したがって、生成したRNAに再度逆転写酵素を作用させDNAを生成させる操作を実施している。 Thus, by the action of reverse transcriptase again generated RNA has implemented an operation to generate the DNA. 一方、目的とする核酸にプローブをハイブリダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプローブのみを増幅する方法(BIO/TECHNOLOGY vol.6, 1197,1988) Meanwhile, after hybridizing the probe to nucleic acid of interest, properly hybridized method of amplifying only the probe (BIO / TECHNOLOGY vol.6, 1197,1988)
も知られている。 It is also known. しかしこの方法では、非特異反応により結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇をきたすという問題がある。 However, in this method, even the probe bound by non-specific reaction is amplified, there is a problem that causes an increase in the blank value.

【0003】 [0003]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的となる核酸を簡単に増幅させることにより、目的である核酸配列を検出する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a, by simply amplifying a nucleic acid to be targeted is to provide a method for detecting a nucleic acid sequence is an object.

【0004】 [0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを用いることにより、上記課題が解決されることを見出して、本発明を完成させるにいたった。 The present inventors Means for Solving the Problems] As a result of advanced intensive studies to solve these problems, by using a nucleotide that can be a cyclic only in the presence of the target nucleic acid as a probe, the problem is solved found a is that is, led to the completion of the present invention. 即ち、本発明は検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくともこの直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、標的核酸配列(A)に直鎖状プローブヌクレオチド(B)をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド(B)を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼとプライマーヌクレオチド(C)を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成させ、生成した一本鎖核酸を測定することにより、検体試料中の標的核酸配列を検出することを特徴とする標的核酸配列の That is, the present invention is a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least this linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequence to form a target nucleic acid sequence (a) is a linear probe nucleotides (B) is hybridized, a linear probe nucleotides (B) cyclic However, the resulting circular probe nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity, produce a single-stranded nucleic acid having a repetitive sequence of the template and the complementary sequence It is allowed, by measuring a single-stranded nucleic acid generated, the target nucleic acid sequence and detecting the target nucleic acid sequence in a specimen sample 検出方法である。 It is a detection method. また本発明の核酸を検出するための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列(A) The reagent kit for detecting a nucleic acid of the present invention, the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A)
の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)、該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)、連結手段、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸および標識されたモノヌクレオチドもしくは標識された核酸プローブを含む標的核酸配列検出用試薬キットである。 Linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence (B), said linear probe nucleotides (B) partially primer nucleotides having a sequence complementary (C), coupling means, a nucleic acid polymerase, nucleotide triphosphates and labeled mononucleotide or labeled target nucleic acid sequence detection reagent kit comprising a nucleic acid probe was.

【0005】本発明では、検出したい標的核酸配列とハイブリッドを形成することにより、リガーゼを用いて環状化することが可能となるように設計された核酸分子を使用し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラーゼ反応により核酸配列を増幅させる。 [0005] In the present invention, by forming a target nucleic acid sequence hybrid to be detected, using a ligase using the nucleic acid molecules are designed to be capable of cyclization, the nucleic acid molecules ring Joka as a template, to amplify the nucleic acid sequences by polymerase reaction. 本発明における標的核酸配列(A)は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋な状態であっても、核酸の混合物の一成分であってもよい。 Target nucleic acid sequence (A) in the present invention may be a double-stranded or single-stranded, be relatively pure state, or may be one component of a mixture of nucleic acids. 本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造等に特に制限されない。 Sequence length of a target nucleic acid related to the present invention is not particularly limited in structure or the like.

【0006】本発明におけるプローブヌクレオチド(B)とは、検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチドである(図1および図2のB [0006] The probe nucleotide in the present invention (B) is a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (Figure 1 and Figure 2 B
参照)。 reference). プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3' Probe nucleotide (B) of 5 'end and 3'
末端は図2に示されるように、標的核酸配列とアニールする部分を有する。 As terminal is shown in FIG. 2, it has a portion the target nucleic acid sequence and annealing. 該アニール部分は、それぞれ6〜4 The annealing portion, respectively 6-4
0ヌクレオチド、好ましくは各々10〜30ヌクレオチドの長さが使用される。 0 nucleotides is the length of the preferably each 10-30 nucleotides used. 5'末端と3'末端に位置する上記アニール部分間を結ぶ配列の長さは一般的に1〜1 5 the length of the 'end and 3' sequences which connects between the annealing portion located at the ends is generally 1 to 1
000個、好ましくは10〜100個のヌクレオチドであればよい。 000, preferably may be a 10 to 100 nucleotides. また、この領域にRNAポリメラーゼのアンチプロモーター配列を含ませることも可能である。 It is also possible to include an anti-RNA polymerase promoter sequence in this region. このRNAポリメラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプローブヌクレオチドを用いた場合、プライマーヌクレオチドとしてRNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つオリゴヌクレオチドを用いることにより、プロモーターに応じたRNAポリメラーゼ、およびリボヌクレオチド(ATP、CTP、GTP、UTP)を作用させれば、プローブヌクレオチドの相補鎖が繰り返し並んだRNAを合成することが可能である。 When using the probe nucleotides having the anti-promoter sequence of the RNA polymerase, by using an oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence as a primer nucleotides, RNA polymerase, and ribonucleotides (ATP depending on the promoter, CTP, GTP , if the action of UTP), it is possible to synthesize the repeated aligned RNA complementary strand of the probe nucleotide.

【0007】本発明のプライマーヌクレオチド(C) [0007] The primer polynucleotides of the present invention (C)
は、プローブヌクレオチド(B)と少なくとも部分的に相補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限されない。 Is have at least partially complementary sequence with the probe nucleotides (B), not limited structure, the length, etc.. 長さは一般的には、6〜40ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドが使用される。 The length is generally 6 to 40 nucleotides, preferably 10-30 nucleotides used. また、 Also,
プローブヌクレオチドがRNAポリメラーゼのアンチプロモーター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチドにプロモーター配列を含ませたものを使用することが可能である。 If the probe nucleotides include anti promoter sequence of an RNA polymerase, it is possible to use those which were free of promoter sequences to the primer nucleotides. これらのオリゴヌクレオチド(B)および(C)は、例えばABI社(Applied Biosystems In These oligonucleotides (B) and (C), for example, ABI Inc. (Applied Biosystems an In
c.)のDNAシンセサイザー391型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。 c.) a DNA synthesizer model 391 can be synthesized by the phosphoamidite method using a. 他にもリン酸トリエステル法、H-ホスホネート法、チオホスファイト法等いかなる方法で合成してもよい。 Other phosphate triester method also, H- phosphonate method, thiophosphite method may be synthesized by any method. また、生物学的起源、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離してもよい。 May also be isolated biological origin, for example from restriction endonuclease digests single. プローブヌクレオチド(B)の5'末端にはリン酸基を付加しておくことが好ましい。 It is preferable to adding the phosphate group at the 5 'end of the probe nucleotide (B). リン酸基の付加は、例えばATPの存在下で、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより行うことができる。 Addition of a phosphate group, for example in the presence of ATP, can be carried out by T4 polynucleotide kinase.

【0008】本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、 [0008] The nucleic acid polymerases used in the present invention,
ヘリカーゼ用活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、D As long as it is a nucleic acid polymerases with helicase for activity, D
NAポリメラーゼであっても、RNAポリメラーゼであってもよい。 Even NA polymerase, it may be a RNA polymerase. 例えばφ29DNAポリメラーゼを用いれば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である。 For example, using the φ29DNA polymerase, the circular nucleic acid molecule as a template, it is possible to synthesize a nucleic acid aligned repeatedly template complementary to sequences. (J. (J.
Biol. Chem., 264, 8935, 1989)。 Biol. Chem., 264, 8935, 1989). 他にも、M2DN Other also, M2DN
Aポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼ 、T7R A polymerase, E. coli DNA polymerase, T7R
NAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、SP6R NA polymerase, T3RNA polymerase, SP6R
NAポリメラーゼなどが利用できる。 Such as NA polymerase is available.

【0009】本発明の標的核酸検出方法は、標的核酸配列(A)に上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド(B) [0009] Target nucleic acid detection method of the present invention, the target nucleic acid sequence (A) to the hybridized said linear probe nucleotides (B), linear probe nucleotides (B)
を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド(B')を鋳型として、プライマーヌクレオチド(C) The circularized, and the resulting circular probe nucleotides (B ') as a template, a primer nucleotide (C)
を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸生成させ、生成した一本鎖核酸を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Using the template and complementary repeated to single-stranded nucleic acid product having the sequence of SEQ, detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the single-stranded nucleic acids generated.

【0010】本発明の標的核酸検出法としては、次のような実施形態が挙げられる。 [0010] As a target nucleic acid detection method of the present invention include the following embodiments. (1)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B) (1) linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B)
と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 When the target nucleic acid which is characterized in that by the following operations (a) ~ (f) using primer nucleotide (C) having at least said linear probe nucleotides (B) and partially complementary sequence the detection method of the array. 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):プライマーヌクレオチド(c)を操作(a)で生成したハイブリッドのプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): and are annealed hybrid probe nucleotides generated by manipulating the primer nucleotide (c) (a) (B). 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (c): Operation 5 'end and 3' by connecting the ends of the (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(d):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): the presence of the labeled mononucleotide, operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, the nucleic acid sequences utilizing a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.

【0011】(2)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0011] (2) and the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)とプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) and primer nucleotide (C). 操作(b):検体試料中の標的核酸配列(A)を操作(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): probe nucleotides (B) in the hybrid produced by the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) the operation (a) and are annealed. 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (c): Operation 5 'end and 3' by connecting the ends of the (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(d):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(c)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): the presence of the labeled mononucleotide, operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, the nucleic acid sequences utilizing a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (c) having a helicase-like activity to amplify. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.

【0012】(3)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくともこの直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0012] (3) a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least this linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (e). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
標的核酸配列(A)およびプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation 5 is linked to 'and 3' ends of the (a) generated in the hybrid linear probe nucleotides (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(c):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (c): the presence of the labeled mononucleotide, operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, the nucleic acid sequences utilizing a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify. 操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (d): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (c), repeated operation of (a) ~ (c) at least once. 操作(e):操作(a)〜(d)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (e): via manipulating the (a) ~ (d), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.

【0013】(4)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0013] (4) a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
と標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 And to form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の隣接した直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation (a) is linked to 5 'and 3' ends of the resulting adjacent linear probe nucleotides in the hybrid (B), it is assumed that cyclic nucleotides (B '). 操作(c):プライマーヌクレオチド(C)を操作(b)で生成した環状プローブヌクレオチド(B')とアニールさせる。 Operation (c): operating the primer nucleotide (C) (b) generated in the circular probe nucleotides (B ') and are annealed. 操作(d):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(b)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): the presence of the labeled mononucleotide, operation (b) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primers nucleotides having helicase-like activity (C) nucleic acid sequences to amplify. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.

【0014】(5)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(g)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0014] (5) and the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (g). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):プライマーヌクレオチド(C)を操作(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): and are annealed probe nucleotides in the hybrid produced by manipulating the primer nucleotide (C) (a) (B). 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて環状ヌクレオチド(B')にする。 Operation (c): where the operation (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B) of 5 'end and 3' were ligated in the ends cyclic nucleotide (B '). 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅する。 Operation (d): the resulting cyclic nucleotides operation (c) the (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primers nucleotides having helicase-like activity (C) amplifying nucleic acid sequences. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): required by the repeated operation using amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d) the (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(g):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (g): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.

【0015】(6)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(g)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0015] (6) and the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (g). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)とプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) and primer nucleotide (C). 操作(b):検体試料中の標的核酸配列(A)を、操作(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): a target nucleic acid sequence in a test sample (A), and are annealed manipulation probe nucleotides in the hybrid produced in (a) (B). 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (c): Operation 5 'end and 3' by connecting the ends of the (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): Operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify the nucleic acid sequence. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(g):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (g): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.

【0016】(7)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0016] (7) and the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
標的核酸配列(A)およびプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation 5 is linked to 'and 3' ends of the (a) generated in the hybrid linear probe nucleotides (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(c):操作(b)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (c): Operation (b) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify the nucleic acid sequence. 操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (d): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (c), repeated operation of (a) ~ (c) at least once. 操作(e):操作(a)〜(d)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (e): via manipulating the (a) ~ (d), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(f):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.

【0017】(8)検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(g)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 [0017] (8) a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotide ( B) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (g). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の隣接した直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation (a) is linked to 5 'and 3' ends of the resulting adjacent linear probe nucleotides in the hybrid (B), it is assumed that cyclic nucleotides (B '). 操作(c):プライマーヌクレオチド(C)を操作(b)で生成した環状プローブヌクレオチド(B')とアニールさせる。 Operation (c): operating the primer nucleotide (C) (b) generated in the circular probe nucleotides (B ') and are annealed. 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): Operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify the nucleic acid sequence. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(g):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (g): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.

【0018】本発明の上記実施様態(3)の理解のために、図2に本発明の原理を模式的に示す。 [0018] For the understanding of the above described aspect of the present invention (3), the principles of the present invention is shown schematically in Figure 2. この図2に基づいて、以下本発明を説明する。 Based on this FIG. 2, illustrating the present invention below. 尚、図中Aは標的核酸、Bは直鎖状ブローブヌクレオチド、B'は環状化プローブヌクレオチド、Cはプライマーヌクレオチド、D In the drawing, A is the target nucleic acid, B represents a linear Burobu nucleotides, B 'is circularization probe nucleotide, C is a primer nucleotides, D
は核酸ポリメラーゼ、Eは標識されたモノヌクレオチドを示す。 The nucleic acid polymerase, E is showing the labeled mononucleotides.

【0019】操作(a):直鎖状プローブヌクレオチド(B)中の検出配列と標的核酸(A)中の標的配列とのハイブリッドを形成させる。 [0019] Operation (a): to form a hybrid with the target sequence in the detection sequence and the target nucleic acid in a linear probe nucleotides (B) (A). 同時に、または別々にプライマーヌクレオチド(C)を該プローブヌクレオチド(B)にアニールさせる(図2(a)参照)。 At the same time, or to separate the primer nucleotide (C) annealed to the probe nucleotide (B) (see FIG. 2 (a)). 標的核酸(A)が二重鎖の場合は加熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖とする。 Target nucleic acid (A) is the case of the duplex heat, alkali treatment, and degenerating single strands by an acid treatment. 加熱変性は例えば80〜 Heat-denatured, for example 80
105℃で1〜5分間処理することで実施できる。 It can be carried out by treating 1-5 minutes at 105 ° C.. アルカリ処理は例えば、0.2〜1規定のNaOH存在下で、1〜30 Alkali treatment, for example, with NaOH presence of 0.2 provisions, 1-30
分間処理し、等量のHClで中和して用いることができる。 Minutes processed, can be used to neutralize an equal volume of HCl. 酸処理は例えば0.01〜1規定のHCl存在下で、1〜 With HCl in the presence of an acid treatment, for example 0.01 to 1 defines, 1
30分処理しNaOHで中和して用いることができる。 It can be used by neutralizing with 30 minutes processing NaOH. 他の方法として酵素的に鎖分解を行なうこともできる。 It can also be carried out enzymatically chain degradation as another method. アニールは、好ましくはプローブヌクレオチド(B)、およびプライマーヌクレオチド(C)について、それぞれ、最大のアニール選択性をもたらすように、選択された温度において行う。 Annealing is preferably a probe nucleotide (B), and the primer nucleotide (C), respectively, so as to provide maximum annealing selectivity, performed at a selected temperature. 一般的には標的核酸(A)とプローブヌクレオチド(B)、およびプローブヌクレオチド(B)とプライマーヌクレオチド(C)がそれぞれ特異的に結合し、且つミスマッチによる非特異的結合が最小となるように、昇温させて行われる。 In general, the target nucleic acid (A) and probe nucleotides (B), and probe nucleotides (B) and primer nucleotide (C) is specifically bound, respectively, and as non-specific binding due to a mismatch is minimized, elevated to be carried out.

【0020】操作(b):上記プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ環状化プローブヌクレオチド(B')とする(図2(b)参照)。 [0020] Operation (b): the probe nucleotides (B) of 5 'end and 3' were ligated end circularization probe nucleotides (B ') to (see Figure 2 (b)). 該プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端がハイブリッド形成の結果、隣接する場合、T4DNAリガーゼ、T7DNAリガーゼ、大腸菌(E. coli)DNAリガーゼ、Thermus thermophilus DNAリガーゼ等の連結酵素を使用する方法が好ましい。 The probe nucleotide (B) of 5 'and 3' ends of hybridization results, if adjacent, using T4DNA ligase, T7 DNA ligase, E. coli (E. coli) DNA ligase, a ligase, such as Thermus thermophilus DNA ligase methods are preferred. また互いに隣接していない場合、DNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結することができる。 If also not adjacent to each other, after filling the gap by a DNA polymerase and / or reverse transcriptase, it can be linked by ligase. この場合、ギャップ部分がA−Tペアのみ、またはC−Gペアのみで構成されるようにプローブヌクレオチドを設計しておけば、添加するモノヌクレオチドをそれぞれA、TまたはC、Gのみとすることでミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチドが間違って伸長されることを防止する方法もとることができる。 In this case, the gap portions A-T pairs only or if designing a probe nucleotide to consist only in C-G pairs, A mononucleotide is added respectively, T or C, be G only, how to prevent that the annealed oligonucleotides by mismatches is incorrectly extended in it can also take. 連結酵素を使用する連結方法については、特開昭63 Consolidated how to use the coupling enzyme, JP 63
-22197号公報および WO90/01069に開示の方法等、公知の手法により行うことができる。 The method or the like disclosed in -22197 discloses and WO90 / 01069, can be carried out by a known technique. 本発明において、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は6〜40 In the present invention, the oligonucleotide portion of the target nucleic acid and annealing 6-40
ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さのものが使用される。 Nucleotides, preferably those of the length of 10 to 30 nucleotides used.

【0021】操作(c):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(b)で環状化したプローブヌクレオチド(B')を鋳型に、また該プローブヌクレオチド(B')にアニールしたプライマーヌクレオチド(C) [0021] Operation (c): the presence of the labeled mononucleotide, operation (b) in circularization probe nucleotides (B ') as a template, and the probe nucleotide (B' primer nucleotides (C annealed to) )
を利用して核酸ポリメラーゼ(D)を用いて核酸合成反応を行う(図2(c)参照)。 Utilizing performing nucleic acid synthesis reaction using a nucleic acid polymerase (D) with (see Fig. 2 (c)). 該操作は、例えばdNT The manipulation is, for example dNT
P(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの4種のデオキシリボヌクレオチド)およびDNAポリメラーゼ(例えばφ29DNAポリメラーゼ、M2DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus D P (dATP, dCTP, dGTP, 4 kinds of deoxyribonucleotides dTTP) and DNA polymerase (e.g. φ29DNA polymerase, M2DNA polymerase, T4 DNA polymerase, Thermus aquaticus D
NAポリメラーゼ、Thermus thermophilus DNAポリメラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素)を用いて、上記環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることによって行われる。 NA polymerase, with high enzyme) of nucleic acid synthesis ability of such Thermus thermophilus DNA polymerase, the cyclic nucleotides is effected by causing an extension reaction as a template. この方法は、例えばジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecul This method is, for example, Journal of Molecular Biology (Journal of Molecul
ar Biology;56,341-361,1971.)に記載されている技術及び条件を用いることができる。 ar Biology;. 56,341-361,1971) techniques can be used, and conditions described in. これらの酵素は、DN These enzymes, DN
Aの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成をすすめていくことができるので、当該操作に先だって、必ずしも標的核酸(A)と環状化プローブヌクレオチド(B')を分離する必要はない。 It is possible to continue recommending the synthesis of primer extension product while peeling off the portion of the duplex A, prior to the operation, it is not always necessary to separate the target nucleic acid (A) and the circularization probe nucleotides (B ') . プライマー伸長物は、標的配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操作(a)における標的核酸(A)と同様にプローブヌクレオチド(B)の標的核酸として利用されうる。 Primer extension product, since having a target sequence homologous sequences, 該伸 Chobutsu may be used as a target nucleic acid of the operation target nucleic acid in (a) (A) similarly to the probe nucleotide (B). この一連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便に大量に得ることができる。 A particular sequence of nucleic acid by repeating this series of operations can be obtained easily in large quantities. また、プローブヌクレオチド(B)、プライマーヌクレオチド(C)にそれぞれアンチプロモーター配列、プロモーター配列が含まれている場合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに応じたRNAポリメラーゼを用いることができる。 The probe nucleotide (B), respectively an anti-promoter sequence primer nucleotide (C), if it contains a promoter sequence, a nucleic acid polymerase can be used RNA polymerase corresponding to the promoter. 当該操作は、NTP(ATP、CTP、GTP、UTP)の4種のリボヌクレオチド)およびRNAポリメラーゼ(例えば、T7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼなど)を用いて該環状ヌクレオチドを鋳型にしてRNA合成反応を行わせることにより行われる。 Such operations, NTP (ATP, CTP, GTP, UTP) 4 kinds of ribonucleotides) and RNA polymerase (e.g., T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, and the cyclic nucleotides in the template using SP6RNA polymerase, etc.) RNA synthesis reaction It is performed by causing the. RNAポリメラーゼ反応の結果として、プローブヌクレオチド(B)の相補鎖が繰り返し並んだRNAが合成されるが、このRNAを鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、このcDNAにプライマーヌクレオチド(C)をアニールさせることにより繰り返しRNAポリメラーゼを作用させて大量にR As a result of the RNA polymerase reaction, complementary strand repeatedly lined RNA probe nucleotides (B) is synthesized, the RNA and using reverse transcriptase as a template to synthesize cDNA, primers nucleotides to the cDNA (C) allowed to act repeatedly RNA polymerase by annealing in large quantities R
NAを合成することも可能である。 It is also possible to synthesize the NA.

【0022】操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも一回繰り返す。 [0022] Operation (d): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (c), repeated operation of (a) ~ (c) at least once. 操作(e):操作(a)〜(d)の結果、生成した核酸の標識量を測定する。 Operation (e): Operation (a) ~ a (d) results, measures the amount of label generated nucleic acid.

【0023】また本発明の上記実施様態(7)の理解のために、図3に本発明の原理を模式的に示す。 [0023] For the understanding of the above described aspect of the present invention (7), the principles of the present invention is shown schematically in FIG. この図3 FIG. 3
に基づいて、以下本発明を説明する。 Based on, describing the present invention hereinafter. 尚、図中Aは標的核酸、Bは直鎖状ブローブヌクレオチド、B'は環状化プローブヌクレオチド、Cはプライマーヌクレオチド、 In the drawing, A is the target nucleic acid, B represents a linear Burobu nucleotides, B 'is circularization probe nucleotide, C is a primer nucleotides,
Dは核酸ポリメラーゼ、Eは標識されたモノヌクレオチドを示す。 D is a nucleic acid polymerase, E is showing the labeled mononucleotides.

【0024】操作(a):直鎖状プローブヌクレオチド(B)中の検出配列と標的核酸(A)中の標的配列とのハイブリッドを形成させる。 [0024] Operation (a): to form a hybrid with the target sequence in the detection sequence and the target nucleic acid in a linear probe nucleotides (B) (A). 同時に、または別々にプライマーヌクレオチド(C)を該プローブヌクレオチド(B)にアニールさせる(図3(a)参照)。 At the same time, or to separate the primer nucleotide (C) annealed to the probe nucleotide (B) (see Figure 3 (a)). 標的核酸(A)が二重鎖の場合は加熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖とする。 Target nucleic acid (A) is the case of the duplex heat, alkali treatment, and degenerating single strands by an acid treatment. 加熱変性は例えば80〜 Heat-denatured, for example 80
105℃で1〜5分間処理することで実施できる。 It can be carried out by treating 1-5 minutes at 105 ° C.. アルカリ処理は例えば、0.2〜1規定のNaOH存在下で、1〜30 Alkali treatment, for example, with NaOH presence of 0.2 provisions, 1-30
分間処理し、等量のHClで中和して用いることができる。 Minutes processed, can be used to neutralize an equal volume of HCl. 酸処理は例えば0.01〜1規定のHCl存在下で、1〜 With HCl in the presence of an acid treatment, for example 0.01 to 1 defines, 1
30分処理しNaOHで中和して用いることができる。 It can be used by neutralizing with 30 minutes processing NaOH. 他の方法として酵素的に鎖分解を行なうこともできる。 It can also be carried out enzymatically chain degradation as another method. アニールは、好ましくはプローブヌクレオチド(B)、およびプライマーヌクレオチド(C)について、それぞれ、最大のアニール選択性をもたらすように、選択された温度において行う。 Annealing is preferably a probe nucleotide (B), and the primer nucleotide (C), respectively, so as to provide maximum annealing selectivity, performed at a selected temperature. 一般的には標的核酸(A)とプローブヌクレオチド(B)、およびプローブヌクレオチド(B)とプライマーヌクレオチド(C)がそれぞれ特異的に結合し、且つミスマッチによる非特異的結合が最小となるように、昇温させて行われる。 In general, the target nucleic acid (A) and probe nucleotides (B), and probe nucleotides (B) and primer nucleotide (C) is specifically bound, respectively, and as non-specific binding due to a mismatch is minimized, elevated to be carried out.

【0025】操作(b):上記プローブヌクレオチド(B)の5''末端と3'末端を連結させ環状化プローブヌクレオチド(B')とする(図3(b)参照)。 [0025] Operation (b): the probe nucleotides (B) of 5 '' end and 3 'were ligated end circularization probe nucleotides (B') to (refer to Figure 3 (b)). 該プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端がハイブリッド形成の結果、隣接する場合、T4DNAリガーゼ、T7DNAリガーゼ、大腸菌(E. coli )DNA 5 'and 3' ends of the hybridization results of the probe nucleotides (B), in the case where the adjacent, T4 DNA ligase, T7 DNA ligase, E. coli (E. coli) DNA
リガーゼ、Thermus thermophilus DNAリガーゼ等の連結酵素を使用する方法が好ましい。 Ligase, a method of using a coupling enzyme such as Thermus thermophilus DNA ligase preferred. また互いに隣接していない場合、DNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結することができる。 If also not adjacent to each other, after filling the gap by a DNA polymerase and / or reverse transcriptase, it can be linked by ligase. この場合、ギャップ部分がA−Tペアのみ、またはC−Gペアのみで構成されるようにプローブヌクレオチドを設計しておけば、添加するモノヌクレオチドをそれぞれA、TまたはC、Gのみとすることでミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチドが間違って伸長されることを防止する方法もとることができる。 In this case, the gap portions A-T pairs only or if designing a probe nucleotide to consist only in C-G pairs, A mononucleotide is added respectively, T or C, be G only, how to prevent that the annealed oligonucleotides by mismatches is incorrectly extended in it can also take. 連結酵素を使用する連結方法については、特開昭 Consolidated how to use the coupling enzyme, JP
63-22197号公報および WO90/01069 に開示の方法等、公知の手法により行うことができる。 The method or the like disclosed in 63-22197 JP and WO90 / 01069, it can be carried out by a known technique. 本発明において、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は6〜4 In the present invention, the oligonucleotide portion of the target nucleic acid and annealing 6-4
0ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さのものが使用される。 0 nucleotides, and preferably is a length of 10-30 nucleotides used.

【0026】操作(c):操作(b)で環状化したプローブヌクレオチド(B')を鋳型に、また該プローブヌクレオチド(B')にアニールしたプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸ポリメラーゼ(D)を用いて核酸合成反応を行う(図3(c)参照)。 [0026] Operation (c): Operation (b) in circularization probe nucleotides (B ') as a template, and the probe nucleotide (B') by utilizing the annealed primers nucleotides (C) in the nucleic acid polymerase (D ) performing nucleic acid synthesis reaction using a reference (Figure 3 (c)). 該操作は、例えばdNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTT The manipulation is, for example, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTT
Pの4種のデオキシリボヌクレオチド)およびDNAポリメラーゼ(例えばφ29DNAポリメラーゼ、M2D P of the four deoxyribonucleotide) and DNA polymerase (e.g. φ29DNA polymerase, M2D
NAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Thermus NA polymerase, T4DNA polymerase, Thermus
aquaticus DNAポリメラーゼ、Thermus thermophilus aquaticus DNA polymerase, Thermus thermophilus
DNAポリメラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素)を用いて、上記環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることによって行われる。 With high enzymatic) of nucleic acid synthesis ability of such DNA polymerase, the cyclic nucleotides is effected by causing an extension reaction as a template. この方法は、例えばジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journa This method is, for example, Journal of Molecular Biology (Journa
l of Molecular Biology;56,341-361,1971.)に記載されている技術及び条件を用いることができる。 l of Molecular Biology;. 56,341-361,1971) techniques can be used, and conditions described in. これらの酵素は、DNAの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成をすすめていくことができるので、当該操作に先だって、必ずしも標的核酸(A)と環状化プローブヌクレオチド(B')を分離する必要はない。 These enzymes, it is possible to continue recommending the synthesis of primer extension product while peeling off the portion of the DNA duplex, prior to the operation, always a target nucleic acid (A) and the circularization probe nucleotides (B ') it is not necessary to separate. プライマー伸長物は、標的配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操作(a)における標的核酸(A)と同様にプローブヌクレオチド(B)の標的核酸として利用されうる。 Primer extension product, since having a target sequence homologous sequences, 該伸 Chobutsu may be used as a target nucleic acid of the operation target nucleic acid in (a) (A) similarly to the probe nucleotide (B). この一連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便に大量に得ることができる。 A particular sequence of nucleic acid by repeating this series of operations can be obtained easily in large quantities. また、プローブヌクレオチド(B)、プライマーヌクレオチド(C) The probe nucleotide (B), the primer nucleotide (C)
にそれぞれアンチプロモーター配列、プロモーター配列が含まれている場合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに応じたRNAポリメラーゼを用いることができる。 Each anti-promoter sequence, if it contains a promoter sequence, a nucleic acid polymerase can be used RNA polymerase corresponding to the promoter. 当該操作は、NTP(ATP、CTP、GT Such operations, NTP (ATP, CTP, GT
P、UTP)の4種のリボヌクレオチド)およびRNA P, 4 kinds of ribonucleotide of UTP)) and RNA
ポリメラーゼ(例えば、T7RNAポリメラーゼ、T3 Polymerase (for example, T7RNA polymerase, T3
RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼなど) RNA polymerase, such as SP6RNA polymerase)
を用いて該環状ヌクレオチドを鋳型にしてRNA合成反応を行わせることにより行われる。 It is performed by as a template to perform the RNA synthesis reaction cyclic nucleotides using. RNAポリメラーゼ反応の結果として、プローブヌクレオチド(B)の相補鎖が繰り返し並んだRNAが合成されるが、このRNA As a result of the RNA polymerase reaction, complementary strand repeatedly lined RNA probe nucleotides (B) is synthesized, the RNA
を鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、このcDNAにプライマーヌクレオチド(C)をアニールさせることにより繰り返しRNAポリメラーゼを作用させて大量にRNAを合成することも可能である。 The using reverse transcriptase as a template to synthesize cDNA, it is also possible to synthesize large quantities RNA by the action of repeating RNA polymerase by annealing primer nucleotide (C) in this cDNA.

【0027】操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも一回繰り返す。 [0027] Operation (d): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (c), repeated operation of (a) ~ (c) at least once.

【0028】操作(e):操作(a)〜(d)を経て、 [0028] Operation (e): through operation of the (a) ~ (d),
生成した核酸と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid between the generated nucleic acid and labeled nucleic acid probes.

【0029】操作(f):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定する。 [0029] Operation (f): measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.

【0030】標識核酸プローブは、標識物として放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ハプテン等の公知の標識物質を利用することができる。 The labeled nucleic acid probes, radioisotopes as labels, enzymes, fluorescent materials, luminescent materials, biotin, may be a known labeling substance hapten like. 核酸プローブはプローブヌクレオチド(B)の相同鎖の配列を持つように設計し、該核酸プローブと合成された核酸をハイブリダイズさせれば、該プローブを検出することで実施できる。 Nucleic acid probe is designed to have a sequence homologous strand of the probe nucleotide (B), if caused to hybridize to a nucleic acid that has been synthesized with the nucleic acid probe, can be performed by detecting the probe. この場合、標識プローブは該プローブヌクレオチド(B)およびプライマーヌクレオチド(C) In this case, the labeled probe the probe nucleotide (B) and primer nucleotide (C)
と相補的な配列部分を含まないように設計されているので、既に存在しているこれらのヌクレオチドの配列の影響を受けることなく、該合成核酸を効率よく検出することができる。 Because it is designed so as not to include sequence complementary parts and, without being affected by the sequence of these nucleotides already present, it is possible to detect the synthetic nucleic acid efficiently. したがって、該合成核酸を該プライマーヌクレオチド(C)から分離して測定する必要がない。 Therefore, it is not necessary to measure separately from the primer nucleotide (C) the synthetic nucleic acid. 本方法は、標的核酸の配列、構造等には特に制限されないので、その応用範囲は広い。 The method sequence of the target nucleic acid, because they are not particularly limited in structure or the like, its application range is wide.

【0031】 [0031]

【発明の効果】本発明の検出法によれば、プローブヌクレオチドの2つの末端が標的核酸にアニールして連結された場合にのみ増幅反応が行われ、標的核酸の有無が検出される。 According to the detection method of the present invention, only the amplification reaction is performed when the two ends of the probe nucleotides were coupled to anneal to the target nucleic acid, the presence or absence of the target nucleic acid is detected. 従ってオリゴヌクレオチドの塩基配列による特異性と、2つの末端が連結される条件を満たす特異性の2つの特異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制される。 Thus the specificity by nucleotide sequence of the oligonucleotide, the two specificities of satisfying specificities two ends are connected is required, the more unspecific reactions are suppressed. 従って核酸の特定の配列の有無を特異的に検出することが可能である。 Thus it is possible to specifically detect the presence or absence of a particular sequence of nucleic acid. また、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼを用いることにより、環状化したプローブヌクレオチド1分子から複数の核酸配列が生成されるので、効率よく検出することが可能である。 Further, by using a nucleic acid polymerase having a helicase-like activity, since a plurality of nucleic acid sequences from the probe nucleotide 1 molecules circularized is generated, it is possible to efficiently detect. 生成した核酸配列を利用して反応をサイクル化することにより、より大量に増幅し、検出感度を高めることもまた可能である。 By cycling the reaction by using the generated nucleic acid sequence, and larger quantities amplified, it is also possible increase the detection sensitivity. さらに、本発明はプローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非特異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブの増幅がなく、S/N(Si Further, since the present invention is not a method of amplifying the probe, no amplification of the remaining probes by mismatches or non-specific hybridization, S / N (Si
gnal/Noise)比を増加させることができる。 gnal / Noise) ratio can be increased.

【0032】 [0032]

【実施例】以下に、本発明の実施例及び比較例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとするが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, by illustrative examples and comparative examples of the present invention, although the effect of the present invention more even more clearly, the present invention is not limited to these examples. (参考例1) 各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI社DNAシンセサイザー391型を用いて、ホスホアミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成した。 Using (Reference Example 1) Various synthetic ABI Inc. DNA synthesizer model 391 oligonucleotide, oligonucleotides were synthesized following sequence by phosphoamidite method. プローブヌクレオチド(第一オリゴヌクレオチド):本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオTDH(Th Probe nucleotide (first oligonucleotide): This oligonucleotide Vibrio parahaemolyticus TDH (Th
ermostable Direct Haemolysin)遺伝子の87番目から104番目、および105番目から126番目のヌクレオチド配列、T7プロモーター配列と相補的な配列を有する(配列表1)。 ermostable Direct Haemolysin) 104 th 87 th gene, and 126 th nucleotide sequence from 105th, having a sequence complementary to the T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 1). また、5'末端にリン酸基が結合している。 Further, the phosphate group is attached to the 5 'end. プライマーヌクレオチド(第二オリゴヌクレオチド):本オリゴヌクレオチドはT7プロモーターの配列を有する(配列表2)。 Primer nucleotide (Second oligonucleotide): This oligonucleotide has a sequence of the T7 promoter (Sequence Listing 2). 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolys Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haemolys
in)遺伝子の95番目から118番目の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ(配列表3)。 in) oligonucleotide probe with 118-th sequence from 95th gene (Sequence Listing 3). 但し5'末端のリン酸基は32 Pが標識されている。 However 5'-terminal phosphate group of 32 P is labeled. 手法はABI社マニュアルに従い、0.2μMスケールで実施した。 Technique in accordance with ABI, Inc. manual, was carried out at 0.2μM scale. 各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃で一夜実施した。 Deprotection of various oligonucleotides was overnight performed at 55 ° C. with aqueous ammonia. 精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。 Purification was performed by reverse phase column with Pharmacia Co. FPLC. なお合成したオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で5'末端にリン酸基を結合させた。 Incidentally synthesized oligonucleotides were coupled to a phosphate group at the 5 'end in the following manner if necessary. オリゴヌクレオチド 5 〜 20 pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ(東洋紡製) 10 単位 水を加えて全量を100μlとして、37℃で 1時間反応させる。 The total amount of added oligonucleotides 5 ~ 20 pmoles 10 × T4 polynucleotide kinase buffer 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4 polynucleotide kinase (Toyobo) 10 units water as 100 [mu] l, reacted for 1 hour at 37 ° C.. ここで 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液とは、 0.5M Tris-HCl(pH8.0) 0.1M MgCl 2 0.1M 2-メルカプトエタノールを示す。 Here, the 10 × T4 polynucleotide kinase buffer, shows a 0.5M Tris-HCl (pH8.0) 0.1M MgCl 2 0.1M 2- mercaptoethanol.

【0033】(参考例2) 標的核酸を検出するためのキット (ア)実施例1の第一オリゴヌクレオチド (イ)実施例1の第二オリゴヌクレオチド (ウ)T4 DNAリガーゼ(東洋紡製)、T7 RNAポリメラーゼ(東洋紡製)、ATP、CTP、GTP、UTP [0033] (Reference Example 2) A kit for detecting a target nucleic acid (A) first oligonucleotides (i) of Example 1 Example 1 second oligonucleotide (c) T4 DNA ligase (Toyobo), T7 RNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.), ATP, CTP, GTP, UTP

【0034】(参考例3) 標的核酸を検出するためのキット (ア)実施例1の第一オリゴヌクレオチド (イ)実施例1の第二オリゴヌクレオチド (ウ)T4 DNAリガーゼ(東洋紡製)、T7 RNAポリメラーゼ(東洋紡製)、ATP、CTP、GTP、UTP (エ)実施例1のオリゴヌクレオチドプローブ [0034] (Reference Example 3) A kit for detecting a target nucleic acid (A) first oligonucleotides (i) of Example 1 Example 1 second oligonucleotide (c) T4 DNA ligase (Toyobo), T7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo), ATP, CTP, GTP, UTP (d) of example 1 oligonucleotide probe

【0035】(参考例4) 標的核酸を検出するためのキット (ア)実施例1の第一オリゴヌクレオチド (イ)実施例1の第二オリゴヌクレオチド (ウ)T4 DNAリガーゼ(東洋紡製) 、 Tth DNAポリメラーゼ (東洋紡製) 、dATP、 dCTP 、 dTTP (エ)実施例1のオリゴヌクレオチドプローブ [0035] (Reference Example 4) A kit for detecting a target nucleic acid (A) first oligonucleotides (i) of Example 1 Example 1 second oligonucleotide (c) T4 DNA ligase (Toyobo), Tth DNA polymerase (manufactured by Toyobo), dATP, dCTP, dTTP (d) of example 1 oligonucleotide probe

【0036】(実施例1) 実施例2のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(1) 操作(a) 参考例1の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加えた。 [0036] (Example 1) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 2, a first oligonucleotide 0.1nmol detection method (1) Operation (a) Example 1, culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus separated from the body, and a genomic nucleic acid 1μg of partially purified both added to the ligase reaction solution for the 10 [mu] l. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl(pH7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作(b) 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol Ligase reaction solution for 66 mM Tris-HCl (pH7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM dithiothreitol 66 [mu] M ATP operation (b) the reaction mixture 10 [mu] l, the second oligonucleotide 0.1nmol
を加え、操作(a)と同様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 It was added, the same operations as (a), were annealed to the first oligonucleotide circularized. 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で Operation (c) Next, at 37 ° C. was added a T4 DNA ligase 1 unit (Toyobo)
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3' Allowed to react for 1 hour, the first oligonucleotide 5 'end and 3'
末端を連結させた。 The ends were linked. 操作(d) 上記反応液に水40μl、T7 RNAポリメラーゼ反応液50μ Operation (d) water 40μl to the reaction solution, T7 RNA polymerase reaction 50μ
l、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作(c)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施した。 l, and the T7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked by the operation (c) as a template, amplification was carried reactions by incubation at 37 ° C. 30 min. T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl(pH8.0) 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl 2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, GTP, UTP 2 mM 32 P-dCTP 操作(e) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 T7 RNA polymerase reaction 80 mM Tris-HCl (pH8.0) 10 mM dithiothreitol 4 mM spermidine 8 mM MgCl 2 50 mM NaCl 160 μg / ml BSA 0.02% Triton X-100 2 mM ATP, GTP , UTP 2 mM 32 P-dCTP operation (e) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80 ℃で1 After the nylon membrane was washed well, dried, X-rays films (New AIF RX, Fuji Photo Industry) is adhered to, 1 at -80 ° C.
昼夜感光させた。 It was day and night photosensitive. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNA が合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNA の合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0037】(実施例2) 参考例2のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(2) 操作(a) 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μlのリガーゼ用反応液に加えた。 [0037] (Example 2) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 2, and a detection method (2) Operation (a) a first oligonucleotide 0.1nmol and a second oligonucleotide 0.1nmol of Reference Example 1 10 [mu] l It was added to the reaction solution for a ligase. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 操作(b) 上記反応液に、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgを加え第一オリゴヌクレオチド とアニールさせ、T4 DNAリガーゼ1単位(東洋紡製)を加え37℃で1時間反応させることにより、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を連結させた。 The operation (b) the above reaction mixture, separated from the culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus, was first oligonucleotide annealed added genomic nucleic 1μg of partially purified, 37 ° C. was added a T4 DNA ligase 1 unit (Toyobo) in by reacting 1 hour, were ligated to 5 'and 3' ends of the first oligonucleotide.
対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. 操作(c) 上記反応液10μlに水40μl、T7 RNAポリメラーゼ反応液 Operation (c) the reaction 10μl of water 40 [mu] l, T7 RNA polymerase reaction
50μl、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施した。 50 [mu] l, and the T7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked with operation (b) as a template, amplification was carried reactions by incubation at 37 ° C. 30 min. 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 Operation (d) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。 After the nylon membrane was washed well, dried, X-rays films (New AIF RX, Fuji Photo Industry) brought into close contact with, and allowed to overnight photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0038】(実施例3) 参考例2のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(3) 操作(a) 参考例1の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgと共に10μlのリガーゼ用反応液に加えた。 [0038] and (Example 3) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 2, the detection method (3) Operation (a) a first oligonucleotide 0.1nmol and a second oligonucleotide 0.1nmol of Reference Example 1, separated from the culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus, it was added to the ligase reaction solution 10μl with genomic nucleic acid 1μg of partially purified. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で Operation (b) Next, at 37 ° C. was added a T4 DNA ligase 1 unit (Toyobo)
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3' Allowed to react for 1 hour, the first oligonucleotide 5 'end and 3'
末端を連結させた。 The ends were linked. 操作(c) 上記反応液10μlに水40μl、下記反応液50μl、およびT Operation (c) water 40μl to the reaction mixture 10 [mu] l, the following reaction solution 50 [mu] l, and T
7 RNAポリメラーゼ10単位を加え、操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増幅反応を実施した。 The 7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked with operation (b) as a template, amplification was carried reactions. 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 Operation (d) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。 After the nylon membrane was washed well, dried, X-rays films (New AIF RX, Fuji Photo Industry) brought into close contact with, and allowed to overnight photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0039】(実施例4) 実施例2のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(4) 操作(a) 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加えた。 [0039] (Example 4) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 2, the detection method (4) Operation (a) a first oligonucleotide 0.1nmol of Reference Example 1, culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus separated from the body, and a genomic nucleic acid 1μg of partially purified both added to the ligase reaction solution for the 10 [mu] l. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で Operation (b) Next, at 37 ° C. was added a T4 DNA ligase 1 unit (Toyobo)
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3' Allowed to react for 1 hour, the first oligonucleotide 5 'end and 3'
末端を連結させた。 The ends were linked. 操作(c) 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol Operation (c) to the reaction mixture 10 [mu] l, the second oligonucleotide 0.1nmol
を加え、操作(a)と同様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 It was added, the same operations as (a), were annealed to the first oligonucleotide circularized. 次に反応液に水40μl、下記反応液50μl、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施した。 Then water 40μl reaction solution, the following reaction solution 50 [mu] l, and the T7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked with operation (b) as a template, amplification was carried reactions by incubation at 37 ° C. 30 minutes . 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 Operation (d) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。 After the nylon membrane was washed well, dried, X-rays films (New AIF RX, Fuji Photo Industry) brought into close contact with, and allowed to overnight photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0040】(実施例5) 参考例3のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(1) 操作(a) 参考例1の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加えた。 [0040] (Example 5) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 3, a first oligonucleotide 0.1nmol detection method (1) Operation (a) Example 1, culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus separated from the body, and a genomic nucleic acid 1μg of partially purified both added to the ligase reaction solution for the 10 [mu] l. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl (pH7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM ジチオスレイトール 66μM ATP 操作(b) 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol Ligase reaction solution for 66 mM Tris-HCl (pH7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM dithiothreitol 66MyuM ATP operation (b) the reaction mixture 10 [mu] l, the second oligonucleotide 0.1nmol
を加え、操作(a)と同様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 It was added, the same operations as (a), were annealed to the first oligonucleotide circularized. 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で Operation (c) Next, at 37 ° C. was added a T4 DNA ligase 1 unit (Toyobo)
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3' Allowed to react for 1 hour, the first oligonucleotide 5 'end and 3'
末端を連結させた。 The ends were linked. 操作(d) 上記反応液に水40μl、T7 RNAポリメラーゼ反応液50μ Operation (d) water 40μl to the reaction solution, T7 RNA polymerase reaction 50μ
l、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施した。 l, and the T7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked with operation (b) as a template, amplification was carried reactions by incubation at 37 ° C. 30 min. T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl(pH8.0) 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl 2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, GTP, UTP, CTP 操作(e) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 T7 RNA polymerase reaction 80 mM Tris-HCl (pH8.0) 10 mM dithiothreitol 4 mM spermidine 8 mM MgCl 2 50 mM NaCl 160 μg / ml BSA 0.02% Triton X-100 2 mM ATP, GTP , UTP, CTP operation (e) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を6×SSC、5×デーンハート液、1mM EDTA Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1 mM EDTA
、10μg の煮沸したサケ精子DNA (平均500 塩基)を含む液100 μl中で、60℃、1時間、プレハイブリダイズした後、上記液に実施例1で調製したオリゴヌクレオチドプローブ を加え、60℃で1時間、ハイブリダイズした。 , The liquid in 100 [mu] l containing salmon sperm DNA was boiled for 10 [mu] g (average 500 bases), 60 ° C., 1 hour, after prehybridized, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 above was added, 60 ° C. in 1 hour, it was hybridized. 60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させた。 After the nylon membrane was sufficiently washed in 6 × SSC for 60 ° C., and dried. X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業) X-ray film (New AIF RX, Fuji photographic industry)
を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。 Was adhered, it was one day photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNA As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the polymer is a reaction solution containing no genomic nucleic acid RNA
の合成はみられなかった。 The synthesis was observed.

【0041】(実施例6) 参考例3のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(2) 操作(a) 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μl のリガーゼ用反応液に加えた。 [0041] (Example 6) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 3, the detection method (2) Operation (a) a first oligonucleotide 0.1nmol and a second oligonucleotide 0.1nmol of Reference Example 1 10 [mu] l It was added to the reaction solution for a ligase. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 操作(b) 上記反応液に、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1 μg を加え、第一オリゴヌクレオチドとアニールさせ、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で1時間反応させることにより、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を連結させた。 The operation (b) the above reaction mixture, separated from the culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus, added partially purified genomic nucleic acid 1 [mu] g, is first oligonucleotide annealed, T4 DNA ligase one unit (Toyobo) was added by 1 hour at 37 ° C., were ligated to 5 'and 3' ends of the first oligonucleotide. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、T7 RNAポリメラーゼ反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位を加え、 Operation (c) water 40μl to the reaction mixture 10 [mu] l, T7 RNA polymerase reaction 50 [mu] l, and the T7 RNA polymerase 10 units was added,
操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施した。 Operation circular oligonucleotide as a template linked with (b), was carried out amplification reactions by incubation at 37 ° C. 30 min. 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 Operation (d) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を6 ×SSC 、5 ×デーンハート液、1mM EDT Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1mM EDT
A 、10μg の煮沸したサケ精子DNA (平均500 塩基)を含む液100 μl中で、60℃、1 時間、プレハイブリダイズした後、上記液に実施例1で調製したオリゴヌクレオチドプローブ を加え、60℃で1時間、ハイブリダイズした。 A, the liquid in 100 [mu] l containing boiled salmon sperm DNA 10 [mu] g (average 500 bases), 60 ° C., 1 hour, after prehybridized, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 above was added, 60 1 hour at ℃, were hybridized. 60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、 After the nylon membrane was sufficiently washed in 6 × SSC for 60 ° C.,
乾燥させた。 And dried. X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80 ℃で1昼夜感光させた。 X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industry) brought into close contact with, and allowed to overnight photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNA が合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNA の合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0042】(実施例7) 参考例3のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(3) 操作(a) 参考例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1 μg The amplification of a target nucleic acid using a kit (Example 7) Reference Example 3, the detection method (3) Operation (a) a first oligonucleotide 0.1 nmol of Reference Example 1 and a second oligonucleotide 0.1 nmol, separated from the culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus, genomic nucleic acid 1 [mu] g of partially purified
と共に10μl のリガーゼ用反応液に加えた。 It was added to the ligase reaction solution 10μl with. 94℃に2分間保った後50℃に5 分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ1単位(東洋紡製)を加え37℃で1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3' Operation (b) Next, T4 DNA ligase 1 Unit (manufactured by Toyobo) reacted at 37 ° C. was added a, a first oligonucleotide 5 'end and 3'
末端を連結させた。 The ends were linked. 操作(c) 上記反応液10μlに水40μl、下記反応液50μl、およびT Operation (c) water 40μl to the reaction mixture 10 [mu] l, the following reaction solution 50 [mu] l, and T
7 RNAポリメラーゼ10 単位を加え、操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増幅反応を実施した。 The 7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked with operation (b) as a template, amplification was carried reactions. 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 Operation (d) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を6×SSC、5×デーンハート液、1mM EDTA、 Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1 mM EDTA,
10μgの煮沸したサケ精子DNA(平均500塩基)を含む液1 Liquid 1 containing 10μg boiled salmon sperm DNA (average 500 bases)
00μl中で、60℃、1時間、プレハイブリダイズした後、上記液に実施例1で調製したオリゴヌクレオチドプローブ を加え、60℃で1時間、ハイブリダイズした。 In 00μl, 60 ℃, 1 hour, after prehybridized, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 above was added, 1 hour at 60 ° C., were hybridized.
60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させた。 After the nylon membrane was sufficiently washed in 6 × SSC for 60 ° C., and dried. X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。 X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industry) brought into close contact with, and allowed to overnight photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0043】(実施例8) 参考例3のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法(4) 操作(a) 参考例1の第一オリゴヌクレオチド0.1nmolと、TDH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgとを共に10μlのリガーゼ用反応液に加えた。 [0043] (Example 8) Amplification of target nucleic acid using the kit of Example 3, the detection method (4) Operation (a) a first oligonucleotide 0.1nmol of Reference Example 1, culture of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus separated from the body, and a genomic nucleic acid 1μg of partially purified both added to the ligase reaction solution for the 10 [mu] l. 94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニールさせた。 To 50 ° C. After maintaining for 2 minutes to 94 ° C. and kept for 5 minutes and allowed to anneal. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3' Operation (b) Next, T4 DNA ligase 1 Unit (manufactured by Toyobo) reacted at 37 ° C. was added a, a first oligonucleotide 5 'end and 3'
末端を連結させた。 The ends were linked. 操作(c) 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1nmol Operation (c) to the reaction mixture 10 [mu] l, the second oligonucleotide 0.1nmol
を加え、操作(a)と同様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチド にアニールさせた。 It was added, the same operations as (a), were annealed to the first oligonucleotide circularized. 次に反応液に水40μl、下記反応液50μl、およびT7 RNAポリメラーゼ 10単位を加え、操作(b)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実施した。 Then water 40μl reaction solution, the following reaction solution 50 [mu] l, and the T7 RNA polymerase 10 units was added, the circular oligonucleotide linked with operation (b) as a template, amplification was carried reactions by incubation at 37 ° C. 30 minutes . 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜GeneSceen plus(DuPont社製)にブロットした。 Operation (d) then electrophoresed on an agarose gel, and blotted to a nylon membrane GeneSceen plus (DuPont Co.) by a conventional method.
ナイロン膜を6×SSC、5×デーンハート液、1mM EDTA、 Nylon membrane 6 × SSC, 5 × Dane Heart solution, 1 mM EDTA,
10μgの煮沸したサケ精子DNA(平均500塩基)を含む液1 Liquid 1 containing 10μg boiled salmon sperm DNA (average 500 bases)
00μl中で、60℃、1時間、プレハイブリダイズした後、上記液に実施例1で調製したオリゴヌクレオチドプローブを加え、60℃で1時間、ハイブリダイズした。 In 00μl, 60 ℃, 1 hour, after prehybridized, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 above was added, 1 hour at 60 ° C., were hybridized.
60℃の6×SSC中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させた。 After the nylon membrane was sufficiently washed in 6 × SSC for 60 ° C., and dried. X線フィルム(New AIF RX, 富士写真工業)を密着させ、-80℃で1昼夜感光させた。 X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industry) brought into close contact with, and allowed to overnight photosensitive at -80 ° C.. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のRNAが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のRNAの合成はみられなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, but the polymer of RNA has been synthesized, the synthesis of RNA macromolecules in a reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【0044】(実施例9) 参考例4のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法 操作(a) 参考例1の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol と、TDH [0044] and (EXAMPLE 9) amplification of the target nucleic acid using the kit of Example 4, the detection method operations: (a) a first oligonucleotide 0.1nmol of Reference Example 1, TDH
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸1μgとを10μl のリガーゼ用反応液に加えた。 Separated from the culture of the producing Vibrio parahaemolyticus, and a genomic nucleic acid 1μg of partially purified were added to ligase reaction solution for the 10 [mu] l. 94℃に2分間保った後、50℃に5分間保温し、アニールさせた。 After holding for 2 minutes to 94 ° C., kept 5 min 50 ° C., were annealed. 対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した。 As a control, it was prepared a reaction solution not mixed genomic nucleic acid. リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl (Ph7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作(b) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド0.1nmo Ligase reaction solution for 66 mM Tris-HCl (Ph7.6) 6.6 mM MgCl 2 10 mM dithiothreitol 66 [mu] M ATP operation (b) the reaction mixture 10 [mu] l, the second oligonucleotide 0.1nmo
lを加え、操作(a)と同様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 l was added, the same operations as (a), were annealed to the first oligonucleotide circularized. 操作(c) 次に T4 DNA リガーセ 1単位(東洋紡製)を加え、37℃ Operation (c) is then T4 DNA Rigase 1 Unit (manufactured by Toyobo) was added, 37 ° C.
で1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と In 1 hour of reaction, the 5 'terminus of the first oligonucleotide
3'末端を連結させた。 3 'was ligated ends. 操作(d) 上記反応液に水40μl 、Tth DNA ポリメラーゼ反応液50 Operation (d) water 40μl to the reaction solution, Tth DNA polymerase reaction solution 50
μl 、およびTth DNAポリメラーゼ4単位を加え、操作(c)で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、75℃で60分間保温することにより増幅反応を実施した。 [mu] l, and the Tth DNA polymerase 4 units added, as a template circular oligonucleotide linked by the operation (c), was carried out amplification reactions by incubation at 75 ° C. 60 min. Tth DNA ポリメラーゼ反応液 67 mM Tris-HCl (pH8.8) 16.6mM (NH 4 ) 2 SO 4 6.7mM MgCl 2 2 mM dATP, dGTP, dTTP 2 mM 32 P-dCTP 操作(e) その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイロン膜 GeneScreenplus (DuPont社製) にブロットした。 Tth DNA polymerase reaction solution 67 mM Tris-HCl (pH8.8) 16.6mM (NH 4) 2 SO 4 6.7mM MgCl 2 2 mM dATP, dGTP, dTTP 2 mM 32 P-dCTP Operation (e) Then, an agarose gel electrophoresed, and blotted to a nylon membrane GeneScreenplus (DuPont Co.) by a conventional method. ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、X線フィルム (New AlF RX,富士写真工業) を密着させ、-80 ℃ After the nylon membrane was washed well, dried, are brought into close contact with X-ray film (New AlF RX, Fuji Photo Industry), -80 ° C.
で1昼夜感光させた。 In was overnight photosensitive. その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のDNA が合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のDNA の合成は見られなかった。 As a result, the reaction solution was added genomic nucleic acid, although DNA of the polymer has been synthesized, the synthesis of DNA polymers in the reaction solution containing no genomic nucleic acid was observed.

【配列表】 [Sequence Listing]

【0045】配列番号:1 配列の長さ:113 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:promoter 存在位置:32..38 特徴を決定した方法:S 他の特徴:T7プロモーター配列と相補的な配列 存在位置:1..18 他の特徴:腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem [0045] SEQ ID NO: 1 Length of sequence: 113 SEQ types: the number of nucleic acid strands: single strand Topology: linear sequence type: Symbol indicating a feature characteristic of other nucleic acid synthetic DNA sequence: promoter A promoter present position : 32..38 method to determine the characteristics: S other features: T7 promoter sequence complementary to that existing position: 1..18 other features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haem
olysin)遺伝子の105番目から126番目の配列 存在位置:92..113 他の特徴:腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem olysin) 105 th to 126 th array the location of a gene: 92..113 other features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haem
olysin)遺伝子の87番目から104番目のヌクレオチド配列 配列 GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113 Olysin) from 87 th gene 104th nucleotide sequence SEQ GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113

【0046】配列番号:2 配列の長さ:17 配列の型:核酸 トポロジー:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:promoter 存在位置:1..17 特徴を決定した方法:S 他の特徴:T7プロモーターの配列を有する 配列 TAATACGACT CACTATA 17 [0046] SEQ ID NO: 2 sequence Length: 17 sequence types: the single-stranded sequence type: nucleic acid Topology symbols have the features characteristic of other nucleic acid synthetic DNA sequence: promoter A promoter present position: 1..17 features determined method: S other features: sequence having the sequence of the T7 promoter TAATACGACT CACTATA 17

【0047】配列番号:3 配列の長さ:25 配列の型:核酸 トポロジー:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..25 特徴を決定した方法:S 他の特徴:腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem [0047] SEQ ID NO: 3 Length of sequence: 25 SEQ type: nucleic acid Topology: single strand sequence of the type: wherein the location of the other nucleic acid synthetic DNA sequence: 1..25 ​​method to determine the characteristics: S Other features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haem
olysin)遺伝子の95番目から118番目の配列と相補的な配列を有する。 Olysin) having a 118-th sequence complementary to the sequence from 95th genes. 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTTT 25 Array CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTTT 25

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】第一オリゴヌクレオチド(プローブヌクレオチド)の構造を示した図である。 1 is a diagram showing the structure of a first oligonucleotide (probe nucleotides).

【図2】本発明の原理を模式的に示した図である。 The principle of the present invention; FIG is a diagram schematically showing.

【図3】本発明の原理を模式的に示した図である。 3 is a diagram schematically showing the principles of the present invention.

【図4】実施例1〜8において合成されたRNAの検出の結果を示す。 Figure 4 shows the results of detection of the synthesized RNA in Examples 1-8.

【図5】実施例9において合成されたDNAの検出の結果を示す。 Figure 5 shows the results of detection of the synthesized DNA in Example 9.

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

図2中、Aは標的核酸、Bは第一オリゴヌクレオチド(プローブヌクレオチド)、B'は環状化した第一オリゴヌクレオチド、Cは第二オリゴヌクレオチド(プライマーヌクレオチド)、Dは核酸ポリメラーゼ、Eは標識されたモノヌクレオチドを示す。 In Figure 2, A is the target nucleic acid, B is a first oligonucleotide (probe nucleotides), B 'is first oligonucleotides circularized, C is the second oligonucleotide (primer nucleotide), D is a nucleic acid polymerase, E is labeled It shows the mono nucleotide. 図3中、Aは標的核酸、Bは第一オリゴヌクレオチド(プローブヌクレオチド)、B'は環状化した第一オリゴヌクレオチド、Cは第二オリゴヌクレオチド(プライマーヌクレオチド)、 In Figure 3, A is a target nucleic acid, B is a first oligonucleotide (probe nucleotides), B 'is first oligonucleotides circularized, C is the second oligonucleotide (primer nucleotides)
Dは核酸ポリメラーゼ、Eはオリゴヌクレオチドプローブを示す。 D is a nucleic acid polymerase, E is shows the oligonucleotide probes. 図4中、1、2、3、4、5、6、7、8はそれぞれ実施例1、2、3、4、5、6、7、8の結果に対応している。 In Figure 4, it corresponds to the result of each 1,2,3,4,5,6,7,8 embodiment 1,2,3,4,5,6,7,8. 矢印は鋳型として用いたプローブヌクレオチド(B;113mer)の位置を示す。 Arrows probe nucleotides used as a template; indicates the position of (B 113mer). また、図中、+は反応液中にゲノム核酸を加えた場合、−は加えなかった場合を示す。 In the figure, + If the genomic nucleic acid was added to the reaction solution, - shows a case where not added. 図5中、1のレーンは反応液中にゲノム核酸を加えた場合、2のレーンは加えなかった場合を示す。 In FIG. 5, 1 lane when the genomic nucleic acid was added to the reaction solution, the 2 lane shows a case where not added.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl. 7 ,DB名) C12Q 1/68 BIOSIS(DIALOG) JICSTファイル(JOIS) WPI(DIALOG) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (58) investigated the field (Int.Cl. 7, DB name) C12Q 1/68 BIOSIS (DIALOG) JICST file (JOIS) WPI (DIALOG)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくともこの直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、 1. A straight chain probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least this linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequence,
    標的核酸配列(A)に直鎖状プローブヌクレオチド(B)をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド(B)を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド(B')を鋳型として、プライマーヌクレオチド(C)を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成させ、得られた一本鎖核酸を測定することにより、検体試料中の標的核酸配列(A) Target nucleic acid sequence (A) to the linear probe nucleotides (B) were hybridized, a linear probe nucleotides (B) cyclize, the resulting circular probe nucleotides (B ') as a template, a primer nucleotide (C) using, to produce a single-stranded nucleic acid having a repetitive sequence of the template and the complementary sequence, by measuring a single-stranded nucleic acid obtained, the target nucleic acid sequence in a specimen sample (a)
    を検出することを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 Method for detecting a target nucleic acid sequence and detecting the.
  2. 【請求項2】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 Wherein the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):プライマーヌクレオチド(C)を操作(a)で生成したハイブリッドのプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): and are annealed hybrid probe nucleotides generated by manipulating the primer nucleotide (C) (a) (B). 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (c): Operation 5 'end and 3' by connecting the ends of the (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(d):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): the presence of the labeled mononucleotide, operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, the nucleic acid sequences utilizing a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.
  3. 【請求項3】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 Wherein the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)とプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) and primer nucleotide (C). 操作(b):検体試料中の標的核酸配列(A)を操作(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): probe nucleotides (B) in the hybrid produced by the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) the operation (a) and are annealed. 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (c): Operation 5 'end and 3' by connecting the ends of the (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(d):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): the presence of the labeled mononucleotide, operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, the nucleic acid sequences utilizing a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.
  4. 【請求項4】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくともこの直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、 Wherein the linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least this linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequence,
    下記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 Method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (e). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
    標的核酸配列(A)およびプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation 5 is linked to 'and 3' ends of the (a) generated in the hybrid linear probe nucleotides (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(c):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (c): the presence of the labeled mononucleotide, operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, the nucleic acid sequences utilizing a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify. 操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (d): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (c), repeated operation of (a) ~ (c) at least once. 操作(e):操作(a)〜(d)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (e): via manipulating the (a) ~ (d), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.
  5. 【請求項5】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 5. a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
    と標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 And to form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の隣接した直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation (a) is linked to 5 'and 3' ends of the resulting adjacent linear probe nucleotides in the hybrid (B), it is assumed that cyclic nucleotides (B '). 操作(c):プライマーヌクレオチド(C)を操作(b)で生成した環状プローブヌクレオチド(B')とアニールさせる。 Operation (c): operating the primer nucleotide (C) (b) generated in the circular probe nucleotides (B ') and are annealed. 操作(d):標識されたモノヌクレオチドの存在下、操作(b)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): the presence of the labeled mononucleotide, operation (b) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primers nucleotides having helicase-like activity (C) nucleic acid sequences to amplify. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), for detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the amount of label generated nucleic acid sequence.
  6. 【請求項6】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(g)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 6. a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (g). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):プライマーヌクレオチド(C)を操作(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): and are annealed probe nucleotides in the hybrid produced by manipulating the primer nucleotide (C) (a) (B). 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて環状ヌクレオチド(B')にする。 Operation (c): where the operation (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B) of 5 'end and 3' were ligated in the ends cyclic nucleotide (B '). 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅する。 Operation (d): the resulting cyclic nucleotides operation (c) the (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primers nucleotides having helicase-like activity (C) amplifying nucleic acid sequences. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): required by the repeated operation using amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d) the (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(g):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (g): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.
  7. 【請求項7】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(g)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 7. a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (g). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)とプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 Operation (a): to form a hybrid between the linear probe nucleotides (B) and primer nucleotide (C). 操作(b):検体試料中の標的核酸配列(A)を、操作(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド(B)とアニールさせる。 Operation (b): a target nucleic acid sequence in a test sample (A), and are annealed manipulation probe nucleotides in the hybrid produced in (a) (B). 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させて、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (c): Operation 5 'end and 3' by connecting the ends of the (b) linear probe nucleotides of the resulting annealed product in our (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): Operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify the nucleic acid sequence. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(g):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (g): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.
  8. 【請求項8】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(f)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 8. a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (f). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
    標的核酸配列(A)およびプライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation 5 is linked to 'and 3' ends of the (a) generated in the hybrid linear probe nucleotides (B), and cyclic nucleotides (B '). 操作(c):操作(b)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (c): Operation (b) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify the nucleic acid sequence. 操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (d): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (c), repeated operation of (a) ~ (c) at least once. 操作(e):操作(a)〜(d)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (e): via manipulating the (a) ~ (d), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(f):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (f): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.
  9. 【請求項9】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下記の操作(a)〜(g)を行うことを特徴とする標的核酸配列の検出方法。 9. a linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), at least said linear probe nucleotides (B ) and using primers nucleotide (C) having a partially complementary sequences, the method for detecting a target nucleic acid sequence and performing the following operations (a) ~ (g). 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、 Operation (a): the linear probe nucleotides (B),
    標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 To form a hybrid with the target nucleic acid sequence (A). 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の隣接した直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5'末端と3'末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B')とする。 Operation (b): Operation (a) is linked to 5 'and 3' ends of the resulting adjacent linear probe nucleotides in the hybrid (B), it is assumed that cyclic nucleotides (B '). 操作(c):プライマーヌクレオチド(C)を操作(b)で生成した環状プローブヌクレオチド(B')とアニールさせる。 Operation (c): operating the primer nucleotide (C) (b) generated in the circular probe nucleotides (B ') and are annealed. 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド(B')を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用して核酸配列を増幅させる。 Operation (d): Operation (c) in the generated cyclic nucleotides (B ') as a template, using a nucleic acid polymerase and primer nucleotide (C) having a helicase-like activity to amplify the nucleic acid sequence. 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1回繰り返す。 Operation (e): If necessary, using the amplified nucleic acid sequences produced by the operation (d), repeating the operation of (a) ~ (d) at least once. 操作(f):操作(a)〜(e)を経て、生成された核酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形成させる。 Operation (f): via manipulating the (a) ~ (e), to form a hybrid between the generated nucleic acid sequences and labeled nucleic acid probes. 操作(g):ハイブリッドを形成した標識核酸プローブの標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配列を検出する。 Operation (g): detecting a target nucleic acid sequence in a test sample by measuring the labeled amount of the labeled nucleic acid probe hybridized.
  10. 【請求項10】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)、該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)、連結手段、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸および標識モノヌクレオチドを含む標的核酸配列検出用試薬キット。 10. A linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), said linear probe nucleotide and (B) partially primer nucleotides having a sequence complementary (C), coupling means, a nucleic acid polymerase, nucleotide triphosphates and a target nucleic acid sequence detection reagent kit comprising a labeled mononucleotide.
  11. 【請求項11】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)、該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)、連結手段、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、および標識された核酸プローブを含む標的核酸配列検出用試薬キット。 11. linear probe nucleotides having a sequence designed to circularized as a result of the presence of the target nucleic acid sequence in a specimen sample (A) (B), said linear probe nucleotide and (B) primer nucleotides having partially complementary sequence (C), coupling means, a nucleic acid polymerase, nucleotide triphosphates, and labeled target nucleic acid sequence detection reagent kit comprising a nucleic acid probe was.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4989493B2 (en) * 2006-01-20 2012-08-01 オリンパス株式会社 Method for detecting nucleic acid sequence by intramolecular probe

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714320A (en) * 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
US7135312B2 (en) 1993-04-15 2006-11-14 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
US6077668A (en) * 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US6096880A (en) 1993-04-15 2000-08-01 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
SE9400522D0 (en) * 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
USRE38442E1 (en) * 1994-06-22 2004-02-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US6593086B2 (en) 1996-05-20 2003-07-15 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Nucleic acid amplification methods
SE9403805D0 (en) * 1994-11-07 1994-11-07 Ulf Landegren Method of preparing oligonucleotide probes or primers, vector therefor and use thereof
JP2809601B2 (en) * 1995-07-13 1998-10-15 株式会社分子バイオホトニクス研究所 Nucleotide sequence amplification method
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
DK0862656T3 (en) * 1995-11-21 2001-04-09 Univ Yale Unimolecular segmentamplifikation and detection
DE69627698T2 (en) * 1995-12-05 2004-01-15 Jorn Erland Koch Extending in a cascade amplification reaction of nucleic acids
US6117635A (en) * 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US5866336A (en) * 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
EP1098996A1 (en) 1998-07-20 2001-05-16 Yale University Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers
EP1114184A2 (en) 1998-09-15 2001-07-11 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
US6255082B1 (en) 1998-09-15 2001-07-03 Yale University Artificial long terminal repeat vectors
US5942609A (en) * 1998-11-12 1999-08-24 The Porkin-Elmer Corporation Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support
US6830884B1 (en) 1998-12-15 2004-12-14 Molecular Staging Inc. Method of amplification
CA2411794A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Molecular Staging, Inc. Signal amplification with lollipop probes
AU2002246612B2 (en) 2000-10-24 2007-11-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic DNA
US6573051B2 (en) 2001-03-09 2003-06-03 Molecular Staging, Inc. Open circle probes with intramolecular stem structures
AU2003303395A1 (en) 2003-12-23 2004-07-22 Dahl, Gary, A. Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase
GB2378245A (en) 2001-08-03 2003-02-05 Mats Nilsson Nucleic acid amplification method
EP1601791B1 (en) 2003-02-26 2016-10-05 Complete Genomics Inc. Random array dna analysis by hybridization
US7618780B2 (en) 2004-05-20 2009-11-17 Trillion Genomics Limited Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry
CN101213310A (en) 2005-04-12 2008-07-02 Novia公司名下的现场Rcp公司 Methods for production of oligonucleotides
EP1871896B1 (en) 2005-04-12 2015-06-03 Olink AB Circle probes and their use in the identification of biomolecules
JP5331476B2 (en) 2005-06-15 2013-10-30 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッドCallida Genomics, Inc. Single molecule array for genetic and chemical analysis
EP1762627A1 (en) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Method for the activation of a nucleic acid for performing a polymerase reaction
JP2009511019A (en) 2005-10-06 2009-03-19 ルシジェン コーポレイション Thermostable viral polymerases and their use
US7910354B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111705A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
US8951731B2 (en) 2007-10-15 2015-02-10 Complete Genomics, Inc. Sequence analysis using decorated nucleic acids
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
US8617811B2 (en) 2008-01-28 2013-12-31 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4989493B2 (en) * 2006-01-20 2012-08-01 オリンパス株式会社 Method for detecting nucleic acid sequence by intramolecular probe

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