JP2984176B2 - The method of culturing bone marrow cells, transplantation material to the mixture and the hard tissue defect for culture - Google Patents

The method of culturing bone marrow cells, transplantation material to the mixture and the hard tissue defect for culture

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JP2984176B2 JP5351035A JP35103593A JP2984176B2 JP 2984176 B2 JP2984176 B2 JP 2984176B2 JP 5351035 A JP5351035 A JP 5351035A JP 35103593 A JP35103593 A JP 35103593A JP 2984176 B2 JP2984176 B2 JP 2984176B2
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【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】この発明は、所望の骨系細胞を未分化な骨髄細胞から分化させる、リン酸カルシウム含有コラーゲンゲルを用いた培養方法とこの培養方法に用いる培養用混合物に関する。 BACKGROUND OF THE INVENTION This invention, to differentiate desired bone system cells from undifferentiated bone marrow cells, to culture mixture used in the culture method and culture method using calcium phosphate-containing collagen gel. この培養方法は、所望の移植部位に適応した骨系細胞を体外で(invitro)作ることができ、また、骨髄細胞の分化機構や機能を解明するのにも有用である。 The culture method, the bone system cells adapted to the desired implantation site can be made outside the body (vitro), also useful to elucidate the differentiation mechanism and function of the bone marrow cells.

【0002】さらに、この発明は、上記培養方法により得られた移植用材料に関する。 [0002] Further, this invention relates to implantable material obtained by the above culture method. この移植用材料は、骨欠損部などの硬組織欠損部を修復するために移植される。 The implant material may be implanted to repair the hard tissue defect, such as a bone defect.

【0003】 [0003]

【従来の技術】動物の骨、軟骨を形成する細胞は、それぞれ、骨芽細胞、軟骨芽細胞であり、未分化な骨髄細胞に由来する。 Bone BACKGROUND OF THE INVENTION Animals, cells that form cartilage, respectively, osteoblasts are chondroblasts, derived from undifferentiated bone marrow cells. そこで、骨欠損部を修復するために、骨片を移植する代わりに骨髄細胞を移植することが試みられている。 Therefore, to repair the bone defect, attempts have been made to transplant bone marrow cells instead of implanting the bone fragments. しかし、骨髄細胞は、流動性を有するため移植部位から流動して目的とする部位で増殖せず、不必要な部位で増殖することがある。 However, bone marrow cells do not proliferate at the site of interest to flow from the implantation site because of its fluidity, it is possible to grow in unwanted sites. 骨髄細胞が流動しないように固定化するために、再構成した繊維状アテロペプチドコラーゲン、リン酸三カルシウム、骨髄、および、展性のある調製物を得るのに充分な流体の混合物からなる移植用材料が提案された(特開昭62−268563号公報)。 For bone marrow cells are immobilized so as not to flow, reconstituted fibrous atelopeptide collagen, tricalcium phosphate, bone marrow, and, for transplantation comprising a mixture of a sufficient fluid to obtain a preparation malleable material has been proposed (JP 62-268563 JP). ここで流体としては生理食塩水が使用されている。 Here saline is used as the fluid.

【0004】骨髄細胞が固定化された移植用材料を生体に移植すると、体内での(in vivo)骨髄細胞の分化を人為的に制御することはできず、移植された部位に適した骨系細胞に分化しないという問題がある。 [0004] Bone marrow cells transplanted implantable material immobilized to the living body, can not be artificially controlled differentiation (in vivo) bone marrow cells in the body, bone systems suitable for transplanted site there is a problem that does not differentiate into cells. 上記移植用材料は、流体として生理食塩水を用いるので骨髄細胞の体外での(in vitro)培養を想定したものではない。 The graft material, since use of saline as the fluid in the bone marrow cells in vitro (in vitro) not assumed the culture. 他方、骨髄不足の問題を防ぎ、骨欠損部への移植用材料を安定に供給するために、生体から取り出された骨髄細胞を体外で培養して骨形成に関与する骨系細胞に分化させることが検討された。 On the other hand, prevent the problem of bone marrow insufficiency, in order to supply the implant material to the bone defect stable, the bone marrow cells removed from a living body are cultured in vitro to differentiate into bone system cells involved in bone formation There were studied.

【0005】現在報告されている培養方法(培養手技) [0005] The culture method that is currently being reported (culture procedure)
では、骨髄組織から骨髄細胞を単離し、種々の添加物を含む血清含有培地で培養し、軟骨細胞に分化させることに成功している。 In the bone marrow cells from bone marrow tissues were isolated and grown in serum-containing medium containing various additives have been successfully differentiate into chondrocytes. 体外で骨髄間質細胞の液体培養を行うと、線維芽細胞様の細胞のコロニーが形成され、コロニー中心部に石灰化沈着物の観察がなされている(Maniat Doing liquid culture of bone marrow stromal cells in vitro, formed colonies of fibroblast-like cells, we observed calcification deposits have been made in the colony center (Maniat
opoulos 他、Cell Tissue Res(1988)254:317-330)。 opoulos other, Cell Tissue Res (1988) 254: 317-330).

【0006】 [0006]

【発明が解決しようとする課題】骨芽細胞や軟骨芽細胞への分化、形成過程および骨、軟骨の形成機序は未解決のまま残されているので、従来の細胞培養方法では、体外で骨髄細胞の分化を制御し、所望の骨系細胞を自在に作り出すことはできなかった。 [0007] Differentiation into osteoblasts and chondroblasts, forming process and bone, since the mechanisms for formation of cartilage is left unsolved, the conventional cell culture method, in vitro controlling the differentiation of bone marrow cells, it was not possible to create freely a desired bone system cells. 従って、骨系細胞を安定して得るために、骨髄細胞の骨系細胞への分化を人為的に制御できる培養方法が望まれる。 Therefore, in order to stably obtain the bone system cell, artificially controllable culture method the differentiation of bone marrow cells into the bone lineage cells are desired.

【0007】上記のように細胞培養に用いられる血清は牛胎仔血清あるいは馬胎仔血清であるため、血清含有培地で培養された細胞がヒトなどの生体へ移植されたときにこれらの血清が強い免疫原生を示し、良好な生体親和性は期待できない。 [0007] For serum used in cell culture as described above is a fetal calf serum or horse calf serum, these sera is strong when the cells cultured in serum-containing medium were transplanted to a living body such as human immunodeficiency It shows the virgin, good biocompatibility is not expected. 骨欠損部修復に培養骨髄細胞を使用するためには、移植部位に適合した細胞を無血清培地で作り、良好な生体親和性を有する移植担体とともに移植する必要がある。 To use the cultured marrow cells in bone defect repair, the cells adapted to the implant site made in serum-free medium, it is necessary to transplant with transplantation carrier having good biocompatibility.

【0008】ところが、従来の無血清培地は、骨髄細胞の培養を行うためには、デキサメサゾンなどのホルモンを含む必要がある。 [0008] However, conventional serum-free media, in order to perform cultivation of bone marrow cells, it is necessary to include the hormones such as dexamethasone. このようにホルモンを含む無血清培地を用いて骨髄細胞の培養を行うと細胞が異形化などの変異を起こすため骨系細胞への分化を制御することができない。 Thus cells Doing cultures of bone marrow cells with serum-free medium containing hormones can not be controlled differentiation into bone system cell to cause a mutation, such as profiled. この発明は、血清もホルモンも含まない液体培地を用いて、体外で未分化な骨髄細胞を移植部位に適応した所望の骨系細胞に分化させることができる骨髄細胞の培養方法、および、この培養方法に用いる培養用混合物を提供することを課題とする。 This invention, sera using a liquid medium that does not contain hormones, the method of culturing bone marrow cells that can be differentiated into the desired bone system cells adapted undifferentiated bone marrow cells to the implant site outside the body, and, the culture and to provide a culture mixture used in the method.

【0009】この発明は、上記培養方法により得られ、 [0009] The present invention, obtained by the above cultivation method,
血清を含まず良好な生体親和性持ち、骨欠損部などの硬組織欠損部を修復するために移植される移植用材料を提供することを課題とする。 Serum has good biocompatibility excluded, and to provide an implant material to be transplanted to repair the hard tissue defect, such as a bone defect.

【0010】 [0010]

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するために、発明者らは、血清もホルモンも含まない液体培地で骨髄細胞を所望の骨系細胞に分化させる方法を検討した。 In order to solve the above problems SUMMARY OF THE INVENTION The inventors have found that serum also bone marrow cells in liquid medium that does not contain hormones to consider how to differentiate into the desired bone system cells. そして、コラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粉末粒子が分散された複合体を骨髄細胞の支持体として用いた場合には、リン酸カルシウムから液体培地にカルシウムイオンとリン酸イオンが溶解するので、液体培地が血清もホルモンも含まなくても、骨髄細胞を所望とする骨系細胞に分化させることができるのを見い出してこの発明を完成させた。 Since complex calcium phosphate powder particles are dispersed with a chemical activity in the collagen gel when used as a support of the bone marrow cells, dissolved calcium and phosphate ions in a liquid medium from calcium phosphate, liquid medium There serum even without also include hormones, finds that it can be differentiated into bone system cells to bone marrow cells and desired to complete the present invention.

【0011】この発明は、コラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散された複合体を骨髄細胞の支持体として用い、動物細胞培養用液体培地中で前記骨髄細胞を所望とする骨系細胞に分化させる骨髄細胞の培養方法を提供する。 [0011] The present invention, bone system cell to complex calcium phosphate particles are dispersed with a chemical activity in the collagen gel used as a support of the bone marrow cells, and desired the bone marrow cells in animal cell culture broth It provides a method for culturing bone marrow cells to differentiate into. この発明は、コラーゲン The present invention, collagen gate
ル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散さ Calcium phosphate particles is dispersed with a chemical activity in Le
れた複合体からなるゲル状支持体、この支持体に支持された骨髄細胞、および、前記支持体に含有された動物細胞培養用液体培地を備えた培養用混合物を提供する。 Gel-like support made of complexes, the support bone marrow cells to the support, and provides the support for culturing a mixture comprising a liquid medium for animal cell culture contained in the.

【0012】この発明は、コラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散された複合体からなるゲル状支持体、この支持体に支持され、骨髄細胞から分化した骨系細胞、および、前記支持体に含有された動物細胞培養用液体培地を有する、硬組織欠損部への移植用材料を提供する。 [0012] The present invention, gel-like support comprising a complex calcium phosphate particles are dispersed with a chemical activity in the collagen gel is supported on the support, bone system cells differentiated from bone marrow cells, and said support with a liquid medium for animal cell culture contained in the body, to provide an implant material to the hard tissue defect. この発明に用いる液体培地は、動物細胞の生存や増殖に必要なすべての必須栄養素、エネルギー代謝・触媒作用に必須のビタミンやそのほかの微量金属など、動物細胞の培養に必須の成分を含むものであれば特に限定はない。 Liquid medium used in the present invention, all the essential nutrients necessary for the survival and growth of animal cells, energy metabolism and catalysts such as essential vitamins and other trace metals in action, those containing essential components for culturing animal cells not particularly limited, if any.

【0013】前記液体培地は、従来の骨髄細胞の培養に必須成分であった血清およびホルモンを含む必要はないので、天然培地よりも、全部またはほぼ全部の成分が既知の合成培地の方が好ましい。 [0013] The liquid medium, there is no need to include a conventional bone marrow cells serum and hormones were essential components for culturing, than natural medium, all or substantially all of the components it is preferable for known synthetic medium . 合成培地の中でも、動物細胞の培養に通常使用されるα−MEM(ALPAH-MINIMU Among synthetic medium it is usually used for the culture of animal cells α-MEM (ALPAH-MINIMU
M ESSENTIAL MEDIUM)培地が好ましい。 M ESSENTIAL MEDIUM) medium is preferable. α−MEM培地は、従来は血清および/またはホルモンを必ず添加して使用していたのに対し、この発明では血清もホルモンも添加しない形で用いる。 alpha-MEM medium, whereas has been conventionally used Always adding serum and / or hormones, used in the form that does not add sera hormone in the present invention. このようなことが可能になったのは、骨髄細胞の支持体として後述する特定の複合体を用いるからである。 It became possible such is because the use of a specific complex will be described later as a support for bone marrow cells. なお、液体培地は、通常、10 -4 The liquid medium is usually 10 -4 to
10 -7重量%の濃度でペントシリン、ゲンタマイシン、 10-7 wt% concentration in pentcillin-containing, gentamicin,
ファンギーソンなどの抗生物質を含むのが好ましい。 Preferably it includes an antibiotic, such as fan ghee Son. 前記範囲を上回ると細胞萎縮を示すおそれがある。 Which may indicate a greater than when cell atrophy the range.

【0014】この発明に用いる液体培地には、必要に応じて、アスコルビン酸を添加するのが好ましい。 [0014] The liquid medium used for the present invention, if necessary, it is preferable to add ascorbic acid. シグマ・ケミカル・カンパニー(SIGMA CHEMICAL CO.、米国ミズリー州セントルイス)から市販されているα−MEM Sigma Chemical Co. (SIGMA CHEMICAL CO., USA, St. Louis, Mo.) is commercially available from alpha-MEM
培地は同社の成分表によればL−アスコルビン酸を0. Medium According to its composition tables the L- ascorbic acid 0.
050g/l 含んでいるが、更にアスコルビン酸を添加するのである。 050g / l and comprise, but is of further adding ascorbic acid. アスコルビン酸、特に、L−アスコルビン酸を含む液体培地で動物細胞の培養を行うと、アスコルビン酸がコラーゲンの合成を活性化して細胞増殖を促進する。 Ascorbic acid, in particular, L- ascorbic acid Doing culturing animal cells in a liquid medium containing ascorbic acid activates synthesis of collagen to promote cell proliferation. アスコルビン酸は、0.001〜0.005重量%、好ましくは0.004〜0.007重量%の濃度となるように添加される。 Ascorbic acid, 0.001-0.005 wt%, is preferably added at a concentration of 0.004 to 0.007 wt%. ただし、ここでの数値範囲には、液体培地の成分として元々含まれていたアスコルビン酸は含まれない。 However, the numerical range here, ascorbic acid is not included originally included as a component of the liquid medium. 前記範囲を下回るとコラーゲンの合成を活性化する働きが得られず、上回ると液体培地のp Below the above range can not be obtained serve to activate the synthesis of collagen, the liquid medium exceeds p
Hに変動を起こし、細胞萎縮を示すおそれがある。 H to cause fluctuations, which may indicate a cell atrophy.

【0015】この発明に用いられる骨髄細胞は、たとえば、動物の骨髄組織から無菌的に取り出した骨髄細胞; [0015] Bone marrow cells used in this invention, for example, aseptically removed bone marrow cells from an animal bone marrow tissue;
動物の歯髄組織から無菌的に取り出した歯髄細胞;動物から無菌的に取り出した各種の血球細胞などをコラーゲンゲル上で初代培養してコラーゲンゲルに付着した細胞を単離したものである。 Aseptically extracted pulp cells from animal pulp tissue; and aseptically taken out various blood cells from the animal with primary cultured on collagen gel was attached to a collagen gel cells are those isolated. 無菌的に取り出された細胞は、 It is aseptically removed cells,
細胞の生育に悪影響を与える夾雑物を除くために、好ましくは、上述の液体培地で洗浄され、EGTA処理(C In order to remove the contaminants adversely affect the growth of cells, preferably washed with a liquid medium above, EGTA treatment (C
2+を取り除き細胞同士の接着を剥がす薬品、たとえば、EGTA(エチレングリコールビス(2−アミノエチルエーテル)四酢酸)を溶解した液体培地に37℃で短時間細胞を浸す処理)した後、遠心分離などの操作で細胞成分が回収され、初代培養に供される。 chemicals peeling the adhesion between cells removed a 2+, for example, after EGTA treated immersing the short cell at 37 ° C. in a liquid medium dissolving (ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid)), centrifuged cellular components are recovered in operations such as separation, it is subjected to primary culture. ここで初代培養は、5%CO 2 、37℃のインキュベーター内でコラーゲンゲル上で行われる。 Here primary culture is performed on collagen gel in a 5% CO 2, 37 in ℃ incubator. 初代培養された細胞は、コラーゲンを消化する酵素(たとえば、コラゲナーゼ)でコラーゲンゲルを消化してコラーゲンゲルに付着している細胞を単離して、この発明に用いられる。 Primary cultured cells, enzyme that digests collagen (e.g., collagenase) cells was digested collagen gel adhering to the collagen gel isolated, used in the present invention. また、低温保存や凍結保存された骨髄細胞も使用できる。 Furthermore, cryopreservation and cryopreserved marrow cells can also be used.

【0016】この発明に用いる、骨髄細胞の支持体は、 [0016] used in the invention, the support of bone marrow cells,
コラーゲンと化学活性を有するリン酸カルシウムの複合体である。 It is a complex of calcium phosphate having a collagen and chemical activity. この複合体は、コラーゲンゲル中にリン酸カルシウム粉末粒子が分散してなる含水ゲルであり、良好な生体親和性を有し、流動性を持たない。 This complex is a water-containing gel calcium phosphate powder particles are dispersed in a collagen gel, it has good biocompatibility, no fluidity. 前記コラーゲンとしては、酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶化コラーゲンなどの可溶性コラーゲンであって、I型コラーゲンが用いられる。 As the collagen, acid-soluble collagen, alkali-soluble collagen, a soluble collagen, such as an enzyme-solubilized collagen, I collagen is used. I型コラーゲンの中でも、アテロコラーゲンは、生体為害性の原因となる分子末端のテロペプタイドが酵素処理により一部または全部除去されているので生体に対して抗原性をほとんどまたは全く持たないので好ましい。 Among the type I collagen, atelocollagen, since terror molecular ends which cause for damage resistance biological peptide does not have little or no antigenicity against biological because it is partially or entirely removed by enzymatic treatment preferred.

【0017】前記リン酸カルシウムとしては、微細構造、リン酸塩のプロトン化状態、または、水和の程度に関わらず、Ca 2+とリン酸塩イオンから構成され、化学活性を有する固体物質である。 [0017] As the calcium phosphate, microstructure, phosphate protonation states or, regardless of the degree of hydration, consists Ca 2+ and phosphate ions, a solid material having a chemical activity. ここで、リン酸カルシウムが化学活性を有するとは、生理条件下、母床の結晶界面上でカルシウムイオンを解離、加水分解を経てカルシウム欠損水酸アパタイトまたは炭酸アパタイトに結晶転化する能力を持つということである。 Here, the calcium phosphate has a chemical activity, physiological conditions, dissociation of calcium ions on the crystal interface of the mother bed, that it have the ability to crystallize converted to calcium-deficient hydroxyapatite or carbonate apatite through hydrolysis is there. この発明に用いる、化学活性を有するリン酸カルシウムとしては、非結晶質リン酸カルシウム(以下では「ACP」と言うことがある)、リン酸八カルシウム(以下では「OCP」と言うことがある)、リン酸四カルシウム(以下では「T Used in the present invention, the calcium phosphate having the chemical activity, amorphous calcium phosphate (in the following sometimes referred to as "ACP"), octacalcium phosphate (hereinafter sometimes referred to as "OCP"), tetracalcium phosphate calcium (hereinafter "T
eCP」と言うことがある)およびα−リン酸三カルシウム(以下では「α−TCP」と言うことがある)からなる群から選ばれる少なくとも1つが、目的の骨系細胞への分化を誘導するので、好ましい。 eCP "and in there) and α- tricalcium phosphate (hereinafter to say is at least one selected from the group consisting of" may be referred to as alpha-TCP "), to induce differentiation into bone system cell of interest because, preferable. この発明では、リン酸カルシウムは、平均粒径が好ましくは5〜40μ In the present invention, calcium phosphate has an average particle diameter of preferably 5~40μ
m、より好ましくは10〜32μmの粉末または顆粒で使用される。 m, more preferably in a powder or granules of 10~32Myuemu.

【0018】前記複合体は、コラーゲン水溶液、濃縮された液体培地、緩衝液、化学活性を有するリン酸カルシウム粉末を混合して、前記粉末を液中に懸濁させ、得られた懸濁物を36〜37℃にしてコラーゲンをゲル化させることにより得られる。 [0018] The conjugates, aqueous collagen solution, concentrated liquid media, buffer, a mixture of calcium phosphate powder having the chemical activity, 36 to the powder was suspended in the solution, the suspension obtained collagen in the 37 ° C. obtained by gelation. 得られた複合体では、コラーゲンゲル中にリン酸カルシウム粉末の粒子が分散している。 In the resulting composite, the particles of the calcium phosphate powder is dispersed in the collagen gel. 複合体を作るために、コラーゲン水溶液、濃縮された液体培地、緩衝液、リン酸カルシウム粉末はいちどに混合されてもよいし、順次混合されてもよいし、2以上を予め混合した後残りを混合してもよいし、特に混合方法には限定はない。 To make the composite, collagen solution, concentrated liquid media, buffer, calcium phosphate powder may be mixed at once, or may be sequentially mixed, a mixture of the remainder was premixed more it may be, not limited to the particular mixing process.

【0019】液体培地に緩衝液などの液が添加される場合、液体培地と前記液との混合物が、液体培地の成分を所定濃度で含むように、濃縮された形で液体培地が使用される。 [0019] If a liquid, such as liquid medium buffer is added, a mixture of the liquid medium liquid, to contain the components of the liquid medium at a predetermined concentration, the liquid medium is used in a concentrated form . コラーゲンは、前記懸濁物がゲル化しうるような量、たとえば、全体量に対して50〜90%、好ましくは70〜80%の割合(0.3重量%コラーゲン水溶液に換算した容積割合)で使用される。 Collagen is an amount such that the suspension can be gelled, for example, 50-90% on the total amount, preferably a rate of 70-80% is (volume percentage in terms of 0.3% by weight aqueous solution of collagen) used.

【0020】前記緩衝液は、前記複合体に緩衝能を付与するために添加される。 [0020] The buffer solution is added to impart buffering capability to the composite. これは、複合体において、リン酸カルシウムが溶解してpH値を大きく変動するのを防ぐためである。 This is to prevent the complex from varying greatly the pH to dissolve calcium phosphate. 緩衝液としては、たとえば、HEPES As the buffer solution, e.g., HEPES
緩衝液などのpH7〜8付近の緩衝液が使用される。 Buffer around pH7~8 such as buffers may be used. 緩衝液の添加量は、混合物がpH7〜8付近において緩衝能を有するような量で適宜添加され、特に制限はない。 The addition amount of the buffer, the mixture is suitably added in amounts such as to have a buffering ability in the vicinity of pH 7-8, not particularly limited.

【0021】化学活性を有するリン酸カルシウム粉末は、液体培地にリン酸イオンを溶出して、リン酸カルシウムの結晶成長を助け、リン酸八カルシウム、カルシウム欠損ハイドロキシアパタイト、炭酸アパタイトなどの生成を促進する。 The calcium phosphate powder with a chemical activity eluted phosphate ions in a liquid medium, helped the crystal growth of calcium phosphate, octacalcium phosphate, calcium-deficient hydroxyapatite, to promote the production of such apatite. リン酸イオンの量が少なすぎるとリン酸カルシウムの結晶成長が遅延するおそれがあり、リン酸イオンの量が過剰だとリン酸塩の無機的析出を起こし、細胞によるリン酸イオンの石灰化を阻害するおそれがあるので、化学活性を有するリン酸カルシウム粉末の量は、通常、コラーゲン水溶液(0.3重量%換算)1 When the amount of phosphate ions is too small calcium phosphate crystal growth of there is a risk of delay, cause inorganic precipitation of phosphate amount of phosphate ion is that it excessively, inhibits calcification of phosphate ions by the cells because fear is, the amount of calcium phosphate powder with a chemical activity is usually, aqueous collagen solution (0.3 wt% basis) 1
mlあたり1.0〜5.0mg/mlである。 It is a 1.0~5.0mg / ml per ml.

【0022】骨髄細胞は、前記複合体の表面に通常の手法により播種されたり、あるいは、前記複合体中に通常の手法(たとえば、複合体の表面に播種された後、その上に複合体を形成して播種された細胞を覆う方法、あるいは、複合体を作るための懸濁液に細胞も懸濁させてコラーゲンをゲル化させる方法)により包埋されたりする。 [0022] Bone marrow cells, the or seeded by conventional techniques on the surface of the composite body, or the complex normal in approach (e.g., after being seeded on the surface of the composite, the composite thereon how to cover the seeded formed to cells or to a suspension with cells also suspended collagen for making complex or embedded by the method) to gel. すなわち、この発明の培養方法は、骨髄細胞を二次元的に増殖させたり、あるいは、三次元的に増殖させたりすることができる。 That is, the method of culturing the invention, or grown bone marrow cells two-dimensionally, or may be or grown three-dimensionally.

【0023】骨髄細胞を分化させるための培養は、前記複合体を支持体として用い、前記液体培地、好ましくはα−MEM培地にL−アスコルビン酸と上記抗生物質が添加されたもの、中において、たとえば、温度36.5 [0023] Culture for differentiating bone marrow cells, the use of a complex as a support, the liquid medium, preferably those L- ascorbic acid and the antibiotics alpha-MEM medium was added, in the middle, For example, temperature 36.5
〜37.0℃、CO 2濃度2.0〜5.0容積%の培養用器具(CO 2インキュベーター)内で行われる。 ~37.0 ℃, carried out in a CO 2 concentration of 2.0 to 5.0 volume% of the culture instrument (CO 2 incubator). 培地交換は1〜2日ごとに1回の割合で行われる。 Medium exchange is carried out at a rate of once every 1-2 days.

【0024】この発明の培養方法により骨髄細胞から分化される骨系細胞は、たとえば、骨芽細胞、破骨細胞、 [0024] Bone system cells that are differentiated from bone marrow cells by culture method of the present invention, for example, osteoblasts, osteoclasts,
軟骨芽細胞から選ばれるいずれか1種または2種以上の共存物である。 Is any one or more of coexisting substances selected from chondroblasts. 分化制御は、たとえば、次のようにして行う。 Differentiation control is carried out, for example, in the following manner. 骨髄細胞を骨芽細胞に分化させるためには、ペプシン可溶化I型コラーゲンとTeCPとの複合体を支持体として用いる。 To differentiate bone marrow cells to osteoblasts, use complex with pepsin-solubilized type I collagen and TeCP as a support. TeCPは、I型コラーゲン水溶液(0.3重量%換算)1mlに対して1.0〜5.0mg、 TeCP is, 1.0 to 5.0 relative to the type I collagen solution (0.3 wt% in terms of) 1 ml,
好ましくは2.0〜3.0mgの割合で混合される。 Preferably it is mixed in a ratio of 2.0~3.0Mg. 培養日数は、初代培養日数も含めて10〜15日である。 Number of days of culture is 10 to 15 days, including primary culture days.

【0025】骨髄細胞を破骨細胞に分化させるためには、ペプシン可溶化I型コラーゲンと、OCPおよび/ [0025] Bone marrow cells to differentiate into osteoclasts, the pepsin-solubilized type I collagen, OCP and /
またはACP(OCP:ACP=0:100〜100: Or ACP (OCP: ACP = 0: 100~100:
0重量比)との複合体を支持体として用いる。 A complex between 0 weight ratio) is used as a support. OCPおよび/またはACPは、I型コラーゲン水溶液(0.3 OCP and / or the ACP, I collagen solution (0.3
重量%換算)1mlに対して1.0〜5.0mg、好ましくは1.5〜2.5mgの割合で混合される。 1.0~5.0mg the weight% conversion) 1 ml, is mixed preferably in a ratio of 1.5-2.5. 培養日数は、 Number of days of culture is,
初代培養日数も含めて15〜25日である。 Primary cultures of days is also 15 to 25 days, including.

【0026】骨髄細胞を骨芽細胞と破骨細胞とに共存分化させるためには、ペプシン可溶化I型コラーゲンとα [0026] Bone marrow cells to coexist differentiate into osteoblasts and osteoclasts, pepsin-solubilized type I collagen and α
−TCPとの複合体を支持体として用いる。 Using a complex of -TCP as a support. α−TCP α-TCP
は、I型コラーゲン水溶液(0.3重量%換算)1mlに対して1.0〜5.0mg、好ましくは1.5〜3.0mg Is, 1.0 to 5.0 relative to the type I collagen solution (0.3 wt% in terms of) 1 ml, preferably 1.5~3.0mg
の割合で混合される。 They are mixed in a ratio of. 培養日数は、初代培養日数も含めて12〜22日である。 Number of days of culture is 12 to 22 days, including primary culture days.

【0027】骨髄細胞を軟骨芽細胞に分化させるためには、酸可溶化I型コラーゲンとα−TCPとの複合体を支持体として用いる。 [0027] Bone marrow cells to differentiate into chondroblasts uses a complex of acid solubilized type I collagen and alpha-TCP as a support. α−TCPは、I型コラーゲン水溶液(0.3重量%換算)1mlに対して1.0〜5.0 alpha-TCP is 1.0 to 5.0 with respect to type I collagen solution (0.3 wt% in terms of) 1 ml
mg、好ましくは1.5〜3.0mgの割合で混合される。 mg, it is preferably mixed at a ratio of 1.5~3.0Mg.
培養日数は、初代培養日数も含めて12〜22日である。 Number of days of culture is 12 to 22 days, including primary culture days.

【0028】この発明の培養方法は、経時的に細胞を位相差顕微鏡で観察し、細胞の分化を形態学的に追跡したり、あるいは、分化機構を追求したりすることができる有効な手法である。 The method for culturing the present invention, over time observing the cells by phase contrast microscopy to track the differentiation of cells morphologically, or an effective method that can be or pursue differentiation mechanism is there. オステオカルシンの検出などの公知の手法により骨芽細胞が識別される。 Osteoblasts are identified by a known method such as detection of osteocalcin. 酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色などの公知の手法により破骨細胞が識別される。 Osteoclasts are identified by known techniques, such as tartrate-resistant acid phosphatase staining. トルイジンブルー染色などの公知の手法により軟骨芽細胞が識別される。 Chondroblasts is identified by a known method such as toluidine blue staining. この発明は、また、無血清培地で培養を行っているため、培養上澄みからの骨分化因子を容易に同定できる。 The invention also, because a free medium, can readily identify osteogenic differentiation factors from the culture supernatant.

【0029】上記の培養方法により、骨髄細胞から分化した骨系細胞がコラーゲンと化学活性を有するリン酸カルシウムとの複合体に支持された移植用材料が得られる。 [0029] By the method of cultivation, implantable material supported complex with calcium phosphate bone system cells differentiated from bone marrow cells have collagen and chemical activity. 得られた移植用材料は、骨欠損部の修復材、歯根膜細胞複合化インプラント材などのハイブリッド型の修復材として、骨折、先天的な骨の欠陥、外科的に生じた骨の欠損などの骨欠損部、補遺を必要とする骨の構造および歯周の欠陥(たとえば、歯根膜細胞の欠損)などの生体硬組織の欠損部などに対して、整形外科や歯科などの医師に良く知られた標準的な外科的手術(たとえば、骨髄または骨片だけを供給する際に用いられる方法である)を用いて移植される。 The resulting graft material for bone defect repair material, as hybrid restorative material such as periodontal ligament cells composite implant material, bone fracture, congenital bone defects, surgically resulting in such bone defects bone defect, structure and periodontal bone defects that require supplements (e.g., loss of periodontal ligament cells) against such defects of the organic hard tissue, such as, well-known to the physician, such as orthopedic and dental standard surgical (e.g., a method in which used when supplying only bone marrow or bone fragments) were being transplanted using. 移植に先立って、組織適合性をチェックする必要があることは従来の移植用材料と同様である。 Prior to transplantation, it is necessary to check the tissue compatibility is the same as the conventional implant material.

【0030】この発明の培養方法により得られた上記移植用材料は、培養に用いた液体培地を含んだゲルの状態で生体に移植される。 The obtained the graft material by the method of culturing the invention, it is implanted in the living body in a gel state containing the liquid medium used for the culture.

【0031】 [0031]

【作用】この発明の骨髄細胞の培養方法は、細胞の支持体としてコラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散された複合体を用いて行うので、無血清かつ無ホルモンの液体培地で骨髄細胞を培養することができ、しかも、この培養により骨髄細胞が骨系細胞へ分化し、あるいは、分化が促進される。 The method of culturing bone marrow cells [action] The present invention, is performed using the calcium phosphate particles with a chemically active collagen gel as a support for the cells are dispersed complex, the bone marrow in liquid culture medium serum-free and hormone can be cultured cells, moreover, bone marrow cells by the culture differentiate into bone system cell, or differentiation is promoted. コラーゲンと前記リン酸カルシウムは、リン酸イオンの存在下でゲル化反応と結晶転化反応により化学的に複合化され、細胞の分化・増殖、および、骨様組成物の合成が可能となる。 The collagen calcium phosphate is chemically conjugated by crystallization shift reaction and gelation reaction in the presence of phosphate ions, differentiation and proliferation of cells, and permits the synthesis of bone-like composition. リン酸イオンは、たとえば、リン酸カルシウムから溶出したものである。 Phosphate ions, for example, those eluted from calcium phosphate. 培養条件を適宜変更することにより、骨髄細胞が所望の骨系細胞に分化するように制御することができる。 By changing the culture conditions can be appropriately bone marrow cells is controlled to differentiate into the desired bone system cells.

【0032】この発明の培養用混合物は、コラーゲン The culture mixture of the present invention, collagen gate
ル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散さ Calcium phosphate particles is dispersed with a chemical activity in Le
れた複合体からなる支持体、この支持体に支持された骨髄細胞、および、リン酸イオンを含む動物細胞培養用液体培地を備えているので、無血清かつ無ホルモン下で骨髄細胞(硬組織細胞)を体外で培養するのに適した培養基材に骨髄細胞が支持されたものとなっている。 Support made complexes, supported bone marrow cells to the support, and is provided with the liquid medium for animal cell culture containing phosphate ions, bone marrow cells (hard tissue under serum-free and hormone bone marrow cells has to have been supported cells) culture substrate suitable for culturing in vitro.

【0033】前記コラーゲンとしてI型コラーゲンを用いることにより、骨、腱、象牙質に認められるコラーゲンと一致するため移植部位への置換性に優れるという利点がある。 [0033] By using a type I collagen as the collagen, there is an advantage that excellent substitution of the implantation site to match the collagen found bone, tendon, dentin. 前記リン酸カルシウムが、ACP、OCP、 The calcium phosphate, ACP, OCP,
TeCPおよびα−TCPからなる群から選ばれる少なくとも1つであると、未分化な細胞を賦活化するエネルギーに富むという利点がある。 Is at least one of the is selected from the group consisting of TeCP and alpha-TCP, there is an advantage that energy-rich to activating undifferentiated cells.

【0034】前記液体培地が合成培地であれば、成分が分かっているので、無血清かつ無ホルモンとすることが容易である。 [0034] If the liquid medium is a synthetic medium, since the found component, it is easy to serum-free and hormone-free. 前記合成培地がα−MEM培地であると、 When the synthetic medium is a alpha-MEM medium,
市販品であるため入手しやすく、この知見を基礎に応用研究分野へも活用できるという利点がある。 Easily available because it is a commercial product, there is an advantage that it can be also utilized to applied research field this finding to the foundation. 前記液体培地がアスコルビン酸を含んでいると、細胞のタンパク質合成が促進される。 When the liquid medium contains ascorbic acid, protein synthesis of the cells is promoted.

【0035】この発明の移植用材料は、コラーゲンゲル [0035] for transplant material of the present invention, collagen gel
中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散され Calcium phosphate particles with a chemically active in the dispersed
複合体からなる支持体、および、この支持体に支持され、骨髄細胞から分化した骨系細胞を有するので、硬組織に近似した骨様組成物となっており、移植しようとする部位に適した骨系細胞が固定されていて流動しないようになっている。 Support consisting complexes, and is supported on the support, since with bone lineage cells differentiated from bone marrow cells, it has a bone-like composition approximate to hard tissue, suitable site to be implanted bone system cell is prevented from flowing is fixed a. このため、この移植用材料を移植すると、その部位から骨系細胞が流れ去らずに増殖し、良好な生体硬組織修復能を示すと期待される。 Therefore, when implanting the implantable material, grown without leave bone system cell flow from the site, it is expected to show good biological hard tissue repair capacity.

【0036】 [0036]

【実施例】以下に、この発明の実施例と、この発明の範囲を外れた比較例とを示すが、この発明は下記実施例に限定されない。 THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the embodiments of the present invention, show a comparative example outside the scope of the invention, the invention is not limited to the following examples. (実施例1)冷却下で、セルマトリックスタイプI−P (Example 1) Under cooling, cell matrix type I-P
(新田ゼラチン株式会社製のペプシン可溶化I型コラーゲンの0.3重量%水溶液)、5倍濃度のα−MEM培地、および、HEPES緩衝液を8:1:1の重量比で混合し、この混合物を直径35mmのプラスチックプレートに入れた。 (Nitta 0.3 wt% aqueous solution of gelatin Co. pepsin-solubilized type I collagen), 5-fold concentration alpha-MEM medium, and, HEPES buffer 8: 1: 1 mixture by weight, the mixture was placed in a plastic plate having a diameter of 35 mm. このプレートを37℃で1時間放置してコラーゲンゲルシート(厚み2.0〜3.0mm)を作った。 The plate was left for 1 hour at 37 ° C. to make a collagen gel sheet (thickness 2.0 to 3.0 mm).

【0037】5〜6週令のウィスター系雄ラットの骨髄中から無菌的に摘出された骨髄細胞をコラーゲンゲルシートの上に播種した。 [0037] 5-6-week-old Wistar male rats aseptically removed bone marrow cells from the bone marrow were seeded on a collagen gel sheet. 播種された細胞を、α−MEM培地(シグマ・ケミカル・カンパニー(SIGMA CHEMICAL C The seeded cells, α-MEM medium (Sigma Chemical Company (SIGMA CHEMICAL C
O.)、米国ミズリー州セントルイス)にL−アスコルビン酸(濃度10mM、ただし、α−MEM培地に元々含まれているL−アスコルビン酸の濃度はこの数値に含まれない)、ペントシリン1mg/ml、ゲンタマイシン0. O.), USA, St. Louis, Mo.) in L- ascorbic acid (concentration 10 mM, however, the concentration of the originally Including L- ascorbic acid alpha-MEM medium is not included in this number), pentcillin-containing 1 mg / ml, gentamicin 0.
5mg/ml、ファンギーソン3.0μg/mlを添加した液体培地中で、5%CO 2 、37℃に調整したCO 2インキュベーター内で7日間初代培養を行った。 5 mg / ml, a fan ghee Son 3.0 [mu] g / ml liquid medium supplemented with, was 5% CO 2, 37 ° C. to adjust the CO 2 incubator for 7 days primary culture. 培地交換は2日に1度の間隔で行った。 Medium exchange was carried out at intervals of once every two days.

【0038】初代培養後、プレート内の浮遊細胞を捨てた後、コラーゲンゲルに付着した細胞を0.1重量%コラゲナーゼによるコラーゲンの消化(37℃、15分間)で浮遊させ、この消化液中に初代培養細胞を1×1 [0038] After the primary culture, after discarding the floating cells in the plate, digestion of collagen and cells attached to the collagen gel according to 0.1 wt% collagenase (37 ° C., 15 minutes) were suspended in, during the digestion solution the primary culture cells 1 × 1
4 cells/mlの量で含む細胞懸濁液を得た。 0 to obtain a cell suspension in an amount of 4 cells / ml. 冷却下で、 Under cooling,
セルマトリックスタイプI−P(新田ゼラチン株式会社製のペプシン可溶化I型コラーゲンの0.3重量%水溶液)、5倍濃度のα−MEM培地、および、HEPES Cell Matrix Type I-P (0.3 wt% aqueous solution of pepsin-solubilized type I collagen manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.), 5-fold concentration alpha-MEM medium, and, HEPES
緩衝液を8:1:1の体積比で混合し、この混合物にL Buffer 8: 1: 1 were mixed at a volume ratio, L in the mixture
−アスコルビン酸(濃度10mM、ただし、α−MEM - ascorbic acid (concentration 10mM, however, α-MEM
培地に元々含まれているL−アスコルビン酸の濃度はこの数値に含まれない)を混合し、リン酸四カルシウム粉末粒子(粒径32μm以下)を2.0mg/mlの割合で懸濁させた懸濁液を直径35mmのプラスチックプレートに入れた。 The concentration of the originally Including L- ascorbic acid in the medium is a mixture of included not) to this value, tetracalcium phosphate powder particles (having a particle size 32 [mu] m) were suspended at a rate of 2.0 mg / ml the suspension was placed in a plastic plate having a diameter of 35 mm. このプレートを37℃で1時間放置して、リン酸四カルシウム粉末粒子が2.0mg/mlの量で分散されたコラーゲンゲルシート(厚み2.0〜4.0mm)を作った。 The plate was left for 1 hour at 37 ° C., tetracalcium phosphate powder particles made dispersed collagen gel sheets (thickness 2.0 to 4.0 mm) in an amount of 2.0 mg / ml.

【0039】上記細胞懸濁液をプレートに入れて初代培養細胞をコラーゲンゲル上に播種した(細胞密度1×1 [0039] The primary cells were placed in the plate the cell suspension was seeded onto collagen gel (cell density 1 × 1
4 cells/ml)。 0 4 cells / ml). 初代培養と同じ液体培地を使用し、3 Using the same liquid medium as primary culture, 3
6.5〜37.0℃、2.0〜3.0容積%のCO 2下で継代培養した(骨芽細胞に分化させるときは、培養器内の酸素分圧をやや高く調節する)。 From 6.5 to 37.0 ° C., it was subcultured in a CO 2 under 2.0 to 3.0 volume% (when to differentiate into osteoblasts regulate slightly higher oxygen partial pressure in the incubator) . 培地は2日ごとに交換した。 The medium was changed every two days.

【0040】継代培養開始後3〜8日目(初代培養開始後10〜15日目)、分化した細胞の確認をするために、細胞の一部を取って、ALPase染色およびオステオカルシンの免疫染色を行った。 [0040] subculture start after 3-8 days (primary culture after the start of 10 to 15 days), in order to confirm the differentiated cells, taking a part of the cell, ALPase staining and osteocalcin immunostaining It was carried out. リン酸カルシウム粒子を中心に線維芽細胞様細胞の重層化したコロニーが認められ、コロニーを形成する細胞表面には、石灰化物の結晶が見られた。 Central stratified colonies of fibroblast-like cells were observed in the calcium phosphate particles, to the cell surface to form a colony, crystalline lime product was observed. 石灰化物を有する細胞は、ALPase陽性を示し、オステオカルシンの局在を認めた。 Cells with lime product showed ALPase positive showed a localization of osteocalcin. これらの結果から、実施例1の継代培養細胞は骨芽細胞であることが確認された。 These results, subculture the cells of Example 1 was confirmed to be an osteoblast.

【0041】(実施例2)実施例1において、細胞懸濁液の細胞の量を5×10 4 cells/mlに変えたこと、リン酸四カルシウム粉末粒子の代わりにリン酸八カルシウム粉末粒子(粒径32μm以下)を用いたこと、継代培養時のCO 2濃度を5.0容積%に変えたこと以外は実施例1と同様にして骨髄細胞を培養した。 [0041] (Example 2) Example 1, it changed the amount of cells in the cell suspension to 5 × 10 4 cells / ml, octacalcium phosphate powder particles in place of tetracalcium phosphate powder particles ( particle size 32μm or less) for the use of, and except for changing the CO 2 concentration at the time of subculture in 5.0% by volume in the same manner as in example 1 was cultured bone marrow cells.

【0042】継代培養開始後13〜18日目(初代培養開始後20〜25日目)、分化した細胞の確認をするために、細胞の一部を取って、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色を施した。 [0042] 13 to 18 days after the start of subculture (20 to 25 days after the start of primary culture), in order to confirm the differentiated cells, taking a part of the cell, facilities tartrate-resistant acid phosphatase staining did. リン酸カルシウム粒子を中心に形成された線維芽細胞様細胞のコロニーが多数認められた。 Colonies of fibroblast-like cells formed around the calcium phosphate particles were observed many. リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は多核巨細胞であり、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色で陽性に染まる細胞であった。 Cells surrounding calcium phosphate particles are multinucleated giant cells were cells stained positive with tartrate-resistant acid phosphatase staining. これらの結果から、リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は、破骨細胞に分化していることが確認された。 These results, cells surrounding calcium phosphate particles, it was confirmed that differentiated into osteoclasts.

【0043】(実施例3)実施例2において、リン酸八カルシウム粉末粒子の代わりに非晶質リン酸カルシウム粉末粒子(粒径32μm以下)を用いたこと以外は実施例2と同様にして骨髄細胞を培養した。 [0043] (Example 3) Example 2, the in the same manner as in Example 2 Bone marrow cells except for the use of amorphous calcium phosphate powder particles in place of octacalcium phosphate powder particles (having a particle size 32 [mu] m) and cultured. 継代培養開始後13〜18日目(初代培養開始後20〜25日目)、分化した細胞の確認をするために、細胞の一部を取って、 13 to 18 days after the start of subculture (20 to 25 days after the start of primary culture), in order to confirm the differentiated cells, taking a part of the cell,
酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色を施した。 It was subjected to tartrate-resistant acid phosphatase staining. リン酸カルシウム粒子を中心に形成された線維芽細胞様細胞のコロニーが多数認められた。 Colonies of fibroblast-like cells formed around the calcium phosphate particles were observed many. リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は多核巨細胞であり、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色で陽性に染まる細胞であった。 Cells surrounding calcium phosphate particles are multinucleated giant cells were cells stained positive with tartrate-resistant acid phosphatase staining. これらの結果から、リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は、破骨細胞に分化していることが確認された。 These results, cells surrounding calcium phosphate particles, it was confirmed that differentiated into osteoclasts.

【0044】(実施例4)実施例2において、リン酸八カルシウム粉末粒子半分の量を非晶質リン酸カルシウム粉末粒子(粒径32μm以下)に置き換えたこと以外は実施例2と同様にして骨髄細胞を培養した。 [0044] (Example 4) In Example 2, the bone marrow in the same manner except that the amount of octacalcium phosphate powder particles half was replaced with amorphous calcium phosphate powder particles (having a particle size 32 [mu] m) Example 2 Cell They were cultured. 継代培養開始後13〜18日目(初代培養開始後20〜25日目)、分化した細胞の確認をするために、細胞の一部を取って、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色を施した。 13 to 18 days after the start of subculture (20 to 25 days after the start of primary culture), in order to confirm the differentiated cells, taking a part of the cell, it was subjected to tartrate-resistant acid phosphatase staining. リン酸カルシウム粒子を中心に形成された線維芽細胞様細胞のコロニーが多数認められた。 Colonies of fibroblast-like cells formed around the calcium phosphate particles were observed many. リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は多核巨細胞であり、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色で陽性に染まる細胞であった。 Cells surrounding calcium phosphate particles are multinucleated giant cells were cells stained positive with tartrate-resistant acid phosphatase staining. これらの結果から、リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は、 These results, cells surrounding calcium phosphate particles,
破骨細胞に分化していることが確認された。 That they are differentiated into osteoclasts it has been confirmed.

【0045】(実施例5)実施例1において、細胞懸濁液の細胞の量を3×10 4 cells/mlに変えたこと、リン酸四カルシウム粉末粒子の代わりにα−リン酸三カルシウム粉末粒子(粒径32μm以下)を用いたこと、継代培養時のCO 2濃度を5.0容積%に変えたこと以外は実施例1と同様にして骨髄細胞を培養した。 [0045] (Example 5) Example 1, it changed the amount of cells in the cell suspension to 3 × 10 4 cells / ml, α- tricalcium phosphate powder instead of tetracalcium phosphate powder particles for the use of particles (having a particle size 32 [mu] m), it was other than changing the CO 2 concentration at the time of subculture in 5.0% by volume in the same manner as in example 1 was cultured bone marrow cells.

【0046】継代培養開始後8〜18日目(初代培養開始後15〜25日目)、分化した細胞の確認をするために、細胞の一部を取って、ALPase染色およびオステオカルシンの免疫染色を施し、また、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色を施した。 [0046] subculture start after 8 to 18 days (primary culture after the start of 15 to 25 days), in order to confirm the differentiated cells, taking a part of the cell, ALPase staining and osteocalcin immunostaining alms, was also subjected to tartrate-resistant acid phosphatase staining. リン酸カルシウム粒子を中心に形成された線維芽細胞様細胞のコロニーが多数認められた。 Colonies of fibroblast-like cells formed around the calcium phosphate particles were observed many. コロニー辺縁部の細胞には、石灰化物の結晶が見られた。 The cells of the colony edges, crystalline lime product was observed. 石灰化物の結晶を含む細胞は、ALPase陽性を示し、オステオカルシンの局在も認められた。 Cells containing a crystal of lime product shows the ALPase positive, localization of osteocalcin were also observed. リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は多核巨細胞であり、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色で陽性に染まる細胞であった。 Cells surrounding calcium phosphate particles are multinucleated giant cells were cells stained positive with tartrate-resistant acid phosphatase staining. これらの結果から、コロニー辺縁部の細胞は骨芽細胞であり、リン酸カルシウム粒子周囲の細胞は、破骨細胞に分化していることが確認された。 These results, the cell colonies edges are osteoblasts, cells surrounding calcium phosphate particles, it was confirmed that differentiated into osteoclasts. すなわち、実施例4の場合、骨芽細胞および破骨細胞の共存分化を誘導することが示された。 That is, in the case of Example 4, was shown to induce the co differentiation of osteoblasts and osteoclasts.

【0047】(実施例6)実施例1において、セルマトリックスタイプI−Pの代わりにセルマトリックスタイプI−A(新田ゼラチン株式会社製の酸可溶化I型コラーゲンの0.3重量%水溶液)を用いたこと、細胞懸濁液の細胞の量を4×10 5 cells/mlに変えたこと、リン酸四カルシウム粉末粒子の代わりにα−リン酸三カルシウム粉末粒子(粒径32μm以下)を用いたこと、継代培養時のCO 2濃度を5.0容積%に変えたこと以外は実施例1と同様にして骨髄細胞を培養した。 [0047] (Example 6) Example 1, cell matrix type instead of cell matrix type I-P I-A (0.3 wt% aqueous solution of Nitta Gelatin Co., Ltd. of acid solubilized type I collagen) it was used, that varying amounts of cells in the cell suspension to 4 × 10 5 cells / ml, instead of α- tricalcium phosphate powder particles of tetracalcium phosphate powder particles (having a particle size 32 [mu] m) it was used was except for changing the CO 2 concentration at the time of subculture in 5.0% by volume in the same manner as in example 1 was cultured bone marrow cells.

【0048】継代培養開始後5〜15日目(初代培養開始後12〜22日目)、分化した細胞の確認をするために、細胞の一部を取って、トルイジンブルー染色を施して、メタクロマジーの観察を行った。 [0048] 5 to 15 days after the start of subculture (12 to 22 days after the start of primary culture), in order to confirm the differentiated cells, taking a part of the cell, subjected to toluidine blue staining, It was metachromatic of observation. リン酸カルシウム粒子を中心の細胞のコロニーが認められ、コロニーを形成する細胞表面には、石灰化物の結晶が見られた。 Observed colonies around the cell calcium phosphate particles, to the cell surface to form a colony, crystalline lime product was observed. 石灰化物の結晶を有する細胞は、メタクロマジーを示していた。 Cells with crystals of lime product indicated the metachromatic. これらの結果から、分化した細胞は、軟骨芽細胞であることが確認された。 These results, differentiated cells, it was confirmed that the chondroblasts.

【0049】(比較例1)アテロペプチドコラーゲンの生理食塩水溶液(濃度65mg/ml)4.8cc、および、β−リン酸三カルシウムとハイドロキシアパタイトの混合物(70重量%の多孔性、密度0.6g/ml、 [0049] (Comparative Example 1) A saline solution telopeptide collagen (concentration 65mg / ml) 4.8cc, and, beta-tricalcium phosphate and mixtures hydroxyapatite (70% by weight of the porous, density 0.6g / ml,
4.2cc)2.5gを良く混合した。 4.2cc) were mixed well 2.5g. この混合物に1.4ccの骨髄を加えて、7ccの組成物を得た。 In addition bone marrow of 1.4cc to the mixture to obtain a composition of 7 cc. この組成物は、骨髄16重量%、コラーゲン3重量%、生理食塩水52重量%、β−リン酸三カルシウムとハイドロキシアパタイトの混合物29重量%であった。 The composition, 16 wt% marrow, collagen 3% by weight, saline 52 wt% was a mixture 29 wt% of β- tricalcium phosphate and hydroxyapatite.

【0050】実施例1において、骨髄細胞が播種されたコラーゲンシートの代わりに上記のようにして作られた組成物を用いたこと以外は実施例1と同様にして骨髄細胞を培養した。 [0050] In Example 1, except for using composition marrow cells were made as described above in place of the seeded collagen sheet in the same manner as in Example 1 was cultured bone marrow cells. その結果、1週間後、浮遊してきた細胞だけでなくコラーゲンに付着していた細胞も死んでいた。 As a result, after one week, also it was dead cells were attached to collagen not only the cells that have been suspended.

【0051】 [0051]

【発明の効果】この発明の骨髄細胞の培養方法によれば、体外で(in vitro)、未分化な骨髄細胞を移植部位に適応した所望の骨系細胞に分化させることができる。 Effects of the Invention] According to the method for culturing bone marrow cells of the present invention, in vitro (in vitro), it may be differentiated into desired bone system cell undifferentiated bone marrow cells adapted for implantation site.
この発明の培養用混合物は、骨髄細胞を上記この発明の培養方法で培養しやすい形態に整えたものであり、体外で骨髄細胞の分化を行うのに好適である。 Culture mixture of the invention, the bone marrow cells are those trimmed to the culture tends to form in the culture method of the present invention, it is preferable to perform the differentiation of bone marrow cells in vitro.

【0052】この発明の移植用材料は、骨形成に関与する細胞を有する骨様組成物であり、この発明の培養方法により、体外で安定かつ多量に得られる。 [0052] graft material of this invention is a bone-like composition having cells involved in bone formation, the method for culturing the present invention, stable and is a large amount obtained in vitro. 骨欠損部などの硬組織欠損部を修復するために、この発明の移植用材料を用いれば、移植部位に適した骨系細胞を固定した状態で移植することができ、取り扱いやすく、修復を効果的に行うことができる。 To repair hard tissue defect, such as a bone defects, the use of the implantable material of the present invention can be implanted in a state of fixing the bone system cells suitable for implantation site, easy to handle, effect a repair it can be carried out in the manner.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 萬代 佳宣 大阪府八尾市二俣2丁目22番地 新田ゼ ラチン株式会社大阪工場内 (72)発明者 永冨 功治 大阪府八尾市二俣2丁目22番地 新田ゼ ラチン株式会社大阪工場内 (56)参考文献 特開 平6−343456(JP,A) 特表 平4−505717(JP,A) 特公 平2−33388(JP,B2) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Bandai Keisen Osaka Prefecture Yao City Futatsumata 2-chome 22 address Nitta a gelatin Co., Ltd. Osaka in the factory (72) inventor Hisashi Tomi Koji Nitta Osaka Prefecture Yao City Futatsumata address 2-chome 22 a gelatin Osaka in the factory (56) reference Patent flat 6-343456 (JP, a) JP-T flat 4-505717 (JP, a) Tokuoyake flat 2-33388 (JP, B2)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】 コラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散された複合体を骨髄細胞の支持体として用い、動物細胞培養用液体培地中で前記骨髄細胞を所望とする骨系細胞に分化させる骨髄細胞の培養方法。 With 1. A composite calcium phosphate particles are dispersed with a chemical activity in the collagen gel as a support of bone marrow cells, differentiate the bone marrow cells in animal cell culture broth to the bone system cells to desired method for culturing bone marrow cells to.
  2. 【請求項2】 液体培地にアスコルビン酸を添加する請求項1記載の培養方法。 2. A method for culturing claim 1, wherein the addition of ascorbic acid in the liquid medium.
  3. 【請求項3】 骨髄細胞を、骨芽細胞、破骨細胞および軟骨芽細胞からなる群から選ばれる少なくとも1つの骨系細胞に分化させる請求項1または2記載の培養方法。 3. A bone marrow cells, osteoblasts, at least one method of culturing according to claim 1 or 2, wherein to differentiate into bone system cell selected from the group consisting of osteoclasts and chondroblasts.
  4. 【請求項4】 支持体として酵素可溶化I型コラーゲンとリン酸四カルシウムとの複合体を用い、液体培地としてα−MEM培地を用いて骨髄細胞を培養し、骨芽細胞に分化させる請求項3記載の培養方法。 Wherein a complex of enzyme-solubilized type I collagen and tetracalcium phosphate used as a support, using alpha-MEM medium as a liquid medium and cultured bone marrow cells, claim of differentiating into osteoblasts 3 culture methods described.
  5. 【請求項5】 支持体として、酵素可溶化I型コラーゲンとリン酸八カルシウムおよび/または非結晶質リン酸カルシウムとの複合体を用い、液体培地としてα−ME As 5. A support, using a complex of enzyme-solubilized type I collagen and octacalcium phosphate and / or amorphous calcium phosphate, alpha-ME as a liquid medium
    M培地を用いて骨髄細胞を培養し、破骨細胞に分化させる請求項3記載の培養方法。 Culturing the bone marrow cells using M medium, the culture method of claim 3, wherein for differentiating osteoclasts.
  6. 【請求項6】 支持体として酵素可溶化I型コラーゲンとα−リン酸三カルシウムとの複合体を用い、液体培地としてα−MEM培地を用いて骨髄細胞を培養し、骨芽細胞と破骨細胞に分化させる請求項3記載の培養方法。 6. The complex of the enzyme-solubilized type I collagen and α- tricalcium phosphate used as a support, using alpha-MEM medium as a liquid medium and cultured bone marrow cells, osteoblasts and osteoclast the method of culturing according to claim 3, wherein for differentiating into a cell.
  7. 【請求項7】 支持体として酸可溶化I型コラーゲンとα−リン酸三カルシウムとの複合体を用い、液体培地としてα−MEM培地を用いて骨髄細胞を培養し、軟骨芽細胞に分化させる請求項3記載の培養方法。 7. Using a complex of acid solubilized type I collagen and α- tricalcium phosphate as a support, using alpha-MEM medium as a liquid medium and cultured bone marrow cells to differentiate into chondroblasts the method of culturing according to claim 3, wherein.
  8. 【請求項8】 コラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散された複合体からなるゲル状支持体、この支持体に支持された骨髄細胞、および、前記支持体に含有された動物細胞培養用液体培地を備えた培養用混合物。 8. A gel-like support calcium phosphate particles with a chemically active in the collagen gel consists of dispersed complex, supported bone marrow cells to the support, and, animal cell culture contained in said support culture mixture having a use liquid media.
  9. 【請求項9】 コラーゲンがI型コラーゲンである請求項8記載の培養用混合物。 9. collagen culture mixture according to claim 8, wherein the type I collagen.
  10. 【請求項10】 リン酸カルシウムが、非結晶質リン酸カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウムおよびα−リン酸三カルシウムからなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項8または9記載の培養用混合物。 10. calcium phosphate, amorphous calcium phosphate, octacalcium phosphate, tetracalcium phosphate and α- at least one is a phosphorus acid is selected from the group consisting of tricalcium claim 8 or 9 culture mixture according .
  11. 【請求項11】 液体培地が合成培地である請求項8から10までのいずれかに記載の培養用混合物。 11. culture mixture according to any of claims 8 to 10 liquid medium is a synthetic medium.
  12. 【請求項12】 合成培地がα−MEM培地である請求項11記載の培養用混合物。 12. The method of claim 11 culture mixture according synthetic medium is alpha-MEM medium.
  13. 【請求項13】 液体培地がアスコルビン酸をも含む請求項8から12までのいずれかに記載の培養用混合物。 13. culture mixture according to any of the liquid medium from the claims 8 also containing ascorbic acid to 12.
  14. 【請求項14】 コラーゲンゲル中に化学活性を有するリン酸カルシウム粒子が分散された複合体からなるゲル状支持体、この支持体に支持され、骨髄細胞から分化した骨系細胞、および、前記支持体に含有された動物細胞培養用液体培地を有する、硬組織欠損部への移植用材料。 14. The gel-like support comprising a complex calcium phosphate particles are dispersed with a chemical activity in the collagen gel is supported on the support, bone system cells differentiated from bone marrow cells, and, to the support with a liquid medium for animal cell culture, which is contained, implantable material to the hard tissue defect.
  15. 【請求項15】 骨系細胞が、骨芽細胞、破骨細胞および軟骨芽細胞からなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項14記載の移植用材料。 15. Bone system cells, osteoblasts, transplantation material according to claim 14, wherein at least one is selected from the group consisting of osteoclasts and chondroblasts.
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