JP2869039B2 - 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 - Google Patents
高純度ヘパリナーゼの大規模精製法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】米国政府は、国立衛生研究所
の認可番号GM25810により、この発明の権利を有する。
の認可番号GM25810により、この発明の権利を有する。
【０００２】この発明は、Ｆ．ヘパリナム（F. heparin
um）からヘパリナーゼおよび他のエリミナーゼを精製す
る方法である。
um）からヘパリナーゼおよび他のエリミナーゼを精製す
る方法である。
【０００３】
【従来の技術】ヘパリナーゼは、ヘパリンの主要な繰り
返し単位：−＞４）−２−デオキシ−２−スルファミノ
−−Ｄ−グルコピラノース ６−スルフェート−（１−
＞４）−α−Ｌ−イドピラノシルロン酸 ２−スルフェ
ート−（１−＞ 中のα−グリコシド結合において、ヘ
パリンを切断するエリミナーゼである。ヘパリンは、血
液の凝固を阻害するために、インビトロおよびインビボ
のいずれにおいても、臨床的に用いられる。20,000まで
の広範囲の分子量を有し、その平均分子量が13,500のム
コ多糖類であるヘパリンは、血液中のトロンビンおよび
活性化Ｘ因子と他のセリンエステラーゼとを直接に阻害
することにより作用する。
返し単位：−＞４）−２−デオキシ−２−スルファミノ
−−Ｄ−グルコピラノース ６−スルフェート−（１−
＞４）−α−Ｌ−イドピラノシルロン酸 ２−スルフェ
ート−（１−＞ 中のα−グリコシド結合において、ヘ
パリンを切断するエリミナーゼである。ヘパリンは、血
液の凝固を阻害するために、インビトロおよびインビボ
のいずれにおいても、臨床的に用いられる。20,000まで
の広範囲の分子量を有し、その平均分子量が13,500のム
コ多糖類であるヘパリンは、血液中のトロンビンおよび
活性化Ｘ因子と他のセリンエステラーゼとを直接に阻害
することにより作用する。
【０００４】ヘパリンの抗凝血効果は、プロタミンで沈
澱させるか、あるいは、Howard Bernsteinらによる「固
定化種を含む体外リアクター」と題する米国特許出願第
044,245号（1987年５月22日付で出願）、および、Lisa
E. Freedらによる「懸濁した固定化種を含むバイオリア
クター」と題する米国特許出願第044,340号（1987年６
月６日付で出願）に記載されているように、固定化され
たヘパリナーゼを含むリアクターにより、臨床的に中和
される。ヘパリナーゼを固定化することにより、リアク
ター内を通過する血液によってヘパリナーゼが体内に浸
入することを防止している。
澱させるか、あるいは、Howard Bernsteinらによる「固
定化種を含む体外リアクター」と題する米国特許出願第
044,245号（1987年５月22日付で出願）、および、Lisa
E. Freedらによる「懸濁した固定化種を含むバイオリア
クター」と題する米国特許出願第044,340号（1987年６
月６日付で出願）に記載されているように、固定化され
たヘパリナーゼを含むリアクターにより、臨床的に中和
される。ヘパリナーゼを固定化することにより、リアク
ター内を通過する血液によってヘパリナーゼが体内に浸
入することを防止している。
【０００５】スルファターゼを含まないヘパリナーゼ
（触媒グレードのヘパリナーゼとも呼ばれる）は、酵素
分解によってヘパリンの抗凝血性を完全に取り除くこと
が要求される。Langerらの米国特許第4,341,869号に記
載されているように、ヘパリナーゼは、フラホバクテリ
ウムヘパリナム（Flavobacterium heparinum）のような
細菌によって産生される。微生物を増殖させ、細胞を溶
解し、破片を遠心分離によって取り除き、そして、細胞
抽出物を、ヒドロキシルアパタイト、すなわち３Ｃａ
3(ＰＯ4)2あるいはＣａ10(ＰＯ4)6(ＯＨ)2のカラムに通
す。このタンパクを、少しずつ、高い塩濃度でカラムか
ら溶離させると、ヒドロキシルアパタイトカラムは10倍
から100倍に酵素を濃縮することができる。ここで述べ
るように、0.01Ｍリン酸ナトリウムｐＨ6.8から0.10Ｍ
リン酸ナトリウム0.19Ｍ塩化ナトリウムｐＨ6.8までの
範囲内で塩化ナトリウム濃度が増加するリン酸塩緩衝液
を使って、ヘパリナーゼを少しずつ溶離させることによ
り、さらに高い収量の酵素が得られる。
（触媒グレードのヘパリナーゼとも呼ばれる）は、酵素
分解によってヘパリンの抗凝血性を完全に取り除くこと
が要求される。Langerらの米国特許第4,341,869号に記
載されているように、ヘパリナーゼは、フラホバクテリ
ウムヘパリナム（Flavobacterium heparinum）のような
細菌によって産生される。微生物を増殖させ、細胞を溶
解し、破片を遠心分離によって取り除き、そして、細胞
抽出物を、ヒドロキシルアパタイト、すなわち３Ｃａ
3(ＰＯ4)2あるいはＣａ10(ＰＯ4)6(ＯＨ)2のカラムに通
す。このタンパクを、少しずつ、高い塩濃度でカラムか
ら溶離させると、ヒドロキシルアパタイトカラムは10倍
から100倍に酵素を濃縮することができる。ここで述べ
るように、0.01Ｍリン酸ナトリウムｐＨ6.8から0.10Ｍ
リン酸ナトリウム0.19Ｍ塩化ナトリウムｐＨ6.8までの
範囲内で塩化ナトリウム濃度が増加するリン酸塩緩衝液
を使って、ヘパリナーゼを少しずつ溶離させることによ
り、さらに高い収量の酵素が得られる。
【０００６】Yangらによって、「フラボバクテリウムヘ
パリナムからのヘパリナーゼの精製および特性付け」J.
Biol. Chem. 260(3),1849-1857(1985）に述べられてい
るように、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
を、繰り返し行うゲル濾過クロマトグラフィーおよびク
ロマトフォーカシングと組み合わせることにより、この
精製法は非常に改善された。
パリナムからのヘパリナーゼの精製および特性付け」J.
Biol. Chem. 260(3),1849-1857(1985）に述べられてい
るように、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
を、繰り返し行うゲル濾過クロマトグラフィーおよびク
ロマトフォーカシングと組み合わせることにより、この
精製法は非常に改善された。
【０００７】精製されたヘパリナーゼは、タンパクであ
って、42,900±1000ダルトンの分子量を有し、ｐI値は
8.5である。
って、42,900±1000ダルトンの分子量を有し、ｐI値は
8.5である。
【０００８】これらの方法は、実験室レベルの試薬量を
調製したり、この酵素の特性付けを行ったりする際には
有用であるが、大規模な臨床上用途に必要とされる量お
よび純度で、ヘパリナーゼを調製するには、不適当であ
る。さらに、ここで概略を述べた精製方式を、大規模な
酵素回収に適用するのは困難である。
調製したり、この酵素の特性付けを行ったりする際には
有用であるが、大規模な臨床上用途に必要とされる量お
よび純度で、ヘパリナーゼを調製するには、不適当であ
る。さらに、ここで概略を述べた精製方式を、大規模な
酵素回収に適用するのは困難である。
【０００９】グラム陰性菌のペリプラズムからタンパク
を抽出するために使われてきた他の方法には、最初の工
程として浸透圧ショック処理がある。典型的には、これ
らの手順は、浸透圧を安定化させた媒体中における最初
の破壊と、続いて浸透圧を安定化させていない媒体中で
の選択的な放出とを包含する。これら媒体の組成（ｐ
Ｈ、保護剤）および使用される破壊方法（クロロホル
ム、リゾチーム、ＥＤＴＡ、音波処理）は、報告されて
いる特定の手順によって変化する。これらのうちのどれ
もまだ、触媒グレードのヘパリナーゼを精製することに
成功裏に適用されていない。
を抽出するために使われてきた他の方法には、最初の工
程として浸透圧ショック処理がある。典型的には、これ
らの手順は、浸透圧を安定化させた媒体中における最初
の破壊と、続いて浸透圧を安定化させていない媒体中で
の選択的な放出とを包含する。これら媒体の組成（ｐ
Ｈ、保護剤）および使用される破壊方法（クロロホル
ム、リゾチーム、ＥＤＴＡ、音波処理）は、報告されて
いる特定の手順によって変化する。これらのうちのどれ
もまだ、触媒グレードのヘパリナーゼを精製することに
成功裏に適用されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
ある目的は、産業上および臨床上の用途に使用するため
に多重の高純度ヘパリナーゼを調製する方法を提供する
ことにある。
ある目的は、産業上および臨床上の用途に使用するため
に多重の高純度ヘパリナーゼを調製する方法を提供する
ことにある。
【００１１】本発明の他の目的は、Ｆ．ヘパリナムから
他のエリミナーゼを単離する方法を提供することにあ
る。
他のエリミナーゼを単離する方法を提供することにあ
る。
【００１２】本発明のさらに他の目的は、多量の酵素的
に活性な精製ヘパリナーゼおよび他のエリミナーゼを提
供することにある。
に活性な精製ヘパリナーゼおよび他のエリミナーゼを提
供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】限外濾過によって濃縮さ
れたＦ．ヘパリナムの細胞を、浸透圧ショック法で処理
し、ペリプラズムから活性ヘパリナーゼを放出させる。
この好ましい実施態様においては、ＥＤＴＡを含むかあ
るいはＥＤＴＡを含まない、浸透圧を安定化させた媒体
（20％スクロース）に細胞をさらし、次に、浸透圧を安
定化させていない媒体（10ｍＭリン酸塩、ｐＨ6.0〜8.
6）中に細胞周辺物質をまず放出させ、続いて浸透圧を
安定化させていない第２の媒体（10ｍＭリン酸塩、150
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ6.0〜8.6）中にへパリナーゼ
および他のエリミナーゼ活性物質を放出させることによ
り、細胞外被の破壊を誘発する。この三段階法により、
75％活性までの収量で、５倍から10倍の初期精製が可能
となる。特に、従来から報告されている方法では、取り
除くことが最も困難なことがわかっている不純物が、こ
の浸透圧ショック処理の初めの二段階で取り除かれる。
れたＦ．ヘパリナムの細胞を、浸透圧ショック法で処理
し、ペリプラズムから活性ヘパリナーゼを放出させる。
この好ましい実施態様においては、ＥＤＴＡを含むかあ
るいはＥＤＴＡを含まない、浸透圧を安定化させた媒体
（20％スクロース）に細胞をさらし、次に、浸透圧を安
定化させていない媒体（10ｍＭリン酸塩、ｐＨ6.0〜8.
6）中に細胞周辺物質をまず放出させ、続いて浸透圧を
安定化させていない第２の媒体（10ｍＭリン酸塩、150
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ6.0〜8.6）中にへパリナーゼ
および他のエリミナーゼ活性物質を放出させることによ
り、細胞外被の破壊を誘発する。この三段階法により、
75％活性までの収量で、５倍から10倍の初期精製が可能
となる。特に、従来から報告されている方法では、取り
除くことが最も困難なことがわかっている不純物が、こ
の浸透圧ショック処理の初めの二段階で取り除かれる。
【００１４】透析濾過によってナトリウムイオンを取り
除いてから、この濃縮物を，陽イオン交換クロマトグラ
フィーによって、好ましくは、FPLC Mono Sカラムを使
って、分画する。ヘパリナーゼ活性は、２つのタンパク
すなわち、約42,000〜43,000ダルトンのタンパクおよび
65,000〜75,000ダルトンのタンパク中に存在する。全収
量は、典型的には25％であり、純度は200〜300倍に増加
する。
除いてから、この濃縮物を，陽イオン交換クロマトグラ
フィーによって、好ましくは、FPLC Mono Sカラムを使
って、分画する。ヘパリナーゼ活性は、２つのタンパク
すなわち、約42,000〜43,000ダルトンのタンパクおよび
65,000〜75,000ダルトンのタンパク中に存在する。全収
量は、典型的には25％であり、純度は200〜300倍に増加
する。
【００１５】浸透圧ショック処理の効果は，２つの放出
媒体のｐＨおよびイオン強度を変化させることより、向
上させることができる。さらに、マスフロ−イオン交換
装置を使用することにより、この方法をスケールアップ
することができる。
媒体のｐＨおよびイオン強度を変化させることより、向
上させることができる。さらに、マスフロ−イオン交換
装置を使用することにより、この方法をスケールアップ
することができる。
【００１６】遺伝子ライブラリーの構築方法、およびヘ
パリナーゼを産生する微生物のスクリーニング方法につ
いても、述べる。
パリナーゼを産生する微生物のスクリーニング方法につ
いても、述べる。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明による、バクテリアからの
大規模なヘパリナーゼ精製の好ましい方法は、フラボバ
クテリウムヘパリナムのような微生物あるいは遺伝子操
作されるかまたは変異してヘパリナーゼを生産する他の
グラム陰性の微生物を含む発酵反応器においてヘパリナ
ーゼを生産し、培養培地を除去して、限外濾過または遠
心分離のような方法によって細胞を濃縮し、この濃縮さ
れた細胞を三段階の浸透圧ショック法にかけ、細胞と非
特異的な細胞周辺物質とを分離し、分子量が10,000のカ
ットオフを有するメンブレンを使用して透析濾過するこ
とによって残りの細胞周辺物質を濃縮して、水および塩
類を除去し、10ｍＭのＮａＣｌ溶液を含む濃縮溶液（好
ましくは，陽イオン交換材料を用いた、タンパク分離用
の高速液体クロマトグラフィーカラム上で）のイオン交
換クロマトグラフィーによってヘパリナーゼを分離し、
そしてヘパリナーゼ活性を有するカラムから溶離させた
物質をゲル電気泳動またはゲル濾過によって更に精製す
ることである。
大規模なヘパリナーゼ精製の好ましい方法は、フラボバ
クテリウムヘパリナムのような微生物あるいは遺伝子操
作されるかまたは変異してヘパリナーゼを生産する他の
グラム陰性の微生物を含む発酵反応器においてヘパリナ
ーゼを生産し、培養培地を除去して、限外濾過または遠
心分離のような方法によって細胞を濃縮し、この濃縮さ
れた細胞を三段階の浸透圧ショック法にかけ、細胞と非
特異的な細胞周辺物質とを分離し、分子量が10,000のカ
ットオフを有するメンブレンを使用して透析濾過するこ
とによって残りの細胞周辺物質を濃縮して、水および塩
類を除去し、10ｍＭのＮａＣｌ溶液を含む濃縮溶液（好
ましくは，陽イオン交換材料を用いた、タンパク分離用
の高速液体クロマトグラフィーカラム上で）のイオン交
換クロマトグラフィーによってヘパリナーゼを分離し、
そしてヘパリナーゼ活性を有するカラムから溶離させた
物質をゲル電気泳動またはゲル濾過によって更に精製す
ることである。
【００１８】（選択的な細胞周辺タンパクの放出）Alfr
ed Linker, Veterans Administration Hospita1, Salt
Lake City, Utahから得たＦ．ヘパリナム細胞を、500ｍ
ｌの特定培地（３ｇ Ｋ2ＨＰＯ4／Ｌ、1.5ｇ ＫＨ2ＰＯ
4−Ｈ2Ｏ／Ｌ、0.5ｇ ＮａＣｌ／Ｌ、1.0ｇ ＮＨ4Ｃｌ
／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、0.2ｇ Ｌ‐ヒスチ
ジン／Ｌ、0.2ｇ Ｌ‐メチオニン／Ｌ、８ｇ グルコー
ス／Ｌ、１ｇ ヘパリン／Ｌ、および各10-4ｍＭのＮａ
ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ、ＣｏＣl2−６Ｈ2Ｏ、ＭｎＳＯ4−Ｈ
2Ｏ、ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏおよび
ＣａＣｌ2）を含む、2.8Ｌの撹拌フラスコにおいて30℃
で増殖させた。微生物は、単一炭素源として４ｇヘパリ
ン／Ｌを含む特定培地中に１％のディフコ（Difco）寒
天を含む寒天プレート上では２週間まで保存され、−80
℃の10％ＤＭＳＯ中では無期限に保存され得る。
ed Linker, Veterans Administration Hospita1, Salt
Lake City, Utahから得たＦ．ヘパリナム細胞を、500ｍ
ｌの特定培地（３ｇ Ｋ2ＨＰＯ4／Ｌ、1.5ｇ ＫＨ2ＰＯ
4−Ｈ2Ｏ／Ｌ、0.5ｇ ＮａＣｌ／Ｌ、1.0ｇ ＮＨ4Ｃｌ
／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、0.2ｇ Ｌ‐ヒスチ
ジン／Ｌ、0.2ｇ Ｌ‐メチオニン／Ｌ、８ｇ グルコー
ス／Ｌ、１ｇ ヘパリン／Ｌ、および各10-4ｍＭのＮａ
ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ、ＣｏＣl2−６Ｈ2Ｏ、ＭｎＳＯ4−Ｈ
2Ｏ、ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏおよび
ＣａＣｌ2）を含む、2.8Ｌの撹拌フラスコにおいて30℃
で増殖させた。微生物は、単一炭素源として４ｇヘパリ
ン／Ｌを含む特定培地中に１％のディフコ（Difco）寒
天を含む寒天プレート上では２週間まで保存され、−80
℃の10％ＤＭＳＯ中では無期限に保存され得る。
【００１９】ヘパリナーゼ活性は、Gallilherら、App
l． Environ. Microbiol. 41,360−365（1981）の手法
に従って、ヘパリンの存在下でアズールＡが青から赤に
異染性変化するのを観察することによって分析される。
吸光度の変化は、分析の線形中の620ｎｍにおいて測定
され、分析緩衝液（0.25Ｍの酢酸ナトリウム、0.0025Ｍ
の酢酸カルシウム、ｐＨ7.0）中の０から８ｍｇ／ｍｌ
のヘパリンの標準曲線と比較される。この分析による１
単位の活性は、１時間あたり、１ｍｇのヘパリンを分解
する酵素の量に相当する。βガラクトシダーゼ活性は、
Millerの方法、Experiments in Molecular Genetics, C
old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New Yorkによって測定される。タンパク濃度は、Bio−R
adタンパク分析法によって測定される。600ｎｍにおけ
る微生物の増殖は、細胞懸濁液の吸光度を測定すること
によってモニターされる。生存能力のある細胞の数は、
特定培地寒天プレート上において適切な希釈液を培養す
ることによって決定される。
l． Environ. Microbiol. 41,360−365（1981）の手法
に従って、ヘパリンの存在下でアズールＡが青から赤に
異染性変化するのを観察することによって分析される。
吸光度の変化は、分析の線形中の620ｎｍにおいて測定
され、分析緩衝液（0.25Ｍの酢酸ナトリウム、0.0025Ｍ
の酢酸カルシウム、ｐＨ7.0）中の０から８ｍｇ／ｍｌ
のヘパリンの標準曲線と比較される。この分析による１
単位の活性は、１時間あたり、１ｍｇのヘパリンを分解
する酵素の量に相当する。βガラクトシダーゼ活性は、
Millerの方法、Experiments in Molecular Genetics, C
old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New Yorkによって測定される。タンパク濃度は、Bio−R
adタンパク分析法によって測定される。600ｎｍにおけ
る微生物の増殖は、細胞懸濁液の吸光度を測定すること
によってモニターされる。生存能力のある細胞の数は、
特定培地寒天プレート上において適切な希釈液を培養す
ることによって決定される。
【００２０】浸透圧ショック法は、以下のとおりであ
る。まず、浸透圧を安定化させた媒体、例えば20％のシ
ョ糖、10ｍＭのリン酸ナトリウムを含む保護媒体（ｐＨ
7.0）に、細胞を懸濁する。この処理に続いて、２つの
浸透圧を安定化させていない（回収）媒体：１）10ｍＭ
のリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0（低イオン強度の緩衝化
溶液）および２）150ｍＭの塩化ナトリウムを含む10ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0（緩衝化塩溶液）に、
細胞を連続的に再懸濁する。まず、これらの細胞を採取
した後、Sorval RC-2B冷却遠心分離機にて、7000ｇで10
分問、遠心分離することによって、各溶液から細胞を取
り出す。特に、明記しなければ、すべての手法は、ｐＨ
7.0および４℃で、５×1010細胞／ｍｌの細胞濃度にお
いて実施される。浸透圧ショック法にかけない細胞部分
を、Branson W-350音波処理機（sonifier）を使用し
て、15分間、50％のパルスを印加、＃６）で音波処理
し、それを標準（100％）として使用する。浸透圧放出
溶液の上澄み液および音波処理を行った細胞は、酵素活
性およびタンパク含有量を測定する前に、10ｍＭのリン
酸塩、150ｍＭのＮａＣｌ中で透析される。
る。まず、浸透圧を安定化させた媒体、例えば20％のシ
ョ糖、10ｍＭのリン酸ナトリウムを含む保護媒体（ｐＨ
7.0）に、細胞を懸濁する。この処理に続いて、２つの
浸透圧を安定化させていない（回収）媒体：１）10ｍＭ
のリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0（低イオン強度の緩衝化
溶液）および２）150ｍＭの塩化ナトリウムを含む10ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0（緩衝化塩溶液）に、
細胞を連続的に再懸濁する。まず、これらの細胞を採取
した後、Sorval RC-2B冷却遠心分離機にて、7000ｇで10
分問、遠心分離することによって、各溶液から細胞を取
り出す。特に、明記しなければ、すべての手法は、ｐＨ
7.0および４℃で、５×1010細胞／ｍｌの細胞濃度にお
いて実施される。浸透圧ショック法にかけない細胞部分
を、Branson W-350音波処理機（sonifier）を使用し
て、15分間、50％のパルスを印加、＃６）で音波処理
し、それを標準（100％）として使用する。浸透圧放出
溶液の上澄み液および音波処理を行った細胞は、酵素活
性およびタンパク含有量を測定する前に、10ｍＭのリン
酸塩、150ｍＭのＮａＣｌ中で透析される。
【００２１】表１に示されるように、全細胞（音波処理
の標準）の比活性と比較して、放出酵素の比活性が高い
ことは、浸透圧を安定化させていない媒体中にヘパリナ
ーゼが優先的に放出されることを示す。破壊された細胞
を、まず低塩濃度の溶液で洗浄し、次いで高塩濃度の溶
液で洗浄すると、ヘパリナーゼが最もよく放出される。
更に、放出上澄み液中には、少量のβガラクトシダーゼ
活性しか検出されない。このことは、細胞質物質がこの
手法によってほとんど放出されないことを示す。浸透圧
を安定化させていない媒体に、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、リゾ
チーム、トルエンまたはクロロホルムを添加して、細胞
の破壊およびペリプラズムからの酵素放出を促進する
か、または細胞を冷凍および解凍することができる。音
波処理はまた、細胞周辺タンパクを選択的に放出させる
が、その制御が容易ではない。しかし、後者の添加物も
音波処理も、ショ糖を単独で使用する場合ほど有効では
ない。
の標準）の比活性と比較して、放出酵素の比活性が高い
ことは、浸透圧を安定化させていない媒体中にヘパリナ
ーゼが優先的に放出されることを示す。破壊された細胞
を、まず低塩濃度の溶液で洗浄し、次いで高塩濃度の溶
液で洗浄すると、ヘパリナーゼが最もよく放出される。
更に、放出上澄み液中には、少量のβガラクトシダーゼ
活性しか検出されない。このことは、細胞質物質がこの
手法によってほとんど放出されないことを示す。浸透圧
を安定化させていない媒体に、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、リゾ
チーム、トルエンまたはクロロホルムを添加して、細胞
の破壊およびペリプラズムからの酵素放出を促進する
か、または細胞を冷凍および解凍することができる。音
波処理はまた、細胞周辺タンパクを選択的に放出させる
が、その制御が容易ではない。しかし、後者の添加物も
音波処理も、ショ糖を単独で使用する場合ほど有効では
ない。
【００２２】
【表１】
【００２３】表２は、回収溶液のイオン強度に対する酵
素放出の依存性を示す。浸透圧を安定させた細胞を、２
つの等量なバッチに分割し、低塩濃度および高塩濃度の
溶液中にそれぞれ再懸濁した。最初の処理を行った後、
これらの細胞を、再度２つのバッチに分割し、２つの浸
透圧を安定化させていない溶液中にそれぞれ再懸濁し
た。上澄み液をすべて回収し、そのヘパリナーゼ活性お
よびタンパク含有量を分析した。結果は、３つのすべて
の溶液（すなわち、20％のショ糖溶液、低塩濃度の溶
液、高塩濃度の溶液）を、この順番で使用することの重
要性を示している。
素放出の依存性を示す。浸透圧を安定させた細胞を、２
つの等量なバッチに分割し、低塩濃度および高塩濃度の
溶液中にそれぞれ再懸濁した。最初の処理を行った後、
これらの細胞を、再度２つのバッチに分割し、２つの浸
透圧を安定化させていない溶液中にそれぞれ再懸濁し
た。上澄み液をすべて回収し、そのヘパリナーゼ活性お
よびタンパク含有量を分析した。結果は、３つのすべて
の溶液（すなわち、20％のショ糖溶液、低塩濃度の溶
液、高塩濃度の溶液）を、この順番で使用することの重
要性を示している。
【００２４】
【表２】
【００２５】表３は、三段階の浸透圧ショック法を使用
して、Ｆ．ヘパリナムからのヘパリナーゼの放出に及ぼ
す、ＥＤＴＡおよびｐＨの影響を示す。ＥＤＴＡの存在
または量によって、ヘパリナーゼの放出は変化しないよ
うである。しかし、低塩濃度の溶液に放出されるヘパリ
ナーゼの量は、ｐＨを6.0から8.7へ上昇させるに従って
増加する。低塩濃度または高塩濃度の画分を最大限に全
回収し得るのは、pH7.5の場合である。
して、Ｆ．ヘパリナムからのヘパリナーゼの放出に及ぼ
す、ＥＤＴＡおよびｐＨの影響を示す。ＥＤＴＡの存在
または量によって、ヘパリナーゼの放出は変化しないよ
うである。しかし、低塩濃度の溶液に放出されるヘパリ
ナーゼの量は、ｐＨを6.0から8.7へ上昇させるに従って
増加する。低塩濃度または高塩濃度の画分を最大限に全
回収し得るのは、pH7.5の場合である。
【００２６】
【表３】
【００２７】細胞の増殖段階は、回収の程度に影響を及
ぼす。最大の回収は、中期から後期における対数増殖期
に採取されたサンプルから得られる。Ｆ．ヘパリナムの
最大増殖率は、0.21-1である。放出されたヘパリナーゼ
の比活性は、対数増殖期を通じて増加するのに対して、
放出されたタンパクの全量は、比較的一定である。定常
増殖期におけるヘパリナーゼの回収の減少は、比活性の
減少というよりはむしろ、放出されたタンパクの量の減
少に関連するようである。
ぼす。最大の回収は、中期から後期における対数増殖期
に採取されたサンプルから得られる。Ｆ．ヘパリナムの
最大増殖率は、0.21-1である。放出されたヘパリナーゼ
の比活性は、対数増殖期を通じて増加するのに対して、
放出されたタンパクの全量は、比較的一定である。定常
増殖期におけるヘパリナーゼの回収の減少は、比活性の
減少というよりはむしろ、放出されたタンパクの量の減
少に関連するようである。
【００２８】一般に、各回収溶液中に放出されたタンパ
クの量は、ほぼ等しく、全細胞タンパクの５％から８％
である。ｐＨ7.0において、ヘパリナーゼは、全放出活
性の65％から80％を含む高塩濃度の溶液中に、優先的に
放出される。
クの量は、ほぼ等しく、全細胞タンパクの５％から８％
である。ｐＨ7.0において、ヘパリナーゼは、全放出活
性の65％から80％を含む高塩濃度の溶液中に、優先的に
放出される。
【００２９】これらの方法を使用すれば、三段階の浸透
圧ショック処理を使用したヘパリナーゼの最適回収の条
件が決定され得る。表１、２および３のデータに基づい
て、放出媒体の塩濃度を変化させることによって、ヘパ
リナーゼがＦ．ヘパリナムから選択的に放出され、同時
に他の細胞周辺成分から分離されるような、改善された
初期精製工程を計画した。
圧ショック処理を使用したヘパリナーゼの最適回収の条
件が決定され得る。表１、２および３のデータに基づい
て、放出媒体の塩濃度を変化させることによって、ヘパ
リナーゼがＦ．ヘパリナムから選択的に放出され、同時
に他の細胞周辺成分から分離されるような、改善された
初期精製工程を計画した。
【００３０】各回収溶液中のタンパク含有量が、ほぼ等
しく、全細胞タンパクの５％から８％であるのに対し
て、放出されたヘパリナーゼ活性のほぼ75％は、比活性
が典型的に10倍に増加した高塩濃度の回収画分中に見い
出される。浸透圧を安定させた細胞を直ちに高塩濃度溶
液にさらすと、良好なタンパクの放出が得られない。更
に、第３段階の工程を、低塩濃度の溶液による洗浄に代
えると、高塩濃度の溶液中に放出されたヘパリナーゼ活
性に匹敵するような活性が得られない。
しく、全細胞タンパクの５％から８％であるのに対し
て、放出されたヘパリナーゼ活性のほぼ75％は、比活性
が典型的に10倍に増加した高塩濃度の回収画分中に見い
出される。浸透圧を安定させた細胞を直ちに高塩濃度溶
液にさらすと、良好なタンパクの放出が得られない。更
に、第３段階の工程を、低塩濃度の溶液による洗浄に代
えると、高塩濃度の溶液中に放出されたヘパリナーゼ活
性に匹敵するような活性が得られない。
【００３１】（イオン交換クロマトグラフィーおよび電
気泳動）浸透圧放出によって、Ｆ．ヘパリナムから単離
されたヘパリナーゼは、陽イオン交換クロマトグラフィ
ーによって、好ましくはタンパク分離用の高速液体クロ
マトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置（Mono S, Pharmacia
Fine Chemicals, Piscataway, NJ）を使用して、更に精
製され得る。サンプルを透析し、10ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ7.0）中に入れ、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で、塩濃
度の直線勾配が0.0Ｍから0.3Ｍの範囲内のＮａＣｌで溶
離させる。
気泳動）浸透圧放出によって、Ｆ．ヘパリナムから単離
されたヘパリナーゼは、陽イオン交換クロマトグラフィ
ーによって、好ましくはタンパク分離用の高速液体クロ
マトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置（Mono S, Pharmacia
Fine Chemicals, Piscataway, NJ）を使用して、更に精
製され得る。サンプルを透析し、10ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ7.0）中に入れ、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で、塩濃
度の直線勾配が0.0Ｍから0.3Ｍの範囲内のＮａＣｌで溶
離させる。
【００３２】カラムにかけられる全タンパクの70％より
多くが、カラムに吸収されない。第１図に示されるよう
に、全タンパクの１％未満を含む２つの画分において、
活性が回収される。150ｍＭのＮａＣｌで溶離するタン
パクは、42,900ダルトンの分子量を有する。この画分の
比活性は、2000Ｕ／ｍｇから3000Ｕ／ｍｇタンパクの範
囲内である。第２の酵素は75ｍＭのＮａＣｌで溶離す
る。75ｍＭのＮａＣｌで溶離する物質のヘパリナーゼ活
性は、冷凍に敏感なようだが、90％より多くの活性は、
10ｍＭのリン酸塩、0.1ＭのＮａＣｌ、ｐＨ7.0、±20％
のグリセロール中で、-20℃にて７日間程度保持され
る。
多くが、カラムに吸収されない。第１図に示されるよう
に、全タンパクの１％未満を含む２つの画分において、
活性が回収される。150ｍＭのＮａＣｌで溶離するタン
パクは、42,900ダルトンの分子量を有する。この画分の
比活性は、2000Ｕ／ｍｇから3000Ｕ／ｍｇタンパクの範
囲内である。第２の酵素は75ｍＭのＮａＣｌで溶離す
る。75ｍＭのＮａＣｌで溶離する物質のヘパリナーゼ活
性は、冷凍に敏感なようだが、90％より多くの活性は、
10ｍＭのリン酸塩、0.1ＭのＮａＣｌ、ｐＨ7.0、±20％
のグリセロール中で、-20℃にて７日間程度保持され
る。
【００３３】酵素の調製は、Laemmli, Nature 227, 680
-685(1970)（12.5％のアクリルアミド分離ゲル）の手法
を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００またはＳＤＳ
−ＰＡＧＥのような分子ふるい上でゲル濃過することに
よって、更に精製および分析され得る。42,900ダルトン
のタンパクは３つの他の主要な夾雑物を含むが、これら
の夾雑物は電気泳動によって除去される。75ｍＭのＮａ
Ｃｌで溶離する物質は、ゲル濾過マトリックス（例え
ば、Superose l2, Pharmacia Fine Chemicals, Piscata
way, NJ）を備えたＦＰＬＣ装置を使用するクロマトグ
ラフィーによって更に精製され得る。サンプルを陽イオ
ン交換クロマトグラフィーから直接充填し、10ｍＭのリ
ン酸ナトリウム、0.1ＭのＮａＣｌ、ｐＨ7.0を用いて、
0.1ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離させる。ヘパリナーゼ活
性は、65,000ダルトンから75,000ダルトンの範囲内の分
子量を有する画分中に検出される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分析する際には、最大活性を有する物質は、還元
条件下でも、70,000の分子量を有する。
-685(1970)（12.5％のアクリルアミド分離ゲル）の手法
を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００またはＳＤＳ
−ＰＡＧＥのような分子ふるい上でゲル濃過することに
よって、更に精製および分析され得る。42,900ダルトン
のタンパクは３つの他の主要な夾雑物を含むが、これら
の夾雑物は電気泳動によって除去される。75ｍＭのＮａ
Ｃｌで溶離する物質は、ゲル濾過マトリックス（例え
ば、Superose l2, Pharmacia Fine Chemicals, Piscata
way, NJ）を備えたＦＰＬＣ装置を使用するクロマトグ
ラフィーによって更に精製され得る。サンプルを陽イオ
ン交換クロマトグラフィーから直接充填し、10ｍＭのリ
ン酸ナトリウム、0.1ＭのＮａＣｌ、ｐＨ7.0を用いて、
0.1ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離させる。ヘパリナーゼ活
性は、65,000ダルトンから75,000ダルトンの範囲内の分
子量を有する画分中に検出される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分析する際には、最大活性を有する物質は、還元
条件下でも、70,000の分子量を有する。
【００３４】（発酵による大規模な生産）２つの主要な
精製工程（すなわち、浸透圧による放出およびＦＰＬ
Ｃ）に次いで、２つの濃縮工程（すなわち、限外濾過お
よび透析濾過）を使用して、大量の物質の取扱いを容易
にする。２ｇ／Ｌ ＤＣＷまで増殖させ、0.1μのRomic
on中空繊維メンブレン装置を使用したマイクロ濾過によ
って１リットルに濃縮されたＦ．ヘパリナムの10リット
ル発酵についての結果を表４に示す。10,000ダルトンの
カットオフ限外濾過膜を使用して透析濾過することによ
って、高塩濃度溶液中に放出された物質を濃縮し、ＦＰ
ＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィーによって分画し
た。通常、20％から25％のヘパリナーゼ活性が回収され
るが、比活性は200倍から300倍に上昇する。
精製工程（すなわち、浸透圧による放出およびＦＰＬ
Ｃ）に次いで、２つの濃縮工程（すなわち、限外濾過お
よび透析濾過）を使用して、大量の物質の取扱いを容易
にする。２ｇ／Ｌ ＤＣＷまで増殖させ、0.1μのRomic
on中空繊維メンブレン装置を使用したマイクロ濾過によ
って１リットルに濃縮されたＦ．ヘパリナムの10リット
ル発酵についての結果を表４に示す。10,000ダルトンの
カットオフ限外濾過膜を使用して透析濾過することによ
って、高塩濃度溶液中に放出された物質を濃縮し、ＦＰ
ＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィーによって分画し
た。通常、20％から25％のヘパリナーゼ活性が回収され
るが、比活性は200倍から300倍に上昇する。
【００３５】
【表４】
【００３６】（抗体の生産およびクローニングのための
ハイブリダイゼーションプローブ）ゲル電気泳動または
ゲル濾過によって得られる精製されたヘパリナーゼタン
パクは、当業者に公知の方法を用いて抗体を生産するた
めに使用されることができる。例えば、抗体はフロイン
トの不完全アジュバントのような適当なアジュバント中
のタンパクをウサギまたはヤギなどの動物に投与するこ
とによって生成し得る。あるいは、モノクロナール抗体
は、抗体を誘導した後、マウスを免疫化して脾臓細胞を
ハイブリドーマ細胞に融合させることによって調製され
ることも可能である。
ハイブリダイゼーションプローブ）ゲル電気泳動または
ゲル濾過によって得られる精製されたヘパリナーゼタン
パクは、当業者に公知の方法を用いて抗体を生産するた
めに使用されることができる。例えば、抗体はフロイン
トの不完全アジュバントのような適当なアジュバント中
のタンパクをウサギまたはヤギなどの動物に投与するこ
とによって生成し得る。あるいは、モノクロナール抗体
は、抗体を誘導した後、マウスを免疫化して脾臓細胞を
ハイブリドーマ細胞に融合させることによって調製され
ることも可能である。
【００３７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥから溶離された材料は充
分な純度であるので、当業者が利用可能な方法および装
置を用いて配列決定することができる。いくつかの不一
致が見られ、最も顕著なものはグルタミン／グルタミン
酸、リジン及びメチオニンであるが、表５の結果はどち
らのタンパクに対しても類似した組成プロフィールを示
している。42,000ダルトンのタンパクの配列は、エドマ
ンド（Edmund）分解法の阻害によって決定されるよう
に、Ｎ末端において修飾される。ヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列は、ヘパリナーゼの生産を増大させることま
たは外部制御による生産で遺伝子操作する微生物におい
て、次いで使用するために、ハイブリダイゼーションプ
ローブの調製およびヘパリナーゼをコードする核酸配列
を得る他の手段において使用されることができる。
分な純度であるので、当業者が利用可能な方法および装
置を用いて配列決定することができる。いくつかの不一
致が見られ、最も顕著なものはグルタミン／グルタミン
酸、リジン及びメチオニンであるが、表５の結果はどち
らのタンパクに対しても類似した組成プロフィールを示
している。42,000ダルトンのタンパクの配列は、エドマ
ンド（Edmund）分解法の阻害によって決定されるよう
に、Ｎ末端において修飾される。ヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列は、ヘパリナーゼの生産を増大させることま
たは外部制御による生産で遺伝子操作する微生物におい
て、次いで使用するために、ハイブリダイゼーションプ
ローブの調製およびヘパリナーゼをコードする核酸配列
を得る他の手段において使用されることができる。
【００３８】
【表５】
【００３９】（ヘパリナーゼ遺伝子についての発現ライ
ブラリーのスクリーニング方法）遺伝子操作された大量
の微生物を、ヘパリナーゼ生産についてスクリーニング
するための分析法が開発されている。ヘパリナーゼに対
する抗体を使用して、以前にスクリーニングを試みた
が、いくつかのその他のＦ．ヘパリナムタンパクとの広
範囲な交差反応により成功しなかった。該分析法および
スクリーニング方法は、42,000ダルトンのヘパリナーゼ
またはヘパリナーゼ活性を有する65,000−75,000ダルト
ンのタンパクの遺伝子を単離し、そして特性決定するの
に使用され得る。
ブラリーのスクリーニング方法）遺伝子操作された大量
の微生物を、ヘパリナーゼ生産についてスクリーニング
するための分析法が開発されている。ヘパリナーゼに対
する抗体を使用して、以前にスクリーニングを試みた
が、いくつかのその他のＦ．ヘパリナムタンパクとの広
範囲な交差反応により成功しなかった。該分析法および
スクリーニング方法は、42,000ダルトンのヘパリナーゼ
またはヘパリナーゼ活性を有する65,000−75,000ダルト
ンのタンパクの遺伝子を単離し、そして特性決定するの
に使用され得る。
【００４０】寒天プレート分析を、硫酸プロタミンとの
静電気結合による、ヒト血液からのヘパリンの沈澱に基
づいて行った。0.25Ｍの酢酸ナトリウム、0.0025ＭのＣ
ａＣｌ2、１リットル当り1.0ｇのブタ腸内粘膜由来のヘ
パリン（Hepar Industries,Franklin, 0H）、および1.5
％のアガロース（ＢＲＬ）、ｐＨ7.0からなるヘパリン
分析プレートを準備する。ヘパリナーゼの生産につい
て、スクリーニングされるべき細胞を、このプレートに
接種する。上記の方法を使用して、標準としてヘパリナ
ーゼを単離し、この単離したものを、10ｍＭリン酸ナト
リウム、150ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ7.0、10μｌ中に、0.
0、0.01、0.10および1.00Ｕの様々な量を添加し、これ
をプレートに加え、次いでこのプレートを37℃で１時間
インキュベートする。このプレートの表面に、２％の硫
酸プロタミン（salmon, Sigma Chemical Co., St. Loui
s, M0）溶液を注ぐ。１時間から２時間の間に、白い沈
澱物が形成される。ただし、ヘパリナーゼの増大量が加
えられるか、あるいはバクテリアのコロニーがヘパリナ
ーゼを生産しつつある領域においては、強度が増大する
クリアゾーンが残存する。例えば、クリアゾーンは、１
リットル当り1.0ｇのヘパリンを含むＬＢ寒天プレート
上に増殖したＦ．ヘパリナムの周囲に形成されたが、同
一のプレート上に増殖したE. coli JM83の周囲には形成
されなかった。
静電気結合による、ヒト血液からのヘパリンの沈澱に基
づいて行った。0.25Ｍの酢酸ナトリウム、0.0025ＭのＣ
ａＣｌ2、１リットル当り1.0ｇのブタ腸内粘膜由来のヘ
パリン（Hepar Industries,Franklin, 0H）、および1.5
％のアガロース（ＢＲＬ）、ｐＨ7.0からなるヘパリン
分析プレートを準備する。ヘパリナーゼの生産につい
て、スクリーニングされるべき細胞を、このプレートに
接種する。上記の方法を使用して、標準としてヘパリナ
ーゼを単離し、この単離したものを、10ｍＭリン酸ナト
リウム、150ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ7.0、10μｌ中に、0.
0、0.01、0.10および1.00Ｕの様々な量を添加し、これ
をプレートに加え、次いでこのプレートを37℃で１時間
インキュベートする。このプレートの表面に、２％の硫
酸プロタミン（salmon, Sigma Chemical Co., St. Loui
s, M0）溶液を注ぐ。１時間から２時間の間に、白い沈
澱物が形成される。ただし、ヘパリナーゼの増大量が加
えられるか、あるいはバクテリアのコロニーがヘパリナ
ーゼを生産しつつある領域においては、強度が増大する
クリアゾーンが残存する。例えば、クリアゾーンは、１
リットル当り1.0ｇのヘパリンを含むＬＢ寒天プレート
上に増殖したＦ．ヘパリナムの周囲に形成されたが、同
一のプレート上に増殖したE. coli JM83の周囲には形成
されなかった。
【００４１】Ｆ．ヘパリナムの構成的生産菌株の検出に
は、ヘパリンを含まない培地において微生物を増殖させ
る必要がある。１ｍＭのＭｇＳＯ4を含む最小培地（抑
制条件）において、Ｆ．ヘパリナムを増殖させ、これ
を、２つの最小培地寒天プレート（その一方には1.0ｇ
／ｌのヘパリン（誘発条件）が補給されている）上にプ
レートするという分析法が開発された。このプレートを
30℃で36時間インキュベートし、コロニーをニトロセル
ロース（ＮＣ）紙に移す。Ｆ．ヘパリナムコロニーは、
ＮＣ紙に付着し、クロロホルムの蒸気に20分間さらすこ
とによって溶菌する。次いで、ＮＣ紙をヘパリナーゼ分
析プレート（上述）上に重ね、37℃で１時間インキュベ
ートする。ＮＣ紙を捨て、２％の硫酸プロタミンでプレ
ートを発色させる。クリアゾーンが、誘導条件（ヘパリ
ン添加プレート）の下で増殖した細胞に対応するプレー
ト上に現れるが、硫酸塩抑制条件の下で増殖した細胞に
対応するプレート上には、ゾーンは検出され得ない。
は、ヘパリンを含まない培地において微生物を増殖させ
る必要がある。１ｍＭのＭｇＳＯ4を含む最小培地（抑
制条件）において、Ｆ．ヘパリナムを増殖させ、これ
を、２つの最小培地寒天プレート（その一方には1.0ｇ
／ｌのヘパリン（誘発条件）が補給されている）上にプ
レートするという分析法が開発された。このプレートを
30℃で36時間インキュベートし、コロニーをニトロセル
ロース（ＮＣ）紙に移す。Ｆ．ヘパリナムコロニーは、
ＮＣ紙に付着し、クロロホルムの蒸気に20分間さらすこ
とによって溶菌する。次いで、ＮＣ紙をヘパリナーゼ分
析プレート（上述）上に重ね、37℃で１時間インキュベ
ートする。ＮＣ紙を捨て、２％の硫酸プロタミンでプレ
ートを発色させる。クリアゾーンが、誘導条件（ヘパリ
ン添加プレート）の下で増殖した細胞に対応するプレー
ト上に現れるが、硫酸塩抑制条件の下で増殖した細胞に
対応するプレート上には、ゾーンは検出され得ない。
【００４２】プレート分析は、ヘパリナーゼ活性を検出
するのに十分であり、他のヘパリン異化酵素の存在を必
要としない。この特性は、以前に報告された方法に対し
て改良されており、従って、クローン化されたヘパリナ
ーゼ遺伝子に対するE. coliの発現遺伝子のバンクをス
クリーニングするのに有用であり得る。更に、ＮＣ紙を
使用して、抑制および誘導条件の下で増殖させたＦ．ヘ
パリナムを区別する能力は、構成的変異体を同定するこ
の方法の有用性を高める。
するのに十分であり、他のヘパリン異化酵素の存在を必
要としない。この特性は、以前に報告された方法に対し
て改良されており、従って、クローン化されたヘパリナ
ーゼ遺伝子に対するE. coliの発現遺伝子のバンクをス
クリーニングするのに有用であり得る。更に、ＮＣ紙を
使用して、抑制および誘導条件の下で増殖させたＦ．ヘ
パリナムを区別する能力は、構成的変異体を同定するこ
の方法の有用性を高める。
【００４３】ヘパリン存在下における、アズールＡ（Ａ
ｚｕｒｅ Ａ）の青から赤への異染性の変化に基づくヘ
パリナーゼ分析を、マイクロ培養物の分析の開発に使用
して、ヘパリナーゼを生産する細胞、特に、遺伝子操作
されたE. coliのような、通常はヘパリナーゼを生産し
ない細胞を同定した。マイクロ培養物分析に、アズール
Ａを使用するという以前行われた試みは、背景の影響、
恐らくは、媒体成分のために、妨害され、検出され得な
いヘパリンを有するサンプルと有さないサンプルにおい
て、色の相違を生じた。0.02ｇ／ｌヘパリンおよび種々
の量のＮａＣｌを含むＢブロスを96穴マイクロ培養プレ
ートに加え、次いで各ウェルに等しい容量で0.04ｇのア
ズールＡ／ｌを加え、Titertek Multiscanプレートリー
ダーを使用して、605ｎｍで吸光度を測定することによ
って、背景の影響の原因となる成分として、塩化ナトリ
ウムを同定した。ＮａＣｌの濃度を１ｇ／ｌ未満に保つ
ことによって、背景の影響が減少する。
ｚｕｒｅ Ａ）の青から赤への異染性の変化に基づくヘ
パリナーゼ分析を、マイクロ培養物の分析の開発に使用
して、ヘパリナーゼを生産する細胞、特に、遺伝子操作
されたE. coliのような、通常はヘパリナーゼを生産し
ない細胞を同定した。マイクロ培養物分析に、アズール
Ａを使用するという以前行われた試みは、背景の影響、
恐らくは、媒体成分のために、妨害され、検出され得な
いヘパリンを有するサンプルと有さないサンプルにおい
て、色の相違を生じた。0.02ｇ／ｌヘパリンおよび種々
の量のＮａＣｌを含むＢブロスを96穴マイクロ培養プレ
ートに加え、次いで各ウェルに等しい容量で0.04ｇのア
ズールＡ／ｌを加え、Titertek Multiscanプレートリー
ダーを使用して、605ｎｍで吸光度を測定することによ
って、背景の影響の原因となる成分として、塩化ナトリ
ウムを同定した。ＮａＣｌの濃度を１ｇ／ｌ未満に保つ
ことによって、背景の影響が減少する。
【００４４】分析は以下のとおりである。10ｇ／ｌのバ
クトトリプトン、1.0ｇ／ｌのＮａＣｌ、0.02ｇ／ｌの
ヘパリンを含み、メチオン、プロリン、ヒスチジンおよ
びチアミンを補給した改変Ｂブロスを濾過滅菌し、マイ
クロ培養ウェル（ウェル当り150μｌ）に加える。ウェ
ルのすべての列は、無接種状態のままとするか、E. col
i JM83を接種するか、またはＦ．ヘパリナムを接種す
る。１つの列は、ヘパリンを含有しない改変Ｂブロスを
含む。プレートを、30℃で36時間インキュベートし、次
いで冷凍および解凍する。0.04ｍｇのアズールＡを１ｍ
ｌあたり150μｌの割合で各ウェルに加え、605ｎｍで吸
光度を測定する前に、解凍したプレートを37℃で３時間
インキュベートする。更に、異なるウェルのセットつま
り、無接種状態のもの、E.coli JM83培養物およびＦ．
ヘパリナム培養物によって、色が異なることが、単純な
肉眼による観察で検出され得る。
クトトリプトン、1.0ｇ／ｌのＮａＣｌ、0.02ｇ／ｌの
ヘパリンを含み、メチオン、プロリン、ヒスチジンおよ
びチアミンを補給した改変Ｂブロスを濾過滅菌し、マイ
クロ培養ウェル（ウェル当り150μｌ）に加える。ウェ
ルのすべての列は、無接種状態のままとするか、E. col
i JM83を接種するか、またはＦ．ヘパリナムを接種す
る。１つの列は、ヘパリンを含有しない改変Ｂブロスを
含む。プレートを、30℃で36時間インキュベートし、次
いで冷凍および解凍する。0.04ｍｇのアズールＡを１ｍ
ｌあたり150μｌの割合で各ウェルに加え、605ｎｍで吸
光度を測定する前に、解凍したプレートを37℃で３時間
インキュベートする。更に、異なるウェルのセットつま
り、無接種状態のもの、E.coli JM83培養物およびＦ．
ヘパリナム培養物によって、色が異なることが、単純な
肉眼による観察で検出され得る。
【００４５】（ヘパリナーゼ遺伝子についての、発現ラ
イブラリーのスクリーニング）プラスミド発現ベクター
pUC18を使用して、Ｆ．ヘパリナム染色体遺伝子バンク
を、E. coli中に構築した。BamH1リンカーの添加および
pUC18の脱リン酸化されたBamH1部位へ連結の前に、Ｆ．
ヘパリナム染色体ＤＮＡを、軽く音波処理した。染色体
ＤＮＡ挿入物の平均サイズが６kbpである、50,000個の
独立形質転換体を単離した。この構築において、音波処
理されたＤＮＡを使用することにより、潜在的に構造遺
伝子内に位置する特異的部位を開裂させる制限酵素消化
によって得られたものよりも、形成された断片のランダ
ム性が高くなる。従って、このpUC18遺伝子バンクは、
検出のための活性タンパクの発現に依存するスクリーニ
ング技術と共に、使用されるのにより適切である。上記
の分析技術は、両方とも、この遺伝子バンクからの候補
をスクリーニングするのに使用されている。
イブラリーのスクリーニング）プラスミド発現ベクター
pUC18を使用して、Ｆ．ヘパリナム染色体遺伝子バンク
を、E. coli中に構築した。BamH1リンカーの添加および
pUC18の脱リン酸化されたBamH1部位へ連結の前に、Ｆ．
ヘパリナム染色体ＤＮＡを、軽く音波処理した。染色体
ＤＮＡ挿入物の平均サイズが６kbpである、50,000個の
独立形質転換体を単離した。この構築において、音波処
理されたＤＮＡを使用することにより、潜在的に構造遺
伝子内に位置する特異的部位を開裂させる制限酵素消化
によって得られたものよりも、形成された断片のランダ
ム性が高くなる。従って、このpUC18遺伝子バンクは、
検出のための活性タンパクの発現に依存するスクリーニ
ング技術と共に、使用されるのにより適切である。上記
の分析技術は、両方とも、この遺伝子バンクからの候補
をスクリーニングするのに使用されている。
【００４６】十分に純粋なヘパリナーゼの調製物を得る
際につきあたる問題は、E. coliのような微生物におけ
るヘパリナーゼ遺伝子の発現によって解決され得た。E.
coliは、Ｆ．ヘパリナム中に存在するサルファター
ゼ、グリクロニダーゼ等のバックグラウンド汚染酵素を
含まない、生合成のための環境を提供し、血液の脱ヘパ
リン化に必要な、触媒グレードのヘパリナーゼの精製工
程を非常に容易にする。更に、Ｆ．ヘパリナムの発酵に
よって示されるものよりも、組換え系における生成物の
力価の増加が期待され得た。生産工程全体における改善
は、工業規模での生産工程の経済的な実現に必要であ
る。基本的な分析によれば、経済的損益分岐点は、発酵
ブロス１リットル当り１×106Ｕの純粋酵素の生産レベ
ルであることを示唆している。本発明の方法を使用する
と、１リットル当り１×104Ｕの純粋酵素がＦ．ヘパリ
ナム発酵物から得られ、これは20％の収率である。
際につきあたる問題は、E. coliのような微生物におけ
るヘパリナーゼ遺伝子の発現によって解決され得た。E.
coliは、Ｆ．ヘパリナム中に存在するサルファター
ゼ、グリクロニダーゼ等のバックグラウンド汚染酵素を
含まない、生合成のための環境を提供し、血液の脱ヘパ
リン化に必要な、触媒グレードのヘパリナーゼの精製工
程を非常に容易にする。更に、Ｆ．ヘパリナムの発酵に
よって示されるものよりも、組換え系における生成物の
力価の増加が期待され得た。生産工程全体における改善
は、工業規模での生産工程の経済的な実現に必要であ
る。基本的な分析によれば、経済的損益分岐点は、発酵
ブロス１リットル当り１×106Ｕの純粋酵素の生産レベ
ルであることを示唆している。本発明の方法を使用する
と、１リットル当り１×104Ｕの純粋酵素がＦ．ヘパリ
ナム発酵物から得られ、これは20％の収率である。
【００４７】本発明は、特定の実施態様を参照して説明
されている。これらの方法に対する変形および改変は、
本発明の上記の詳細な説明から当該技術者に自明であ
る。このような改変および変形は、添付のクレームの範
囲内にある。
されている。これらの方法に対する変形および改変は、
本発明の上記の詳細な説明から当該技術者に自明であ
る。このような改変および変形は、添付のクレームの範
囲内にある。
【００４８】
【発明の効果】本願発明により、約65,000〜75,000の分
子量を有し、ヘパリン分解活性を有する新規なヘパリナ
ーゼが提供される。
子量を有し、ヘパリン分解活性を有する新規なヘパリナ
ーゼが提供される。
【図１】 三段階の浸透圧ショック法によって放出さ
せ、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｓカラムを使った陽イオン交換
クロマトグラフィーによって分画し、０〜0.3Ｍ ＮａＣ
ｌの勾配で溶離させた物質の活性クロマトグラムである
（１ｍｌの画分を溶離勾配中から採集し、アズール（Ａ
ｚｕｒｅ）Ａ染料を使って、ヘパリナーゼ活性について
分析した）。
せ、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｓカラムを使った陽イオン交換
クロマトグラフィーによって分画し、０〜0.3Ｍ ＮａＣ
ｌの勾配で溶離させた物質の活性クロマトグラムである
（１ｍｌの画分を溶離勾配中から採集し、アズール（Ａ
ｚｕｒｅ）Ａ染料を使って、ヘパリナーゼ活性について
分析した）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:20） (73)特許権者 596096696 77 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ａｖ ｅｎｕｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ 02139 ＵＳＡ (72)発明者 チャールズ エル． クーニィ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02146，ブルックリン，チェスナット プレイス 35
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の工程によりグラム陰性細菌から単
離された、ヘパリナーゼ： 浸透圧を安定化させた媒体中で，グラム陰性細菌の外被
を破壊する工程； 該細菌を，イオン強度が実質的に１０ｍＭのリン酸塩に
等しく、ｐＨが６．０と８．６との間に調整された緩衝
液にさらすことにより、破壊された細菌のペリプラズム
から非へパリナーゼタンパクを放出させる工程；および 該低イオン強度で洗浄した細菌を、イオン強度が実質的
に０．１５Ｍの塩化ナトリウムに等しく、そしてｐＨが
６．０と８．６との間に調整された緩衝化塩溶液にさら
すことによって，ヘパリナーゼを該破壊された細菌から
放出させる工程； ここで，該ヘパリナーゼは以下の特性： （１）ゲルクロマトグラフィーによる分子量が、６５，
０００および７５，０００の間であり； （２）還元もしくは非還元条件下においてＳＤＳの存在
下にてポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が
約７０，０００である；および （３）ヘパリン分解活性を有する。 - 【請求項２】 前記ヘパリナーゼが以下のアミノ酸組成
を有する、請求項１に記載のヘパリナーゼ。 【化１】 - 【請求項３】 前記浸透圧を安定化させた媒体が２０％
のショ糖を含有する、請求項１に記載のヘパリナーゼ。 - 【請求項４】 前記放出溶液が約６．０および８．６の
ｐＨに調整されたリン酸塩含有溶液である、請求項１に
記載のヘパリナーゼ。 - 【請求項５】 前記第１の放出溶液が、約７．０および
７．５の間のｐＨに調整された１０ｍＭリン酸塩であ
り、前記第２の放出溶液が、７．０および７．５の間の
ｐＨに調整された０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸
緩衝液である、請求項４に記載のヘパリナーゼ。 - 【請求項６】 前記第２の溶液中に放出される物質が、
さらに、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製さ
れる、請求項１に記載のヘパリナーゼ。 - 【請求項７】 請求項６に記載の約６５，０００から７
５，０００の分子量を有するヘパリナーゼに対する抗
体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20323588A | 1988-06-06 | 1988-06-06 | |
| US203,235 | 1988-06-06 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1506606A Division JP2603349B2 (ja) | 1988-06-06 | 1989-06-02 | 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09149788A JPH09149788A (ja) | 1997-06-10 |
| JP2869039B2 true JP2869039B2 (ja) | 1999-03-10 |
Family
ID=22753090
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1506606A Expired - Lifetime JP2603349B2 (ja) | 1988-06-06 | 1989-06-02 | 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 |
| JP8164991A Expired - Lifetime JP2869039B2 (ja) | 1988-06-06 | 1996-06-25 | 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1506606A Expired - Lifetime JP2603349B2 (ja) | 1988-06-06 | 1989-06-02 | 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0420894B1 (ja) |
| JP (2) | JP2603349B2 (ja) |
| AT (1) | ATE113991T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341079C (ja) |
| DE (1) | DE68919360T2 (ja) |
| WO (1) | WO1989012692A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714376A (en) * | 1991-10-23 | 1998-02-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase gene from flavobacterium heparinum |
| US5389539A (en) * | 1992-11-30 | 1995-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Purification of heparinase I, II, and III from Flavobacterium heparinum |
| DE4429660B4 (de) | 1994-08-20 | 2004-02-12 | Dade Behring Marburg Gmbh | Zusatzmittel für diagnostische Tests zur Bestimmung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes, Verfahren zur Reduzierung der Beeinflussung von diagnostischen Tests durch Heparin und Verwendung von Metallsalzen zu diesen Zwecken |
| US20060173167A1 (en) * | 2003-08-13 | 2006-08-03 | Gunter Stempfer | Process for the purification of recombinant polypeptides |
| KR101484337B1 (ko) * | 2007-01-12 | 2015-01-19 | 피페넥스 인크. | 세포에 삼투압 쇼크를 가하기 위한 장치 및 방법 |
| WO2018113775A1 (zh) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 | 产肝素酶的施氏假单胞菌菌株及从其衍生的肝素酶 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54107584A (en) * | 1978-02-10 | 1979-08-23 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Preparation of pure heparinase |
| US4341869A (en) * | 1980-08-25 | 1982-07-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for producing heparinase |
-
1989
- 1989-06-02 JP JP1506606A patent/JP2603349B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 DE DE68919360T patent/DE68919360T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 EP EP89907019A patent/EP0420894B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 AT AT89907019T patent/ATE113991T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 WO PCT/US1989/002434 patent/WO1989012692A1/en active IP Right Grant
- 1989-06-06 CA CA000601943A patent/CA1341079C/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-25 JP JP8164991A patent/JP2869039B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0420894A4 (en) | 1992-03-18 |
| WO1989012692A1 (en) | 1989-12-28 |
| DE68919360D1 (de) | 1994-12-15 |
| CA1341079C (en) | 2000-08-08 |
| DE68919360T2 (de) | 1995-05-18 |
| JP2603349B2 (ja) | 1997-04-23 |
| EP0420894A1 (en) | 1991-04-10 |
| JPH09149788A (ja) | 1997-06-10 |
| JPH03505815A (ja) | 1991-12-19 |
| EP0420894B1 (en) | 1994-11-09 |
| ATE113991T1 (de) | 1994-11-15 |
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