JP2727625B2 - Detection of Nucleic Acids - Google Patents

Detection of Nucleic Acids


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【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 この発明は、核酸の検出法に関する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (i) relates to this invention is directed to a method for detecting nucleic acids. さらに詳しくは、目的DNAの検出を簡便に行うことができ、例えば生体内に存在しうる病因性遺伝子の検出や遺伝子学的研究等に有用な検出法に関する。 More specifically, it is possible to easily perform the detection of the objective DNA, such as on the usefulness detection method in the detection and genetic studies such as the pathogenic genes that may be present in vivo.

(ロ)従来の技術 特定のDNAの検出のために、目的DNAと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを利用し、これに蛍光物質、放射性同位体、酵素等による標識化を行ったいわゆるオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法が知られている。 (B) for the detection of prior art specific DNA, utilizing the oligonucleotide having a base sequence complementary to the objective DNA, which the fluorescent substance, the so-called oligo Been radioisotope, labeling with an enzyme such as a method of using a nucleotide probe are known.

かかる従来のDNAの検出法は、基本的に、検体や細胞破砕液等のDNA含有試料をアルカリ処理や熱処理に付して目的DNAを一本鎖DNAに変性する工程、この一本鎖DNA Such detection methods conventional DNA, basically, analyte or steps are denoted by the DNA containing sample cell lysate or the like alkali treatment or heat treatment to denature the target DNA into single-stranded DNA, single-stranded DNA
を、ナイロンやニトロセルロースメンブラン等の支持体に固定化する工程、固定化された一本鎖DNAに上記したオリゴヌクレオチドプローブを作用させてハイブリダイゼーションを行う工程、及びハイブリダイゼーション後のメンブランを洗浄した後、固定化DNAの標識部位の蛍光強度、放射活性、酸素活性等に基づいてDNAを検出する工程から構成される。 And immobilizing on a support such as a nylon or nitrocellulose membrane, and by applying the oligonucleotide probes described above to single-stranded DNA which is immobilized cleaning step of performing hybridization, and the membrane after hybridization after, the fluorescence intensity of the labeled site of the immobilized DNA, radioactivity, and a step of detecting a DNA based on oxygen activity and the like.

そして最近、微量の目的DNAの高感度検出手法として、上記した固定化工程の前に、目的DNAの塩基配列の一部と相補的な塩基配列を有する短鎖(通常10〜30ヌクレオチド)のオリゴヌクレオチドからなるDNAプライマーを結合させ、これにポリメラーゼの存在下でdATP、dG And recently, as a highly sensitive method of detecting target DNA traces, prior to the immobilization step described above, a short chain having a portion complementary to the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the target DNA (usually 10-30 nucleotides) oligo to bind the DNA primer consisting of nucleotides, dATP in the presence of a polymerase to this, dG
TP、dCTP、dTTPのようなヌクレオチド試薬を作用させることにより目的DNAを複製し、これを必要に応じて繰り返すことで目的DNAを増幅し、増幅された目的DNAについて再び一本鎖に変性して上記検出操作に付す方法も提案されており、いわゆるPCR(polymerase chain reactio TP, dCTP, replicating DNA of interest by the action of nucleotide reagents such as dTTP, which amplifies the target DNA to a be repeated as necessary, for the amplified target DNA was denatured into single strands again a method of subjecting the aforementioned detection operation have been proposed, a so-called PCR (polymerase chain reactio
n)法によるDNA検出法として知られている。 It is known as DNA detection method n) method.

(ハ)発明が解決しようとする課題 しかしながら、いずれにせよ上記従来の検出法においては、支持体に一本鎖DNAを固定する際に、熱処理や紫外線照射処理を行う必要があり、専用の装置が必要になると共に、取扱いが煩雑で時間が掛かる不都合があった。 (C) SUMMARY OF THE INVENTION However, in any case the conventional detection method, when fixing the single-stranded DNA to a support, it is necessary to perform a heat treatment or ultraviolet irradiation treatment, a dedicated device together is required, handling there has been a complicated and time-consuming inconvenience. さらに、固定化後に、ハイブリダイゼーションが必要になるため、固定化DNAを至適温度に保持する必要があり、上記と同様に専用の装置が必要であると共に、取扱いが煩雑であった。 Furthermore, after immobilization, because hybridization is needed, it is necessary to hold the immobilized DNA on the optimum temperature, the and with requires a dedicated apparatus as well, the handling is complicated.

この発明は、かかる状況下なされたものであり、目的 The present invention has been made under such circumstances, the purpose
DNAを簡便に検出でき、ことにバイブリダイゼーションや従来のごとき支持体への固定化処理を行うことなくDN DNA can easily detect, DN without particular performing immobilization process to by hybridization or conventional such support
A検出を行うことができる検出法を提供しようとするものである。 It is intended to provide a detection method which can perform A detection.

(ニ)課題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、(a)目的DNAを一本鎖D (D) According challenges means thus this invention to solve, (a) a single-stranded D DNA of interest
NAに変性する工程、(b)上記一本鎖DNAに、目的DNAの塩基配列の一部と相補的な塩基配列を有する短鎖のオリゴヌクレオチドからなりかつジスルフィド結合を介して Step of denatured NA, in (b) above single-stranded DNA, made short oligonucleotide having a portion complementary to the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the target DNA and via a disulfide bond
DNA固定用官能基を有してなるDNAプライマーを結合させる工程、(c)DNAプライマーが結合した一本鎖DNAに、 Step of binding the DNA primer comprising a DNA anchoring functional group, the single-stranded DNA bound is (c) DNA primers,
ポリメラーゼの存在下でヌクレオチド試薬を作用させることによりDNA固定用官能基で修飾された目的DNAの複製物を作製する工程、(d)複製された上記目的DNAを上記DNA固定用官能基と反応して結合しうる官能基を有する水不溶性担体に水系媒体中で作用させて、該目的DNA The step of producing copies of the desired DNA modified with DNA fixing functional group by the action of the nucleotide reagent in the presence of a polymerase, (d) is replicated the target DNA to react with the DNA anchoring functional group by the action in an aqueous medium in the water-insoluble carrier having capable of binding Te functional group, said purpose DNA
を水不溶性担体に固定する工程、(e)上記DNA固定水不溶性担体に吸光性又は蛍光性のDNA染色剤を水系媒体中で作用させて該DNAを染色する工程、(f)染色されたDNAの吸光度又は蛍光強度に基づいて目的DNAを検出する工程、からなる核酸の検出法が提供される。 The fixed water-insoluble carrier process, (e) step of the DNA staining agent absorbing or fluorescent properties to the DNA fixed water-insoluble carrier by the action in an aqueous medium to stain the DNA, (f) stained DNA detecting the absorbance or target DNA, based on the fluorescence intensity, the detection method of a nucleic acid consisting of are provided.

この発明は、DNA検出に際し、末端にジスルフィド結合を介して固定用官能基を有するDNAプライマーを用いて目的DNAを複製する点を第1の特徴とするものである。 This invention is directed to a first feature point to duplicate the target DNA using a DNA primer having a fixing function through upon DNA detection, a disulfide bond at the terminal. そして、複製された固定用官能基含有DNAを水不溶性の担体に固定した状態で染色を行い、この染色された Then, the duplicated fixing functional group-containing DNA Staining was performed while fixing a water-insoluble carrier, which is the stained
DNAの吸光度又は蛍光度に基づいて目的DNAの検出を行う点を第2の特徴とするものである。 The point of detecting the target DNA on the basis of the absorbance or fluorescence of the DNA is to the second feature.

(DNAプライマー) この発明で用いるDNAプライマーは、目的DNAの塩基配列の一部を相補的な塩基配列を有する短鎖のオリゴヌクレオチドに、ジスルフィド結合を介してDNA固定用官能基を結合することにより作製することができる。 DNA primers used in (DNA primer) The present invention, in short the oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a part of the nucleotide sequence of interest DNA, by binding the DNA fixing functional group via a disulfide bond it can be produced.

ここで短鎖のオリゴヌクレオチドとしては、PCR法で用いられるDNAプライマーと同程度の長さ、通常10〜30 Here short as the chain of oligonucleotides, comparable to the DNA primers used in the PCR method length, usually 10 to 30
ヌクレオチド程度のもの、用いるのが適している。 Of about nucleotides, to use suitable.

かかるオリゴヌクレオチドに上記DNA固定用官能基を導入するに当り、まずジスルフィド基による化学修飾が行われる。 Per to such oligonucleotides introducing the DNA fixing functional group, the chemical modification is carried out first by a disulfide group. この化学修飾は、オリゴヌクレオチドに、ジスルフィド結合を有し両端に各々アミノ基を有するシスタミンのようなジアミノ化合物を水系中で作用させることにより行なうことができる。 The chemical modification to oligonucleotides, the diamino compound, such as cystamine, each having amino groups at both ends has a disulfide bond can be carried out by the action in an aqueous. ここで用いるジアミノ化合物としては、下式(I): H 2 N−(CH 2 −S−S−(CH 2 −NH 2 ……(I) (式中、m,nは各々1〜12の整数を示す) で現される化合物又はその塩を用いるのが適している。 Examples of the diamino compound used, the following formula (I): H 2 N- ( CH 2) m -S-S- (CH 2) n -NH 2 ...... (I) ( wherein, m, n are each compound revealed 1-12 an integer) or to use a salt thereof are suitable.

この化学修飾において、このジアミノ化合物残基がオリゴヌクレオチドに導入されるが、この導入位置は、オリゴヌクレオチドの5′末端か核酸塩基のいずれかに選択できる。 In this chemical modification, although the diamino compound residue is introduced into the oligonucleotide, the introduction position may be selected to either the 5 'end or nucleobase oligonucleotide.

5′末端への導入は、通常、オリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドキナーゼを水溶液中で作用させてその5′末端の水酸基をリン酸基に変換し、次いで緩和な条件下で、例えば、カルボジイミド系の縮合剤を用いて上記リン酸基とジアミノ化合物を反応させる、いわゆるホスホロアミデート法により行うことができる(Chu.BF 5 'introduction to end, usually by the action in aqueous solution polynucleotide kinase the oligonucleotide at its 5' by converting a hydroxyl group-terminated to a phosphate group, then under mild conditions, for example, condensation of carbodiimide agent the phosphate group and reacting the diamino compound can be carried out by a so-called phosphoramidite method using (Chu.BF
etal,Nucl.Acids.Res. 11 (1983)6513)。 etal, Nucl.Acids.Res. 11 (1983) 6513). かかる反応により、5′末端のリン酸基のOH基とジアミノ化合物の一端のアミノ基との脱水縮合反応が生じて、下式のように上記ジアミノ化合物残基がオリゴヌクレオチドに導入されることとなる。 Such reactions, 5 'end dehydration condensation reaction of the end amino groups of the OH groups and diamino compound of the phosphate group is generated in, and that the above diamino compound residue by the following equation is introduced into the oligonucleotide Become.

一方、核酸塩基への導入は、よく知られたシトシンの4位のアミノ基転位反応を利用することにより行うことができる。 On the other hand, introduction into the nucleic acid bases can be carried out by utilizing a 4-position amino group rearrangement reaction well known cytosine. かかる反応によりオリゴヌクレオチドの核酸塩基におけるオキシ基とジアミノ化合物の一端のアミノ基との脱水縮合反応が生じて例えば下式のようにジアミノ化合物残基がオリゴヌクレオチドに導入されることとなる。 Diamino compound residue as dehydration condensation reaction occurs for example following expression in the end amino groups of the group and a diamino compound in a nucleic acid base oligonucleotide is to be introduced into the oligonucleotide by such a reaction.

このようにして反応液中に得られた化学修飾オリゴヌクレオチドは、通常、液体クロマトグラフィや電気泳動法等により精製してDNA固定用官能基を結合する工程に用いられる。 In this way, the chemically modified oligonucleotides obtained in the reaction solution is usually used and purified by liquid chromatography or electrophoresis or the like to the step of coupling a DNA anchoring functional group.

ここでDNA固定用官能基の結合は、上記で得られた化学修飾オリゴヌクレオチドを必要に応じて架橋剤を用いて、後述する水不溶性担体の官能基と水系媒体中で容易に反応して結合しうる他の官能基を有する化合物(DNA Wherein binding of the DNA fixing functional groups with a crosslinking agent as necessary The resulting chemically modified oligonucleotides above, bonded to readily react in functional groups and the aqueous medium of the water-insoluble carrier to be described later compounds having another functional group capable of (DNA
固定用化合物)と反応させることにより行うことができる。 It can be carried out by reacting anchoring compound) and. このようなDNA固定用化合物と水不溶性担体の官能基との組合せとしては、例えばビオチン/アビジンの組合せや、各種抗体/抗原の組合せが挙げられる。 As the combination of the functional group of a DNA anchoring compound and a water-insoluble carrier, for example, a combination or biotin / avidin, a combination of various antibody / antigen can be mentioned. ビチオンを用いる場合には、アミノ基あるいはチオール基と反応性を有するビチオン誘導体が適している。 When using the biotin is biotin derivative having reactivity with an amino group or a thiol group are suitable. また、ハプテン(抗原基)を用いる場合には、チオール基を有するもの、あるいはアミノ基を有するものが適しており、又はアミノ反応性基と反応性を有する架橋剤[例えば、N In the case of using a hapten (antigen group) are those having a thiol group, or those having an amino group are suitable, or an amino reactive group and a crosslinking agent having reactivity [e.g., N
−スクシンイミド−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネートやマレイミド−N−ヒドロキシスクシンイミド誘導体類]と組み合わせて用いることができる。 - it can be used in combination with succinimide 3- (2-pyridylthio) propionate and maleimide -N- hydroxysuccinimide derivatives.

かかる結合反応は、通常上記DNA固定用化合物を、必要に応じて架橋剤と水系中で反応させた後、前述した化学修飾オリゴヌクレオチドと水系中で反応させることにより行うのが適している。 Such coupling reactions after normal the DNA anchoring compound, is reacted with a crosslinking agent and water-based if necessary, is suitable carried out by reacting with chemically modified oligonucleotides and water in the above-mentioned. いずれの反応も、緩和な条件下で混合することにより進行させることができる。 Any of reactions can proceed by mixing under mild conditions.

なお、架橋剤及びDNA固定用化合物の使用量は、化学修飾オリゴヌクレオチドに対し、5〜25当量とするのが適している。 Incidentally, the amount of the crosslinking agent and the DNA anchoring compound, compared chemically modified oligonucleotides, is suitable for 5 to 25 equivalents.

(DNAの複製) このようにして得られたDNA固定用官能基を有するDNA (Replication of DNA) DNA having a thus obtained DNA fixing functional groups
プライマーを用いて一本鎖DNAから目的DNAの複製が行われる。 Replication of target DNA is carried out from the single-stranded DNA using a primer. かかるDNAプライマーは(+)(−)の二種類同時に用いることもできる。 Such DNA primers (+) (-) of the two types may be used simultaneously. この複製の手順、方法は、いわゆるPCR法における複製の手順と同様にして行うことができる。 Procedure of this duplication, the method can be carried out analogously to the procedure of replication in the so-called PCR method. すなわち水系媒体中でアルカリ処理又は加熱処理により目的DNAを一本鎖DNAに変性した後、上記DNA That was denatured target DNA into single-stranded DNA by alkali treatment or heat treatment in an aqueous medium, the DNA
プライマーを添加して緩和な温度下でアニーリングを行い、次いでポリメラーゼと順次ヌクレオチド試薬(dAT Perform annealing at mild temperatures with the addition of primer, followed by sequential nucleotide reagent polymerase (DAT
P、dGTP、dCTP、dTTP)を添加して一本鎖DNAを鋳型として相補的なポリヌクレオチド鎖を成長させることにより行うことができる。 P, dGTP, dCTP, single-stranded DNA by the addition of dTTP) can be carried out by growing complementary polynucleotide strand as a template. なお、目的DNA自体は、PCR法で増幅されたものを用いてもよく、高感度検出の点で増幅されたものを用いるのが好ましい。 Incidentally, the target DNA itself may be used after being amplified by the PCR method, it is preferable to use those amplified in terms of high sensitivity detection.

(固定) 上記複製DNAを固定する担体としては、複製DNAにおけるDNA固定用官能基を反応して結合しうる他の官能基を有する水不溶性担体が用いられる。 The carrier for fixing the (fixed) the duplicated DNA, water-insoluble carrier having other functional groups capable of binding by reacting DNA fixing functional group in replicating DNA is used. かかる担体の材質としては、水系媒体中で分散しうる粒状体を用いるのが適しており、例えばアクリルアミドゲル、セファロースゲルのような有機ポリマーからなる粒状体、やシリカゲルのような無機物質からなる粒状体が挙げられる。 As the material of such carrier is suitable to use a granulate which can be dispersed in an aqueous medium, comprising, for example, acrylamide gel, granulate consisting of organic polymers, such as Sepharose gel, or inorganic materials such as silica gel granular body, and the like. また、 Also,
上記他の官能基としては、前述したごとき、アビジン残基や抗体を用いることができ、これらは公知の手法により上記担体に化学固定、物理固定手法等により固定した状態で用いることができる。 Examples of the other functional groups, such as described above, can be used avidin residues or an antibody, which may be used in the state of fixed by chemical fixation, physical fixing method or the like to the carrier by a known method.

複製DNAの上記担体への固定は、緩和な温度下、水系中でこれらを混合することにより迅速に行われ、とくに熱処理や紫外線照射処理等を施す必要はない。 Fixed to the carrier of replication DNA is under mild temperatures, quickly performed by mixing them in an aqueous, not particularly necessary to heat treatment or ultraviolet irradiation treatment.

この固定化が行われた後、水洗により夾雑成分や未反応成分を系から効率良く除去することができ、通常、この水洗後に次の染色工程が行われる。 After the immobilization was carried out, washing with water makes it possible to efficiently remove contaminating components and unreacted components from the system, usually the next dyeing step after the washing is performed.

(染色) この発明でDNA染色剤とは、吸光性又は蛍光性を有しかつ水性媒体中でDNA二本鎖内に迅速に取り込まれる水溶性物質を意味し、とくに可視光での吸光性を有するものでなくてもよい。 (Staining) The DNA stain in the present invention has a light absorbing or fluorescence and means water-soluble substance to be incorporated in the rapidly within the duplex DNA in an aqueous medium, in particular the absorbance in the visible light it may not be as it has. 通常、高感度検出の点で蛍光性を有するものを用いるのが適しており、この例としてはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ等が挙げられる。 Usually, and to use those having fluorescence in terms of high sensitivity detection is suitable, as this example ethidium bromide, acridine orange, and the like.

かかる染色工程の後に、DNAの検出が行われるが、通常、この検出の前に、洗浄が行われこれにより過剰の染色剤が効率良く除去できる。 After such dyeing processes, although the detection of DNA is carried out, usually, prior to the detection, thereby the excess stain cleaning is performed can be efficiently removed.

(DNA検出) 検出は、染色されたDNAの吸光度又は蛍光測定に基づいて化学的に行われる。 (DNA detection) detection is chemically performed based on absorbance or fluorescence measurements of the stained DNA. この化学的検出は、染色された This chemical detection were stained
DNAを固定した担体を、適当な支持体(例えば、濾紙、 The DNA was immobilized carrier, suitable support (e.g., filter paper,
ガラスフィルタ等)に担持させた状態で行うこともできるが、高感度検出の観点から、染色されたDNA固定水不溶性担体に還元剤を水系媒体中で作用させて固定化されたDNAのジスルフィド結合を開裂して上記水不溶性担体から染色DNAを分離し、この分離された染色DNA含有水系媒体を光学的分析に付してその吸光度又は蛍光度を測定するのが好ましい。 It may be conducted in the state of being supported on a glass filter or the like), in view of high sensitivity detection, disulfide bonds of DNA immobilized by the action of a reducing agent in an aqueous medium in the stained DNA fixed water-insoluble carrier the cleaved to separate the stained DNA from the water-insoluble carrier, it is preferable to measure the absorbance or fluorescence are denoted by the separated dyed DNA containing aqueous medium optical analysis. この際用いる還元剤としては、例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミン等が挙げられる。 The reducing agent used in this case, for example, dithiothreitol, mercaptoethanol, and mercaptoethylamine the like.

(ホ)作 用 水不溶性担体と特異的に結合しうるDNA固定用官能基を有するDNAプライマーを用いることにより、複製DNAを該担体に効率良く固定することができる。 By using the DNA primer having a (e) operation for water-insoluble carrier and capable of specifically binding DNA anchoring functional group, it is possible to efficiently secure the replicating DNA to the carrier. そしてDNAの検出は染色法で行われるが、染色法されたDNAが不溶性担体に固定されているため、水洗により夾雑成分等を容易に分離することができる。 And although the detection of DNA is carried out by staining for staining DNA was is fixed on an insoluble carrier, it is possible to easily separate the impurity component such as by washing with water.

従って、従来のごとき支持体への煩雑な固定処理や熱処理を行うことなくしかも煩雑なバイブリダイゼーションを行うことなく、DNAの簡便な検出や高感度な検出が可能となる。 Therefore, without performing addition complicated by hybridization without performing a complicated fixing treatment or heat treatment to conventional such support, it is possible to simple detection and high sensitivity detection of DNA.

(ヘ)実施例 1.オリゴヌクレオチドの化学修飾 (1)オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドとしては、、M13mp8用のプライマー(5′−GTAAAACGACGGCCAGT−3′及び5′−TTGTGTG (F) Example 1. Oligonucleotides of chemical modification (1) Primer for ,, M13mp8 as oligonucleotides oligonucleotide (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3 'and 5'-TTGTGTG
GAATTGTGAGC−3′)を島津自動合成機NS−1で化学合成後HPLC精製したものを用いた。 GAATTGTGAGC-3 ') was used as the chemically-synthesized HPLC purified on a Shimadzu automated synthesizer NS-1. このプライマーは、M1 This primer, M1
3mp8RF−DNA(目的DNA)(+)鎖あるいは(−)鎖に相補的な配列をもつ17量体あるいは18量体である。 3mp8RF-DNA (objective DNA) (+) strand or (-) is a 17-mer or 18-mer having a sequence complementary to the strand.

なお、鋳型としてM13mp8RF I DNAプライマーとして上記した2種のプライマーを用いてPCR反応を行うと約120量体の位置に相当する電気泳動パターンが得られた。 Note that the electrophoretic pattern corresponding to the position of about 120 mer performed a PCR reaction using two primers described above as M13mp8RF I DNA primer as a template is obtained. 本結果は予想位置と一致した。 This result was consistent with the expected position.

(2)反応 リン酸基の導入 上記オリゴヌクレオチドの溶液(50D、30μ)をT 4 (2) a solution of introducing the oligonucleotide reactive phosphate groups (50D, of T 4
ポリヌクレオチドキナーゼ30ユニットで処理(37℃ 2.5 Treated with polynucleotide kinase 30 units (37 ° C. 2.5
時間)し、5′位へリン酸残基を導入した。 Time), was introduced into the phosphate residues to the 5 'position. 反応溶液を The reaction solution
SEP PAK C 18カラムを用いて精製し3mlの溶出液を得た。 Purified using SEP PAK C 18 column to obtain an eluate of 3 ml. 溶出液を振盪下真空濃縮した。 The eluate was shaken under vacuo.

シスタミン残基の導入 5′位リン酸化プローブ(10D)を、縮合剤としての1−エチル−3−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ECDI)(1M 10μ)の存在下、ルチジンバッファー(pH7.5、0.75M、88ml)中で、シスタミン[H 2 N Introducing 5 'position phosphorylated probe cystamine residues (10D), the presence of 1-ethyl as the condensing agent-3- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (ECDI) (1M 10 [mu]), Le cytidine buffer (pH7.5 , 0.75 M, 88 ml) in, cystamine [H 2 N
−(CH 2 −S−S−(CH 22 NH 2 ]の2塩酸塩(1M、 - (CH 2) 2 -S- S- (CH 2) 2 2 hydrochloride NH 2] (1M,
2μ)と室温で一昼夜反応させた。 was reacted with at room temperature overnight. 反応溶液はHPLCにて目的ピークを回収し、振とう下真空濃縮した。 The reaction solution of the desired peak were collected by HPLC, and with shaking concentrated in vacuo.

これにより下式を示す化学修飾(シスタミン導入)されたオリゴヌクレオチドを得た。 This gave chemically modified (cystamine introduced) oligonucleotides indicating the following formula.

2.DNA固定用官能基の導入 上記で得られたシスタミン導入オリゴヌクレオチド(0.7 OD)をPBS 100μに溶解し攪拌下、25倍当量のビオチン−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドを添加して室温下2時間反応させることにより、下記のような5′−ビオチン化プライマーを合成し、HPLCあるいはゲル電気泳動で精製した。 2.DNA fixing functional groups introduced above obtained cystamine introduced oligonucleotide (0.7 OD) was dissolved in PBS 100 microns stirring, by the addition of 25 equivalents of biotin -ε- aminocaproic acid -N- hydroxysuccinimide by reacting for 2 hours under room temperature, to synthesize the 5'-biotinylated primer as described below and purified by HPLC or gel electrophoresis.

3.目的DNAの複製 M13mp8RF−DNA1a mol(10 -18 mol)を目的DNAとして用い、上記で合成した5′−ビオチン化プライマー(50pm 3. Using the replication M13mp8RF-DNA1a mol object DNA (10 -18 mol) purposes DNA, synthetic and 5'-biotinylated primer above (50 pm
ol)及び未修飾プライマー(50pmol)、Taqポリメラーゼ、ヌクレオチド試薬dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP) ol) and unmodified primers (50 pmol), Taq polymerase, nucleotide reagents dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
を加えて、これをPCR法により40回増幅した。 It was added, which was amplified 40 times by PCR. これにより、5′−ビチオン化プライマーがPCR反応で増巾した2本鎖DNA断片に結合されたことになる。 As a result, the 5'-biotin primer is bound to a double-stranded DNA fragments Zohaba in PCR reactions.

4.水不溶性担体への固定 アビジンを直接架橋したアガロースビーズを1×SSC 4. Direct fixing avidin to water insoluble carrier crosslinked agarose beads 1 × SSC
で2回洗浄したものを、上記ビオチン修飾DNA含有水溶液中に添加した。 In what was washed twice, it was added into the biotin-modified DNA-containing aqueous solution. ビオチンとアビジンの結合定数は非常に大きいため上記ゲルの添加混合によりビオチン修飾DN Biotin-modified DN by admixing the gel for binding constant of biotin and avidin is very high
Aが室温下で速やかに該ビーズ(水不溶性担体)に固定されることとなる。 A is to be fixed to quickly said beads (water-insoluble carrier) at room temperature.

5.DNAの染色 上記固定化の後、この固定化物をポアサイズ0.45μm After staining the immobilization of 5.DNA, pore size 0.45μm this fixed product
のフィルタで濾取し、バッファーで充分に洗浄することによって、未反応の一本鎖DNA、プライマー、その他夾雑物を除去した。 Filtered off with a filter, by extensive washing with buffer, single-stranded DNA of the unreacted primers were removed and other contaminants.

次いで固定化物をアクリジンオレンジの水溶液に接触させることにより、接触を行った。 By contacting the immobilized product in an aqueous solution of acridine orange was then carried out contact. 染色後に水で充分に洗浄することにより、過剰のアクリジンオレンジを除去した。 By thoroughly washed with water after staining to remove excess acridine orange.

6.DNAの検出 上記のようにしてフィルタ上に担持された染色化DNA Senshokuka DNA carried on the filter as detected in the above 6.DNA
固定物に、還元剤としてのメルカプトエチルアミン(0. To a fixed object, mercaptoethylamine as a reducing agent (0.
1M)を含むリン酸緩衝液を加え37℃で90分反応させた。 Was reacted 90 minutes at 37 ° C. was added a phosphate buffer containing 1M).
これにより染色化DNA固定化物におけるジスルフィド結合が速やかに開裂し、染色化DNAが液相に分散溶解し、 Thus disulfide bonds are rapidly cleaved in Senshokuka DNA immobilized product, Senshokuka DNA is dispersed and dissolved in the liquid phase,
水不溶性担体と分離された。 It separated from the water-insoluble carrier.

このDNA含有水溶液について、蛍光光度計を用いてその蛍光度(Ex490nm)を測定したところ、530nmと640nm This DNA-containing aqueous solution, where the fluorescence intensity using a fluorometer (Ex490nm) was measured, 530 nm and 640nm
に明確な蛍光ピークが確認された。 Clear fluorescence peak to have been confirmed. そして、この両ピークの強度比は、530nm>640nmであり、アクリジンオレンジ水溶液自体の強度比を逆転していることから、DNAの二本鎖中に捕り込まれたアクリジンオレンジによるものであることも確認された。 The intensity ratio of the two peaks is 530 nm> 640 nm, since it is reverse the intensity ratio of acridine orange solution itself, also be by acridine orange that was incorporated into the during duplex DNA confirmed.

一方、染色剤としてエチジウムブロマイドを用いた際には、Ex300nmで590nmの蛍光ピークが呈されるが、この蛍光ピーク強度は、一本鎖DNAに結合したエチジウムブロマイド水溶液に比して増大化されたものであり、二本鎖DNAに捕り込まれたエチジウムブロマイドによるものであることも確認された。 On the other hand, when using ethidium bromide as a staining agent is a fluorescent peak of 590nm is presented in Ex300nm, the fluorescent peak intensity was increased reduction compared to ethidium bromide aqueous solution attached to the single-stranded DNA are those, also confirmed to be due to ethidium bromide which is incorporated into the double-stranded DNA.

(ト)発明の効果 この発明の核酸の検出法によれば、従来のごとき煩雑な固定化処理やハイブリダイゼーションを行うことなく、簡便に目的DNAを検出することができ、しいては自動化、装置化が容易となり、従来に比してより高感度な検出も可能である。 According to the detection method of a nucleic acid of the effect the present invention of (g) the invention, without performing a conventional complicated fixing treatment and hybridization such as, conveniently able to detect a target DNA, by force automation, apparatus reduction is facilitated, it is possible more sensitive detection than conventional.

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】(a)目的DNAを一本鎖DNAに変性する工程、 (b)上記一本鎖DNAに、目的DNAの塩基配列の一部と相補的な塩基配列を有する短鎖のオリゴヌクレオチドからなりかつジスルフィド結合を介してDNA固定用官能基を有してなるDNAプライマーを結合させる工程、 (c)DNAプライマーが結合した一本鎖DNAに、ポリメラーゼの存在下でヌクレオチド試薬を作用させることによりDNA固定用官能基で修飾された目的DNAの複製物を作製する工程、 (d)複製された上記目的DNAを上記DNA固定用官能基と反応して結合しうる官能基を有する水不溶性担体に水系媒体中で作用させて、該目的DNAを水不溶性担体に固定する工程、 (e)上記DNA固定水不溶性担体に吸光性又は蛍光性のD 1. A (a) a step of denaturing the target DNA into single-stranded DNA, (b) to the single-stranded DNA, a short chain having a portion complementary to the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the target DNA oligo step consists nucleotides and via a disulfide bond linking the DNA primer comprising a DNA anchoring functional group, the single-stranded DNA bound is (c) DNA primers, the action of the nucleotide reagent in the presence of a polymerase the step of producing copies of the desired DNA modified with DNA fixing functional groups by water-insoluble with (d) is replicated functional group of the target DNA may be bound by reacting with the DNA anchoring functional group carrier by the action in an aqueous medium, the said purpose DNA fixed on a water-insoluble carrier process, (e) absorbing or fluorescent properties to the DNA fixed water-insoluble carrier D
    NA染色剤を水系媒体中で作用させて該DNAを染色する工程、 (f)染色されたDNAの吸光度又は蛍光強度に基づいて目的DNAを検出する工程、 からなる核酸の検出法。 Step of NA stain by the action in an aqueous medium to stain the DNA, the nucleic acid detection method comprising steps of, detecting a target DNA on the basis of the absorbance or fluorescence intensity of (f) stained DNA.
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