JP2025532113A

JP2025532113A - 新規のアデニン脱アミノ酵素変異体及びこれを用いた塩基編集方法

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Publication number: JP2025532113A
Application number: JP2025517270A
Authority: JP
Inventors: ジンスキム; ソンイクチョ; カヨンイム; ジェスクイ
Original assignee: Institute for Basic Science
Current assignee: Institute for Basic Science
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2023-07-04
Publication date: 2025-09-29
Also published as: AU2023344227A1; EP4590813A1; KR20250075667A; CN119998447A; WO2024063273A1

Abstract

本発明は、新規のアデニン脱アミノ酵素変異体、前記アデニン脱アミノ酵素変異体を含む融合タンパク質、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための前記融合タンパク質を含む塩基編集用組成物、及び標的ＤＮＡを含有する細胞に前記塩基編集用組成物を伝達する段階を含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集方法に関する。前記新規のアデニン脱アミノ酵素変異体は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を含むオフターゲット効果を著しく減少させることができ、標的ＤＮＡで任意に意図していないオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

Description

オフターゲット編集（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｅｄｉｔｉｎｇ）を減少できるアデニン脱アミノ酵素（ａｄｅｎｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ）変異体；ＤＮＡ結合タンパク質及びアデニン脱アミノ酵素変異体を含む融合タンパク質；融合タンパク質を含むＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための塩基編集用組成物；及び標的ＤＮＡを含む細胞に塩基編集用組成物を伝達する段階を含むＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集方法を提供する。

哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の標的塩基編集は、強力で且つ多芸多才な技術であって、細胞株と動物でミトコンドリア遺伝疾患をモデリングし、患者の病原性突然変異を修正する新しい治療方式を開発するのに使用することができる。オーダーメイド型ＤＮＡ結合タンパク質及び核塩基脱アミノ酵素で構成されたプログラミング可能な脱アミノ酵素は、標的方式でのミトコンドリアＤＮＡ編集を可能にする。

シトシン塩基エディターとは異なり、ＴＡＬＥＤｓとして知られているアデニン塩基エディター（ａｄｅｎｉｎｅｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓ、ＡＢＥｓ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から由来したｔＲＮＡ－特異的ＴａｄＡタンパク質からエンジニアリングされたデオキシアデニン脱アミノ酵素（ｄｅｏｘｙ－ａｄｅｎｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ）であるＴａｄＡ８ｅを含む。ＴａｄＡ８ｅ及びＴａｄＡの関連変異体は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ－ガイドアデニン塩基エディターで重要な構成要素であって、核ＤＮＡのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集に広範囲に使用される。それにもかかわらず、ＲＮＡ－ガイドＡＢＥｓを用いて細胞小器官ＤＮＡを編集することは、ガイドＲＮＡを細胞小器官に伝達することが難しいために挑戦課題となる。さらに、ＡＢＥｓに存在するＴａｄＡ８ｅは、ＲＮＡ基質に対する残留脱アミノ酵素活性を維持し、意図していないトランスクリプトームワイド（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ）オフターゲット塩基編集をもたらす。オフターゲット効果は、各編集装置が意図していないゲノム領域に誤って作用し、所望でない修正をもたらすときに発生する。

プログラミング可能な脱アミノ酵素媒介塩基編集に対する広範囲な関心にもかかわらず、現在としては、向上した特異性を有するアデニン塩基エディターに対して開発された戦略が不足し、オフターゲット編集効果の発生を減少できる方法が不足している。このような副作用を最小化するこれらの塩基エディターを開発し、副作用を減少させるための方法を具現することは相当重要であり、科学的及び治療的応用に対するさらに多くの信頼性を持ってさらに広い範囲への適用を可能にする。

本発明は、塩基編集用組成物、その遺伝子治療及びゲノム工学での適用方法に関する。より具体的には、本発明の組成物及び方法は、臨床的環境で使用される場合、オフターゲットゲノム切断及びＲＮＡオフターゲット毒性などの副作用が著しく減少する塩基エディター変異体を含む。革新的なアデニン塩基エディターに伴われる新規の活用接近法を導入することによって、本発明は、医学及び生命工学分野で広範囲な応用分野を有する標的塩基編集のための新しい道を提供する。

本発明の一実施例において、本明細書では、アデニン脱アミノ酵素変異体を提供する。

本発明の他の実施例において、本明細書では、ＤＮＡ結合タンパク質及びアデニン脱アミノ酵素変異体を含む融合タンパク質を提供する。

本発明の他の実施例において、本明細書では、アデニン脱アミノ酵素変異体又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

本発明の一実施例において、本明細書では、融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための塩基編集用組成物を説明する。

本発明の他の実施例において、本明細書では、標的ＤＮＡを含む細胞に塩基編集用組成物を伝達する段階を含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための方法を提供する。

本発明の他の実施例において、本明細書では、標的ＤＮＡを含む細胞に塩基編集用組成物を伝達する段階を含む、オフターゲット編集効果を減少させる方法を説明する。

本発明の他の実施例において、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集及び／又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のオフターゲット効果を減少させるにおいて、又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための組成物を製造するにおいて、及び／又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のオフターゲット効果を減少させるにおいてアデニン脱アミノ酵素変異体又は融合タンパク質の用途を提供する。

本発明で使用された塩基エディターの構造を示す図である。ＡＤ（ＴａｄＡ８ｅアデニン脱アミノ酵素）；ＡＤ＊（ＴａｄＡ８ｅアデニン脱アミノ酵素変異体）；ＭＴＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ；ミトコンドリア標的配列）；ＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ウラシルグリコシラーゼ抑制剤）。Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＲＮＡ編集数及び編集頻度を示すグラフである。Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＡ－ｔｏ－Ｇ編集数及びＣ－ｔｏ－Ｔ編集数（左側）、及び野生型Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤに対するＣｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体の標的活性（右側）を示すグラフである。ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＲＮＡ編集数及び編集頻度を示すグラフである。ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＡ－ｔｏ－Ｇ編集数及びＣ－ｔｏ－Ｔ編集数（左側）、及び野生型ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤに対するＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体の標的活性（右側）を示すグラフである。ＡＢＥ８ｅのＴａｄＡ部分の構造的な代表図である（タンパク質情報銀行（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ、ＰＤＢ）受託番号６ＶＰＣ）。合計２０９個のｓＴＡＬＥＤ変異体のうちミトコンドリアＤＮＡオンターゲット（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）活性を維持する１０１個のｓＴＡＬＥＤ変異体のＤＮＡオンターゲット活性（左側）、ＲＮＡオフターゲット活性（中間）、及びＲＮＡオフターゲット編集頻度に対するＤＮＡオンターゲット編集頻度の相対的な比率（右側）を示すヒートマップである。前記相対的な比率は、１の値を有する元のｓＴＡＬＥＤの比率に正規化された。２０９個のｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＤＮＡオンターゲット塩基編集頻度を示すグラフである。標的ＲＮＡシーケンシングで測定した６個のＲＮＡオフターゲット部位での編集頻度を示すグラフである。６個の選別されたＲＮＡオフターゲット部位において、トランスクリプトームワイドシーケンシングで抽出したｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＲＮＡオフターゲット編集頻度を示すグラフである。標的ＲＮＡアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）シーケンシングで分析されたｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＲＮＡオフターゲット編集頻度を示すグラフである。Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＲＮＡ編集数及び編集頻度を示すグラフである。Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＡ－ｔｏ－Ｇ編集及びＣ－ｔｏ－Ｔ編集を示すグラフである。ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＲＮＡ編集数及び編集頻度を示すグラフである。ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＡ－ｔｏ－Ｇ編集及びＣ－ｔｏ－Ｔ編集を示すグラフである。ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＲＮＡ編集数及び編集頻度を示すグラフである。ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤｓに対するＡ－ｔｏ－Ｇ編集及びＣ－ｔｏ－Ｔ編集を示すグラフである。野生型ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤに相対的なＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体のオンターゲット活性を示すグラフである。野生型ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤに相対的なＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体のオンターゲット活性を示すグラフである。６個の代表的な部位において、ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体のＲＮＡオフターゲット活性を示すヒートマップである。６個の代表的な部位において、ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体のＲＮＡオフターゲット活性を示すヒートマップである。６個の代表的な部位において、ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＲＮＡオフターゲット編集頻度を示す棒グラフである。各反復実験の編集効率性は、グラフ上に点で表される。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２（反復実験）×６（ＲＮＡオフターゲット部位）に対するｓ．ｅ．ｍ．である。６個の部位において、ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＲＮＡオフターゲット編集頻度を示す棒グラフである。各反復実験の編集効率性は、グラフ上に点で表される。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２（反復実験）×６（ＲＮＡオフターゲット部位）に対するｓ．ｅ．ｍ．である。ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＲＮＡオフターゲット編集頻度に相対的なＤＮＡオンターゲット編集頻度の比率を示す棒グラフである。ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたＲＮＡオフターゲット編集頻度に相対的なＤＮＡオンターゲット編集頻度の比率を示す棒グラフである。前記比率は、１の値を有するｓＴＡＬＥＤに対する比率に正規化された。Ｃｏｘ３．１、ＮＤ１（図６（Ｇ））、及びＮＤ６（図６（Ｈ））を標的とするｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ変異体に対する平均相対比率値を示すグラフである。Ｃｏｘ３．１部位を標的とするｓＴＡＬＥＤ又はｓＴＡＬＥＤ変異体によって発生したＡ－ｔｏ－Ｇ転換を示すヒートマップである。ＮＤ１部位を標的とするｓＴＡＬＥＤ又はｓＴＡＬＥＤ変異体によって発生したＡ－ｔｏ－Ｇ転換を示すヒートマップである。ＮＤ６部位を標的とするｓＴＡＬＥＤ又はｓＴＡＬＥＤ変異体によって発生したＡ－ｔｏ－Ｇ転換を示すヒートマップである。それぞれ図７ａ乃至図７ｃに要約されたＣｏｘ３．１、ＮＤ１、ＮＤ６対立遺伝子の分析を示す図である。スペーサー配列は左側に示され、各対立遺伝子の頻度を表示する棒グラフは右側に示される。参照配列は、いずれも大文字で記載され、小文字は、塩基編集が発生した位置を表示する。形質感染後４日目に、ミトコンドリアゲノム全体においてオンターゲット及びオフターゲット編集の位置を示すプロットである。黒色及び灰色の点は、それぞれオフターゲット編集及び自然に発生する単一ヌクレオチド変異（ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓ、ＳＮＶｓ）を示し、矢印は、オンターゲット（及びバイスタンダー）編集を示す。ヒトミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置はＸ軸に表される。野生型ＴＡＬＥＤ及びＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたゲノムワイド（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ）オフターゲット編集の平均頻度を示す図である。形質感染後２日目に、ミトコンドリアゲノム全体においてオンターゲット及びオフターゲット編集の位置を示すプロットである。黒色及び灰色の点は、それぞれオフターゲット編集、及び自然に発生する単一ヌクレオチド変異（ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓ、ＳＮＶｓ）を示し、矢印は、オンターゲット（及びバイスタンダー）編集を表示する。ヒトミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置はＸ軸に表される。野生型ＴＡＬＥＤ及びＴＡＬＥＤ変異体によって誘導されたゲノム全体のオフターゲット編集の平均頻度を示すグラフである。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２に対するｓ．ｅ．ｍ．である。（Ａ）Ｃｏｘ３．１－、（Ｂ）ＮＤ１－、（Ｃ）ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ変異体（Ｖ１０６Ｗ、Ｖ２８Ｒ、Ｒ１１１Ｓ）によって誘導されたオンターゲット塩基編集の頻度を時間の経過によって示す線グラフである。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２に対するｓ．ｅ．ｍ．である。６個の代表的な部位において、（Ｄ）Ｃｏｘ３．１－、（Ｅ）ＮＤ１－、（Ｆ）ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ変異体（Ｖ１０６Ｗ、Ｖ２８Ｒ、Ｒ１１１Ｓ）によって誘導されたＲＮＡオフターゲット塩基編集の頻度を時間の経過によって示す線グラフである。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２に対するｓ．ｅ．ｍ．である。Ｃｏｘ３．１－、ＮＤ１－及びＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ変異体に対する平均ＲＮＡオフターゲット編集頻度を時間の経過によって示す線グラフである。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２に対するｓ．ｅ．ｍ．である。本発明の一実施例に対する実験計画を示す図である。ｓＴＡＬＥＤ、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｒ１１１Ｓを発現するプラスミドで形質感染された細胞の生存率を示す棒グラフであって、形質感染後２日（Ｂ）及び４日（Ｃ）目にＭＴＳ検定でホルマザン形成による色相変化を観察して決定した。吸光度の値は、対照群としてのｐＥＧＦＰで形質感染された細胞の吸光度の値に正規化した。誤差棒は、生物学的に独立したサンプルｎ＝２に対するｓ．ｅ．ｍ．である。ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅ変異構造体の構造を示す図である。ＡＤ（ＴａｄＡ８ｅアデニン脱アミノ酵素）；ＡＤ＊（ＴａｄＡ８ｅアデニン脱アミノ酵素変異体）；ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ；核局所化配列））。核ＴＹＲＯ３部位において、ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅ変異体（ＡＢＥ８ｅ－Ｖ１０６Ｗ、ＡＢＥ８ｅ－Ｖ２８Ｒ、ＡＢＥ８ｅ－Ｒ１１１Ｓ）のオンターゲット活性を示すグラフである。核ＴＹＲＯ３部位において、ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅ変異体（ＡＢＥ８ｅ－Ｖ１０６Ｗ、ＡＢＥ８ｅ－Ｖ２８Ｒ、ＡＢＥ８ｅ－Ｒ１１１Ｓ）によって発生したＡ－ｔｏ－Ｇ転換頻度を表示するヒートマップである。６個の代表的な部位において、ＴＹＲＯ３標的ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅ変異体（ＡＢＥ８ｅ－Ｖ１０６Ｗ、ＡＢＥ８ｅ－Ｖ２８Ｒ、ＡＢＥ８ｅ－Ｒ１１１Ｓ）のＲＮＡオフターゲット活性を示すグラフである。トランスクリプトームワイドシーケンシングを通じて評価した核ＴＹＲＯ３部位を標的とするＡＢＥ８ｅ又はＡＢＥ８ｅ変異体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発見されたＲＮＡ編集の総個数を示すグラフである。二量体ＴＡＬＥＤ（ｄｉｍｅｒｉｃＴＡＬＥＤｓ、ｄＴＡＬＥＤｓ）、半単量体ＴＡＬＥＤ（ｄＴＡＬＥＤ－ＡＤｓ）、単量体ＴＡＬＥＤｓ（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃＴＡＬＥＤｓ、ｍＴＡＬＥＤｓ）、及び未処理サンプルを含むＣｏｘ３－特異的ＴＡＬＥＤｓのＤＮＡオンターゲット活性を示すグラフである。６個の代表的な部位において、二量体ＴＡＬＥＤｓ（ｄＴＡＬＥＤｓ）、半単量体ＴＡＬＥＤ（ｄＴＡＬＥＤ－ＡＤｓ）、単量体ＴＡＬＥＤｓ（ｍＴＡＬＥＤｓ）、及び未処理サンプルを含むＣｏｘ３－特異的ＴＡＬＥＤｓのＲＮＡオフターゲット活性を示すグラフである。Ｃｏｘ３－特異的ＴＡＬＥＤｓによって誘導されたオンターゲット編集に対するＲＮＡオフターゲット編集の特異性比率を示すグラフである。

次の定義は、当業界の定義を補完し、本出願に関するものであって、関連しているか、又は関連していない場合、例えば、任意の一般的に所有された特許又は出願に帰属してはならない。本明細書の説明と類似又は同等な任意の方法及び材料は、本明細書のテストのための実務で使用され得るが、好ましい材料及び方法は本明細書に説明されている。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施例のみを説明するためのものであって、これを制限しようとするものではない。別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の熟練者が一般的に理解する意味を有する。

本明細書において、単数の使用は、別に明示されない限り、複数を含む。本明細書で使用される単数型である「一つ」、「一つの」及び「その」は、文脈上明らかに異なる意味で明示されない限り、複数型参照を含むという点に留意しなければならない。本明細書において、「又は」の使用は、別に明示されない限り、「及び／又は」を意味し、包括的なものと理解される。また、「包含」という用語のみならず、「含む」及び「含まれた」などの他の形態の使用は制限されない。

本明細書で使用される「約」又は「略」などの用語は、当業界で通常の技術者が決定した特定の値に対して許容できる誤差範囲内にあることを意味し、これは、部分的に値が測定又は決定される方式、すなわち、測定システムの限界によって変わり得る。例えば、「約」は、当業界の慣行に従って１又は１以上の標準偏差内にあることを意味することができる。又は、「約」は、与えられた値の最大２０％、最大１０％、最大５％又は最大１％の範囲を意味することができる。又は、特に、生物学的システム又はプロセスと関連して、前記用語は、値の５倍以内又は２倍以内のように大きさの範囲内を意味することができる。特定の値が明細書及び特許請求の範囲に説明された場合、別に明示されない限り、「約」という用語は、特定の値に対して許容できる誤差範囲内を意味するものと仮定しなければならない。

本明細書で使用される「相応する」という用語は、ポリペプチドに羅列された位置のアミノ酸残基、又はポリペプチドに羅列されたものと類似、同一、又は相同のアミノ酸残基を意味する。相応する位置でアミノ酸を識別することは、特定の配列を参照する配列で特定のアミノ酸を決定することであり得る。本明細書で使用される「相応する領域」は、一般的に関連タンパク質又は参照タンパク質で類似又は相応する位置を意味する。例えば、任意のアミノ酸配列は配列番号３に整列され、これをベースにして、アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号３のアミノ酸残基及び相応するアミノ酸残基の数字位置を参照して番号が付けられ得る。例えば、本明細書に説明した配列整列アルゴリズムは、クエリ（ｑｕｅｒｙ）配列（「参照配列」とも言う）の位置との比較を通じて、アミノ酸の位置又は置換、挿入又は欠失などの変形が発生する位置を決定することができる。

本明細書で使用される「整列」という用語は、配列判読を参照ゲノムにマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）した後、ゲノムで同一の部位を有する塩基を各部位に合わせて整列することを意味する。よって、上記と同一の方式で配列判読を整列できる限り、任意のコンピュータープログラムを使用することができる。前記プログラムは、当業界で既に知られたものであってもよく、目的に合わせて調整されたプログラムから選択することもできる。本発明の一実施例において、整列はＩＳＡＡＣを用いて行われるが、これに制限されない。

本明細書において、「多様な実施例」、「一部の実施例」、「実施例」、「一実施例」又は「他の実施例」に対する参照は、実施例と関連した説明した特定の特徴、構造、又は特性が本明細書の少なくとも一部の実施例を含むが、必ず全ての実施例を含むものではないことを意味する。

本明細書で使用される「宿主細胞」（又は「組換え宿主細胞」）という用語は、遺伝的に変形したか、組換えプラスミド又はベクターなどの外因性ポリヌクレオチド分子の導入によって遺伝的に変形し得る細胞を称するものと意図される。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫を称するものと理解しなければならない。特定の変形は、突然変異又は環境的影響によって後続世代で発生し得るので、このような子孫細胞は、実際に親細胞と同一でない場合があるが、それにもかかわらず、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。

本明細書で使用される「塩基エディター（ｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ、ＢＥ）」という表現は、ポリヌクレオチドに結合し、核塩基変形活性を有する作用剤を意味する。本発明の一実施例において、前記塩基エディターは、核塩基変形ポリペプチド（例えば、脱アミノ酵素）及び核酸プログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインを含む。本発明の他の実施例において、前記塩基エディターは、核塩基変形ポリペプチド（例えば、脱アミノ酵素）及びガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と共に、核酸プログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインを含む。しかし、本発明の他の実施例において、前記作用剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子（例えば、ＤＮＡ）内の塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、又はＵ）を変形できるドメインを含む生体分子複合体である。本発明の一部の実施例において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なＤＮＡ結合ドメインは、脱アミノ酵素ドメインに融合又は連結される。本発明の一実施例において、前記作用剤は、塩基編集活性を有するドメインを含む融合タンパク質である。本発明の他の実施例において、前記塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドＲＮＡに（例えば、ガイドＲＮＡ上のＲＮＡ結合モチーフ及び脱アミノ酵素に融合されたＲＮＡ結合ドメインを通じて）連結される。本発明の一部の実施例において、前記塩基編集活性を有するドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。本発明の一部の実施例において、前記塩基エディターは、ＤＮＡ分子内の一つ以上の塩基を脱アミノ化することができる。本発明の一部の実施例において、前記塩基エディターは、ＤＮＡ内のアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ、Ａ）を脱アミノ化することができる。本発明の一部の実施例において、前記塩基エディターは、アデニン塩基エディター（ａｄｅｎｉｎｅｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ、ＡＢＥ）である。

本明細書で使用される「投与」は、本明細書に説明した一つ以上の組成物を患者又は対象者に提供することを意味する。例示として及び制限なしで、組成物の投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）注射であり得、これらのうち一つ以上の経路を用いて行うことができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注入又は時間の経過による漸進的貫流であり得る。本発明の一部の実施例において、非経口投与は、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、脊椎腔内、腫瘍内、皮内、腹腔内、器官内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下及び胸骨内注入又は注射を含む。経口投与は、交互に又は同時に行うことができる。

本明細書で使用される「他のアミノ酸」という表現は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リシン、及びその知られている全ての、元の置換位置で野生型タンパク質が維持されるアミノ酸は除外した、変異体から選ばれたアミノ酸を称するものと意図され得る。

本明細書で使用される「オフターゲット部位」という用語は、オンターゲット部位ではないが、アデニン塩基エディターが活性を示す部位を称することができる。すなわち、前記オフターゲット部位は、オンターゲット部位以外に、塩基編集が発生する部位を称することができる。本発明の一実施例において、「オフターゲット部位」という用語は、アデニン塩基エディターのオンターゲット部位でないだけでなく、そのオフターゲット部位になる可能性がある部位も包括して使用することができる。

本明細書で使用される「全ゲノムシーケンシング」（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）という用語は、次世代シーケンシングを通じた全ゲノムシーケンシングのために１０Ｘ、２０Ｘ、及び４０Ｘ形式などの様々な倍数でゲノムを読む方法を称する。前記「次世代シーケンシング」という用語は、チップベース及びＰＣＲベースのペアエンド（ｐａｉｒｅｄｅｎｄ）形式で全ゲノム又はゲノムの標的領域を断片化し、化学反応（ハイブリッド化）ベースの高処理量で断片のシーケンシングを行う技術を意味する。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。「核酸配列」又は「ポリヌクレオチド配列」は、５’から３’末端方向に読むデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の単一又は二重鎖重合体を意味する。ここでは、自己複製プラスミド、ＤＮＡ又はＲＮＡの感染性重合体、及び非機能的ＤＮＡ又はＲＮＡを全て含む。

「核酸分子暗号化」という文句は、特定のタンパク質又はペプチドの発現を指示する核酸分子を意味する。前記核酸配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列及びタンパク質又はペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列を全て含む。前記核酸分子には、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）核酸配列のみならず、全長タンパク質から由来した非全長（ｎｏｎ－ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）配列も全て含む。前記配列には、特定の宿主細胞でコドン選好度を提供するために導入され得る本来の（ｎａｔｉｖｅ）配列又は各配列の縮退コドンを含むという点も理解しなければならない。

「ベクター」という用語は、ウイルス発現システム、自律的自己複製原型ＤＮＡ（プラスミド）を意味し、発現及び非発現プラスミドを全て含む。組換え微生物又は細胞が「発現ベクター」を保有すると説明される場合、ここでは、染色体外の原型ＤＮＡ及び宿主染色体に統合されたＤＮＡを全て含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、前記ベクターは、自律的構造として、細胞分裂の間に前記細胞によって安定的に複製されるか、又は前記宿主のゲノム内に統合され得る。

「プラスミド」という用語は、細胞内で複製され得る自律的原型ＤＮＡ分子を意味し、発現及び非発現類型を全て含む。組換え微生物又は細胞が「発現プラスミド」を保有すると説明される場合、ここでは、宿主染色体に統合された潜伏ウイルスＤＮＡを含む。プラスミドが宿主細胞によって維持される場合、前記プラスミドは、自律的構造として、細胞分裂の間に前記細胞によって安定的に複製されるか、又は前記宿主のゲノム内に統合される。

本明細書で使用される「アミノ酸配列相同性百分率」又は「アミノ酸配列同一性百分率」は、１番目のアミノ酸配列と２番目のアミノ酸配列との間の配列同一性を意味する。これは、［２番目のアミノ酸配列の相応位置にあるアミノ酸残基と同一の１番目のアミノ酸配列のアミノ酸残基の数］を［１番目のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数］で割った後、これに［１００％］を掛けて計算することができ、２番目のアミノ酸配列アミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は追加のそれぞれは、１番目のアミノ酸配列と比較したとき、単一アミノ酸残基（位置）での差、すなわち、本明細書に定義された「アミノ酸の差」と見なされる。又は、二つのアミノ酸配列の間の配列同一性程度は、ヌクレオチド配列の配列同一性程度を決定するために前記言及した、公知のコンピューターアルゴリズムを用いて標準設定で再度計算することができる。

本発明の多様な実施例において、ＴａｄＡ８ｅと関連した所望でないオフターゲット効果の問題を解決するために、ＲＮＡオフターゲット効果又はＤＮＡオフターゲット効果（例えば、バイスタンダーオフターゲット効果を包含）が減少したＴａｄＡ８ｅ変異体を選択する過程を説明した。本発明の一実施例において、このような目的は、ヌクレオチドと相互作用するＴａｄＡ８ｅ内の特定の位置で他のアミノ酸残基に取り替えることによって達成された。さらに、このような変異体がＲＮＡ又はＤＮＡオフターゲット効果に及ぼす影響を評価するために、全体のミトコンドリアゲノムシーケンシングのみならず、ＲＮＡシーケンシングも行われた。このような包括的な分析を通じて、ＲＮＡオフターゲット部位の全体のスペクトル又は６個の著しいＲＮＡオフターゲット部位の代表的な選別を識別及び確認できた。また、ＲＮＡが有する一時的な特性を認識し、時間の経過によるＲＮＡオフターゲット効果の動力学も測定した。このような測定は、多様な時間地点で行われ、ＲＮＡオフターゲット様相が発現過程でどのように変化したのかを評価した。

本発明の一実施例において、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むアデニン脱アミノ酵素が提供され、ここで、配列番号１の残基２８、３０、４６、４８、４９、８２、８４、１０６、１０８、１１０、及び１１１から選ばれた少なくとも一つのアミノ酸残基、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列相同性（又は配列同一性）を有するアミノ酸配列の相応するアミノ酸残基は他のアミノ酸に置換される。

「アデニン脱アミノ酵素」という用語は、アデニン又はアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒できるポリペプチド又は断片を意味する。本発明の一実施例において、前記脱アミノ酵素又は脱アミノ酵素ドメインは、アデノシンからイノシン又はデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解的脱アミノ化を容易にするアデニン脱アミノ酵素を表現する。また、本発明の他の実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）でアデニン又はアデノシンの加水分解的脱アミノ化を行う。本明細書に説明した、エンジニアリングされたアデノシン脱アミノ酵素又は進化されたアデノシン脱アミノ酵素などの前記アデノシン脱アミノ酵素は、バクテリアを含む全ての有機体から由来し得る。

本発明の一部の実施例において、前記アデノシン脱アミノ酵素は、ＴａｄＡ脱アミノ酵素である。本発明の一部の実施例において、前記ＴａｄＡ脱アミノ酵素はＴａｄＡ変異体である。本発明の一部の実施例において、前記ＴａｄＡ変異体はＴａｄＡ８ｅである。本発明の一部の実施例において、前記脱アミノ酵素又は脱アミノ酵素ドメインは、バクテリア、古細菌、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、又はマウスなどの有機体から自然に発生する脱アミノ酵素の変異体である。本発明の一部の実施例において、前記脱アミノ酵素又は脱アミノ酵素ドメインは自然で発生しない。例えば、本発明の一部の実施例において、前記脱アミノ酵素又は脱アミノ酵素ドメインは、自然に発生する脱アミノ酵素と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％同一である。

ＴａｄＡ８ｅアデノシン脱アミノ酵素は、次のような配列を有する：

ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＳＫＲＧＡＡＧＳＬＭＮＶＬＮＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＤＦＹＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＩＮ（配列番号１）

本発明の一部の実施例において、前記アミノ酸置換は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＶ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、Ａ４８Ｗ、Ｆ８４Ｍ、Ｖ１０６Ａ、Ｋ１１０Ｓ、Ｋ１１０Ｔ、又はＫ１１０Ｖ、及びＲ１１１Ｆ、Ｒ１１１Ｑ、Ｒ１１１Ｓ、Ｒ１１１Ｔ、又はＲ１１１Ｙからなる群から選ばれた少なくとも一つであり得る。

本発明の一実施例において、最も低いＲＮＡ又はＤＮＡオフターゲット編集効率を有する前記アミノ酸置換（例えば、バイスタンダーオフターゲット効果を包含）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＶ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、Ａ４８Ｗ、及びＲ１１１Ｓからなる群から選ばれた少なくとも一つであり得る。

本発明の多様な実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を含む著しく減少したオフターゲット効果を示すことができる。本発明の他の実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

本発明の一実施例において、ＤＮＡ結合タンパク質；及び前記アデニン脱アミノ酵素変異体を含む融合タンパク質が提供される。前記アデニン脱アミノ酵素変異体のアミノ酸置換は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＶ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、Ａ４８Ｗ、Ｆ８４Ｍ、Ｖ１０６Ａ、Ｋ１１０Ｓ、Ｋ１１０Ｔ、又はＫ１１０Ｖ、及びＲ１１１Ｆ、Ｒ１１１Ｑ、Ｒ１１１Ｓ、Ｒ１１１Ｔ、又はＲ１１１Ｙからなる群から選ばれた少なくとも一つであり得る。本発明の一実施例において、最も低いＲＮＡ又はＤＮＡオフターゲット編集効果（例えば、バイスタンダーオフターゲット効果を包含）を有する前記アデニン脱アミノ酵素変異体の前記アミノ酸置換は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＶ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、Ａ４８Ｗ、及びＲ１１１Ｓからなる群から選ばれた少なくとも一つであり得る。

本発明の多様な実施例において、前記融合タンパク質は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を含む著しく減少したオフターゲット効果を示すことができる。本発明の他の実施例において、前記融合タンパク質は、活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記融合タンパク質は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

前記ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、これに制限されないが、１）ジンクフィンガー（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒ）タンパク質、２）転写活性化因子様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒ、ＴＡＬＥ）タンパク質、３）ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼであり得る。前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ；周期的な間隔で分布する短い回文式反復部）関連タンパク質９；ＣＲＩＳＰＲａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ９））又はＣｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲｆｒｏｍＰｒｅｖｏｔｅｌｌａａｎｄＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１；プレボテラ及びフランシセラ１由来ＣＲＩＳＰＲ）などのＩＩ型及び／又はＶ型である。ＣＲＩＳＰＲシステムと関連したヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）又はこれと類似するものを使用することができる。具体的には、本発明の一実施例において、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ６、又はＣ２ｃ２などのＣａｓタンパク質、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩＩ型のＣａｓタンパク質、より具体的には、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＰｙｏｇｅｎｅｓ）から由来したＣａｓ９タンパク質であり得る。

本明細書で使用される「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）という用語は、高度に可変的な２個のアミノ酸モチーフ（反復可変二残基；ＲｅｐｅａｔＶａｒｉａｂｌｅＤｉｒｅｓｉｄｕｅ、ＲＶＤ）を含む高度に保存された３３個～３４個のアミノ酸配列の多数を含むＴＡＬＥ反復配列を含むＤＮＡ結合タンパク質を意味する。前記ＲＶＤモチーフは、核酸配列に対する結合特異性を決定し、当業者に広く知られている方法によって所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するように設計され得る。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の簡単な関係により、適切なＲＶＤｓを含む反復セグメントの組み合わせを選択し、特定のＤＮＡ結合ドメインを設計することができる。

本発明の一実施例において、前記ＤＮＡ結合タンパク質はＴＡＬＥであり得る。本発明の他の実施例において、前記ＴＡＬＥは、第１ＴＡＬＥモジュール及び第２ＴＡＬＥモジュールで構成された二重ＴＡＬＥモジュールであり得る。本発明の一部の実施例において、前記第１及び第２ＴＡＬＥモジュールのそれぞれは多様な脱アミノ酵素に連結され得る。例えば、前記第１ＴＡＬＥモジュールは、全長形態でＤｄｄＡ_ｔｏｘなどのシトシン脱アミノ酵素に連結され得、前記第２ＴＡＬＥモジュールはアデニン脱アミノ酵素変異体に連結され得る。

Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要なタンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼとして機能することができる。

Ｃａｓ９タンパク質又はその遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；国立生命工学情報センター、米国）のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから収得することができる。例えば、前記Ｃａｓ９タンパク質は、下記のように構成された群から選ばれた少なくとも一つであり得るが、これに制限されない：

ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスから由来したＣａｓ９タンパク質、（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）（暗号化遺伝子：配列番号２２９）；

カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）から由来したＣａｓ９タンパク質；

ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）又はストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）から由来したＣａｓ９タンパク質；

ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から由来したＣａｓ９タンパク質；

パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｓｐ．）、例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）から由来したＣａｓ９タンパク質；及び

フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｓｐ．）、例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）から由来したＣａｓ９タンパク質。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと区別される新しいＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであるＣｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９に比べて小さく、ｔｒａｃｒＲＮＡが必要でなく、単一ガイドＲＮＡとして機能することができる。また、Ｃｐｆ１は、チミジンが豊かなＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ；プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識し、凝集性二重鎖切断（凝集性末端）を生成することができる。

例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダタス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓｓｐｐ．）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｓｐｐ．）、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｓｐｐ．）、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｓｐｐ．）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐｐ．）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｓｐｐ．）、カンジダタス・メタノプラズマ（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、又はユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）から由来したエンドヌクレアーゼであり得る。前記Ｃｐｆ１タンパク質が由来し得る微生物の例としては、パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．；ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｍａｃａｃａｅ）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）、プレボテーラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｄｉｓｉｅｎｓ）、モラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ；２３７）、スミセラ（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａｓｐ．；ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レットスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ；Ｕ１１２）、カンジダタス・メタノプラズマ・ターミタム（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａｔｅｒｍｉｔｕｍ）、カンジダタス・パセイバクター（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｉｂａｃｔｅｒ）、及びユウバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ）を含むが、これに制限されない。

本発明の一実施例において、前記ＤＮＡ結合タンパク質がＣａｓ９タンパク質である場合、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０に突然変異（例えば、他のアミノ酸に置換）を導入した結果として、エンドヌクレアーゼ活性はなく、ニッカーゼ活性は維持する変形したＣａｓ９（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）、及びストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０とＨ８４０の全てに突然変異（例えば、他のアミノ酸に置換）を導入した結果として、エンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性がいずれもない変形したＣａｓ９タンパク質からなる群から選ばれた少なくとも一つであり得る。Ｃａｓ９タンパク質において、例えば、Ｄ１０での突然変異は、Ｄ１０Ａ突然変異（Ｃａｓ９タンパク質の１０番目の位置でアミノ酸ＤがＡに置換される）であり得、Ｈ８４０での突然変異はＨ８４０Ａ突然変異であり得る。

前記ヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有する場合、ニック（ｎｉｃｋ）は、脱アミノ酵素－媒介塩基変形（例えば、シチジンがウラジンに転換）と同時に導入されるか、塩基変形が発生した鎖又はその反対の鎖（例えば、塩基転換が発生した鎖の反対側の鎖）に順次に、いずれの順にも導入され得る（例えば、ニックは、ＰＡＭが位置した鎖の反対の鎖にあるＰＡＭ配列の５’末端方向に３番目のヌクレオチド位置と４番目のヌクレオチド位置との間に導入される）。ヌクレアーゼ突然変異（例えば、アミノ酸置換など）は、ヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で発生し得る。

本発明の一実施例において、前記ストレプトコッカス・ピオゲネスから由来したＣａｓ９タンパク質の場合、前記突然変異は、１０番目の位置の触媒アスパラギン酸（Ｄ１０）、７６２番目の位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目の位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目の位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目の位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、及び９８６番目の位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）からなる群から選ばれた少なくとも一つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換するものであり得る。具体的には、Ｃａｓ９のＨ８３９、Ｈ８４０、及びＮ８６３からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体を含むことができる。具体的には、Ｃａｓ９のＮ８６３、Ｈ８４０－Ｎ８６３、又はＨ８３９－Ｈ８４０－Ｎ８６３のアミノ酸は、他のアミノ酸に置換された変異体を含むことができる。Ｈ８４０Ａ以外にも、一部の触媒ドメインを除去して製造されたＤ１０ＡＳｐＣａｓ９ニッカーゼＳｐＣａｓ９ニッカーゼも使用され得る。

本発明の一部の実施例において、前記融合タンパク質は、ガイドＲＮＡをさらに含むことができる。前記ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）からなる群から選ばれた少なくとも一つであり得る。具体的には、これは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体であるか、ｃｒＲＮＡ又はその一部及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はその一部がオリゴヌクレオチドリンカーによって連結された単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。

前記アデニン脱アミノ酵素変異体及び前記ＤＮＡ結合タンパク質は、互いに直接又はペプチドリンカーを介して融合された融合タンパク質の形態（例えば、Ｎ－からＣ－末端方向にアデニン脱アミノ酵素変異体－ＤＮＡ結合タンパク質の順に存在（すなわち、アデニン脱アミノ酵素変異体のＣ－末端に融合されたＤＮＡ結合タンパク質）、又はＮ－からＣ－末端方向にＤＮＡ結合タンパク質－アデニン脱アミノ酵素変異体の順に存在（すなわち、ＤＮＡ結合タンパク質のＣ－末端に融合されたアデニン脱アミノ酵素変異体））、アデニン脱アミノ酵素変異体又はこれをコードするｍＲＮＡ及びＤＮＡ結合タンパク質又はこれをコードするｍＲＮＡの混合物、アデニン脱アミノ酵素変異体－暗号化遺伝子及びＤＮＡ結合タンパク質－暗号化遺伝子を全て運搬するプラスミド（例えば、前記説明した融合タンパク質をコードするように配列された二つの遺伝子、アデニン脱アミノ酵素変異体発現プラスミド及びＤＮＡ結合タンパク質発現プラスミドの混合物、又はアデニン脱アミノ酵素変異体－暗号化遺伝子及びＤＮＡ結合タンパク質－暗号化遺伝子をそれぞれ運搬するプラスミド）として使用され得る。

本発明の一実施例において、前記融合タンパク質は、シトシン脱アミノ酵素をさらに含むことができる。前記シトシン脱アミノ酵素は、ヌクレオチド（例えば、二重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに存在するシトシン）で発見されるシトシンをウラシルに転換する活性（Ｃ－Ｕ転換活性又はＣ－Ｕ編集活性）を有する任意の酵素を意味する。前記シトシン脱アミノ酵素は、標的配列に連結されたＰＡＭ配列が存在する鎖に位置したシトシンをウラシルに転換する。本発明の一実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素は、バクテリア、古細菌、ヒト及びサルなどの霊長類、ラット及びマウスなどのげっ歯類などを含む哺乳類から由来し得るが、これに制限されない。例えば、前記シトシン脱アミノ酵素は、ウミヤツメからのＰｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓｃｙｔｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ１）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）からのＤｄｄＡ_ｔｏｘ、及びＡＰＯＢＥＣ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ；アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様）からなる群から選ばれた少なくとも一つであり得るが、これに制限されない。

本発明の一部の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素は、野生型ウミヤツメＣＤＡ１（ｐｍＣＤＡ１）又はその触媒ドメインである。本発明の一部の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素は、ｐｍＣＤＡ１配列で一つ以上の突然変異を含み、ｐｍＣＤＡ１の編集効率、及び／又は基質編集選好度が特定の需要に応じて変化する。

ｐｍＣＤＡ１は、次のようなアミノ酸配列を有する：

ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＩＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶＳＲＧＳＧ（配列番号２）

本発明の一部の実施例において、脱アミノ酵素の例示として、ＤｄｄＡ_ｔｏｘは、細胞毒性であるので、宿主細胞での毒性を避けるために二つの非活性の半分に分割され、それぞれは、ＤｄｄＡ由来シトシン塩基エディター（ＤｄｄＡ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ、ＤｄＣＢＥ）でＤＮＡ結合タンパク質に融合される。機能性脱アミノ酵素は、二つの非活性の半分がＤＮＡ結合タンパク質によって合されるとき、標的ＤＮＡ部位で再度組み立てられる。全長ＤｄｄＡ_ｔｏｘは、次のようなアミノ酸配列を有する：

ＧＳＹＡＬＧＰＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＤＡＧＧＬＥＳＫＶＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＥＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＡＫＭＴＶＶＰＰＥＧＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＫＶＦＴＧＮＳＮＳＰＫＳＰＴＫＧＧＣ（配列番号３）、これは、バークホルデリア・セノセパシアのＰＤＢ受託番号６Ｕ０８＿Ａに相当し、６Ｕ０８＿ＡのＤｄｄＡと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むその断片又は変異体を含むことができる。

本発明の他の実施例において、例えば、前記ＡＰＯＢＥＣは、次のような群から選ばれた少なくとも一つであり得るが、これに制限されない：

ＡＰＯＢＥＣ１：ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）ＡＰＯＢＥＣ１（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２９１４９５．１、ＮＰ＿００１６３５．２、ＮＰ＿００５８８０．２など；遺伝子（ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ；前記羅列した相応するタンパク質の順に説明される）：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１３０４５６６．１、ＮＭ＿００１６４４．４、ＮＭ＿００５８８９．３など）、ハツカネズミ（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＡＰＯＢＥＣ１（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２７８６３．１、ＮＰ＿１１２４３６．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３４３９１．１、ＮＭ＿０３１１５９．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ２：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ２（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６７８０．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６７８９．３など）、マウスＡＰＯＢＥＣ２（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３３８２４．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００９６９４．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２５７３４０．１、ＮＰ＿００４８９１．４など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２７０４１１．１、ＮＭ＿００４９００．４など）、ハツカネズミＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１５３８８７．１、ＮＰ＿００１３３３９７０．１、ＮＰ＿０８４５３１．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１６０４１５．１、ＮＭ＿００１３４７０４１．１、ＮＭ＿０３０２５５．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５５３２３．２など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４５０８．２など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｅを包含）：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６８９６３９．２など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５２４２６．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６６０３４１．２、ＮＰ＿００１００６６６７．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１４５２９８．５、ＮＭ＿００１００６６６６．１など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８５９４．１、ＮＰ＿００１３３６３６５．１、ＮＰ＿００１３３６３６６．１、ＮＰ＿００１３３６３６７．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１８２２．３、ＮＭ＿００１３４９４３６．１、ＮＭ＿００１３４９４３７．１、ＮＭ＿００１３４９４３８．１など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１５９４７４．２、ＮＰ＿００１１５９４７５．２、ＮＰ＿００１１５９４７６．２、ＮＰ＿８６１４３８．３など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１６６００２．２、ＮＭ＿００１１６６００３．２、ＮＭ＿００１１６６００４．２、ＮＭ＿１８１７７３．４など）；

ＡＰＯＢＥＣ４（ＡＰＯＢＥＣ３Ｅを包含）：ホモ・サピエンスＡＰＯＢＥＣ４（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿９８２２７９．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０３４５４．２など）；マウスＡＰＯＢＥＣ４（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０７４６６６．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０８１１９７．１など）；及び

活性化誘導シチジン脱アミノ酵素（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＡＩＣＤＡ又はＡＩＤ）：ホモ・サピエンスＡＩＤ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１３１７２７２．１、ＮＰ＿０６５７１２．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１３３０３４３．１、ＮＭ＿０２０６６１．３など）；マウスＡＩＤ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３３７７５．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００９６４５．２など）、その他。

前記シトシン脱アミノ酵素は、非毒性全長脱アミノ酵素（すなわち、単量体シトシン脱アミノ酵素）であるか、分離された第１及び第２ドメインを含む二つの分割された形態（すなわち、二量体脱アミノ酵素）であり得、それぞれは、脱アミノ酵素活性がないことを特徴とすることができる。

本発明の他の実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、ＤＮＡ結合タンパク質、又はシトシン脱アミノ酵素又はその変異体のＮ－又はＣ－末端に結合することができる。例えば、前記ＤＮＡ結合タンパク質がＺＦＰで、前記アデニン脱アミノ酵素変異体がＴａｄＡ８ｅ変異体で、前記シトシン脱アミノ酵素又はその変異体がＤｄｄＡ_ｔｏｘである場合、これらは次の順に含まれ得るが、これに制限されない：ＺＦＰ－ＴａｄＡ８ｅ変異体－ＤｄｄＡ_ｔｏｘ、ＺＦＰ－ＤｄｄＡ_ｔｏｘ－ＴａｄＡ８ｅ変異体、ＴａｄＡ－ＤｄｄＡ_ｔｏｘ－ＺＦＰ、又はＤｄｄＡ_ｔｏｘ－ＴａｄＡ８ｅ変異体－ＺＦＰ。

本発明の一部の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素が分割された形態で含まれており、前記ＤＮＡ結合タンパク質がジンクフィンガータンパク質である場合、前記シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＣ－末端は前記ジンクフィンガータンパク質のＮ－末端に結合し（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）、前記シトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＮ－末端はジンクフィンガータンパク質のＣ－末端に結合し（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）（ＮＣ構成）、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、前記ジンクフィンガータンパク質のＣ－末端（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）、前記シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＮ－末端又はＣ－末端、ジンクフィンガータンパク質のＮ－末端（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）、又は前記シトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。

本発明の多様な実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、次のようなものに結合することができる：

シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＮ－末端に結合されたジンクフィンガータンパク質のＣ－末端（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）、及びシトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＮ－末端に結合されたジンクフィンガータンパク質のＣ－末端（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）（ＣＣ構成）；

シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＮ－末端に結合されたジンクフィンガータンパク質のＣ－末端（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）、及びシトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＣ－末端に結合されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端（ＣＮ構成）；又は

シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＣ－末端に結合されたジンクフィンガータンパク質のＮ－末端（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）、及びシトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＣ－末端に結合されたジンクフィンガータンパク質のＮ－末端（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）（ＮＮ構成）。

したがって、本発明の一部の実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、ジンクフィンガータンパク質のＣ－末端（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）、シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＮ－末端又はＣ－末端、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）、又はシトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。

本発明の一部の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素が分割形態で、ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥである場合、前記シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインは第１ＴＡＬＥに結合し、前記シトシン脱アミノ酵素の第２ドメインは第２ＴＡＬＥに結合し、それぞれは、Ｎ’－ＴＡＬＥ－第１ドメインＤＤＤＡ－Ｃ’及びＮ’－ＴＡＬＥ－第２ドメインＤＤＤＡ－Ｃ’の構造を有する。前記アデニン脱アミノ酵素変異体は、シトシン脱アミノ酵素の第１ドメインのＮ－末端又はＣ－末端、又はシトシン脱アミノ酵素の第２ドメインのＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。

本発明の一実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素が全長形態で含まれ、ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥである場合、単一ＴＡＬＥモジュール及びＮＣ方向のシトシン脱アミノ酵素を含む単一ＴＡＬＥモジュールを含み、ここで、アデニン脱アミノ酵素変異体は、前記単一ＴＡＬＥモジュールのＣ－末端、又は前記シトシン脱アミノ酵素のＮ－又はＣ－末端に結合することができる。

本発明の他の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素が全長形態で含まれ、ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥである場合、二重ＴＡＬＥモジュールが含まれ得る。第１ＴＡＬＥモジュール及びシトシン脱アミノ酵素はＮ－Ｃ方向に含まれ、アデニン脱アミノ酵素変異体及び第２ＴＡＬＥを含む第２ドメインがさらに含まれ得る。Ｎ’－ＴＡＬＥ－シトシン脱アミノ酵素－Ｃ’及びＮ’－ＴＡＬＥ－アデニン脱アミノ酵素変異体－Ｃ’の構造で、前記アデニン脱アミノ酵素変異体はＴＡＬＥのＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。

本発明の一実施例において、前記融合タンパク質は、ＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ウラシルグリコシラーゼ抑制剤）をさらに含むことができる。ＵＧＩは、ＤＮＡでのＵの除去を促進する、突然変異ＤＮＡ復旧酵素であるＵＤＧ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）の活性を抑制することによって塩基編集の効率を増加させることができる。

本発明の他の実施例において、前記ＤＮＡは、核ＤＮＡ又は細胞小器官ＤＮＡであり得る。

本発明の一実施例において、前記融合タンパク質は、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ；核局所化信号）をさらに含むことができる。前記核局所化信号タンパク質は、例えば、シミアンウイルス４０大型腫瘍抗原（ＳＶ４０大型Ｔ抗原）から由来し得るが、これに制限されない。前記核局所化信号タンパク質は、例えば、次のようなアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない：

ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）

本発明の他の実施例において、前記融合タンパク質は、ＭＴＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ；ミトコンドリア標的配列）又はＣＴＰ（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｉｔｐｅｐｔｉｄｅ；葉緑体移行ペプチド）をさらに含むことができる。前記ミトコンドリア標的配列タンパク質は、例えば、ＳＯＤ２－ＭＴＳ又はＣＯＸ８Ａ－ＭＴＳであり得、次のようなアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない：

ＳＯＤ２－ＭＴＳ：ＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＶＬＧＹＬＧＳＲＱＫＨＳＬＰＤ（配列番号５）

ＣＯＸ８Ａ－ＭＴＳ：ＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫＩＨＳＬ（配列番号６）。

前記葉緑体移行ペプチドタンパク質は、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＲＥＣＡ１から由来し得るが、これに制限されない。前記葉緑体移行ペプチドタンパク質は、例えば、次のようなアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない：

ＭＤＳＱＬＶＬＳＬＫＬＮＰＳＦＴＰＬＳＰＬＦＰＦＴＰＣＳＳＦＳＰＳＬＲＦＳＳＣＹＳＲＲＬＹＳＰＶＴＶＹＡＡＫ（配列番号７）

本発明の他の実施例において、前記融合タンパク質は、ＮＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒｅｘｐｏｒｔｓｉｇｎａｌ；核外搬出信号）をさらに含むことができる。前記核外搬出信号タンパク質は、例えば、ＭＶＭ（Ｍｉｎｕｔｅｖｉｒｕｓｏｆｍｉｃｅ；マウス微細ウイルス）から由来し得るが、これに制限されない。前記核外搬出信号タンパク質は、例えば、次のようなアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない：

ＶＤＥＭＴＫＫＦＧＴＬＴＩＨＤＴＥＫ（配列番号８）

本発明の一実施例において、前記信号ペプチドが融合タンパク質に付着するとき、その構造は次の通りである：信号ペプチド－ＤＮＡ結合タンパク質－脱アミノ酵素。本発明の他の実施例において、前記構造は、信号ペプチド－脱アミノ酵素－ＤＮＡ結合タンパク質であり得る。本発明の一実施例において、前記核外搬出信号タンパク質、ＣＴＰ（葉緑体移行ペプチド）、又はこれをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ結合タンパク質、シトシン脱アミノ酵素（ＤｄＣＢＥ）、又はこれをコードするポリヌクレオチドのＮ－末端に付着し得る。

本発明の多様な実施例において、前記融合タンパク質は、ニッカーゼ、例えば、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＨ変異体、又はＮｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ（Ｃ）をさらに含み得るが、これに制限されない。ＭｕｔＨは、ＭｕｔＬに結合すると活性化される弱いエンドヌクレアーゼである。これは、メチル化されていないＤＮＡと半メチル化されたＤＮＡのメチル化されていない鎖をニッキング（ｎｉｃｋｉｎｇ）するが、完全にメチル化されたＤＮＡはニッキングしない。その一方で、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ（Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ）は、異種二量体制限エンドヌクレアーゼＲ．ＢｓｐＤ６Ｉの大きいサブユニットである。これは、短い特定のＤＮＡ配列５’’－ＧＡＧＴＣを認識し、認識部位の下流の３’’－末端に向かって４個のヌクレオチドの距離でｄｓＤＮＡの上端の鎖のみを切断する。結果的に生成された鎖特異的ニックは、一時的な単一鎖ＤＮＡの生成を誘導する。ＴａｄＡ変異体は、単一鎖ＤＮＡを特異的に標的とする核塩基脱アミノ酵素であるので、ニック部位に非常に近接し、Ａ－ｔｏ－Ｇ編集を誘導する能力を有する。本発明の他の実施例において、前記ニッカーゼをさらに含む融合タンパク質は、第１融合タンパク質及び第２タンパク質を含む二量体形態であり得る。前記第１融合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、及びアデニン脱アミノ酵素変異体を含むことができ、前記第２タンパク質は、他のＤＮＡ結合タンパク質、及びニッカーゼを含むことができる。

本発明の一実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」と相互交換可能に使用される。これは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体の重合体形態を含むことができる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知の又は公知となっていない任意の機能を行うことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの一つ以上の変形したヌクレオチドを含むことができる。前記ヌクレオチド構造に対する変形は、重合体の組み立て前後に可能である。

前記核酸は、ＲＮＡ配列、特に、ｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。

前記核酸は、アデノ随伴ウイルスベクター（Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒ、ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター（ＡｄｅｎｏｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒ、ＡｄＶ）、レンチウイルスベクター（ＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒ、ＬＶ）、レトロウイルスベクター（ＲｅｔｒｏｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒ、ＲＶ）、又はシミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ４０、ＳＶ４０）ｏｒｉ、牛パピローマウイルス（ｂｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、ＢＰＶ）ｏｒｉ又はエプスタイン・バー核抗原（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ、ＥＢＶ）を含むエピソームベクターなどの他のウイルスベクターを用いて伝達することができる。本発明の多様な実施例において、前記伝達は、非ウイルスベクターを用いるか、プラスミド又はｍＲＮＡ伝達を通じて行われる場合もある。

前記ベクターは、局所注入方法（例えば、病変又は標的部位に直接注入）、電気穿孔、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノ粒子、ＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ；タンパク質転位ドメイン）融合タンパク質方法、又はこれと類似する方法で生体内又は細胞内に伝達され得る。

前記タンパク質を発現する手段として、プラスミドベクター、コスミドベクター及びバクテリオファージベクターなどの公知の発現ベクターを使用することができる。このようなベクターは、ＤＮＡ組換え技術を用いて任意の公知の方法によって当業者が容易に製造することができる。

組換え発現ベクターは、宿主細胞内での発現を容易にする形式で核酸を運搬するように設計された。発現を目的とする核酸配列は、組換え発現ベクターに作動的に連結され、このベクターは、特定の宿主細胞によって選択できる一つ以上の調節要素を備えている。組換え発現ベクターにおいて、「作動的に連結された」は、関心のあるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で（例えば、試験管内の転写／翻訳システムで、又は前記ベクターが宿主細胞に導入されるときの宿主細胞で）調節要素に連結されたことを意味する。

本発明の一実施例において、前記融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための塩基編集用組成物を提供する。前記融合タンパク質については、上記で詳細に説明した。

本発明の一実施例において、前記塩基編集用組成物の融合タンパク質は、シトシン脱アミノ酵素をさらに含むことができる。前記シトシン脱アミノ酵素は上記で説明した。本発明の一部の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素は、２個の分割体形態で存在することができ、前記融合タンパク質は、前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体を含む第１融合タンパク質と、前記シトシン脱アミノ酵素の第２分割体を含む第２融合タンパク質とを含むことができる。前記第１分割体は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含むことができ、第２分割体は、配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない。本発明の一実施例として、例えば、二つのＴＡＬＥＤは、Ｇ１３９７でＮ－末端ＤｄｄＡ_ｔｏｘ半分の分割体に融合された左側又は右側ＴＡＬＥ（それぞれＬ－１３９７Ｎ又はＲ－１３９７Ｎ）、及びＧ１３９７とＴａｄＡ８ｅでＣ－末端ＤｄｄＡ_ｔｏｘ半分の分割体に融合された右側又は左側ＴＡＬＥ（Ｒ－１３９７Ｃ－ＡＤ又はＬ－１３９７Ｃ－ＡＤ）で構成され得る。

本発明の多様な実施例において、前記塩基編集用組成物は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を伴う著しく減少したオフターゲット効果を示すことができる。本発明の他の実施例において、前記塩基編集用組成物は、活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記塩基編集用組成物は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

本発明の他の実施例において、標的ＤＮＡを含む細胞に塩基編集用組成物を伝達する段階を含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集方法を提供する。

前記細胞は、真核細胞（例えば、酵母などの菌類、真核動物及び／又は真核植物由来細胞（例えば、胚細胞、幹細胞、体細胞、生殖細胞など）、真核動物（例えば、ヒト、サル、霊長類、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラットなど）、又は真核植物（例えば、緑藻類などの藻類、トウモロコシ、大豆、小麦、米など）であり得るが、これに制限されない。

標的ＤＮＡを含む細胞に対する前記塩基編集用組成物の伝達は、体外又は体内で行われ得る。

本発明の一部の実施例において、前記標的ＤＮＡは、遺伝性疾患を有する対象者であるヒトの核ＤＮＡ、細胞小器官ＤＮＡ、又はミトコンドリアＤＮＡであり得る。

本明細書で使用される「遺伝性疾患」という用語は、遺伝子又は染色体に有害な突然変異によって発生する病理学的状態を意味する。前記遺伝性疾患の例としては、ＭＥＬＡＳ症候群（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｏｓｉｓ、ａｎｄｓｔｒｏｋｅ－ｌｉｋｅｅｐｉｓｏｄｅｓｓｙｎｄｒｏｍｅ；ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、及び脳卒中様症状症候群）、ＤＥＡＦ、レーバー遺伝性視神経症（ｌｅｂｅｒｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｏｐｔｉｃｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ、ＬＨＯＮ）、リー症候群（ｌｅｉｇｈＳｙｎｄｒｏｍｅ）、ミオパシー（Ｍｙｏｐａｔｈ）及び慢性進行性外眼筋麻痺（Ｃｈｒｏｎｉｃｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｅｘｔｅｒｎａｌｏｐｈｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ、ＣＰＥＯ）を含むが、これに制限されない。

前記方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有するアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用する場合に比べて減少したオフターゲット効果を示すことができ、ここで、オフターゲット編集は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの意図していない塩基変形を特徴とする。本発明の他の実施例において、前記方法は、配列番号１の突然変異で表現されるアミノ酸を有するアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用する場合に比べて活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記方法は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

本発明の他の実施例において、前記方法は、配列番号１で表されるアミノ酸配列でＶ１０６Ｗ突然変異を有するアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用するときに比べて減少したオフターゲット効果を示すことができ、ここで、オフターゲット編集は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を特徴とする。本発明の他の実施例において、前記方法は、配列番号１で表されるアミノ酸配列でＶ１０６Ｗ突然変異を有するアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用するときに比べて活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記方法は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

本発明の一実施例において、オフターゲット効果及び／又は活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させる方法を提供し、前記方法は、標的ＤＮＡを含む細胞に前記塩基編集用組成物を伝達する段階を含む。

本発明の一部の実施例において、前記標的ＤＮＡは、遺伝性疾患を有する対象者であるヒトの核ＤＮＡ、細胞小器官ＤＮＡ、又はミトコンドリアＤＮＡであり得る。前記遺伝性疾患は上記で定義された。前記方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有するアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用する場合に比べて減少したオフターゲット効果を示すことができ、ここで、オフターゲット編集は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を特徴とする。本発明の他の実施例において、前記方法は、配列番号１で表されるアミノ酸を有するアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用する場合に比べて活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記方法は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

しかし、本発明の他の実施例において、前記アデニン脱アミノ酵素変異体又は前記融合タンパク質の、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集及び／又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集におけるオフターゲット効果の減少、又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集及び／又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集におけるオフターゲット効果の減少のための組成物製造用途を提供する。前記アデニン脱アミノ酵素変異体又は前記融合タンパク質は、上記で詳細に説明した。

本発明の一実施例において、前記融合タンパク質は、シトシン脱アミノ酵素をさらに含むことができる。前記シトシン脱アミノ酵素は上記で説明した。本発明の一部の実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素は、２個の分割体形態で存在することができ、前記融合タンパク質は、前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体を含む第１融合タンパク質と、前記シトシン脱アミノ酵素の第２分割体を含む第２融合タンパク質とを含む。前記第１分割体は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含むことができ、前記第２分割体は、配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない。

本発明の多様な実施例において、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための、及び／又はＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集におけるオフターゲット効果の減少のための前記組成物は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡで意図していない塩基変形を伴う著しく減少したオフターゲット効果を示すことができる。本発明の一実施例において、前記組成物は、活動範囲を狭めると同時に、所望でないバイスタンダー効果を減少させることができる。又は、前記組成物は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、又は少なくとも１５％の頻度で、標的ＤＮＡで任意に意図されたオフターゲット編集なしで、単一ヌクレオチド残基でのみ塩基編集を誘導することができる。

以下、本発明は、実施例を参照してより詳細に説明する。このような例は、発明を説明するためのものに過ぎなく、発明の範囲がこのような例によって制限されると解釈してはならないことは、当業者であれば理解できるだろう。

参照実施例

１．細胞株の準備

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＲＬ－１１２６８）で購入した。ＮＩＨ３Ｔ３及びＢ１６Ｆ１０細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１６５８、ＣＲＬ－６４７５）で購入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１％（ｖ／ｖ）抗生剤－抗真菌剤溶液（Ｗｅｌｇｅｎｅ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。ＮＩＨ３Ｔ３及びＢ１６Ｆ１０細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合は、１０％（ｖ／ｖ）仔ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭで、Ｂ１６Ｆ１０細胞の場合は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭで抗生剤なしで培養した。前記細胞は、５％ＣＯ_２及び３７℃で培養した。全ての細胞株は、９０％のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到逹する前に継代された。

２．ＰｙＭＯＬ分析

ＡＢＥ８ｅ（ＰＤＢ受託番号６ＶＰＣ）構造は、ＰＤＢでダウンロードし、ＰｙＭＯＬｖ．２．５．４で視覚化した。Ｃａｓ９、単一ガイドＲＮＡ、及び二重鎖ＤＮＡを含む一部の要素はＰＤＢファイルから除外した。アデノシン脱アミノ化反応の遷移状態類似体である８ＡＺ、及びＴａｄＡ単量体は維持した。ＤＮＡと接触するものとして知られている残基を含む、８ＡＺ付近にある１１個の残基（Ｖ２８、Ｖ３０、Ｎ４６、Ａ４８、Ｉ４９、Ｖ８２、Ｆ８４、Ｖ１０６、Ｎ１０８、Ｋ１１０、及びＲ１１１）が選択された。

３．プラスミド構築

特定の部位を標的とするＤｄＣＢＥ、ＤｄｄＡ－分割ＴＡＬＥＤ（ｓＴＡＬＥＤ）、及びｍＴＡＬＥＤをコードするプラスミドを構築するために、ゲル電気泳動中、断片を分離するときに役に立つ二つの制限酵素部位の間の配列であるスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を含むプラスミドを製造した。前記プラスミドの構築様式は次の通りである。ｓＴＡＬＥＤプラスミド（ｐ３ｓ－スタッファー－ＤｄｄＡ_ｔｏｘ半分（１３９７Ｃ）－ＡＤ及びｐ３ｓ－スタッファー－ＤｄｄＡ_ｔｏｘ半分（１３９７Ｎ））；ｍＴＡＬＥＤプラスミド（ｐ３ｓ－スタッファー－Ｅ１３４７ＡＤｄｄＡ_ｔｏｘ全体－ＡＤ）。このプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（ＤｄＣＢＥ、＃１８７１６８、＃１８７１７１、＃１８７１７３、＃１７８１７４；ｓＴＡＬＥＤ、＃１８７１６７、＃１８７１６９、＃１８７１７０、＃１８７１７２；ｍＴＡＬＥＤ、＃１８７１６３、＃１８７１６６）で購入した。特定の部位を標的とするＤｄＣＢＥ、ｓＴＡＬＥＤ及びｍＴＡＬＥＤをコードするプラスミドは、下記表２に表示したように、オーダーメイド設計されたＴＡＬＥアレイ配列を挿入して構築した。前記スタッファー配列を除去するために、ＢｓａＩ又はＢｓｍｂＩ（ＮＥＢ）で消化した各プラスミド、及びＩＤＴが合成したオーダーメイド設計されたＴＡＬＥアレイ配列を含む挿入物を、ＨｉＦｉＤＮＡ組み立てキット（ＮＥＢ）を用いて前記消化されたベクターに挿入した。又は、所望のＴＡＬＥＤ構築は、マスターベクターをＢｓａＩ又はＢｓｍｂＩで消化し、スタッファーで部位を切断した後、ゴールデンゲート（ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ）方法を用いて当該位置に６個のＴＡＬＥアレイを組み立てて生成した。

４．細胞培養及び形質感染

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１％抗生剤－抗真菌剤溶液（Ｗｅｌｇｅｎｅ）が含まれたＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。ＮＩＨ３Ｔ３（ＣＲＬ－１６５８、ＡＴＣＣ）及びＢ１６Ｆ１０（ＣＲＬ－６４７５、ＡＴＣＣ）細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合は、１０％（ｖ／ｖ）仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭで、Ｂ１６Ｆ１０細胞の場合は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭで抗生剤なしで培養した。細胞株は、３７℃で５％ＣＯ_２に維持され、９０％のコンフルエンシーに到逹する前に継代し、その時期は、特定の細胞株の倍加期間（ｄｏｕｂｌｉｎｇｐｅｒｉｏｄ）によって異なる。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合、形質感染前に４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１ウェル当たり７．５×１０^４細胞の密度で分注した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．５μＬを用いてプラスミド（合計１μｇ）で細胞を形質感染させた。ｓＴＡＬＥＤペア（ｐａｉｒ）、ＤｄＣＢＥペア、及びｓｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ－塩基エディターを伝達する場合、プラスミドの総量は１μｇ（それぞれ５００ｎｇ）であった。単一構築物を使用した場合、形質感染されたプラスミドの量は５００ｎｇであった。９６時間後、形質感染された細胞を収穫した。ＮＩＨ３Ｔ３及びＢ１６Ｆ１０細胞の場合、形質感染１８時間乃至２４時間前に２４ウェル細胞培養プレート（ＳＰＬ、ソウル、韓国）に１ウェル当たり１×１０^５細胞の密度で分注した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたリポフェクションは、各ｓＴＡＬＥＤ暗号化プラスミド５００ｎｇで行い、トータルプラスミドＤＮＡ１０００ｎｇを構成した。ｍＴＡＬＥＤの場合は、プラスミド５００ｎｇを使用した。細胞は、形質感染３日後に収穫した。

５．トランスクリプトームシーケンシング

トータルＲＮＡは、形質感染後４８時間又は９６時間目に製造業社の指針に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡキット（ＭＮ＃Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて分離した。ＲＮＡライブラリは、ＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄＴｏｔａｌＲＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＧｏｌｄキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて準備した。ＲＮＡライブラリの品質は、Ｄ１０００ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）がある２２００ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて評価した。トータルＲＮＡシーケンシングは、ＭａｃｒｏｇｅｎのＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とペアードエンドシーケンシングシステム（２ｘ１００ｂｐ）を用いて行った。

６．ＲＮＡ変異呼び出し

ＲＮＡシーケンシングでＮＧＳデータを分析するために、ＣＲＩＳＰＲＤＮＡ塩基エディターのＲＮＡオフターゲット分析に対して以前に使用されたＲＮＡ変異呼び出しパイプラインを参照して製造した。簡単に言えば、ｆａｓｔｑシーケンシング判読は、ＳＴＡＲアライナー（ａｌｉｇｎｅｒ）（ｖ．２．７．１０ａ）を用いてｈｇ３８ヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８、発売ｖ１０５）に整列された。生成されたＢＡＭファイルは、ＧＡＴＫ（ｖ．４．２．４．１）ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓ、ＢａｓｅＲｅｃａｌｉｂｒａｔｏｒ、及びＡｐｐｌｙＢＱＳＲで処理された。ＲＮＡ塩基編集変異は、ＧＡＴＫＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを用いて呼び出された。ＲＮＡ変異遺伝子座は、対照群サンプルの遺伝子座と比較し、次の基準に従ってフィルタリングされた。（１）最小１０の判読の深さを有する遺伝子座は維持された。（２）最小２の変異数を有する遺伝子座は維持された。（３）対照群サンプルにも存在する遺伝子座は除去された。（４）前記対照群サンプルでシーケンシングの深さが不足するために決定できない遺伝子座は除外した。反復実験セット－１の場合は、未処理の反復実験セット－２がフィルタリングのための対照群として使用され、反復実験セット－２の場合は、未処理の反復実験セット－１が対照群として使用された。Ａ－ｔｏ－Ｇ編集は、陽性鎖でＡ－ｔｏ－Ｇ編集を有するか、陰性鎖でＴ－ｔｏ－Ｃ編集を有するＲＮＡ変異遺伝子座の数を数えた。Ｃ－ｔｏ－Ｔ編集は、陽性鎖でＣ－ｔｏ－Ｔ編集を有するか、陰性鎖でＧ－ｔｏ－Ａ編集を有するＲＮＡ変異遺伝子座の数を数えた。

７．ゲノムＤＮＡ分析のための細胞溶解

成長培地を除去した後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｑｉａｇｅｎ）５μＬが補充された細胞溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）１００μＬで処理した。前記細胞は、５５℃で１時間にわたって培養した後、９５℃で１０分間培養して溶解した。ゲノムＤＮＡ混合物は、標的ディープシーケンシングに適用された。

８．標的ディープシーケンシング

標的ディープシーケンシングのためのＮＧＳライブラリは、重畳ＰＣＲを用いて生成された。標的領域は、最初はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＰＣＲで増幅された。アンプリコンは、ＴｒｕＳｅｑＤＮＡ－ＲＮＡＣＤインデックスを含むプライマーを用いてＰＣＲで再度増幅し、アダプター及びインデックス配列で各断片を標識し、ＮＧＳライブラリを構築した。ＰＣＲプライマーは、下記表３乃至表６に記載された。最終ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット（ＭＧｍｅｄ）で精製し、ＭｉｎｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングした。ターゲットディープシーケンシングデータの塩基編集頻度は、ソースコード（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉｂｓ－ｃｇｅ／ｍａｕｎｄ）で測定した。

９．培養された哺乳類細胞でのＲＮＡ精製及び標的ＲＮＡシーケンシング

ＲＮＡは、製造業社の指針に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡＰｌｕｓキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて培養された細胞から抽出された。その後、ＲＮＡも、製造業社の指針に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ逆転写酵素キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを生成した。その後、関心領域を下記表７乃至表８に表示されたプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。増幅された領域は、前記説明した標的ディープシーケンシング手順を用いてシーケンシングした。

１０．ＤＮＡオンターゲット編集頻度に対するＲＮＡオフターゲット編集頻度の相対的な比率

６個の代表的な部位で変異体のＤＮＡオンターゲット編集頻度に対するＲＮＡオフターゲット編集頻度を分析するために、前記変異体のＤＮＡオンターゲット活性及びＲＮＡオフターゲット活性をｓＴＡＬＥＤ値に正規化した。その後、正規化されたＤＮＡオンターゲット値は、下記のように正規化されたＲＮＡオフターゲット値で割り、下記に示した通りである。

正規化されたＤＮＡオンターゲット値及びＲＮＡオフターゲット値がいずれも１であるので、野生型ｓＴＡＬＥＤの場合、この値は１である。相対的な比率が高いほど、オンターゲット活性に比べてオフターゲット活性が低いことを示す。

１１．全体のミトコンドリアゲノムシーケンシング

全体のミトコンドリアゲノムシーケンシングの場合、ＰＣＲ増幅、ＮＧＳライブラリ生成、及びＮＧＳの三つの手順が必要であった。最初に、細胞は、成長培地を除去した後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Ｑｉａｇｅｎ）５μＬを補充した細胞溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）１００μＬで処理した。前記細胞は、５５℃で１時間にわたって培養した後、９５℃で１０分間培養して溶解した。ミトコンドリアＤＮＡは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）を用いてＰＣＲで増幅された。プライマー偏向を減少させるために、前記表３乃至表６に表示された僅かに重なるプライマーの二セットを用いてＰＣＲを行った。各プライマーペアは、ミトコンドリアＤＮＡのほぼ５０％を増幅した。その後、ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（ＭＧｍｅｄ）で精製した。最後に、ＮｅｘｔｅｒａＤＮＡＣＤインデックスがあるＩｌｌｕｍｉｎａＤＮＡＰｒｅｐキットを用いて精製されたＰＣＲ産物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＮＧＳライブラリを生成した。その後、前記ライブラリをプーリングしてからＭｉｎｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に移した。

１２．ミトコンドリアゲノムワイドオフターゲット編集分析

全体のミトコンドリアゲノムシーケンシングでＮＧＳデータを分析するために、ミトコンドリアゲノムでオフターゲット効果を調査するのに使用される方法を用いた。最初に、Ｆａｓｔｑ配列は、ＢＷＡ（ｖ．０．７．１７）を用いてＧＲＣｈ３８（発売ｖ１０２）参照ゲノムに整列した後、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ．１．９）で判読ペアリング情報とフラグを修正し、ＢＡＭファイルを生成した。その後、ＲＥＤＩｔｏｏｌｓ（ｖ．１．２．１）のＲＥＤＩｔｏｏｌＤｅｎｏｖｏ．ｐｙスクリプトを用いて転換率＞０．１％であるミトコンドリアゲノムの全てのチミンとアデニンを発見した。処理されたサンプルと未処理のサンプルのいずれにおいても転換率≧１０％である位置は、細胞株でＳＮＶとして識別して除去した。構造のオンターゲット部位は除外された。残りの部位はオフターゲットサイトとして見なされ、編集頻度＞０．１％である編集されたＡ／Ｔヌクレオチドの数を数えた。Ａ／ＴからＧ／Ｃへの平均編集頻度は、下記表示したように、オフターゲット部位内の各塩基位置での転換率を平均し、ミトコンドリアゲノムの全ての塩基に対して計算した。

ミトコンドリアゲノムワイドのグラフは、全体のミトコンドリアゲノムにおいて編集頻度が≧１％であるオンターゲット及びオフターゲット部位の転換率をプロッティングして構成された。

１３．細胞生存率検定

細胞生存率検定は、プラスミド形質感染後２日又は４日目にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ＭＴＳ検定は、比色法で生存可能な細胞の数を測定した。細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎで処理し、生物学的に還元された生成物の定量は、製造業社の指針に従って４９０ｎｍでの吸光度を記録して測定した。

実施例１：ミトコンドリアＤＮＡ－標的ＴＡＬＥＤｓは、トランスクリプトームワイドオフターゲット編集を誘導する。

ＣＯＸ３．１又はＮＤ１部位を標的とするＤｄｄＡ－分割ＴＡＬＥＤｓ（ｓＴＡＬＥＤｓ）がヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞で所望でないオフターゲットＲＮＡ編集を誘発できるかどうかを調査するために、形質感染後２日目の細胞から分離した全体のＲＮＡのトランスクリプトームワイドシーケンシングを前記参照例示を参照して行った。二つの独立した生物学的複製本のトランスクリプトームワイドシーケンシングは、Ｇ１３９７でＮ－末端ＤｄｄＡ_ｔｏｘ半分の分割体に融合された左側又は右側ＴＡＬＥ（それぞれＬ－１３９７Ｎ又はＲ－１３９７Ｎ）、及びＧ１３９７とＴａｄＡ８ｅでＣ－末端ＤｄｄＡ_ｔｏｘ半分の分割体に融合された右側又は左側ＴＡＬＥ（Ｒ－１３９７Ｃ－ＡＤ又はＬ－１３９７Ｃ－ＡＤ）で構成された二つのｓＴＡＬＥＤｓが最小７％の頻度で＞５０，０００個の部位で塩基転換を誘導することを示した（図１）。このような塩基転換のほとんど（＞９９．８％）は、Ｃ－ｔｏ－Ｔ編集ではないＡ－ｔｏ－Ｇ編集（ＲＮＡで逆転写されたｃＤＮＡ）であり、これは、シトシン脱アミノ酵素ではないアデニン脱アミノ酵素がこのような単一ヌクレオチド変形を担当することを示す。対照的には、同一の部位又は単一ｓＴＡＬＥＤサブユニット（Ｌ－１３９７Ｎ又はＲ－１３９７Ｎ）を標的とするＤｄＣＢＥｓは、陰性対照群として使用し、このようなオフターゲットＲＮＡ編集を誘導しなかった。このような結果は、ＴａｄＡ８ｅ（Ｌ－１３９７Ｃ－ＡＤ又はＲ－１３９７Ｃ－ＡＤ）を含む他のサブユニットがＲＮＡでＡ－ｔｏ－Ｉ変形によって観察されるＡ－ｔｏ－Ｇ転換を担当することを示唆する。

ＴＡＬＥＤｓによって誘導された所望でないトランスクリプトームワイドオフターゲットＡ－ｔｏ－Ｉ転換を避けるか最小化するために、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ－ガイドアデニン塩基エディター（ＡＢＥｓ）に統合されるときにオフターゲットＲＮＡ編集を減少させるものとして知られているＶ１０６Ｗ、Ｖ１０６Ｇ、Ｋ２０Ａ／Ｒ２１Ａ（二重突然変異）、又はＦ１４８Ａを含む部位特異的突然変異をＴａｄＡ８ｅに導入した。トランスクリプトームワイドシーケンシングは、ＴａｄＡ８ｅでこのような突然変異を統合したｓＴＡＬＥＤ変異体がＤＮＡオンターゲット編集効率を維持しながらも、オフターゲットＡ－ｔｏ－Ｇ編集数を、完全ではなくても、相当減少させたことを示す（図１）。よって、このような部位特異的突然変異を有するＣｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体は、４４，６２７（Ｆ１４８Ａ）から１０７，３０４（Ｋ２０Ａ／Ｒ２１Ａ）までの部位でＲＮＡオフターゲット編集を誘導し、元のｓＴＡＬＥＤ（１３２、０６４個のＡ－Ｇ編集）に比べて当該部位の数を１８．７％（＝（１３２，０６４－１０７，３０４）／１３２，０６４）から６６．２％（＝（１３２，０６４－４４，６２７）／１３２，０６４）に減少させた（図１ｂ及び図１ｃ）。同様に、ＮＤ１－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体は、ＲＮＡオフターゲット編集数を最小４６．２％（＝（６１，１８９－３２，９１０）／６１，１８９）（Ｋ２０Ａ／Ｒ２１Ａ）、及び最大８４．２％（＝（６１，１８９－９，６７４）／６１，１８９）（Ｖ１０６Ｇ）まで減少させた（図１ｄ及び図１ｅ）。このような結果は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ－ガイドＡＢＥｓのＲＮＡオフターゲット編集効果を減少させるのに使用された同一のＴａｄＡ８ｅ変異体がｓＴＡＬＥＤｓによる付随的損傷も減少できることを示す。しかし、最小９，６００個から最大１０７，０００個のオフターゲットＡ－ｔｏ－Ｇ編集は、最も性能が良いＴａｄＡ８ｅ変異体でも持続された。

実施例２：ＲＮＡオフターゲット編集を避けるためのＴＡＬＥＤｓのタンパク質エンジニアリング

トランスクリプトームワイドオフターゲット編集をさらに最小化するために、ＴａｄＡ８ｅ内の基質結合部位でＶ１０６を含むアミノ酸残基を突然変異させ、ＴＡＬＥＤｓをエンジニアリングした。このために、ＤＮＡに結合されたＡＢＥ８ｅの３Ｄ冷凍－電子顕微鏡構造（図２（Ａ））をベースにして、基質結合部位で１１個のアミノ酸残基を選別し、これらの残基のそれぞれをＣｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤの他の１９個のアミノ酸残基に取り替え、合計２０９（＝１１×１９）個のｓＴＡＬＥＤ変異体を製造した。参照実施例３に説明したように、生成されたｓＴＡＬＥＤペアのそれぞれをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染した。その後、形質感染後４日目にＣｏｘ３．１部位のオンターゲット編集頻度を測定した。２０９個のｓＴＡＬＥＤ変異体のうち合計１０１個のｓＴＡＬＥＤペアは、野生型ｓＴＡＬＥＤペアに比べて少なくとも５０％の効率を有し、標的ミトコンドリアＤＮＡ編集で高い活性を維持した（図３）。その後、標的ＲＮＡアンプリコンシーケンシングを用いてトランスクリプトームワイドシーケンシング分析で明らかになった６個の代表的部位で１０１個のｓＴＡＬＥＤｓのオフターゲット編集頻度を測定した（図４（Ａ））。これらの代表的部位は、Ｃｏｘ３．１－及びＮＤ１－特異的ＴＡＬＥＤｓの全てによって６０％から８０％範囲の高い頻度で突然変異された（図２（Ｂ））。標的ディープシーケンシングで測定したＲＮＡオフターゲット編集頻度は、トランスクリプトームワイドシーケンシングで推定した頻度とよく一致していた（図４（Ｂ）及び図４（Ｃ））。合計１２個のＴａｄＡ８ｅ変異体を選択し、６個の代表的な部位でＲＮＡオフターゲット編集効率を最小化すると同時に、ｍｔＤＮＡオンターゲット編集効率を維持した（図２（Ｂ））。

トランスクリプトームワイドシーケンシングを行い、１２個のｓＴＡＬＥＤ変異体が６個の代表的な部位ではない他の部位でオフターゲット編集を避けることができるかどうかを調査した（図５）。これらの変異体は、いずれもオフターゲット編集の数を著しく減少させた。例えば、Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓを有するｓＴＡＬＥＤ変異体は、それぞれ８５２個及び８２９個の部位でのみオフターゲット編集を誘導した一方で、元のｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ（ＴａｄＡ８ｅでＶ１０６Ｗ突然変異を有するｓＴＡＬＥＤ）は、それぞれ９６，５５９個及び８１，１５６個の部位でオフターゲット編集を誘導した（図５ａ及び図５ｂ）。したがって、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓは、ＲＮＡオフターゲット編集の＞９９％を回避した。陰性対照群として使用された未処理のＤＮＡサンプルでは３１６個のＡ－ｔｏ－Ｇ編集が発見され、これは、高処理量シーケンシングのエラーによって発生した可能性が高いことを考慮したとき、このような結果は、これらのｓＴＡＬＥＤ変異体がＲＮＡオフターゲット編集をほぼ完璧に避けたことを示した。

また、これらのＴａｄＡ８ｅ突然変異が他のミトコンドリアＤＮＡ標的部位を標的とするｓＴＡＬＥＤｓに統合されるとき、ＲＮＡオフターゲット編集を減少できるかどうかをさらに調査した（図５ｃ乃至図５ｆ及び図６）。標的ＲＮＡアンプリコンシーケンシングは、ほとんどのＮＤ１－及びＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体が６個の代表的な部位でＲＮＡオフターゲット編集頻度を相当減少させたことを示した（図６（Ｃ）乃至図６（Ｆ））。また、標的ディープシーケンシングを通じてミトコンドリアＤＮＡオンターゲット編集頻度を測定した後（図６（Ａ）及び図６（Ｂ））、ＤＮＡオンターゲット編集頻度とＲＮＡオフターゲット編集頻度の比率を収得した（図６（Ｇ）及び図６（Ｈ））。このような結果に基づいて、元のｓＴＡＬＥＤ及びＣｏｘ３．１、ＮＤ１及びＮＤ６部位を標的とするｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗに比べて高いミトコンドリアＤＮＡオンターゲット活性及び低いＲＮＡオフターゲット活性を示す次の４個のＴａｄＡ８ｅ変異体、Ｖ２８Ｑ、Ｖ２８Ｒ、Ａ４８Ｗ及びＲ１１１Ｓが選別された（図６（Ｉ））。トランスクリプトームワイドシーケンシングは、これらの４個の変異体をそれぞれ有するＮＤ１－及びＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体がＲＮＡオフターゲット編集の数を大きく減少させたことを示し（図５）、これは、Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤ変異体に対する前記結果と一致する。言い換えると、ＮＤ１－及びＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ又は－Ｒ１１１Ｓ変異体は、最も差別的にＲＮＡオフターゲット編集を最も少なく誘導した（図５ｃ乃至図５ｆ）。

実施例３：操作されたＴＡＬＥＤは、バイスタンダー及びオフターゲット編集を減少させる。

ＴａｄＡ８ｅ基質結合部位に部位特異的突然変異があるｓＴＡＬＥＤ変異体は、これらの突然変異がＲＮＡ基質の活性を減少させるだけでなく、ＤＮＡ基質のアデニン脱アミノ酵素活性を潜在的に微細に調整できるので、標的部位のバイスタンダー編集及びミトコンドリアゲノムのオフターゲット編集も減少させることができる。そうではあるが、各ヌクレオチド位置で塩基編集頻度を調査した。Ｃｏｘ３．１、ＮＤ１及びＮＤ６部位特異的なｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓ変異体は、いずれも野生型ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体より狭い領域でＡ－ｔｏ－Ｉ編集を誘導した（図７）。例えば、前記Ｃｏｘ３．１部位を標的とする野生型ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ－ｖ１０６Ｗは、様々な位置、二つのＴＡＬＥ結合部位の間のスペーサー領域のみならず、ＴＡＬＥ結合部位でも＞１．１％の頻度でＡ－ｔｏ－Ｉ編集を誘導した。対照的には、Ｃｏｘ３．１－特異的ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒは、スペーサー領域の単一位置でＡ－ｔｏ－Ｉ編集を誘導した（図７ａ）。

次に、３個のミトコンドリアＤＮＡ部位を標的とするこれらのｓＴＡＬＥＤｓによって誘導された編集された対立遺伝子の頻度を比較した。元のｓＴＡＬＥＤｓ又はｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体によって誘導されたほとんどの突然変異対立遺伝子は、単一塩基編集ではない多重塩基編集を含む。明らかに対照的には、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓは、多重塩基置換より遥かに頻繁に単一塩基置換を有する突然変異対立遺伝子を誘導した。したがって、スペーサー領域の中間に単一Ａ－ｔｏ－Ｉ編集がある最も豊かな対立遺伝子は、元のｓＴＡＬＥＤｓによって３．０６％（Ｃｏｘ３．１）、１．９０％（ＮＤ１）、及び１．７０％（ＮＤ６）の低い頻度で誘導された一方で、同一の対立遺伝子は、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ変異体によって１０．１％（Ｃｏｘ３．１）、１７．０％（ＮＤ１）、及び１０．５％（ＮＤ６）の高い頻度で誘導された（図７ｄ乃至図７ｆ）。このような結果は、治療的応用分野のみならず、疾病モデリングでＴＡＬＥＤｓの用途に重要な意味を有する。ミトコンドリア遺伝的疾患を担当する病原性ミトコンドリアＤＮＡ突然変異のほとんどは、多重ヌクレオチド変異体ではない単一ヌクレオチド変異体であるので、バイスタンダー編集がないか少ない単一塩基置換を誘導するＴＡＬＥＤｓが好ましい。

また、全体のミトコンドリアゲノムシーケンシングを行い、形質感染後４日目に野生型ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ変異体のオフターゲット効果を評価して比較した（図８）。３個のミトコンドリアＤＮＡ部位を標的とする野生型ｓＴＡＬＥＤｓは、ミトコンドリアゲノムワイドオフターゲット編集の平均頻度を有するオフターゲット突然変異を誘導し、その平均頻度は０．００２４％から０．００６６％までの範囲で、未処理の対照群で観察された場合（０．０００６％）より４倍～１０倍さらに高い。対照的には、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓは、陰性対照群で観察された基準頻度と類似する＜０．０００６％の平均頻度を有するオフターゲット編集を誘導した（図８（Ｂ））。さらに、ミトコンドリアゲノムで誘導されたオフターゲット編集の数もｓＴＡＬＥＤ変異体によって減少した。したがって、前記ＮＤ１－特異的野生型ｓＴＡＬＥＤは、ヒトミトコンドリアＤＮＡの１０８個の部位において＞０．１％の頻度でＡ－ｔｏ－Ｉオフターゲット編集を誘発した一方で、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓは、それぞれ１４個と１７個の部位でオフターゲット編集を誘導し、これは、未処理のサンプルで観察された基準数（すなわち、２４個）と類似していた（図８（Ａ））。また、形質感染後２日目に全体のミトコンドリアゲノムシーケンシングを行い（図９）、このとき、ＲＮＡオフターゲット編集が最も高いレベルで誘導された。３個の部位を標的とする元のｓＴＡＬＥＤｓは、０．００７１％から０．００９０％までの範囲の平均頻度でオフターゲット編集を誘導し、これは、未処理の対照群で観察された場合（０．０００６％）より１１倍～１４倍高い。しかし、前記Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓ変異体は、陰性対照群に比べてオフターゲット編集を誘導しなかった（図９（Ｂ））。

実施例４：時間の経過によるＤＮＡオンターゲット及びＲＮＡオフターゲット編集頻度の測定

図１０において、ｓＴＡＬＥＤｓの多様な形態によって誘導されたオンターゲット突然変異が安定的に維持されるのか、及びＲＮＡオフターゲット変異が時間の経過によってどれほど長く持続されるのかを調査した。標的ディープシーケンシングを用いて、３個のミトコンドリアＤＮＡ部位でのＤＮＡオンターゲット編集頻度（図１０（Ａ）乃至図１０（Ｃ））、及び３個の部位を標的とするｓＴＡＬＥＤｓによって共同編集された、６個の代表的部位でのＲＮＡオフターゲット編集頻度（図１０（Ｄ）乃至図１０（Ｇ））を多様な時間地点で測定した。ＲＮＡ編集は、形質感染後１日及び２日目にｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体によって大きく誘導されたが、形質感染後８日目にはほぼ完全に消えた。新規のｓＴＡＬＥＤ変異体は、ｓＴＡＬＥＤｓ又はｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体に比べて、形質感染後１日及び２日目にもＲＮＡオフターゲット編集頻度を何倍も減少させた（図１０（Ｇ））。前記ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体によって誘導されたミトコンドリアＤＮＡオンターゲット編集は、安定的に維持されなかった。したがって、ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体によって誘導されたミトコンドリアＤＮＡオンターゲット編集の頻度は、時間の経過によって相当低下した。例えば、ミトコンドリアＤＮＡオンターゲット編集は、ＮＤ６－特異的ｓＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗによって誘導され、形質感染後１日及び２日目にはそれぞれ最大４７％及び４０％の高い頻度を示したが、８日目又はその後には＜１０％の低い頻度を示した（図１０（Ｃ））。対照的には、ｓＴＡＬＥＤ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓによって誘導されたオンターゲット編集の頻度は、時間の経過によって増加するか、さらに安定的に維持された。結果的に、新規のｓＴＡＬＥＤ変異体に対して観察された編集頻度は、形質感染後１日及び２日目には低かったが、８日目又はその後には以前のバージョンのｓＴＡＬＥＤｓによって誘導された場合より高かった（図１０（Ａ）乃至図１０（Ｃ））。

このような結果に基づいて、ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体は、高い頻度で過度に多いＲＮＡオフターゲット編集を誘導したので、細胞毒性を示し、ｍｔＤＮＡ編集細胞は、時間の経過によって分裂されないか死んだ。しかし、本発明のｓＴＡＬＥＤ変異体は、ＲＮＡオフターゲット編集を避けたか、標的部位での過度に多いバイスタンダー編集及びミトコンドリアゲノムのオフターゲット突然変異を誘導しなかったので容認できた。また、ＭＴＳ細胞増殖検定（図１１（Ａ））を行い、ｓＴＡＬＥＤｓ及びｓＴＡＬＥＤ－Ｖ１０６Ｗ変異体が実際に細胞毒性を帯び、陰性対照群（ｐＥＧＦＰ形質感染）に比べて細胞生存率が相当減少したことを確認した（図１１（Ｂ））。前記ｓＴＡＬＥＤ変異体は遥かによく耐えており、形質感染後４日目にも細胞生存率が減少しなかった（図１１（Ｃ））。

実施例５：ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ－ガイドＡＢＥｓに統合されたＴａｄＡ８ｅ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓ

図１２において、ＴａｄＡ８ｅのＶ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓ突然変異が、核ＤＮＡ編集に広く使用されるＣＲＩＳＰＲＲＮＡ－ガイドＡＢＥｓによって誘導されたバイスタンダー編集及びＲＮＡオフターゲット編集を減少できるかどうかを調査した。まず、ＴＹＲＯ３部位でオンターゲット及びバイスタンダー編集頻度を測定した。ＡＢＥ８ｅ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓは、いずれも編集頻度が＞３０％である標的部位でＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅ－Ｖ１０６Ｗ（ＡＢＥ８ｅＷ）と同じ程度に効率的であった（図１２（Ｂ）及び図１２（Ｃ））。前記Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓ変異体は、プロトスペーサー領域の５番目及び７番目の位置で効率的な編集（最大３７％）を有する狭い編集範囲を示したが（図１２（Ｃ）のＡ５及びＡ７）、１０番目の位置（Ａ１０）ではバイスタンダー編集がほとんどなかった（それぞれ０．８％及び０．５％）。対照的には、ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅＷは、Ａ５（それぞれ２９％及び３０％）とＡ７（それぞれ２９％及び３０％）で最大編集を有し、Ａ１０（それぞれ９．３％及び３．１％）で相当なバイスタンダー編集を有するさらに広い編集範囲を示した。

次に、標的ＲＮＡアンプリコンシーケンシングを用いてＲＮＡオフターゲット編集活性を評価した。ＡＢＥ８ｅ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓは、合計６個の部位で測定された平均ＲＮＡオフターゲット編集頻度をＡＢＥ８ｅに比べてそれぞれ３．８倍及び２．５倍減少させ、ＡＢＥ８ｅＷに比べてそれぞれ３．１倍及び２．０倍減少させた（図１２（Ｄ））。さらに、トランスクリプトームワイドシーケンシングは、ＡＢＥ８ｅ－Ｖ２８Ｒ及び－Ｒ１１１Ｓが、ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８ｅＷに比べてＲＮＡオフターゲット編集数を相当減少させたことを示した（図１２（Ｅ）及び図１２（Ｆ））。このような結果は、２個の新規のＴａｄＡ８ｅ変異体であるＶ２８Ｒ及びＲ１１１ＳがＲＮＡオフターゲット編集及びバイスタンダー編集を減少させ、ＡＢＥ８ｅも改善できることを示す。

実施例６：ｍＴＡＬＥＤ及びｓＴＡＬＥＤｓによるＤＮＡオンターゲット及びＲＮＡオフターゲット編集

図１３において、ｓＴＡＬＥＤ以外に、Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓを有する二量体ＴＡＬＥＤｓ（ｄＴＡＬＥＤ）及び単量体ＴＡＬＥＤｓ（ｍＴＡＬＥＤ）変異体がＲＮＡオフターゲット編集を減少できるかどうかを調査した。前記ｄＴＡＬＥＤにおいて、各ＴＡＬＥ単位は、一側にシトシン脱アミノ酵素（例えば、ＤｄｄＡ_ｔｏｘ変異体（Ｅ１３４７Ａ））を含み、他側にアデニン脱アミノ酵素（例えば、ＴａｄＡ８ｅ）を含む。その一方で、前記ｍＴＡＬＥＤは、シトシン脱アミノ酵素とアデニン脱アミノ酵素がいずれも単一ＴＡＬＥ単位に存在することを特徴とする。

図１３（ａ）において、Ｃｏｘ３部位を標的とするｄＴＡＬＥＤｓとｍＴＡＬＥＤｓがいずれもオンターゲット活性を示すことが確認された。さらに、ＴＡＬＥ単位にアデニン脱アミノ酵素のみが存在するときは、遺伝子編集が起こらないことが観察された。図１３（ｂ）は、６個の代表的な部位での編集効率結果に関するものである。前記ｓＴＡＬＥＤｓと同様に、Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓを有するｄＴＡＬＥＤｓとｍＴＡＬＥＤｓ変異体のいずれにおいても、ＴａｄＡ８ｅに比べてＲＮＡオフターゲット効率が相当減少したことが観察された。

図１３（ｃ）において、Ｃｏｘ３－特異的ＴＡＬＥＤｓによって誘導されたオンターゲット編集に対するＲＮＡオフターゲット編集の特異性比率を分析した。この結果は、Ｖ２８Ｒ及びＲ１１１Ｓを有するＴａｄＡ変異体が、ｓＴＡＬＥＤ及びＡＢＥなどの他のシステムでのみならず、ｄＴＡＬＥＤｓ及びｍＴＡＬＥＤｓでもＲＮＡオフターゲット効率を減少させたことを示す。このような結果は、ＲＮＡオフターゲット効果が、ＤＮＡ結合タンパク質又はシトシン脱アミノ酵素よりは、ＴａｄＡアデニン脱アミノ酵素によって主に誘導されたことを示す。さらに、前記ＴａｄＡ変異体は、このような好ましくないＲＮＡオフターゲット効果を著しく減少させることができる。

上記の説明から、当業者は、本発明がその精神又は必須特性から逸脱することなく、他の特定の形態に具体化され得ることを理解するだろう。これと関連して、前記説明した実施例は、全ての側面で例示的なものであって、制限的なものでないことを理解しなければならない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の範囲に含まれるものと解釈しなければならない。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むアデニン脱アミノ酵素であって、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基２８、３０、４６、４８、４９、８２、８４、１０６、１０８、１１０、及び１１１から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基、又は前記配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列のうち対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアデニン脱アミノ酵素。
前記置換が、次のように構成された群から選ばれる一つ以上である、請求項１に記載のアデニン脱アミノ酵素：
配列番号１で表されるアミノ酸配列の
Ｖ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、
Ａ４８Ｗ、
Ｆ８４Ｍ、
Ｖ１０６Ａ、
Ｋ１１０Ｓ、Ｋ１１０Ｔ、又はＫ１１０Ｖ、及び
Ｒ１１１Ｆ、Ｒ１１１Ｑ、Ｒ１１１Ｓ、Ｒ１１１Ｔ、又はＲ１１１Ｙ。
前記置換が、次のように構成された群から選ばれる一つ以上である、請求項２に記載のアデニン脱アミノ酵素：
配列番号１で表されるアミノ酸配列の
Ｖ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、
Ａ４８Ｗ、及び
Ｒ１１１Ｓ。
ＤＮＡ結合タンパク質；及び
請求項１に記載の変形したアデニン脱アミノ酵素；
を含む融合タンパク質。
前記変形したアデニン脱アミノ酵素での置換が、次のように構成された群から選ばれる一つ以上である、請求項４に記載の融合タンパク質：
配列番号１で表されるアミノ酸配列の
Ｖ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、
Ａ４８Ｗ、
Ｆ８４Ｍ、
Ｖ１０６Ａ、
Ｋ１１０Ｓ、Ｋ１１０Ｔ、又はＫ１１０Ｖ、及び
Ｒ１１１Ｆ、Ｒ１１１Ｑ、Ｒ１１１Ｓ、Ｒ１１１Ｔ、又はＲ１１１Ｙ。
前記変形したアデニン脱アミノ酵素での置換が、次のように構成された群から選ばれる一つ以上である、請求項５に記載の融合タンパク質：
配列番号１で表されるアミノ酸配列の
Ｖ２８Ｑ、又はＶ２８Ｒ、
Ａ４８Ｗ、及び
Ｒ１１１Ｓ。
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒ）、又はＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥである、請求項７に記載の融合タンパク質。
前記ＴＡＬＥが、第１ＴＡＬＥモジュール及び第２ＴＡＬＥモジュールで構成された二重ＴＡＬＥモジュールである、請求項８に記載の融合タンパク質。
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓニッカーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性のないＣａｓタンパク質である、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質は、シトシン脱アミノ酵素をさらに含むものである、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記シトシン脱アミノ酵素が、全長（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）形態又は２個の分割体（ｔｗｏ－ｓｐｌｉｔ）形態である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
前記シトシン脱アミノ酵素が、ＡＰＯＢＥＣ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｅｄｉｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ＤｄｄＡ_ｔｏｘ（ｃｙｔｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ）、又はその変異体である、請求項１１又は１２に記載の融合タンパク質。
前記融合タンパク質は、ＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をさらに含むものである、請求項４～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
前記ＤＮＡが、核ＤＮＡ又は細胞小器官ＤＮＡである、請求項４～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）をさらに含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
ＭＴＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はＣＴＰ（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｉｔｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
ＮＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒｅｘｐｏｒｔｓｉｇｎａｌ）をさらに含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
ニッカーゼをさらに含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
前記ＤＮＡ結合タンパク質及び前記変形したアデニン脱アミノ酵素を含む第１融合タンパク質と、前記ＤＮＡ結合タンパク質及び前記ニッカーゼを含む第２融合タンパク質と、を含むものである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
前記ニッカーゼが、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＨ変異体、又はＮｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ（Ｃ）である、請求項４に記載の融合タンパク質。
請求項１～３のいずれか１項に記載の変形したアデニン脱アミノ酵素、又は請求項４～１２及び請求項１９～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項４～１０及び請求項１９～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集のための塩基編集用組成物。
前記融合タンパク質は、シトシン脱アミノ酵素をさらに含むものである、請求項２４に記載の塩基編集用組成物。
前記シトシン脱アミノ酵素は２個の分割体形態で存在し、前記融合タンパク質は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体を含む第１融合タンパク質と、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体を含む第２融合タンパク質と、を含むものである、請求項２５に記載の塩基編集用組成物。
前記第１分割体は、配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列を含み、第２分割体は、配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項２６に記載の塩基編集用組成物。
減少したオフターゲット効果を示し、前記オフターゲット効果は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡでの意図していない塩基変異（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を特徴とするものである、請求項２４に記載の塩基編集用組成物。
標的ＤＮＡを含有する細胞に請求項２４に記載の塩基編集用組成物を伝達する段階を含む、ＤＮＡでのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基編集方法。
前記伝達が体外（ｅｘｖｉｖｏ）で行われる、請求項２９に記載の方法。
前記伝達が体内（ｉｎｖｉｖｏ）で行われる、請求項２９に記載の方法。
前記標的ＤＮＡは、遺伝性疾患を有するヒトの対象体の核ＤＮＡ、細胞小器官ＤＮＡ、又はミトコンドリアＤＮＡである、請求項２９に記載の方法。
少なくとも１０％の頻度で標的ＤＮＡのうち単一ヌクレオチド残基での塩基編集を誘導する、請求項２９に記載の方法。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用するときに比べて減少したオフターゲット編集効果を示し、前記オフターゲット編集効果は、ＤＮＡ又はＲＮＡで意図していない塩基変異を特徴とすることである、請求項２９に記載の方法。
Ｖ１０６Ｗ突然変異を有する配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用するときに比べて減少したオフターゲット編集効果を示し、前記オフターゲット編集効果は、ＤＮＡ又はＲＮＡで意図していない塩基変異を特徴とすることである、請求項２９に記載の方法。
１０％以上の頻度で標的遺伝子のうち単一ヌクレオチド残基での塩基編集を誘導する、請求項２９に記載の方法。
標的ＤＮＡを含有する細胞に請求項２４に記載の塩基編集用組成物を伝達する段階を含むオフターゲット効果を減少させる方法であって、前記方法は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むアデニン脱アミノ酵素を含む塩基エディターを使用するときに比べて減少したオフターゲット編集効果を示し、前記オフターゲット編集効果は、ＤＮＡ又はＲＮＡで意図していない塩基変異を特徴とすることである、方法。