JP2024106646A - 三元共重合体及びそれを用いた表面修飾針状物、並びにその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロニードル・ナノニードル等の物質吸着表面における物質の吸着効率、吸着特異性、放出効率等を向上するための新たな手段を提供する【解決手段】式（１）で表される構造を有する三元共重合体。JPEG2024106646000009.jpg80146（但し、式（１）中、各符号は明細書に記載の定義を表す。）【選択図】図１

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｊｓａｐ２０２２ｓ／ｓｕｂｊｅｃｔ／２４ａ－Ｅ１０４－３／ｔａｂｌｅｓ？ｃｒｙｐｔｏＩｄ＝ 掲載日：令和４年２月２５日 ［刊行物等］ ２０２２年第６９回応用物理学会春季学術講演会 開催日：令和４年３月２４日 ［刊行物等］ ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｂｉｏｓｙｍｐｏ２０２２／ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ＿ｌｏｇｉｎ？ｅｖｅｎｔＣｏｄｅ＝ｂｉｏｓｙｍｐｏ２０２２ 掲載日：令和４年９月２日 ［刊行物等］ 第１６回バイオ関連化学シンポジウム 開催日：（１）令和４年９月１１日、（２）令和４年９月１２日

本発明は、三元共重合体及び当該三元共重合体により表面修飾された表面修飾針状物、並びに斯かる表面修飾針状物を用いたマイクロニードルアレイ（以下適宜「ＭＮＡ」と略称する。）、植物細胞への物質導入方法、原子間力顕微鏡（以下適宜「ＡＦＭ」と略称する。）用プローブ及びカンチレバーに関する。

種苗産業をはじめとする様々な分野において、植物の機能改変には、交雑、放射線やＤＮＡ損傷薬剤等による突然変異の誘発、アグロバクテリウムや植物ウイルスベクターを用いた遺伝子組換えによる形質導入等の方法が用いられている。また、近年では、遺伝的性質を改変する方法として、ゲノム編集技術に注目が集まっており、植物の機能改変においても、ゲノム編集技術の研究が進められている。植物のゲノム編集技術としては、上記のアグロバクテリウムを用いてＤＮＡを細胞に導入する方法が知られているが、当該方法はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入に頼るものであるため、挿入箇所の遺伝子が破壊されるリスクを伴う。また例えば、対象の細胞が含まれる組織によっては、導入の目的とするタンパク質やゲノム編集に必要なタンパク質のプロモーターが機能しないために当該タンパク質が発現せず、目的の編集操作ができないといった問題もある。

他方、タンパク質やＲＮＡを細胞に直接導入することによってゲノム編集をする技術によれば、生物種、組織、細胞を問わず、ゲノム編集を行うことが可能である。しかしながら、動物細胞や培養細胞と比較して、植物組織に含まれている細胞は、固い表皮組織や細胞壁に覆われているため、物理的な穿孔が困難である。これまで、このような植物細胞に目的物質を直接導入する技術としては、パーティクルボンバードメント法、エレクトロポーレション法、及びマイクロインジェクション法が知られている。

前記パーティクルボンバードメント法は、金微粒子表面に目的物質（核酸、タンパク質等）を付着させ、これを高圧ガスで射出することによって植物細胞に穿孔し、当該植物細胞内に前記目的物質を導入する方法である。しかしながら、パーティクルボンバードメント法には、導入効率が低いことや、導入箇所が制御できないといった問題がある。前記エレクトロポーレション法は、電気パルスによって植物細胞に穿孔して目的物質を導入する方法である。しかしながら、エレクトロポーレション法では、プロプラストを調製する必要があり、同方法には植物組織に含まれている細胞に対して直接適用することができないといった問題がある。前記マイクロインジェクション法は、キャピラリによって細胞内に目的物質の溶液を注入する方法であり、植物組織に含まれている細胞に対して直接適用することが可能である。しかしながら、マイクロインジェクション法では、キャピラリの形状や大きさが植物細胞（特に植物組織の深層部にある細胞）に適しておらず、また、スループットも低いといった問題がある。

特許文献１（特開２０１５－１８１３８４号公報）には、人工ヌクレアーゼが結合したマイクロニードルを細胞に穿刺することによって細胞に人工ヌクレアーゼを導入する方法が記載されており、特許文献２（国際公開第２０１９／１１３３９６号）には、ナノワイヤアレイを植物細胞に挿入して生体分子を植物細胞内に挿入する方法が記載されている。このようなマイクロニードルやナノワイヤアレイを用いた方法によれば、顕微鏡観察下で位置合わせを行いながら細胞への挿入操作を行うため、植物組織の目的細胞に対して目的物質を導入することが可能となる。しかし、これらのマイクロニードルやナノワイヤアレイは、植物細胞、特に、組織培養細胞、植物体再生が困難な植物種の細胞等の、植物組織に含まれている植物細胞に対してこれらを挿入することが困難であったり、目的物質の導入ができない場合があった。

本発明者等は、ナノスケールの超極細針状材料を使用することで、細胞に対するダメージを低減した技術（特許文献３：特許４６２５９２５号公報）、及び、ナノニードルを細胞へと挿入した後に、ナノニードルアレイを高周波振動させることにより、細胞内への物質導入効率を向上させた技術（特許文献４：特許６４４９０５７号公報）を開発している。また、凸状構造物であって特定の高アスペクト比を有するマイクロニードルを、特定の間隔で支持体上に整列させたマイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）を用いることにより、植物組織に含まれている植物細胞に対して目的物質を高効率に導入可能な技術を開発している（特許文献５：特開２０２１－１５１２０１号公報）。これらは優れた技術であるが、斯かるマイクロニードル・ナノニードルを用いた目的物質の導入時には、当該マイクロニードル・ナノニードル表面に目的物質の溶液を滴下し、静電的な相互作用でマイクロニードル・ナノニードル表面に吸着させているところ、目的物質の導入効率に限界があり、更に改善の余地があった。

特開２０１５－１８１３８４号公報 国際公開第２０１９／１１３３９６号 特許４６２５９２５号公報 特許６４４９０５７号公報 特開２０２１－１５１２０１号公報

本発明は上記課題に鑑みてなされたもので、マイクロニードル・ナノニードル等の物質吸着表面における物質の吸着効率、吸着特異性、放出効率等を向上するための新たな手段を提供することを目的とする。

本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、新規な構造を有する三元共重合体を開発し、斯かる三元共重合体で針状物の表面を修飾することにより、物質の吸着効率、吸着特異性、放出効率等を向上できること、惹いては斯かる表面修飾針状物を使用することで、マイクロニードル・ナノニードルを用いた目的物質の導入効率の向上や、ＡＦＭのカンチレバーによる目的物質の吸着効率・吸着特異性の向上等、各種用途への適用により種々の利点が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］式（１）で表される構造を有する三元共重合体。
（但し、式（１）中、
Ｒ^１１は、炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖の二価の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ^１２は、水素又はメチルを表し、
Ｒ^２１は、１～３個の水酸基により置換された炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖の一価の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ^２２は、水素又はメチルを表し、
Ｒ^３は、水素又はメチルを表し、
ＲｉｎｇＡは、１～３個の水酸基を有する芳香族炭化水素基を表し、
ＲｉｎｇＢは、１～３個のオキソ基を有する窒素含有環式基を表し、
Ｔ^１及びＴ^２は、各々独立に、末端基を表し、
ｘは、１以上５０００以下の自然数を表し、
ｙは、１以上８０００以下の自然数を表し、
ｚは、１以上５０００以下の自然数をし、
ここで、ｘ個、ｙ個、及びｚ個の各単量体単位は、各々ブロックとして存在していてもよく、ランダムに共存していてもよい。）
［２］ＲｉｎｇＡが、ジヒドロキシフェニル基である、項１に記載の三元共重合体。
［３］ＲｉｎｇＢが、Ｎ－コハク酸イミド基である、項１に記載の三元共重合体。
［４］表面の少なくとも一部が、項１～３の何れか一項に記載の三元共重合体により修飾されてなる、表面修飾針状物。
［５］支持体と、前記支持体上に配列された複数の針部とを備えるマイクロニードルアレイであって、
前記複数の針部の一部又は全部が、項４に記載の表面修飾針状物である、マイクロニードルアレイ。
［６］前記針部の基底面の直径が１～２０μｍであり、
前記針部の先端面の直径が０．５～３μｍであり、
前記針部の長さが３０～１００μｍであり、
前記針部の先端面及び断面の直径が前記基底面の直径以下、かつ、前記先端面から前記針部の長さマイナス１０μｍまでの前記断面の直径の増加率が０～５％であり、
前記針部の先端面間距離が２０～１０００μｍである、項５に記載のマイクロニードルアレイ。
［７］前記針部のアスペクト比（長さ／（１／２長さ面の直径））が５～２００である、項６に記載のマイクロニードルアレイ。
［８］前記支持体及び前記針部が一体であり、かつ、単結晶シリコンからなる、項６に記載のマイクロニードルアレイ。
［９］植物細胞への目的物質の導入に用いるための、項６に記載のマイクロニードルアレイ。
［１０］前記植物細胞が植物組織に含まれている細胞である、項９に記載のマイクロニードルアレイ。
［１１］前記植物組織が茎頂分裂組織である、項１０に記載のマイクロニードルアレイ。
［１２］植物細胞に目的物質を導入する方法であり、
前記植物細胞に、前記目的物質を表面に付着させた、項４に記載の表面修飾針状物、又は、項５に記載のマイクロニードルアレイの針部を挿入する挿入工程、
を含む、植物細胞への物質導入方法。
［１３］前記挿入工程における挿入速度が、０．０１～５０μｍ／秒である、項１２に記載の植物細胞への物質導入方法。
［１４］前記挿入工程において、前記針部を、挿入方向に、振幅０．０１～５０μｍ及び周波数０．１～２０００Ｈｚの条件で振動させる、項１２の植物細胞への物質導入方法。
［１５］前記植物細胞が植物組織に含まれている細胞であり、植物組織への物質導入方法である、項１２に記載の植物細胞への物質導入方法。
［１６］原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力測定装置のカンチレバーに取り付けて使用される、針状先端部を有するプローブであって、
前記針状先端部が、項４に記載の表面修飾針状物である、プローブ。
［１７］項１６に記載のプローブを含む、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力測定装置のカンチレバー。

本発明の三元共重合体は、マイクロニードル・ナノニードルや原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）のカンチレバー等の針状物の表面修飾に用いることにより、物質の吸着効率、吸着特異性、放出効率等を向上させることができる。

本発明のマイクロニードルアレイの一実施形態を示す模式縦断面図である。 実施例で使用したマイクロニードルアレイの外観を示すＳＥＭ写真である。 洗浄前後の各実施例及び比較例の修飾ＭＮＡ表面固定化ＧＦＰタンパク質の植物細胞質模擬緩衝液による蛍光強度を示すグラフである。 実施例で使用したＧＵＳレポーター遺伝子の構成を説明するための模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施例１の修飾ＭＮＡによる導入操作後のＧＵＳ染色葉組織の光学顕微鏡写真である。（ａ）の写真における点線部はＭＮＡ挿入部位を示す。（ｂ）の写真は（ａ）の写真のうちＧＵＳ染色が観察された部分の拡大写真である。 実施例で使用したネスチンテール固定化ＡＦＭ探針の構成を説明するための模式図である。 実施例で使用したアクチン固定化ガラス基板の構成を説明するための模式図である。 実施例で実施したネスチンテール引張試験の構成を説明するための模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施例におけるネスチンテール引張試験に使用したネスチンテール伸展時に得られるフォースカーブの模式図である。（ａ）は、高分子の伸展によって得られる特徴的なカーブを示し、（ｂ）は、基板と探針との間における非特異的相互作用の結合破断力を示す伸展距離０のカーブを示す。

以下、本発明を具体的な実施形態に基づき説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されない。なお、本明細書において引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、あらゆる目的において、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。

［三元共重合体］
本発明の一側面は、式（１）で表される構造を有する三元共重合体（以下適宜「本発明の三元共重合体」と略称する。）に関する。

式（１）中、各符号の定義は以下の通りである。

Ｒ^１１は、炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖の二価の脂肪族炭化水素基を表す。具体例としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基（ｎ－プロピレン基、イソプロピレン基）、ブチレン基（ｎ－ブチレン基、イソブチレン基、ｓｅｃ－ブチレン基）、ペンチレン基、ヘキシレン基等が挙げられる。中でも、メチレン基、エチレン基、プロピレン基等が好ましく、エチレン基が特に好ましい。

Ｒ^１２は、水素又はメチル基を表す。

Ｒ^２１は、１～３個の水酸基により置換された炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖の一価の脂肪族炭化水素基を表す。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基（ｎ－プロピル基、イソプロピル基）、ブチル基（ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基）、ペンチル基、ヘキシル基等が１～３個の水酸基で置換された基が挙げられる。中でも、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基等が好ましく、ヒドロキシプロピル基が特に好ましい。

Ｒ^２１は、水素又はメチル基を表す。

Ｒ^３は、水素又はメチル基を表す。

ＲｉｎｇＡは、１～３個の水酸基を有する芳香族炭化水素基を表す。具体例としては、ヒドロキシフェニル、ジヒドロキシフェニル、トリヒドロキシフェニル等が挙げられる。中でも、ジヒドロキシフェニル基が好ましい。

ＲｉｎｇＢは、１～３個のオキソ基を有する窒素含有環式基を表す。具体例としては、Ｎ－コハク酸イミド、Ｎ－フタルイミド等が挙げられる。中でも、Ｎ－コハク酸イミド基が好ましい。

Ｔ^１及びＴ^２は、各々独立に、末端基を表す。例としては、炭素数１～３の直鎖又は分岐鎖の一価の脂肪族炭化水素基を表す。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基（ｎ－プロピル基、イソプロピル基）等が挙げられる。中でも、各々独立に、メチル基、エチル基等が好ましく、メチル基が特に好ましい。

ｘは、１以上５０００以下の自然数を表す。より具体的には、ｘは例えば１以上、又は３以上、又は１０以上、又は２０以上とすることができ、また、例えば５０００以下、又は３０００以下、又は２０００以下、又は１０００以下とすることができる。
ｙは、１以上８０００以下の自然数を表す。より具体的には、ｙは例えば１以上、又は５以上、又は２０以上、又は５０以上とすることができ、また、例えば８０００以下、又は６０００以下、又は５０００以下、又は４０００以下とすることができる。
ｚは、１以上５０００以下の自然数を表す。より具体的には、ｚは例えば１以上、又は３以上、又は１０以上、又は２０以上とすることができ、また、例えば５０００以下、又は３０００以下、又は２０００以下、又は１０００以下とすることができる。

ｘ：ｙ：ｚの比率は、特に制限されるものではないが、ｘを１０とした場合に、ｙは１０～２００の範囲とすることができ、また、ｚは１～５０の範囲とすることができる。

ｘ個の単量体単位（これを適宜「単量体単位Ｘ」と称する。）は、互いに同一の単位であってもよく、２以上の異なる単位が混在していてもよい。単量体単位Ｘとして特に好ましくは、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）単位が挙げられる。

ｙ個の単量体単位（これを適宜「単量体単位Ｙ」と称する。）は、互いに同一の単位であってもよく、２以上の異なる単位が混在していてもよい。単量体単位Ｙとして特に好ましくは、２－ヒドロキシプロピルアクリルアミド（ＨＰＡ）単位が挙げられる。

ｚ個の単量体単位（これを適宜「単量体単位Ｚ」と称する。）は、互いに同一の単位であってもよく、２以上の異なる単位が混在していてもよい。単量体単位Ｚとして特に好ましくは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）単位が挙げられる。

ｘ個の単量体単位Ｘ、ｙ個の単量体単位Ｙ、及びｚ個の単量体単位Ｚは、各々ブロックとして纏まって存在していてもよく、ランダムに混在していてもよい。

本発明の三元共重合体の重合度（ｘ＋ｙ＋ｚの合計）は、特に限定されるものではないが、例えば２０以上、又は５０以上、又は１００以上とすることができ、また、例えば１８０００以下、又は１５０００以下、又は１２０００以下、１００００以下、又は７０００以下、又は５０００以下とすることができる。

本発明の三元共重合体の具体例としては、これに限定されるものではないが、下記式（２）で表されるＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体が挙げられる。

式（２）中、ｘ、ｙ、及びｙの定義は、式（１）と同様である。

本発明の三元共重合体を製造する方法は、特に限定されるものではないが、各々個別に用意した単量体単位Ｘ、単量体単位Ｙ、及び単量体単位Ｚにそれぞれ対応する単量体化合物を、所望のｘ：ｙ：ｚの比率となるように用い、従来公知の任意の重合法により重合させる方法が挙げられる。単量体単位Ｘ、単量体単位Ｙ、及び単量体単位Ｚにそれぞれ対応する単量体化合物としては、種々公知の市販の化合物を用いてもよく、従来公知の任意の合成法を用いて合成してもよい。斯かる単量体化合物の合成法及び重合法は種々公知であり、当業者であれば適宜選択して用いることができる。具体例として、上記式（２）で表されるＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体を合成する場合、後記の「合成例」において採用した方法を用いることができる。

本発明の三元共重合体は、後述の針状物を含む各種構造体の表面修飾に使用することができる。特に、本発明の三元共重合体は、目的物質を吸着させる操作、又は、吸着させた後に放出する操作に用いられる種々の物理的、化学的、又は生物学的な処理又は分析装置において、吸着表面の表面処理に使用することにより、目的物質の吸着効率及び／又は放出効率を改善できるという効果を有する。このため、本発明の三元共重合体は、斯かる処理又は分析装置の吸着表面の表面に用いることが好ましい。斯かる表面処理の対象となる構造体の例としては、これらに限定されるものではないが、マイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）やナノニードルアレイ、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や分子間力測定装置のカンチレバー等の各種の針状物が挙げられる。なお、本発明の三元共重合体を含む表面修飾材も、本発明の一側面に含まれる。

［表面修飾針状物］
本発明の一側面は、本発明の三元共重合体によって表面が修飾された針状物に関する。本発明において針状物とは、針の形状の構造体を意味する。本発明の表面処理針状物は、物質の吸着に用いられることが好ましい。本発明において物質吸着用の針状物とは、種々の物理的、化学的、又は生物学的な処理又は分析装置において、目的物質を吸着させる操作、又は、吸着させた後に放出する操作に用いられる針状物を意味する。斯かる針状物の例としては、特に限定されるものではないが、マイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）やナノニードルアレイの針状部、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や分子間力測定装置のカンチレバーのプローブ等が挙げられる。

針状物の材質は特に限定されず、任意の材料を用いることができる。具体例としては、制限されるものではないが、ガラス等の無機材料；シリコン（単結晶シリコン等）、窒化シリコン、金、クロム、ヒ化インジウム、シリカ等の金属；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂等の樹脂；カーボンナノチューブ、セルロースナノファイバー等の繊維状材料；酸化亜鉛、炭化ケイ素等からならなるウェスカー材料などが挙げられる。

針状物のサイズも制限されず、その用途に応じて任意のサイズとすることができるが、少なくともその断面直径をマイクロスケール又はナノスケールとする（即ち、マイクロニードル又はナノニードルである）ことが好ましい。

斯かる針状物の表面の少なくとも一部を、本発明の三元共重合体によって修飾することにより、本発明の表面処理針状物が製造される。本発明の三元共重合体による表面修飾法は特に制限されず、従来公知の任意の修飾法を適宜選択して用いることができる。具体例としては、後記の実施例において採用した方法を用いることができる。

このように本発明の三元共重合体によって表面修飾された本発明の針状物は、従来の表面未修飾の針状物や、従来の共重合体により表面修飾された針状物と比較して、物質の吸着効率、吸着特異性、放出効率等が優れている。

中でも、本発明の三元共重合体は、各種のマイクロニードル又はナノニードルの表面処理や、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や分子間力測定装置のカンチレバーのプローブの表面処理に用いることが好ましい。ナノニードルの例としては、本発明者等が開発した特許文献３（特許４６２５９２５号公報）や特許文献４（特許６４４９０５７号公報）に記載のナノニードル等が挙げられる。マイクロニードルの例としては、本発明者等が開発した特許文献５（特開２０２１－１５１２０１号公報）に記載のマイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）が有するマイクロニードル等が挙げられる。なお、複数のマイクロニードルを有するマイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）に本発明の三元共重合体を適用した例、及び、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や分子間力測定装置のカンチレバーのプローブの表面処理に本発明の三元共重合体を適用した例については、章を改めて以下に説明する。

［マイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）］
本発明の一側面は、本発明の三元共重合体によって表面が修飾された針状物を有するマイクロニードルアレイ（ＭＮＡ）に関する。本発明において「マイクロニードルアレイ」又は「ＭＮＡ」とは、複数のマイクロメートルオーダーの凸状構造物（マイクロニードル、針部）が支持体上に分散配置されているものを示す。斯かるＭＮＡの構成は特に限定されるものではないが、支持体と、前記支持体上に配列された複数の針部とを備えるＭＮＡであって、前記針部の一部又は全部が、本発明の三元共重合体によって表面修飾された本発明の表面処理針状物である構成が挙げられる。

中でも、本発明の三元共重合体は、本発明者等が開発した特許文献５（特開２０２１－１５１２０１号公報）に記載の特定のＭＮＡの針部の表面処理に用いることが好ましい。特に特許文献３に記載のＭＮＡは、凸状構造物であって特定の高アスペクト比を有する針部を、特定の間隔で支持体上に整列させた構造を有する。このように、前記針部の大きさ及びその配置を精密に制御したことにより、植物組織に含まれている植物細胞に対して目的物質を高効率に導入することが可能である。以下、斯かる特許文献３に記載の特定のＭＮＡに対して、本発明の三元共重合体による表面処理を施した態様（これを以下適宜「本発明のマイクロニードルアレイ」又は「本発明のＭＮＡ」と称する。）について、場合により図１を参照しながら例を挙げて詳細に説明するが、本発明の三元共重合体を適用可能なＭＮＡはこれに限定されるものではなく、任意のＭＮＡに適用することができる。

本発明のＭＮＡは、支持体と、前記支持体上に配列された複数の針部とを備えるＭＮＡであって、前記針部の基底面の直径が１～２０μｍであり、前記針部の先端面の直径が０．５～３μｍであり、前記針部の長さが３０～１００μｍであり、前記針部の先端面及び断面の直径が前記基底面の直径以下、かつ、前記先端面から前記針部の長さマイナス１０μｍまでの前記断面の直径の増加率が０～５％であり、前記針部の先端面間距離が２０～１０００μｍであるとともに、前記針部の表面の少なくとも一部が、本発明の三元共重合体により修飾されてなる。

図１は、支持体１と複数の針部２とを備える本発明のＭＮＡの一実施形態（ＭＮＡ１０）の模式縦断面図である。ただし、図１に示すＭＮＡにおけるサイズ比は、本発明のＭＮＡに係るサイズ比に対応するものではない。なお、以下の説明及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

本発明において、「支持体」とは、下記の針部を支持する機能を有するものであり、針部が配置される面は平面であることが好ましい（図１では支持体１）。前記支持体の形状としては、例えば、線状、基板状（針部は上面又は下面に配置されても側面に配置されてもよい）が挙げられる。

本発明に係る支持体の大きさとしては、特に制限されないが、例えば、針部が１列に配置される場合には、幅０．３～２０ｍｍ（より好ましくは０．５～２ｍｍ）、長さ（前記列方向）１～５０ｍｍ（より好ましくは３～１０ｍｍ）であることが好ましい。また、例えば、針部が２列以上の複数列で配置される場合には、幅１～１００ｍｍ（より好ましくは１～５０ｍｍ）、長さ１～５０ｍｍ（より好ましくは３～１０ｍｍ）であることが好ましい。また、前記支持体の厚さとしては、特に制限されず、支持体をさらに支持する構造と一体になっていてもよい。

本発明に係る支持体の材質としては、細胞に毒性のないものであれば特に制限されず、例えば、シリコン（単結晶シリコン等）、窒化シリコン、金、クロム、ヒ化インジウム、シリカ等の金属；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂等の樹脂；カーボンナノチューブ、セルロースナノファイバー等の繊維状材料；酸化亜鉛、炭化ケイ素等からならなるウェスカー材料が挙げられ、これらの中でも、支持体の強度及び微細構造を制御しやすい傾向にある観点から、単結晶シリコンであることが好ましい。また、本発明に係る支持体としては、ＭＮＡの強度の観点から、下記の針部と一体であることが好ましい。

本発明において、「針部」は、凸状構造物を意味する。言い換えれば、「針部」は、鋭い先端を有する針形状に限定されるものではない。本発明に係る針部（図１では針部２）は、前記支持体との境界面である基底面（図１では針部２の下面）とそれに相対する先端面（図１では針部２の上面）とを有する。なお、前記支持体と前記針部とが一体である場合、前記境界面とは、前記支持体の針部が配置されている面を延長した面上の針部が配置されている面を示す。

本発明において、前記針部の基底面の直径は１～２０μｍであることが必要であり、１～１０μｍであることが好ましく、１～５μｍであることがより好ましい。前記基底面の直径が前記下限未満であると、目的物質を植物細胞に導入することが困難となる傾向にある。他方、前記基底面の直径が前記上限を超えると、植物組織に含まれている植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。なお、本発明において、「基底面の直径」とは、当該基底面の最大直径を示し、前記基底面が円ではない場合には、当該基底面の外接円の直径を示す（図１のｄ１）。

本発明において、前記針部の先端面の直径は０．５～３μｍであることが必要である。前記先端面の直径が前記下限未満であると、目的物質を植物細胞に導入することが困難となる傾向にある。他方、前記先端面の直径が前記上限を超えると、植物組織に含まれている植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。なお、本発明において、「先端面の直径」とは、当該先端面の最大直径を示し、前記先端面が円ではない場合には、当該先端面の外
接円の直径を示す（図１のｄ２）。

また、本発明に係る針部の形状としては、針部の先端面及び断面の直径が、前記基底面の直径以下であればよく、先端面から基底面までの断面が全て同じである柱状であっても（例えば、図１の（ａ））、先端面から基底面までの断面が連続して相同である錐台状や先端面から基底面までの断面の一組の対辺が連続して変化する台形板状であってもよい（例えば、図１の（ｂ））。また、針部側面の傾き（角度）を連続的に変化させた構造であってもよく、針部側面の傾き（角度）が非連続的に変化する、二層又はそれ以上の多層構造であってもよいが、前記柱状、台形板状、又は錐台状であることが好ましい。なお、本発明において、「針部の断面」とは、前記先端面及び基底面に平行な横断面を示し、「断面の直径」とは、当該断面の最大直径を示し、前記断面が円ではない場合には、当該断面の外接円の直径を示す。

前記針部の基底面、先端面、及び断面の形状としては、特に制限されず、円、楕円、三角形、正方形、長方形、台形、五角形以上の多角形が挙げられるが、目的物質の導入効率の観点から、円又は正多角形であることが好ましい。

また、本発明に係る針部としては、前記針部の先端面及び断面の直径が前記基底面の直径未満である場合、前記先端面から下記の針部の長さ方向に向けて、針部の長さマイナス１０μｍ（図１のｈ’）の範囲まで、任意の長さにおける断面の直径はいずれも同じであるか、又は、先端面側の断面の直径よりも基底面側の断面の直径の方が大きく、かつ、その間の直径の増加率が５％以下であること、すなわち、前記先端面から針部の長さマイナス１０μｍまでの前記断面の直径の増加率が０～５％であることも必要である。前記断面の直径の増加率が前記上限を超えると、目的物質を植物細胞に導入することが困難となる傾向にある。なお、本発明において、「断面の直径の増加率」とは、前記先端面から針部の長さ方向に向かって長さマイナス１０μｍ（ｈ’：ｈ－１０μｍ）の範囲内における任意の長さ軸上の２点間における、先端面側の断面の直径に対する基底面側の断面の直径の増加率（％）のことをいう。

本発明において、前記針部の長さは、３０～１００μｍであることが必要であり、５０～１００μｍであることが好ましい。前記長さが前記下限未満であると、植物組織に含まれている植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。他方、前記長さが前記上限を超えると、針部の座屈により植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。なお、本発明において、「針部の長さ」とは、前記先端面から前記基底面へ下ろした垂線の長さ（高さ）を示す（図１のｈ）。

本発明に係る針部は、従来の細胞への物質導入に用いられていたマイクロニードルに比べて、アスペクト比の高いものである。このようなアスペクト比としては、針部の長さと、針部の１／２長さにおける断面の直径（１／２長さ面の直径）との比（長さ／（１／２長さ面の直径））で、５～２００であることが好ましく、１０～１００であることがより好ましく、２５～６７であることがさらに好ましい。前記アスペクト比が前記下限未満であると、植物組織に含まれている植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。他方、前記アスペクト比が前記上限を超えると、針部の座屈により植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。なお、本発明において、「１／２長さ面の直径」とは、前記針部の１／２長さ（図１の２／ｈ）における断面の最大直径を示し、前記断面が円ではない場合には、当該断面の外接円の直径を示す（図１のｄ３）。

本発明のＭＮＡにおいて、複数ある針部は、先端面間距離が２０～１０００μｍで配列されることが必要である。前記先端面間距離としては、２０～１００μｍであることが好ましい。前記先端面間距離が前記下限未満であると、植物組織に含まれている植物細胞への挿入が困難となる傾向にある。他方、前記先端面間距離が前記上限を超えると、細胞あたりの針部の数が減少して目的物質の導入効率が低下する傾向にある。なお、本発明において、「先端面間距離」とは、１つの針部の先端面と、それに隣接する針部の先端面との間において、その外周上にある点同士の水平距離が最小になる当該点間距離を示す（図１のｗ）。

本発明のＭＮＡにおいて、複数ある針部の形状としては、上記条件を満たす限り、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、本発明に係る針部は、上記条件を満たす限り、前記支持体上にどのように配置されていてもよいが、１列又は２列以上の複数列で配列されていることが好ましい。ＭＮＡの列長としては、０．５～５０ｍｍであることが好ましく、３～１０ｍｍであることがより好ましい。前記列長が前記下限未満であると、目視による位置合わせ等の取り扱いが難しくなる傾向にある。他方、前記列長が前記上限を超えると、材料としての取り扱いが困難となる傾向にある。

本発明に係る針部の材質としては、細胞に毒性のないものであれば特に制限されない。例としては、前述した各種の材質が挙げられる。中でも、針部の強度及び微細構造を制御しやすい傾向にある観点から、単結晶シリコンであることが好ましい。また、本発明に係る針部としては、ＭＮＡの強度の観点から、前記支持体と一体であることが好ましい。

本発明のＭＮＡとしては、本発明の効果を阻害しない限り、前記支持体及び前記針部以外の他の構成を備えていてもよい。このような他の構成としては、例えば、主に下記の目的物質を結合させることを目的として、前記針部の表面に結合させた生体適合性ポリマー等が挙げられる。

本発明のＭＮＡの製造方法は、上記の条件を満たすＭＮＡを製造することができる方法であれば特に制限されず、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。このようなＭＮＡの製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィ技術及び／又はエッチング技術を用いて針の形状を作製する方法；ＭＮＡの形状に対応した凹部が形成された鋳型を用いて、射出成形によって樹脂製のＭＮＡを製造する方法；柱状構造を触媒反応により積層する方法；柱状構造をデポジッションにより作製する方法が挙げられる。

例えば、前記支持体上に前記針部を１列配列させる場合には、前記支持体及び前記針部の材料となるウエハの端部をエッチング加工して、針部を削り出し、前記支持体及び前記針部を一体として成形する方法が挙げられる。

また、例えば、前記支持体上に前記針部を１列又は２列以上配列させる場合には、特開２０１３－１８３７０６号公報に記載されているように、シリコンウエハ等のウエハ上に、ドット状のレジストマスクを施した上で、エッチングを行うことで針部を形成させる方法も挙げられる。

本発明のＭＮＡは、その複数の針部のうち一部又は全部が、前述の本発明の三元共重合体によって表面修飾された針状物（本発明の表面処理針状物）であることを特徴とする。斯かる本発明のＭＮＡは、従来の表面未修飾の針状物や、従来の共重合体により表面修飾された針状物を用いたＭＮＡと比較して、物質の導入効率が改善されるという効果を有する。

［植物細胞への物質導入方法］
本発明のＭＮＡによれば、培養細胞の他、植物組織に含まれている植物細胞にも目的物質を導入することが可能である。よって、本発明は、植物細胞への目的物質の導入に用いるための、植物細胞への物質導入用ＭＮＡも提供する。

目的物質を導入する対象となる「植物細胞」としては、特に制限されず、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の植物の細胞が挙げられる。前記植物の例としても特に制限されず、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションが挙げられる。前記植物細胞には、例えば、植物個体又は器官において植物組織に含まれている細胞、植物個体又は器官から分離した植物組織に含まれている細胞、これらの植物組織に由来する培養細胞が含まれ、特に制限されないが、本発明のＭＮＡは、植物組織に含まれている細胞にも適用可能である。本発明において、「植物細胞に含まれている細胞（植物細胞）」とは、植物組織を構成しており、当該植物組織から分離されていない細胞（植物細胞）を示す。なお、前記組織としては、植物個体又は器官から分離されていても、組織培養されたものであってもよい。

前記植物の器官としては、例えば、葉、茎、茎頂、根、塊茎、塊根、種子、胚軸、花粉、子房が挙げられる。前記植物組織としては、例えば、茎頂分裂組織、根端分裂組織、シュート頂分裂組織、カルスが挙げられ、中でも、茎頂分裂組織が好ましい。

本発明において、前記植物細胞に導入する「目的物質」としては、植物細胞への導入によって効果が期待できる物質が挙げられ、特に制限されないが、例えば、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、ペプチド、脂質、糖、低分子化合物（補酵素、毒素、抗生物質、抗菌薬剤、抗ウイルス薬剤等）、金属イオン、金属錯体、及びこれらのうちの２種以上の分子を含む複合分子が挙げられ、１種を単独であっても２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、必要に応じて、導入の確認のための標識物質と組み合わせてもよい。

例えば、前記目的物質として、部位特異的ヌクレアーゼタンパク質を用いてこれを植物細胞に導入することにより、当該植物細胞のゲノム編集が可能となるが、本発明の目的はゲノム編集に限定されない。前記部位特異的ヌクレアーゼタンパク質としては、例えば、Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４等）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＰＰＲ－ＮＤ１、ＰＰＲ－ＮＤ２が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらは、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質のガイドＲＮＡ等と組み合わせてもよい。

また、本発明は、上記本発明のＭＮＡを用いた方法として、植物細胞に目的物質を導入する方法であり、前記植物細胞に、前記目的物質を表面に付着させた、本発明のＭＮＡの針部を挿入する挿入工程を含む、植物細胞への物質導入方法（以下適宜「本発明の物質導入方法」という。）も提供する。

本発明の物質導入方法においては、前記目的物質を表面に付着させた本発明のＭＮＡの針部を前記植物細胞に挿入する（挿入工程）。前記挿入工程に用いる本発明のＭＮＡとしては、１枚を単独で用いても、２枚以上を重ねて用いてもよい。また、２枚以上を重ねて用いる場合には、１種を単独であっても、２種以上の組み合わせであってもよく、それらを同時に挿入しても、順次挿入してもよい。

前記目的物質をＭＮＡの針部表面に付着させる方法としては、例えば、対象の植物細胞、又は対象の植物細胞が含まれる植物組織若しくは器官の表面に前記目的物質の溶液を滴下し、そこにＭＮＡの針部を挿入する方法が挙げられる。或いは、予めＭＮＡの針部表面に前記目的物質を吸着させておき、これを対象の植物細胞、又は対象の植物細胞が含まれる植物組織若しくは器官に挿入する方法が挙げられる。これにより、前記対象の植物細胞（好ましくは前記植物組織に含まれている植物細胞）に目的物質を導入することができる。前記目的物質の溶液の溶媒としては、細胞に毒性のないものであれば特に制限されず、例えば、緩衝液、培地が挙げられる。

前記挿入において、前記植物細胞又は植物組織若しくは器官は、基板上に固定又は保持されていることが好ましく、ＭＮＡの針部の挿入は、顕微鏡観察下において、挿入箇所の位置合わせを行いながら行うことが好ましい。前記挿入は、手動で行っても、コンピュータ制御による自動化された方法で行ってもよい。ＭＮＡの針部の挿入の確認は、目的物質に標識物質を組み合わせた場合には、当該標識物質に応じた方法でこれを検出すること等によっても確認することができる。

前記挿入工程においては、前記植物細胞への針部の挿入速度が０．０１～５０μｍ／秒であることが好ましい。

前記挿入工程においては、前記針部を振動させることが好ましく、かかる振動の条件としては、挿入方向（針部の長さ方向に対して平行方向）に、振幅が０．０１～５０μｍであることが好ましい。また、このときの振動としては、その周波数が０．１～２０００Ｈｚであることが好ましい。前記振幅と周波数との組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、振幅０．１～５μｍ及び周波数１～２００Ｈｚである。植物組織は固いためにマイクロニードル（針部）の座屈が起こりやすく挿入が困難であるが、かかる振動によって針部の座屈が起こりにくくなり、より容易かつ正確な挿入が可能となる。このような振動をするようにＭＮＡに加振するための装置としては、例えば特開２０１１－１８２７６１号公報に記載の細胞の選択的分離装置をＭＮＡ動作装置として用いることができる。

前記挿入工程において、前記針部の挿入深度としては、前記植物細胞が植物組織に含まれている細胞である場合、当該植物組織若しくは当該植物組織を含む器官の表面から２０～１００μｍであることが好ましく、２０～６０μｍであることがより好ましい。これにより、前記目的物質を植物組織若しくは器官の深層にある細胞に導入することができる。

本発明の物質導入方法においては、前記挿入工程の後に、前記植物細胞から前記ＭＮＡの針部を抜出する抜出工程により、対象の植物細胞内に前記目的物質のみを残すことができる。前記抜出工程の条件としては特に制限されない。前記針部の挿入時間としては、挿入開始から抜出完了までの時間で、０．１～１２０分間であることが好ましい。そのうち、前記挿入時間内においては、前記針部が対象の植物細胞に到達した挿入深度で、その深度を０．１～１２０分間維持することが好ましい。さらに、前記針部が対象の植物細胞に到達した挿入深度でその深度を維持する場合には、前記針部に加振することが好ましく、かかる加振の条件としては上記の同様の条件が挙げられる。

本発明の物質導入方法においては、本発明の前記抜出工程の後に、必要に応じて、前記植物細胞及び前記植物細胞が含まれている植物組織をインキュベーションする工程等をさらに含んでいてもよい。前記インキュベーションの条件は目的物質、植物細胞、植物組織に応じて適宜設定することができる。

本発明の物質導入方法によれば、目的物質を植物組織に含まれている植物細胞にも導入
することができるため、本発明の物質導入方法は、特に制限されず、前記目的物質に応じて様々な用途に用いることができる。例えば、本発明の物質導入方法によれば、目的物質を植物組織の深層部（例えば、組織表面から２０～１００μｍの層、２０～６０μｍの層）にある植物細胞にも導入することが可能であるため、ｉｎ ｐｌａｎｔａ法で、茎頂分裂組織等の未分化細胞を含む植物組織に対して前記部位特異的ヌクレアーゼタンパク質を導入してゲノム編集を行い、それによって植物の機能改変を行うことも可能である。

［プローブ及びカンチレバー］
本発明の一側面は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力測定装置のカンチレバーに取り付けて使用される、針状先端部を有するプローブ、並びに斯かるプローブを先端に有するカンチレバーに関する。斯かる針状先端部は、プローブと個別の部材として形成され、プローブに固定されたものであってもよく、また、プローブ自身を先鋭化し針状に形成したものであってもよい。

本発明のプローブ及びカンチレバーは、その針状先端部が、前述の本発明の三元共重合体によって表面修飾された針状物（本発明の表面処理針状物）であることを特徴とする。斯かる本発明の三元共重合体によって表面修飾された針状先端部を有する本発明のプローブ及びカンチレバーは、従来の表面未修飾の針状物や、従来の共重合体により表面修飾された針状物を用いたプローブ及びカンチレバーと比較して、非特異的な相互作用を低減することができるという効果を有する。

以下、本発明を実施例に則してさらに詳細に説明する。但し、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。

［合成例：ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体の合成］
（１）ＨＰＡ（２－ヒドロキシプロピルアクリルアミド）モノマーの合成
炭酸カリウム４１．０４ｇを６０ｍＬの水に溶解させ、氷槽内、丸底フラスコ中で攪拌した。１－アミノ－２－プロパノール１８．５８ｇを酢酸エチル２００ｍＬに溶解させ、フラスコ内に加えた。塩化アクリロイル２０ｍＬを滴下し、氷中で３０分攪拌した後、室温に戻し、更に終夜攪拌して反応させた。反応後、水相から酢酸エチル（油相）で目的化合物を抽出した。油相を硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターで濃縮し、酢酸エチルを可能な限り除去した。更にエアバブリングを１８時間行い、酢酸エチルを完全に除去し、目的化合物を透明液体として得た。
1H NMR (D₂O): δ (ppm): 1.06 (d, 3H), 3.14 (m, 1H), 3.21 (br , 1H), 3.84 (m, 1H), 5.66 (dd, 1H), 6.08 (m, 1H), 6.17 (dd , 1H)..

（２）ＤＯＰＡ（Ｎ－（３，４－ジヒドロキシフェネチル）メタクリルアミド）モノマーの合成
塩酸ドーパミン８．０ｇ及びリエチルアミン４．３０９ｇを超脱水メタノール８０ｍＬに溶解させた。得られた溶液に、氷槽内、塩化メタクリロイル５．２９ｇを含むテトラヒドロフラン溶液とトリエチルアミン６．２７８ｇを含むメタノール溶液を交互に滴下した。２時間室温で攪拌した後、１Ｍ塩酸溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで濃縮した。得られた粉状の化合物を、酢酸エチルを用いて再結晶させて精製し、目的化合物を茶白色状の粉末として得た。
¹H NMR (DMSO-d₆): δ (ppm): 1.80 (s, 3H, CH₂CCH₃), 2.47 (t, 2H, C₆H₃CH₂CH₂), 3.13-3.25 (m, 2H, C₆H₃CH₂CH₂), 5.26, 5.58 (s, 2H, CH₂CCH₃), 6.33-6.66 (m, 3H, C₆H₃), 7.89 (s, 1H, CONH), 8.59, 8.69 (s, 2H, OH).

（３）ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ三元共重合体の合成
ＨＰＡ／ＮＨＳ／ＤＯＰＡ／ＲＡＦＴ／ＡＩＢＮを、それぞれ１７０／１０／２０／１／０．１又は１６０／２０／２０／１／０．１のモル比で混合し、７０℃の油槽内、アルゴン雰囲気下、ＤＭＦ中で２時間反応させて重合し、ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ三元共重合体を合成した。反応後、ＤＭＦ系ＧＰＣ測定により、得られた重合体の分子量及び分子量分布を決定した。得られた三元共重合体を、アセトンを用いた再沈回収により精製した。^１Ｈ ＮＭＲにより、未反応のモノマーが除去されていること、並びに、高分子鎖中のＨＰＡ、ＢＰＡ、及びＮＨＳの含有量が仕込み比とほぼ一致することを確認した。

［実施例群Ａ：ＭＮＡ針部表面修飾による検討］
（１）ＭＮＡの作製
シリコン単結晶を削り出し、支持体と一体に、先端面から基底面までの断面が全て同じ正方形の正四角柱（正方形断面の一辺の長さ：１μｍ、長さ：１００μｍ）の針部が１６７個、先端面間距離：３０μｍの間隔で１列に整列したマイクロニードルアレイ１０を作製した。得られたマイクロニードルアレイ１０の外観のＳＥＭ写真を図２に示す。

（２）ＭＮＡ針部の表面修飾
・実施例Ａ１：ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体によるＭＮＡ針部表面修飾
ＭＮＡ（ＭＮＡ）の表面を、イソプロパノールに１分間、１％フッ化水素酸に１分間それぞれ浸漬して洗浄した。洗浄後のＭＮＡをＵＶ－オゾンで３０分間処理した後、硫酸と過酸化水素水の混合比率が１：１となるように調製したＳＰＭ溶液で１０分間、常温で浸漬することで洗浄した。処理後のＭＮＡを超純水及びエタノールで洗浄後、超純水、塩酸、及び過酸化水素水をそれぞれ６：１：１の比率で混合した塩酸過酸化水素混合液（hydrochloric acid-hydrogen peroxide mixture：ＨＰＭ）に浸漬し、５０℃で３０分間反応させることで、ＭＮＡのシリコン表面の水酸化を行った。その後、ＭＮＡの表面を超純水、エタノール、及び１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した。合成例において得られたＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ＝１０／８５／５の共重合体を、１０％エタノールを含むホウ酸緩衝液に０．５ｗｔ％で溶解した溶液を調製した。このＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳポリマー溶液に、前記の洗浄ＭＮＡを浸漬し、１８℃にて一晩静置した。その後、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で１５分間、ＥＤＳ／ＮＨＳ反応を行い、ＭＮＡに修飾したポリマーにＮＨＳ基を再導入した。ＭＥＳ緩衝液及びホウ酸緩衝液でポリマー修飾ＭＮＡを洗浄後、ホウ酸緩衝液に溶解した１０ｍＭ Ｎ－（５－アミノ－１－カルボキシペンチル）イミノ二酢酸遊離体（ＡＢ－ＮＴＡ）溶液中で３７℃、２～３時間反応させた。反応後のポリマー修飾ＭＮＡをホウ酸緩衝液で洗浄後、ホウ酸緩衝液に溶解した終濃度２０ｍＭのエタノールアミン溶液で１時間、室温で反応させることで、未反応ＮＨＳ基のブロッキングを行った。ブロッキング後のポリマー修飾ＭＮＡを、ホウ酸緩衝液及び蒸留水で洗浄した後、最後に超純水に溶解した終濃度１００ｍＭの塩化ニッケル（II）（ＮｉＣｌ_２）溶液中で１時間、室温で反応させた。反応後のポリマー修飾ＭＮＡを、Ｈｉｓタグ融合タンパク質溶液中に浸漬し、４℃で一晩反応させて修飾することにより、表面がＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体で修飾されたＭＮＡを作製した。

・比較例Ａ１：シラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ共重合体によるＭＮＡ表面の修飾
ＭＮＡの表面を１％フッ化水素酸で洗浄した後、硫酸過酸化水素混合液（sulfuric acid-hydrogen peroxide mixture：ＳＰＭ）処理及び塩酸過酸化水素混合液（hydrochloric acid-hydrogen peroxide mixture：ＨＰＭ）処理を行い、表面を水酸化した。得られた表面水酸化ＭＮＡを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したシラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ（終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）溶液に浸漬し、室温で１時間反応させた。反応後のＭＮＡを、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解したＮ－（５－アミノ－１－カルボキシペンチル）イミノ二酢酸遊離体（ＡＢ－ＮＴＡ；終濃度１０ｍＭ）に浸漬し、３７℃で１時間反応させた後、ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した終濃度２０ｍＭのエタノールアミン溶液で１時間ブロッキングした。ブロッキング後の修飾ＭＮＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈した終濃度４０μｇ／ｍＬのＧＦＰ溶液中で、４℃で一晩反応させて修飾することにより、表面がシラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ共重合体で修飾されたＭＮＡを作製した。

・比較例Ａ２：ＡＰＴＥＳ－ＧＴＡ共重合体によるＭＮＡ表面の修飾
ＭＮＡの表面を１％フッ化水素酸で洗浄した後、ＳＰＭ処理及びＨＰＭ処理を行い、表面を水酸化した。得られた表面水酸化ＭＮＡを、超純水、エタノール、及びトルエンを用いて順に洗浄した。洗浄後のＭＮＡを、トルエンに溶解した１（ｖ／ｖ）％ＡＰＴＥＳ溶液に浸漬し、７０℃で１時間反応させた。その後、トルエン洗浄及びエタノール洗浄を行い、エタノールに溶解した１０％グルタルアルデヒド中で３７℃で１時間反応させた。反応後の修飾ＭＮＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈した終濃度４０μｇ／ｍＬのＧＦＰ溶液中で、４℃で一晩反応させて修飾することにより、表面がＡＰＴＥＳ－ＧＴＡ共重合体で修飾されたＭＮＡを作製した。

・ＭＮＡによるＧＦＰの固定化量及び放出量の測定
前記手順で得られた実施例１のＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳポリマー修飾ＭＮＡ、比較例１のシラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ修飾ＭＮＡ、及び比較例２のＡＰＴＥＳ－ＧＴＡ修飾ＭＮＡに、常法により緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を固定化した。得られた各ＧＦＰ固定化ＭＮＡを、植物細胞質を模擬した緩衝液（１００ｍＭ塩化カリウム、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、５００ｍＭマンニトール、１．２Ｍスクロース、２５ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．４ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、ｐＨ８．０）に浸漬し、９０秒間静置することでＧＦＰの放出を行った。浸漬前後のＭＮＡの蛍光顕微鏡画像から、針一本当たりのＧＦＰ蛍光強度を算出し、ＧＦＰの固定化量及び放出量を比較した。

その結果を図３のグラフに示す。実施例１のＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ修飾ＭＮＡに固定化したタンパク質の約７６％が植物細胞質模擬緩衝液で放出されたのに対し、比較例１のシラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ修飾ＭＮＡに固定化したタンパク質の放出量は４５％、比較例２のＡＰＴＥＳ－グルタルアルデヒド修飾ＭＮＡに固定化したタンパク質の放出量は４７％に留まった。

・シロイヌナズナ葉に対するＭＮＡを用いたＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の直接導入
２．５ｐｍｏｌのＣａｓ９並びに７．５ｐｍｏｌのフォワードｓｇＲＮＡ及びリバースｓｇＲＮＡをＣａｓ９緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に添加し、溶液量が１０μＬとなるよう調整した。氷上で１０分間反応することでＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を形成させた。このＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体溶液に、実施例１のＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体による修飾後にＮｉ－ＮＴＡを反応させたＭＮＡを浸漬し、４℃で一晩反応させた。このＭＮＡをアレイ動作装置のステージ上に載置し、ｘＧｘＧＵＳレポーターシロイヌナズナの葉を粘着性両面テープでサンプルステージに固定した。このレポーターシロイヌナズナのゲノムに組み込まれたβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子には、ｇＲＮＡの標的となるフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）遺伝子部分配列が挿入されており、ＰＤＳ配列の前にあるＧＵＳ遺伝子の一部と同じ配列がＰＤＳ配列の後ろにも存在し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体によるＰＤＳ配列内での切断が生じると、反復配列間において相同組み換えが起こり、正常なＧＵＳ遺伝子へと改変される（図４）。

５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、０．４Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター、及び０．０５％シルウェット（Silwet）^{（登録商標）}を含むヌクレアーゼフリー水を、ＭＮＡと葉組織の隙間に滴下した。ＭＮＡを葉組織に対して１０μｍ／秒の速度で挿入し、１分間静止後、１０μｍ／秒の速度で抜去した。葉組織はＢ５培地プレート（０．５％寒天、２０ｇ／Ｌグルコース、０．６ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１×ガンボーグＢ５培地用混合塩類、１×ムラシゲ・スクーグビタミン溶液（MS vitamins、ｐＨ５．７）上で４８時間インキュベートした。その後、葉組織を染色液（２０％（ｗ／ｖ）メタノール、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）に溶解した０．５ｍｇ／ｍＬのＸ－グルクロニド溶液中で３７℃、５時間反応させた。その後、エタノール及び酢酸を６：１で混合した溶液中に葉を添加し、一晩静置することで脱色した。９９．５％エタノール、及び滅菌蒸留水で洗浄後、スライドグラスに載せて倒立顕微鏡で青色の呈色を観察した（図５）。

その結果を下記表３に示す。ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体で修飾した実施例１のＭＮＡでは、無処理のＭＮＡを使用した時と比較して、ゲノム編集効率が約２０％向上していることが確認された。

［実施例群Ｂ：ＡＦＭ探針表面修飾による検討］
（１）ＡＦＭ探針の表面修飾
・実施例Ｂ１：ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体によるＡＦＭ探針表面修飾
無修飾のＡＦＭ探針に対して、プラズマアッシャーを用いて２００Ｗで１０分処理後、超純水に浸漬した。さらに、過酸化水素水０．５ｍＬと硫酸２ｍＬを混合したＳＰＭ溶液に浸漬し８０℃で３０分静置した。その後、超純水で洗浄し、過酸化水素水０．４ｍＬ、アンモニア水０．４ｍＬ、及び超純水２ｍＬを混合したＡＰＭ溶液に浸漬し、６５℃で３０分静置した後、超純水で洗浄した。次に、過酸化水素水１ｍＬと硫酸１ｍＬを混合したＳＰＭ溶液にＡＦＭ探針を浸漬し、室温で１０分静置することで、シリコン表面に表面水酸基を生成した。処理後のＡＦＭ探針を超純水で洗浄後、表面に吸着した水分子を取り除くために脱水エタノールで洗浄した。さらに、過酸化水素水０．４ｍＬ、塩酸０．４ｍＬ、及び超純水２ｍＬを混合したＨＰＭ溶液に浸漬し、８０℃で１０分静置した後、超純水及び脱水エタノールで洗浄した。

ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳポリマー粉末を終濃度５ｗｔ％となるようジメチルスルホキシド溶液に添加し溶解した。さらに終濃度１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で希釈し、終濃度０．５ｗｔ％のポリマー溶液とした。表面を洗浄したＡＦＭ探針をこのポリマー溶液に浸漬し、１２時間反応させた。１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）に終濃度５０ｍＭとなるようＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）を溶解し、この溶液１００μＬ中でＡＦＭ探針を３０分静置した後、ＭＥＳ緩衝液で洗浄した。ホウ酸緩衝液に終濃度１０ｍＭとなるよう溶解したＡＢ－ＮＴＡ中にＡＦＭ探針を３０分静置することでＮＴＡ基を導入し、ホウ酸緩衝液に溶解したエタノールアミン（終濃度１０ｍＭ）溶液で３０分静置することで、未反応ＮＨＳ基のブロッキングを行った。超純水に溶解した１００ｍＭ塩化ニッケル（II）（ＮｉＣｌ_２）に１０分浸漬後、２０ｎＭネスチンテールタンパク質溶液中で４℃で８時間以上静置することで修飾した（図６）。

・比較例Ｂ１：シラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ共重合体によるＡＦＭ探針表面修飾
ＡＦＭ探針の表面を１％フッ化水素酸で洗浄した後、硫酸過酸化水素混合液（sulfuric acid-hydrogen peroxide mixture：ＳＰＭ）処理及び塩酸過酸化水素混合液（hydrochloric acid-hydrogen peroxide mixture：ＨＰＭ）処理を行い、表面を水酸化した。得られた表面水酸化AFM探針を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したシラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ（終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）溶液に浸漬し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）に終濃度５０ｍＭとなるようＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）を溶解し、この溶液１００μＬ中でＡＦＭ探針を３０分静置した後、ＭＥＳ緩衝液で洗浄した。ホウ酸緩衝液に終濃度１０ｍＭとなるよう溶解したＡＢ－ＮＴＡ中にＡＦＭ探針を３０分静置することでＮＴＡ基を導入し、ホウ酸緩衝液に溶解したエタノールアミン（終濃度１０ｍＭ）溶液で３０分静置することで、未反応ＮＨＳ基のブロッキングを行った。超純水に溶解した１００ｍＭ塩化ニッケル（II）（ＮｉＣｌ_２）に１０分浸漬後、ブロッキング後の修飾ＡＦＭ探針を、２０ｎＭネスチンテールタンパク質溶液中で４℃で８時間以上静置することで修飾した。

（２）アクチン固定化基板の調製
アクチン重合バッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．２ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ）を用いて、終濃度４μＭの骨格筋由来アクチンタンパク質溶液を調整し、室温で３０分静置することで、アクチン繊維を重合させた。その後、ローダミンファロイジン（終濃度０．４μＭ）を添加し、氷上で１時間以上静置した。次に、２７φガラスベースディッシュに対して、エタノールに溶解した１ｍＭ（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）溶液０．４ｍＬを滴下し、１時間静置した。エタノールで３回洗浄後、エタノールに溶解した１０％グルタルアルデヒド溶液０．４ｍＬを滴下し１時間静置した。エタノールで３回洗浄後、１ｍＬのアクチン重合バッファーで１回洗浄した。アクチン重合バッファーで終濃度４００ｎＭとなるよう希釈したアクチン繊維溶液を２０μＬ滴下し、室温で３０分静置することで固定化した（図７）。その後、アクチン重合バッファーを用いて１ｍＬ、５分、１００ｒｐｍの条件で三回洗浄を行った。最後にアクチン重合バッファーに溶解した２μＭＢＳＡ溶液を滴下し、室温で３０分静置することで、アクチンが結合していないアルデヒド基をブロッキングした。その後、ＢＳＡ含有アクチン重合バッファーを用いて１ｍＬ、５分、１００ｒｐｍの条件で三回洗浄を行った。

（３）ＡＦＭを用いたネスチンテール引張試験
ＡＦＭを用いてセットポイント１ｎＮ、速度１μｍ／ｓでネスチンテール修飾探針を上下させることで、アクチン繊維固定化ガラス基板の一辺１０μｍの正方形内における８×８の６４点でネスチンテール引張試験を行い（図８）、得られたフォースカーブを解析した。高分子の伸展によって得られる特徴的なカーブを図９（ａ）に示す。また、基板と探針との間における非特異的相互作用の結合破断力を示す伸展距離０のカーブを図９（ｂ）に示す。得られたフォースカーブのうち、非特異的相互作用を意味する図９（ｂ）の伸展距離０のピークが観察されたフォースカーブの数を計測したところ、ネスチンテールをＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体により修飾した実施例Ｂ１のＡＦＭ探針では６４カーブ中２３カーブ、シラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ共重合体により修飾した比較例Ｂ１のＡＦＭ探針では６４カーブ中４０カーブであった。即ち、非特異的相互作用の出現頻度は、ＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体により修飾した実施例Ｂ１のＡＦＭ探針では３５．９％、シラン－ＰＥＧ－ＮＨＳ共重合体により修飾した比較例Ｂ１のＡＦＭ探針では６２．５％となった。即ち、本発明のＤＯＰＡ／ＨＰＡ／ＮＨＳ共重合体を用いてネスチンテールタンパク質を修飾したことで、基板－探針間の非特異的な相互作用が顕著に抑制されることが確認された。

本発明の三元共重合体は、マイクロニードル・ナノニードルや原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）のカンチレバー等の物質吸着針状物の表面修飾に用いることにより、物質の吸着効率、吸着特異性、放出効率等を向上させるという効果を有する。よって、物理学、化学、生物学等の実験や分析等の分野において、極めて高い利用可能性を有する。

１： 支持体
２： 針部
１０：マイクロニードルアレイ

Claims (17)

1. 式（１）で表される構造を有する三元共重合体。
   （但し、式（１）中、
   Ｒ^１１は、炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖の二価の脂肪族炭化水素基を表し、
   Ｒ^１２は、水素又はメチルを表し、
   Ｒ^２１は、１～３個の水酸基により置換された炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖の一価の脂肪族炭化水素基を表し、
   Ｒ^２２は、水素又はメチルを表し、
   Ｒ^３は、水素又はメチルを表し、
   ＲｉｎｇＡは、１～３個の水酸基を有する芳香族炭化水素基を表し、
   ＲｉｎｇＢは、１～３個のオキソ基を有する窒素含有環式基を表し、
   Ｔ^１及びＴ^２は、各々独立に、末端基を表し、
   ｘは、１以上５０００以下の自然数を表し、
   ｙは、１以上８０００以下の自然数を表し、
   ｚは、１以上５０００以下の自然数をし、
   ここで、ｘ個、ｙ個、及びｚ個の各単量体単位は、各々ブロックとして存在していてもよく、ランダムに共存していてもよい。）
2. ＲｉｎｇＡが、ジヒドロキシフェニル基である、請求項１に記載の三元共重合体。
3. ＲｉｎｇＢが、Ｎ－コハク酸イミド基である、請求項１に記載の三元共重合体。
4. 表面の少なくとも一部が、請求項１～３の何れか一項に記載の三元共重合体により修飾されてなる、表面修飾針状物。
5. 支持体と、前記支持体上に配列された複数の針部とを備えるマイクロニードルアレイであって、
   前記複数の針部の一部又は全部が、請求項４に記載の表面修飾針状物である、マイクロニードルアレイ。
6. 前記針部の基底面の直径が１～２０μｍであり、
   前記針部の先端面の直径が０．５～３μｍであり、
   前記針部の長さが３０～１００μｍであり、
   前記針部の先端面及び断面の直径が前記基底面の直径以下、かつ、前記先端面から前記針部の長さマイナス１０μｍまでの前記断面の直径の増加率が０～５％であり、
   前記針部の先端面間距離が２０～１０００μｍである、請求項５に記載のマイクロニードルアレイ。
7. 前記針部のアスペクト比（長さ／（１／２長さ面の直径））が５～２００である、請求項６に記載のマイクロニードルアレイ。
8. 前記支持体及び前記針部が一体であり、かつ、単結晶シリコンからなる、請求項６に記載のマイクロニードルアレイ。
9. 植物細胞への目的物質の導入に用いるための、請求項６に記載のマイクロニードルアレイ。
10. 前記植物細胞が植物組織に含まれている細胞である、請求項９に記載のマイクロニードルアレイ。
11. 前記植物組織が茎頂分裂組織である、請求項１０に記載のマイクロニードルアレイ。
12. 植物細胞に目的物質を導入する方法であり、
    前記植物細胞に、前記目的物質を表面に付着させた、請求項４に記載の表面修飾針状物、又は、請求項５に記載のマイクロニードルアレイの針部を挿入する挿入工程、
    を含む、植物細胞への物質導入方法。
13. 前記挿入工程における挿入速度が、０．０１～５０μｍ／秒である、請求項１２に記載の植物細胞への物質導入方法。
14. 前記挿入工程において、前記針部を、挿入方向に、振幅０．０１～５０μｍ及び周波数０．１～２０００Ｈｚの条件で振動させる、請求項１２の植物細胞への物質導入方法。
15. 前記植物細胞が植物組織に含まれている細胞であり、植物組織への物質導入方法である、請求項１２に記載の植物細胞への物質導入方法。
16. 原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力測定装置のカンチレバーに取り付けて使用される、針状先端部を有するプローブであって、
    前記針状先端部が、請求項４に記載の表面修飾針状物である、プローブ。
17. 請求項１６に記載のプローブを含む、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力測定装置のカンチレバー。

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