JP2024066198A - 生体分子自動検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】小型で取り扱い性に優れ、かつ高速処理可能な生体分子検査自動化装置を提供することである。【解決手段】マイクロチューブ、試料ホルダー、試料移送機構、生体分子検知機構、試料ホルダー移送機構および制御機構を有し、試料移送機構は採液ピン、治具、第１の電動ステージ、柔軟性に富むチューブおよびポンプを具備し、検知機構は検査チップ、画像取得装置、対物レンズを有する光学系、照明光学系からなる一体配置の１つの像検出装置、光源および信号処理装置を具備し、像検出装置の移動手段を備え、検知機構は光源からの光が前記光学系を介してメタ表面をもつ検査チップの検査面に照射され、試料の蛍光が前記光学系を介して画像取得装置に取り込まれ、信号処理装置にて信号解析される構成になっており、制御機構は第１の電動ステージの駆動、ポンプの駆動、光照射の制御および信号解析の制御を行う。【選択図】 図１

Description

本発明は、生体分子自動検出装置に関する。

医療の高度化、効率化要求に伴い、体外診断検査などで、生体分子を自動化して検出する装置の需要が高まっている。

医療用の検査装置としては、たんぱく質対象のエライザ法や核酸対象のＰＣＲ法などの手法を用いたものが多用されているが、人為操作を必要とするものが多く、また、精度、感度の高さを追求した高額な装置も多い。
このような背景から、小型で取り扱い性が優れ、廉価な生体分子自動検出装置が嘱望されていた。なお、生体分子検査装置としては、例えば、特許文献１～３に開示がある。

特開２００７－２４８１５９号公報 特開２０１０－８１０７号公報 特開２０１５－５５５６８号公報 国際公開２０２１／１３１３３１

Ｒｕｄｏｌｆ Ｇｅｓｚｔｅｌｙｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｈｉｌｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ａｒｃｈ． Ｈｉｓｔ． Ｅｘａｃｔ Ｓｃｉ．（２０１２）６６：４２７－４３８，ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００４０７－０１２－００９８－５．

本発明は、小型で取り扱い性に優れ、感度が高く、かつ高速処理可能な全自動測定の生体分子検査装置を提供することを目的とする。

課題を解決するための本発明の構成を以下に示す。
（構成１）
マイクロ流路に内包される被測定試料に光を当てて前記被測定試料から発せられる蛍光を検知する検査チップを搭載した生体分子検出装置であって、
前記生体分子検出装置は、被測定試料を入れるマイクロチューブ、前記マイクロチューブを収める試料ホルダー、前記マイクロチューブ内に保持された前記被測定試料を前記検査チップに送る試料移送機構、生体分子を検知する検知機構、試料ホルダー移送機構、および制御機構を有し、
前記マイクロチューブは、採液ピンで貫通することが可能な蓋を有し、前記被測定試料を前記マイクロチューブ内に密閉して保持することが可能な構造であり、
前記試料ホルダーは、複数の前記マイクロチューブを列状または行列状に載置可能なホルダーであり、
前記試料移送機構は、前記採液ピン、前記採液ピンを保持する治具、前記治具と前記試料ホルダーの間隔（Ｚ方向）を変化させる第１の電動ステージ、耐薬性を備えて柔軟性に富むチューブ、およびポンプを具備し、
前記チューブは、前記採液ピンから前記ポンプを介して前記検査チップに接続されて、前記ポンプの駆動によって前記採液ピンから吸引された被測定試料が前記検査チップに移送される構成になっており、
前記検知機構は、前記検査チップ、画像取得装置、対物レンズを有する光学系、照明光学系、前記光を発する光源、および前記画像取得装置からの信号を解析処理する信号処理装置を具備し、
前記検知機構は、前記光源から発せられた光が前記照明光学系を介して前記検査チップの検査面に照射され、前記検査面から発せられる蛍光が前記対物レンズを有する光学系を介して前記画像取得装置に取り込まれ、前記画像取得装置からの信号が前記信号処理装置に送られて信号解析される構成になっており、
前記検査チップは、メタ表面を有する第１の基板と、
前記第１の基板と対向して位置し、マイクロ流路を有する第２の基板とを備え、
前記メタ表面は、検出されるべき生体分子の固定を効率化する間隙を有すると共に、前記生体分子が発する蛍光の波長範囲を含む領域において蛍光増強を示し、
前記第２の基板は、前記光を透過する材料からなり、
前記第1の基板と前記第２の基板との間で前記蛍光が共振する検査チップであり、
前記画像取得装置および前記対物レンズを有する光学系は、一体で配置された１つの像検出装置になっており、
前記像検出装置の位置を移動させる像検出装置移動手段が具備されており、
前記像検出装置移動手段は、第２の電動ステージによって一列状の方向（Ｘ方向）に沿って前記像検出装置の位置を移動させることができ、
前記試料ホルダー移送機構は、前記試料ホルダーと前記採液ピンの相対位置をＹ軸方向に沿って変える第３の電動ステージを有し、
前記制御機構は、前記第１の電動ステージの駆動、前記ポンプの駆動、前記光の前記検査面への照射の制御、前記第２の電動ステージの駆動、前記第３の電動ステージの駆動、および前記画像取得装置の信号解析の制御を行う、生体分子検出装置。
（構成２）
前記検査チップは複数からなり、離散的に配置されている、構成１に記載の生体分子検出装置。
（構成３）
前記一体で配置された１つの像検出装置は、前記画像取得装置、前記対物レンズを有する光学系、前記照明光学系、および前記光源からなる、構成１または２に記載の生体分子検出装置。
（構成４）
前記メタ表面は、金属の周期的相補的積層構造またはナノロッドアレイ構造である、構成１から３の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
（構成５）
前記第１の基板と前記第２の基板とにより形成されるマイクロ流路の高さは、１０μｍ以上１００μｍ以下の範囲である、構成１に記載の生体分子検出装置。
（構成６）
前記第１の基板と前記第２の基板とにより形成されるマイクロ流路の高さは、１５μｍ以上５０μｍ以下の範囲である、構成５に記載の生体分子検出装置。
（構成７）
前記マイクロ流路の材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる、構成１から６の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
（構成８）
前記メタ表面は、前記金属の周期的相補的積層構造であり、
前記金属の相補的積層構造は、基材と、前記基材の表面に位置するスラブ材と、少なくとも前記スラブ材上に位置する金属材料とを含み、
前記基材は、少なくとも前記スラブ材と接する表面層を備え、
前記スラブ材は、前記表面層の屈折率よりも高い屈折率を有する材料からなると共に、その表面から前記基材の前記表面層に達する、周期的に配列した複数の穴を有し、
前記金属材料は、前記スラブ材の表面、および、前記複数の穴の底面を形成する前記基材の表面層上にそれぞれ位置する、構成４に記載の生体分子検出装置。
（構成９）
前記メタ表面は、ナノロッド構造であり、
前記ナノロッド構造は、基材と、前記基材の表面に周期的に起立する複数のナノロッドとを備え、
前記基材は、前記複数のナノロッドの屈折率よりも小さい屈折率を有する材料からなる、構成１から７の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
（構成１０）
前記第１の電動ステージを駆動させて、前記採液ピンのピン先が、前記蓋を貫通して、前記マイクロチューブ内に保持された前記被測定試料を予め定めた所定量吸引可能な位置に到達するまで下降させ、
前記ポンプを駆動させて、前記被測定試料を前記検査チップに移送させ、
前記光源、および前記照明光学系を介して前記検査面への光照射を行い、
前記検査面からの前記蛍光を、前記対物レンズを有する光学系を介して前記画像取得装置で受光し、前記信号処理装置による信号強度分析の制御を行う、構成１から９の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
（構成１１）
前記チューブおよび前記検査チップの数は、複数からなる前記採液ピンの数と等しい、構成１から１０の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
（構成１２）
前記試料ホルダーの前記マイクロチューブの配置周期は、前記マイクロチューブの直径の１．２倍以上２．１倍以下である、構成１から１１の何れか１つに記載の生体分子検出装置。

本発明によれば、小型で取り扱い性に優れ、広いダイナミックレンジを有しながら感度が高く、かつ高速処理可能な生体分子検査装置が提供される。この装置を用いれば、体外診断検査などにおける生体分子検出を自動化することができ、検出に要する人的負担の大幅な低減、工程の短時間化および検出結果の定量性向上が実現される。

本発明の検査装置の全体構成を示す説明図である。 本発明の試料移送機構の構成を示す説明図である。 本発明の試料移送機構の構成を示す説明図である。 本発明の検知機構の構成を示す説明図である。 本発明の検知機構の構成を示す説明図である。 本発明の蛍光検出用生体分子検査チップを示す模式図である。 本発明の蛍光検出用生体分子検査チップを用いた検出原理を示す模式図である。 金属の相補的積層構造を有するメタ表面の模式図である。 ナノロッド構造を有するメタ表面の模式図である。 実施例１の検査装置の概要を示す鳥観図である。 実施例における被測定試料採取部の構造を示す断面構造図である。 実施例１の検査チップが配置された基板の外観を示す図である。 実施例１の検査チップホルダーの外観を示す図である。各チップには柔軟なチューブが接続されており、中央のスポットには光源（ＬＥＤ）からの光が集光されて照射されている。。 実施例１：検出標的としてＤＮＡを用いたときの検査チップ検出面蛍光画像取得結果を示す画像である。 実施例２：検出標的としてＤＮＡを用いたときの検査チップ検出面蛍光画像取得結果を示す画像である。 実施例３：検出標的としてｃＤＮＡを用いたときの検査チップ検出面蛍光画像取得結果を示す画像である。 実施例３：標的濃度と蛍光強度の関係を示す特性図である。 実施例３：共焦点光学系におけるｃＤＮＡの検出結果と解析を示す。 実施例４：検出標的としてＰＳＡを用いたときの検査チップ検出面蛍光画像取得結果を占める画像である。

以下本発明を実施するための形態について図面を参照しながら説明する。なお、同様の要素には同様の番号を付し、その説明を省略することがある。また、文章中のＡ～Ｂは、Ａ以上Ｂ以下を表す。

（実施の形態１）
実施の形態１の生体分子検出装置１は、マイクロ流路を有する検査チップに光を当てて、検査チップの検査面に捉えられた被検査試料から発せられる蛍光を測定して生体分子を検出、測定する生体分子検出装置であって、図１に示すように、試料を入れるマイクロチューブ１１を収める試料ホルダー１２、試料を試料ホルダー１２から検査チップに移送する機能をもつ試料移送機構１３、生体分子を検知する検知機構１４、および試料移送機構１３および検知機構１４および試料ホルダー移送機構１５の制御を行う制御機構１６からなる。

マイクロチューブ１１は、採液ピン２０１で貫通することが可能な蓋を有し、５０μＬ程度の量の被測定試料をマイクロチューブ１１内に密閉して保持することが可能な容器である。ここで、蓋は、採液部分と物理的に干渉することなく、常に動作することが必要である。
一般に、マイクロチューブの蓋は、被測定試料の蒸発を防ぐため、厚いポリプロピレン製で作製されている。この場合、採液ピン２０１の針先で蓋を貫通させることは容易ではなく、機械強度的には電動ドリルが必要になるほどである。しかし、電動ドリルは削りくずを出すため被測定試料を汚染するので使用できない。
この課題を解決するため、直径１．５ｍｍ以上７ｍｍ以下にくり抜かれ、その上にアルミ箔が張られたマイクロチューブ専用の押さえ蓋を使用することが好ましい。アルミ箔を押し込むことでマイクロチューブの口を塞ぎ密閉状態を作り、なおかつ採液ピンで容易に貫通して採液することが可能になる。

試料ホルダー１２は、複数のマイクロチューブ１１を列状または行列状に載置可能なホルダーである。ここで、操作性を損なわずにパッキングデンシティを高めて装置を小型化する上で、マイクロチューブ１１の配置周期はマイクロチューブ１１の直径の１．２倍以上２．１倍以下とすることが好ましい。

試料移送機構１３は、図２に示すように、採液ピン２０１、採液ピン２０１を保持する治具２０２、治具２０２と試料ホルダー１２との間隔を変化させる、すなわち治具２０２と試料ホルダー１２の相対位置を鉛直方向（Ｚ軸方向）に変化させる第１の電動ステージ２０３、柔軟性に富むチューブ２０４、およびポンプ２０５を具備する。

チューブ２０４は、採液ピン２０１からポンプ２０５を介して検査機構１４内に収められた検査チップ（図示なし）に接続されて、ポンプ２０５の駆動によって採液ピン２０１から吸引された被測定試料が検査チップに移送される構成になっている。なお、ポンプ２０５は必ずしも採液ピン２０１と検査機構１４の間に置かれている必要はなく、図３に示すように検査機構１４の後に備えられていてもよい。
ここで、採液部分から検査機構１４、ポンプ２０５へ至る流路長は短いほど、送液時間を短時間化できるため好ましい。なお、採液ピン２０１は、被測定試料が少量であるため、底面付近の試薬の採液に失敗しないために採液部分がマイクロチューブ１１の底の直前まで到達するストロークを有する必要がある。採液ピン２０１は、最小４０ｍｍ上下動するため、その可動範囲を考慮して接続チューブを設置する必要がある。この採液ピン２０１に接続するチューブ２０４の内径は、試料を含む薬液の使用量を少なくするという観点と一定以上の薬液の供給流速を確保するという観点から、０．５ｍｍ以上２ｍｍ以下とすることが好ましい。
チューブ２０４の材質としては、耐薬性があり柔軟性がある材料であれば用いることができ、例えばポリ塩化ビニール、シリコンゴム、ポリアミド、ポリウレタンエラストマー、パーフルオロアルコキシルアルカンポリマー、パーフルオロエチレンプロペンコポリマーおよびポリオレフィンを挙げることができる。この中でも、酸性、アルカリ性の両方の薬液に対して耐性があり、コストも低いポリ塩化ビニール製チューブが特に適している。ここで、検査チップから小型ポンプに至る経路に関しては、圧縮動作により液流を作り出すため、伸縮性と耐久性に優れたシリコンゴムチューブが適している。

ポンプ２０５としては、小型化が容易な圧縮送液型ポンプを好んで用いることができる。薬液の使用量が少量なため、圧縮式の中でも、ロータリーポンプを特に好んで用いることができる。
また、ポンプ２０５は多様な測定条件に対応するため、８μＬ／分以上１００μＬ／分以下の範囲で定量的に流速を保って送液できることが好ましく、ポンプ２０５で並行して送液する各チャンネルに流速差がない状態で送液できることが好ましい。

検知機構１４は、図４に示すように、検査チップ１００、画像取得装置５１１、対物レンズ５２１、照明光学系５３１、波長選択フィルタ５３２、光源５４１、および画像取得装置５１１からの信号を解析処理する信号処理装置５５０を具備する。そして、検知機構１４は、光源５４１から発せられた光５３３が照明光学系５３１および５３２による反射を介して検査チップ１００の検査面１１０上面に照射され、前記検査面から発せられる蛍光が対物レンズ５２１を介して集光され、５３２により選択的に透過されて画像取得装置５１１に取り込まれ、画像取得装置５１１からの信号が信号処理装置５５０に送られて信号解析される構成になっている。また、画像取得装置５１１、および結像光学系等対物レンズを有する光学系５２１および５３２は、一体で配置された１つの像検出装置５１０になっており、像検出装置５１０の位置を移動させる像検出装置移動手段が具備されている。前記像検出装置移動手段は、第２の電動ステージによって検査チップ１００が配列された方向（Ｘ方向）に沿って像検出装置５１０の位置を移動させることができる構成になっている。

ここで、光源５４１および照明光学系は、図４に示すように、コリメータレンズ５３１を用いて光線５３３を平行光とすることにより、照明光学系の一部と光源を一体として移動可能な像検出装置５１０と分けて固定して使用することもできるし、図５に示すように、光源５４１およびレンズ５３１ａおよびハーフミラー５３２ａからなる照明光学系も像検出装置５１０に一体として組み込んだ構成とすることもできる。前者である図４に示す構成は、特に照度の高い照明を行う場合に有効であり、後者である図５に示す構成の場合は、光源５４１として小型、軽量および発熱量の少ないのＬＥＤや半導体レーザ光源を用いることにより、装置全体の小型化が容易になるという特徴を有する。

光源５４１は、蛍光分子の励起波長に合わせて選択し、検査チップ１００の検査面での光パワーを１ｍＷ以上確保するために出力２ｍＷ以上であることが好ましい。なお、光源５４１の発熱、消費電力の問題から、その出力の上限は、ＬＥＤの場合は１０ｍＷ以下に抑えておくことが好ましい。
光源５４１としては、ＬＥＤ、半導体レーザ、波長選択可能なレーザおよび波長選択可能な白色光源を挙げることができる。この中でも、小型・軽量で、重量当たりの輝度が高いＬＥＤは特に好んで用いることができる。

照明光学系としては、図４に示すような対物レンズ５２１とコリメータレンズ５３１、波長選択フィルタ５３２などの集光光学系を組み合わせた光学系や図５に示すような集光レンズ５３１ａとハーフミラーなどの反射ミラー５３２ａを組み合わせたケーラー照明光学系などを挙げることができる。
また、照明光学系は、蛍光分子を効率的に励起する光を導入するためのビームスプリッターや蛍光発光を選択的に透過するフィルタを備えておくことが好ましい。

像検出装置５１０では、検査チップの微小な検査面からの蛍光を十分な収率で捉えるため、開口数（ＮＡ）が０．１２以上の対物レンズ５２１あるいは集光レンズ５２１aを用いることが好ましく、検査チップの厚みを考慮して焦点距離は３ｍｍ以上であることが望ましい。空間的な高分解能を求める場合には共焦点光学系を特に好んで用いることができる。本発明の装置では焦点距離を３ｍｍ以上確保した比較的小型・軽量の結像光学系（対物レンズを有する光学系）であり、その光学系を第２の電動ステージで移動させても光軸等のずれは生じにくく、安定した蛍光測定を行うことができる。
像検出装置５１０は、被測定試料からの蛍光を集光測定することが目的であるため、蛍光の波長帯を選択するバンドパスフィルタ５３２あるいは５３２aが、像検出装置５１０内、あるいは検査チップ１００の検査面から画像取得装置の撮像素子面までの間に備えられていることが好ましい。
なお、像検出装置５１０の対物レンズと検査チップ１００の検査面との高さ位置調整のために、５１１を保持するカメラホルダーには微小位置合わせ用マイクロステージを組み込んでおくことが好ましい。また、対物レンズと検査チップ１００に形成された流路方向の位置調整のために第２の電動ステージ上にマイクロステージを配置しておくことが好ましい。

画像取得装置５１１は、ＣＣＤカメラなどの撮像素子からなり、ノイズが少なく高感度な撮像素子を好んで用いることができる。画素数としては特に制約はないが、５１２×５１２以上２０４８×２０４８以下が好ましい。また、ＣＭＯＳ撮像素子の場合は、低ノイズで高い感度を得やすい裏面照射型の素子を好んで用いることができる。なお、前述の蛍光測定用のバンドパスフィルタに換えて、蛍光波長帯のみに感度を有する撮像素子を用いることもできる。

信号処理装置５５０はＰＣなどからなり、前述のように画像取得装置５１１からの信号を保存する。また、装置５１１は解析して、生体分子の存在の有無やその量を測定、解析する設備でもある。

検査チップ１００は、蛍光検出型のマイクロ流路型検査チップ、すなわちマイクロ流路に内包される被検査試料に光を当てて被検査試料から発せられる蛍光を検知する検査チップで、メタ構造を基板表面に作製して蛍光を共鳴させて感度を飛躍的に向上させたメタ表面マイクロ流路型検査チップである。
メタ表面マイクロ流路型検査チップは、本願発明者が考案したもので、特許文献４に開示がある。

本発明で用いたメタ表面マイクロ流路型検査チップ（蛍光検出用生体分子検査チップ）１００は、メタ表面１１０を有する第１の基板１２０と、そのメタ表面１１０側に対向して位置し、マイクロ流路１３０を有する第２の基板１４０とを備える。メタ表面１１０は、検出されるべき生体分子（以降では簡単のため標的生体分子と称する）の固定を効率化する間隙を有し、かつ、蛍光増強を示す。

ここで、「標的生体分子」とは、疾患診断のマーカー分子として使用される抗体や抗原、プロコラーゲンＩＩＩペプチド、副次生成タンパク質等の生体分子であるが、例示的には、肝炎ウイルスＩｇＭ型抗体、肝炎ウイルスｓ抗原、ＣＥＡ分子、ｐ５３分子、ｐ５３抗体等の生体分子、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸およびその細分化された分子等である。

「間隙を有するメタ表面」とは、生体分子よりも大きい数十～数百ナノメートルオーダの間隙を有する立体構造からなる表面を意図する。このような間隙を有することにより、メタ表面１１０の表面積が大きくなり、生体分子の固定を効率化できる。また、流体の速度を局所的に低減させることで生体分子の固定を効率化できる。図６では巨視的に示すため、図７では分子を拡大模式化して示すため、間隙を図示しないが、メタ表面１１０上に捕捉分子が固定され、その捕捉分子に補足抗体が結合し、さらに、補足抗体に効率的に蛍光標識付き生体分子が結合している様子が示される。このように、メタ表面１１０は、生体分子の固定を効率化し得る。ここで、後述する図８の３５０、図９の４３０が間隙にあたる。

「蛍光増強を示すメタ表面」とは、上述したように、人工ナノ表面構造であって、その上に蛍光を発する物質が位置する場合に、蛍光物質に活性化させない平坦な表面（シリコンウェーハや平坦な石英基板など）と比して、蛍光強度を増大させる人工ナノ表面構造を意図する。本発明の検査チップ１００によれば、第１の基板１２０のメタ表面１１０は、さらに、標的生体分子（例えば、図７の蛍光標識付き生体分子）が発する蛍光の波長範囲を含む領域において蛍光増強を示すため、標的生体分子の濃度が低濃度であっても高精度に検出することができる。なお、「標的生体分子が発する蛍光」とは、標的生体分子それ自身が発する蛍光、標的生体分子に標識化された蛍光標識が発する蛍光、あるいは、標的生体分子に捕捉された二次抗体に標識化された蛍光標識が発する蛍光を意図する。

本発明の検査チップ１００によれば、第２の基板１４０は、可視光または近赤外光を透過する材料（光透過性材料）からなり、第１の基板１２０上に位置する標的生体分子に光（励起光）が照射されると、標的生体分子あるいは標識化された蛍光標識が励起され、蛍光を発する。図７に示すように、この標的生体分子が発する蛍光は、第１の基板１２０と第２の基板１４０との間で共振する。この結果、標的生体分子からの蛍光の強度が増大され、標的生体分子の濃度が低濃度であっても高精度に検出することができる。さらに、共振によって増大した蛍光は、メタ表面１１０ではなく、第２の基板１４０側に効率的に放射されるので、蛍光は第２の基板１４０を透過し、効率良く検出できる。本願明細書において、可視光とは、波長３６０ｎｍ以上８３０ｎｍ未満の範囲の波長を有する光を意図する。また、近赤外光とは波長８３０ｎｍ以上１６００ｎｍ以下の範囲の波長を有する光を意図する。

なお、本願明細書において、可視光または近赤外光を透過する材料とは、可視光または近赤外光の第２の基板１４０の平均透過率が６０％以上となる材料を意味し、好ましくは８０％以上となる材料である。このような可視光または近赤外光を透過する材料は、透明セラミクス、ガラス等の無機材料およびプラスチック等の有機材料を使用できるが、加工性の観点から、シリコーン系樹脂、（メタ）アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、スチレン系樹脂、ポリカーボネート、エステル系樹脂、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂、ポリアミド、シクロオレフィンポリマー等が好ましい。中でも、シリコーン系樹脂としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。

メタ表面１１０の示す蛍光増強は、可視光域または近赤外光における波長を有する光の強度の増強であり、好ましくは、５２０ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長範囲にピークを有する光を増強する。これにより、生体分子の検出を促進できる。さらに好ましくは、５４０ｎｍ以上６２０ｎｍ以下または８００ｎｍ以上９００ｎｍ以下の波長範囲にピークを有する光を増強する。

第１の基板１２０と第２の基板１４０との間の距離Ｄ（図７）は、好ましくは、１０μｍ以上１００μｍ以下の範囲である。この範囲であれば、マイクロ共振器としての機能が顕在し、マイクロ流路として標的生体分子を第１基板１２０上へ固定する効率が高まる。一方で、距離Ｄを１０μｍよりも小さくする場合、流路内での安定的な液流が困難となる、または第２基板１４０が自重による変形によって第１基板１２０に接触するなどの不具合が起こることが予見され、好ましくない。距離Ｄは、より好ましくは、１５μｍ以上５０μｍ以下の範囲である。

メタ表面１１０は、好ましくは、金属の相補的積層構造、または、高屈折率を有する半導体あるいは誘電体からなるナノロッド構造である。これらの構造は、生体分子の固定を効率化する間隙を有し、かつ、蛍光増強を示し得る。

図８は、金属の相補的積層構造を有するメタ表面の模式図である。

金属の相補的積層構造を有するメタ表面３００は、基材３１０と、基材３１０の表面に位置するスラブ材３２０と、少なくともスラブ材３２０上に位置する金属材料３３０とを含む。

基材３１０は、少なくともスラブ材３２０と接する表面層３４０を備える。スラブ材３２０は、表面層３４０の屈折率よりも高い屈折率を有する材料からなる。さらに、スラブ材３２０は、スラブ材３２０の表面から基材３１０の表面層３４０に達する周期的に配列した複数の穴３５０を有する。このような構造により、基材３１０およびスラブ材３２０は、六方格子状、正方格子状等の周期的に配列される複数の穴３５０の周期Λ_１および直径Ｄ_１によって決定される周期構造体に特徴的な光の共鳴バンド状態を有する。この場合に、スラブ材３２０の屈折率が、表面層３４０の屈折率よりも大きいことがスラブ材３２０への光のバンド状態密度（閉じ込め効果）を大きくするために必要である。

金属材料３３０は、少なくともスラブ材３２０上に位置するが、詳細には、スラブ材３２０の表面および複数の穴３５０のそれぞれを介した基材３１０の表面層３４０上に位置しており、相補的な金属積層構造を有する。わかり易くは、金属材料３３０は、スラブ材３２０の複数の穴３５０における穴側壁３６０を覆わない。すなわち、金属材料３３０はスラブ材３２０の厚さから金属材料３３０の厚さを引いた距離離間することを典型とする。以上のような構造により、金属の相補的積層構造を有するメタ表面３００は、金属材料３３０で覆われていない穴側壁３６０を通って、スラブ材３２０内に閉じ込められる共鳴状態を形成できる。さらに、金属材料３３０が付与されているので、上述の共鳴の線幅がそれぞれ広帯域化されており、この複数の共鳴の少なくとも１つが、標的生体分子からの蛍光波長と重なることにより、その共鳴の線幅の範囲において効率的に蛍光を増強する。

スラブ材３２０は、表面層３４０が屈折率１．５程度の材料が容易に使用できるから、２以上の屈折率を有する材料からなることが好ましい。スラブ材３２０の屈折率の上限は特に制限はないが、入手できる材料から４以下である。具体的には、スラブ材３２０は、Ｓｉ、Ｇｅ、ＳｉＮ、ＳｉＣ、ＩＩ－ＶＩ属の半導体、ＩＩＩ－Ｖ属の半導体および二酸化チタン（ＴｉＯ_２）からなる群から選択される材料である。これらの材料であれば、２以上の屈折率を有しており、加工性に優れるまたは成長技術が発展しているため、容易にスラブ材３２０を形成できる。

スラブ材３２０は、好ましくは、１００ｎｍ以上２μｍ以下の範囲の厚さを有する。この範囲であれば、光のバンド状態を形成できる。金属材料３３０が組み合わさることにより、光の放射率の大きな共鳴状態が発現し、蛍光増強できる。より好ましくは、スラブ材３２０は、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の範囲の厚さを有し、これにより、スラブ材３２０への光の閉じ込め効果が増し、金属材料３３０との組み合わせた相補的な積層構造において、蛍光増強に適した共鳴状態を構成しやすくなる。

複数の穴３５０の周期Λ_１は、光の波長程度であるが、好ましくは、３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲を有すれば、メタ表面３００は、５２０ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。周期Λ_１は、より好ましくは、４００ｎｍ以上７５０ｎｍ以下の範囲を有する。これにより、メタ表面３００は、５４０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。複数の穴３５０は、２以上の異なる周期を有する穴であってもよい。この場合も、２以上の異なる周期のそれぞれが、３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲を有すれば、可視光域および近赤外光域において複数の範囲の光を増強できるので、蛍光標識の異なる２種以上の生体分子の検出も可能となる。

複数の穴３５０の直径Ｄ_１は周期Λ_１よりも小さい範囲で、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲を有すれば、メタ表面３００は、５４０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。直径Ｄ_１は、より好ましくは、２５０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下の範囲を有する。これにより、メタ表面３００は、５４０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。

なお、複数の穴３５０は、２以上の異なる直径を有する穴であってもよい。この場合も、２以上の異なる直径のそれぞれが、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲を有すれば、可視光域および近赤外光域において複数の範囲の光を増強できるので、蛍光標識の異なる２種以上の生体分子の検出も可能となる。

当然ながら、複数の穴３５０が、２以上の異なる直径および２以上の異なる周期で配列されていてもよく、これにより、蛍光増強可能な可視光および近赤外光の波長域を制御でき、多様な生体分子に対応できる。

穴の形状は、図８では円柱状で示したが、これに限らず、角柱状、三角柱状などその他の形状であってもよく、共鳴状態を呈する限り、制限はない。

基材３１０の表面層３４０は、好ましくは、２未満の屈折率を有する材料からなる。表面層３４０の屈折率の下限は特に設定はないが、入手できる材料から１以上である。表面層３４０には、いわゆる透明絶縁体を採用できるが、具体的には、ＳｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、ガラスおよびプラスチックからなる群から選択される材料からなる。プラスチックには上述の樹脂が含まれる。これらの材料であれば、上述のスラブ材３２０と表面層３４０との屈折率の大小関係により、効率的に、スラブ材３２０に光を閉じ込めることができる。なお、基材３１０は、Ｓｉ基板、石英基板などのバルク基板と表面層３４０とから形成され、スラブ材３２０および金属材料３３０を維持できる任意の基板であり得る。

表面層３４０の厚さは、スラブ材３２０の厚さと同じまたはそれ以上であることが好ましい。これにより、スラブ材３２０を光損失の少ない導波路とすることができる。表面層３４０は、より好ましくは、２００ｎｍ以上の厚さを有する。なお、容易に入手でき、加工性に優れているという観点から、基材３１０をＳｉ基板として、表面層３４０をＳｉＯ_２とし、Ｓｉからなるスラブ材３２０と融着したものがある。また、基材３１０をガラス基板などとし、Ｓｉ層を成膜形成してスラブ材３１０とすることも可能である。

金属材料３３０は、特に制限はないが、ドルーデ金属に近似できる複素誘電率を有する物質であればよい。ドルーデ金属とは、自由電子を有する金属をモデル化したものであり、複素誘電率ε（ω）＝１－ω_ｐ ^２／ω（ω＋ｉγ）で表される金属である。ここで、ωは角周波数、ω_ｐはプラズマ周波数、ｉは虚数単位、γはダンピング定数である。したがって、多くの金属が、電子のバンド間遷移が生じる波長近傍を除いて、ドルーデ金属として近似できることが知られている。

可視光域あるいは近赤外光域において、このようなドルーデ金属に近似できる複素誘電率を有する物質には、例示的には、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、白金（Ｐｔ）、チタン（Ｔｉ）、ニッケル（Ｎｉ）およびそれらの合金からなる群から選択される物質がある。金属材料３３０は、好ましくは、３０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の範囲の厚さを有する。厚さが３０ｎｍ未満であると、光が透過してしまい、金属として機能しない場合があり得る。厚さが１００ｎｍを超えると、穴３５０の側壁がふさがれてしまい、相補的な金属積層構造を形成できない場合があり得る。より好ましくは、金属材料３３０は、３０ｎｍ以上４０ｎｍ以下の範囲の厚さを有する。

図９は、ナノロッド構造を有するメタ表面の模式図である。

ナノロッド構造を有するメタ表面４００は、基材４１０の表面に存在する複数のナノロッド４２０を備える。ここで、基材４１０はナノロッド４２０の材料よりも小さい屈折率をもつ材料であることが好ましい。

基材４１０が検査チップ１００に入射される光の波長域において透明な材料で、屈折率１以上１．６以下である場合、ナノロッド４２０の材料としては、屈折率が２以上５以下である半導体または誘電体であることが好ましい。なぜなら、ナノロッドの材料が大きな屈折率をもつほど、ナノロッドは反射または透過スペクトルによって容易に確認できる、明瞭な共鳴状態を有するためである。明瞭な共鳴状態は、蛍光増強効果などの共鳴増強効果を生じるために必要な物理条件である。他方、基材４１０の屈折率がナノロッド４２０の材料と同程度以上の屈折率を有する場合、共鳴状態は不明瞭となり、顕著な共鳴増強効果は期待できない。

例えば、検査チップ１００に入射される光の波長が、波長５００ｎｍ以上１１００ｎｍ以下の範囲である場合、ナノロッド４２０の材料は、シリコン、ゲルマニウム、窒化ガリウム、および、二酸化チタンからなる群から選択される。これらの材料は、屈折率が２以上５以下を有する。

複数のナノロッド４２０の周期Λ_２は、光の波長程度であるが、３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲を有すれば、メタ表面４００は、５２０ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。周期Λ_２は、より好ましくは、３００ｎｍ以上４５０ｎｍ以下の範囲を有する。これにより、メタ表面４００は、５４０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。複数のナノロッド４２０は、２以上の異なる周期を有するナノロッドであってもよい。この場合も、２以上の異なる周期のそれぞれが、３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲を有すれば、可視光域において複数の範囲の光を増強できるので、蛍光標識の異なる２種以上の生体分子の検出も可能となる。

同様に、複数のナノロッド４２０の直径Ｄ_２は、周期Λ_２より小さい範囲で１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲を有すれば、メタ表面４００は、５２０ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。直径Ｄ_２は、より好ましくは、２００ｎｍ以上３５０ｎｍ以下の範囲を有する。これにより、メタ表面４００は、５４０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の波長範囲の光を増強できる。

なお、複数のナノロッド４２０は、２以上の異なる直径を有するナノロッドであってもよい。この場合も、２以上の異なる直径のそれぞれが、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲を有すれば、可視光域および近赤外光域において複数の範囲の光を増強できるので、蛍光標識の異なる２種以上の生体分子の検出も可能となる。

当然ながら、複数のナノロッド４２０が、２以上の異なる周期および２以上の異なる直径で配列されていてもよく、これにより、高精度に蛍光増強可能な可視光の波長域を制御でき、多様な生体分子に対応できる。

複数のナノロッド４２０の高さは、好ましくは、１００ｎｍ以上２μｍ以下の範囲である。この範囲であれば、ナノロッドの局在する電磁波共鳴の効果があり、明瞭な共鳴状態を生じることができる。より好ましくは、複数のナノロッド４２０は、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の範囲の高さを有し、これにより、低次の共鳴状態の利用が可能になり、大きな蛍光増強を期待できる。

ナノロッドの形状は、図９では円柱状で示したが、これに限らず、角柱状、三角柱状などその他の形状であってもよく、共鳴状態を呈する限り、制限はない。

制御機構１６は、第１の電動ステージ２０３の駆動、ポンプ２０５の駆動、光源５４１から照明光学系（図４または図５。図１０には図示なし）を介しての検査チップ１００の検査面への照射の制御、第２の電動ステージ２２０の駆動、第３の電動ステージ２２０の駆動５６０、および画像取得装置５１１の信号解析の制御を行う装置で、ＰＣで行うことができる。なお、制御機構１６のＰＣは、信号処理装置５５０のＰＣと兼用することができる。
制御機構１６の機能は、第１の電動ステージ２０３を駆動させて、採液ピン２０１のピン先が採液ピン２０１の蓋を貫通してマイクロチューブ１１内に保持された被測定試料を予め定めた所定量吸引可能な位置に到達するまで下降（Ｚ方向）させ、ポンプ２０５を駆動させて被測定試料をチューブ２０４を介して検査チップ１００に移送させる試料移送の制御と、光源５４１および照明光学系を介して検査チップ１００の検査面への光照射を行い、検査面の被測定試料からの蛍光を光学系５２１を介して画像取得装置５１１で受光し、信号処理装置５５０による信号強度分析の制御と、第２の電動ステージ２２０を駆動して少なくとも画像取得装置５１１および対物レンズ５２１等からなる像検出装置５１０の位置制御（Ｘ方向）と、第３の電動ステージ５６０を駆動して試料ホルダー１２と採液ピン２０１との相対位置（Ｙ方向）を制御する試料ホルダー移送機構１５の制御である。

測定効率および操作性を向上させるため、試料ホルダー１２と採液ピン２０１の相対位置をＹ軸方向に沿って変える第３の電動ステージを備える。このようにすると、被測定試料の入ったマイクロチューブ１１を行列状に配置して、逐次自動処理にて多量の試料を測定することが可能になる。すなわち、第１の行に配置された試料を自動処理した後、洗浄液を採液ピン２０１、チューブ２０４および検査チップ１００に導入し、次に、空気をこれらに送って被測定試料が通る経路を乾燥させて初期化を行う。しかる後、第３の電動ステージを駆動させて採液ピン２０１を第２の行に配列されたマイクロチューブ１１に差し込み、第２の行に配列された試料を吸い上げて検査チップに導入して測定を行うという繰り返しを行うことが可能になって、多量の試料を効率的に自動測定を行うことが可能になる。
なお、チューブ２０４および検査チップ１００の数は、複数からなる採液ピン２０１の数と合わせておくことが、無駄がなくて好ましい。

本発明の生体分子検出装置１は、生体分子検出部としてマイクロ流路検査チップを使用し、第２の電動ステージ２２０により移動可能な像検出装置をもつことを特徴とした小型で被測定試料の必要量が少ない装置であり、特に、マイクロ流路検査チップとしてメタ構造表面をもつ蛍光共鳴型の検査チップを用いることにより極めて高い検査感度が得られる装置である。

生体分子検出装置１の動作手順の概要を下記に示す。
最初に、準備として、マイクロチューブ１１に被測定試料を入れて前述の密封を行い、マイクロチューブ１１を試料ホルダー１２に収める。マイクロチューブ１１の数は１本でもよいが、測定効率を上げるためには、一行状あるいは行列状に配置して試料ホルダー１２に収めておくことが好ましい。
次に、制御機構１６のコントロール下で、第１の電動ステージ２０３を駆動させて、液ピン２０１のピン先が、前述の蓋を貫通してマイクロチューブ１１内に保持された被測定試料を予め定めた所定量吸引可能な位置に到達するまで下降させ、ポンプ２０５を駆動させて、チューブ２０４を介して被測定試料を検査チップ１００に移送させる。
しかる後、光源５４１および照明光学系を介して検査チップ１００の検査面への光照射を行い、検査面に捉えられている被測定試料からの蛍光を対物レンズ５２１を介して画像取得装置５１１で受光し、信号処理装置５５０による信号強度分析を行うことによって生体分子の有無判定あるいはその定量測定が行われる。

マイクロ流路検査チップを用い、複数の被測定試料を並列処理で高速に処理することを目的とした装置は、例えば特許文献１から３に開示がある。それらに対して、本発明の装置の長所を下記に示す。

特許文献１から３では、高密度に集積化されたマイクロ流路検査チップが用いられ、固定の光学系を用いて広い視野で画像取得して一括で測定を行うという方式が用いられている。
対して本発明では、特許文献１から３に比して比較的疎に配置されたマイクロ流路検査チップが用いられ、マイクロ流路チップ１個に対応する比較的狭い視野測定とすることで移動可能な小型の光学系を用いて測定チップ毎に測定を行うという方法になっている。この方法は、特に、メタ表面構造のマイクロ流路チップの特徴を活かしたものになっている。

メタ表面構造をもつマイクロ流路チップは超微細構造をもつので高価であり、また、作製歩留まりを鑑みると大面積に集積化されたものは歩留まりが低く、さらに高価なものとなる。
また、ある程度使用すると検査チップは交換が必要となるが、高密度に集積化された検査チップでは、一部のチップが劣化した場合でも全交換になり不経済となる。
また、集積化し過ぎると、１枚の基板上での検査の手数が増えすぎてコスト増になり、小さいチップをたくさん並べると送液および排液の経路が煩雑になり、作業性が大きく落ちるという問題も生じる。
一方、本発明の個別チップ単位あるいは比較的疎で少数のチップが配置された検査チップは上記問題が緩和され、コストメリットがある。

また、公知例の方式では、高ＮＡかつ視野の広い光学系が必要になり、装置が大型になり、装置コストも上がる。
一方、本発明の測定では、１測定を１チップに限定しているので必要な視野は狭くてよく、レンズのＮＡ等を大きいものとしても、また照明系も備えるとしても小型の像検出系にできる。このため、配列されたチップを一括で像取得するのではなく、像検出系をステッピング移動させて、シーケンシャルに像取得することにより、装置のコンパクト化と廉価化が可能になる。シーケンシャル像取得でも、その間にシーケンシャルの試料供給などを行うシステムにすることと、測定時間の短い超高感度なメタ表面をもつチップということで高速処理が可能になる。実際、蛍光測定の時間は１チップ当たり２秒程度であり、被測定試料の移送などのオーバーヘッドタイムに比べ十分短いものになっている。

なお、検査チップと光学系との相対位置移動は検査チップの方を動かす方法もあるが、ホルダーはチューブに接続されており可動域に制約がある。検査チップの方を動かす方法は光学系を動かす方法より装置が大きくなりがちになる。
高速シーケンシャル試料供給のためにもチップホルダーは固定がよい。

次に具体的な実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明がこれら実施例に限定されないことに留意されたい。

（実施例１）
実施例１では、生体分子検出装置１を作製してＤＮＡを標的として検出した結果を述べる。

＜装置＞
実施例１で使用した装置（生体分子検出装置１）の外観を図１０および１１に示す。
生体分子検出装置１は、主要なところを挙げると、マイクロチューブ１１、試料ホルダー１２、検出機構１４、検査チップホルダー１５０、採液ピン２０１、取付治具２０２、第１の電動ステージ２０３、ポンプ２０５、第２の電動ステージ５６０、および第３の電動ステージ２２０からなり、各部分の機能、役割は実施の形態１で説明したものになっている。

マイクロチューブ１１は、ポリプロピレン製が標準的であり、大きさが直径１２ｍｍ、長さ４０ｍｍ、試薬容量が１５００または２０００μＬ、そして厚さ５ｍｍの蓋が各マイクロチューブ１１に設けられている。マイクロチューブ１１は、試料ホルダー１２にピッチ１５～２５ｍｍで、一列に配列されて収められている（図１１）。
検出機構１４は、光源５４１、照明光学系５３１、ハーフミラー５３２、結像レンズ５２１、画像取得装置５１１、および信号処理装置５５０からなる図４に示した構成からなる。

光源５４１としてはＬＥＤ（Ｍ５３０Ｆ２、Ｔｈｏｒｌａｂ、ＵＳＡ）を用いた。ピーク波長は５３０ｎｍ（半値全幅３０ｎｍ）である。このＬＥＤは３．１Ｗと消費電力が少なく、発熱等の問題も認められない。ヘッドの大きさは３５×４７×３２ｍｍ^３とコンパクトであり、重量も１２０ｇと軽い。光源５４１は結像光学系５１０に導入され、一体になって第２の電動ステージ２２０により移動をするが、その移動に伴って光軸がずれるなどの問題が生じないことを確認してある。

照明光学系５３１ａには開口数（ＮＡ）０．２８の１０倍対物レンズ（Ｍ Ｐｌａｎ Ａｐｏ、Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ、日本）が用いられ、ＬＥＤの光が直径２ｍｍ以下の領域に照射される構成になっている。照射光パワーは０．４５ｍＷと見積もられた。

共焦点蛍光検出配置（図示なし）では、対物レンズ５２１としては、ＮＡ０．３２の１０倍の対物レンズを使用した共焦点蛍光顕微鏡（Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ５、ライカ、ドイツ）を用いた。励起波長が５２１ｎｍの場合、空気中の空間分解能は８３０ｎｍである。レーザ走査型共焦点系のため、後述のように、非常に希釈されたサンプルで低バックグラウンド蛍光測定を行うことができる。実際、フォトンカウンティングモードでは、装置からのバックグラウンドがほぼゼロに抑えられた。共焦点顕微鏡の長焦点の対物レンズを用いることにより検査チップの検査面とのクリアランスは４～５ｍｍとれており、検査チップへ試料を送る配管、チューブなどがある中でも、各検査チップの検査面で蛍光像が取れる位置に、上下方向移動を伴わないＸ方向移動のみで像検出装置５１０を移動可能で、作業効率が高い。

画像取得装置５１１としては、ＣＣＤカメラ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ－３Ｓ、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ－Ｌｕｍｅｎｅｒａ、ＵＳＡ）を常温で使用した。冷却を伴わないため、軽量、コンパクト化が容易な上に、結露などの問題も生じない。
なお、検査チップとＣＣＤカメラの間には蛍光波長に対応したバンドパスフィルタ（エドモンドオプティクス製）が配置されている（５３２）。
信号処理装置５５０としてはＰＣ（ＤＡＩＶ ４Ｐ、マウスコンピュータ製）を使用した。
なお、結像光学系５１０の大きさは、１００×２００×２５０ｍｍ^３であり、コンパクトなものになっている。

共焦点顕微鏡においては、蛍光分子ＨＥＸにしたがって、励起波長を５２１ｎｍに設定し、検出波長を５７０～７００ｎｍに設定した。蛍光画像は１０フレームの蓄積によって取得した。

検査チップホルダー１５０には６個の検査チップ（図示なし）がピッチ４ｍｍで一列状等間隔に配置されている。
検査チップは、メタ表面を有する蛍光共鳴型のチップであり、４５×４５ｍｍ^２のメタ表面基板とＰＤＭＳで成形されたマイクロ流路チップで構成されている。この検査チップが配置されたセンサ部の写真を図１２に示す。ＰＤＭＳを使用したチップは透明で、６つのマイクロ流路チャネルの入口と出口の穴が備えられている。このセンサ部は、図１３に示すようにホルダーにセットされ、試料を検査チップに供給するチューブに接続される。この検査チップのメタ表面は、周期的なＳｉロッドアレイで構成され、そのロッドの設計周期は３００ｎｍ、円直径は２２０ｎｍ、そして高さは２００ｎｍである。１個のメタ表面エリアの大きさは（０．６～０．７）×（１．２～２．１）ｍｍ^２である。

採液ピン２０１の先端部分（針の部分）は、ステンレスからなり、その直径は１．２ｍｍ、内径は１ｍｍである。治具２０２はＰＥＥＫからなり、長さ１１５ｍｍ、幅１２ｍｍ、高さ１０ｍｍで、６本の採液ピン２０１がピッチ１５ｍｍで、等間隔に配列されている。
第１の電動ステージ２０３、第２の電動ステージ２２０、および第３の電動ステージ５６０の位置決め精度は全て０．５μｍ、ストロークは各々７５、７５、および１５０ｍｍである。
ポンプ２０５は、小型ロータリーポンプ（ＲＰ－６Ｒ０１Ｓ－３Ｐ６Ａ－ＤＣ１０ＶＳ、高砂フルイディックシステムズ、日本）である。このポンプは６チャンネルの流れを同時に制御することができる。

作製された生体分子検出装置１の外形は底面が４００ｍｍ×３００ｍｍ以内、高さが４００ｍｍ以下とコンパクトな形状である。
小型で取り扱い性に優れ、感度が高く、かつ高速処理可能な生体分子検査装置を実現するために、第１から第３の電動ステージからなる３軸の高精度電動ステージ、小型精密ポンプ、顕微鏡用ＣＣＤカメラとのその移動装置（第２の電動ステージ）およびそれらを統合する治具が本発明の装置の核であり、全ての要素を物理的な干渉が一切起きないように治具設計がなされている。

＜使用方法＞
制御装置により、３つの電動ステージ（第１の電動ステージ２０３、第２の電動ステージ２２０、および第３の電動ステージ５６０）およびポンプ２０５が制御され、マイクロチューブ１１に内蔵された試料が採液ピン２０１およびポンプ２０５を介して検査チップに送られる。この試料送液は、６個の検査チップの何れか１つ以上とすることができ、複数の検査チップに供給するときは、同時に供給することもシーケンシャルに供給することも可能である。

（実施例１）
ヒトの遺伝子配列の中からセルフリーＤＮＡとして検出される二重鎖ＤＮＡ（鎖長２３９ベースペア、ｂｐ）を検出対象の鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅を行い、増幅されたＤＮＡを試料として、本発明の生体分子検出装置１にて測定を行った。

＜核酸増幅の手順＞
ＰＣＲ法は前記鋳型ＤＮＡに対して２種の短鎖かつ一本鎖のオリゴ合成ＤＮＡを設計しプライマーとした。５末端にビオチン修飾を行い、後のメタ表面上への固定に備えた。高温で反応が開始するＰＣＲポリメラーゼキット（ＴａＫａＲａ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ、タカラバイオ株式会社）を用いて増幅反応を行った。温度条件は９８℃、１０秒；５０℃、３０秒；７２℃、４０秒の３温度を１サイクルとして、計３５サイクルとした。増幅反応後は２５℃まで冷却した。その後、前記プライマーと別に蛍光標識されたプローブＤＮＡを用意し、増幅物への交配反応を９０℃、２分；４７℃、３０分の条件で行い、終了後２５℃まで冷却した。この試料を蛍光測定した。

＜測定とその結果＞
詳細な蛍光測定手順を下記に示す。
最初に、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１６４－２５５１１、富士フイルム和光純薬、日本)を検査チップのマイクロ流路に７５～８０μＬ／ｍｉｎで５分間流し、流路をこの緩衝液で満たす。次に、９８体積％ＰＢＳと２体積％グリセリン（０７０－０４９４１、富士フイルム和光純薬）で ２μｇ／ｍＬに希釈したＣｙｓ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｃｙｓ－ＳＡ、ＰＲＯ１００５、ＣｌｉｃｋＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１０～１１μＬ／ｍｉｎで１２分間流す。ＰＢＳリンスは１０～１１μＬ／ｍｉｎで８分間行う。
その後、蛍光検出のためのバックグラウンド測定を実施する。
しかる後、ＰＢＳで１００μＬに調整した試験液サンプルを９．５±０．５μＬ／ｍｉｎで１０分間検査チップに供給する。
続いて、ＰＢＳリンスを１８～２０μＬ／ｍｉｎで５分間行う。
最後に、ＬＥＤ励起下で２秒間露光する蛍光測定を実行する。
以上すべての手順は、制御用コンピューター（ＰＣ）で事前に設定され、自動的に実行される。

検出チップの検出面に配置されたメタ表面センサ上の蛍光像を図１４に示す。中央付近の明るい帯状領域が検査チップの検出面に対応する。蛍光像はＤＮＡの検出を意味する。
元の鋳型濃度が１ピコモーラー（ｐＭ＝１０^－１２Ｍ，Ｍ＝モル／リットル）から１５２アトモーラー（ａＭ＝１０^－１８Ｍ）の広い濃度範囲にわたって検出している。また、偽反応を検証するためにネガティブコントロールとして鋳型が含まれない０Ｍの試験液に対しても同様の工程を行い、蛍光検出した結果を合わせて示している。０Ｍでの信号レベルが実験的な信号のゼロレベルを与える。
図１４ではマイクロ流路が縦方向に配置されており、中央付近の明度が高いエリアがメタ表面に対応する。検出対象のＤＮＡ濃度が１ｐＭから１５２ａＭの約４桁にわたる広い濃度域でいずれも蛍光検出された。高濃度側でやや輝度が落ちている原因は過度なＰＣＲによるものと考えられる。低濃度の１５２ａＭにおいて明瞭に蛍光検出できていることから、より低濃度域においても検出可能であることを示唆している。

メタ表面センサが配置された検出面の周囲はマイクロ流路となっているが、メタ表面センサがない流路内では蛍光はほとんど観測されず、偽信号の原因となりうる流路への蛍光分子の非特異吸着は十分に低減できていることがわかる。
ここで、１試料当たりの試料の使用量は５０μＬである。少量の試料で感度の高いＤＮＡ検出が、生体分子検出装置１により行えることが実証された。
なお、１試料当たりの実質的な測定時間は試験液の送液から蛍光像の取得までであり、約２０分で完了した。６試料を同時に送液と蛍光測定を行い採液から測定完了まで終えるまで高速処理することが可能となった。
また、低濃度標的試料に対してＰＣＲサイクルを３５サイクルに抑えて、擬反応を抑えながら、蛍光検出できることは本願装置の高感度性を活かした結果である。通常低濃度標的試料に対しては、４０サイクルのＰＣＲが実施されており、３５サイクルより２^５（＝３２）倍の増幅を経て結果判定がなされるが、擬反応も起きやすくなることから４０サイクルより低いサイクル数で結果判定ができる実用的な利点は大きい。

（実施例２）
実施例２では、実施例１で使用した生体分子検出装置１を用いて、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による核酸増幅後の試料を評価した結果を述べる。

鋳型のＤＮＡは実施例１で使用したものと同じ配列である。鋳型ＤＮＡに対して設計した増幅用のプライマー６種（Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、ＬＦ、ＬＢ）と市販のＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンとｄＮＴＰｓバッファーを調整されたＤＮＡ増幅試薬（２×ＬＡＭＰ ＭＡＳＴＥＲ，株式会社ニッピンジーン）を混合して、核酸増幅用マイクロチューブに入れ、検出対象の鋳型を実施例１で示した濃度でそれぞれ４μＬ滴下、混合した。その後、６３℃、７０分で等温増幅反応を行った。蛍光分子を標識したプローブＤＮＡを増幅物に結合させるため、９０℃、３分；４５℃、２０分；４０℃、２０分の追加反応を実施した。この後、生体分子検出装置１を用いて蛍光測定を行った。その結果を図１５に示す。濃度が１．３７ｆＭまでの試料では、蛍光信号が確認できた。それより低濃度では０Ｍと比べて有意な信号は観測されたなかった。この結果はＬＡＭＰによるＤＮＡ増幅が前記ＰＣＲと比べて、効果的に起きなかったことを示唆している。核酸増幅法の判定に本願の蛍光検出自動化装置は使用できる。

（実施例３）
実施例３では、実施例１で使用した生体分子検出装置１を用いて、新型コロナウイルスの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を検出標本として核酸増幅を行った試料の測定（蛍光観察）を行った結果について述べる。
なお、参考までに、使用したＤＮＡの配列の一部を表１に示す。

試料作製の詳細を下記に示す。
新型コロナウイルスのＲＮＡから終端付近の３６０ベースの配列を選択して、このｃＤＮＡを標的試料に設定した。ＲＮＡは逆転写法によってｃＤＮＡに転写されることは常套的に行われており、ｃＤＮＡを標的試料とすることは新型コロナウイルスの核酸検査と同様の手順となる。
検出対象の３６０ｂｐの二重鎖ｃＤＮＡに対して、ＬＡＭＰ法の６種類のプライマーを設計した。このうちＦＩＰとＢＩＰの５末端にビオチン標識を施した。また、ＬＦ、ＬＢの５末端に蛍光分子ＨＥＸを標識して蛍光プローブとしての機能も担わせた。反応前にＦＩＰ、ＢＩＰ、ＬＦ、ＬＢの４種を標的ｃＤＮＡおよびＰＣＲポリメラーゼキットと混合した。ＦＩＰ、ＢＩＰをＰＣＲプライマーとして使用する構成である。最初に９８℃、１０秒加熱してｃＤＮＡを解離させたのち、６０℃、３０秒；７０℃、３０秒；９５℃、５秒の３条件を１サイクルとして３５サイクル実施し、そのまま５０℃、１５分間蛍光プローブのＬＦとＬＢの増幅ＤＮＡへの交配反応を行って室温に試料を戻した。これらの工程はワンステップ（すなわち、途中での試薬等の追加なし）で行われた。

前記ＰＣＲ試料液を実施例１の蛍光測定と同様の手順で行った。
蛍光測定画像を図１６、標的ｃＤＮＡ濃度と蛍光強度の関係を図１７に示す。標的ｃＤＮＡ濃度が２．６ａＭと極めて薄い状態で有意な蛍光検出ができていることがわかる。２．６aＭはｃＤＮＡ１．５個／μＬに相当する低濃度である。また、標的ｃＤＮＡ濃度が６４ａＭ以下の領域ではＬｏｇ－Ｌｏｇプロットで標的ｃＤＮＡ濃度と蛍光強度がスケーリングされた関係にあることと、６４ａＭ以上で蛍光強度が飽和することがわかる。本発明の生体分子検出装置１は、高い感度で新型コロナウイルスの核酸検査が可能なことが実証された。

図１６の蛍光画像は結像光学系によって測定されたが、共焦点光学系における測定蛍光像を図１８（a）に示す。標的ｃＤＮＡ濃度は左から順に１６０aＭ、３２aＭ、６．４aＭ、０Ｍである。長方形のメタ表面以外のエリアは暗く、バックグラウンドノイズが十分に抑えられていることが分かる。
図１８（a）のそれぞれ蛍光像から蛍光強度をヒストグラム化し、標的濃度に対してプロットした結果が図１８（ｂ）である。各データ点にエラーバーを付けて表示している。０Ｍの標準偏差σから縦軸で３σ離れた位置（図中点線）が統計的な検出下限となる。データ点をＨｉｌｌ方程式（非特許文献１）でフィッティングした曲線との交点のｘ座標が標的濃度の検出限界を与え、５．８６aＭと同定した。バックグラウンドノイズを抑制することで極低濃度域における検出限界を定量的に決定することができる。

（実施例４）
癌マーカー抗原の１つＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）を標的試料として蛍光検出した結果を示す。ＰＳＡ抗体で特異的にＰＳＡを挟みこんでサンドウィッチ複合体を形成し、一方の抗体にビオチン標識をあらかじめ施してメタ表面上のＣｙｓ－ＳＡと結合させて固定し、もう一方の抗体にＨｙｌｙｔｅ５５５分子による蛍光標識をあらかじめ施して蛍光検出を行う配置を採った。

測定手順と結果について述べる。
まず始めに前記ＰＢＳを７５～８０μＬ／分で４分間流して、マイクロ流路内を液浸した。
その後、前記Ｃｙｓ－ＳＡの希釈液２μｇ／ｍＬをメタ表面エリア上に１１～１２μＬ／分の流速で１２分程流し、Ｃｙｓ－ＳＡを固定した。
引き続き、ＰＢＳで同じ流速で５分程メタ表面のリンスを行った。この段階で全６チャンネルに対して蛍光のバックグラウンド測定を行い、実験的な信号のゼロレベルを決めるデータを得た。
続いて、サンプル希釈液ＮＳ（aｂ１９３９７２、アブカム）で５μｇ／ｍＬに調整したビオチン標識したＰＳＡ抗体（aｂ５３７７４、アブカム）液を１１～１２μL／分で８分程メタ表面上に流し、同じ流速でＰＢＳリンスを１０分程行った。ＰＳＡ（aｂ２６４６１５、アブカム）をサンプル希釈液ＮＳで２０、５，１．２５、０．３１、０．０８ｎｇ／ｍＬに希釈し、５つのマイクロ流路チャンネルにそれぞれ流した。ネガティブコントロールとしてサンプル希釈液ＮＳのみを１チャンネルに流し、ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬとした。流速は約８μＬ／分で１２分間メタ表面上に流した。ＰＳＡはＰＳＡ抗体に特異的に結合する。液をＰＢＳに切り替えて、１８～１９μＬ／分の流速で６分間リンスを行った。蛍光標識したＰＳＡ抗体（ＭＡＢ６７２９、Ａｂｎｏｖａ）をサンプル希釈液ＮＳで３．５μｇ／ｍＬに調整してメタ表面上に１０～１１μＬ／分で１０分程度流し、ＰＳＡと特異的に結合させた。
その後、ＰＢＳリンスを１８～１９μＬ／分で６分程度行い、続けてＰＢＳ－Ｔ（１６３－２４３６１、富士フイルム和光純薬）で最終リンスを同じ流速で４分程度行って、ＣＣＤカメラによる蛍光測定を行った。試薬の装填以外はすべて自動化されており、各段の省力化を実現している。

測定した蛍光像を図１９に示す。図１９（a）から（ｆ）のすべての像の明るさを同一基準に統一している。ＰＳＡの濃度の大小を反映して蛍光輝度が増減していることがわかる。例えば、０．０８ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬが区別できる。ＰＳＡの医療診断基準値は４ｎｇ／ｍＬであるから、その１／５０の濃度であっても検出ができ、本願自動化装置はＰＳＡ診断検査を行う性能が十分にあることが実証された。

以上述べてきたように、本装置は小型である上に、少量の被測定試料でも複合動作による自動蛍光検出が可能で、その検査感度も大変高いことが実証された。

質の高い高度な医療を広く汎用に提供するためには、小型で安価で、高速処理が可能な生体分子検査装置が必要になる。本発明の生体分子検査装置は、上述のように、小型で取り扱い性に優れ、かつ高速処理可能な全自動測定装置という特徴をもっている。このため、本発明の装置は、装置ビジネスの拡がりを見せ、その結果、医療を中心に社会に大いに貢献すると考えている。

１：生体分子検出装置
１１：マイクロチューブ
１２：試料ホルダー
１３：試料移送機構
１４：検知機構
１５：試料ホルダー移送機構
１６：制御機構
１００：検査チップ（蛍光検出用生体分子検査チップ）
１１０：メタ表面
１２０：第１の基板
１３０：マイクロ流路
１４０：第２の基板
１５０：検査チップホルダー
２０１：採液ピン
２０２：取付治具
２０３：第１の電動ステージ
２０４：チューブ
２０５：ポンプ
２２０：第３の電動ステージ
３００：メタ表面
３１０：基材
３２０：スラブ材
３３０：金属材料
３４０：表面層
３５０：穴
３６０：穴側壁
４００：メタ表面
４１０：基材
４２０：ナノロッド
４３０：間隔
５１０：像検出装置（結像光学系、対物レンズを有する光学系）
５１１：画像取得装置（ＣＭＯＳセンサ）
５２１：対物レンズ、対物レンズを有する光学系
５３１：照明光学系（コリメータレンズ）
５３１ａ：照明光学系（レンズ）
５３２：波長選択フィルタ
５３２ａ：照明光学系（ハーフミラー）
５３３：光線
５４１：光源
５５０：信号処理装置
５６０：第２の電動ステージ

Claims (12)

1. マイクロ流路に内包される被測定試料に光を当てて前記被測定試料から発せられる蛍光を検知する検査チップを搭載した生体分子検出装置であって、
   前記生体分子検出装置は、被測定試料を入れるマイクロチューブ、前記マイクロチューブを収める試料ホルダー、前記マイクロチューブ内に保持された前記被測定試料を前記検査チップに送る試料移送機構、生体分子を検知する検知機構、試料ホルダー移送機構、および制御機構を有し、
   前記マイクロチューブは、採液ピンで貫通することが可能な蓋を有し、前記被測定試料を前記マイクロチューブ内に密閉して保持することが可能な構造であり、
   前記試料ホルダーは、複数の前記マイクロチューブを列状または行列状に載置可能なホルダーであり、
   前記試料移送機構は、前記採液ピン、前記採液ピンを保持する治具、前記治具と前記試料ホルダーの間隔（Ｚ方向）を変化させる第１の電動ステージ、耐薬性を備えて柔軟性に富むチューブ、およびポンプを具備し、
   前記チューブは、前記採液ピンから前記ポンプを介して前記検査チップに接続されて、前記ポンプの駆動によって前記採液ピンから吸引された被測定試料が前記検査チップに移送される構成になっており、
   前記検知機構は、前記検査チップ、画像取得装置、対物レンズを有する光学系、照明光学系、前記光を発する光源、および前記画像取得装置からの信号を解析処理する信号処理装置を具備し、
   前記検知機構は、前記光源から発せられた光が前記照明光学系を介して前記検査チップの検査面に照射され、前記検査面から発せられる蛍光が前記対物レンズを有する光学系を介して前記画像取得装置に取り込まれ、前記画像取得装置からの信号が前記信号処理装置に送られて信号解析される構成になっており、
   前記検査チップは、メタ表面を有する第１の基板と、
   前記第１の基板と対向して位置し、マイクロ流路を有する第２の基板とを備え、
   前記メタ表面は、検出されるべき生体分子の固定を効率化する間隙を有すると共に、前記生体分子が発する蛍光の波長範囲を含む領域において蛍光増強を示し、
   前記第２の基板は、前記光を透過する材料からなり、
   前記第1の基板と前記第２の基板との間で前記蛍光が共振する検査チップであり、
   前記画像取得装置および前記対物レンズを有する光学系は、一体で配置された１つの像検出装置になっており、
   前記像検出装置の位置を移動させる像検出装置移動手段が具備されており、
   前記像検出装置移動手段は、第２の電動ステージによって一列状の方向（Ｘ方向）に沿って前記像検出装置の位置を移動させることができ、
   前記試料ホルダー移送機構は、前記試料ホルダーと前記採液ピンの相対位置をＹ軸方向に沿って変える第３の電動ステージを有し、
   前記制御機構は、前記第１の電動ステージの駆動、前記ポンプの駆動、前記光の前記検査面への照射の制御、前記第２の電動ステージの駆動、前記第３の電動ステージの駆動、および前記画像取得装置の信号解析の制御を行う、生体分子検出装置。
2. 前記検査チップは複数からなり、離散的に配置されている、請求項１に記載の生体分子検出装置。
3. 前記一体で配置された１つの像検出装置は、前記画像取得装置、前記対物レンズを有する光学系、前記照明光学系、および前記光源からなる、請求項１または２に記載の生体分子検出装置。
4. 前記メタ表面は、金属の周期的相補的積層構造またはナノロッドアレイ構造である、請求項１から３の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
5. 前記第１の基板と前記第２の基板とにより形成されるマイクロ流路の高さは、１０μｍ以上１００μｍ以下の範囲である、請求項１に記載の生体分子検出装置。
6. 前記第１の基板と前記第２の基板とにより形成されるマイクロ流路の高さは、１５μｍ以上５０μｍ以下の範囲である、請求項５に記載の生体分子検出装置。
7. 前記マイクロ流路の材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる、請求項１から６の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
8. 前記メタ表面は、前記金属の周期的相補的積層構造であり、
   前記金属の相補的積層構造は、基材と、前記基材の表面に位置するスラブ材と、少なくとも前記スラブ材上に位置する金属材料とを含み、
   前記基材は、少なくとも前記スラブ材と接する表面層を備え、
   前記スラブ材は、前記表面層の屈折率よりも高い屈折率を有する材料からなると共に、その表面から前記基材の前記表面層に達する、周期的に配列した複数の穴を有し、
   前記金属材料は、前記スラブ材の表面、および、前記複数の穴の底面を形成する前記基材の表面層上にそれぞれ位置する、請求項４に記載の生体分子検出装置。
9. 前記メタ表面は、ナノロッド構造であり、
   前記ナノロッド構造は、基材と、前記基材の表面に周期的に起立する複数のナノロッドとを備え、
   前記基材は、前記複数のナノロッドの屈折率よりも小さい屈折率を有する材料からなる、請求項１から７の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
10. 前記第１の電動ステージを駆動させて、前記採液ピンのピン先が、前記蓋を貫通して、前記マイクロチューブ内に保持された前記被測定試料を予め定めた所定量吸引可能な位置に到達するまで下降させ、
    前記ポンプを駆動させて、前記被測定試料を前記検査チップに移送させ、
    前記光源、および前記照明光学系を介して前記検査面への光照射を行い、
    前記検査面からの前記蛍光を、前記対物レンズを有する光学系を介して前記画像取得装置で受光し、前記信号処理装置による信号強度分析の制御を行う、請求項１から９の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
11. 前記チューブおよび前記検査チップの数は、複数からなる前記採液ピンの数と等しい、請求項１から１０の何れか１つに記載の生体分子検出装置。
12. 前記試料ホルダーの前記マイクロチューブの配置周期は、前記マイクロチューブの直径の１．２倍以上２．１倍以下である、請求項１から１１の何れか１つに記載の生体分子検出装置。