JP2023545004A - タイプ２シータ振動を調節することによって共感を修正するための方法及びシステム - Google Patents

Abstract

本開示は、対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節することによって、ヒト等の対象における共感を修正するための方法に関する。この方法は、対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を増加させることによって、ヒト等の対象における共感を増加させることを含み、それによって、対象における共感を増加させる。ヒト対象は、準最適な共感を引き起こす精神医学的又は神経学的状態を有してよい。対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節することは、光遺伝学的処置、脳領域の電気刺激、薬剤の投与、又はそれらの組み合わせによって達成することができる。本明細書に開示される方法を実行するためのシステムもまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１日に出願された米国仮出願第６３／０８６，５１４号の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

序論
共感は、社会的動物としての人間の存在の重要な機能である。共感障害は、自閉症、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安障害、注意欠陥／多動障害、失感情症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、及び精神病質等の多くの障害で観察される。アルツハイマー病及び関連する認知症、パーキンソン病、及びてんかんを含む多くの神経性疾患も、共感の欠如を引き起こすことが知られている。依存症の特徴的な症状の１種には、共感の欠如も含まれる。共感は多くの精神疾患及び神経疾患及び依存症の重要な要素であるが、なぜ共感障害においてそのような一般的症状が起こるのかについてはほとんど知られていない。各疾患は症状において多様なプロファイルを示すが、社会的欠陥は、患者が社会で正常な生活を送ることを妨げる重要な要素である。これらの疾患の病因機構は多様であると考えられているが、これらの疾患状態の多くが社会的欠陥を誘発するという事実は、これらの神経精神疾患の間で共通の神経機構が共有されている可能性があることを示唆している。共感にとって重要な共通の脳領域又は脳回路が、これらの障害において影響を受けている可能性がある。したがって、多くの精神医学的又は神経学的状態は、そのような状態の特徴的な症状が共感に直接関連していないにもかかわらず、低レベルの共感に関連している。

人間及び動物は、嫌悪的な出来事にさらされている同種を観察すること、すなわち観察恐怖（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｆｅａｒ）によって恐怖を感じることができる。実際、霊長類及びヒトにおける研究は、より強い代理的恐怖反応が共感と正の関連性があることを実証した。げっ歯類における観察恐怖学習において、実践個体の苦痛反応を観察することは、観察個体における感情的経験と特定の環境文脈との間の関連（文脈依存的条件付け）を引き起こす代理的な無条件刺激として役立つ可能性がある。苦痛の中にいる実践個体を観察することによって、観察個体において同様の感情的経験を誘発する認知プロセスは、共感に関連する可能性がある。このげっ歯類システムを使用して、最近、感情的共感に関与する遺伝子及び回路に関する多くの見識が得られている。例えば、ヒトにおいて共感に関与している前帯状皮質（ＡＣＣ）、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）、視床正中、及び絶縁領域は、マウスにおける共感に関与していることが確認されている。ヒトのｆＭＲＩ研究においても、これらの脳領域は共感に関与していた。ＡＣＣ中のソマトスタチン介在ニューロン中のニューレキシン－３分子は、観察恐怖を遮断することが示されている。マウスで確立された観察恐怖学習アッセイは、共感の根底にある分子的、細胞的、回路機構を研究することを可能にした。

げっ歯類は、観察恐怖学習、痛みの感情的伝染、親社会的支援、又は苦しんでいる他者の慰め等の共感的な行動を示し、これは、共感はげっ歯類及びヒトにおいて進化的に保存されていることを示唆している。特に、観察恐怖学習は、げっ歯類における共感恐怖の神経生物学を研究するための行動モデルとして利用されてきた。この行動アッセイにおいて、未処置の動物には、隣接する部屋内で足刺激等の嫌悪処置を受けている同種の動物を観察した部屋の文脈によって条件付けられた恐怖心がある。したがって、この条件付けにおいては、従来の恐怖条件付けで使用される直接的な足刺激とは異なり、無条件刺激は実践個体動物の苦しみの代理経験である。未処置の観察個体動物への恐怖の社会的移行、感情的伝染は、観察個体動物は実践個体動物の感情を認識する能力を必要とし、人間の観察恐怖について示されているように、共感がこの行動に関与していることを示唆している。

他者の感情を共有し、評価し、反応する能力は、時間とともに進化してきており、模倣及び感情的伝染等の原始的な形態から、視点取得、同情、利他主義、標的を絞った支援等の高レベルの形態までの幅広いものがある。最近の証拠は、げっ歯類が他者の感情的状態に対して顕著な感情的感受性を有し、観察恐怖、痛みの感情的伝染、慰め、及び向親社会的支援行動等の多様な形態の共感的行動を示すことを示している。したがって、げっ歯類モデルは、動物及びヒトにおける共感の研究に日常的に使用される。また、適切なアッセイを伴うこれらのげっ歯類モデルは、共感の欠如の根本的な機構の同定及びヒトにおける減少した又は準最適な（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）共感を治療するための治療方法の開発を容易にすることができる。

概要
本開示は、多領域神経回路、例えば、内側中隔、海馬、ＡＣＣ、及び／又はＢＬＡを含む回路における同期タイプ２シータ振動が、代理、観察恐怖、及び共感に固有の認知プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示す。その結果、本明細書において、ヒト対象等の対象における共感を調節するための方法が提供される。この方法は、対象の脳領域におけるタイプ２のシータ振動を調節することを含み、それによって、対象における共感を調節する。ある場合には、この方法は、対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を増加させることを含み、それによって、対象における共感を増加させる。ヒト対象は、準最適な共感を引き起こす精神医学的又は神経学的状態を有することができる。

対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動の調節は、光遺伝学的処置、脳領域の電気刺激、薬剤の投与、又はそれらの組み合わせによって達成することができる。

本明細書に開示される方法を実行するためのシステムもまた提供される。

図１Ａ～図１Ｓ．ＡＣＣの錐体ニューロンにおけるＰＬＣ－β１の欠損は、２／３層ニューロンにおける観察恐怖及び興奮性を損なう。Ａ：観察恐怖課題に使用される装置の図。Ｂ、Ｃ：ＰＬＣ－β１^－／－（ｎ＝９）及び野生型（ｎ＝１１）マウスの観察恐怖。野生型マウスと比較して、ＰＬＣ－β１ノックアウト観察個体は、障害のある観察恐怖条件付け（Ｂ）（Ｆ_１、１８＝４．６４８、Ｐ＜０．０５、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）及び条件付け２４時間後の文脈記憶（Ｃ）（ｐ＜０．０１、ｔ（１８）＝３．２１３、ｔ－７検定）を示した。Ｄ：野生型マウス脳の両側ＡＣＣへのｓｈＲＮＡ送達の概略図。ＳｈＰＬＣ－β１又はｓｈＳＣＲを発現するレンチウイルスベクターのマウス脳のＡＣＣへの両側注入。Ｅ、Ｆ：ｓｈＳＣＲを注入された（ｎ＝１１）マウスと比較して、ｓｈＰＬＣ－β１を注入された観察個体（ｎ＝７）は、障害のある観察恐怖条件付け（Ｅ）（Ｆ_１、１６＝４．９１６、Ｐ＜０．０５、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）及び条件付け２４時間後の文脈記憶（Ｆ）（ｐ＜０．０１、ｔ（１６）＝２．９６１、ｔ検定）を示した。Ｇ：ＳｈＰＬＣ－β１又はｓｈＳＣＲを発現するレンチウイルスベクターの、マウス脳のＰｒＬ及びＩＬを含むｍＰＦＣへの両側注入の概略図。Ｈ、Ｉ：同様のすくみレベルは、訓練中（Ｈ）（Ｆ_１、１２＝０．００４０６、Ｐ＝０．９５０、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）、及び訓練後２４時間の文脈記憶（Ｉ）（ｐ＝０．８２４、ｔ（１２）＝０．２２８、ｔ検定）において、ｓｈＰＬＣ－β１を注入されたマウス（ｎ＝７）とｓｈＳＣＲを注入されたマウス（ｎ＝７）との間で見られた（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、及び^＊＊＊ｐ＜０．００１）。全てのデータは平均±標準誤差で示される。Ｊ：ＡＣＣの興奮性ニューロンにおけるＰＬＣ－β１削除の概略図。ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＧＦＰ－Ｃｒｅの、ＰＬＣ－β１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスのＡＣＣへの片側注入。Ｋ、Ｌ：ＰＬＣ－β１ＡＣＣ／ＧＦＰマウス（ｎ＝１１）と比較して、ＰＬＣ－β１^{ＡＣＣ／Ｃｒｅ}観察個体（ｎ＝９）は、障害のある観察恐怖条件付け（Ｋ）（Ｆ_１、１８＝１０．９８１、ｐ＜０．０１、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）及び条件付け２４時間後の文脈記憶（Ｌ）（ｐ＜０．０５、ｔ（１８）＝２．３５８、ｔ－１４検定）を示した。Ｍ：ＡＣＣ中の非興奮性ニューロンにおけるＰＬＣ－β１ノックダウンの概略図。ＡＡＶ－ｌｏｘＰ－Ｕ６－ｓｈＰＬＣ－β１－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｌｏｘＰの、ＣａＭＫＩＩα－ＣｒｅマウスのＡＣＣへの片側注入。Ｎ、Ｏ：同様のすくみレベルは、観察恐怖条件付け中（Ｎ）（Ｆ_１、１２＝０．１６２、Ｐ＝０．６９５、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）、及び条件付け（Ｏ）後２４時間の文脈記憶（ｐ＝０．４１７、ｔ（１２）＝－０．８４１、ｔ検定）において、ＡＣＣ阻害ニューロン特異的ｓｈＰＬＣ－β１を注入された観察個体マウス（ｎ＝６）とｓｈＳＣＲを注入された観察個体マウス（ｎ＝８）との間で、見出された。Ｐ：ＰＬＣ－β１^＋／＋（左パネル）及びＰＬＣ－β１^－／－（右パネル）マウスにおける２／３層（上パネル）及び５／６層（下パネル）のＡＣＣニューロンの電流誘起発火の代表的な出力。Ｑ：異なる電流パルスに伴う、ＰＬＣ－β１^＋／＋（ｎ＝５２）及びＰＬＣ－β１^－／－（ｎ＝４８）マウスからのＡＣＣニューロンの発火の平均頻度。Ｒ：異なる電流パルスに伴う、ＰＬＣ－β１^＋／＋（ｎ＝１６）及びＰＬＣ－β１^－／－（ｎ＝３６）マウスのＡＣＣニューロンの２／３層の発火の平均頻度。Ｓ：異なる電流パルスを伴う、ＰＬＣ－β１^＋／＋（ｎ＝２０）及びＰＬＣ－β１^－／－（ｎ＝２８）マウスのＡＣＣニューロンの５／６層の発火の平均頻度。データは、平均±標準誤差（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、及び^＊＊＊ｐ＜０．００１）で示される。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ａの説明を参照のこと。 図２Ａ～図２Ｏ．ＡＣＣとＢＬＡとの相互接続の光遺伝学的阻害は、古典的な恐怖条件付けではなく、観察恐怖を抑制する。Ａ：観察恐怖試験中のＡＣＣ－ＢＬＡ、ＢＬＡ－ＡＣＣ、及びｍＰＦＣ－ＢＬＡ投射のＮｐＨＲ３．０媒介性阻害の概略図。Ｂ：ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰ（ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰ）を野生型マウスのＡＣＣに注入し、ＢＬＡを黄色レーザー（左パネル）で両側照射した。ＡＣＣ特異的ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入されたマウスの右又は左ＢＬＡで撮影された、ＡＣＣ及びＡＣＣ線維中のＮｐＨＲ３．０－ＹＦＰ発現興奮性ニューロンを示す冠状断面（右パネル）。Ｃ：観察恐怖条件付け中のＢＬＡにおけるＡＣＣ入力の照射は、すくみレベルを有意に低下させた（Ｆ_１、１９＝１４．２２４、ｐ＝０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）。Ｄ：ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入された観察個体は、ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ）が注入されたマウスと比較して、２４時間後の文脈記憶の減少を示した（ｐ＜０．０５、ｔ（１９）＝－２．６７１、ｔ検定）。Ｅ：野生型マウスのＢＬＡにＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰを注入し、ＡＣＣを黄色レーザーで照射した（左パネル）。ＢＬＡ特異的ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入されたマウスのＡＣＣで撮影されたＢＬＡ及びＢＬＡ線維中のＮｐＨＲ３．０－ＹＦＰ発現興奮性ニューロンを示す冠状断面（右パネル）。Ｆ、Ｇ：観察恐怖条件付け中のＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入された観察個体のＡＣＣにおけるＢＬＡ入力の光遺伝学的阻害は、ｅＹＦＰが注入されたマウスと比較して、観察恐怖条件付け（Ｆ）（Ｆ１、２１＝１２．８５８、Ｐ＜０．０１、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）及び２４時間文脈記憶（Ｇ）（ｐ＜０．０５、ｔ（２１）＝－２．２５１、ｔ検定）を有意に低下させた。Ｈ：野生型マウスのＰｒＬ及びＩＬを含むｍＰＦＣにＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰを注入し、ＢＬＡを黄色レーザーで両側照射した（左パネル）。ＡＣＣ特異的ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入されたマウスの右側又は左側ＢＬＡで撮影されたｍＰＦＣ及びｍＰＦＣ線維中におけるＮＰＨＲ３．０－ＹＦＰ発現興奮性ニューロンを示す冠状断面（右パネル）。Ｉ：観察恐怖条件付け中のＢＬＡへのｍＰＦＣ入力の照射は、観察恐怖条件付けに影響を及ぼさなかった（Ｆ_１、１３＝０．００２３２、Ｐ＝０．９６２、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）。Ｊ：ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰを注入した観察個体とｅＹＦＰを注入したマウスとの間で、２４時間文脈記憶に有意差はなかった（ｐ＝０．２６７、ｔ（１３）＝１．１６０、ｔ検定）。Ｋ：ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰ（ＮｐＨＲ３．０）を野生型マウスのＡＣＣに注入し、ＢＬＡを黄色レーザーで照射した。Ｌ：文脈恐怖条件付け中、ＢＬＡへのＡＣＣ入力の照射は、訓練期間中のすくみ行動に有意な効果を及ぼさなかった（Ｆ_１、１２＝０．０５８７、Ｐ＝０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後１検定）。Ｍ：ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入された観察個体マウスとＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ）が注入されたマウスとの間で、２４時間の文脈記憶に有意差はなかった（ｐ＝０．７８７、ｔ（１２）＝０．２７６、ｔ検定）。Ｎ、Ｏ：文脈恐怖条件付け中、ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰが注入された観察個体のＡＣＣにおけるＢＬＡ入力の光遺伝学的阻害は、ｅＹＦＰが注入されたマウスと比較して、訓練期間中のすくみ行動（Ｎ）（Ｆ_１、１２＝１．３９８、ｐ＝０．２６０、二元配置反復測定分散分析）にも２４時間の文脈記憶（Ｏ）（ｐ＝０．６９８、ｔ（１２）＝０．３９８、ｔ検定）にも影響を及ぼさなかった。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図２Ａの説明を参照のこと。 図３Ａ～図３Ｌ．観察恐怖中のＰＬＣ－β１ノックダウンマウスにおいて、ＡＣＣ－ＢＬＡ回路には４～８Ｈｚの振動は存在しない。Ａ：観察恐怖中のＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１ノックダウン観察個体のＡＣＣ及びＢＬＡにおけるＬＦＰの同時記録を示す概略図。Ｂ：観察恐怖中のＬＦＰ記録を示す概略図；観察恐怖の条件付けプロトコルの馴化及び刺激間期間からの記録を観察個体マウスごとに使用した。Ｃ：ｓｈＳＣＲを注入された観察個体（上）及びＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１をノックダウンされた観察個体（下）のＡＣＣ及びＢＬＡにおけるＬＦＰ記録の馴化中の代表的な元の出力。Ｄ：条件付けの間、Ｃと同様である。Ｅ、Ｆ：ＡＣＣ特異的ｓｈＳＣＲ出力（Ｅ）及びＡＣＣ特異的ｓｈＰＬＣ－β１出力（Ｆ）の着色された電力スペクトルは、ｃ（馴化）及びｄ（条件付け）において示される。ＡＣＣ特異的ｓｈＳＣＲを注入されたマウスのＡＣＣ及びＢＬＡにおけるシータリズムの出力が、ＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１がノックダウンされた観察個体におけるこれらのリズムの出力に対して、馴化期間と比べて条件付け期間の間に、実質的に増加していることに留意されたい。Ｇ、Ｈ：馴化期間及び条件付け期間中のｓｈＳＣＲが注入されたマウス（ｎ＝７）のＡＣＣ（Ｇ）及びＢＬＡ（Ｈ）におけるニューロン活性の平均電力スペクトル密度。Ｉ、Ｊ：ＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１がノックダウンされた観察個体のＡＣＣ（Ｉ）及びＢＬＡ（Ｊ）におけるニューロン活動の平均電力スペクトル密度（ｎ＝１０）。Ｋ：順化及び条件付け期間中のＡＣＣ特異的ｓｈＳＣＲが注入された観察個体におけるＡＣＣとＢＬＡとの間の平均クロスコレログラム。Ｌ：ＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１がノックダウンされた観察個体について、Ｋと同様である。各実験群の順化及び条件付けの相関の間の時間差に関する順位和検定の有意なｐ値を出力の下に示す。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図４Ａ～図４Ｔ．中隔海馬ＧＡＢＡ作動性投射の光遺伝学的阻害によるタイプ２海馬シータリズムの減衰は、観察恐怖及びＡＣＣ及びＢＬＡにおける４～８Ｈｚシータ２リズムを減少させる。Ａ：ＡＡＶ５－ＥＦ１α－ＤＩＯ－ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ＮｐＨＲ）をＰＶ－ＣｒｅトランスジェニックマウスのＭＳに注入し、背側脳弓を黄色レーザーで照射した（左パネル）。ＭＳにおけるｅＹＦＰ発現及びｅＹＦＰを発現する脳弓線維を、ＭＳ特異的ＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入されたＰＶ－Ｃｒｅトランスジェニックマウスの背側脳弓において撮影した（右パネル）。Ｂ：ＰＶ－ＣｒｅトランスジェニックマウスのＡＣＣ、ＢＬＡ、及び海馬に、ＥＥＧ電極を移植した。Ｃ：観察恐怖試験における海馬（ＭＳＧＡＢＡ－Ｈｉｐｐ）へのＭＳ ＧＡＢＡ作動性投射のＮｐＨＲ３．０媒介阻害の概略図。Ｄ、Ｅ：観察恐怖条件付け中の海馬へのＧＡＢＡ作動性ＭＳ入力の光遺伝学的阻害は、すくみレベルを有意に低下させた（Ｄ）（Ｆ_１、２２＝１７．２７７、ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）。ＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入された観察個体は、ＡＡＶ５－ＥＦ１α－ＤＩＯ－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ｅＹＦＰ）を注入されたマウス（Ｅ）と比較して、２４時間文脈記憶の減少を示した（ｐ＜０．０５、ｔ（２１）＝２．４８０、ｔ検定）。Ｆ：古典的文脈恐怖条件付け試験におけるＭＳＧＡＢＡ－Ｈｉｐｐ投射のＮｐＨＲ３．０媒介性阻害の概略図。Ｇ、Ｈ：文脈恐怖条件付け中にＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入された観察個体の海馬へのＧＡＢＡ作動性ＭＳ入力の光遺伝学的阻害は、ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入されたマウスと比較して、訓練期間中のすくみレベル（Ｇ）（Ｆ_１、１１＝０．００２８９、ｐ＝０．９５８）及び２４時間文脈記憶（Ｈ）（ｐ＝０．８１７、ｔ（１１）＝０．２３８、ｔ検定）に影響を及ぼさなかった。Ｉ－Ｋ：ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入された観察個体（ｎ＝７）のＡＣＣ（Ｉ）、ＢＬＡ（Ｊ）、及び海馬（Ｋ）におけるニューロン活動の平均電力スペクトル密度。Ｌ－Ｎ：ＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入された観察個体（ｎ＝６）のＡＣＣ（Ｌ）、ＢＬＡ（Ｍ）、及び海馬（Ｎ）におけるニューロン活動の平均電力スペクトル密度。Ｏ－Ｑ：ＡＣＣ（Ｏ；ｐ＜０．０５、ｔ（１１）＝－２９６７８、ｔ検定）、ＢＬＡ（Ｐ；ｐ＜０．０１、ｔ（１１）＝－３．１８２９、ｔ検定）、及び海馬（Ｑ；ｐ＜０．０５、ｔ（１１）＝－２．４８６９、ｔ検定）における４～８Ｈｚの周波数範囲での馴化から条件付けへのＬＦＰ電力の変化。Ｒ－Ｔ：ＡＣＣ（Ｒ；ｐ＝０．３１８９、ｔ（１１）＝１．０４３９、ｔ検定）、ＢＬＡ（Ｓ；ｐ＝０．３０６１、ｔ（１１）＝１．０７３４、ｔ検定）、及び海馬（Ｔ；ｐ＝０．１４４４、ｔ（１１）＝１．５７１６、ｔ検定）における８～１２Ｈｚの周波数範囲での馴化から条件付けへのＬＦＰ電力の変化。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図５Ａ～図５Ｊ．海馬－帯状－扁桃体回路のタイプ２シータにおける電力調節は、すくみ発作と時間的に連動し、この電力調節の程度は、観察恐怖の大きさを予測する。Ａ、Ｃ：すくみ行動の開始（Ａ）及び消失（Ｃ）を中心としたＡＣＣ、ＢＬＡ及び海馬の平均スペクトログラム。Ｂ、Ｄ：すくみが開始（Ｂ）及び消失（Ｄ）したときのＡＣＣ、ＢＬＡ、及び海馬におけるＬＦＰ電力の平均ｚスコア。合計４２匹（Ａ及びＢ）及び７匹のマウスに由来する合計４１匹のエポック（Ｃ及びＤ）をそれぞれ使用した。スペクトログラム上の黒い線は、運動指数の変化を示す。Ｅ－Ｇ：ＡＣＣ（Ｅ）、ＢＬＡ（Ｆ）、及び海馬（Ｈｉｐｐ、Ｇ）におけるタイプ２シータリズムの電力の平均変化と、観察恐怖におけるすくみ行動とのピアソンの相関分析。Ｈ－Ｊ：ＡＣＣ（Ｈ）、ＢＬＡ（Ｉ）、及び海馬（Ｊ）におけるタイプ１シータリズムの電力の平均変化と、観察恐怖におけるすくみ行動とのピアソンの相関分析。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図６Ａ～図６Ｗ．海馬タイプ２シータの光遺伝学的増強は観察恐怖を調節する。Ａ：ＡＡＶ５－ＥＦ１α－ＤＩＯ－ＣｈＲ２－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ＣｈＲ２）をＰＶ－ＣｒｅトランスジェニックマウスのＭＳに注入し、背側脳弓を青色レーザーで照射した（左パネル）。ＭＳにおけるｅＹＦＰ発現及びｅＹＦＰを発現する脳弓線維を、ＭＳ特異的ＤＩＯ－ＣｈＲ２が注入されたＰＶ－Ｃｒｅトランスジェニックマウスの背側脳弓において撮影した（右パネル）。Ｂ：ＰＶ－ＣｒｅトランスジェニックマウスのＡＣＣ、ＢＬＡ、及び海馬のそれぞれに、３つのＥＥＧ電極を移植した。Ｃ：観察恐怖試験における中隔海馬へのＧＡＢＡ作動性投射のＣｈＲ２媒介活性化の概略図。Ｄ、Ｅ：観察恐怖条件付け中の海馬へのＧＡＢＡ作動性ＭＳ入力の光遺伝的活性化は、すくみレベル（Ｄ）を増加させた（Ｆ_１、１７＝９．１５５、ｐ＝０．００８、二元配置反復測定分散分析、それに続くスチューデント－ニューマン－コイルス事後検定）。しかしながら、２４時間の文脈記憶において、試験群と対照群との間に差は観察されなかった（Ｅ）（ｐ＝０．５８７、ｔ（１７）＝０．５５４）。Ｆ－Ｈ：ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入された対照観察個体（ｎ＝８）のＡＣＣ（Ｆ）、ＢＬＡ（Ｇ）、及び海馬（Ｈ）におけるＬＦＰ活性の平均電力スペクトル密度。Ｉ－Ｋ：ＤＩＯ－ＣｈＲ２を注入された試験観察個体（ｎ＝１１）のＡＣＣ（Ｉ）、ＢＬＡ（Ｊ）、及び海馬（Ｋ）におけるＬＦＰ活性の平均電力スペクトル密度。Ｌ－Ｎ：ＡＣＣ（Ｌ；ｐ＜０．０５、ｔ（１７）＝２．４２１１、ｔ検定）、ＢＬＡ（Ｍ；ｐ＝０．１９７６、ｔ（１７）＝１．３４１、ｔ検定）及び海馬（Ｎ；ｐ＜０．０５、ｔ（１７）＝２．３４２５、ｔ検定）における、対照群（青色バー）及び試験群（赤色バー）の４～８ ８Ｈｚの周波数範囲での馴化から条件付けへのＬＦＰ電力の変化。Ｏ－Ｑ：ＡＣＣ（Ｏ）、ＢＬＡ（Ｐ）、及び海馬（Ｈｉｐｐ、Ｑ）におけるタイプ２シータリズムの電力の平均変化と、観察恐怖におけるすくみ行動とのピアソンの相関分析。Ｒ－Ｗ：中隔海馬ＧＡＢＡ作動性投射の光遺伝活性化によるタイプ１シータリズムの変化は、観察恐怖と関連していなかった。ＡＣＣ（Ｒ；ｐ＝０．３１６２、ｔ（１７）＝－１．０３２７、ｔ検定）、ＢＬＡ（Ｓ；ｐ＜０．０１、ｔ（１７）＝－３．３１７４、ｔ検定）、及び海馬（Ｈｉｐｐ、Ｔ；ｐ＜０．０５、ｔ（１７）＝－２．２１０６、ｔ検定）における８～１２Ｈｚの周波数範囲での馴化から条件付けへのＬＦＰ電力の変化。ＡＣＣ（Ｕ）、ＢＬＡ（Ｖ）、及び海馬（Ｗ）におけるタイプ１シータリズムの電力の平均変化と、観察恐怖におけるすくみ行動とのピアソンの相関分析。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。

詳細な説明
中枢神経系のニューロンは振動パターンで活性化することができる。これらの振動は、振動の周波数によって分類することができる。例えば、シータ振動は４Ｈｚ～８Ｈｚの範囲で発生するが、アルファ振動は８Ｈｚ～１５Ｈｚの範囲で発生する。シータ振動には、タイプ１シータ振動とタイプ２シータ振動が含まれる。ある場合には、タイプ１振動は７Ｈｚ～８Ｈｚで生じる。タイプ１振動は、自発的な動きとレム睡眠中に時々生じる。タイプ１振動は、通常、薬剤アトロピンの投与によって影響を受けない。タイプ２振動は、４Ｈｚ～７Ｈｚで時々生じる。ウレタン（すなわち、カルバミン酸エチル）の投与等により、対象が麻酔されている間にタイプ２振動が時々生じる。タイプ２振動は、対象が恐怖のために固まっているとき、例えば、実験室のラットが近くのネコ又はフェレットを恐れているときにも生じることがある。タイプ２の振動は、動物が動く準備をしているがまだ動いていないときに短時間生じることがある。タイプ１及びタイプ２の表記は、海馬の振動に適用されることがある。

本開示は、多領域神経回路、例えば、内側中隔、海馬、ＡＣＣ、及び／又はＢＬＡにかかわる回路における同期２シータ振動が、代理、観察恐怖、及び共感に固有の認知プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示す。したがって、本明細書に示されるのは、対象、例えばヒト対象等における共感を、修正、特に、増加させるための方法である。この方法は、対象の脳領域におけるタイプ２のシータ振動を調節することを含み、それによって、対象における共感を修正する。

ある場合には、本方法は、対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を増加させることを含み、それによって、対象における共感を増加させる。ヒト対象は、準最適な共感を引き起こす精神医学的又は神経学的状態を有することができる。

対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動の調節は、光遺伝子処置、遺伝子組換え、脳領域の電気刺激、薬剤の投与、又はそれらの組み合わせによって達成することができる。

本明細書に開示される方法を実行するためのシステムもまた提供される。

本発明がより詳細に説明される前に、本発明は、説明される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、変化し得ることが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

値の範囲が提供される場合、文脈上別段の指示のない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、下限のユニットの１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。任意の記載値又は記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値又はその記載された範囲内の間に介在する値との間の、それぞれより小さい範囲が、本発明に包含される。これらの小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、又は両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載されている範囲の中で任意の具体的に除外されている限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限定の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は均等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ例示的な方法及び材料を説明することができる。本明細書で言及される任意の及び全ての刊行物は、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「別個の実体（ａ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｅｎｔｉｔｙ）」への言及は、１つ以上の別個の実体への言及を含む。特許請求の範囲は、あらゆる要素、例えば、あらゆる選択的要素を除外するように起草してよいことに更に留意されたい。したがって、この宣言は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して、「専ら」、「のみ」等の排他的用語を使用すること、又は「否定的な」制限を使用することの先行的な根拠として機能することが意図される。

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。更に、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。本明細書におけるいずれかの用語の定義又は使用の範囲が、参照によって本明細書に組み込まれる出願又は参照における用語の定義又は使用と矛盾するときには、本出願が統制する。

本開示を読むと当業者には明らかであろうように、本明細書に記載及び例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の様々な実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又はこれらと組み合わされ得る別個のコンポーネント及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。

定義
本明細書で使用される場合、「準最適な共感」は、その種の平均的な対象で観察される共感よりも低い共感のレベルによって特徴付けられる対象における感情的特性を指す。準最適な共感とは、他者の感情及び要求を認識又は特定することができないことを指し、例えば、冷酷で感情的でない態度、他のヒト又は動物の苦痛を認識することができないこと、及び他のヒト又は動物の感情を推測できないことによって、表され得る。

共感は様々な方法で評価することができる。例示的な共感の尺度又はタイプとしては、観察恐怖学習、痛みの感情的伝染、親社会的支援、苦しんでいる他者の慰め、視点取得、同情、利他主義、及び標的を絞った支援が挙げられる。「準最適な共感」という用語は、例えば、医療又は精神医学の専門家が、対象が社会における個人に対する共感の平均レベルを下回るレベルの共感を有すると判断した場合が含まれる。「準最適な共感」には、医学的又は精神医学的専門家が、対象が対人関係の問題を引き起こす共感の欠陥を有すると判断する状況も含まれる。

ヒトの共感を評価するため、特定の試験が心理学で使用される。例えば、論文Ｃａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｐｓｙｃｈｏｌ Ａｓｓｅｓｓ；２５（３）：６７９－９１では、ヒトの共感を評価するために使用される特定の共感尺度が記載されている。Ｃａｒｒｅらの論文はその全体が本明細書に組み込まれる。別のそのような方法は、Ｊｏｌｌｉｆｆｅらの論文「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｅｍｐａｔｈｙ Ｓｃａｌｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２９，Ｉｓｓｕｅ ４，Ａｕｇｕｓｔ ２００６，Ｐａｇｅｓ ５８９－６１１に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、当業者は、対象、特にヒトが、準最適な共感、すなわち、平均的なヒトで観察される共感よりも低い共感のレベルを有するかどうかを決定することができる。

「シータ振動」という用語は、「シータ波」又は「シータリズム」と互換的に使用され、４Ｈｚ～８Ｈｚの範囲の周波数を有する神経振動を指す。「神経振動」という用語は、本明細書では、「脳波」及び「脳の波」という用語と互換的に使用される。タイプ２シータ振動はタイプ－２シータ振動と互換的に使用される。シータ振動は、シータリズムと互換的に使用される。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、動物、例えばヒトを指す。

「治療有効量」、「治療有効用量」、又は「治療用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療有効性を達成する、所望の治療応答を達成する等）ために十分な量である。治療有効用量は、１回以上の投与で投与することができる。本開示の目的のために、組成物の治療有効用量は、個体に投与されるときに、対象に存在する疾患の状態又は状態の進行を緩和、改善、安定化、反転、予防、原則又は遅延させるのに十分な量である。

本明細書で使用される場合、「決定する」、「測定する」、「評価する」、及び「アッセイする」という用語は、互換的に使用され、定量的及び定性的決定の両方を含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、対象、例えば、哺乳動物、特にヒトへの投与に好適な組成物を包含することを意味する。一般に、「薬学的組成物」は、無菌であり、好ましくは、対象に望ましくない応答を誘発することができる汚染物質を含まない（例えば、薬学的組成物中の化合物は、薬学的グレードである）。薬学的組成物は、経口、経頬、経腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下等を含む多数の異なる投与経路を介して、必要とする対象又は患者に投与するように設計できる。

方法
本開示は、タイプ２海馬シータ振動が、海馬、ＡＣＣ、及びＢＬＡの間の長距離ニューロンネットワーク結合を誘導し、次いで、マウスにおいて、古典的恐怖条件付けに影響を及ぼすことなく、観察恐怖の根底にある感情的共感を推進することを示唆する。本開示は、準最適な共感、例えば、多様な神経精神医学的又は神経学的状態によって引き起こされた準最適な共感の治療についての、タイプ２海馬シータ振動の移行可能性を強調する。

したがって、ある場合には、対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節することによって、ヒト対象における共感を修正する方法が提供され、それによって、対象における共感を修正する。ある場合には、本方法は、対象の脳領域におけるタイプ２シータ振動を増加させることによって、ヒト対象における共感を増加させることを含み、それによって、対象における共感を増加させる。ある場合には、対象は、精神医学的又は神経学的状態によって引き起こされる可能性がある、準最適な共感を有する。

タイプ２シータ振動の調節は、例えば、光遺伝学的処置、１つ以上の電極を使用した脳領域の電気刺激、薬剤の投与、脳領域内のニューロンを遺伝子修正して振動を直接調節すること、又はそれらの組み合わせによって達成できる。ある場合には、調節は、タイプ２シータ振動を増加させることを伴う。他の場合には、調節は、タイプ２シータ振動の減少させることを伴う。

タイプ２シータ振動の調節は、感覚刺激、電気刺激、機械的刺激、又は機械的に活性化された遺伝的標的指向型刺激によっても達成することができ、これらは全て、同調、遺伝子療法、細胞療法、及び薬剤とともに、又はこれらなしで、達成することができる。

光遺伝学的処置
光遺伝学的処置は、特定の脳領域及び／又は特定のタイプの細胞における細胞を遺伝子組換えすること、それに続いて遺伝子組換えされた脳領域を光に接触させることを含む。遺伝子組換えは、組換えされた細胞に光感受性イオンチャネルを発現させる。ニューロン等の細胞を光に接触させると、これらのチャネルが活性化し、ニューロン等の細胞の活性化に影響を与える。

ある場合には、光遺伝学的処置は、同調とともに施される。ある場合には、光遺伝学的処置は、同調せずに施される。

特定の脳領域内のニューロン又は他の非神経細胞型等の、脳内の遺伝子組換え細胞の特定の詳細は、論文Ｈａｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ，Ｖｏｌ．１３，Ａｒｔｉｃｌｅ ９３に記載されており、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

ある場合には、ニューロン又は他の脳細胞は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを介して遺伝子を送達することによって、遺伝子組換えされる。ウイルスベクターは、光感受性イオンチャネルをコードする遺伝子を含む。そのような感光性イオンチャネルの非限定的な例としては、オプシン、例えば、チャネルロドプシン、例えば、チャネルロドプシン２、藻類チャネルロドプシン、又は微生物ロドプシンが挙げられる。感光性イオンチャネルの更なる例は、米国特許出願公開第２０２０／０１２１７４６号及び米国特許出願公開第２０２０／０１９１７７６号に記載されており、これらは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

ある場合には、感光性イオンチャネルをコードする遺伝子を含有するウイルスベクター等のベクターを、関心領域に特異的に注入し、それによって、脳内の標的領域における感光性イオンチャネルの発現を制限する。ある場合には、ウイルスベクターは、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、ＭＳ、海馬采脳弓のうちの１つ以上に注入される。一実施形態において、ウイルスベクターは視床にのみ注入され、ウイルスは、例えば、ＡＣＣを含む、視床よりも広い領域の細胞に核酸を導入する。

代替的に、ウイルスベクターは、プロモーター又はエンハンサー等の特定の調節要素の制御下で、感光性イオンチャネルをコードする遺伝子を含有することができ、これは、特定の及び所望の領域又は細胞型において感光性イオンチャネルの発現を誘導する。そのようなある特定のプロモーター又はエンハンサーは、Ｈａｅｒｙらによって、特に、表４に記載されている。追加のかかるプロモーター又はエンハンサーは、論文Ｍｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０２１），Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．；３４（１３）：１０８７５４に記載されており、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

そのようなある特定プロモーター又はエンハンサーとしては、ヒトシナプシン１、ＭｅＣＰ２、ニューロン特異的エノラーゼ、ＢＭ８８、ｍＤＬＸ、ドーパミンβ－ヒドロキシラーゼ、ＰＲＳｘ８（修飾ドーパミンβ－ヒドロキシラーゼ）、ＰＣＰ２、ＦＥＶ、メラニン濃縮ホルモン、ＳＬＣ６Ａ４、ＮＲ２Ｅ１、ＧｆＡＢＣ１Ｄ、Ａｌｄｈ１／１、ミエリン関連糖タンパク質、ＩＣＡＭ－２、ＣＬＤＮ５、Ｔｉｅ－２、及びＦＬＴ１のプロモーターが挙げられる。

感光性イオンチャネルを発現するように特異的に修飾される脳領域は、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、内側中隔（ＭＳ）、海馬采脳弓のうちの１つ以上であってよい。ある場合には、脳領域は海馬である。ある場合には、脳領域は中隔海馬である。ある場合には、脳領域はＡＣＣである。ある場合には、脳領域はＢＬＡである。ある場合には、脳領域は内側中隔である。ある場合には、脳領域は海馬采脳弓である。

光遺伝学的処置のいくつかの場合では、方法は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが関与する。これらのニューロンは、神経伝達物質ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の影響を受ける。したがって、ある場合には、本方法は、ＧＡＢＡに応答するシナプスを含むニューロンが関与する。ある場合には、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、海馬采脳弓に位置する。ある場合には、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、中隔海馬に位置する。

感光性イオンチャネルの脳領域特異的又は脳細胞特異的発現が確立された後、特定の領域を刺激してタイプ２シータ振動を生成できる。これは、レーザーを使用して標的脳領域を照射することによって達成できる。そのようなレーザーは、対象の脳内に外科的に配置されて、有線又は無線通信を介して活性化され、標的領域を照射できる。このような標的領域の照射は、標的領域内の感光性イオンチャネルを活性化し、それによってタイプ２シータ振動を誘導する。

対象の脳内に設置されたレーザーを活性化するための無線及びバッテリーフリーのデバイスは、当該技術分野で既知である。そのような特定のデバイスは、論文Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０２１），Ｗｉｒｅｌｅｓｓ ａｎｄ ｂａｔｔｅｒｙ－ｆｒｅｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇに記載され、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

設置されたレーザーには、電源と制御デバイスを接続することができる。そのような接続は、有線又は無線であってよい。制御デバイスは、タイプ２シータ振動を誘発するために、対象の脳に設置されたレーザーに電力を供給するように構成されてよい。

脳内の標的領域の光遺伝子学的刺激の更なる詳細は、当業者には既知であり、そのような実施形態は、本発明の範囲内である。

電気刺激処置
ある場合には、本方法は、１つ以上の電極を使用して脳領域を電気的に刺激し、タイプ２シータ振動を誘導することを含む。ある場合には、電極は、一時的に又は永久的に、関心ある脳領域に配置することができる。通常、そのような技術は「深部脳刺激」と呼ばれる。

対象の脳内に設置された電極を作動させるための無線及び電池不要のデバイスは、当該技術分野で既知である。そのような特定のデバイスは、Ｗｏｎらの論文に記載され、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

脳の関心領域は、上記のようであってよく、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、ＭＳ、海馬采脳弓のうちの１つ以上を含む。ある場合には、脳領域は海馬である。ある場合には、脳領域は中隔海馬である。ある場合には、脳領域はＡＣＣである。ある場合には、脳領域はＢＬＡである。ある場合には、脳領域は内側中隔である。ある場合には、脳領域は海馬采脳弓である。

そのような電極は、対象の脳内に外科的に配置されることができ、それは、標的領域を電気的に刺激するために有線又は無線通信を介して活性化されることができる。このような標的領域の電気刺激は、関心領域におけるタイプ２シータ振動を誘導する。上で特定したＷｏｎらの論文は、これらの実施形態のいくつかに関連する情報を提供し、そのような実施形態は、本開示の範囲内である。

薬剤
ある場合には、本方法は、薬剤の投与が関与する。ある場合には、薬剤は、抗コリンエステラーゼである。抗コリンエステラーゼは、コリン作動性神経末端からの放出後にアセチルコリンの存在を増加させる薬物である。抗コリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼ及びブチルコリンエステラーゼの両方を阻害できる。人工型の抗コリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼのアニオン性部位を阻害する。酸転移性抗コリンエステラーゼは、酵素と反応し、アセチルコリンから形成されたアセチル化酵素ほど迅速に加水分解することができない中間化合物を形成する。

ある場合には、薬剤は、抗コリンエステラーゼ剤は、アトロピンである。ある場合には、薬剤はフィゾスチグミンであり、これはエゼリンとしても知られている。

ある場合には、薬物は、ＰＬＣの活性化剤、特に、ＰＬＣ－β１及び／又はＰＬＣ－β４の活性化剤である。場合によっては、ＰＬＣ活性化剤は、ｍ３Ｍ３ＦＢＳ（２，４，６－トリメチル－Ｎ－（メタ－３－トリフルオロメチル－フェニル）－ベンゼンスルホンアミド）、又はタプシガルギンである。ＰＬＣの活性化剤の更なる例は、米国特許出願公開第２０２０／０３０６２１３号及び米国特許出願公開第２０１１／０１２３９９４号に記載されており、これらはその全体が本明細書に組み込まれる。

ある場合には、薬剤は修飾され、標的脳領域はその薬剤がその標的脳領域でのみ作用するように修飾される。そのような特定の方法は、論文Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５６（６３３３）に開示されており、これは参照によりその全体が組み込まれる。

Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．に記載されているように、場合によっては、薬物活性は、連結による薬物の急性制限（ＤＡＲＴ）と呼ばれる分子内での連結によって、制限される。ＤＡＲＴは、ＤＡＲＴを活性薬物に変換する酵素を発現するタイプの細胞を標的とする。対象の脳内の特定の細胞は、ＤＡＲＴに作用する酵素を発現するように修飾されてもよい。ＤＡＲＴは、酵素を発現する細胞に送達されることができ、次に、その細胞は、標的細胞に薬物を送達する。

標的ニューロンの遺伝子組換え
ある場合には、本方法は、脳領域内のニューロンを遺伝子組換えして振動を直接調節することを含む。したがって、これらの実施形態は、ニューロンを光と接触させることを必要とせず、代わりに、他の生化学的経路を介してタイプ２シータ振動を修正することを伴う。例えば、そのような調節には、標的脳領域のニューロン等の細胞の遺伝子組換えが関与し、タイプ２シータ振動を直接調節する。光遺伝学的処置とは異なり、この選択肢は、他の生化学的経路を介してタイプ２シータ振動を修正する。

例えば、Ａｒｓｈａａｄ ｅｔ ａｌ．（２０２１），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌｕｍｅ１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１０９９は、Ｔ型Ｃａ^２＋チャネルＣａ_ｖ３．２の阻害が、海馬領域におけるタイプ２シータ振動を増加させることを示す。したがって、一実施形態において、タイプ２シータ振動の調節は、特定の脳領域、特にＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＣａ_ｖ３．２発現の調節を含む。ある場合には、タイプ２シータ振動は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＣａ_ｖ３．２発現を減少させることによって、増加する。このような減少は、これらの領域のうちの１つ以上における細胞を遺伝子組換えして、Ｃａ_ｖ３．２をコードする遺伝子の発現を阻害する阻害性ＲＮＡを発現させることによって達成できる。

ある場合には、タイプ２シータ振動の調節は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＣａ_ｖ３．１発現の調節を含む。ある場合には、タイプ２シータ振動は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＣａ_ｖ３．１発現を減少させることによって、増加する。このような減少は、これらの領域のうちの１つ以上における細胞を遺伝子組換えして、Ｃａ_ｖ３．１をコードする遺伝子の発現を阻害する阻害性ＲＮＡを発現させることによって達成できる。

ある場合には、タイプ２シータ振動の調節は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＣＡＶ３遺伝子発現の調節を含む。ＣＡＶ３遺伝子は、タンパク質カベオリン－３をコードする。ある場合には、タイプ２シータ振動は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＣＡＶ３発現を減少させることによって、増加する。このような減少は、これらの領域のうちの１つ以上における細胞を遺伝子組換えして、ＣＡＶ３遺伝子を阻害する阻害性ＲＮＡを発現させることによって達成できる。

ある場合には、タイプ２シータ振動の調節は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＰＣＦ－β１発現の調節を含む。ある場合には、タイプ２シータ振動は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＰＣＦ－β１発現を増加させることによって、増加する。このような減少は、これらの領域のうちの１つ以上における細胞を遺伝子組換えして、ＰＣＦ－β１をコードする遺伝子を発現させることによって達成できる。

ある場合には、タイプ２シータ振動の調節は、ある特定の脳領域、特に内側中隔におけるＰＣＦ－β４発現の調節を含む。ある場合には、タイプ２シータ振動は、ある特定の脳領域、特に、ＡＣＣ、ＢＬＡ、内側中隔、及び／又は海馬におけるＰＣＦ－β４発現を増加させることによって、増加する。このような減少は、これらの領域のうちの１つ以上における細胞を遺伝子組換えして、ＰＣＦ－β４をコードする遺伝子を発現させることによって達成できる。

対象及びタイプ２シータ振動の脳領域特定活性化
対象
本方法は、準最適な共感を有すると決定された任意の対象に使用できる。ある場合には、対象は、自閉症スペクトラム障害、認知症、依存症、うつ病、不安、双極性障害、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、失感情症、強迫性障害（ＯＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、精神病質、パーキンソン病、及びてんかんからなる群より選択される、精神的又は神経学的状態を有する。ある場合には、精神的又は神経学的状態は、自閉症スペクトラム障害、認知症、及び依存症からなる群より選択される。自閉症スペクトラム障害には、自閉症及びアスベルガー症候群が含まれる。例示的なタイプの認知症としては、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、及び前頭側頭型認知症が挙げられる。注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）は、注意欠陥障害（ＡＤＤ）と互換的に使用される。例示的な依存症としては、アルコール、大麻、ニコチン、オピオイド、幻覚剤、及び覚醒剤が挙げられる。

調節される特定の脳領域は、処置の有効性に影響を与えることができる。ある場合には、脳領域は、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、内側中隔、海馬采脳弓、又はこれらの領域のうちのいずれか１つ以上の組み合わせであってよい。ある場合には、脳領域は海馬である。ある場合には、脳領域は中隔海馬である。ある場合には、脳領域はＡＣＣである。ある場合には、脳領域はＢＬＡである。ある場合には、脳領域は内側中隔である。ある場合には、脳領域は海馬采脳弓である。ある場合には、列挙された脳領域のうちの２つ以上が調節される。

ある場合には、脳領域は、ＡＣＣの錐体ニューロン、内側前頭前野、及び／又は中隔海馬ＧＡＢＡ作動性投射を含む。

システム
対象の特定の脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節することによって、ヒト等の対象における共感を調節するためのシステムが提供される。ある場合には、システムは、対象の特定の脳領域におけるタイプ２シータ振動を増加させることによって、準最適な共感を有するヒト等の対象における共感を増加させる。準最適な共感は、準最適な共感を伴う精神医学的又は神経学的状態によって引き起こされ得る。場合によっては、システムは、対象の脳領域における調節型２シータ振動に構成されるデバイスを含む。

ある場合には、デバイスは、光遺伝学的デバイスである。光遺伝子デバイスは、脳領域に光を送達するように構成及び配置された光送信機に作動可能に結合された光源を含む。例えば、光遺伝学的処置のために、対象は、光感受性イオンチャネルを発現するように遺伝的に修正されたニューロンを脳内に有することができ、それによって、光がこれらのチャネルによって細胞と接触することを可能にする。光感受性イオンチャネルを発現するための脳内の遺伝子組換え細胞の特定の詳細は上記に記載されており、そのような詳細は、本明細書に開示されるシステムにも関連する。

細胞がニューロンである場合、光感受性イオンチャネルを発現する細胞を光にさらすことは、ニューロンの発火に影響する。ある場合には、光送信機は、光ファイバーケーブルを含む。ある場合には、光ファイバーケーブルの端部が脳領域内に配置され、光はその脳領域内の光遺伝子修正ニューロンに向けられる。

ある場合には、デバイスは、脳領域に電気刺激を送達するように構成及び配置された少なくとも１つの電極に作動可能に結合された電流発生器を含む電気刺激デバイスである。ある場合には、システムは、２つの電極を備える。ある場合には、システムは、３つ以上の電極を備える。

ある場合には、脳領域は、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、ＭＳ、海馬采脳弓、及び扁桃体からなる群より選択される。

添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の項によっても明確化される。

条項１．ヒトの脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節することを含む、ヒトにおける共感を調節する方法。

条項２．共感を調節することが、ヒトにおける共感を増加させることを含み、ヒトが、準最適な共感を有する、条項１に記載の方法。

条項３．ヒトにおける準最適な共感が、精神医学的又は神経学的状態によって引き起こされる、条項２に記載の方法。

条項４．タイプ２シータ振動を調節することが、同調を伴う又は伴わない光遺伝学的処置を含む、先行する条項のいずれか一項に記載の方法。

条項５．光遺伝学的処置が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを刺激することを含む、先行する条項のいずれか一項に記載の方法。

条項６．ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、海馬采脳弓に位置する、条項５に記載の方法。

条項７．ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、中隔海馬に位置する、条項５又は６に記載の方法。

条項８．タイプ２シータ振動を調節することが、脳領域におけるニューロンを遺伝子組換えしてタイプ２シータ振動を直接調節することを含む、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項９．脳領域におけるニューロンを遺伝子組換えすることが、Ｃａ_ｖ３．２、Ｃａ_ｖ３．１、ＣＡＶ３、ＰＬＣ－β１、及びＰＬＣ－β４をコードする１つ以上の遺伝子の発現を修正することを含む、条項８の方法。

条項１０．タイプ２シータ振動を調節することが、１つ以上の電極を使用する脳領域の電気刺激を含む、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項１１．調節することが、ヒトに薬剤を投与することを含む、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項１２．薬剤が、抗コリンエステラーゼ剤である、条項１１に記載の方法。

条項１３．抗コリンエステラーゼ剤が、アトロピン又はフィゾスチグミンである、条項１２に記載の方法。

条項１４．薬剤が、ＰＬＣの活性化剤である、条項１１に記載の方法。

条項１５．ＰＬＣの活性化剤が、ＰＬＣ－β１及び／又はＰＬＣ－β４の活性化剤である、条項１４に記載の方法。

条項１６．ＰＬＣの活性化剤が、ｍ３Ｍ３ＦＢＳ（２，４，６－トリメチル－Ｎ－（メタ－３－トリフルオロメチル－フェニル）－ベンゼンスルホンアミド）又はタプシガルギンである、条項１４又は１５に記載の方法。

条項１７．脳領域が、海馬、中隔海馬、前帯状皮質（ＡＣＣ）、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）、視床正中、絶縁領域、内側中隔（ＭＳ）、又は海馬采脳弓である、条項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

条項１８．タイプ２シータ振動が、海馬、ＡＣＣ、又はＢＬＡにおいて同期される、条項１～１７のいずれかに記載の方法。

条項１９．精神医学的又は神経学的状態が、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、認知症、依存症、うつ病、不安、双極性障害、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、失感情症、強迫性障害（ＯＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、精神病質、パーキンソン病、又はてんかんである、条項３に記載の方法。

条項２０．精神医学的又は神経学的状態が、自閉症スペクトラム障害、認知症、及び依存症からなる群より選択される、条項１９に記載の方法。

条項２１．調節することが、タイプ２シータ振動を増加させる、条項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

条項２２．調節することが、タイプ２シータ振動を減少させる、条項１に記載の方法。

条項２３．タイプ２シータ振動を調節することが、タイプ１シータ振動の調節を誘導しない、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項２４．ヒトの脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節するように構成されたデバイスを備える、ヒトにおける共感を調節するためのシステム。

条項２５．デバイスが、準最適な共感を有するヒトにおける共感を増加させるように構成されている、条項２４に記載のシステム。

条項２６．デバイスが、脳領域に光を送達するように構成及び配置された光送信機に作動可能に結合された光源を含む光遺伝学的デバイスである、条項２４又は２５に記載のシステム。

条項２７．デバイスが、脳領域に電気刺激を送達するように構成及び配置された少なくとも１つの電極に作動可能に結合された電流発生器を含む電気刺激デバイスである、条項２４又は２５に記載のシステム。

条項２８．２つの電極を備える、条項２７に記載のシステム。

条項２９．脳領域が、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、内側中隔、海馬采脳弓、扁桃体、又はそれらの組み合わせである、条項２４又は２５に記載のシステム。

以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が実行される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。

対象の脳内のタイプ２シータ振動のレベルを調節することによって、対象が準最適なレベルの共感を治療できることが提案されている。理論によって制限されることを意図するものではないが、マウスにおける共感は観察恐怖と相関することが見出されている。特に、より高い観察恐怖を有するマウスは、仲間のマウスに対してより高いレベルの共感も持っているのに対して、より低い観察恐怖を有するマウスは、仲間のマウスに対してより低いレベルの共感を持っている。加えて、タイプ２シータ振動は、より大きな共感とより大きな観察恐怖と関連していることが見出されている。したがって、対象におけるタイプ２シータ振動の増加は、対象における共感を増加させるであろう。

実施例１－実験方法
実験的アプローチは、高度な光遺伝学機能的ＭＲＩスキャン、計算モデル化、及び光遺伝学機能的超音波イメージングとともに、シータ振動及び共感の根底にある遺伝学的及び回路機構の研究を組み合わせて使用した。

マウス繁殖プログラムを実施し、観察恐怖が減少したマウス系統と、観察恐怖のレベルが正常又は増加した２番目のマウス系統とを得た。シータ脳波、遺伝学、光遺伝学、超音波、ｆＭＲＩ、及び光遺伝学機能的ＭＲＩによって、共感行動と観察恐怖との間の相関関係を明らかにするため、これらの系統を研究した。

予備研究中の観察恐怖学習において重度の欠陥を示したＰＬＣ－β１変異マウスを使用した。ＡＣＣと扁桃体におけるリズム振動に焦点を当てた。ここでは、ＡＣＣ興奮性ニューロンにおけるＰＬＣ－β１の機能と、観察恐怖中のＡＣＣ及びＢＬＡにおける同期した４～８Ｈｚシータ振動とが、観察恐怖に関与していることが分かった。これらの同期振動はタイプ２海馬シータリズムであり、これらのリズム同期は、観察恐怖学習のために選択的に必要であるが古典的恐怖条件付けのためには必要ではないことが示された。更に、３つの脳領域（海馬、ＡＣＣ、及びＢＬＡ）間のこのリズム同期の上昇と下降は、観察恐怖中の各すくみの開始と消失に時間的に先行する。最後に、観察恐怖行動の強度は、光遺伝学的にタイプ２シータ振動の強度を変化させることによって、双方向に変化する可能性がある。したがって、海馬、ＡＣＣ、及び扁桃体からなる長距離ネットワークにおいて同期した海馬タイプ２シータリズムは、従来の恐怖条件付けに影響を及ぼすことなく、観察恐怖につながる感情的共感の根底にある認知プロセスを駆動する。

実施例２－ＡＣＣの錐体ニューロンにおけるＰＬＣ－β１欠損は、２／３層ニューロンにおける観察恐怖及び興奮性を損なう
社会的欠陥を含む統合失調症の複数の中間形質を示すマウスモデルであるＰＬＣ－β１変異マウスは、観察恐怖学習の欠如を示す。したがって、この変異体の系統的分析を、行動、細胞、回路、生理学及びＥＥＧ分析を含む多様なレベルで実行した。ＰＬＣ－β１が観察恐怖に関与しているかどうかを具体的に判定するために、先に記載したるＪｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）を使用して、ＰＬＣ－β１ノックアウト（ＰＬＣ－β１^－／－）マウスによる観察恐怖学習アッセイを実行した（図１Ａ）。このアッセイにおいて、観察個体ＰＬＣ－β１^－／－マウスは、野生型観察個体マウスと比較して、すくみ行動の減少を明確に示した（Ｆ_１、１８＝４．６４８、ｐ＜０．０５；図１Ｂ）。ＰＬＣ－β１^－／－観察個体マウスは、同一の観察チャンバーに戻され、他のチャンバーは空にし、訓練後２４時間には、野生型観察個体マウスと比較して、すくみが減少したことを示した（ｐ＜０．０１、ｔ（１８）＝３．２１３；図１Ｃ）。したがって、ＰＬＣ－β１シグナル伝達は、マウスにおける観察恐怖行動に必要である。ＰＬＣ－β１は、ＡＣＣを含む内側前頭前野（ｍＰＦＣ）の領域において豊富に発現される。便宜上、ＡＣＣと、前辺縁皮質（ＰｒＬ）及び下辺縁皮質（ＩＬ）を含むｍＰＦＣ領域とを区別する。ＰＬＣ－β１^－／－マウスにおける観察恐怖の障害が、ＡＣＣ又はｍＰＦＣにおけるＰＬＣ－β１欠損に起因したかどうかを決定するために、ＰＬＣ－β１ ｍＲＮＡ（ｓｈＰＬＣ－β１）を標的とする小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするレンチウイルスを、野生型マウスのＡＣＣ（図１Ｄ）又はｍＰＦＣ（図１Ｇ）に両側から注入した。観察恐怖条件付け中、ｓｈＰＬＣ－β１のＡＣＣ特異的注入が施された観察個体は、混合型のｓｈＲＮＡ配列（ｓｈＳＣＲ）を伴うウイルスを注入された観察個体よりも有意に低いすくみレベルを示した（Ｆ_１、１６＝４．９１６、ｐ＜０．０５；図１Ｅ）。ＡＣＣ特異的ｓｈＰＬＣ－β１注入が施された観察個体において、２４時間での文脈記憶も減少した（ｐ＜０．０１、ｔ（１６）＝２．９６１；図１Ｆ）。一方、ｍＰＦＣにおけるＰＬＣ－β１ノックダウンは、観察恐怖条件付け（Ｆ_１、１２＝０．００４０６、Ｐ＝０．９５０；図１Ｈ）及び２４時間文脈記憶（ｐ＝０．８２４、ｔ（１２）＝０．２２８；図１Ｉ）に影響を及ぼさなかった。全身ＰＬＣ－β１ノックアウトマウスとは対照的に、ＰＬＣ－β１のＡＣＣ特異的サイレンシングは、文脈恐怖条件付け及び２４時間文脈依存記憶に影響を及ぼさなかった。この知見は、ＡＣＣは観察を通じた代理恐怖学習には関与しているが、有害な刺激である足刺激の直接的経験に依存する古典的な条件付けには関与していない、という以前の報告と一致している。ＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１ノックダウンを伴う観察個体マウスは、オープンフィールド試験、明暗遷移試験、及び高架式十字迷路試験によって決定されるような、移動又は不安レベルの変化を示さなかった。遺伝子サイレンシングの程度を評価するために、行動試験の完了後にマウスを屠殺し、ＡＣＣニューロンにおけるＰＬＣ－β１発現を免疫組織化学的に測定した。ＡＣＣ中のＰＬＣ－β１陽性ニューロンは、ｓｈＳＣＲが注入されたマウスと比較して、ｓｈＰＬＣ－β１が注入されたマウス中で数が顕著に減少した。次に、マウス脳のＡＣＣにおいて、ＰＬＣ－１７β１を発現した細胞型を明確にした。ＰＬＣ－β１と、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）又はグルタミン酸脱炭酸酵素６７（ＧＡＤ６７）との共発現を、二重免疫蛍光分析によって調べた。ＰＬＣ－β１陽性のＡＣＣニューロンは、主にＣａＭＫＩＩαで標識され、ＧＡＤ６７標識細胞の頻度は低かった。ＣａＭＫＩＩα標識ニューロンの平均９４．９１％±４．３９％及びＧＡＤ６７標識ニューロンの平均３２．７２％±４．３２％もＰＬＣ－β１陽性であった。したがって、大部分のＡＣＣ興奮性ニューロン及びいくつかの阻害性ニューロンは、ＰＬＣ－１ β１を発現する。

観察恐怖における、ＡＣＣの興奮性ニューロン中のＰＬＣ－β１の役割を調査するため、ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＧＦＰ－ＣｒｅをＰＬＣ－β１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウスのＡＣＣに注入することによって、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ組換えアプローチを使用してＡＣＣ興奮性ニューロン特異的ＰＬＣ－β１条件付きノックアウト（ＰＬＣ－β１ＡＣＣ／Ｃｒｅ）マウスを作製した（図１Ｊ）。ＰＬＣ－β１ＡＣＣ／Ｃｒｅ観察個体マウスは、ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＧＦＰ（ＰＬＣ－β１ＡＣＣ／ＧＦＰ）が注入された対照観察個体と比較して、観察恐怖（Ｆ_１、１８＝１０．９８１、ｐ＜０．０１；図１Ｋ）及び２４時間文脈記憶（ｐ＜０．０５、ｔ（１８）＝２．３５８；図１Ｌ）の障害を示した。観察恐怖に対する、阻害ニューロンを含むＡＣＣ非興奮性ニューロン中のＰＬＣ－β１サイレンシングの効果を決定するため、ＡＡＶ－ｌｏｘＰ－Ｕ６－ｓｈＰＬＣ－β１－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｌｏｘＰをＣａＭＫＩＩα－ＣｒｅマウスのＡＣＣに送達した（図１１ １Ｍ）。ＡＣＣ非興奮性ニューロン中のＰＬＣ－β１のノックダウンは、観察恐怖条件付け（Ｆ_１、１２＝０．１６２、ｐ＝０．６９５；図１Ｎ）及び２４時間文脈記憶（Ｐ＝０．４１７、ｔ（１２）＝－０．８４１；図１Ｏ）に影響を及ぼさなかった。

行動試験の完了後、マウスを屠殺し、二重免疫組織化学を用いて、興奮性及び抑制性ＡＣＣニューロン中のＰＬＣ－β１の発現を測定した。ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＧＦＰを注入されたマウスと比較して、ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ＧＦＰ－Ｃｒｅを注入されたマウスのＡＣＣ興奮性ニューロンにおいて、ＰＬＣ－β１の発現は低下した。同様に、ＡＡＶ－ｌｏｘＰ－２０ Ｕ６－ｓｈＳＣＲ－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｌｏｘＰを注入したマウスと比較して、ＡＡＶ－ｌｏｘＰ－Ｕ６－ｓｈＰＬＣ－β１－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｌｏｘＰを注入したマウスのＡＣＣ阻害ニューロンにおいて、ＰＬＣ－β１の発現は低下した。

ＰＬＣ－β１^－／－マウスにおける障害ある観察恐怖の根底にある細胞機構を評価するため、パッチクランプ記録技術を使用して、脳スライス中のＡＣＣ錐体ニューロンについて、内発的な発火特性を調べた。－６０ｍＶに調整された静止膜電位から脱分極電流（１０－ｐＡ増分、７ステップ、１－ｓ持続時間）を細胞に注入することによって、Ｂ６．１２９ ＰＬＣ－β１^＋／＋／ＧＡＤ６５ＧＦＰｔｇマウス及びＢ６．１２９ ＰＬＣ－β１^－／－／ＧＡＤ６５ＧＦＰｔｇマウスにおけるＡＣＣ錐体ニューロンの活性を比較した（図１Ｐ）。脱分極電流によって誘発される活動電位の頻度は、野生型マウスのそれと比較して、ＰＬＣ－β１^－／－マウスの錐体ニューロンで有意に減少した（Ｆ_１、９８＝１０．８６、ｐ＝０．００１４、二元配置反復測定分散分析；図１Ｑ）。特に、この興奮性の低下は、２／３層ＡＣＣニューロン（Ｆ_１、３４＝１１．６２、ｐ＝０．００１７、二元配置反復測定分散分析；図１Ｒ）でのみ観察され、５／６層ニューロン（Ｆ_１、６２＝２．７４、ｐ＝０．１０２７、二元配置反復測定分散分析；図１Ｓ）では観察されなかった。総合すると、これらの所見は、ＡＣＣの興奮性であって阻害性ではないニューロンにおけるＰＬＣ－β１シグナル伝達が、マウスにおける２／３層ニューロンの観察恐怖及び興奮性に関与することを示す。

実施例３－ＡＣＣとＢＬＡとの間の相互回路は、観察恐怖条件付けのために必要であるが、古典的恐怖条件付けのためには必要ではない
以前の順行性及び逆行性標識研究は、ＡＣＣ及びｍＰＦＣにおいて、５／６層ニューロンではなく、２／３層ニューロンが、マウスにおけるＢＬＡに優先的に投射することを示した。ＡＣＣはまた、主にＢＬＡから扁桃体入力を受信し、ＡＣＣ－ＢＬＡ回路の相互関係を実証している。自由に行動する野生型観察個体マウスのＡＣＣ及び外側扁桃体における局所的電場電位（ＬＦＰ）の同時記録を使用した研究は、観察恐怖におけるＡＣＣと扁桃体との機能的接続性を示唆した。ＡＣＣ又はｍＰＦＣからＢＬＡへの投射が観察恐怖に必要かどうかを調査するために、観察恐怖中にＡＣＣ－ＢＬＡ又はｍＰＦＣ－ＢＬＡ回路を阻害する光遺伝学的アプローチを使用した（図２Ａ）。これらの実験では、ＡＣＣ（図２Ｂ）又はｍＰＦＣ（図２Ｈ）に、観察恐怖課題の６週間前にＡＡＶ５－２ ＣａＭＫＩＩα－ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰ（ＮｐＨＲ）を注入し、ＢＬＡを黄色レーザーで両側照射した。観察恐怖条件付け中の両側ＢＬＡ内のＡＣＣ興奮性ニューロンの軸索末端の光遺伝学的サイレンシング時に、ＮｐＨＲを注入されたマウスは、ＡＡＶ５－ＣａＭＫＩＩα－ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ）が注入された対照マウスと比較して、すくみの減少を示した（Ｆ_１、１９＝１４．２２４、Ｐ＝０．００１；図２Ｃ）。翌日実行された文脈想起試験において、ＮｐＨＲ注入群のマウスは、ｅＹＦＰ注入群のマウスと比較して、すくみ行動の有意な低下を示した（ｐ＜０．０５、ｔ（１９）＝－２．６７１；図２Ｄ）。しかしながら、観察恐怖中の両側ＢＬＡ内のＰｒＬ及びＩＬ興奮性ニューロンを含むｍＰＦＣの軸索末端の光遺伝学的阻害は、条件付け（Ｆ_１、１３＝０．００２３２、ｐ＝０．９６２；図２Ｉ）及び２４時間文脈記憶回復（ｐ＝０．２６７、ｔ（１３）＝１．１６０；図２Ｊ）に影響しなかった。古典的文脈恐怖条件付け（図２Ｋ）中の両側ＢＬＡ（図２Ｂ）内の興奮性ＡＣＣニューロンの軸索末端の光遺伝学的阻害も、訓練（Ｆ_１、１２＝０．０５８７、Ｐ＝０．８１３；図２Ｌ）にも２４時間文脈記憶回復（ｐ＝０．７８７、ｔ（１２）＝０．２７６；図２Ｍ）にも影響を及ぼさなかった。

ＢＬＡからＡＣＣへの投射が観察恐怖に関与しているかどうかを検証するために、観察恐怖中のＢＬＡからＡＣＣへの興奮性投射を光遺伝学的に阻害した。この目的のために、ＢＬＡにＮｐＨＲを注入し、ＡＣＣを黄色レーザーで照射した（図２Ｅ）。観察恐怖条件付け中のＡＣＣ内の興奮性ＢＬＡ末端の光遺伝学的サイレンシング時（図２Ａ及び図２Ｅ）、ＮｐＨＲを注入されたマウスは、ｅＹＦＰを注入された対照マウスと比較して、すくみの減少を示した（Ｆ_１、２１＝１２．８５８、ｐ＜０．０１、図２Ｆ）。翌日実行した文脈想起試験において、ＮｐＨＲ注入群のマウスは、ｅＹＦＰ注入群のマウスと比較して、すくみ行動が低下した（ｐ＜０．０５、ｔ（２１）＝－２．２５１；図２Ｇ）。一方、文脈恐怖条件付け（図２Ｋ）中のＡＣＣ内興奮性ＢＬＡニューロンの軸索末端の光遺伝学的阻害（図２Ｅ）は、訓練（Ｆ_１、１２＝１．３９８、ｐ＝０．２６０、図２Ｎ）にも２４時間文脈記憶回復（ｐ＝０．６９８、ｔ（１２）＝０．３９８、図２Ｏ）にも影響を及ぼさなかった。まとめると、これらの知見は、ＡＣＣとＢＬＡとの間の相互興奮回路は観察恐怖には必要であるが、古典的な文脈的恐怖条件付けには必要ではないことを示唆している。

実施例４－ＡＣＣ－ＢＬＡ回路における４～８Ｈｚ振動は、観察恐怖に障害のあるＡＣＣ特異的ＰＬＣ－β１ノックダウンマウスには存在しない
観察恐怖中にＡＣＣとＢＬＡとの間に４～８Ｈｚの同期振動が出現することが以前示された。したがって、方法に記載されている手順に従って、これらの同期振動が、観察恐怖に障害のあるＡＣＣ－ＰＬＣ－β１－ノックダウンマウスに存在しないかどうかを試験した。この目的のために、ｓｈＰＬＣ－β１又はｓｈＳＣＲ対照ウイルスのいずれかをＡＣＣ特異的に注入した観察個体マウスにおいて、観察恐怖条件付け中のＡＣＣ及びＢＬＡにおけるＬＦＰを記録した（図３Ａ）。条件付け中の馴化及び刺激間の期間に得られたＬＦＰ記録を使用し、各マウスについて電力スペクトル密度及びクロスコレログラムを推定した（図３Ｂ～図３Ｄ）。まず、対照マウスにおいて、観察恐怖中のＡＣＣとＢＬＡとの間の４～８Ｈｚの同期振動の出現を確認した。その結果、ｓｈＳＣＲがＡＣＣに注入されたマウスにおいて、馴化から条件付けの間で、ＬＦＰシータパワーの有意な調節を見出した（ＡＣＣ相互作用条件ｘ周波数：Ｆ_８、９６＝６．１５５、ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定；４～８Ｈｚ、馴化から条件付けへ：ｐ＜０．０５、ｔ（６）＝３．２７９２、対応のあるｔ検定；図３Ｅ及び図３Ｇ）、及びＢＬＡ（ＢＬＡ相互作用条件ｘ周波数：Ｆ_８、９６＝５．６９７、ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定；４～８Ｈｚ、馴化から条件付けへ：ｐ＜０．０５、ｔ（６）＝２．５９７２、対応のあるｔ検定；図３Ｅ及び図３Ｈ）。対照群とは著しく対照的に、ｓｈＰＬＣ－β１を注入されたマウスは、馴化から条件付けまで、４～８ＨｚでのＬＦＰスペクトルの電力の有意な低下を示した。（ＡＣＣ相互作用条件×周波数：Ｆ_{８、１４４}＝４．４０１、ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定；４～８Ｈｚ、馴化から条件付けへ：ｐ＜０．０１、ｔ（９）＝－３．２８９４、対応のあるｔ検定；図３Ｆ及び図３Ｉ）（ＢＬＡ相互作用条件ｘ周波数：Ｆ_{８、１４４}＝４．０１６、ｐ＜０．０１、二元配置反復測定分散分析、続くボンフェローニ事後検定；馴化から条件付けへ：ｐ＜０．０１、ｔ（９）＝－３．３２０１、対応のあるｔ検定；図３Ｆ及び図３Ｊ）。

シータ電力の減少に加えて、ｓｈＰＬＣ－β１を注入された観察個体マウスにおいて、観察恐怖中に、ＡＣＣとＢＬＡとの間の同期も障害を受けた。対照であるｓｈＳＣＲを注入されたマウスにおける相互相関分析は、条件付け段階における、有意な相関関係の増加を示し、特にシータ周波数に対応する第２のピーク（０ラグピークから第２のピークまでの平均距離：１４２ミリ秒［７．０４６ヘルツ］；図３Ｋ、明るい青色の出力）において、ＡＣＣとＢＬＡとの間のシータ同期について以前の観察を再度確認した。一方、ｓｈＰＬＣ－β１を注入されたマウスにおける同様の相互相関分析は、観察恐怖中に同期の兆候を示さなかった（図３Ｌ）。これらの結果は、ＡＣＣ及びＢＬＡにおけるシータ同期の中断が、ＡＣＣにおけるＰＬＣ－β１欠失に起因する観察恐怖の障害と関連していることを示唆する。これらの知見は、ＡＣＣ内のＰＬＣ－β１が、ＡＣＣとＢＬＡとの間の相互回路における同期した４～８Ｈｚ振動及び観察上の恐怖のために必要であることを示す。

実施例５－海馬、ＡＣＣ、及び扁桃体からなる長距離ネットワークにおけるタイプ２シータの同期は、観察恐怖の発現に不可欠である
ＡＣＣ及びＢＬＡにおけるこの同期した４～８Ｈｚリズムが実際に海馬シータリズムであるかどうかを判定するため、Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎらによって以前に記載された方法を使用して、タイプ２海馬シータリズムを選択的に調節した。内側中隔（ＭＳ）から海馬へのＧＡＢＡ作動性投射を阻害することによって、マウスにおいてタイプ１ではなくタイプ２海馬シータリズムが特異的に低減することが知られている。この目的のために、ＰＶ－ＣｒｅトランスジェニックマウスのＭＳに、観察恐怖アッセイの４週間前にＡＡＶ５－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ＮｐＨＲ３．０－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ＮｐＨＲ）を注入した。次いで、観察恐怖学習中に背側脳弓を黄色レーザーによって照射した（図４Ａ）。このような光照射は、海馬への中隔ＧＡＢＡ作動性投射に選択的に影響を及ぼし、それによってタイプ２シータを選択的に減衰させることが予想される。

まず、そのような処置が観察恐怖行動に影響を与えるかどうかを検査した。観察恐怖条件付け中に、背側脳弓内の中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維の光遺伝的不活性化の際（図４Ｃ）、ＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入されたマウスは、対照であるＡＡＶ５－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ｅＹＦＰ）ウイルスを注入したマウスと比較して、すくみの減少を示した（Ｆ_１、２２＝１７．２７７、ｐ＜０．００１；図４Ｄ）。翌日実行した文脈想起試験において、ＤＩＯ－ＮｐＨＲ注入群のマウスは、ＤＩＯ－ｅＹＦＰ注入群のマウスと比較して、すくみ行動が有意に低下した（ｐ＜０．０５、ｔ（２２）＝２．４８０；図４Ｅ）。対照的に、古典的文脈恐怖条件付け（図４Ｆ）中の中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維のＮｐＨＲ媒介性阻害は、訓練（Ｆ_１、１１＝０．００２８９、ｐ＝０．９５８；図４Ｇ）及び２４時間文脈記憶回復（ｐ＝０．８１７、ｔ（１１）＝０．２３８；図４Ｈ）に影響を及ぼさなかった、これは、タイプ２海馬リズムは観察恐怖のためには選択的に必要であるものの、一般的な恐怖のためには必要ではないことを示す。

観察恐怖におけるタイプ２海馬シータリズムの役割を、別のアプローチも使用して確認した。ＰＬＣ－β４のＭＳ選択的サイレンシングは、マウスの海馬におけるタイプ２シータリズムを減衰させることが知られている。したがって、ＭＳ特異的ＰＬＣ－β４ノックダウンマウスを、ＰＬＣ－β４（ｓｈＰＬＣ－β４）を標的とするｓｈＲＮＡを使用して作製し、次いでこれらのマウスに観察恐怖課題を課した。ＭＳ－８制限ＰＬＣ－β４－ノックダウン観察個体マウスは、対照であるｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）を注入された観察個体マウスと比較して、障害のある観察恐怖（Ｆ_１、２１＝９ ７．４２３、ｐ＜０．０５）及び障害のある２４時間文脈記憶（ｐ＜０．０５、ｔ（２１）＝－２．５４５）を示した。上記光遺伝学的実験と同様に、古典的文脈恐怖条件付け（Ｆ_１，９＝４．８４７、ｐ＝０．０５５）及び２４時間文脈恐怖記憶（ｐ＝０．９６１、ｔ（９）＝０．０４９９）において、ｓｈＰＬＣ－β４注入群及びｓｈＣｏｎｔｒｏｌ注入群の間に差はなかった。

次に、ＡＣＣ及びＢＬＡ内の４～８Ｈｚ活性が、観察恐怖中のＭＳにおける海馬投射ＧＡＢＡ作動性ニューロンの光遺伝学的阻害によって、実際に影響されるかどうかを確認するために、ＤＩＯ－ＮｐＨＲ又はＤＩＯ－ｅＹＦＰをＭＳ特異的に注入した同じ観察個体マウスにおいて、観察恐怖条件付け中のＡＣＣ、ＢＬＡ、及び海馬におけるＬＦＰを測定した（図４Ｂ）。光遺伝学的サイレンシングは、４～１２Ｈｚ振動の全体的な発生及び検出を有意に変化させなかった。しかしながら、４～８Ｈｚ及び８～１２Ｈｚ周波数の間の電力の比較分析は、対照であるＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入された観察個体において、ＬＦＰ電力が、３つの脳領域の馴化から条件付けの間、特に４～８Ｈｚの周波数で有意に増加したが、８～１２Ｈｚでは増加しなかったこと、を明らかにした。ＡＣＣ（ＡＣＣ相互作用条件×周波数：Ｆ_８、１ ９６＝４．７４３、Ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定；図４Ｉ）、ＢＬＡ（ＢＬＡ相互作用条件×周波数：Ｆ_８、９６＝６．２４８、ｐ＜０．００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定；図４Ｊ）、及び海馬（海馬相互作用条件×周波数：Ｆ_８、９６＝３．０６１、ｐ＜０．０１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定；図４Ｋ）。対照的に、海馬へのＭＳ ＧＡＢＡ作動性投射のＤＩＯ－ＮｐＨＲ媒介光遺伝学的阻害は、３つの領域の馴化から条件付けの間、ＬＦＰ電力においてそのような調節を抑止した。ＡＣＣ（ＡＣＣ相互作用条件×周波数：Ｆ_８、８０＝０．１８８、ｐ＝０．９９２、二元配置反復測定分散分析、それに続く１０ボンフェローニ事後検定；図４Ｌ）、ＢＬＡ（ＢＬＡ相互作用条件×頻度：Ｆ_８、８０＝０．７４３、ｐ＝０．６５３、二元配置反復測定分散分析；図４Ｍ）、及び海馬（海馬相互作用条件×周波数：Ｆ_８、８０＝０．０８１、ｐ＝１．０００、二元配置反復測定分散分析；図４Ｎ）。これらの結果は、海馬タイプ２シータの抑制が実際に観察恐怖行動を妨げることを実証する。

重要なことに、観察恐怖中の海馬シータ振動の調節は、タイプ２シータに特異的であり（図４Ｋ）、中隔海馬ＧＡＢＡ作動性投射のサイレンシングは、８～１２Ｈｚのタイプ１シータ振動に影響を及ぼすことなく（ｐ＝０．１４４４、ｔ（１１）＝１．５７１６；図４Ｔ）、タイプ２シータ振動におけるこの調節を選択的に妨害した（Ｐ＜０．０５、ｔ（１１）＝－２．４８６９；図４Ｑ）。海馬シータ振動のタイプ２特異的妨害と一致して、４～８ＨｚのＬＦＰ電力における同様の妨害が、ＡＣＣ（Ｐ＜０．０５、ｔ（１１）＝－２．９６７８；図４Ｏ）及びＢＬＡ（Ｐ＜０．０１、ｔ（１１）＝－３．１８２９；図４Ｐ）において観察された。一方、ＡＣＣ及びＢＬＡにおける８～１２Ｈｚシータリズムの電力変化は、ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入されたマウス及びＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入されたマウスの間で差はなかった（ＡＣＣ：ｐ＝０．３１８９、ｔ（１１）＝１．０４３９；ＢＬＡ：ｐ＝０．３０６１、ｔ（１１）＝１．０７３４；図４Ｒ及び図４Ｓ）。

タイプ２海馬シータ振動の光遺伝学的抑制も、これら３つの脳領域間の同期を妨害した。ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入した対照観察個体は、３つの脳領域の間で、４～８Ｈｚ、タイプ２シータの範囲において、相関関係の増加を示した（０ラグピークから第２のピークまでの平均距離：ＡＣＣ－ＢＬＡ、１３４ｍｓ［７．４６Ｈｚ］；ＡＣＣ－海馬、１６３ｍｓ［６．１３Ｈｚ］；ＢＬＡ－海馬、１７５ｍｓ［５．７１Ｈｚ］）。対照的に、馴化から条件付けの間のタイプ２シータ同期におけるそのような調節は、ＤＩＯ－ＮｐＨＲを注入された観察個体においては抑止された。脳領域間の非ゼロラグ位相差は、観察恐怖中の同期が、私たちの記録における体積伝導によるものではないことを示唆している。

総合すると、これらの知見は、海馬－帯状回枝－扁桃体回路の長距離ネットワークにおけるタイプ２シータリズム同期が、観察恐怖の発現に不可欠であることを示している。

実施例６－タイプ２シータにおける電力調節は、すくみ行動と時間的に連動し、この電力調節の程度は、観察恐怖の大きさを予測する
観察恐怖中のタイプ２海馬シータリズムとすくみ発作との間の時間的関係を調べるために、対照であるＤＩＯ－ｅＹＦＰ－２２を注入された観察個体におけるすくみの開始及び消失付近のタイプ２海馬シータリズムの時間的進行を分析した（図５Ａ～図５Ｄ）。これらの実験は、海馬－帯状－扁桃体回路におけるタイプ２シータリズムの電力が、すくみの開始直前に増加し（図５Ａ及び図５Ｂ）、すくみ中に維持され、次いで、すくみの消失の直前に終了（図５Ｃ及び図５Ｄ）することを示し、タイプ２シータ調整とすくみ行動との間の緊密な時間的連動を明らかにした。

次に、タイプ２シータの強度が観察恐怖行動の大きさと関連しているかどうかを検討した。馴化から条件付けにおける４～８ＨｚのＬＦＰにおける電力調節の程度も、マウスにおけるすくみレベルと正相関していた（ピアソンの相関分析：ＡＣＣ、ｒ＝０．８１３、ｐ＜０．００１；ＢＬＡ、ｒ＝０．８３６、Ｐ＜０．００１；海馬、ｒ＝０．７２２、ｐ＜０．０１；図５Ｅ～図５Ｇ）。一方、タイプ１シータリズムのレベルの変化とすくみレベルとの間には有意な相関はなく（図５Ｈ～図５Ｊ）、タイプ１リズムはすくみ中にやや減少しているようである（図５Ａ～図５Ｄ）。

要約すると、これら３つの脳領域におけるタイプ２シータリズムの調節は、観察恐怖中のすくみ行動と、時間的に密接に固定され、定量的に相関している。

実施例７－観察恐怖中のタイプ２海馬シータリズム調節の上方調節
タイプ２海馬シータリズムを実験的に調節することが観察恐怖を高める可能性があるかどうかを検証するため、Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎら（２０１６）による前述の手順を使用して、海馬へのＭＳ ＧＡＢＡ作動性投射を光遺伝学的に活性化することによって、タイプ２海馬シータリズムを調節した。この目的のために、ＡＡＶ５－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ＣｈＲ２－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ＣｈＲ２）を、ＰＶ－ＣｒｅトランスジェニックマウスのＭＳに観察恐怖アッセイの４週間前に注入し（図６Ａ）、観察恐怖条件付け中に青色レーザーで背側脳弓を照射した（図６Ａ及び図６Ｃ）。観察恐怖の間、３つの脳領域ＡＣＣ、ＢＬＡ、及び海馬におけるＬＦＰ記録によって、マウスを調べた（図６Ｂ）。観察恐怖条件付け中、中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維の光遺伝子活性化時（図６Ｃ）、ＤＩＯ－ＣｈＲ２を注入されたマウスは、ＡＡＶ５－ＥＦ１ａ－４ ＤＩＯ－ｅＹＦＰ（ＤＩＯ－ｅＹＦＰ）を注入された対照マウスと比較して、条件付け中のすくみ行動が有意に高まったことを示した（Ｆ_１，１７＝９．１５５、ｐ＝０．００８、図６Ｄ）。しかしながら、２４時間文脈記憶は、ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入されたマウスと比較して、有意に高まらなかった（Ｐ＝０．５８７、ｔ（１７）＝－０．５５４、図６Ｅ）。

タイプ２海馬シータにおける電力変化は、光遺伝子刺激によって対照と比較して有意に増加したが、全体的な４～１２Ｈｚ振動の発生及び検出の有意な変化はなかった。以前の実験と同様に、電力スペクトル密度は、ＤＩＯ－ｅＹＦＰを注入されたマウス（図６Ｆ～図６Ｈ；ＡＣＣ、Ｆ_{８、１１２}＝５．６８、ｐ＜１２ ０．０００１；ＢＬＡ、Ｆ_{８、１１２}＝７．０２２、Ｐ＜０．０００１；海馬、Ｆ_{８、１１２}＝２．３９１、ｐ＜０．０５、相互作用条件×周波数、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定）、及びＤＩＯ－ＣｈＲ２を注入されたマウス（図６Ｉ～図６Ｋ、相互作用条件ｘ周波数：ＡＣＣ、Ｆ_{８、１６０＝}１４．２６、ｐ＜０．０００１；ＢＬＡ、Ｆ_{８、１６０}＝１４．１７、Ｐ＜０．０００１；海馬、Ｆ_{８、１６０}＝３．５２１、Ｐ＜０．０００１、二元配置反復測定分散分析、それに続くボンフェローニ事後検定）のＡＣＣ及びＢＬＡにおいて、低周波数シータ振動の増強を明示した。特に、ＣｈＲ２媒介光遺伝子刺激は、観察恐怖条件付け中の海馬及びＡＣＣにおける４～８Ｈｚのシータの電力変化を更に増加させた（図６Ｌ～図６Ｎ；ＡＣＣ、ｐ＜０．０５、ｔ（１７）＝２．４２１１；ＢＬＡ、ｐ＝０．１９７６、ｔ（１７）＝１．３４１；海馬、Ｐ＜０．０５、ｔ（１７）＝２．３４２５、ｔ検定）。光遺伝子刺激による電力変化の調節は、ＢＬＡにおいて、傾向は示したものの、統計的に有意ではなかった。上記図５の結果と一致して、ＡＣＣ、ＢＬＡ、及び海馬における４～８Ｈｚのタイプ２シータの電力変化の大きさは、観察恐怖中のすくみ行動と正相関していた（図６Ｏ～図６Ｑ）。一方、これらの脳領域における８～１２Ｈｚのタイプ１シータの電力変化（図６Ｒ～図６Ｔ）は、観察恐怖中のすくみ行動と相関しなかった（図６Ｕ～図６Ｗ）。総合すると、これらの結果は、タイプ２海馬シータリズムの高めることが観察恐怖を高めることができることを示している。

実施例８－海馬、ＡＣＣ、及び扁桃体のネットワークで同期されたタイプ２シータリズムは、共感的恐怖を駆動する
本開示は、マウスにおいて、海馬、ＡＣＣ、及び扁桃体からなるネットワーク内で同期したタイプ２シータリズムが、古典的な恐怖条件付けに影響を及ぼすことなく、共感的恐怖を引き起こすことを実証する。したがって、多領域回路におけるシータリズム同期の上昇及び下降は、それぞれすくみ行動の開始及び消失に先行する。また、これらの振動の増強の程度は、観察恐怖中のすくみ行動の強さを予測し、タイプ２海馬シータ振動の電力を変化させることで、３つの領域の振動結合を双方向的に調節し、次に観察恐怖を調節する。

ＡＣＣ－ＢＬＡ投射は機能的に不均一なようであり、それぞれが別個の恐怖行動に関与している。ＡＣＣ－ＢＬＡ又はＢＬＡ－ＡＣＣ興奮性突起の光遺伝学的阻害は、観察恐怖を損なったが、古典的な文脈恐怖条件付けには影響しなかった（図２）。したがって、相互的なＡＣＣ－ＢＬＡ接続における観察恐怖の根底にある神経機構は、古典的な恐怖条件付けに関与するものとは異なる。観察個体動物おける軽度の足刺激についての以前の知識は、代理的観察恐怖学習を強く高める。しかしながら、この行動パラダイムにおいては、ＡＣＣ－ＢＬＡ投射及び反対のＢＬＡ－ＡＣＣ投射のいずれの光遺伝学的阻害も、実践個体の苦痛の観察における共感的恐怖反応を抑制しなかった。これは、未処置の観察個体マウスで実施された観察恐怖課題の結果とは対照的であり、それにおいては、ＡＣＣ－ＢＬＡ及びＢＬＡ－ＡＣＣ回路の両方が観察恐怖のために必要であった（図２）。この矛盾は、これら２つの異なるパラダイムによって明らかにされた行動が、異なる神経機構によって支持されている可能性があることを示唆している。したがって、未処置の観察個体動物で明らかにされる観察恐怖は、過去に足刺激を経験した観察個体動物によって社会的に呼び起こされる起想の複雑な問題から隔離された共感的行動を、反映するはずである。ＡＣＣ－ＢＬＡ投射の不活性化は、嗅覚的脅威刺激に対する本能的な恐怖反応を高めたが、これらの投射の活性化はこれらの反応を低下させ、異なるＡＣＣ－ＢＬＡ投射が恐怖関連行動につながる多様な認知プロセスに関与しているという考えを支持した。

海馬シータ振動の明確な亜型の存在と異なる脳機能との関連性は、ヒト及びげっ歯類において示されている。タイプ１シータリズム（８～１２Ｈｚ）と呼ばれるシータリズムのサブセットの１つは、随意運動の間に現れる。タイプ２シータリズム（４～８Ｈｚ）と呼ばれるシータリズムの他のサブセットは、警戒不動、不安関連行動、捕食者臭に対する本能的反応、及び新規性探索行動と関連している。これらシータリズムの２つの形態は、薬理学的感受性、光遺伝学に基づく異なる神経回路、及び関与する遺伝因子によっても互いに区別される。本開示の結果は、哺乳動物の脳におけるシータ振動の不均一性のアイデアを更に強化する。

脳の２つの領域間の同期シータ振動は、ヒト及びげっ歯類における認知及び感情行動中の調整された領域間脳コミュニケーションを支持するためのリズムニューロン活動であると考えられている。それにもかかわらず、特定の行動中の前頭前皮質及び扁桃体等の関連する構造に存在するシータ周波数での調整されたリズム活動の起源及び機能は、まだ明らかにされていない。例えば、恐怖消滅後のｍＰＦＣ及びＢＬＡにおける調整された６～１２Ｈｚの振動も海馬シータリズムに似ているが、その起源はまだ決定されていない。ｍＰＦＣ及びＢＬＡにおける同期した４Ｈｚの７つの振動は、条件付けられた恐怖の発現と関連していたが、海馬のシータ振動には依存していなかった。条件付けられた恐怖によって誘導されたすくみ行動中に、ｍＰＦＣ、ＢＬＡ、及び海馬等のいくつかの脳領域において嗅覚入力は、呼吸関連リズム活性（約４Ｈｚ）を調節することができる。しかしながら、これらの海馬呼吸誘導振動は、局所的に生成されたシータ振動とは異なり、海馬呼吸結合リズムは、独自の層状振幅プロファイルを有し、アトロピンに対して耐性である。対照的に、本開示は、観察恐怖中のＡＣＣ－ＢＬＡ回路における４～８Ｈｚリズムの同期強化が実際に海馬タイプ２シータであり、観察恐怖中のすくみエピソードと時間的にも量的にも強く関連していることを示す。重要なことに、このリズム同期は、通常の恐怖条件付けには必要なかった。したがって、共感的恐怖に関与するタイプ２海馬シータは、古典的恐怖の間に観察された呼吸誘導４Ｈｚ振動とは異なる。また、ＡＣＣ－ＢＬＡ回路のタイプ２シータ振動は、観察恐怖に固有の認知プロセスを表し、直接的な恐怖行動と代理的な恐怖行動の２つの異なる恐怖行動が異なる神経系によって媒介されることを示唆している。

内側中隔におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞体の光遺伝学的阻害は、海馬の全ての層におけるシータ活性を低下させたが、広範な電気生理学的データによって実証されたように、他の海馬活動には影響を及ぼさなかった。操作の選択性を更に向上させるために、背側脳弓の中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維を光遺伝学的に標的とし、これにより、光刺激を中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維に限定した。解剖学的には、中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維は、ＭＳから海馬へ背側脳弓を介して投射し（図４Ａ及び図６Ａ）、これらのＧＡＢＡニューロンは、海馬全体に投射する。したがって、背側脳弓を介した光学操作は、中隔海馬ＧＡＢＡ投射全体を調節する効果的な方法である。この方法は背側海馬及び腹側海馬の両方で低周波シータを操作するので、観察恐怖のために海馬のどの小領域が（違いがある場合に）重要であるかは現在不明である。最近の研究は、感情処理における腹側小領域の強い関与を示唆している。しかしながら、観察恐怖中のＡＣＣ及び扁桃体とのシータ同期は、古典的恐怖中に以前観察された振動機構と根本的に異なることが判明したため、観察恐怖が腹側海馬機能によるのか、ＡＣＣと背側海馬との間の双方向通信等の他の神経回路に依存するのかは調査されていない。中隔海馬ＧＡＢＡ作動性線維の光遺伝活性化は、１日目の条件付けで観察恐怖を高めたが、２４時間文脈記憶には影響しなかったことは注目に値する。これは、１日目の条件付けにおいて示される「強調行動」の根底にある機構が、２日目の記憶試験の根底にあるものとは根本的に異なる可能性があるという考えと一致する。

したがって、本開示は、多様な神経精神医学的又は神経学的状態に示される社会的欠陥の症状が、脳回路におけるタイプ２シータ振動の障害と関連する可能性があることを示唆する。言い換えれば、タイプ２海馬シータ同期の障害は、社会的欠陥の根底にある普遍的な神経病理である可能性があり、これは多様な神経精神医学的又は神経学的状態で広く見られる。

ＰＬＣ－β１は、多くの脳領域に広く分布しているが、大脳皮質において高度に発現している。更に、げっ歯類におけるｍＰＦＣ（ＡＣＣを含む）と相同である背外側前頭前皮質（ＤＬＰＦＣ）を含むいくつかの脳領域における統合失調症患者のＰＬＣ－β１発現の減少は、統合失調症におけるＰＬＣ－β１下方調節の病理的関与を示唆している。ここで、ｓｈＲＮＡを介したＰＬＣ－β１のサイレンシングを使用して、統合失調症患者のＤＬＰＦＣにおけるＰＬＣ－β１の減少を模倣したマウスモデルを作製した。これらのモデルマウスの行動特性評価は、移動の増加、不安の減少、及び文脈的恐怖条件付けの障害を含むヌル変異体ＰＬＣ－β１^－／－の表現型とは異なり、ＰＬＣ－β１のＡＣＣ制限ノックダウンは、不安又は移動に影響を及ぼすことなく、観察恐怖の障害を誘導したことを明らかにした。加えて、本明細書に開示される結果は、感情的共感への関与のために、ＡＣＣをｍＰＦＣの残りの領域、すなわち、前辺縁皮質及び下辺縁皮質から区別する。したがって、ＡＣＣにおける観察恐怖の根底にある神経機構は、ＰＬＣ－β１^－／－、ヌル変異体の抗不安様行動又は過剰に活発な運動の根底にあるものとは異なっていなければならない。更に、本明細書で観察されるシータ振動の欠損と共感の欠如との間の強い関連性は、ＰＬＣ－β１が減少している統合失調症のヒト患者に見られる社会的欠陥を説明することができる。本開示は、シータ同期が共感的応答のための重要な調節因子であることを確認する。

上記の発明は、明確な理解のために例示及び例により多少詳しく説明されてきたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正が行われて得ることが、容易に明らかである。

したがって、上述は単に本発明の原理を説明したものである。当業者であれば、本明細書には明示的に記載も示されてもいないが、本発明の原理を具現化し、本発明の趣旨及び範囲内に含まれる様々な変更を考案し得ることが、理解されよう。更に、本明細書に列挙される全ての例及び条件付き用語は、主に、読者が、本発明の原理、及び当該技術分野を更に進めるために発明者らによって提供された概念を理解するのを助けることを意図しており、そのような具体的に列挙される例及び条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態を列挙する、本明細書の全ての記述、並びにその具体例は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することが意図される。更に、そのような等価物は、構造に関係なく、現在知られている等価物と、将来開発される等価物との両方、すなわち、同じ機能を実行するように開発されたあらゆる要素を含むことが意図される。更に、本明細書に開示されるいかなるものも、そのような開示が特許請求の範囲において明示的に列挙されているかどうかにかかわらず、公に献呈するように意図されていない。

したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載される例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。特許請求の範囲においては、米国特許法第１１２条（ｆ）又は米国特許法第１１２条（６）は、「のための手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」又は「のためのステップ（ｓｔｅｐ ｆｏｒ）」と完全に一致する語句が、特許請求項における限定の始まりで列挙されるときにのみ、特許請求項におけるそのような限定を喚起しているとして明確に定義されており、そのような完全に一致する語句が、特許請求項における限定に使用されていない場合、米国特許法第１１２条（ｆ）も米国特許法第１１２条（６）も適用されない。

Claims (29)

1. ヒトの脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節することを含む、ヒトにおける共感を調節する方法。
2. 共感を調節することが、前記ヒトにおける共感を増加させることを含み、前記ヒトが、準最適な（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）共感を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒトにおける前記準最適な共感が、精神医学的又は神経学的状態によって引き起こされる、請求項２に記載の方法。
4. タイプ２シータ振動を調節することが、同調を伴う又は伴わない光遺伝学的処置を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記光遺伝学的処置が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを刺激することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、海馬采脳弓に位置する、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、中隔海馬に位置する、請求項５に記載の方法。
8. タイプ２シータ振動を調節することが、前記脳領域におけるニューロンを遺伝子組換えしてタイプ２シータ振動を直接調節することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記脳領域におけるニューロンを遺伝子組換えすることが、Ｃａ_ｖ３．２、Ｃａ_ｖ３．１、ＣＡＶ３、ＰＬＣ－β１、及びＰＬＣ－β４をコードする１つ以上の遺伝子の発現を修正することを含む、請求項８に記載の方法。
10. タイプ２シータ振動を調節することが、１つ以上の電極を使用する前記脳領域の電気刺激を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記調節することが、前記ヒトに薬剤を投与することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記薬剤が、抗コリンエステラーゼ剤である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記抗コリンエステラーゼ剤が、アトロピン又はフィゾスチグミンである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記薬剤が、ＰＬＣの活性化剤である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記ＰＬＣの活性化剤が、ＰＬＣ－β１及び／又はＰＬＣ－β４の活性化剤である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＰＬＣの活性化剤が、ｍ３Ｍ３ＦＢＳ（２，４，６－トリメチル－Ｎ－（メタ－３－トリフルオロメチル－フェニル）－ベンゼンスルホンアミド）又はタプシガルギンである、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記脳領域が、海馬、中隔海馬、前帯状皮質（ＡＣＣ）、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）、視床正中、絶縁領域、内側中隔（ＭＳ）、又は海馬采脳弓である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記タイプ２シータ振動が、海馬、ＡＣＣ、又はＢＬＡにおいて同期される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記精神医学的又は神経学的状態が、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、認知症、依存症、うつ病、不安、双極性障害、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、失感情症、強迫性障害（ＯＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、精神病質、パーキンソン病、又はてんかんである、請求項３に記載の方法。
20. 前記精神医学的又は神経学的状態が、自閉症スペクトラム障害、認知症、及び依存症からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記調節することが、タイプ２シータ振動を増加させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記調節することが、タイプ２シータ振動を減少させる、請求項１に記載の方法。
23. 前記タイプ２シータ振動を調節することが、タイプ１シータ振動の調節を誘導しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
24. ヒトの脳領域におけるタイプ２シータ振動を調節するように構成されたデバイスを備える、ヒトにおける共感を調節するためのシステム。
25. 前記デバイスが、準最適な共感を有するヒトにおける共感を増加させるように構成されている、請求項２４に記載のシステム。
26. 前記デバイスが、前記脳領域に光を送達するように構成及び配置された光送信機に作動可能に結合された光源を含む光遺伝学的デバイスである、請求項２４又は２５に記載のシステム。
27. 前記デバイスが、前記脳領域に電気刺激を送達するように構成及び配置された少なくとも１つの電極に作動可能に結合された電流発生器を含む電気刺激デバイスである、請求項２４又は２５に記載のシステム。
28. ２つの電極を備える、請求項２７に記載のシステム。
29. 前記脳領域が、海馬、中隔海馬、ＡＣＣ、ＢＬＡ、視床正中、絶縁領域、内側中隔、海馬采脳弓、扁桃体、又はそれらの組み合わせである、請求項２４又は２５に記載のシステム。

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