JP2023133647A - Production method of novel anti-hbs immunoglobulin - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換え抗HBsヒト免疫グロブリン製剤を提供することに関する。 The present invention relates to providing recombinant anti-HBs human immunoglobulin preparations.
B型肝炎ウイルス（Hepatitis B Virus；HBV）持続感染者は世界で約3億人存在すると推定され、年間約90万人がHBV関連疾患で死亡しており、国内におけるHBVの感染率は約1％と見積もられている。出産時ないし乳幼児期においてHBVに感染すると、9割以上の症例は持続感染に移行し、そのうち約9割は若年期に非活動性キャリアとなり、ほとんどの症例で病態は安定化する。しかし、残りの約1割ではウイルスの活動性が持続して慢性肝炎の状態が続き、年率約2％で肝硬変へ移行し、肝細胞癌、肝不全に進展する。 It is estimated that there are approximately 300 million people persistently infected with hepatitis B virus (HBV) worldwide, and approximately 900,000 people die annually from HBV-related diseases, and the HBV infection rate in Japan is approximately 1. It is estimated that %. When infected with HBV at birth or during infancy, more than 90% of cases progress to persistent infection, approximately 90% of whom become inactive carriers at a young age, and the disease condition stabilizes in most cases. However, in the remaining approximately 10%, the virus remains active and the state of chronic hepatitis continues, and at an annual rate of approximately 2%, the disease progresses to cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and liver failure.
近年、母子垂直感染や輸血によるHBV感染は激減したが、性行為感染症としての水平感染は若年層を中心に頻発している。一方、移植後等免疫不全状態の患者におけるHBV再活性化は高度医療が生み出した新たな肝炎発症リスクである。 In recent years, vertical mother-to-child transmission and HBV infection through blood transfusion have decreased dramatically, but horizontal transmission as a sexually transmitted disease continues to occur frequently, especially among young people. On the other hand, HBV reactivation in immunocompromised patients after transplantation is a new risk of developing hepatitis created by advanced medical care.
現在、日本においては、HBV母子感染予防、針刺し等医療事故後のHBV感染防止、さらに肝移植後のB型肝炎再発抑制および発症抑制のため、抗HBsヒト免疫グロブリン製剤（HBIG）が一般的に使用されている。HBIGは、HBVの中和エピトープであるHBs抗原に対する抗体（抗HBs抗体）の力価が極めて高い献血者の血漿から精製された免疫グロブリン製剤である。 Currently, anti-HBs human immunoglobulin (HBIG) is commonly used in Japan to prevent mother-to-child transmission of HBV, to prevent HBV infection after medical accidents such as needle sticks, and to suppress the recurrence and onset of hepatitis B after liver transplantation. It is used. HBIG is an immunoglobulin preparation purified from blood donor plasma that has extremely high titers of antibodies against HBs antigen, a neutralizing epitope of HBV (anti-HBs antibodies).
HBIGを含むヒト血液に由来する血液製剤は、血漿分画製剤を含め、その原料を国内で自給することが「安全な血液製剤の安定供給の確保等に関する法律」により定められているが、日本国内での販売開始以来、HBIG原料血液自給率は2～3％と非常に低率を推移しており、原料完全自給には程遠い状態が続いている。 The "Act on Securing a Stable Supply of Safe Blood Products" stipulates that raw materials for blood products derived from human blood, including HBIG, including plasma fractionated products, be self-sufficient in Japan. Since the start of sales in Japan, the self-sufficiency rate of HBIG raw material blood has remained extremely low at 2-3%, and the situation continues to be far from achieving complete self-sufficiency in raw materials.
これに対して、2013年度（平成25年度）からこの問題を解決するために、HBVワクチンによりすでに抗HBs抗体を獲得しているヒト個体に対してワクチンを追加接種し、抗HBs抗体価を高めた上で献血による原料血漿を確保する事業が行われており、日本赤十字社が本事業を受託してこれまで実施している［Sugauchi F, et al., Hepatol Res. 2006; 36: 107-14］。 In order to solve this problem, starting in 2013, human individuals who have already acquired anti-HBs antibodies through the HBV vaccine will be additionally vaccinated to increase the anti-HBs antibody titer. A project is being carried out to secure raw plasma from donated blood, and the Japanese Red Cross Society has been commissioned to carry out this project [Sugauchi F, et al., Hepatol Res. 2006; 36: 107- 14].
しかし、このワクチン追加接種に基づく上記事業を実施しても、確保できる原料血漿量は部分的にすぎず、完全自給には遠く及んでいない。 However, even if we carry out the above-mentioned project based on this additional vaccination, the amount of raw plasma that can be secured is only a partial amount, and we are far from achieving complete self-sufficiency.
本発明は、抗HBsヒト免疫グロブリン製剤の原料血液の国内自給未達成問題の根本的解決を図り、安全で有効な抗体製剤を提供することを課題とする。 The object of the present invention is to fundamentally solve the problem of domestic self-sufficiency in raw blood for anti-HBs human immunoglobulin preparations, and to provide safe and effective antibody preparations.
本発明は、HBVワクチンの接種により抗HBs抗体を獲得し抗体力価が上昇しているヒト個体の体内末梢血循環B細胞から、HBVに対して中和活性を有し得る抗HBs抗原特異的モノクローナル抗体をスクリーニングし、当該抗体の遺伝子を単離し、組換え抗HBsヒト免疫グロブリン製剤を提供することで上記課題を解決することとした。 The present invention provides anti-HBs antigen-specific monoclonal antibodies that can have neutralizing activity against HBV from B cells circulating in the peripheral blood of human individuals who have acquired anti-HBs antibodies through HBV vaccination and whose antibody titer has increased. We decided to solve the above problem by screening antibodies, isolating the gene for the antibody, and providing a recombinant anti-HBs human immunoglobulin preparation.
より具体的には、本件出願は、前述した課題を解決するため、以下の態様を提供する：
［1］：（1）重鎖の相補性決定領域、CDR1（GFMFSGHS、SEQ ID No: 1）、CDR2（IGSTGEFI、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（AREQGTRGRYYYYGLDV、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（SQSVSTY、SEQ ID No: 4）、CDR2（DAF、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（QQRGHWPLT、SEQ ID No: 6）；
（2）重鎖の相補性決定領域、CDR1（SGGSISGHY、SEQ ID No: 7）、CDR2（IHYSGIT、SEQ ID No: 8）、およびCDR3（ARGDATYGY、SEQ ID No: 9）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（SQSLLHRNGYNY、SEQ ID No: 10）、CDR2（LGS、SEQ ID No: 11）、およびCDR3（MQALRTPWT、SEQ ID No: 12）；
（3）重鎖の相補性決定領域、CDR1（SGFSFSNYG、SEQ ID No: 13）、CDR2（IWRDGSHQ、SEQ ID No: 14）、およびCDR3（AREDPAIVLPVLDH、SEQ ID No: 15）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（QRINSY、SEQ ID No: 16）、CDR2（GAS、SEQ ID No: 17）、およびCDR3（QQGYSTPLLS、SEQ ID No: 18）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、HBVのHBs抗原に対して結合性を有し、HBVに対する中和活性を有する、血液原料に由来しない、抗体または抗体誘導体；
［2］：組換え型である、［1］に記載の抗体または抗体誘導体；
［3］：HBs抗原が、HBs抗原のL抗原、M抗原、S抗原、HBs抗原のadr型、adw型、ayr型、ayw型からなる群から選択される1または複数である、［1］または［2］に記載の抗体または抗体誘導体；
［4］：抗体誘導体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、多価抗体、および多重特異性抗体から選択される抗体改変体またはその機能的断片から選択される、［1］～［3］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［5］：抗体または抗体誘導体の重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列が、（1）SEQ ID No: 19、（2）SEQ ID No: 21および（3）SEQ ID No: 23から選択される、［1］～［4］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［6］：抗体または抗体誘導体の軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列が、（1）SEQ ID No: 20、（2）SEQ ID No: 22および（3）SEQ ID No: 24から選択される、［1］～［5］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［7］：抗体または抗体誘導体が、
（1）重鎖（SEQ ID No: 25）および軽鎖（SEQ ID No: 26）を含む抗体または抗体誘導体；
（2）重鎖（SEQ ID No: 27）および軽鎖（SEQ ID No: 28）を含む抗体または抗体誘導体；
（3）重鎖（SEQ ID No: 29）および軽鎖（SEQ ID No: 30）を含む抗体または抗体誘導体；
からなる群から選択される、［1］～［6］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体；
［8］：［1］～［7］のいずれか1項に記載される抗体または抗体誘導体を含み、血液由来成分を含まない、HBVを中和するための医薬組成物；
［9］：［1］～［7］のいずれか1項に記載される抗体または抗体誘導体を複数種類含む、［8］に記載の医薬組成物；
［10］：B型肝炎の再活性化を予防し、またはHBVの医療感染を阻止するための、［8］または［9］に記載の医薬組成物；
［11］：被験体から採取された生体由来試料を、in vitroにおいて［1］～［7］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体と接触させる工程、
前記抗体または抗体誘導体と結合した試料中のHBVを検出・測定する工程、
を含む、生体由来試料中のHBVの存在・存在量を検出・測定する方法；
［12］：［1］～［7］のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体を含む、被験体体内におけるHBVの存在・存在量を検出・測定するためのキット。
More specifically, the present application provides the following aspects in order to solve the aforementioned problems:
[1]: (1) Heavy chain complementarity determining regions, CDR1 (GFMFSGHS, SEQ ID No: 1), CDR2 (IGSTGEFI, SEQ ID No: 2), and CDR3 (AREQGTRGRYYYYGLDV, SEQ ID No: 3), and light chain complementarity determining regions, CDR1 (SQSVSTY, SEQ ID No: 4), CDR2 (DAF, SEQ ID No: 5), and CDR3 (QQRGHWPLT, SEQ ID No: 6);
(2) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (SGGSISGHY, SEQ ID No: 7), CDR2 (IHYSGIT, SEQ ID No: 8), and CDR3 (ARGDATYGY, SEQ ID No: 9), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (SQSLLHRNGYNY, SEQ ID No: 10), CDR2 (LGS, SEQ ID No: 11), and CDR3 (MQALRTPWT, SEQ ID No: 12);
(3) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (SGFSFSNYG, SEQ ID No: 13), CDR2 (IWRDGSHQ, SEQ ID No: 14), and CDR3 (AREDPAIVLPVLDH, SEQ ID No: 15), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (QRINSY, SEQ ID No: 16), CDR2 (GAS, SEQ ID No: 17), and CDR3 (QQGYSTPLLS, SEQ ID No: 18);
Contains any heavy chain/light chain complementarity determining region selected from the group consisting of, has binding ability to the HBs antigen of HBV, has neutralizing activity against HBV, is not derived from a blood source, antibodies or antibody derivatives;
[2]: The antibody or antibody derivative according to [1], which is a recombinant type;
[3]: HBs antigen is one or more selected from the group consisting of L antigen, M antigen, S antigen of HBs antigen, adr type, adw type, ayr type, and ayw type of HBs antigen, [1] or the antibody or antibody derivative according to [2];
[4]: Any of [1] to [3], wherein the antibody derivative is selected from antibody variants or functional fragments thereof selected from humanized antibodies, chimeric antibodies, multivalent antibodies, and multispecific antibodies. or the antibody or antibody derivative according to item 1;
[5]: The amino acid sequence of the heavy chain variable region VH domain of the antibody or antibody derivative is selected from (1) SEQ ID No: 19, (2) SEQ ID No: 21, and (3) SEQ ID No: 23. , the antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [4];
[6]: The amino acid sequence of the light chain variable region VL domain of the antibody or antibody derivative is selected from (1) SEQ ID No: 20, (2) SEQ ID No: 22, and (3) SEQ ID No: 24. , the antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [5];
[7]: The antibody or antibody derivative is
(1) An antibody or antibody derivative comprising a heavy chain (SEQ ID No: 25) and a light chain (SEQ ID No: 26);
(2) an antibody or antibody derivative comprising a heavy chain (SEQ ID No: 27) and a light chain (SEQ ID No: 28);
(3) an antibody or antibody derivative comprising a heavy chain (SEQ ID No: 29) and a light chain (SEQ ID No: 30);
The antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [6], selected from the group consisting of;
[8]: A pharmaceutical composition for neutralizing HBV, which contains the antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [7] and does not contain blood-derived components;
[9]: The pharmaceutical composition according to [8], comprising multiple types of antibodies or antibody derivatives according to any one of [1] to [7];
[10]: The pharmaceutical composition according to [8] or [9] for preventing reactivation of hepatitis B or inhibiting medical infection of HBV;
[11]: Contacting a biological sample collected from a subject with the antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [7] in vitro,
Detecting and measuring HBV in the sample bound to the antibody or antibody derivative;
A method for detecting and measuring the presence and abundance of HBV in a biological sample, including;
[12]: A kit for detecting and measuring the presence and abundance of HBV in a subject, comprising the antibody or antibody derivative according to any one of [1] to [7].
本発明により、血液原料由来の抗HBsヒト免疫グロブリン製剤にまつわる国内自給未達成問題や血液製剤の問題点などを根本的に解決することができる、安全で有効なそして安定した活性が期待される抗体製剤を提供することができる。 The present invention provides an antibody that is expected to be safe, effective, and have stable activity, which can fundamentally solve the problems of domestic self-sufficiency and blood products related to anti-HBs human immunoglobulin preparations derived from blood raw materials. A formulation can be provided.
本発明において使用する用語を以下の通り定義する：
（a）HBs抗原：HBVの外殻を構成するタンパク質の1つであり、HBV感染の有無を判定する際に検査される抗原。過去にHBVに感染したがウイルスが排除されている場合や、HBVワクチンの接種を受けて抗体陽性（＋）になった場合などに、生体内でこのHBs抗原に対する抗体が見いだされる；
（b）HBIG：抗HBsヒト免疫グロブリン（human anti-HBs Immunoglobulin）のこと。市販されているHBIGは、抗HBs抗体力価の高いヒト血漿を原料にIgGを精製した製剤で、即効性はあるが、効果持続は、約3月間と比較的短いのが特徴。
The terms used in the present invention are defined as follows:
(a) HBs antigen: One of the proteins that make up the outer shell of HBV, and an antigen that is tested to determine the presence or absence of HBV infection. Antibodies to this HBs antigen are found in vivo in cases where the virus has been eliminated from HBV infection in the past, or when the person becomes antibody positive (+) after receiving HBV vaccination;
(b) HBIG: Human anti-HBs Immunoglobulin. Commercially available HBIG is a preparation of purified IgG made from human plasma with high anti-HBs antibody titers, and although it has immediate effects, it is characterized by a relatively short duration of effect, about 3 months.
本発明は、特定のアミノ酸配列を有する重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、HBVのHBs抗原に対して結合性を有し、HBVに対する中和活性を有する、血液原料に由来しない、抗体または抗体誘導体を提供することにより、本発明の課題を解決することができることを示した。この抗体または抗体誘導体は、HBVのHBs抗原に対して結合性を有し、HBVに対する中和活性を有し、血液原料に由来しないものであれば、どのような抗体または抗体誘導体であっても本発明の範囲に含まれる。 The present invention provides a protein that is not derived from a blood source, that contains the complementarity determining regions of heavy and light chains that have a specific amino acid sequence, that has binding properties to the HBs antigen of HBV, that has neutralizing activity against HBV, and that has a specific amino acid sequence. It has been shown that the problems of the present invention can be solved by providing antibodies or antibody derivatives. This antibody or antibody derivative may be any antibody or antibody derivative as long as it has binding properties to the HBs antigen of HBV, has neutralizing activity against HBV, and is not derived from blood sources. Within the scope of the present invention.
＜抗体または抗体誘導体＞
本発明において使用する抗体または抗体誘導体は、従来肝炎ウイルスの治療のために使用されてきた血液由来抗体製剤などの血液製剤に特有の種々の問題（特に、感染性の問題、免疫性の問題）を解決することを目的とするため、血液中に含まれる可能性がある（血液製剤に混入する危険性がある）HBV、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）などのウイルスなどの病原体を含まず、また血液中に含まれる抗原性タンパク質やヒトタンパク質と結合する抗体など、投与された個体に免疫異常を生じさせる危険性のある血液由来成分を含まないことを特徴とする。
<Antibody or antibody derivative>
The antibodies or antibody derivatives used in the present invention have various problems unique to blood products such as blood-derived antibody products conventionally used for the treatment of hepatitis viruses (in particular, infectious problems and immunological problems). Viruses such as HBV, hepatitis C virus (HCV), and human immunodeficiency virus (HIV) that may be present in the blood (there is a risk of contamination with blood products) It is characterized in that it does not contain pathogens such as, and does not contain blood-derived components that pose a risk of causing immune abnormalities in the administered individual, such as antibodies that bind to antigenic proteins and human proteins contained in the blood. .
血液由来成分を含まない抗体または抗体誘導体として、抗体産生細胞に由来する不死化細胞を、血液由来成分を含まない条件下で取得し、その細胞から血液由来成分を含まない培養条件下で調製される抗体や、上記不死化細胞から取得した抗体タンパク質を規定するDNAを使用して組換え的に抗体タンパク質を発現させて調製することができる組換え抗体などを使用することができる。 As antibodies or antibody derivatives that do not contain blood-derived components, immortalized cells derived from antibody-producing cells are obtained under conditions that do not contain blood-derived components, and then prepared from the cells under culture conditions that do not contain blood-derived components. Recombinant antibodies that can be prepared by recombinantly expressing the antibody protein using the DNA that defines the antibody protein obtained from the immortalized cells can be used.
すなわち、一態様において、本発明における抗体は、過去にHBVワクチンを投与された個体の血液から、HBV由来のHBs抗原に対する抗体を産生する細胞クローンを取得・不死化することにより抗体産生細胞に由来する不死化細胞を得て、その不死化抗体産生細胞からin vivoにおいてHBVを中和する作用を有するものを選択することにより得ることができる。 That is, in one embodiment, the antibody of the present invention is derived from antibody-producing cells by obtaining and immortalizing a cell clone that produces antibodies against HBV-derived HBs antigen from the blood of an individual who has previously been administered an HBV vaccine. It can be obtained by obtaining immortalized cells that have the ability to neutralize HBV in vivo and selecting from among the immortalized antibody-producing cells those that have the effect of neutralizing HBV in vivo.
また別の一態様において、上述した特徴を実現するため、遺伝子組換え技術を用いて、HBVに対して中和活性を有する組換え型抗HBs抗体または抗体誘導体を提供することもできる。より具体的には、本発明は、上述した方法により選択されたHBVを中和する作用を有する不死化抗体産生細胞から、周知の方法に従って、mRNAの取得、cDNAの作成を経て、抗体タンパク質を規定するDNA配列を取得し、ベクターを使用して、血液由来成分を含まない哺乳動物発現系において発現させることにより、組換え型イムノグロビン（IgG）として産生させて得られた中和活性のあるモノクローナル抗体あるいはその抗体誘導体を、組換え型HBIGとして提供することもできる。 In another embodiment, in order to achieve the above characteristics, recombinant anti-HBs antibodies or antibody derivatives having neutralizing activity against HBV can be provided using genetic recombination technology. More specifically, the present invention involves obtaining mRNA and creating cDNA according to well-known methods from immortalized antibody-producing cells having the effect of neutralizing HBV selected by the method described above, and then producing antibody proteins. A recombinant immunoglobin (IgG) with neutralizing activity obtained by obtaining a defined DNA sequence and expressing it using a vector in a mammalian expression system free of blood-derived components. Monoclonal antibodies or antibody derivatives thereof can also be provided as recombinant HBIG.
本発明においては、これらの抗体の誘導体を使用することもできる。本発明において使用することができる抗体誘導体としては、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、多価抗体、および多重特異性抗体から選択される抗体改変体またはその機能的断片を使用することができるが、これらには限定されない。このうち、機能的断片としては、例えば、F（ab'）2を使用することができるが、これらには限定されない。 Derivatives of these antibodies can also be used in the present invention. As antibody derivatives that can be used in the present invention, for example, antibody variants or functional fragments thereof selected from humanized antibodies, chimeric antibodies, multivalent antibodies, and multispecific antibodies can be used. , but not limited to. Among these, F(ab')2 can be used as a functional fragment, but is not limited thereto.
これらの抗体の誘導体は、抗体が得られたのち、当該技術分野において周知の方法に従って作製することができ、上述した本発明の抗体について記載した組換え型の抗体誘導体として調製することができる。 Derivatives of these antibodies can be produced according to methods well known in the art after the antibodies have been obtained, and can be prepared as recombinant antibody derivatives as described above for the antibodies of the present invention.
上述した方法により取得した抗体または抗体誘導体は、HBV由来のHBs抗原に対して結合性を有するものであるが、本発明においては、HBV由来のHBs抗原に対して結合性を有するこのような抗体または抗体誘導体の中から、さらにHBVを中和する作用を有することに基づいてスクリーニングを行い、当該中和作用を有する抗体または抗体誘導体を提供することを特徴とする。 The antibody or antibody derivative obtained by the method described above has binding property to HBV-derived HBs antigen. Alternatively, the antibody derivatives are further screened based on their ability to neutralize HBV to provide antibodies or antibody derivatives having the neutralizing effect.
後述する実施例においても実際に取得した抗体を複数種類示しているが、これらに限定されるわけではない。 Although multiple types of antibodies actually obtained are shown in the Examples described later, the present invention is not limited to these.
＜抗体または抗体誘導体の標的＞
HBVは、直径42 nmの球状ウイルスで、外被（エンベロープ）とコアの二重構造を形成する。HBVを構成するタンパク質としては、HBs抗原、HBc抗原、HBe抗原、Xタンパク質（HBx抗原）などが知られている。HBc抗原はウイルスの内側のコアのタンパク質であるためその抗体は感染の状態を確認するためには有用であるが、HBVの感染防御に利用できないことが知られており、HBe抗原はHBVが肝臓で増殖する際に過剰につくられるタンパク質でありHBe抗原に対する抗体（抗HBe抗体）は、HBVの感染を防御する働きはないことが知られており、そしてXタンパク質はエンハンサーやプロモーター領域と結合し各種タンパク質の発現調節をする機能を有するトランス活性化タンパク質であり、HBVの感染を防御する働きはないことが知られている。
<Target of antibody or antibody derivative>
HBV is a spherical virus with a diameter of 42 nm, forming a dual structure consisting of an envelope and a core. Known proteins that constitute HBV include HBs antigen, HBc antigen, HBe antigen, and X protein (HBx antigen). Since HBc antigen is a protein in the inner core of the virus, its antibodies are useful for confirming the state of infection, but it is known that they cannot be used to protect against HBV infection. It is known that antibodies against the HBe antigen (anti-HBe antibodies), which are produced in excess during cell proliferation, have no protective function against HBV infection, and the X protein binds to enhancer and promoter regions. It is a transactivation protein that has the function of regulating the expression of various proteins, but is known to have no protective function against HBV infection.
これに対してHBs抗原は、HBVの外殻（エンベロープ）を構成するタンパク質であり、抗HBs抗体が存在することにより、HBVの感染を防御することができることが知られている。現在の日本においては、HBV母子感染予防、針刺し等医療事故後のHBV感染防止、さらに肝移植後のB型肝炎再発抑制および発症抑制が必要とされる場合に、HBVの感染を防御するため、HBIGが一般的に使用されている。したがって、本発明において、抗体または抗体誘導体は、HBs抗原に対して結合性を有していることが必要である。 On the other hand, HBs antigen is a protein that constitutes the outer shell (envelope) of HBV, and it is known that the presence of anti-HBs antibodies can protect against HBV infection. Currently in Japan, in order to prevent HBV infection, when it is necessary to prevent mother-to-child transmission of HBV, prevent HBV infection after medical accidents such as needle sticks, and suppress the recurrence and onset of hepatitis B after liver transplantation. HBIG is commonly used. Therefore, in the present invention, the antibody or antibody derivative needs to have binding ability to HBs antigen.
本発明の抗体または抗体誘導体の標的としてのHBs抗原には、Sドメイン、Pre-S1ドメイン、Pre-S2ドメインの3つのドメインが存在し、これらの組み合わせから
・S抗原（Sドメインのみで構成）、
・M抗原（SドメインとPre-S2ドメインで構成）および
・L抗原（Sドメイン、Pre-S2ドメイン、およびPre-S1ドメインの3つのドメインで構成）
の3種類が存在する。本発明の抗体または抗体誘導体は、HBs抗原に対して結合性を有していれば、HBs抗原のS抗原に対するものであっても、M抗原に対するものであっても、L抗原に対するものであってもよい。
HBs antigen, which is the target of the antibody or antibody derivative of the present invention, has three domains: S domain, Pre-S1 domain, and Pre-S2 domain, and from the combination of these domains, S antigen (consisting only of S domain) ,
・M antigen (composed of S domain and Pre-S2 domain) and ・L antigen (consisted of three domains: S domain, Pre-S2 domain, and Pre-S1 domain)
There are three types: As long as the antibody or antibody derivative of the present invention has binding property to HBs antigen, it may be directed against S antigen, M antigen, or L antigen of HBs antigen. It's okay.
また、このHBs抗原には、抗原決定基a、抗原決定基dまたはy、そして抗原決定基rまたはwという3種類の抗原決定基があることが知られており、抗原決定基aは全てのサブタイプに共通し、その組み合わせによりadr型、adw型、ayr型、ayw型の4つのサブタイプに分類することができる。わが国ではadr型が70～90％、adw型が10～30％を占め、ayr型、ayw型はまれである。このHBsのサブタイプの評価は、HBVの感染経路の解明や重複感染の解析などに利用されている。本発明の抗体または抗体誘導体は、HBs抗原に対して結合性を有していれば、これらadr型、adw型、ayr型、ayw型の4つのサブタイプのいずれを標的とするものであってもよく、このうちの複数を標的とするものであってもよい。 It is also known that this HBs antigen has three types of antigenic determinants: antigenic determinant a, antigenic determinant d or y, and antigenic determinant r or w. It is common to all subtypes, and can be classified into four subtypes: ADR type, ADW type, AYR type, and AYW type, depending on the combination of subtypes. In Japan, the ADR type accounts for 70-90%, the ADW type accounts for 10-30%, and the AYR and AYW types are rare. This evaluation of HBs subtypes is used to elucidate the HBV infection route and analyze co-infection. The antibody or antibody derivative of the present invention may target any of these four subtypes: adr type, adw type, ayr type, and ayw type, as long as it has binding property to HBs antigen. It is also possible to target more than one of these.
＜HBVの中和作用＞
本発明の抗体または抗体誘導体は、上述したHBV由来のHBs抗原（例えば、S抗原、M抗原、L抗原のいずれであっても、adr、adw、ayr、aywの4つのサブタイプのいずれであってもよい）に結合するものであって、結果としてHBVを中和する作用を有するものであれば、本発明の目的の達成のために使用することができる。
<HBV neutralization effect>
The antibody or antibody derivative of the present invention may be any of the above-mentioned HBV-derived HBs antigens (for example, S antigen, M antigen, L antigen, or any of the four subtypes of adr, adw, ayr, and ayw). It can be used to achieve the object of the present invention as long as it binds to HBV and has the effect of neutralizing HBV as a result.
前述したように、従来より、HBVにり患した場合の治療には、HBIG製剤が使用されている。本発明の抗体または抗体誘導体は、血液が原料のHBIGと比較して、力価や品質の安定性に優れているという特徴を有している。また、本発明の抗体または抗体誘導体は、従来型のHBIGに代わるHBV治療薬として使用することを目的としていることから、HBVの中和活性と同様の、好ましくは同程度の、より好ましくはそれ以上のHBVの中和活性を有することができる。一方、本発明の抗体または抗体誘導体は、複数のものをカクテルにして使用することもできることを特徴としていることから、単一の抗体または抗体誘導体では中和活性が低い場合であっても、複数の抗体または抗体誘導体を組み合わせて治療薬として使用することができる。 As mentioned above, HBIG preparations have traditionally been used to treat patients suffering from HBV. The antibody or antibody derivative of the present invention is characterized by superior stability in titer and quality compared to HBIG, which is made from blood. Furthermore, since the antibody or antibody derivative of the present invention is intended to be used as an HBV therapeutic agent in place of conventional HBIG, the antibody or antibody derivative of the present invention has a similar, preferably comparable, and more preferably higher HBV neutralizing activity. or more HBV neutralizing activity. On the other hand, the antibody or antibody derivative of the present invention is characterized in that it can be used as a cocktail of multiple antibodies, so even if a single antibody or antibody derivative has low neutralizing activity, multiple antibodies or antibody derivatives can Antibodies or antibody derivatives can be used in combination as therapeutic agents.
HBVの中和活性は、ヒト肝臓由来の培養細胞あるいはヒト肝臓初代細胞に対してHBVを感染させ、その細胞に対して培養条件下で抗体を添加することにより、
・HBVのウイルス量の抑制、
・細胞内でのHBV由来タンパク質（例えば、HBs抗原、HBc抗原、HBe抗原、Xタンパク質（HBx抗原）など）の発現抑制、
・細胞内でのHBV由来DNA量（例えば、細胞内でHBVカプシドに覆われたウイルスDNA（capsid-associated relaxed circular DNA［rcDNA］）量）の合成抑制
などがみられるかどうかにより、半定量的に特定することができる。
HBV neutralizing activity can be determined by infecting cultured cells derived from human liver or primary human liver cells with HBV, and adding antibodies to the cells under culture conditions.
・Suppression of HBV viral load,
・Suppression of the expression of HBV-derived proteins (e.g., HBs antigen, HBc antigen, HBe antigen, X protein (HBx antigen), etc.) in cells,
・Semi-quantitative results depending on whether there is suppression of synthesis of HBV-derived DNA within cells (e.g., amount of viral DNA (capsid-associated relaxed circular DNA [rcDNA]) covered by HBV capsids within cells) can be specified.
＜本発明の抗体の例＞
本発明においては、過去に公知のHBVワクチンの接種を受けた個体から、HBV由来のHBs抗原に対して結合する抗体を産生する細胞を上述の＜抗体または抗体誘導体＞の通り採取し、得られた抗体または抗体誘導体に関して上述の＜HBVの中和作用＞の通りHBVに対する中和活性を調べた。その結果、複数の個体から、複数の抗体およびその抗体を産生する細胞が得られた。
<Examples of antibodies of the present invention>
In the present invention, cells that produce antibodies that bind to HBV-derived HBs antigen are collected from individuals who have been vaccinated with a known HBV vaccine as described above in <Antibody or antibody derivative>. The antibody or antibody derivative was examined for neutralizing activity against HBV as described above in <HBV neutralizing effect>. As a result, multiple antibodies and cells producing the antibodies were obtained from multiple individuals.
そのような中で、実施例において検討を行った具体的なものとして、以下の特定のアミノ酸配列を有する重鎖・軽鎖の相補性決定領域：
（1） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（GFMFSGHS、SEQ ID No: 1）、CDR2（IGSTGEFI、SEQ ID No: 2）、およびCDR3（AREQGTRGRYYYYGLDV、SEQ ID No: 3）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（SQSVSTY、SEQ ID No: 4）、CDR2（DAF、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（QQRGHWPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SGGSISGHY、SEQ ID No: 7）、CDR2（IHYSGIT、SEQ ID No: 8）、およびCDR3（ARGDATYGY、SEQ ID No: 9）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（SQSLLHRNGYNY、SEQ ID No: 10）、CDR2（LGS、SEQ ID No: 11）、およびCDR3（MQALRTPWT、SEQ ID No: 12）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SGFSFSNYG、SEQ ID No: 13）、CDR2（IWRDGSHQ、SEQ ID No: 14）、およびCDR3（AREDPAIVLPVLDH、SEQ ID No: 15）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（QRINSY、SEQ ID No: 16）、CDR2（GAS、SEQ ID No: 17）、およびCDR3（QQGYSTPLLS、SEQ ID No: 18）；
を含む組換え抗体またはこれらの抗体誘導体を提供することを例として挙げることができるが、これらのものに限定されない。
In this context, the specific examples examined in the Examples include the complementarity determining regions of heavy and light chains having the following specific amino acid sequences:
(1) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (GFMFSGHS, SEQ ID No: 1), CDR2 (IGSTGEFI, SEQ ID No: 2), and CDR3 (AREQGTRGRYYYYGLDV, SEQ ID No: 3), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (SQSVSTY, SEQ ID No: 4), CDR2 (DAF, SEQ ID No: 5), and CDR3 (QQRGHWPLT, SEQ ID No: 6);
(2) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (SGGSISGHY, SEQ ID No: 7), CDR2 (IHYSGIT, SEQ ID No: 8), and CDR3 (ARGDATYGY, SEQ ID No: 9), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (SQSLLHRNGYNY, SEQ ID No: 10), CDR2 (LGS, SEQ ID No: 11), and CDR3 (MQALRTPWT, SEQ ID No: 12);
(3) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (SGFSFSNYG, SEQ ID No: 13), CDR2 (IWRDGSHQ, SEQ ID No: 14), and CDR3 (AREDPAIVLPVLDH, SEQ ID No: 15), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (QRINSY, SEQ ID No: 16), CDR2 (GAS, SEQ ID No: 17), and CDR3 (QQGYSTPLLS, SEQ ID No: 18);
Examples include, but are not limited to, providing recombinant antibodies or antibody derivatives thereof comprising:
本発明は一態様において、このような抗体または抗体誘導体として：
（1）SEQ ID No: 19、（2）SEQ ID No: 21および（3）SEQ ID No: 23から選択される重鎖可変領域VHドメインのアミノ酸配列；および
（1）SEQ ID No: 20、（2）SEQ ID No: 22および（3）SEQ ID No: 24から選択される軽鎖可変領域VLドメインのアミノ酸配列；
を含む抗体または抗体誘導体をより具体的な例として挙げることができる。
In one aspect, the invention provides such an antibody or antibody derivative as:
an amino acid sequence of a heavy chain variable region VH domain selected from (1) SEQ ID No: 19, (2) SEQ ID No: 21 and (3) SEQ ID No: 23; and (1) SEQ ID No: 20. (2) an amino acid sequence of a light chain variable region VL domain selected from SEQ ID No: 22 and (3) SEQ ID No: 24;
More specific examples include antibodies or antibody derivatives containing the following.
本発明はさらに詳細な一態様として、以下の実施例において、
（1）M2-11クローン：重鎖可変領域（SEQ ID No: 19）および軽鎖可変領域（SEQ ID No: 20）を含む抗体または抗体誘導体；
（2）5A4クローン：重鎖可変領域（SEQ ID No: 21）および軽鎖可変領域（SEQ ID No: 22）を含む抗体または抗体誘導体；または
（3）3B6クローン：重鎖可変領域（SEQ ID No: 23）および軽鎖可変領域（SEQ ID No: 24）を含む抗体または抗体誘導体；もしくは
（1）M2-11クローン：重鎖（SEQ ID No: 25）および軽鎖（SEQ ID No: 26）を含む抗体または抗体誘導体；
（2）5A4クローン：重鎖（SEQ ID No: 27）および軽鎖（SEQ ID No: 28）を含む抗体または抗体誘導体；または
（3）3B6クローン：重鎖（SEQ ID No: 29）および軽鎖（SEQ ID No: 30）を含む抗体または抗体誘導体；
をより具体的な例として挙げることができる。
As a more detailed aspect of the present invention, in the following Examples,
(1) M2-11 clone: antibody or antibody derivative containing a heavy chain variable region (SEQ ID No: 19) and a light chain variable region (SEQ ID No: 20);
(2) 5A4 clone: an antibody or antibody derivative comprising a heavy chain variable region (SEQ ID No: 21) and a light chain variable region (SEQ ID No: 22); or (3) 3B6 clone: a heavy chain variable region (SEQ ID No: 22); (1) M2-11 clone: heavy chain (SEQ ID No: 25) and light chain (SEQ ID No: 26); );
(2) 5A4 clone: an antibody or antibody derivative containing a heavy chain (SEQ ID No: 27) and a light chain (SEQ ID No: 28); or (3) a 3B6 clone: an antibody or antibody derivative containing a heavy chain (SEQ ID No: 29) and a light chain. an antibody or antibody derivative comprising the chain (SEQ ID No: 30);
can be cited as a more specific example.
＜医薬組成物＞
本発明においては、一態様において、これまでに説明した抗体または抗体誘導体を含み、HBVを中和するための医薬組成物を提供することもできる。この医薬組成物は、HBVに感染した個体または感染が疑われる個体に対して、HBVにより生じる症状の発現を予防、治療するため、B型肝炎の再活性化を予防するため、またはHBVの母子感染や医療感染を阻止するために使用することができる。
<Pharmaceutical composition>
In one embodiment, the present invention can also provide a pharmaceutical composition for neutralizing HBV, which includes the antibody or antibody derivative described above. This pharmaceutical composition can be used to prevent or treat symptoms caused by HBV, to prevent reactivation of hepatitis B, or to prevent and treat HBV-infected individuals or individuals suspected of being infected with HBV. It can be used to prevent infections and medical infections.
この医薬組成物に含まれる本発明の抗体または抗体誘導体は血液原料に由来しないものであることから、この医薬組成物は、血液中に含まれる可能性がある（血液製剤に混入する危険性がある）HBV、HCV、HIVなどのウイルスなどの病原体を含まず、また血液中に含まれる抗原性タンパク質やヒトタンパク質と結合する抗体など、投与された個体に免疫異常を生じさせる危険性のある血液由来成分を含まないことを特徴とする。 Since the antibody or antibody derivative of the present invention contained in this pharmaceutical composition is not derived from blood sources, this pharmaceutical composition may be contained in blood (there is a risk of contamination with blood products). Blood that does not contain pathogens such as viruses such as HBV, HCV, and HIV, and that contains antibodies that bind to antigenic proteins and human proteins contained in the blood, which may cause immune abnormalities in the administered individual. It is characterized by not containing derived ingredients.
本発明における医薬組成物には、上述した抗体または抗体誘導体を1種類含んでいても、複数種類含んでいてもよい。 The pharmaceutical composition of the present invention may contain one type of the above-mentioned antibody or antibody derivative, or may contain multiple types of the above-mentioned antibody or antibody derivative.
＜抗体または抗体誘導体の他の用途＞
本発明において作製される抗体または抗体誘導体は、生体由来試料中のHBVの存在・存在量を検出・測定する目的で使用することができる。このような目的で使用する場合、被験体から採取された生体由来試料を、in vitroにおいて本発明の抗体または抗体誘導体と接触させ、HBVに結合した本発明の抗体または抗体誘導体を二次抗体により検出することにより、当該抗体または抗体誘導体と結合した試料中のHBVを検出・測定することにより、生体由来試料中のHBVの存在・存在量を検出・測定することができる。
<Other uses of antibodies or antibody derivatives>
The antibodies or antibody derivatives produced in the present invention can be used for the purpose of detecting and measuring the presence and abundance of HBV in biological samples. When used for such purposes, a biological sample collected from a subject is contacted with the antibody or antibody derivative of the present invention in vitro, and the antibody or antibody derivative of the present invention bound to HBV is isolated by a secondary antibody. By detecting and measuring HBV in the sample bound to the antibody or antibody derivative, the presence and amount of HBV in the biological sample can be detected and measured.
本発明の抗体または抗体誘導体により上述したように生体試料中のHBVを検出・測定することができることから、既存の抗HBsヒト免疫グロブリン製剤（例えば、市販のHBIG製剤（一般社団法人日本血液製剤機構または日本製薬株式会社（販売：武田薬品工業株式会社）））との性能比較を行うことができる。 Since the antibody or antibody derivative of the present invention can detect and measure HBV in biological samples as described above, existing anti-HBs human immunoglobulin preparations (for example, commercially available HBIG preparations (Japan Blood Products Organization or Nippon Pharmaceutical Co., Ltd. (sold by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.))).
また、本発明の抗体または抗体誘導体は、研究用試薬として、試料中のHBVを検出・測定するためのELISA、ウェスタンブロッティングなどの用途で使用することもできる。このような用途を利用することにより、HBVへの感染が疑われる被検体の感染の確定ができるほか、HBVワクチンの検定、抗HBV医薬品評価のための感染実験における感染抑制コントロールなどにも使用することができる。 Furthermore, the antibody or antibody derivative of the present invention can also be used as a research reagent in applications such as ELISA and Western blotting for detecting and measuring HBV in a sample. By using this kind of application, it is possible to confirm the infection of a subject suspected of being infected with HBV, and it can also be used for infection control control in infection experiments for testing HBV vaccines and evaluating anti-HBV drugs. be able to.
さらに、本発明の抗体または抗体誘導体を含む、被験体体内におけるHBVの存在・存在量を検出・測定するためのキットとすることもできる。このようなキットには、当該抗体または抗体誘導体を検出するための標識化二次抗体を含んでいてもよい。 Furthermore, a kit containing the antibody or antibody derivative of the present invention for detecting and measuring the presence/abundance of HBV in a subject can also be provided. Such a kit may include a labeled secondary antibody for detecting the antibody or antibody derivative.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically illustrated by giving Examples. The examples presented below are not intended to limit the invention in any way.
実施例1：抗体遺伝子単離（Antigen-specific Single cell sorting法；AgS-SCS法）
本実施例は、HBVワクチンの接種を受けたヒト個体から、抗HBs抗体の遺伝子を単離することを目的として行った。
Example 1: Antibody gene isolation (Antigen-specific single cell sorting method; AgS-SCS method)
This example was carried out for the purpose of isolating an anti-HBs antibody gene from a human individual vaccinated with an HBV vaccine.
末梢血中を循環しているB細胞のうち、約60％は抗原刺激を受けていないナイーブB細胞であり、40％が膜結合型IgG、IgA、IgM、IgEのいずれかを発現するメモリーB細胞であることが知られている。メモリーB細胞中の抗体配列にはすでに、体細胞超突然変異（somatic hypermutation）が入り、抗原への結合親和性が高まっていると考えられる。そこで目的抗体遺伝子単離法として、IgGへクラススイッチしたメモリーB細胞集団の中で、HBs抗原と特異的に結合する高親和性抗体を発現している細胞のみを選択的に分取し、1細胞クローニング技術を用いて抗体遺伝子を単離する抗原特異的単一細胞ソーティング法（AgS-SCS法）を採用して、抗HBs抗体の遺伝子を単離することとした。 Approximately 60% of B cells circulating in peripheral blood are naive B cells that have not received antigen stimulation, and 40% are memory B cells that express membrane-bound IgG, IgA, IgM, or IgE. known to be cells. It is thought that the antibody sequences in memory B cells have already undergone somatic hypermutation, increasing their binding affinity for antigens. Therefore, as a target antibody gene isolation method, we selectively isolate only cells expressing high-affinity antibodies that specifically bind to HBs antigen among the memory B cell population that has class-switched to IgG. We decided to isolate the anti-HBs antibody gene by employing the antigen-specific single cell sorting method (AgS-SCS method), which uses cell cloning technology to isolate antibody genes.
過去にHBVワクチンの接種を受けたヒト個体に対して、HBVワクチンの追加接種を行った。追加接種したHBVワクチンとしては、HBV遺伝子型Cで血清型adr配列をもつ酵母由来組換えHBs抗原ワクチンであるビームゲン（KM biologics, Japan）またはHBV遺伝子型Aで血清型adw配列をもつ酵母由来組換えHBs抗原ワクチンHeptavax II（Merck, German）を使用した。なお、ヒト個体の初回接種時のワクチンについての詳細は不明であった。 A booster vaccination with HBV vaccine was given to human individuals who had previously been vaccinated with HBV vaccine. The additional HBV vaccines were Beamgen (KM biologics, Japan), a yeast-derived recombinant HBs antigen vaccine with HBV genotype C and serotype adr sequence, or yeast-derived recombinant HBs antigen vaccine with HBV genotype A and serotype adw sequence. The recombinant HBs antigen vaccine Heptavax II (Merck, German) was used. The details of the vaccine for the first vaccination of human individuals were unknown.
血漿抗HBs抗体力価が4,000 IU/L以上のヒト個体から、約30 mLの全血採血を行った。スクリーニングでの抗体力価測定は酵素免疫測定法（ELISA）で実施した。 Approximately 30 mL of whole blood was collected from human individuals with plasma anti-HBs antibody titers of 4,000 IU/L or higher. Antibody titer measurement in screening was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
実験を行ったヒト個体に対してHBVワクチンを追加接種してから6日目および28日目に、それぞれ全血30 mLを採血し、磁気ビーズ（MACSxpress Whole Blood B Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Germany)）を用いたネガティブセレクション法によるB細胞の1ステップ精製を行った。 On the 6th and 28th day after the booster vaccination with the HBV vaccine for the human individuals in the experiment, 30 mL of whole blood was collected and treated with magnetic beads (MACSxpress Whole Blood B Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Germany). )) One-step purification of B cells was performed using a negative selection method.
精製したB細胞5.0×107個を、下記条件で染色し、逆転写反応用バッファーを8μLずつ分注した96ウエルマイクロプレートにて、シングルセルソーティングした。 5.0×10 7 purified B cells were stained under the following conditions and single cell sorted in a 96-well microplate into which 8 μL of reverse transcription reaction buffer was dispensed.
精製B細胞を希釈したマウス血清を用いて非特異反応のブロッキングを行ったのち、HBs抗原によるウイルス様粒子（Virus Like particle：以下、VLPと呼ぶ）構造を保持する酵母由来組換えHBs抗原（HBsAg-XT, Beacle Inc, Japan）を、200 ng/mLの濃度で、ブロッキング処理したB細胞に氷上にて30分間反応させた。 After blocking non-specific reactions using mouse serum diluted with purified B cells, yeast-derived recombinant HBsAg (HBsAg -XT, Beacle Inc, Japan) at a concentration of 200 ng/mL, was reacted on blocked B cells for 30 minutes on ice.
HBs抗原を結合させた細胞を、100μLの抗体カクテル（抗-HBsポリクローナルウサギ抗体（Beacle Inc）、抗-ウサギIgG-Alexa488（Jackson ImmunoReserach Laboratories, USA）、抗-ヒトIgG-APC（BD Bioscience）、抗-CD27-PE（BD Bioscience）、抗-CD19-ACP-Cy7（BD Bioscience）、抗-CD38-PE-Cy7（BioLegend, USA）、7-AAD7-AAD（BD Bioscience）を、それぞれの試薬の指定用量にて混合し、FACSバッファー100μLにしたもの）で、氷上にて30分間染色した。 Cells bound with HBs antigen were incubated with 100 μL of antibody cocktail (anti-HBs polyclonal rabbit antibody (Beacle Inc), anti-rabbit IgG-Alexa488 (Jackson ImmunoReserach Laboratories, USA), anti-human IgG-APC (BD Bioscience), Anti-CD27-PE (BD Bioscience), anti-CD19-ACP-Cy7 (BD Bioscience), anti-CD38-PE-Cy7 (BioLegend, USA), and 7-AAD7-AAD (BD Bioscience) were added to each reagent. The cells were mixed at the specified volume to make 100 μL of FACS buffer) and stained on ice for 30 minutes.
細胞ソーティング装置BD FACSAria（BD Bioscience, USA）を用いて、CD19+、CD27+、CD38-、IgG+、7-ADD-、HBsAg+のゲートを用いて、1ウェルあたり8μLのRTバッファーが入った96ウェルプレートの各ウェルに細胞を1個ずつ分取した。 Using a cell sorting device BD FACSAria (BD Bioscience, USA), a 96-well plate containing 8 μL of RT buffer per well was prepared using gates for CD19+, CD27+, CD38-, IgG+, 7-ADD-, and HBsAg+. One cell was sorted into each well.
具体的には、細胞ソーティングは、まず、
・前方散乱光（FSC）による細胞の大きさ、側方散乱光（SSC）による細胞の形態、核、顆粒などの細胞内部構造に基づき、全血液細胞からリンパ球を選別し、
・その細胞中に含まれる生細胞集団（7AAD-）を得た。
・その後、IgG＋かつCD19＋の細胞を選別し、
・さらにCD27＋かつCD38-の細胞を選別する
ことにより、IgGメモリーB細胞を得た。この細胞の中から、さらにメモリーB細胞膜上に発現する抗HBs抗体に結合したHBs抗原を、検出用抗HBsポリクローナル抗体を用いてHBs antigen high gateで検出した結果、約300個の細胞が得られた。
Specifically, cell sorting first involves
- Sorting lymphocytes from all blood cells based on cell size by forward scattered light (FSC), cell morphology by side scattered light (SSC), and internal structure of cells such as nuclei and granules.
- A living cell population (7AAD-) contained in the cells was obtained.
・Then, select IgG+ and CD19+ cells,
- IgG memory B cells were obtained by further selecting CD27+ and CD38- cells. From among these cells, the HBs antigen bound to the anti-HBs antibody expressed on the memory B cell membrane was detected using an HBs antigen high gate using an anti-HBs polyclonal antibody for detection, and approximately 300 cells were obtained. Ta.
ソーティングした単一細胞を、逆転写反応用バッファーをウェル当たり8μl含む96ウェルプレートの個別のウェル中に入れ、逆転写用プライマー（ATATGGATCC GGCGCGCCGT CGACTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTT；SEQ ID No: 32）を含む逆転写酵素液2μLを各wellに分注し、逆転写反応を行った。 Sorted single cells were placed into individual wells of a 96-well plate containing 8 μl of reverse transcription reaction buffer per well, and reverse transcriptase containing reverse transcription primers (ATATGGATCC GGCCGCCGT CGACTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTT; SEQ ID No: 32). 2 μL of the solution was dispensed into each well, and a reverse transcription reaction was performed.
逆転写されたcDNA溶液1μLを用いて、重鎖の可変領域、および軽鎖の可変領域と定常領域について、1st PCRを行った。プライマー配列およびその使用量は以下の表1に示す通りである。 Using 1 μL of the reverse-transcribed cDNA solution, 1st PCR was performed on the heavy chain variable region and the light chain variable and constant regions. Primer sequences and amounts used are as shown in Table 1 below.
さらに、1st PCR後のPCR産物各2.5μLを用いて、同様に重鎖の可変領域、および軽鎖の可変領域と定常領域について、2nd PCRを行った。配列およびその使用量は以下の表2に示す通りである。 Furthermore, using 2.5 μL of each PCR product after the 1st PCR, 2nd PCR was similarly performed on the variable region of the heavy chain, and the variable region and constant region of the light chain. The sequences and their usage are as shown in Table 2 below.
2nd PCRのPCR産物を精製（QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN, Germany）した後、重鎖についてはIgG1発現クローニングベクターpIgG1H7（pcDNA3.1(+)Hyg（Invitrogen）の962番から991番までの29 bpを欠失させたもの骨格として、IgG重鎖分泌シグナルペプチド配列遺伝子、可変領域クローニング用制限酵素認識配列（NotI-XhoI）、IgG1定常領域遺伝子を人工合成して、挿入したプラスミドベクター）の可変領域クローニング用制限酵素認識配列（NotI-XhoI）サイトにクローニングし、目的とする抗体重鎖発現ベクターを得た。 After purifying the PCR product of the 2nd PCR (QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN, Germany), for the heavy chain, we used the IgG 1 expression cloning vector pIgG 1 H7 (from 962 to 991 of pcDNA3.1(+)Hyg (Invitrogen)). A plasmid vector in which 29 bp of the IgG heavy chain secretory signal peptide sequence gene, restriction enzyme recognition sequence for variable region cloning (NotI-XhoI), and IgG 1 constant region gene were artificially synthesized and inserted as a backbone. ) into the restriction enzyme recognition sequence (NotI-XhoI) site for variable region cloning to obtain the desired antibody heavy chain expression vector.
軽鎖についても、PCR産物を、軽鎖発現クローニング用ベクターpLight（pcDNA3.1(+)Hyg（Invitrogen）の962番から991番までの29 bpを欠失させたもの骨格として、軽鎖分泌シグナル配列遺伝子および軽鎖クローニング用制限酵素認識配列（NotI-XhoI）を人工合成したものを挿入したプラスミドベクター）、軽鎖クローニング用制限酵素認識配列（NotI-XhoI）サイトに組込んで抗体軽鎖発現ベクターを得た。 続いて、作成した重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターのうち全塩基配列を決定してオープンリーディングフレームが正常と確認されたものを、重鎖＋軽鎖のペアでヒト腎由来細胞株293T細胞（ATCC CRL-3216）へ一過性遺伝子導入（Lipofectamin LTX, Thermo Fisher scientific）し、5日後の培養上清中の目的抗体量を市販ELISAキット（Enzygnost anti-HBs II, SIEMENS, Germany）またはin house ELISAで測定した。この結果、強陽性の抗体（M2-11）が得られたので、これを組換えHBIG候補とし、このM2-11抗体の重鎖発現ベクターをpIgG1H7-M2-11、M2-11抗体の軽鎖発現ベクターをpL-M2-11として特定した。 Regarding the light chain, the PCR product was used as the backbone of the light chain expression cloning vector pLight (pcDNA3.1(+)Hyg (Invitrogen) with 29 bp deleted from position 962 to position 991), and the light chain secretion signal was A plasmid vector into which an artificially synthesized restriction enzyme recognition sequence for light chain cloning (NotI-XhoI) and a restriction enzyme recognition sequence for light chain cloning (NotI-XhoI) is inserted into the restriction enzyme recognition sequence (NotI-XhoI) site for antibody light chain expression. Obtained vector. Next, among the heavy chain expression vectors and light chain expression vectors that were created, those whose open reading frames were confirmed to be normal by determining the full nucleotide sequence were used as heavy chain + light chain pairs to be used in human kidney-derived cell line 293T cells. Transient gene transfer (Lipofectamin LTX, Thermo Fisher scientific) into (ATCC CRL-3216) and measure the amount of target antibody in the culture supernatant after 5 days using a commercially available ELISA kit (Enzygnost anti-HBs II, SIEMENS, Germany) or in Measured by house ELISA. As a result, a strongly positive antibody (M2-11) was obtained, which was used as a recombinant HBIG candidate . The light chain expression vector was identified as pL-M2-11.
実施例2：抗体遺伝子単離（EBV-ハイブリドーマ法）
本実施例は、HBVワクチンの接種を受けたヒト個体から、実施例1とは別法で抗HBs抗体の遺伝子を単離することを目的として行った。
Example 2: Antibody gene isolation (EBV-hybridoma method)
This example was conducted for the purpose of isolating an anti-HBs antibody gene from a human individual who had been vaccinated with an HBV vaccine, using a different method from Example 1.
HBVワクチンの接種を過去に受けたヒト個体から採取した全血から、末梢血単核球（PBMC）を密度勾配遠心分離法で精製し、その培養液中に、Epstein-Barr virus（EBV)持続感染ヒトB細胞株であるB95-8細胞の培養上清を添加することによりEBVを感染させ、B細胞を不死化した。 Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are purified by density gradient centrifugation from whole blood collected from human individuals who have previously been vaccinated with HBV vaccine, and Epstein-Barr virus (EBV) persists in the culture medium. B cells were immortalized by infecting them with EBV by adding the culture supernatant of B95-8 cells, an infected human B cell line.
1.0×106個ずつのEBV感染不死化B細胞とJMS-3ミエローマ細胞を混合した後、回収して、50％PEG（PEG 1540, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Japan）1 mLを1分かけて滴下して加え、さらに1分かけてRPMI 1640培地（日水製薬）を1 mL、さらに1分かけて10 mLのRPMI 1640培地を加え、混和後、遠心して回収した。 After mixing 1.0 × 106 EBV-infected immortalized B cells and JMS-3 myeloma cells, they were collected, and 1 mL of 50% PEG (PEG 1540, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Japan) was added over 1 minute. The mixture was added dropwise, and then 1 mL of RPMI 1640 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was added over a further 1 minute, and 10 mL of RPMI 1640 medium was added over a further 1 minute, mixed, and collected by centrifugation.
細胞を回収し、20％FCSを添加したRPMI 1640培地で2.5×105個/mLの細胞濃度に懸濁し、0.1 mLずつ96ウェルプレートに分注し、翌日、0.1 mLのHAT選択培地（0.5μMウアバイン添加）を加えて培養を継続し、7～10日後に培養上清中に抗体が産生されていることを確認した。 The cells were collected and suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 20% FCS to a cell concentration of 2.5 × 10 cells/mL, dispensed in 0.1 mL portions into a 96-well plate, and the next day, suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 20% FCS. After 7 to 10 days, it was confirmed that antibodies were produced in the culture supernatant.
抗体が産生されていることが確認されたウェルから抗体産生細胞を採取し、この抗体産生細胞を限界希釈法にてクローニングし、各ハイブリドーマの培養上清中抗体について、受身赤血球凝集反応法（Passive Hemmaglutination : PHA）（マイセルII anti-HBs、特殊免疫研究所）により、自動測定装置（PK7300, Beckman Coulter, USA）を用いたハイスループットスクリーニングを行った。PHA法では抗体のアビディティー（avidity、特異抗原との結合力）の強さが抗体価に反映されるという特徴があるため、本法によるスクリーニングを採用することでウイルス中和活性を持つ抗体を得られる可能性が高くなる。その結果、3名の個体のPBMCからHBs抗原凝集陽性のハイブリドーマを12株樹立した。 Antibody-producing cells were collected from wells in which it was confirmed that antibodies were being produced, and these antibody-producing cells were cloned using the limiting dilution method, and the antibodies in the culture supernatant of each hybridoma were analyzed using the passive hemagglutination method (Passive hemagglutination reaction method). Hemmaglutination (PHA) (Mycell II anti-HBs, Special Immunology Research Institute) was used for high-throughput screening using an automatic measurement device (PK7300, Beckman Coulter, USA). The PHA method has the characteristic that the strength of antibody avidity (binding force with a specific antigen) is reflected in the antibody titer, so by employing screening using this method, antibodies with virus-neutralizing activity can be detected. more likely to be obtained. As a result, 12 HBs antigen agglutination-positive hybridoma strains were established from PBMC of three individuals.
PHA陽性となったハイブリドーマからRNAを精製し（NucleoSpin RNA (TaKaRa)）、抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域と定常領域を取得し、上記実施例1のプライマーと同じプライマーを使用して実施例1の方法と同様の方法でベクターへクローニングし、ヒト腎由来細胞株293T細胞（ATCC CRL-3216）へ一過性遺伝子導入（Lipofectamin LTX, Thermo Fisher scientific）により組換え抗体として発現させた。 RNA was purified from the PHA-positive hybridoma (NucleoSpin RNA (TaKaRa)), and the antibody heavy chain variable region and light chain variable region and constant region were obtained, and the test was performed using the same primers as those in Example 1 above. It was cloned into a vector in the same manner as in Example 1, and expressed as a recombinant antibody by transient gene transfer (Lipofectamin LTX, Thermo Fisher scientific) into human kidney-derived cell line 293T cells (ATCC CRL-3216).
塩基配列の解析からIgG1であることが確認された抗体について、実施例1と同様にELISAを行った。その結果、3種の抗体（5A4、3D1および3B6）がELISAにて強陽性となり、これらを組換えHBIG候補とし、それぞれ、5A4抗体の重鎖発現ベクターをpIgG1H7-5A4、5A4抗体の軽鎖発現ベクターをpL-5A4、3D1抗体の重鎖発現ベクターをpIgG1H7-3D1、3D1抗体の軽鎖発現ベクターをpL-3D1、3B6抗体の重鎖発現ベクターをpIgG1H7-3B6、3B6抗体の軽鎖発現ベクターをpL-3B6として特定した。 ELISA was performed in the same manner as in Example 1 for the antibody that was confirmed to be IgG 1 from base sequence analysis. As a result, three types of antibodies (5A4, 3D1, and 3B6) were strongly positive in ELISA, and these were selected as recombinant HBIG candidates . The chain expression vector is pL-5A4, the heavy chain expression vector of the 3D1 antibody is pIgG 1 H7-3D1, the light chain expression vector of the 3D1 antibody is pL-3D1, the heavy chain expression vector of the 3B6 antibody is pIgG 1 H7-3B6, 3B6 antibody The light chain expression vector was identified as pL-3B6.
実施例3：組換え抗体発現と精製
本実施例は、実施例1および実施例2において得られた組換えHBIG候補の4種の抗体を発現し、精製することを目的として行った。
Example 3: Recombinant antibody expression and purification This example was carried out for the purpose of expressing and purifying the four recombinant HBIG candidate antibodies obtained in Examples 1 and 2.
実施例1で得られたM2-11抗体の重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクター（pIgG1H7-M2-11およびpL-M2-11）、および実施例2で得られた3種の抗体（5A4、3D1および3B6）についての重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクター（5A4抗体についてはpIgG1H7-5A4およびpL-5A4、3D1抗体についてはpIgG1H7-3D1およびpL-3D1、3B6抗体についてはpIgG1H7-3B6およびpL-3B6）を、抗体発現用細胞に一過性にトランスフェクションした。具体的には、浮遊系ヒト腎由来細胞株GIBCO Expi 293F cell（Thermo Fisher Scientific）1.5×108個に対して、遺伝子導入試薬GIBCO Expifectamine 293（Thermo Fisher Scientific）を用いて、45μgの重鎖発現ベクターおよび15μgの軽鎖発現ベクターを遺伝子導入し、無血清培地（Gibco Expi293 Expression Medium, Thermo Fisher Scientific）で7日間振とう培養（125 rpm、37℃、8％CO2）した後、培養上清を抗体原液として回収した。 The heavy chain expression vector and light chain expression vector (pIgG 1 H7-M2-11 and pL-M2-11) of the M2-11 antibody obtained in Example 1, and the three antibodies obtained in Example 2 ( 5A4, 3D1 and 3B6) and light chain expression vectors (pIgG 1 H7-5A4 and pL-5A4 for the 5A4 antibody, pIgG 1 H7-3D1 and pL-3D1 for the 3D1 antibody, pIgG 1 H7-3D1 and pL-3D1 for the 3B6 antibody) pIgG 1 H7-3B6 and pL-3B6) were transiently transfected into antibody-expressing cells. Specifically, 45 μg of heavy chain was expressed using the gene transfer reagent GIBCO Expifectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) into 1.5 × 10 cells of the floating human kidney-derived cell line GIBCO Expi 293F cell (Thermo Fisher Scientific). After transfecting the vector and 15 μg of the light chain expression vector, culturing with shaking (125 rpm, 37°C, 8% CO 2 ) in a serum-free medium (Gibco Expi293 Expression Medium, Thermo Fisher Scientific) for 7 days, the culture supernatant was was collected as an antibody stock solution.
培養上清を遠心して細胞片を除き、孔径0.45μmおよび0.22μmの親水性メンブレン（Durapore, Merck, USA）で濾過を行い、pH7.4に調整した。PBSで平衡化したHiTrap Protein G HP Columns（GE Healthcare, USA）を用いて、培養上清から抗体をアフィニティ精製後、Sephadex G-25（PD-10 column、GE Healthcare）を用いてゲル濾過し、限外濾過法でPBSへのバッファー交換と濃縮を行った（Centricon Plus-70 Centrifugal Filter, Merck）。これにより、実施例1および実施例2においてELISA強陽性となった4つの抗体M2-11、5A4、3D1および3B6について、精製抗体を得た。 The culture supernatant was centrifuged to remove cell debris, filtered through hydrophilic membranes (Durapore, Merck, USA) with pore sizes of 0.45 μm and 0.22 μm, and adjusted to pH 7.4. Antibodies were affinity purified from the culture supernatant using HiTrap Protein G HP Columns (GE Healthcare, USA) equilibrated with PBS, and then gel-filtered using Sephadex G-25 (PD-10 column, GE Healthcare). Buffer exchange into PBS and concentration were performed by ultrafiltration (Centricon Plus-70 Centrifugal Filter, Merck). As a result, purified antibodies were obtained for the four antibodies M2-11, 5A4, 3D1, and 3B6 that were strongly positive by ELISA in Examples 1 and 2.
実施例4：組換え抗体の中和活性の評価
本実施例は、実施例3で得られた精製抗体が、HBVに対する中和活性を有することを確認するために行った。
Example 4: Evaluation of neutralizing activity of recombinant antibody This example was carried out to confirm that the purified antibody obtained in Example 3 had neutralizing activity against HBV.
（4-1）遺伝子型D型のHBVに感染させた細胞を使用した1回目のスクリーニング
中和活性の評価に際しては、まず遺伝子型D型のHBV感染細胞を使用して1回目のスクリーニングを行った。HBVの細胞レセプターであるタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（sodium-taurocholate co-transporting polypeptide；NTCP）を発現させたヒト肝細胞株HepG2細胞（HepG2-hNTCP-C4細胞）を12ウェルディッシュに2.5×105 cells/wellで播種した。
(4-1) First screening using cells infected with genotype D HBV To evaluate neutralizing activity, first perform a first screening using cells infected with genotype D HBV. Ta. Human liver cell line HepG2 cells (HepG2-hNTCP-C4 cells) expressing sodium-taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP), a cellular receptor for HBV, were placed in a 12-well dish at 2.5 x 10 cells. It was seeded at 5 cells/well.
翌日、上記の細胞の培養液を、1,000ゲノム等価物（genome equivalents；GEq）/cell（MOI＝1,000）の遺伝子型D型のHBVおよび実施例3で得られた4種の精製抗体を含む感染培地（DMEM（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）に、400μg/ml G418（Nacalai Tesque）、10％ウシ胎児血清（FBS）、および4％ PEG 8000（Nacalai Tesque）を添加したもの）に交換して、1日培養することで細胞を感染させた。 The next day, the culture medium of the above cells was infected with 1,000 genome equivalents (GEq)/cell (MOI = 1,000) containing genotype D HBV and the four purified antibodies obtained in Example 3. Replace with medium (DMEM (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) supplemented with 400 μg/ml G418 (Nacalai Tesque), 10% fetal bovine serum (FBS), and 4% PEG 8000 (Nacalai Tesque)). Cells were infected by culturing for 1 day.
さらに翌日、細胞を、4種の精製抗体のいずれかを含む増殖培地（DMEM（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）に、400μg/ml G418（Nacalai Tesque）および10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したもの）に交換し、2日毎に継代して培養を続け、感染14日目の細胞を回収し、細胞内でHBVカプシドに覆われたウイルスDNA（capsid-associated relaxed circular DNA［rcDNA］）量を定量的PCR（qPCR）で定量することにより、精製抗体が中和活性を有していたかどうかを確認した。 Further, the next day, cells were cultured in growth medium (DMEM (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) containing any of the four purified antibodies, supplemented with 400 μg/ml G418 (Nacalai Tesque) and 10% fetal bovine serum (FBS). The culture was continued by subculturing every 2 days, and the cells were collected on the 14th day of infection, and the amount of viral DNA (capsid-associated relaxed circular DNA [rcDNA]) covered by HBV capsids in the cells was determined. We confirmed whether the purified antibody had neutralizing activity by quantifying it by quantitative PCR (qPCR).
qPCR反応は、感染細胞から回収した核酸をテンプレートとし、Fast SYBER Green Master Mix（Applied Biosystems, USA）およびプライマーセット（フォワードプライマー5'-gagtgtggattcgcactcc-3'（SEQ ID No: 79）およびリバースプライマー5'-gaggcgagggagttcttct-3'（SEQ ID No: 80）を使用して行った。 The qPCR reaction used nucleic acids recovered from infected cells as a template, Fast SYBER Green Master Mix (Applied Biosystems, USA) and primer sets (forward primer 5'-gagtgtggattcgcactcc-3' (SEQ ID No: 79) and reverse primer 5' -gaggcgagggagttcttct-3' (SEQ ID No: 80).
この結果、M2-11、5A4、3B6の3種類の精製抗体は、濃度依存的にHBVのDNAコピー数を減少させて良好な中和活性を示したが、3D1には濃度依存的なHBVのDNAコピー数の減少は見られず、中和活性が認められなかったため、3D1抗体の評価はここで終了した（図1）。 As a result, three types of purified antibodies, M2-11, 5A4, and 3B6, showed good neutralizing activity by decreasing HBV DNA copy number in a concentration-dependent manner, but 3D1 showed a concentration-dependent decrease in HBV DNA copy number. Since no decrease in DNA copy number was observed and no neutralizing activity was observed, the evaluation of the 3D1 antibody was terminated at this point (Figure 1).
（4-2）遺伝子型C型のHBVに感染させた初代ヒト肝細胞による2回目のスクリーニング
次に、遺伝子型C型のHBVに感染させた初代ヒト肝細胞を使用して、2回目のスクリーニングを行った。初代ヒト肝細胞を使用した感染実験では、24ウェルディッシュに4×105 cell/wellで培養したキメラマウス由来ヒト新鮮肝細胞PXB細胞（PhoenixBio）に対して、2×106ゲノム等価物（GEq）（MOI＝5）の遺伝子型C型HBVを、組換え抗HBs抗体（M2-11、5A4、3B6の3種類の精製抗体）のいずれかまたは市販のHBIG（ヘブスブリン筋注用1000単位、日本血液製剤機構）を含む増殖培地（dHCGM培地、PhoenixBio, Japan）でプレインキュベーションし、感染させた。
(4-2) Second screening using primary human hepatocytes infected with HBV genotype C Next, a second screening using primary human hepatocytes infected with HBV genotype C I did it. In infection experiments using primary human hepatocytes, 2× 10 6 genome equivalents (GEq ) (MOI = 5) with either recombinant anti-HBs antibody (3 types of purified antibodies, M2-11, 5A4, and 3B6) or commercially available HBIG (1000 units for intramuscular injection, Japan). The cells were pre-incubated with a growth medium (dHCGM medium, PhoenixBio, Japan) containing Blood Products Japan, and infected.
感染16時間後に、細胞の培養を増殖培地で開始し、5日毎に培地交換しながら、それぞれの抗体存在下で11日間培養を行った。11日目の培養上清を回収し、HBV由来のHBe抗原量を、ELISA（CSB-E13557h, Cusabio, USA）で測定した。 Cell culture was started in a growth medium 16 hours after infection, and cultured for 11 days in the presence of each antibody while changing the medium every 5 days. The culture supernatant on day 11 was collected, and the amount of HBV-derived HBe antigen was measured by ELISA (CSB-E13557h, Cusabio, USA).
この結果、3種類の組換え抗HBs抗体（M2-11、5A4、3B6の精製抗体）はいずれも、濃度依存的にHBe抗原量を減少させることが示され、抗体濃度が20μg/mLの場合には3種類の抗体ともにHBe抗原量を検出限界以下に減少させることが分かった。また、M2-11、5A4、3B6の3種類いずれの精製抗体も、0.02μg/mLでのHBe抗原を減少させる効果が、0.2μg/mLの市販HBIGよりも高い（すなわち、少なくとも10倍以上の中和活性を意味する）ことが明らかになった（図2）。このように、3種類の抗HBsヒトモノクローナル抗体は強い中和活性を示し、これら抗体の単独または混合物が組換えHBIGとして有望であると示された。 The results showed that all three types of recombinant anti-HBs antibodies (purified antibodies M2-11, 5A4, and 3B6) decreased the amount of HBe antigen in a concentration-dependent manner, and when the antibody concentration was 20 μg/mL. It was found that all three types of antibodies reduced the amount of HBe antigen below the detection limit. In addition, all three purified antibodies, M2-11, 5A4, and 3B6, were more effective in reducing HBe antigen at 0.02 μg/mL than commercially available HBIG at 0.2 μg/mL (i.e., at least 10 times more effective) than commercially available HBIG at 0.2 μg/mL. (Figure 2). Thus, the three types of anti-HBs human monoclonal antibodies showed strong neutralizing activity, and these antibodies alone or in combination were shown to be promising as recombinant HBIG.
実施例5：組換え抗体の結合特性の評価
本実施例は、実施例4のスクリーニングで中和活性の認められた3種のヒト抗HBs組換えモノクローナル抗体（M2-11、5A4、3B6の3種類の精製抗体）の、HBVに対する結合特性を確認するために行った。
Example 5: Evaluation of binding properties of recombinant antibodies This example evaluates the binding properties of recombinant antibodies. This was carried out to confirm the binding properties of various purified antibodies to HBV.
組換えHBs抗原（HBsAg-XT）を100℃、10分で加熱後、1℃/minの速度で20℃まで徐冷し、ウイルス様粒子（VLP）を誘導した。SDS-PAGE用には、熱処理抗原を0.1 mg/mLとなるように調整し、半数の検体に還元剤（50 mM DTT, GE Healthcare）を添加後、100℃、5分加熱し、10％ Bolt Bis-Tris Plusゲル（Thermo Fisher Scientific）で電気泳動を行った。 Recombinant HBs antigen (HBsAg-XT) was heated at 100°C for 10 minutes and then slowly cooled to 20°C at a rate of 1°C/min to induce virus-like particles (VLPs). For SDS-PAGE, heat-treated antigen was adjusted to 0.1 mg/mL, a reducing agent (50 mM DTT, GE Healthcare) was added to half of the samples, heated at 100°C for 5 minutes, and 10% Bolt Electrophoresis was performed on Bis-Tris Plus gels (Thermo Fisher Scientific).
一方、Native PAGE用にはBlue Native-PAGE法を使用した。すなわち、上記HBs抗原をNative sample buffer（Thermo Fisher Scientific）にて0.1 mg/mLとなるように調整し、半数の検体に還元剤（50 mM DTT）を添加し、NativePAGE 4-16％ Bis-Tris Protein Gels（Thermo Fisher Scientific）で電気泳動を行った。電気泳動後のタンパク質をPVDFメンブレン（iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF, mini, Thermo Fisher Scientific）に転写し、室温で1時間ブロッキングした後、2μg/mLの評価対象抗体（3種のヒト抗HBs組換えモノクローナル抗体（M2-11、5A4、3B6の3種類の精製抗体）のいずれかまたは比較対照であるHBIGまたはウマポリクローナル抗体）で4℃にて一晩、一次反応を行った。 On the other hand, Blue Native-PAGE method was used for Native PAGE. That is, the above HBs antigen was adjusted to 0.1 mg/mL in Native sample buffer (Thermo Fisher Scientific), a reducing agent (50 mM DTT) was added to half of the samples, and NativePAGE 4-16% Bis-Tris Electrophoresis was performed on Protein Gels (Thermo Fisher Scientific). The proteins after electrophoresis were transferred to a PVDF membrane (iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF, mini, Thermo Fisher Scientific), blocked for 1 hour at room temperature, and then 2 μg/mL of the target antibody (3 types of human anti-HBs recombinant A primary reaction was performed overnight at 4° C. with one of the monoclonal antibodies (three types of purified antibodies M2-11, 5A4, and 3B6) or HBIG or horse polyclonal antibody as a comparison control.
次に、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG（709-035-149, Jackson ImmunoReserach Laboratories）またはHRP標識抗ウマIgGポリクローナル抗体（ab6921 abcam, UK）)および、化学発光試薬（ECL Select, Thermo Fisher Scientific）を使用して、ゲル上のHBs抗原に対しての評価用抗体の結合性を検出した。 Next, a secondary antibody (peroxidase-labeled anti-human IgG (709-035-149, Jackson ImmunoReserach Laboratories) or HRP-labeled anti-horse IgG polyclonal antibody (ab6921 abcam, UK)) and chemiluminescent reagent (ECL Select, Thermo Fisher Scientific ) was used to detect the binding of the evaluation antibody to the HBs antigen on the gel.
この結果、SDS-PAGEの還元条件においては、HBs抗原はコントロールとして用いた抗HBsウマポリクローナル抗体によって単量体（約25 kDa）および二量体（約50 kDa）として検出されるが、非還元状態ではサンプルウェル付近にシグナルが観察されることから、非還元条件では高分子多量体であるVLPが検出されていることが示された（図3上）。 As a result, under the reducing conditions of SDS-PAGE, HBs antigen was detected as a monomer (approximately 25 kDa) and a dimer (approximately 50 kDa) by the anti-HBs horse polyclonal antibody used as a control; Under non-reducing conditions, a signal was observed near the sample well, indicating that VLP, a polymer multimer, was detected under non-reducing conditions (Figure 3, top).
また、本発明の3種のモノクローナル抗体は、還元条件SDS-PAGEにおいて単量体および二量体のHBs抗原とは全く結合せず、非還元状態においてもVLPとほとんど結合しなかった。ただし、3B6は非還元状態のVLPに対して弱く結合した（図3上）。 Furthermore, the three monoclonal antibodies of the present invention did not bind to monomeric or dimeric HBs antigens at all in SDS-PAGE under reducing conditions, and hardly bound to VLPs even under non-reducing conditions. However, 3B6 weakly bound to VLP in the non-reduced state (Fig. 3, top).
一方、タンパク質がSDS-PAGEより本来の構造を維持していると予想されるNative-PAGEにおいては、3種のモノクローナル抗体はすべてVLPと結合したが、M2-11と5A4では非還元状態では、VLPへ還元状態の場合より強固に結合し、3B6は還元剤の影響をほとんど受けないことが示された（図3中および下）。また、非還元状態のVLPへの結合強度を比較すると、3B6＞M2-11＞5A4であった。 On the other hand, in Native-PAGE, in which proteins are expected to maintain their original structure compared to SDS-PAGE, all three monoclonal antibodies bound to VLPs, but M2-11 and 5A4 bound to VLPs in the non-reduced state. It was shown that 3B6 bound to VLP more tightly than in the reduced state, and was almost unaffected by reducing agents (Figure 3 middle and bottom). Furthermore, when comparing the binding strength to VLP in a non-reduced state, 3B6>M2-11>5A4.
以上の結果より、3種のモノクローナル抗体が認識しているエピトープは不連続のアミノ酸からなる立体構造エピトープ（conformational epitopes）であること、連続したペプチド配列としては定義されないこと、さらに少なくともM2-11/5A4と3B6とは認識するエピトープが異なること、が示された。 The above results indicate that the epitopes recognized by the three monoclonal antibodies are conformational epitopes consisting of discontinuous amino acids and are not defined as a continuous peptide sequence, and that at least M2-11/ It was shown that 5A4 and 3B6 recognize different epitopes.
HBs抗原は細胞外領域に8個のシステイン残基を持ち、これら残基による分子内および分子間ジスルフィド結合がVLP多量体構造に大きく寄与している。そのため、M2-11と5A4のVLP結合性が還元剤感受性であることは、これらの抗体がHBs抗原からなる多量体構造そのものを認識していることを強く支持する。 HBs antigen has eight cysteine residues in the extracellular region, and intramolecular and intermolecular disulfide bonds formed by these residues greatly contribute to the VLP multimeric structure. Therefore, the fact that the VLP binding properties of M2-11 and 5A4 are sensitive to reducing agents strongly supports that these antibodies recognize the multimeric structure itself consisting of HBs antigen.
実施例6：候補抗体の交差反応性の評価
本実施例は、実施例4のスクリーニングで中和活性の認められた3つのヒト抗HBs組換えモノクローナル抗体（M2-11、5A4、3B6）が、ヒト由来成分に対して非特異結合しないこと（交差反応性を有さないこと）を確認するために行った。
Example 6: Evaluation of cross-reactivity of candidate antibodies In this example, three human anti-HBs recombinant monoclonal antibodies (M2-11, 5A4, 3B6), which were found to have neutralizing activity in the screening in Example 4, This was done to confirm that there is no non-specific binding (no cross-reactivity) to human-derived components.
抗体医薬品の使用において最も懸念される副反応は、
・投与抗体がヒト以外の動物種由来配列を持つ場合、ヒトに対して抗原性を持つことと、
・用いた抗体がヒトの正常組織に非特異結合すること
である。今回単離した3種のモノクローナル抗体については、ワクチン接種した健康ヒト個体の末梢血から取得したヒトB細胞由来完全ヒト抗体であるため、前者の副反応の可能性は極めて低いと考えられる。また、後者についても、この3種のモノクローナル抗体の由来B細胞を提供したヒト個体において、ワクチン追加接種後に炎症・自己免疫疾患等の発症が全く報告されていないことから、これら抗体が自己反応性を示す可能性は低いと考えられる。
The most concerning side reactions when using antibody drugs are:
・If the administered antibody has a sequence derived from an animal species other than humans, it must be antigenic to humans;
・The antibody used non-specifically binds to normal human tissues. The three types of monoclonal antibodies isolated this time are fully human antibodies derived from human B cells obtained from the peripheral blood of vaccinated healthy human individuals, so the possibility of side effects of the former is considered to be extremely low. Regarding the latter, there have been no reports of the development of inflammatory or autoimmune diseases after booster vaccination in the human individuals who provided the B cells from which these three monoclonal antibodies were derived. It is thought that the possibility of showing this is low.
念のため、これらのモノクローナル抗体がヒトの正常組織に対して非特異的に結合しないこと（交差反応性を有さないこと）について検証するため、ELISAおよび組織免疫染色で3種の抗HBsモノクローナル抗体のヒト由来成分への結合を解析した。 As a precautionary measure, in order to verify that these monoclonal antibodies do not bind nonspecifically to human normal tissue (have no cross-reactivity), we tested three types of anti-HBs monoclonal antibodies using ELISA and tissue immunostaining. The binding of antibodies to human-derived components was analyzed.
（6-1）ELISA
ELISAはAntigen-Down ELISA Development Kit（Immunochemistry technologies, Australia）を用いて行った。ELISAで対象とした成分は、HBs抗原（HBAg-XT）に加えて、抗体医薬品のヒト由来成分への非特異結合評価に用いられているヒトインスリン（富士フイルム和光純薬）および自己免疫疾患患者における代表的な自己抗体抗原であるゲノムDNA（ヒト培養細胞株HeLa細胞（ATCC CCL-2）から抽出したものをヒトゲノムDNAとして使用）であり、これらをELISA用96ウェルプレートに固相化した。
(6-1) ELISA
ELISA was performed using the Antigen-Down ELISA Development Kit (Immunochemistry technologies, Australia). In addition to HBs antigen (HBAg-XT), the components targeted by ELISA include human insulin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is used to evaluate non-specific binding of antibody drugs to human-derived components, and patients with autoimmune diseases. Genomic DNA (extracted from human cultured cell line HeLa cells (ATCC CCL-2) was used as human genomic DNA), which is a typical autoantibody antigen, was immobilized on a 96-well plate for ELISA.
プレートに、希釈した3種の組換え抗HBs抗体のいずれかを各100μL/well加え、抗-ヒトIgG-HRP（709-035-149, Jackson）と反応させ、ペルオキシダーゼ基質を添加して発色させた。呈色反応結果を、吸光度測定マイクロプレートリーダー（MTP-300, CORONA Electric, Japan）を用いて、測定波長450 nm、対象波長630 nmの吸光度として測定した。 Add 100 μL/well of each of the three diluted recombinant anti-HBs antibodies to the plate, react with anti-human IgG-HRP (709-035-149, Jackson), and add peroxidase substrate to develop color. Ta. The color reaction results were measured as absorbance at a measurement wavelength of 450 nm and a target wavelength of 630 nm using an absorbance measurement microplate reader (MTP-300, CORONA Electric, Japan).
3種のヒトHBsモノクローナル抗体は、特異抗原であるHBsへの結合が飽和する濃度の10倍以上の抗体濃度においてもELISAプレートに固相化したヒト由来成分に対して非特異的な結合を示さなかった（図4）。 Three types of human HBs monoclonal antibodies showed nonspecific binding to human-derived components immobilized on ELISA plates even at antibody concentrations 10 times higher than the concentration at which binding to the specific antigen HBs was saturated. There was no (Figure 4).
（6-2）組織免疫染色
HBV陽性ヒト肝臓組織パラフィン切片アレイ（LV1401, US Biomax Inc, USA）および正常ヒト組織パラフィン切片アレイ（T8234708-5, BioChain, USA）を脱パラフィン後、3％ H2O2と反応させて内在性ペルオキシダーゼを不活化し、5％ BSAで4℃にて一晩ブロッキング反応を行った。
(6-2) Tissue immunostaining
HBV-positive human liver tissue paraffin section array (LV1401, US Biomax Inc, USA) and normal human tissue paraffin section array (T8234708-5, BioChain, USA) were deparaffinized and then reacted with 3% H 2 O 2 to remove endogenous Peroxidase was inactivated, and a blocking reaction was performed overnight at 4°C with 5% BSA.
次いで、10μg/mLに希釈した組換え抗HBs抗体混合溶液（M2-11、5A4、3B6の混合溶液）と反応させた後、二次抗体（709-035-149, Jackson ImmunoReserach Laboratories）と反応させた。ペルオキシダーゼ基質（ImmPACT DAB, VECTOR laboratorie, USA）を加えて発色させ、Mayer's Hematoxylinで対比染色を行った。 Next, it was reacted with a recombinant anti-HBs antibody mixed solution (mixed solution of M2-11, 5A4, and 3B6) diluted to 10 μg/mL, and then reacted with a secondary antibody (709-035-149, Jackson ImmunoReserach Laboratories). Ta. Peroxidase substrate (ImmPACT DAB, VECTOR laboratory, USA) was added to develop color, and counterstaining was performed with Mayer's Hematoxylin.
この結果、3種のモノクローナル抗体混合溶液は、10μg/mLの抗体濃度でHBV陽性者の肝臓組織中にあるHBs抗原を明瞭に検出した（図5a）が、同濃度で各種正常ヒト組織への染色は認められなかった（図5b）。これらの結果から、組換えHBIG候補である3種のモノクローナル抗体は、ヒト由来成分との交差反応性が極めて低いことが明らかとなった。 As a result, the mixed solution of three monoclonal antibodies clearly detected HBs antigen in the liver tissues of HBV-positive patients at an antibody concentration of 10 μg/mL (Figure 5a), but the same concentration did not detect HBs antigen in various normal human tissues. No staining was observed (Fig. 5b). These results revealed that the three monoclonal antibodies that are recombinant HBIG candidates have extremely low cross-reactivity with human-derived components.
実施例7：候補抗体CDR配列の特徴
本実施例では、本発明において得られたそれぞれのHBsモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の特徴を解析した。
Example 7: Characteristics of Candidate Antibody CDR Sequences In this example, the characteristics of the heavy chain and light chain amino acid sequences of each HBs monoclonal antibody obtained in the present invention were analyzed.
HBsモノクローナル抗体M2-11、5A4、3B6それぞれの抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定したところ、それぞれの鎖の可変領域（VH領域およびVL領域）のアミノ酸配列は、以下の通りであった。 The amino acid sequences of the heavy chain and light chain of HBs monoclonal antibodies M2-11, 5A4, and 3B6 were determined, and the amino acid sequences of the variable regions (VH region and VL region) of each chain were as follows. Ta.
これらのHBsモノクローナル抗体M2-11、5A4、3B6それぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をさらに詳細に解析し、それぞれの鎖の相補性決定領域（complementarity determining region：CDR）のアミノ酸配列を以下のアミノ酸配列に下線で示した（それぞれのアミノ酸配列において、順にCDR1、CDR2、CDR3）。CDR配列の抽出にはIMTG（the international ImMunoGeneTics information system）の抗体配列解析ソフトウエアIMTG/V-QUESTを用いた。 The amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region of these HBs monoclonal antibodies M2-11, 5A4, and 3B6 were analyzed in more detail, and the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs) of each chain were analyzed in more detail. The sequences are underlined in the amino acid sequences below (in each amino acid sequence, CDR1, CDR2, and CDR3 in this order). The antibody sequence analysis software IMTG/V-QUEST from IMTG (the international ImMunoGeneTics information system) was used to extract CDR sequences.
＜M2-11クローン＞
重鎖可変領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 19、CDR1、CDR2、CDR3に下線を引いた）
AAAVLSQVQL VESGGGLVKP GESLRLSCAA SGFMFSGHSM VWVRQAPGKG LEWVSFIGST GEFISYADSV RGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRADDTAVY YCAREQGTRG RYYYYGLDVW GQGTTVTVSS ASRTK
軽鎖可変領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 20、CDR1、CDR2、CDR3に下線を引いた）
AAAMTQTPPS LSLSPGESAT LSCRASQSVS TYLAWYQQKP GQAPRLLIYD AFNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAVYYCQQ RGHWPLTFGG GTKVEIK
＜5A4クローン＞
重鎖可変領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 21、CDR1、CDR2、CDR3に下線を引いた）
AAAVLSQVQL QESGPGLVKP SDTLSLTCTV SGGSISGHYW SWIRRLPGGG LEWIGYIHYS GITNYNPSLK SRVTMSVDMS KNQFSLRLRS VTATDTAVYY CARGDATYGY WGQGAPVTVS SASRTK
軽鎖可変領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 22、CDR1、CDR2、CDR3に下線を引いた）
AAAMTQSPFT LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HRNGYNYVNW YLRKPGQSPQ LLISLGSDRA SGVPDRFRGS GAGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALRTP WTFGQGTKVE IK
＜3B6クローン＞
重鎖可変領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 23、CDR1、CDR2、CDR3に下線を引いた）
AAAVQCEVQL VESGGGVVQP GKSLRVSCAA SGFSFSNYGM HWVRQAPGKG LEWVSVIWRD GSHQYYADSV KGRFTVSRDN ARDTLFLQMD GLRAEDTAVY YCAREDPAIV LPVLDHWGRG TLVTVSSASR TK
軽鎖可変領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 24、CDR1、CDR2、CDR3に下線を引いた）
AAAMTQSPVS LSASVGDRVT ITCRASQRIN SYLNWYQQKP GKAPKLLIYG ASNLPSGVPS RFSGSGSGTY FTLTISSLQP EDLATYYCQQ GYSTPLLSFG PGTKVEIK
<M2-11 clone>
Amino acid sequence of heavy chain variable region (SEQ ID No: 19, CDR1, CDR2, CDR3 are underlined)
AAAVLSQVQL VESGGGLVKP GESLRLSCAA S GFMFSGHS M VWVRQAPGKG LEWVSF IGST GEFI SYADSV RGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRADDTAVY YC AREQGTRG RYYYYGLDV W GQGTTVTVSS ASRTK
Amino acid sequence of light chain variable region (SEQ ID No: 20, CDR1, CDR2, CDR3 are underlined)
AAAMTQTPPS LSLSPGESAT LSCRA SQSVS TY LAWYQQKP GQAPRLLIY D AF NRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAVYYC QQ RGHWPL TFGG GTKVEIK
<5A4 clone>
Amino acid sequence of heavy chain variable region (SEQ ID No: 21, CDR1, CDR2, CDR3 are underlined)
AAAVLSQVQL QESGPGLVKP SDTLSLTCTV SGGSISGHY W SWIRRLPGGG LEWIGY IHYS GIT NYNPSLK SRVTMSVDMS KNQFSLRLRS VTATDTAVYY C ARGDATYGY WGQGAPVTVS SASRTK
Amino acid sequence of light chain variable region (SEQ ID No: 22, CDR1, CDR2, CDR3 are underlined)
AAAMTQSPFT LPVTPGEPAS ISCRS SQSLL HRNGYNY VNW YLRKPGQSPQ LLIS LGS DRA SGVPDRFRGS GAGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC MQALRTP WT FGQGTKVE IK
<3B6 clone>
Amino acid sequence of heavy chain variable region (SEQ ID No: 23, CDR1, CDR2, CDR3 are underlined)
AAAVQCEVQL VESGGGVVQP GKSLRVSCAA SGFSFSNYG M HWVRQAPGKG LEWVSV IWRD GSHQ YYADSV KGRFTVSRDN ARDTLFLQMD GLRAEDTAVY YC AREDPAIV LPVLDH WGRG TLVTVSSASR TK
Amino acid sequence of light chain variable region (SEQ ID No: 24, CDR1, CDR2, CDR3 are underlined)
AAAMTQSPVS LSASVGDRVT ITCRAS QRIN SY LNWYQQKP GKAPKLLIY G AS NLPSGVPS RFSGSGSGTY FTLTISSLQP EDLATYYC QQ GYSTPLLS FG PGTKVEIK
それぞれのCDRアミノ酸配列に対して、以下の通り配列番号を付与した。 Sequence numbers were assigned to each CDR amino acid sequence as follows.
本発明により、血液原料由来の抗HBsヒト免疫グロブリン製剤にまつわる国内自給未達成問題や血液製剤の問題点などを根本的に解決することができる、安全で有効なそして安定した活性が期待される抗体製剤を提供することができる。 The present invention provides an antibody that is expected to be safe, effective, and have stable activity, which can fundamentally solve the problems of domestic self-sufficiency and blood products related to anti-HBs human immunoglobulin preparations derived from blood raw materials. A formulation can be provided.
Claims (12)
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（SQSVSTY、SEQ ID No: 4）、CDR2（DAF、SEQ ID No: 5）、およびCDR3（QQRGHWPLT、SEQ ID No: 6）；
（2） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SGGSISGHY、SEQ ID No: 7）、CDR2（IHYSGIT、SEQ ID No: 8）、およびCDR3（ARGDATYGY、SEQ ID No: 9）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（SQSLLHRNGYNY、SEQ ID No: 10）、CDR2（LGS、SEQ ID No: 11）、およびCDR3（MQALRTPWT、SEQ ID No: 12）；
（3） 重鎖の相補性決定領域、CDR1（SGFSFSNYG、SEQ ID No: 13）、CDR2（IWRDGSHQ、SEQ ID No: 14）、およびCDR3（AREDPAIVLPVLDH、SEQ ID No: 15）、および
軽鎖の相補性決定領域、CDR1（QRINSY、SEQ ID No: 16）、CDR2（GAS、SEQ ID No: 17）、およびCDR3（QQGYSTPLLS、SEQ ID No: 18）；
からなる群から選択されるいずれかの重鎖・軽鎖の相補性決定領域を含む、B型肝炎ウイルス（HBV）のHBs抗原に対して結合性を有し、HBVに対する中和活性を有する、血液原料に由来しない、抗体または抗体誘導体。 (1) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (GFMFSGHS, SEQ ID No: 1), CDR2 (IGSTGEFI, SEQ ID No: 2), and CDR3 (AREQGTRGRYYYYGLDV, SEQ ID No: 3), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (SQSVSTY, SEQ ID No: 4), CDR2 (DAF, SEQ ID No: 5), and CDR3 (QQRGHWPLT, SEQ ID No: 6);
(2) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (SGGSISGHY, SEQ ID No: 7), CDR2 (IHYSGIT, SEQ ID No: 8), and CDR3 (ARGDATYGY, SEQ ID No: 9), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (SQSLLHRNGYNY, SEQ ID No: 10), CDR2 (LGS, SEQ ID No: 11), and CDR3 (MQALRTPWT, SEQ ID No: 12);
(3) Complementarity determining regions of the heavy chain, CDR1 (SGFSFSNYG, SEQ ID No: 13), CDR2 (IWRDGSHQ, SEQ ID No: 14), and CDR3 (AREDPAIVLPVLDH, SEQ ID No: 15), and light chain complementarity sex-determining regions, CDR1 (QRINSY, SEQ ID No: 16), CDR2 (GAS, SEQ ID No: 17), and CDR3 (QQGYSTPLLS, SEQ ID No: 18);
Comprising any of the heavy chain/light chain complementarity determining regions selected from the group consisting of: having binding property to the HBs antigen of hepatitis B virus (HBV) and having neutralizing activity against HBV; Antibodies or antibody derivatives not derived from blood sources.
（1）重鎖（SEQ ID No: 25）および軽鎖（SEQ ID No: 26）を含む抗体または抗体誘導体；
（2）重鎖（SEQ ID No: 27）および軽鎖（SEQ ID No: 28）を含む抗体または抗体誘導体；
（3）重鎖（SEQ ID No: 29）および軽鎖（SEQ ID No: 30）を含む抗体または抗体誘導体；
からなる群から選択される、請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体または抗体誘導体。 The antibody or antibody derivative is
(1) An antibody or antibody derivative comprising a heavy chain (SEQ ID No: 25) and a light chain (SEQ ID No: 26);
(2) an antibody or antibody derivative comprising a heavy chain (SEQ ID No: 27) and a light chain (SEQ ID No: 28);
(3) an antibody or antibody derivative comprising a heavy chain (SEQ ID No: 29) and a light chain (SEQ ID No: 30);
The antibody or antibody derivative according to any one of claims 1 to 6, selected from the group consisting of:
前記抗体または抗体誘導体と結合した試料中のHBVを検出・測定する工程、
を含む、生体由来試料中のHBVの存在・存在量を検出・測定する方法。 contacting a biological sample collected from a subject with the antibody or antibody derivative according to any one of claims 1 to 7 in vitro;
Detecting and measuring HBV in the sample bound to the antibody or antibody derivative;
A method for detecting and measuring the presence and abundance of HBV in biological samples, including
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