JP2023066035A - Method for producing VHH antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＶＨＨ抗体の製造方法に関する。 The present invention relates to methods for producing VHH antibodies.
免疫応答における抗体は、生体が感染によって抗原と接触した後、比較的感染初期に患者の血中で増加するイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）と、その後に増加するＩｇＧ等があることが知られている。
ここで、一般的なイムノグロブリン（Ｉｇ）は軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物は、軽鎖を含まない重鎖抗体を産生することが知られている。また、重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメインは、天然のシングルドメインであり、それ自身でも抗体として機能する。このため、「シングルドメイン抗体」（以下、「ＶＨＨ抗体」と略すことがある。）と呼ばれている。
Antibodies in the immune response are known to include immunoglobulin M (IgM), which increases in the patient's blood relatively early in the infection after the body comes into contact with the antigen due to infection, and IgG, which increases thereafter. .
Here, general immunoglobulins (Ig) are composed of light and heavy chains, but camelids are known to produce heavy-chain antibodies that do not contain light chains. Also, a single domain comprising the variable region of a heavy chain antibody is a natural single domain and functions as an antibody itself. Therefore, they are called "single domain antibodies" (hereinafter sometimes abbreviated as "VHH antibodies").
ウイルスの立体構造エピトープが、例えば、酵素ポケットのような穴状の構造や、ドメイン間の割目の構造部分を含む場合、従来のＩｇＧではその大きさからこうしたエピトープに結合することができなかった。これに対し、上記のＶＨＨ抗体は、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、上記のような構造のエピトープにも結合することができ、多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る分子の幅が広くなる。 When the conformational epitope of a virus includes, for example, a hole-like structure such as an enzyme pocket or a structural portion of a cleft between domains, conventional IgG cannot bind to such an epitope due to its size. . In contrast, the VHH antibody described above has a molecular weight as small as one-tenth that of the IgG antibody, so it can also bind to an epitope having the structure described above, and can bind to many sugar chain-modified virus particles. Since it can also bind to surfaces and the like, the range of molecules that can be target molecules is widened.
さらに、ＶＨＨ抗体は耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、大腸菌、酵母等で生産することができる。このため、量産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨ抗体は１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有する。 Furthermore, VHH antibodies are excellent in acid resistance and heat resistance, and unlike IgG, they do not need to be produced in cultured cells, and can be produced in Escherichia coli, yeast, and the like. For this reason, there is an advantage that mass production is easy and purification is also easy. Furthermore, since the VHH antibody is composed of a single-chain peptide, it is easy to modify the function using techniques such as protein engineering or chemical modification, and it is easy to prepare an antibody drug conjugate (ADC). have
一般的に、抗体精製には、目的物質への特異的な親和性を利用することでワンステップにて高純度に精製することができるアフィニティークロマトグラフィーが用いられている（例えば、特許文献１）。アフィニティー担体の表面には、目的物質に対して高い特異性と親和性を有するリガンドと呼ばれる物質が固定化されている。通常、リガンドには、プロテインＡという抗体結合性タンパク質が用いられる。アフィニティークロマトグラフィーでは、プロテインＡアフィニティー担体を充填したカラムに抗体原液を通液し、抗体を特異的に吸着させた後、酸性緩衝液で抗体を脱離させることで高純度の抗体を回収する。 In general, antibody purification uses affinity chromatography, which enables high-purity purification in one step by utilizing the specific affinity for the target substance (for example, Patent Document 1). . A substance called a ligand, which has high specificity and affinity for the target substance, is immobilized on the surface of the affinity carrier. An antibody-binding protein called protein A is usually used as a ligand. In affinity chromatography, an undiluted antibody solution is passed through a column filled with a protein A affinity carrier to specifically adsorb the antibody, followed by desorption with an acidic buffer to recover a highly pure antibody.
最近、一度のクロマト精製で多量の抗体原液を高速に処理できる高い抗体結合能力を示すプロテインＡアフィニティー担体が種々開発され、抗体の生産性の大きな向上が期待されている。
しかしながら、カラムへのＶＨＨ抗体原液の負荷（吸着）量を増加させて通常の酸性条件下で溶出させると、抗体活性が低下する場合があることが判明した。
従って、本発明の課題は、高負荷量であっても抗体の活性維持が可能なＶＨＨ抗体の製造方法を提供することにある。
Recently, various protein A affinity carriers have been developed that exhibit high antibody-binding capacity, enabling high-speed processing of a large amount of undiluted antibody solution in a single chromatographic purification, and are expected to significantly improve antibody productivity.
However, it was found that when the amount of the VHH antibody undiluted solution loaded (adsorbed) onto the column was increased and elution was carried out under normal acidic conditions, the antibody activity sometimes decreased.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing a VHH antibody capable of maintaining antibody activity even at a high load.
本発明者は、抗体活性の低下の原因について検討したところ、高負荷量であると酸性条件下でのＶＨＨ抗体の分子構造の崩れと高密度化が重なることでＶＨＨ抗体が不安定となり、変性と会合化が起こりやすいことに原因があると考えられた。そこで更に検討した結果、アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数が増大する条件下で溶出させれば、ＶＨＨ抗体の会合を抑え、抗体活性の低下を回避できることを見出した。 The present inventors investigated the cause of the decrease in antibody activity, and found that when the loading amount is high, the VHH antibody becomes unstable due to the collapse of the molecular structure of the VHH antibody under acidic conditions and the increase in density, which leads to denaturation. This is thought to be due to the tendency of aggregation to occur. As a result of further investigation, it was found that elution under conditions that increase the partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody suppresses association of the VHH antibody and avoids a decrease in antibody activity.
すなわち、本発明は、次の工程（１）及び（２）：
（１）プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体の充填層体積（Ｌ）に対して、ＶＨＨ抗体の吸着量（ｇ）が４～２０ｇ／Ｌとなるように、ＶＨＨ抗体を含有する溶液を通液する工程
（２）工程（１）の後、前記アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数が０．０７～２０の範囲となる溶出液を通液する工程
を含む、ＶＨＨ抗体の製造方法を提供するものである。
That is, the present invention provides the following steps (1) and (2):
(1) A solution containing a VHH antibody is passed so that the adsorption amount (g) of the VHH antibody is 4 to 20 g/L with respect to the packed bed volume (L) of the affinity carrier with protein A as a ligand. step (2), after step (1), passing through an eluate having a partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody in the range of 0.07 to 20. It is something to do.
本発明によれば、抗体活性を維持しつつ、精製ＶＨＨ抗体を生産性良く得ることができる。 According to the present invention, purified VHH antibodies can be obtained with high productivity while maintaining antibody activity.
本発明のＶＨＨ抗体の製造方法は、次の工程（１）及び（２）：
（１）プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体の充填層体積（Ｌ）に対して、ＶＨＨ抗体の吸着量（ｇ）が４～２０ｇ／Ｌとなるように、ＶＨＨ抗体を含有する溶液を通液する工程
（２）工程（１）の後、前記アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数が０．０７～２０の範囲となる溶出液を通液する工程、を有する。
The method for producing a VHH antibody of the present invention comprises the following steps (1) and (2):
(1) A solution containing a VHH antibody is passed so that the adsorption amount (g) of the VHH antibody is 4 to 20 g/L with respect to the packed bed volume (L) of the affinity carrier with protein A as a ligand. and step (2), after step (1), passing an eluate in which the partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody is in the range of 0.07 to 20.
〔工程（１）〕
本工程は、プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体の充填層体積（Ｌ）に対して、ＶＨＨ抗体の吸着量（ｇ）が４～２０ｇ／Ｌとなるように、ＶＨＨ抗体を含有する溶液を通液する工程である。本工程により、プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体にＶＨＨ抗体を吸着させる。
[Step (1)]
In this step, a solution containing a VHH antibody is passed through so that the adsorption amount (g) of the VHH antibody is 4 to 20 g/L with respect to the packed bed volume (L) of the affinity carrier having protein A as a ligand. This is the process of liquefying. Through this step, the VHH antibody is adsorbed to the affinity carrier with protein A as a ligand.
（ＶＨＨ抗体）
ＶＨＨ抗体は、重鎖抗体の可変領域を利用した抗体である。ＶＨＨ抗体の標的分子は特に限定されない。ＶＨＨ抗体には、動物細胞で産生された抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体が含まれる。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
好適には、ＶＨＨ抗体として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するＶＨＨ抗体が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するＶＨＨ抗体は、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のうちのＳ１サブユニットに結合する抗体である。
本発明において、より好適なＶＨＨ抗体は、以下に例示するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ抗体であるＣｏＶＨＨ１と、ＶＨＨ-ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９である。当該ＣｏＶＨＨ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、本出願人により見出された抗体で、本出願人による出願（特願２０２１－０７６８０９と特願２０２１－１６２８２０）に記載されている。
(VHH antibody)
A VHH antibody is an antibody that utilizes the variable region of a heavy chain antibody. Target molecules of VHH antibodies are not particularly limited. VHH antibodies include antibodies produced in animal cells, humanized antibodies and chimeric antibodies. Since humanized antibodies can be administered to humans, they can be applied as pharmaceuticals.
Suitably, VHH antibodies include VHH antibodies that bind to SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 is a SARS-associated coronavirus that causes acute respiratory disease (COVID-19), and its viral genome is a single-stranded positive-strand RNA virus of approximately 29,903 bases. A VHH antibody that binds to SARS-CoV-2 is specifically an antibody that binds to the S1 subunit of the spike protein of SARS-CoV-2.
In the present invention, more preferred VHH antibodies are CoVHH1 and VHH-COVE1 to VHH-COVE9, which are SARS-CoV-2 VHH antibodies exemplified below. The CoVHH1 and VHH-COVE1 to VHH-COVE9 are antibodies discovered by the present applicant, and are described in the applications filed by the present applicant (Japanese Patent Application No. 2021-076809 and Japanese Patent Application No. 2021-162820).
（ＣｏＶＨＨ１）
ＣｏＶＨＨ１は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体である。
(CoVHH1)
CoVHH1 consists of CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence is substituted with another amino acid, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or one in the amino acid sequence A structure containing CDR2 consisting of an amino acid sequence in which one amino acid is substituted with another amino acid, and CDR3 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence is substituted with another amino acid An antibody that binds to SARS-CoV-2 and has one or more domains.
ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。 A CDR (Complementarity Determining Region) includes a sequence-variable antigen recognition site or a random sequence region, and is also called a hypervariable region. In the structural domain of an antibody, the three CDRs are present in the order of CDR1, CDR2 and CDR3 from the N-terminal side.
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列はＧＳＴＦＳＤＹＶＭＡであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列はＴＩＳＲＮＧＧＴＴＴであり、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＶＧＧＤＧＤＳである。 Here, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is GSTFSDYVMA, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is TISRNGGTTT, and the amino acid sequence of CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is VGGDGDS.
上記配列番号１～３で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲは、配列番号１～３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲに変異が導入されたＣＤＲを意味する。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に変異が導入されていても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能を有している限り、ＣｏＶＨＨ１のＣＤＲに包含される。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、ＣＤＲ１においては３、４、５又は１０番目が挙げられ、ＣＤＲ２においては３、４、５、６、７、８、９又は１０番目が挙げられ、ＣＤＲ３においては１、２、３又は４番目が挙げられる。
また、置換後のアミノ酸の種類は限定されないが、好ましい置換として、極性や大きさが類似のアミノ酸への置換が挙げられる。また、スレオニン残基のアスパラギン残基、イソロイシン残基またはメチオニン残基への置換、フェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、セリン残基のアルギニン残基またはアスパラギン残基への置換、アラニン残基のスレオニン残基への置換、アルギニン残基のセリン残基への置換、アスパラギン残基のチロシン残基への置換、グリシン残基のセリン残基への置換、バリン残基のフェニルアラニン残基またはイソロイシン残基への置換、アスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換も好ましい置換として挙げられる。
置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類の好ましい組み合わせとしては、ＣＤＲ１においては、３番目のスレオニン残基のアスパラギン残基への置換、４番目のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、５番目のセリン残基のアルギニン残基への置換、１０番目のアラニン残基のスレオニン残基への置換、
ＣＤＲ２においては、３番目のセリン残基のアスパラギン残基への置換、４番目アルギニン残基のセリン残基への置換、５番目のアスパラギン残基のチロシン残基への置換、６番目のグリシン残基のセリン残基への置換、７番目のグリシン残基のセリン残基への置換、８番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、９番目のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換、１０番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、
ＣＤＲ３においては、１番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、３番目のグリシン残基のバリン残基への置換、４番目のアスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換、が好ましい。
A CDR consisting of an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence shown by SEQ ID NOS: 1 to 3 is replaced with another amino acid is a CDR consisting of an amino acid sequence shown by SEQ ID NOS: 1 to 3. A mutation was introduced into the CDR. means CDRs. In addition, even if mutations are introduced into CDR1, CDR2, and CDR3, they are included in the CDRs of CoVHH1 as long as they have binding ability to SARS-CoV-2.
Here, the position of the amino acid to be substituted is not limited, but preferred positions include 3, 4, 5 or 10 in CDR1, and 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 9 in CDR2. The 10th is mentioned and in CDR3 the 1st, 2nd, 3rd or 4th is mentioned.
In addition, although the type of amino acid after substitution is not limited, preferred substitutions include substitutions with amino acids having similar polarities and sizes. In addition, substitution of threonine residue for asparagine residue, isoleucine residue or methionine residue, substitution of phenylalanine residue for isoleucine residue, substitution of serine residue for arginine residue or asparagine residue, alanine residue threonine residue, arginine residue for serine residue, asparagine residue for tyrosine residue, glycine residue for serine residue, valine residue for phenylalanine or isoleucine Preferred substitutions include substitutions with residues, and substitutions of aspartic acid residues with glycine or valine residues.
Preferred combinations of the position of the amino acid to be substituted and the type of amino acid after substitution include, in CDR1, substitution of the 3rd threonine residue with an asparagine residue, and substitution of the 4th phenylalanine residue with an isoleucine residue. , substitution of the 5th serine residue with an arginine residue, substitution of the 10th alanine residue with a threonine residue,
In CDR2, 3rd serine residue to asparagine residue, 4th arginine residue to serine residue, 5th asparagine residue to tyrosine residue, 6th glycine residue Substitution of a group with a serine residue, substitution of a glycine residue at position 7 with a serine residue, substitution of a threonine residue at position 8 with a methionine residue, substitution of a threonine residue at position 9 with an isoleucine residue , replacement of the tenth threonine residue with a methionine residue,
In CDR3, substitution of the 1st valine residue with an isoleucine residue, substitution of the 3rd glycine residue with a valine residue, substitution of the 4th aspartic acid residue with a glycine residue or a valine residue , is preferred.
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、バイオレイヤー干渉法により、平衡乖離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、表面プラズモン共鳴測定法等を用いた方法によっても評価できる。本発明における解離定数ＫＤは、バイオレイヤー干渉法によって求めたものとする。 The binding ability to SARS-CoV-2 can be evaluated by methods known to those skilled in the art. Specifically, as shown in Examples described later, it can be evaluated by obtaining the equilibrium dissociation constant KD by biolayer interferometry. In addition, evaluation can also be performed by methods using, for example, antigen-immobilized ELISA, immunochromatography, isothermal titration calorimetry, surface plasmon resonance measurement, and the like. The dissociation constant KD in the present invention is determined by biolayer interferometry.
ＣｏＶＨＨ１の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。
フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
The structural domain of CoVHH1 may have framework regions flanking CDR1, CDR2, and CDR3.
The framework region is a highly conserved region excluding the complementarity determining region in the variable region of an antibody molecule.
That is, in one aspect, the structural domain of the present invention comprises the first framework region (FR1), CDR1, second framework region (FR2), CDR2, third framework region (FR3), CDR3 and fourth framework Examples include those having the region (FR4) in this order.
Amino acid sequences of the framework regions in the structural domains include the following.
FR1: amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or amino acid sequence having 80% or more identity with said amino acid sequence FR2: amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5 or amino acid sequence having 80% or more identity with said amino acid sequence FR3: amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 or amino acid sequence having 80% or more identity with said amino acid sequence FR4: amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 or amino acid sequence having 80% or more identity with said amino acid sequence
配列番号４～７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。 A framework region consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 7 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and more A framework region consisting of an amino acid sequence having an identity of preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more is included.
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列の同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて解析を行なうことにより算出できる。 Here, the identity of amino acid sequences refers to the ratio (%) of the number of positions where identical amino acid residues are present in both sequences when two amino acid sequences are aligned, relative to the total number of amino acid residues. Sequence identity can be calculated by analysis using, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
ＣｏＶＨＨ１のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号７で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号８）を有する抗体が好適である。 Of CoVHH1, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 are linked in this order, CDR1 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, CDR2 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, and CDR3 is SEQ ID NO. 3, FR1 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, FR2 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5, FR3 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6, and FR4 is shown by SEQ ID NO: 7. Antibodies with structural domains that are amino acid sequences (SEQ ID NO: 8) are preferred.
（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）
ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、下記の配列番号９～３５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体である。
(VHH-COVE1 to VHH-COVE9)
VHH-COVE1 to VHH-COVE9 consist of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 9 to 35 below or amino acid sequences in which at least one amino acid is substituted with another amino acid, CDR1, CDR2 and CDR3, respectively. An antibody that binds to SARS-CoV-2 having one or more structural domains comprising
ここで、置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類は、これらのアミノ酸配列の抗原との解離定数が１００ｎＭ以上とならない限り、限定されないが好ましくは１個の置換である。 Here, the position of the amino acid to be substituted and the type of amino acid after substitution are not limited as long as the dissociation constant with the antigen of these amino acid sequences is 100 nM or more, but preferably one substitution.
上記ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～９のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の点から、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９が好ましい。 Among the above VHH-COVE1 to 9, VHH-COVE2, VHH-COVE5, VHH-COVE8 and VHH-COVE9 are preferred in terms of neutralizing activity against SARS-CoV-2.
ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を有するものであってもよい。
ＦＲ１は配列番号３６～４２に示すアミノ酸配列であってもよく、ＦＲ２は配列番号４３～５０に示すアミノ酸配列であってもよい。ＦＲ３は、配列番号５１～５８に示すアミノ酸配列であってもよく、ＦＲ４は配列番号５９～６１に示すヌクレオチド配列で規定されるアミノ酸配列であってもよい。
The structural domains of VHH-COVE1 to VHH-COVE9 may have framework regions (FR1 to FR4) at both ends of CDR1, CDR2 and CDR3.
FR1 may have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs:36-42, and FR2 may have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs:43-50. FR3 may be the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs:51-58 and FR4 may be the amino acid sequence defined by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs:59-61.
また、ＦＲ１～ＦＲ４は、上記の配列番号３６～６１に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号３６～６１に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号３６～６１に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有する配列であることがより好ましく、さらに好ましくは９０％以上である。９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域であることが、さらに好ましい。
アミノ酸配列の同一性は前述したとおりである。
In addition, FR1 to FR4 preferably contain amino acid sequences having 80% or more identity with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS:36 to 61 above. Here, the amino acid sequences having 80% or more identity with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 36-61 are preferably sequences having 85% or more identity with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 36-61. It is preferably 90% or more, more preferably 90% or more. More preferred are framework regions consisting of amino acid sequences having 99% or more identity.
Amino acid sequence identity is as described above.
ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、例えば、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に連結されたものを挙げることができる。これらの領域のアミノ酸配列は、上述したとおり、配列表の配列番号９～６１で示され、前述したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の当該領域のアミノ酸配列は、配列番号６２（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１）、配列番号６３（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２）、配列番号６４（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３）、配列番号６５（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４）、配列番号６６（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５）、配列番号６７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６）、配列番号６８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７）、配列番号６９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８）、配列番号７０（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）に示すものとなっている。 Examples of VHH-COVE1 to VHH-COVE9 include those linked in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 from the N-terminal side to the C-terminal side. As described above, the amino acid sequences of these regions are shown in SEQ ID NOs: 9 to 61 in the sequence listing. SEQ ID NO: 63 (VHH-COVE2), SEQ ID NO: 64 (VHH-COVE3), SEQ ID NO: 65 (VHH-COVE4), SEQ ID NO: 66 (VHH-COVE5), SEQ ID NO: 67 (VHH-COVE6), SEQ ID NO: 68 (VHH -COVE7), SEQ ID NO: 69 (VHH-COVE8), and SEQ ID NO: 70 (VHH-COVE9).
ＶＨＨ抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、ＶＨＨ抗体をコードする核酸を適当なベクター（例えば、プラスミド）に組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。 The method for producing VHH antibodies is not particularly limited, and they can be easily produced by techniques known in the art. For example, it can be prepared by combining a peptide solid-phase synthesis method and a native chemical ligation (NCL) method, or by genetic engineering. A preferred method is to incorporate it into (eg, a plasmid), introduce it into a host cell, and produce it as a recombinant antibody.
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、バチルス（Bacillus）属細菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。なかでも、生産性の点から、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌である。
バチルス（Bacillus）属細菌は、具体的には、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus anthracis、Bacillus stearotheromophilus、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacillus halodurans、Bacillus brevis(Brevibacillus brevis)、Bacillus choshinensis (Brevibacillus choshinensis）、Bacillus pumilus、Bacillus alcalophilus、Bacilus amylolyticus、Bacilus amyloliquefaciens、Bacilus liqueniformis、Bacillus polymyxa(Paenibacillus polymyxa)、Bacillus sphaericus、Bacillus firmus、Bacillus clausii、Bacillus macerans等を挙げることができる。なかでも、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）又はバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）が好ましい。
なお、Bacillus brevisはBrevibacillus属に分類されて、株によってBrevibacillus brevisあるいはBrevibacillus choshinensis等と記載される場合があり、Bacillus polymyxaはPaenibacillus属に分類されてPaenibacillus polymyxaと記載される場合があり、Bacillus stearotheromophilusはGeobacillus属に分類されてGeobacillus stearotheromophilusと記載される場合がある。しかしながら、本明細書においては、Bacillus brevis、Bacillus polymyxa、及びBacillus stearotheromophilusは、共にBacillus属に属する細菌として定義する。すなわち、本発明において、Bacillus属細菌といった場合、Brevibacillus brevis、Brevibacillus choshinensisと記載される細菌、Paenibacillus polymyxaと記載される細菌及びGeobacillus stearotheromophilusと記載される細菌を含む意味として解釈する。
Host cells used in the production of recombinant antibodies include, for example, E. coli, bacteria of the genus Bacillus, fungi, animal cells, plant cells, baculovirus/insect cells, yeast cells, and the like. Among them, bacteria belonging to the genus Bacillus are preferred from the viewpoint of productivity.
Bacillus genus bacteria are specifically Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus stearotheromophilus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus halodurans, Bacillus brevis (Brevibacillus brevis), Bacillus choshinensis (Brevibacillus choshinensis) , Bacillus pumilus, Bacillus alcalophilus, Bacilus amylolyticus, Bacilus amyloliquefaciens, Bacillus liqueniformis, Bacillus polymyxa (Paenibacillus polymyxa), Bacillus sphaericus, Bacillus firmus, Bacillus clausii, Bacillus macerans and the like. Among them, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium or Bacillus brevis is preferable.
Bacillus brevis is classified into the genus Brevibacillus and may be described as Brevibacillus brevis or Brevibacillus choshinensis depending on the strain, Bacillus polymyxa is classified into the genus Paenibacillus and may be described as Paenibacillus polymyxa, and Bacillus stearotheromophilus is It is sometimes classified into the genus Geobacillus and described as Geobacillus stearotheromophilus. However, in the present specification, Bacillus brevis, Bacillus polymyxa, and Bacillus stearotheromophilus are all defined as bacteria belonging to the genus Bacillus. That is, in the present invention, bacteria of the genus Bacillus are interpreted as including bacteria described as Brevibacillus brevis, Brevibacillus choshinensis, bacteria described as Paenibacillus polymyxa, and bacteria described as Geobacillus stearotheromophilus.
抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
As an expression vector for expressing an antibody, a vector suitable for various host cells can be used. Expression vectors include, for example, E. coli-derived vectors such as pBR322, pBR325, pUC12 and pUC13; Bacillus subtilis-derived vectors such as pUB110, pTP5 and pC194; Shuttle vectors such as pHY300PLK that can be shared between E. coli and Bacillus subtilis; Yeast-derived vectors such as pSH19 and pSH15; bacteriophages such as λ phage; viruses such as adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, vaccinia virus and baculovirus; and vectors modified from these.
These expression vectors have replication origins, selection markers and promoters suitable for each vector, and if necessary, enhancers, transcription assembly sequences (terminators), ribosome binding sites, polyadenylation signals and the like. may have. Furthermore, in order to facilitate purification of the expressed polypeptide, the expression vector may have inserted therein a base sequence for fusing and expressing FLAG tag, His tag, HA tag, GST tag, or the like.
発現させたＶＨＨ抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。 When extracting the expressed VHH antibody from cultured bacterial bodies or cultured cells, the bacterial bodies or cultured cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and treated with ultrasonic waves, lysozyme and/or cells. Alternatively, after disrupting the cells or cells by freezing and thawing, a soluble extract is obtained by centrifugation or filtration.
本発明では、ＶＨＨ抗体を含有する溶液として、前述した可溶性抽出液等の培養液由来の溶液を用いることが工業的生産性の点から好ましい。
ＶＨＨ抗体を含有する溶液におけるＶＨＨ抗体の含有量は、吸着性の点、工程時間の点から、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．３ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、また、吸着性の点、ＶＨＨ抗体分子の安定溶解性の点から、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ以下、より更に好ましくは５ｇ／Ｌ以下である。
In the present invention, as the solution containing the VHH antibody, it is preferable to use a solution derived from the culture medium, such as the soluble extract described above, from the standpoint of industrial productivity.
The content of the VHH antibody in the solution containing the VHH antibody is preferably 0.01 g/L or more, more preferably 0.1 g/L or more, still more preferably 0.3 g, from the viewpoints of adsorption and process time. /L or more, more preferably 0.5 g/L or more, and preferably 50 g/L or less, more preferably 20 g/L or less, in terms of adsorption and stable solubility of VHH antibody molecules. It is preferably 10 g/L or less, more preferably 5 g/L or less.
（プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体）
本工程で用いられるプロテインＡは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の細胞壁に存在する膜タンパク質であり、免疫グロブリンＧ（抗体）等の定常領域に特異的に結合することが知られている。プロテインＡは、天然型、改変したもののいずれでもよい。例えば、アルカリ耐性を向上させた改変プロテインＡ等が知られている。
プロテインＡは、特に限定されず、黄色ブドウ球菌より抽出精製されたもの、遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができる。
(Affinity carrier with protein A as a ligand)
Protein A used in this step is a membrane protein present in the cell wall of Staphylococcus aureus, and is known to specifically bind to constant regions such as immunoglobulin G (antibody). Protein A may be either natural or modified. For example, modified protein A with improved alkali tolerance is known.
Protein A is not particularly limited, and those extracted and purified from Staphylococcus aureus, those produced by genetic recombination techniques, and the like can be used.
アフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィーに用いられる生体分子を特異的かつ可逆的に吸着する能力をもつ不溶性の担体である。担体基材としては、合成高分子、多糖類天然高分子、シリカゲル、多孔性ガラス等が挙げられる。合成高分子としては、ポリスチレン、架橋ポリスチレン等のスチレン系樹脂、アクリル系樹脂、メタクリル系樹脂等が挙げられる。天然高分子としては、アガロース、デキストラン、セルロース、プルラン等の多糖類が挙げられる。
アフィニティー担体の形状としては、粒子状、繊維状、膜状、モノリス状等が挙げられる。好ましくは、粒子状である。担体は、多孔性でも非多孔性でもよい。
アフィニティー担体の平均粒子径は、吸脱着性、圧力損失の観点から、好ましくは１～１０００μｍ、より好ましくは１０～５００μｍである。平均粒子径は、担体を蒸留水に分散し、粒子径分布測定装置（例えば、ＬＡ－９２０、堀場製作所社）を用いて測定することができる。
また、細孔径は、吸着容量、吸脱着性の観点から、好ましくは１０～１０００ｎｍ、より好ましくは２０～２００ｎｍである。
Affinity carriers are insoluble carriers that have the ability to specifically and reversibly adsorb biomolecules used in affinity chromatography. Examples of carrier substrates include synthetic polymers, polysaccharide natural polymers, silica gel, porous glass, and the like. Examples of synthetic polymers include styrene-based resins such as polystyrene and crosslinked polystyrene, acrylic-based resins, and methacrylic-based resins. Natural polymers include polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose, and pullulan.
The shape of the affinity carrier includes particulate, fibrous, membranous, monolithic and the like. Preferably, it is particulate. A carrier may be porous or non-porous.
The average particle size of the affinity carrier is preferably 1-1000 μm, more preferably 10-500 μm, from the viewpoint of adsorption/desorption properties and pressure loss. The average particle size can be measured by dispersing the carrier in distilled water and using a particle size distribution analyzer (eg, LA-920, Horiba Ltd.).
Also, the pore diameter is preferably 10 to 1000 nm, more preferably 20 to 200 nm, from the viewpoint of adsorption capacity and adsorption/desorption properties.
アフィニティー担体へプロテインＡを固定化する方法は、タンパク質を担体に固定化する一般的な方法により行うことができる。また、アフィニティー担体とリガンドであるプロテインＡとの間に、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類等のスペーサーを導入してもよい。 A method for immobilizing protein A on an affinity carrier can be carried out by a general method for immobilizing proteins on a carrier. A spacer such as a polymethylene chain, a polyethylene glycol chain, or a sugar may be introduced between the affinity carrier and protein A as a ligand.
プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体は、商業的に入手したものを使用することができる。例えば、市販品として、Ａｍｐｓｈｅｒｅ Ａ３（ＪＳＲライフサイエンス社製）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）、Ｐｒａｅｓｔｏ ＡＰ（ピュロライト社製）、ＫａｎＣａｐＡ ３Ｇ（カネカ社製）等がある。 A commercially available affinity carrier with protein A as a ligand can be used. For example, commercially available products include Ampshere A3 (manufactured by JSR Life Sciences), MabSelect Sure (manufactured by GE Healthcare), Praesto AP (manufactured by Purolite), KanCapA 3G (manufactured by Kaneka), and the like.
（平衡化）
ＶＨＨ抗体を含有する溶液を通液する前においては、カラムへ、りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の中性緩衝液に必要に応じて塩化ナトリウムや硫酸ナトリウム等の無機塩を添加した溶液を通液し、予め平衡化を行うことが好ましい。
緩衝液の濃度は、吸着性の点、活性維持性の点から、好ましくは０．５ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは２ｍＭ以上、更に好ましくは３ｍＭ以上であり、また、同様の点から、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２５ｍＭ以下、更に好ましくは１５ｍＭ以下である。
塩濃度は、吸着性の点、活性維持性の点から、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上、更に好ましくは１００ｍＭ以上であり、また、同様の点から、好ましくは１５００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、更に好ましくは２００ｍＭ以下である。
(Equilibration)
Before the solution containing the VHH antibody is passed through the column, a solution prepared by adding an inorganic salt such as sodium chloride or sodium sulfate to a neutral buffer such as phosphate buffered saline (PBS) as necessary. It is preferable to pass through and equilibrate in advance.
The concentration of the buffer solution is preferably 0.5 mM or higher, more preferably 1 mM or higher, still more preferably 2 mM or higher, still more preferably 3 mM or higher, from the viewpoints of adsorption and activity maintenance. Therefore, it is preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, still more preferably 25 mM or less, and still more preferably 15 mM or less.
The salt concentration is preferably 5 mM or higher, more preferably 50 mM or higher, and still more preferably 100 mM or higher from the viewpoints of adsorptivity and activity maintenance. It is 1000 mM or less, more preferably 200 mM or less.
平衡化に用いる溶液のｐＨ（２０℃、以下同じ）は、吸着性の点、活性維持性の点から、好ましくはｐＨ５．５以上、より好ましくはｐＨ６．０以上、更に好ましくはｐＨ６．５以上、更に好ましくはｐＨ７．０以上であり、また、同様の点から、好ましくはｐＨ９．０以下、より好ましくはｐＨ８．５以下、更に好ましくはｐＨ８．０以下、更に好ましくはｐＨ７．５以下である。 The pH of the solution used for equilibration (at 20°C, the same shall apply hereinafter) is preferably pH 5.5 or higher, more preferably pH 6.0 or higher, and still more preferably pH 6.5 or higher, from the viewpoints of adsorptivity and activity maintenance. , more preferably pH 7.0 or higher, and from the same point of view, preferably pH 9.0 or lower, more preferably pH 8.5 or lower, still more preferably pH 8.0 or lower, and still more preferably pH 7.5 or lower .
カラム温度は、吸着性の点、活性維持性の点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは２℃以上であり、また、同様の点から、好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃以下である。 The column temperature is preferably 0° C. or higher, more preferably 2° C. or higher, from the viewpoints of adsorptivity and activity maintenance, and is preferably 35° C. or lower, more preferably 30° C. or lower from the same point of view. is.
通液速度（空間速度、ＳＶ）は、吸着性の点、活性維持性の点、及び工程時間の点から、好ましくは０．１／ｈｒ以上、より好ましくは１／ｈｒ以上、更に好ましくは２／ｈｒ以上、更に好ましくは３／ｈｒ以上であり、また、吸着性の点、活性維持性の点から、好ましくは２５／ｈｒ以下、より好ましくは２０／ｈｒ以下、更に好ましくは１５／ｈｒ以下、更に好ましくは１０／ｈｒ以下である。
また、通液量（ＢＶ）は、吸着性の点、活性維持性の点、及び工程時間の点から、好ましくは１以上、より好ましくは１．５以上、更に好ましくは２以上、更に好ましくは２．５以上である。上限は特に限定されないが、ＶＨＨ抗体の吸着収率の点から、好ましくは１００以下、より好ましくは３０以下、更に好ましくは１０以下である。
The flow rate (space velocity, SV) is preferably 0.1/hr or more, more preferably 1/hr or more, and still more preferably 2 from the viewpoints of adsorptivity, activity maintenance, and process time. /hr or more, more preferably 3/hr or more, and preferably 25/hr or less, more preferably 20/hr or less, still more preferably 15/hr or less from the viewpoint of adsorption and activity maintenance. , more preferably 10/hr or less.
In addition, the flow rate (BV) is preferably 1 or more, more preferably 1.5 or more, still more preferably 2 or more, and still more preferably 2.5 or more. Although the upper limit is not particularly limited, it is preferably 100 or less, more preferably 30 or less, and still more preferably 10 or less from the viewpoint of VHH antibody adsorption yield.
（吸着）
本工程では、ＶＨＨ抗体を含有する溶液を、プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体の充填層体積（Ｌ）に対して、ＶＨＨ抗体の吸着量（ｇ）が４～２０ｇ／Ｌとなるように通液する。このようなクロマト精製によってＶＨＨ抗体の生産性の大きな向上が見込まれる。
プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体の充填層体積（Ｌ）に対するＶＨＨ抗体の吸着量（ｇ）は、ＶＨＨ抗体の生産性の点から、好ましくは４ｇ／Ｌ以上、より好ましくは５ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは７ｇ／Ｌ以上であり、また、ＶＨＨ抗体の吸着収率の点から、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１５ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
(adsorption)
In this step, a solution containing a VHH antibody is passed through so that the adsorption amount (g) of the VHH antibody is 4 to 20 g/L with respect to the packed bed volume (L) of the affinity carrier having protein A as a ligand. liquid. Such chromatographic purification is expected to greatly improve the productivity of VHH antibodies.
The adsorption amount (g) of the VHH antibody to the packed bed volume (L) of the affinity carrier with protein A as a ligand is preferably 4 g/L or more, more preferably 5 g/L or more, from the viewpoint of VHH antibody productivity, It is more preferably 7 g/L or more, and is preferably 20 g/L or less, more preferably 15 g/L or less, still more preferably 10 g/L or less from the viewpoint of VHH antibody adsorption yield.
カラム温度は、吸着性の点、活性維持性の点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは２℃以上であり、また、同様の点から、好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃以下である。 The column temperature is preferably 0° C. or higher, more preferably 2° C. or higher, from the viewpoints of adsorptivity and activity maintenance, and is preferably 35° C. or lower, more preferably 30° C. or lower from the same point of view. is.
通液速度（空間速度、ＳＶ）は、吸着性の点、工程時間の点から、好ましくは０．１／ｈｒ以上、より好ましくは１／ｈｒ以上、更に好ましくは２／ｈｒ以上、更に好ましくは３／ｈｒ以上であり、また、吸着性の点から、好ましくは２５／ｈｒ以下、より好ましくは２０／ｈｒ以下、更に好ましくは１５／ｈｒ以下、更に好ましくは１０／ｈｒ以下である。
通液量（ＢＶ）は、吸着性の点、活性維持性の点、及び工程時間の点から、好ましくは０．１以上、より好ましくは１以上であり、また、同様の点から、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下、更に好ましくは５０以下である。
The flow rate (space velocity, SV) is preferably 0.1/hr or more, more preferably 1/hr or more, still more preferably 2/hr or more, and still more preferably 3/hr or more, and preferably 25/hr or less, more preferably 20/hr or less, even more preferably 15/hr or less, still more preferably 10/hr or less from the viewpoint of adsorptive properties.
The flow rate (BV) is preferably 0.1 or more, more preferably 1 or more, from the viewpoints of adsorptivity, activity maintenance, and process time. It is 200 or less, more preferably 100 or less, and still more preferably 50 or less.
（洗浄）
工程（１）の後は、工程（２）の前に、アフィニティー担体の充填層に洗浄液を通液し洗浄する工程を行うことが好ましい。洗浄の回数は、１回又は複数回でもよい。
洗浄液としては、りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の中性緩衝液に必要に応じて塩化ナトリウムや硫酸ナトリウム等の無機塩を添加した洗浄液が挙げられる。
緩衝液の濃度は、収率の点、活性維持性の点、及び精製度の点から、好ましくは０．５ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは２ｍＭ以上、更に好ましくは３ｍＭ以上であり、また、同様の点から、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２５ｍＭ以下、更に好ましくは１５ｍＭ以下である。
塩濃度は、収率の点、活性維持性の点、及び精製度の点から、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上、更に好ましくは１００ｍＭ以上であり、また、同様の点から、好ましくは１５００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、更に好ましくは２００ｍＭ以下である。
(Washing)
After step (1) and before step (2), it is preferable to carry out a step of washing by passing a washing liquid through the packed layer of the affinity carrier. The number of washings may be one or more.
Examples of the washing liquid include a washing liquid obtained by adding an inorganic salt such as sodium chloride or sodium sulfate to a neutral buffer such as phosphate buffered saline (PBS) as necessary.
The concentration of the buffer solution is preferably 0.5 mM or higher, more preferably 1 mM or higher, still more preferably 2 mM or higher, and still more preferably 3 mM or higher, in terms of yield, activity maintenance, and purity. Also, from the same point of view, it is preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, still more preferably 25 mM or less, still more preferably 15 mM or less.
The salt concentration is preferably 5 mM or higher, more preferably 50 mM or higher, and still more preferably 100 mM or higher from the viewpoints of yield, activity retention, and purity. It is 1500 mM or less, more preferably 1000 mM or less, and still more preferably 200 mM or less.
洗浄液のｐＨ（２０℃）は、収率の点、活性維持性の点から、好ましくはｐＨ４．５以上、より好ましくはｐＨ５．５以上、更に好ましくはｐＨ６．５以上、更に好ましくはｐＨ７．０以上であり、また、同様の点から、好ましくはｐＨ９．０以下、より好ましくはｐＨ８．５以下、更に好ましくはｐＨ８．０以下、更に好ましくはｐＨ７．５以下である。 The pH (20°C) of the washing solution is preferably pH 4.5 or higher, more preferably pH 5.5 or higher, still more preferably pH 6.5 or higher, and still more preferably pH 7.0, from the viewpoint of yield and activity maintenance. From the same point of view, the pH is preferably 9.0 or less, more preferably 8.5 or less, still more preferably 8.0 or less, and still more preferably 7.5 or less.
カラム温度は、収率の点、活性維持性の点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは２℃以上であり、また、同様の点から、好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃以下である。 The column temperature is preferably 0° C. or higher, more preferably 2° C. or higher, from the viewpoint of yield and activity maintenance, and is preferably 35° C. or lower, more preferably 30° C. or lower from the same viewpoint. is.
通液速度（空間速度、ＳＶ）は、収率の点、精製度の点、及び工程時間の点から、好ましくは０．１／ｈｒ以上、より好ましくは１／ｈｒ以上、更に好ましくは２／ｈｒ以上、更に好ましくは３／ｈｒ以上であり、また、収率の点、精製度の点から、好ましくは２５／ｈｒ以下、より好ましくは２０／ｈｒ以下、更に好ましくは１５／ｈｒ以下、更に好ましくは１０／ｈｒ以下である。
また、通液量（ＢＶ）は、収率の点、精製度の点、及び工程時間の点から、好ましくは１以上、より好ましくは１．５以上、更に好ましくは２以上、更に好ましくは３以上である。上限は特に限定されないが、工程時間、経済性の点から、好ましくは１００以下、より好ましくは３０以下、更に好ましくは１０以下である。
The liquid flow rate (space velocity, SV) is preferably 0.1/hr or more, more preferably 1/hr or more, and still more preferably 2/hr from the viewpoint of yield, degree of purification, and process time. hr or more, more preferably 3/hr or more, and in terms of yield and purity, preferably 25/hr or less, more preferably 20/hr or less, further preferably 15/hr or less, and further It is preferably 10/hr or less.
In addition, the flow rate (BV) is preferably 1 or more, more preferably 1.5 or more, still more preferably 2 or more, and still more preferably 3 from the viewpoint of yield, degree of purification, and process time. That's it. Although the upper limit is not particularly limited, it is preferably 100 or less, more preferably 30 or less, and still more preferably 10 or less from the viewpoint of process time and economy.
〔工程（２）〕
本工程は、工程（１）の後、前記アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数が０．０７～２０の範囲となる溶出液を通液する工程であり、当該工程によりＶＨＨ抗体を溶出させ、溶出液を回収することで、目的とするＶＨＨ抗体をその活性を低下させることなく得ることができる。溶出工程は、１回又は複数回行うことができる。
[Step (2)]
This step is, after step (1), a step of passing an eluate in which the partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody is in the range of 0.07 to 20, and the VHH antibody is eluted by this step. By collecting the eluate, the desired VHH antibody can be obtained without lowering its activity. The elution step can be performed once or multiple times.
アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数は、収率の点、活性維持性の点から、好ましくは０．０７以上、より好ましくは０．１以上、更に好ましくは０．３以上、より更に好ましくは０．５以上、より更に好ましくは０．７以上、より更に好ましくは１以上であり、また、同様の点から、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、更に好ましくは７以下、より更に好ましくは５以下、より更に好ましくは３以下、より更に好ましくは２以下、より更に好ましくは１．４以下である。
アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数の算出方法の詳細は実施例に記載した。
The partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody is preferably 0.07 or more, more preferably 0.1 or more, still more preferably 0.3 or more, still more preferably 0.3 or more, from the viewpoint of yield and activity retention. is 0.5 or more, more preferably 0.7 or more, still more preferably 1 or more, and from the same point of view, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, still more preferably 7 or less, and even more It is preferably 5 or less, more preferably 3 or less, still more preferably 2 or less, and even more preferably 1.4 or less.
Details of the method for calculating the partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody are described in Examples.
溶出液は、アフィニティー担体に吸着したＶＨＨ抗体を脱離、溶出することができるものである。溶出液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、グリシン－塩酸緩衝液、りん酸緩衝液等が挙げられる。好ましくはグリシンを含有する緩衝液である。
緩衝液の濃度は、収率の点、活性維持性の点から、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上、更に好ましくは８０ｍＭ以上であり、また、同様の点から、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは１５０ｍＭ以下、更に好ましくは１２０ｍＭ以下である。
塩濃度は、収率の点、活性維持性の点から、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、更に好ましくは５０ｍＭ以上、更に好ましくは８０ｍＭ以上であり、また、同様の点から、好ましくは１５００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、更に好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１２０ｍＭ以下である。
The eluate is capable of desorbing and eluting the VHH antibody adsorbed to the affinity carrier. Examples of the eluent include acetate buffer, citrate buffer, tartrate buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, phosphate buffer and the like. A buffer containing glycine is preferred.
The concentration of the buffer solution is preferably 5 mM or higher, more preferably 50 mM or higher, and still more preferably 80 mM or higher from the viewpoint of yield and activity maintenance. It is preferably 150 mM or less, more preferably 120 mM or less.
The salt concentration is preferably 5 mM or higher, more preferably 10 mM or higher, still more preferably 50 mM or higher, and still more preferably 80 mM or higher from the viewpoint of yield and activity maintenance. It is 1500 mM or less, more preferably 1000 mM or less, still more preferably 200 mM or less, still more preferably 120 mM or less.
溶出液のｐＨは、収率の点、活性維持性の点から、好ましくはｐＨ２．８以上、より好ましくはｐＨ３．０以上、更に好ましくはｐＨ３．２以上、より更に好ましくはｐＨ３．３以上であり、また、同様の点から、好ましくはｐＨ４．０以下、より好ましくはｐＨ３．８以下、更に好ましくはｐＨ３．７以下、より更に好ましくはｐＨ３．６以下、より更に好ましくはｐＨ３．５以下である。 The pH of the eluate is preferably pH 2.8 or higher, more preferably pH 3.0 or higher, still more preferably pH 3.2 or higher, and even more preferably pH 3.3 or higher, in terms of yield and activity maintenance. Also, from the same point, it is preferably pH 4.0 or less, more preferably pH 3.8 or less, still more preferably pH 3.7 or less, still more preferably pH 3.6 or less, and even more preferably pH 3.5 or less. be.
カラム温度は、収率の点、活性維持性の点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは２℃以上であり、また、同様の点から、好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃以下である。 The column temperature is preferably 0° C. or higher, more preferably 2° C. or higher, from the viewpoint of yield and activity maintenance, and is preferably 35° C. or lower, more preferably 30° C. or lower from the same viewpoint. is.
通液速度（空間速度、ＳＶ）は、収率の点、精製度の点、及び工程時間の点から、好ましくは０．１／ｈｒ以上、より好ましくは１／ｈｒ以上、更に好ましくは２／ｈｒ以上、更に好ましくは３／ｈｒ以上であり、また、収率の点、精製度の点から、好ましくは２５／ｈｒ以下、より好ましくは２０／ｈｒ以下、更に好ましくは１５／ｈｒ以下、更に好ましくは１０／ｈｒ以下である。
また、通液量（ＢＶ）は、収率の点、工程時間の点、活性維持制、及び液量を考慮して、好ましくは１以上、より好ましくは１．５以上、更に好ましくは２以上、更に好ましくは２．５以上であり、また、工程時間、ＶＨＨ抗体濃度低下による後工程の精製負荷の点から、好ましくは１００以下、より好ましくは３０以下、更に好ましくは１０以下である。
The liquid flow rate (space velocity, SV) is preferably 0.1/hr or more, more preferably 1/hr or more, and still more preferably 2/hr from the viewpoint of yield, degree of purification, and process time. hr or more, more preferably 3/hr or more, and in terms of yield and purity, preferably 25/hr or less, more preferably 20/hr or less, further preferably 15/hr or less, and further It is preferably 10/hr or less.
In addition, the flow volume (BV) is preferably 1 or more, more preferably 1.5 or more, and still more preferably 2 or more in consideration of yield, process time, activity maintenance, and liquid volume. , more preferably 2.5 or more, and preferably 100 or less, more preferably 30 or less, still more preferably 10 or less, from the viewpoint of the process time and the purification load in the post-process due to the decrease in VHH antibody concentration.
本発明において、工程（２）におけるＶＨＨ抗体の収率は、８０質量％以上という高い収率とすることができる。 In the present invention, the yield of VHH antibodies in step (2) can be as high as 80% by mass or more.
（中和）
工程（２）の後は、溶出されたＶＨＨ抗体を中性又はアルカリ性の溶液と混合し中和する工程を行うことが好ましい。
中性又はアルカリ性の溶液としては、トリス－塩酸緩衝液等の緩衝液が挙げられる。当該溶液のｐＨは、活性維持性の点から、好ましくはｐＨ６以上、より好ましくはｐＨ７以上、更に好ましくはｐＨ８以上、更に好ましくはｐＨ８．５以上であり、また、同様の点から、好ましくはｐＨ１４以下、より好ましくはｐＨ１１以下、更に好ましくはｐＨ１０以下、更に好ましくはｐＨ９．５以下である。
(neutralization)
After step (2), it is preferable to perform a step of neutralizing the eluted VHH antibody by mixing it with a neutral or alkaline solution.
Neutral or alkaline solutions include buffers such as Tris-HCl buffer. The pH of the solution is preferably pH 6 or higher, more preferably pH 7 or higher, still more preferably pH 8 or higher, and still more preferably pH 8.5 or higher from the viewpoint of activity maintenance. Below, the pH is more preferably 11 or less, still more preferably 10 or less, and still more preferably 9.5 or less.
中和後のＶＨＨ抗体を含む溶出液のｐＨは、活性維持性の点から、好ましくはｐＨ６以上、より好ましくはｐＨ７以上であり、また、同様の点から、好ましくはｐＨ１０以下、より好ましくはｐＨ９以下である。 The pH of the eluate containing the VHH antibody after neutralization is preferably pH 6 or higher, more preferably pH 7 or higher, from the viewpoint of activity maintenance, and is preferably pH 10 or lower, more preferably pH 9 from the same viewpoint. It is below.
（再生）
また、アフィニティー担体の再生工程を行ってもよい。アフィニティー精製用カラムは、通常、アルカリ溶液で洗浄、平衡化されて繰り返し使用される。
アルカリ溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等の溶液が挙げられる。
アルカリ溶液の濃度は、収率の点、精製度の点から、好ましくは０．０５Ｍ以上、より好ましくは０．１Ｍ以上であり、また、同様の点から、好ましくは１Ｍ以下、より好ましくは０．５Ｍ以下である。
通液速度（空間速度、ＳＶ）は、収率の点、精製度の点、及び工程時間の点から、好ましくは０．１／ｈｒ以上、より好ましくは１／ｈｒ以上、更に好ましくは１．５／ｈｒ以上であり、また、収率の点、精製度の点から、好ましくは２５／ｈｒ以下、より好ましくは２０／ｈｒ以下、更に好ましくは１５／ｈｒ以下、更に好ましくは１０／ｈｒ以下である。
また、通液量（ＢＶ）は、収率の点、精製度の点、及び工程時間の点から、好ましくは１以上、より好ましくは１．５以上、更に好ましくは２以上である。上限は特に限定されないが、同様の点から、好ましくは１００以下、より好ましくは３０以下、更に好ましくは１０以下である。
(reproduction)
Also, a regeneration step of the affinity carrier may be performed. Affinity purification columns are usually washed and equilibrated with an alkaline solution and used repeatedly.
Alkaline solutions include solutions of sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine, tetrabutylammonium hydroxide, and the like.
The concentration of the alkaline solution is preferably 0.05 M or more, more preferably 0.1 M or more, from the viewpoint of yield and purity, and is preferably 1 M or less, more preferably 0 from the same viewpoint. .5M or less.
The flow rate (space velocity, SV) is preferably 0.1/hr or more, more preferably 1/hr or more, still more preferably 1.0/hr or more, from the viewpoints of yield, degree of purification, and process time. 5/hr or more, and preferably 25/hr or less, more preferably 20/hr or less, still more preferably 15/hr or less, and still more preferably 10/hr or less in terms of yield and purity. is.
In addition, the flow rate (BV) is preferably 1 or more, more preferably 1.5 or more, and still more preferably 2 or more in terms of yield, purity and process time. Although the upper limit is not particularly limited, it is preferably 100 or less, more preferably 30 or less, and still more preferably 10 or less from the same point of view.
このような処理の結果、ＶＨＨ抗体が精製され、精製ＶＨＨ抗体が得られる。
本発明により得られたＶＨＨ抗体は、そのまま使用することもできるが、更に必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等により精製して使用することができる。
As a result of such treatment, the VHH antibody is purified to obtain a purified VHH antibody.
The VHH antibody obtained according to the present invention can be used as it is, or if necessary, it can be used after being purified by ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography or the like.
［ＶＨＨ発現枯草菌変異株作製材料］
（１）菌株
枯草菌（Bacillus subtilis）１６８株（以下、１６８株という）から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸ）の欠損株を作製した。以下、得られた細胞外プロテアーゼ単一欠損株をそれぞれΔｅｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｎｐｒＢ、Δｂｐｒ、ΔｎｐｒＥ、Δｖｐｒ、ΔａｐｒＥ、及びΔａｐｒＸと記載する。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
[Materials for preparing VHH-expressing Bacillus subtilis mutants]
(1) Strain Extracellular protease genes (epr, wprA, mpr, nprB, bpr, nprE, vpr, aprE and aprX) were generated. The obtained extracellular protease single-deficient strains are hereinafter referred to as Δepr, ΔwprA, Δmpr, ΔnprB, Δbpr, ΔnprE, Δvpr, ΔaprE, and ΔaprX, respectively. In addition, according to the method described in Japanese Patent No. 4336082, the sigF gene involved in sporulation was deleted from the Bacillus subtilis strain Dpr9, which lacks all of the above nine extracellular protease genes. The resulting extracellular protease multiple-deficient strain is referred to as Dpr9ΔsigF.
（２）培地
・ＬＢ培地：１％ Ｂａｃｔｏ（登録商標） Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、１％塩化ナトリウム。平板培地には１．５％の寒天を加えた。必要に応じてテトラサイクリン塩酸塩（５０ｐｐｍ）を加えた。
・ＳＭＭＰ溶液：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ） （３５ｇ／Ｌ）、スクロース（１７１．５ｇ／Ｌ）、マレイン酸二ナトリウム（３．２ｇ／Ｌ）、塩化マグネシウム六水和物（４．０６ｇ／Ｌ）
・ＰＥＧ溶液：スクロース（８５．７５ｇ／Ｌ）、マレイン酸二ナトリウム（１．６ｇ／Ｌ）、塩化マグネシウム六水和物（２．０３ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ８０００（４００ｇ／Ｌ）
・ＤＭ３培地：１％ ＣＭＣ（関東化学）、０．５％ Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、８．１％コハク酸二ナトリウム六水和物、０．３５％リン酸水素二カリウム、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．５％グルコース、２０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ ＢＳＡ、５０ｐｐｍテトラサイクリン塩酸塩。平板培地には１％の寒天を加えた。
(2) Medium/LB medium: 1% Bacto (registered trademark) Tryptone (Difco), 0.5% Bacto Yeast Extract (Difco), 1% sodium chloride. 1.5% agar was added to the plates. Tetracycline hydrochloride (50 ppm) was added as needed.
SMMP solution: Antibiotic Medium 3 (Difco) (35 g/L), sucrose (171.5 g/L), disodium maleate (3.2 g/L), magnesium chloride hexahydrate (4.06 g/L)
PEG solution: sucrose (85.75 g/L), disodium maleate (1.6 g/L), magnesium chloride hexahydrate (2.03 g/L), PEG8000 (400 g/L)
- DM3 medium: 1% CMC (Kanto Chemical), 0.5% Bacto Casamino Acids (Difco), 0.5% Bacto Yeast Extract (Difco), 8.1% disodium succinate hexahydrate, 0.35 % dipotassium hydrogen phosphate, 0.15% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% glucose, 20 mM magnesium chloride, 0.01% BSA, 50 ppm tetracycline hydrochloride. 1% agar was added to the plates.
（３）試薬
試薬は、特に記述が無い場合はＷａｋｏ社製を用いた。
(3) Reagents Reagents manufactured by Wako were used unless otherwise specified.
［カラム出口溶液のモニタリング］
カラム出口にクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＬＰ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株））もしくはＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株）））の検出器を取り付け、２８０ｎｍの紫外線吸光度及び電気伝導度の経時トレンドを測定した。
[Monitoring of column outlet solution]
Attach the detector of the chromatography system (BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories, Inc.) or BioLogic DuoFlow (Bio-Rad Laboratories, Inc.)) to the column outlet, and measure the temporal trend of the ultraviolet absorbance at 280 nm and the electrical conductivity. bottom.
［ｐＨの測定法］
ｐＨは、室温（２０℃）で、ｐＨメータ ＴＰＸ－９９９ｉ（（株）東興化学研究所）を用いて測定した。
[Measurement method of pH]
The pH was measured at room temperature (20° C.) using a pH meter TPX-999i (Toko Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.).
［ＶＨＨタンパク質濃度の測定法］
試料を、Ａｎｙ ｋＤ プレキャストポリアクリルアミドゲル（バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株））にアプライし、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分析を行った。染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ－２５０ Ｓｔａｉｎ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株）））により染色したゲルのバンドパターンを、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ）が開発した画像ソフトＩｍａｇｅＪを用いて輝度解析を行った。同一ゲルに標準タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（富士フィルム和光純薬（株））をアプライし、検量線を作成し、サンプルのバンドパターン解析によりＶＨＨタンパク質濃度を定量した。
[Method for measuring VHH protein concentration]
The samples were applied to Any kD precast polyacrylamide gel (Bio-Rad Laboratories, Inc.) and analyzed by electrophoresis (SDS-PAGE). The band pattern of the gel stained with a staining solution (Bio-Safe Coomassie G-250 Stain (Bio-Rad Laboratories, Inc.)) was analyzed using ImageJ, an imaging software developed by the National Institute of Health (NIH). was used for luminance analysis. Bovine serum albumin (BSA) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was applied as a standard protein to the same gel to prepare a calibration curve, and the VHH protein concentration was quantified by band pattern analysis of the sample.
［ＶＨＨタンパク質吸着率の測定法］
クロマトグラフィー精製によるＶＨＨ吸着率は次式により算出した。
ＶＨＨ吸着率（質量％）＝［（ロード液（粗ＶＨＨ溶液）中のＶＨＨ量（ｇ））－（吸着工程におけるカラム通過液中のＶＨＨ量（ｇ））］／［ロード液（粗ＶＨＨ溶液）中のＶＨＨ量（ｇ）］×１００
[Method for measuring VHH protein adsorption rate]
The VHH adsorption rate by chromatographic purification was calculated by the following formula.
VHH adsorption rate (% by mass) = [(VHH amount (g) in load liquid (crude VHH solution)) - (VHH amount (g) in column passing liquid in adsorption step)] / [load liquid (crude VHH solution ) in VHH amount (g)] × 100
［ＶＨＨタンパク質回収率の測定法］
クロマトグラフィー精製によるＶＨＨ回収率は次式により算出した。
ＶＨＨ回収率（質量％）＝［溶出液（精製ＶＨＨ溶液）中のＶＨＨ量（ｇ）］／［ロード液（粗ＶＨＨ溶液）中のＶＨＨ量（ｇ）］×１００
[Method for measuring VHH protein recovery]
The VHH recovery rate by chromatographic purification was calculated by the following formula.
VHH recovery rate (% by mass) = [VHH amount (g) in eluate (purified VHH solution)]/[VHH amount (g) in load solution (crude VHH solution)] x 100
［サンドイッチＥＬＩＳＡによるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性測定法］
Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標） Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの２０μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＶＨＨを添加し、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にブロッキング剤を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＨＨ抗体を固相化した各ウェルに対して１００μＬの０．１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）／ＰＢＳＴを添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＦｃタグ付きＳ１タンパク質を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）（アブカム）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２０分間インキュベートした後、直ちにマイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株））を用いて吸光度４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）を測定した。
[Measurement of binding activity of VHH to S1 protein by sandwich ELISA]
100 μL of 20 μg/mL His-tagged VHH was added to each well of Pierce® Nickel Coated Plates, Clear, 96-Well (Thermo Fisher Scientific) and allowed to stand at 4° C. overnight. After carefully removing VHH antibodies that were not adsorbed to the wells using a pipette, 200 μL of 5% skimmed milk/PBST (PBS containing 0.05% Tween 20) was added and incubated at room temperature for 1 hour. After carefully removing the blocking agent using a pipette, 200 μL of PBST was added and removed carefully using a pipette. This washing operation was performed three times. 100 μL of 0.1 μg/mL SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-Fc Recombinant Protein (Fc-tagged S1 protein, Sino Biological)/PBST was added to each well where the VHH antibody was immobilized. , incubated for 50 minutes at room temperature. After carefully removing the Fc-tagged S1 protein using a pipette, 200 μL of PBST was added and removed carefully using a pipette. This washing operation was performed three times. Goat Anti-Human IgG Fc (HRP) (Abecam) was used as a detection antibody. Primary antibody was diluted 1/5,000 in PBST. 100 μL of detection antibody was added to each well and incubated for 50 minutes at room temperature. After carefully removing the detection antibody using a pipette, 200 μL of PBST was added and removed carefully using a pipette. This washing operation was performed three times. A chromogenic substrate was prepared by dissolving an OPD tablet (Thermo Fisher Scientific) in a Stable Peroxide Substrate Buffer (Thermo Fisher Scientific). After adding 100 μL of a chromogenic substrate to each well and incubating for 20 minutes in the dark, the absorbance at 450 nm (OD450) was immediately measured using a microplate reader Multiskan Sky (Thermo Fisher Scientific Co.).
［ＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率の測定法］
クロマトグラフィー精製におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は次式により算出した。
Ｓ１タンパク質への結合活性維持率（％）＝［溶出液（精製ＶＨＨ溶液）中のＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性（ＯＤ４５０）］／［バッチクロマトグラフィー精製で得られた溶出液（精製ＶＨＨ溶液）中のＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性（ＯＤ４５０）］×１００
[Method for measuring retention rate of binding activity of VHH to S1 protein]
The binding activity maintenance rate of VHH to S1 protein in chromatographic purification was calculated by the following formula.
S1 protein binding activity retention rate (%) = [VHH binding activity to S1 protein (OD450) in eluate (purified VHH solution)]/[eluate obtained by batch chromatography purification (purified VHH solution ) binding activity of VHH to S1 protein (OD450)] × 100
実施例１
（１）ＶＨＨ（ＣｏＶＨＨ１）発現枯草菌変異株の構築 （ＣｏＶＨＨ１）
１．遺伝子の人工合成
ＶＨＨ遺伝子（配列番号７１（翻訳後配列７３））は、サーモフィッシャー社で人工合成された。人工合成遺伝子には、該遺伝子をプラスミドベクターに挿入するための配列として、ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡ（配列番号７５）がそれぞれの５’末端に、ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴ（配列番号７６）がそれぞれの３’末端に付加された。
Example 1
(1) Construction of VHH (CoVHH1)-expressing Bacillus subtilis mutant (CoVHH1)
1. Artificial Synthesis of Gene The VHH gene (SEQ ID NO: 71 (post-translational sequence 73)) was artificially synthesized by Thermo Fisher. To the artificially synthesized gene, GCAGCTCTTGCAGCA (SEQ ID NO: 75) and TCTATTAAACTAGTT (SEQ ID NO: 76) were added to the 5' end and the 3' end, respectively, as sequences for inserting the gene into a plasmid vector.
２．ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号７７）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号７８）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に、上記１の人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、上記１に示した人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
以下の手順でプロモーター領域を枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来のものに変更した。
ＶＨＨ発現用プラスミドをテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号７９）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号８０）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号８１）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号８２）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ遺伝子を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。構築したプラスミドを、下記３に示す手順に従ってＤｐｒ９ΔｓｉｇＦに導入した。
2. Construction of VHH Expression Plasmid Recombinant plasmid pHY-S237 (JP-A-2014-158430) was used as a template, and 5′-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-3′ (SEQ ID NO: 77) and 5′-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-3′ (SEQ ID NO: 78) primers were used. Plasmid sequences were amplified by PCR using the set and PrimeSTAR Max DNA polymerase (TaKaRa). DNA containing the artificially synthesized gene of 1 above was incorporated into the resulting PCR fragment using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara) to construct a VHH expression plasmid containing each of the artificially synthesized VHH genes shown in 1 above. bottom.
The promoter region was changed to that derived from the Bacillus subtilis spoVG gene by the following procedure.
Using a VHH expression plasmid as a template, a plasmid was generated by PCR using a primer set of 5'-GATCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-3' (SEQ ID NO: 79) and 5'-ATGATGTTAAGAAAAGAAAAACAAAGCAG-3' (SEQ ID NO: 80) and PrimeSTAR Max DNA polymerase (TaKaRa). Sequence was amplified. A promoter DNA derived from the spoVG gene was amplified by PCR using the genome of strain 168 as a template and a primer set of 5′-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAGTGATTCTGGGAGAG-3′ (SEQ ID NO: 81) and 5′-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTTCCC-3′ (SEQ ID NO: 82). . The resulting promoter DNA was incorporated into the plasmid sequence using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara) to construct a VHH expression plasmid containing the VHH gene linked to the spoVG promoter. The constructed plasmid was introduced into Dpr9ΔsigF according to the procedure shown in 3 below.
３．組換え枯草菌の作製
枯草菌株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。
１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした各種枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートすることで形質転換体のコロニーを取得した。
3. Preparation of Recombinant Bacillus Subtilis Plasmids were introduced into Bacillus subtilis strains by the following protoplast method.
Various types of Bacillus subtilis stocked in glycerol were inoculated into 1 mL of LB liquid medium and cultured with shaking at 30° C. and 210 rpm overnight. On the next day, 10 μL of this culture solution was inoculated into a new 1 mL LB liquid medium, and cultured with shaking at 37° C. and 210 rpm for about 2 hours. The culture solution was collected in a 1.5 mL tube, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed. The pellet was suspended in 500 μL of SMMP containing 4 mg/mL Lysozyme (SIGMA) and incubated at 37° C. for 1 hour. . After centrifugation at 3,500 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed and the pellet was suspended in 400 μL of SMMP. 33 μL of this suspension was mixed with various plasmids, and 100 μL of 40% PEG was added and vortexed. 350 μL of SMMP was added to this solution, mixed by inversion, and shaken at 30° C. and 210 rpm for 1 hour. Acquired.
（２）培養
前記で得た形質転換体（組換え枯草菌）を、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム）３６０ｍＬに接種し、２Ｌヒダ付き三角フラスコで２０時間、３０℃で１８０ｒ／ｍｉｎの振盪速度で培養し、種菌とした（シード培養）。
(2) Cultivation The transformant (recombinant Bacillus subtilis) obtained above was inoculated into 360 mL of LB medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride), and It was cultured for 20 hours at 30° C. and a shaking speed of 180 r/min to obtain an inoculum (seed culture).
次いで、前記種菌をテトラサイクリン含有２ｘＬ／ｍａｌ培地（２０ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、７５ｇ／Ｌ マルトース一水和物、７．５ｐｐｍ 硫酸マンガン五水和物、１５ｐｐｍ テトラサイクリン塩酸塩）１８Ｌに全量接種し、３０℃、通気流量０．２ｖｖｍ、３００ｒ／ｍｉｎ、０．０４ＭＰａ加圧条件で７２時間通気撹拌培養を行った（メイン培養）。 The inoculum was then transferred to 2xL/mal medium containing tetracycline (20 g/L tryptone, 10 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride, 75 g/L maltose monohydrate, 7.5 ppm manganese sulfate pentahydrate, 15 ppm tetracycline Hydrochloride) was inoculated in 18 L, and aeration and agitation culture was performed for 72 hours at 30° C., an aeration flow rate of 0.2 vvm, 300 r/min, and a pressure of 0.04 MPa (main culture).
（３）精密ろ過
上記培養液を精密ろ過膜モジュール（中空糸状精密ろ過膜、旭化成（株）、ＰＳＰ－１１３Ｌ）により除菌し、粗ＶＨＨ溶液を得た。粗ＶＨＨ溶液中のＶＨＨ濃度は０．６６ｇ／Ｌであった。
(3) Microfiltration The above culture solution was sterilized with a microfiltration membrane module (hollow fiber microfiltration membrane, Asahi Kasei Corporation, PSP-113L) to obtain a crude VHH solution. The VHH concentration in the crude VHH solution was 0.66 g/L.
（４）クロマトグラフィー精製
以降カラムへの通液は、室温（２０℃）で、すべてカラム上方から行った。カラム（内径１１ｍｍ、高さ２５０ｍｍ、容積２２．５ｍＬ）にプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー担体 Ａｍｓｐｈｅｒｅ（登録商標） Ａ３（ＪＳＲライフサイエンス（株））を充填し、りん酸緩衝生理食塩水（４ｍＭ りん酸、１５４ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２、ＰＢＳ（－））をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝３．３でカラムに通液し平衡化した。次いで、粗ＶＨＨ溶液をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝１１．１（負荷量７．３ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層）で通液し、粗ＶＨＨ溶液中のＶＨＨをクロマトグラフィー担体に吸着させた（吸着工程）。次いで、ＰＢＳ（－）をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝５．１で通液し、洗浄を行った（洗浄工程）。次いで、溶出緩衝液としてグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．０）をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝２．８で通液し、ＶＨＨを溶出させることで精製ＶＨＨ溶液を取得した（溶出工程）。精製ＶＨＨ溶液は、２０分の１量の１Ｍトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）と混合し中和を行い、ｐＨ８とした。ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は７．３ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９６％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は８５％であった。
溶出後の担体カラムは、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液をＳＶ＝３．７／ｈｒ、ＢＶ＝２．２を通液して再生し、ＰＢＳ（－）をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝３．３で通液して洗浄した後、保管用緩衝液（１６％エタノール、５０ｍＭりん酸緩衝液、ｐＨ７．５）に置換し、次回使用時まで５℃条件下で保管した。
(4) Purification by Chromatography Subsequent passages through the column were carried out at room temperature (20° C.) from the top of the column. A column (inner diameter 11 mm, height 250 mm, volume 22.5 mL) was packed with protein A affinity chromatography carrier Amsphere (registered trademark) A3 (JSR Life Sciences Co., Ltd.), and phosphate buffered saline (4 mM phosphate, 154 mM sodium chloride, pH 7.2, PBS(−)) was passed through the column at SV=6.7/hr and BV=3.3 for equilibration. Next, the crude VHH solution was passed at SV = 6.7/hr, BV = 11.1 (load amount 7.3 g - VHH / L - packed bed), and the VHH in the crude VHH solution was adsorbed on the chromatography carrier. (adsorption step). Next, PBS(−) was passed through at SV=6.7/hr and BV=5.1 to wash (washing step). Then, as an elution buffer, a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.0) is passed through at SV = 6.7/hr, BV = 2.8 to elute VHH. A purified VHH solution was thus obtained (elution step). The purified VHH solution was neutralized to pH 8 by mixing with 1/20 volume of 1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0). The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 7.3 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 96%. The rate was 85%.
After elution, the carrier column was regenerated by passing 0.1 M sodium hydroxide solution at SV = 3.7/hr, BV = 2.2, and PBS (-) at SV = 6.7/hr, BV = 3.3 and washed, then replaced with storage buffer (16% ethanol, 50 mM phosphate buffer, pH 7.5) and stored at 5°C until next use.
（５）アフィニティー担体とＣｏＶＨＨ１の分配係数測定
（４）で使用したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー担体 Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３を充填したカラムに、（４）で使用した溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．０）を、カラム内が置換されるまでＳＶ＝６．７／ｈｒで通液した。（４）で得られた中和後の精製ＶＨＨ溶液をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝０．０１９で通液した後、再度上記溶出緩衝液をＳＶ＝６．７／ｈｒで通液し、カラム出口での紫外線吸光度からＶＨＨの滞留時間（ｔR）を測定した。下式からＶＨＨについての分配係数Ｋを算出し、同様に溶出緩衝液の分配係数Ｋ’を測定した。、その差分から算出した、ｐＨ３．０条件下におけるアフィニティー担体とＣｏＶＨＨ１の間の分配係数Ｋdは３．２×１０-1であった。
(5) Affinity carrier and CoVHH1 partition coefficient measurement A column packed with the protein A affinity chromatography carrier Amsphere A3 used in (4) was filled with the elution buffer (0.1 M glycine, 0.1 M chloride sodium, pH 3.0) was passed through the column at SV=6.7/hr until the inside of the column was replaced. After the neutralized purified VHH solution obtained in (4) was passed through at SV = 6.7/hr and BV = 0.019, the above elution buffer was passed through again at SV = 6.7/hr. Then, the retention time (t R ) of VHH was measured from the ultraviolet absorbance at the column outlet. The partition coefficient K for VHH was calculated from the following formula, and the partition coefficient K' of the elution buffer was measured in the same manner. , the partition coefficient K d between the affinity carrier and CoVHH1 under pH 3.0 conditions, calculated from the difference, was 3.2×10 −1 .
参考例１ バッチクロマトグラフィー精製（ＣｏＶＨＨ１）
１．５ｍＬ容マイクロチューブにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー担体 Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３を５０μＬ入れた。ＰＢＳ（－）を１ｍＬ添加し、遠心分離（３，０００×ｇ、２分間）後の上清を除去する操作を２回繰り返し、担体を平衡化した。次いで、実施例１（１）～（３）で得られた粗ＶＨＨ溶液０．５６ｍＬを添加後、５分間混合し、粗ＶＨＨ溶液中のＶＨＨをクロマトグラフィー担体に吸着させた（負荷量７．４ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－樹脂層）。次いで、遠心分離（３，０００×ｇ、２分間）後、上清を除去し、上記平衡化と同様の操作によりＰＢＳ（－）による洗浄を行った。次いで、溶出緩衝液としてグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）０．１４ｍＬを添加後、５分間混合しＶＨＨを溶出させ、遠心分離（３，０００×ｇ、２分間）後の上清を回収し精製ＶＨＨ溶液を取得した。この溶出操作は２回行った。精製ＶＨＨ溶液は、２０分の１量の１Ｍトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）と混合し中和を行い、ｐＨ８とした。ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は７．４ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９９％であった。
Reference Example 1 Batch chromatography purification (CoVHH1)
50 μL of protein A affinity chromatography carrier Amsphere A3 was placed in a 1.5 mL microtube. The procedure of adding 1 mL of PBS(−), centrifuging (3,000×g, 2 minutes) and removing the supernatant was repeated twice to equilibrate the carrier. Next, after adding 0.56 mL of the crude VHH solution obtained in Examples 1 (1) to (3), the mixture was mixed for 5 minutes to allow the VHH in the crude VHH solution to be adsorbed on the chromatography carrier (loading amount 7.5). 4g-VHH/L-resin layer). Then, after centrifugation (3,000×g, 2 minutes), the supernatant was removed, and washing with PBS(−) was performed in the same manner as the above equilibration. Then, after adding 0.14 mL of glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 2.5) as an elution buffer, mixing for 5 minutes to elute VHH, centrifugation (3,000× g, 2 minutes), the supernatant was recovered to obtain a purified VHH solution. This elution operation was performed twice. The purified VHH solution was neutralized to pH 8 by mixing with 1/20 volume of 1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0). The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 7.4 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery was 99%.
参考例２
溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）に変更した以外は実施例１（５）と同様の操作を行った。ｐＨ２．５条件下におけるプロテインＡ担体とＣｏＶＨＨ１の間の分配係数Ｋdは１．１×１０-2であった。次いで、粗ＶＨＨ溶液をＢＶ＝５．６（負荷量３．７ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層）で通液し、溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）に変更した以外は実施例１（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は３．７ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９７％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は８１％であった。
Reference example 2
The same operation as in Example 1(5) was performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 2.5). The partition coefficient K d between protein A carrier and CoVHH1 under pH 2.5 conditions was 1.1×10 −2 . Next, the crude VHH solution was passed through at BV = 5.6 (loading amount 3.7 g - VHH / L - packed bed), and the elution buffer was glycine-HCl buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride , pH 2.5) were performed in the same manner as in Example 1 (1) to (4).
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 3.7 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 97%. The rate was 81%.
比較例１
溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）に変更した以外は実施例１（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は７．３ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９７％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は４８％であった。
Comparative example 1
The same operations as in Example 1 (1) to (4) were performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 2.5).
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 7.3 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 97%. The rate was 48%.
実施例２
溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）に変更した以外は実施例１（５）と同様の操作を行った。ｐＨ３．５条件下におけるアフィニティー担体とＣｏＶＨＨ１の間の分配係数Ｋdは１．４であった。次いで、溶出緩衝液にグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）を使用し、ＢＶ＝３．３で通液した以外は実施例１（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は７．３ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９４％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は９９％であった。
Example 2
The same operation as in Example 1(5) was performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.5). The partition coefficient K d between the affinity carrier and CoVHH1 under pH 3.5 conditions was 1.4. Next, except that glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.5) was used as the elution buffer and passed at BV = 3.3, Example 1 (1) to ( The same operation as in 4) was performed.
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 7.3 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 94%. The rate was 99%.
比較例２
粗ＶＨＨ溶液をＢＶ＝８．３（負荷量５．５ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層）で通液し、溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）に変更した以外は実施例１（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は５．５ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９２％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は６０％であった。
Comparative example 2
The crude VHH solution was passed through at BV=8.3 (loading amount 5.5 g-VHH/L-packed bed), and the elution buffer was glycine-hydrochloric acid buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 2 The same operations as in Example 1 (1) to (4) were performed except for changing to .5).
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 5.5 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 92%. The rate was 60%.
実施例３
溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．０）に変更した以外は比較例２と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は５．５ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９９％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は７４％であった。
Example 3
The same operation as in Comparative Example 2 was performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.0).
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 5.5 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 99%. The rate was 74%.
実施例４
溶出緩衝液にグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）を使用し、ＢＶ＝３．３で通液した以外は比較例２と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は５．５ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９８％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は７４％であった。
Example 4
The same operation as in Comparative Example 2 was performed except that a glycine-hydrochloric acid buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.5) was used as the elution buffer and the solution was passed at BV = 3.3. .
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 5.5 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 98%. The rate was 74%.
実施例５
粗ＶＨＨ溶液をＢＶ＝２２．２（負荷量１４．７ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層）で通液した以外は実施例１（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は９３％であり、ＶＨＨ吸着量は１３．６ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９２％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は９９％であった。
Example 5
The same operations as in Examples 1 (1) to (4) were performed except that the crude VHH solution was passed at BV=22.2 (load amount 14.7 g-VHH/L-packed layer).
The VHH adsorption yield was 93%, the VHH adsorption amount was 13.6 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 92%. The rate was 99%.
実施例６
溶出緩衝液にグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）を使用し、ＢＶ＝３．３で通液した以外は実施例５と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は９３％であり、ＶＨＨ吸着量は１３．７ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９３％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は８２％であった。
Example 6
The same operation as in Example 5 was performed except that a glycine-hydrochloric acid buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.5) was used as the elution buffer and the solution was passed at BV = 3.3. .
The VHH adsorption yield was 93%, the VHH adsorption amount was 13.7 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 93%. The rate was 82%.
実施例７
（１）ＶＨＨ（ＶＨＨ Ｅ２）発現枯草菌変異株の構築 （ＶＨＨ Ｅ２）
配列番号７２（翻訳後配列７４）の人工合成ＶＨＨ遺伝子をＰＣＲ断片に組み込んだ以外は実施例１（１）と同様の操作を行い、ＶＨＨ Ｅ２を発現する枯草菌変異株の形質転換体のコロニーを取得した。
Example 7
(1) Construction of VHH (VHH E2)-expressing Bacillus subtilis mutant (VHH E2)
A colony of a transformant of a Bacillus subtilis mutant expressing VHH E2 was carried out in the same manner as in Example 1 (1), except that the artificially synthesized VHH gene of SEQ ID NO: 72 (post-translational sequence 74) was incorporated into the PCR fragment. obtained.
（２）培養
前記で得た形質転換体を使用した以外は実施例１（２）と同様の操作を行った。
(2) Cultivation The same procedure as in Example 1(2) was performed except that the transformant obtained above was used.
（３）精密ろ過
前記で得た培養液を用いて実施例１（３）と同様の操作を行った。得られた粗ＶＨＨ溶液中のＶＨＨ濃度は０．３３ｇ／Ｌであった。
(3) Microfiltration Using the culture solution obtained above, the same operation as in Example 1 (3) was performed. The VHH concentration in the resulting crude VHH solution was 0.33 g/L.
（４）クロマトグラフィー精製
前記で得た粗ＶＨＨ溶液を用いて、粗ＶＨＨ溶液をＳＶ＝６．７／ｈｒ、ＢＶ＝１４．４（負荷量４．８ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層）で通液した以外は実施例１（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は４．８ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９０％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は９０％であった。
(4) Chromatographic Purification Using the crude VHH solution obtained above, the crude VHH solution was passed through at SV=6.7/hr, BV=14.4 (loading 4.8 g-VHH/L-packed bed). The same operation as in Example 1 (4) was performed except that the liquid was added.
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 4.8 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 90%. The rate was 90%.
（５）アフィニティー担体とＶＨＨ Ｅ２の分配係数測定
前記で得た精製ＶＨＨ溶液を用いて実施例１（５）と同様の操作を行った。ｐＨ３．０条件下におけるアフィニティー担体とＶＨＨ Ｅ２の間の分配係数Ｋdは２．３×１０-1であった。
(5) Measurement of Partition Coefficient of Affinity Carrier and VHH E2 Using the purified VHH solution obtained above, the same procedure as in Example 1 (5) was performed. The partition coefficient K d between the affinity carrier and VHH E2 under pH 3.0 conditions was 2.3×10 −1 .
参考例３ バッチクロマトグラフィー精製（ＶＨＨ Ｅ２）
実施例７（１）～（３）で得られた粗ＶＨＨ溶液を使用し、溶液中のＶＨＨをアフィニティー担体に吸着させた（負荷量３．７ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－樹脂層）以外は参考例１と同様の操作を行った。ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は３．７ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は９１％であった。
Reference Example 3 Batch chromatography purification (VHH E2)
The crude VHH solutions obtained in Examples 7 (1) to (3) were used, and the VHH in the solution was adsorbed on the affinity carrier (loading amount: 3.7 g-VHH/L-resin layer). The same operation as in 1 was performed. The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 3.7 g-VHH/L-filled bed, and the VHH recovery was 91%.
実施例８
溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）に変更した以外は実施例７（５）と同様の操作を行った。ｐＨ３．５条件下におけるアフィニティー担体とＶＨＨ Ｅ２の間の分配係数Ｋdは１．４であった。次いで、溶出緩衝液にグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）を使用し、ＢＶ＝３．３で通液した以外は実施例７（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は４．８ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は８３％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は９３％であった。
Example 8
The same operation as in Example 7(5) was performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.5). The partition coefficient K d between the affinity carrier and VHH E2 under pH 3.5 conditions was 1.4. Next, except that glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 3.5) was used as the elution buffer and passed at BV = 3.3, Example 7 (1) to ( The same operation as in 4) was performed.
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 4.8 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 83%. The rate was 93%.
比較例３
溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）に変更した以外は実施例７（５）と同様の操作を行った。ｐＨ２．５条件下におけるアフィニティー担体とＶＨＨ Ｅ２の間の分配係数Ｋdは５．７×１０-3であった。次いで、溶出緩衝液をグリシン－塩酸緩衝液（０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ２．５）に変更した以外は実施例７（１）～（４）と同様の操作を行った。
ＶＨＨ吸着収率は１００％であり、ＶＨＨ吸着量は４．８ｇ－ＶＨＨ／Ｌ－充填層であり、ＶＨＨ回収率は８８％であり、クロマトグラフィー精製工程におけるＶＨＨのＳ１タンパク質への結合活性維持率は３８％であった。
Comparative example 3
The same operation as in Example 7(5) was performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 2.5). The partition coefficient K d between the affinity carrier and VHH E2 under pH 2.5 conditions was 5.7×10 −3 . Then, the same operations as in Examples 7 (1) to (4) were performed except that the elution buffer was changed to a glycine-hydrochloride buffer (0.1 M glycine, 0.1 M sodium chloride, pH 2.5).
The VHH adsorption yield was 100%, the VHH adsorption amount was 4.8 g-VHH/L-packed bed, and the VHH recovery rate was 88%. The rate was 38%.
Claims (7)
（１）プロテインＡをリガンドとするアフィニティー担体の充填層体積（Ｌ）に対して、ＶＨＨ抗体の吸着量（ｇ）が４～２０ｇ／Ｌとなるように、ＶＨＨ抗体を含有する溶液を通液する工程
（２）工程（１）の後、前記アフィニティー担体とＶＨＨ抗体の間の分配係数が０．０７～２０の範囲となる溶出液を通液する工程
を含む、ＶＨＨ抗体の製造方法。 The following steps (1) and (2):
(1) A solution containing a VHH antibody is passed so that the adsorption amount (g) of the VHH antibody is 4 to 20 g/L with respect to the packed bed volume (L) of the affinity carrier with protein A as a ligand. step (2), after step (1), passing through an eluate having a partition coefficient between the affinity carrier and the VHH antibody in the range of 0.07 to 20. A method for producing a VHH antibody.
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