JP2022543014A - アミノ酸レベルを調節することによりアルツハイマー病を治療するための方法 - Google Patents

アミノ酸レベルを調節することによりアルツハイマー病を治療するための方法 Download PDF

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Abstract

対象においてアルツハイマー病を治療するための薬剤の製造における、アミノ酸レベルを調節するための薬剤の使用が提供される。

Description

本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に関する。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病の進行を阻害するための脳腸軸相関の使用に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、潜行的に発症する進行性の神経変性疾患である。臨床では、アルツハイマー病は、記憶障害、失語症、失行、失認、視空間認知障害、遂行機能障害、ならびに人格および行動変容などの全般的認知症を特徴とする。アルツハイマー病の２つの病理学的特徴は、細胞外β－アミロイド沈着（老人斑）および細胞内神経原線維錯綜（対らせん状細線維）である。β－アミロイド沈着および神経原線維錯綜はシナプスおよびニューロンの喪失を生じ、一般に側頭葉に始まる脳の損傷領域の深刻な萎縮に至る。β－アミロイドペプチドおよび神経原線維錯綜によって引き起こされるこの損傷の機序は完全には理解されていない。
中国科学院製薬イノベーション研究所(the Institute of Pharmaceutical Innovation of the Chinese Academy of Sciences)／上海薬物研究所(Shanghai Institute of Materia Medica)の研究者であるＧｅｎｇ Ｍｅｉｙｕが率いる研究チームによって開発されたマンヌロン酸オリゴ糖は、独立した知的財産権を有する新規な革新的経口抗アルツハイマー病（ＡＤ）薬である。２０１８年７月１７日の、第ＩＩＩ相非盲検臨床試験の結果は、マンヌロン酸オリゴ糖は、認知機能の改善の主要な有効性指標に関して期待されるに至り、極めて有意な統計学的および臨床的有意性を有する。さらに、有害事象の発生率はプラセボ群と同等であり、良好な安全性を有し、長期使用に好適である。マンヌロン酸オリゴ糖は、世界的なＡＤ治療分野において、１６年間の第ＩＩＩ相臨床試験において成功した最初の薬物となった。
マンヌロン酸オリゴ糖に関しては、多くの関連中国特許が提出されてきた。ＣＮ２０１７１１４６７５９６６は、マンヌロン二酸の組成物を記載している。ＣＮ２０１６１００６９７０３９は、オリゴマンヌロン二酸の製造方法を記載している。ＣＮ２０１８１０７１３４１１３は、パーキンソン病の治療におけるマンヌロン二酸の組成物の使用を記載している。ＣＮ２０１５１０４２４３４０１は、パーキンソン病の治療における、還元末端から１位にカルボキシル基を有するマンヌロン酸オリゴ糖およびそれらの誘導体の使用を記載している。これらの特許は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
Figure 2022543014000001
当技術分野では、アルツハイマー病を治療するために使用することができるさらなる薬物が必要とされる。
本発明において、本発明者らは、ＡＤの進行における腸内微生物叢の破綻と神経炎症の因果関係を示す。具体的には、腸内微生物叢の組成の変化は、フェニルアラニンおよびイソロイシンなどの細菌叢の代謝産物の末梢蓄積をもたらし得る。それはＡＤの進行において末梢炎症誘発性１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）細胞の増殖および分化を促進する。末梢免疫細胞は脳に浸潤し、神経炎症を増強する。重要なこととして、ＡＤにより引き起こされた軽度認知障害（ＭＣＩ）を有する患者の２つの独立したコホートで末梢血中のフェニルアラニンおよびイソロイシンの上昇が確認された。本発明者らはまた、中国での第ＩＩＩ臨床試験で信頼性のある一貫した認知改善を示したマンヌロン酸オリゴ糖は、腸管内菌叢のバランスを整え、血中の細菌叢のアミノ酸代謝産物の蓄積を減らし、神経炎症を阻害することを示した。一般に、本発明者らの発見は、ＡＤの進行における腸内微生物叢の破綻によって促進される神経炎症の役割を強調し、脳腸軸に介入することによってＡＤ治療の新たな戦略を提案する。
１つの側面において、本発明は、対象においてアルツハイマー病を治療するための薬剤の製造における、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤の使用を提供する。
別の側面において、本発明は、有効量の、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤を含んでなる、対象においてアルツハイマー病を治療するための医薬組成物を提供する。
さらに別の側面において、本発明は、アルツハイマー病を治療するために使用することができる薬物候補をスクリーニングするための方法であって、
ａ）試験薬剤を末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに投与すること、および
ｂ）そのアミノ酸レベルを調節する試験薬剤を、アルツハイマー病を治療するために使用することができる薬物候補として選択すること
を含んでなる方法を提供する。
さらに別の側面において、本発明は、アルツハイマー病を有する患者を治療するための方法であって、
（ａ）前記患者のアミノ酸レベルを検出し、それを対応する正常集団の対応するアミノ酸レベルと比較して、そのレベルが、対応する正常集団の対応するアミノのレベルと異なるアミノ酸を選択すること；
（ｂ）選択されたアミノ酸のレベルを調節して、それらを対応する正常集団の対応するアミノ酸レベルに近づける、または到達させるために、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤を前記患者に投与すること
を含んでなる方法を提供する。
５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける疾病進行中の腸内破綻および免疫細胞変化。 （ａ）２、３、５、７および９か月の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスならびに２か月の時点の野生型（ＷＴ）マウスの海馬におけるシナプトフィジンの相対ＲＮＡ発現レベルの変化（ｎ＝５～１２）。データは、アクチンの発現レベルに対する平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（５，４３）＝２．９５２）による。 （ｂ）２、３、５、７、および９か月の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスならびに２か月の時点の野生型（ＷＴ）マウスの弁別学習能を評価するための試験における、８０％の成功を達成するためにかかる１０４秒のタイムアウト（方法参照）の変化（ｎ＝４～８）。データは平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５はスチューデントのｔ検定による。ｓは秒。 （ｃ）種々の時点での操作的分類単位（ＯＴＵ）レベルに対するＷＴおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの腸内微生物叢組成の主成分分析（ＰＣＡ）（ｎ＝４～１０）。ポイントの形と色は、種々の月数からの各個体のサンプルを示す。カラーの楕円は、各試験群内の０．９５信頼区間（ＣＩ）範囲を示す。Ｍは、月数。 （ｄ）ストリームグラフに門階級で色を付けた、種々の月数での５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの腸内微生物叢の全集団における操作的分類単位（ＯＴＵ）の相対存在量変化（ｎ＝４～１０）。グラフでは、最も多い２つの門、バクテロイデス門（Bacteroidetes）およびファーミキューテス門(Firmicutes)を表示している。色は、腸内微生物叢の異なる門を示す。 （ｅ）２か月齢の野生型（ＷＴ）マウスの値に対する２、３、５、７、および９か月の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの海馬のミクログリア細胞の活性化を反映するＩＢＡ１免疫蛍光染色の陽性密度の変化（ｎ＝２～７）。データは平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表し、ラインのフィッティングには三次スプラインを用いる。Ｙ軸上のＩＢＡ１の値は、各時点におけるトランスジェニック動物の蛍光染色発現の、同時点の野生型動物の蛍光染色発現に対する相対値である。 （ｆ）２、３、５、７および９か月時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの全脳ホモジネートにおいて検出された活性化Ｍ１およびＭ２型ミクログリアの変化（ｎ＝４～８）。Ｍ１型ミクログリア（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋ＣＸ３ＣＲ１＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋）およびＭ２型（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋ＣＸ３ＣＲ１＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）ミクログリアがフローサイトメトリーにより検出され、それらの細胞総数が、ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋細胞の頻度に対して表される。赤いポイントとライン：Ｍ１ミクログリア。緑のポイントとライン：Ｍ２ミクログリア。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表し、ラインのフィッティングには三次スプラインアルゴリズムを用いる。 （ｇ）フローサイトメトリーによって検出した場合に、種々の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（赤いポイントおよびライン）およびＷＴマウス（黒いポイントおよびライン）の全脳ホモジネートにおいて検出された浸潤細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈ）の変化（Ｔｇマウス：２か月齢、ｎ＝５；３か月齢、ｎ＝４；５か月齢、ｎ＝４；７か月齢、ｎ＝７；９か月齢、ｎ＝３。ＷＴマウス：ｎ＝６）。細胞総数はＣＤ４５＋細胞の頻度に対して表し、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）形式とする。ラインのフィッティングには三次スプラインアルゴリズムを用いる。 （ｈ）種々の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおけるＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の変化（ｎ＝４～８）。バープロットで、細胞総数はＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の頻度に対して表す。色は、ＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の異なるサブタイプを表す：Ｎｅｕ、好中球；ＤＣ、樹状細胞；ＮＫ、ナチュラルキラー細胞；Ｍｏ／Ｍφ：単球およびマクロファージ；Ｂ、Ｂ細胞；その他、分類されない細胞。 （ｉ）フローサイトメトリーによって検出した場合に、２、３、５、７および９か月の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの全脳ホモジネートにおいて検出された浸潤ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋）（赤いポイントおよびライン）の変化（ｎ＝４～８）。細胞総数はＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の頻度に対して表し、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）形式とする。ラインのフィッティングには三次スプラインを用いる。 （ｊ）２、３、５、７および９か月の時点の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの全脳ホモジネートにおいて検出された浸潤末梢Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の変化（ｎ＝４～８）。Ｔｈ１細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）およびＴｈ２細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－ＣＣＲ４＋）がフローサイトメトリーにより検出され、ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に対して表される。赤いポイントおよびライン：Ｔｈ１細胞。緑のポイントおよびライン：Ｔｈ２細胞。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。ラインのフィッティングには三次スプラインを用いる。 （ｋ）初期（２～３か月）および後期（７～９か月）それぞれにおけるＴｈ２／Ｍ２関連ステージおよびＴｈ１／Ｍ１関連ステージにおいて属階級で現れる脳内リンパ球と腸内微生物叢の相関（左のパネル、ｎ＝４～８）。５ＸＦＡＤマウスの脳内リンパ球数と有意に相関した総ての細菌を右側のパネルに挙げる。黄色のアスタリスク（＊）が付いた赤い四角（正の相関）または青い四角（負の相関）は、ピアソンのパラメトリック相関検定により評価したＰ値＜０．０５の有意な相関を示す。 腸内微生物叢は免疫細胞浸潤およびミクログリアの活性化に必要とされる。 （ａ）７か月齢の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける腸内微生物の相対存在量に及ぼす抗生物質の３か月強制経口投与の影響（ｎ＝６～７）。ＡＢＸ、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびコリスチン（０．１ｍｇ／ｍＬ）から構成される混合抗生物質のカクテル。腸内微生物の異なる属を異なる色で示し、それらの相対存在量の変化をバープロットで示す。 （ｂ～ｃ）７か月齢の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの脳ホモジネートにおけるＴｈ１細胞（ｂ）およびＭ１型ミクログリア（ｃ）の頻度に及ぼす抗生物質の３か月強制経口投与の影響。Ｔｈ１細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）の細胞総数はＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋細胞の頻度に対して表し（ｂ）、Ｍ１型ミクログリア（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋ＣＸ３ＣＲ１＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋）の細胞総数はＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋細胞の頻度に対して表す（ｃ）。両方ともフローサイトメトリーにより検出する。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。 （ｄ）ＷＴ、共飼育ＷＴおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける属階級の腸内微生物の相対存在量（ｎ＝６～７）。３つのマウス群は総て７か月齢であった。異なる色は異なる属を表す。共飼育ＷＴ：Ｔｇマウスと一緒に飼育したＷＴマウス。 （ｅ～ｆ）７か月齢の共飼育ＷＴ、ＷＴおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの脳ホモジネートにおけるＴｈ１細胞（ｅ）およびＭ１型ミクログリア（ｆ）の頻度の変化（ｎ＝６～７）。Ｔｈ１細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）はＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋細胞の頻度に対して表し（ｅ）、Ｍ１型ミクログリア（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋ＣＸ３ＣＲ１＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋）の頻度はＣＤ４５ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋細胞の頻度に対して表す（ｆ）。両方ともフローサイトメトリーにより検出する。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はスチューデントのｔ検定による。 （ｇ）サイトカイン抗体アレイによって検出される、７か月齢のＷＴ、共飼育ＷＴおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの脳ホモジネートにおけるサイトカインタンパク質のレベル（ｎ＝６～７）。３つのマウス群は総て７か月齢であった。ヒートマップの色は、Ｒｏｗ Ｚスコアによって正規化した相対サイトカインレベルを表し、赤はアップレギュレーションを受けているサイトカインを示し、青はダウンレギュレーションを受けているサイトカインを示す。 ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおける行動変化に及ぼすＯＭ１の影響。 （ａ）ＯＭ１の構造。ＯＭ１は、平均分子量がおよそ１ｋＤａで、重合度が二量体～十量体の範囲の酸性直鎖オリゴ糖類の混合物である。 （ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間学習および記憶の測定値としてのモリス水迷路（ＭＷＭ）試験の逃避潜時結果。９か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを、５０ｍｐｋおよび１００ｍｐｋのＯＭ１で１２か月齢まで３か月間処置した。その後、空間学習および記憶力に関するＭＷＭ試験をさらに６日間行った。試験中、ＯＭ１は投与し続けた。逃避潜時の開始（秒）を試験の最終読み取りの１つとして測定した（方法参照）。逃避潜時が長いほど、これらのマウスは目標に到達するために時間がかかることを示し、これは空間学習および記憶力障害の重症度が高いことを示す（ｎ＝１１～１４）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。黒いアスタリスクは、ＷＴ群とＡＰＰ／ＰＳ１群の間の比較を示す。青いアスタリスクは、ＯＭ１（１００ｍｐｋ）処置群とＡＰＰ／ＰＳ１群の比較を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は２元配置ＡＮＯＶＡによる。 （ｃ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける空間学習および記憶の測定値としてのＭＷＭ試験における逃避台位置横断回数。９か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを５０ｍｐｋおよび１００ｍｐｋのＯＭ１で１２か月齢まで３か月間処置した。その後、空間学習および記憶力に関するＭＷＭ試験をさらに６日間行った。試験中、ＯＭ１は投与し続けた。逃避台位置横断回数は、試験のその他の読み取りとして測定した（方法参照）。逃避台位置横断回数が多いほど、空間学習および記憶力障害の重症度が低いことを示す（ｎ＝１１～１７）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（３，５５）＝６．５４２）による。 （ｄ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＹ型迷路を用いて試験した場合の空間作業記憶の精度。９か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを５０ｍｐｋおよび１００ｍｐｋのＯＭ１で１２か月齢まで３か月間処置した。その後、Ｙ型迷路試験を行った。試験中、ＯＭ１は投与し続けた。Ｙ型迷路の精度は、適切な交替反応と総交替反応の間の比であった（「材料および方法」参照）。精度が高いほど、作業記憶力障害の重症度が低いことを示す（ｎ＝１７～２０）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（３，７１）＝１２．３９）による。 ＯＭ１は腸内微生物叢を再調整することによって神経炎症を緩和する。 （ａ）７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスおよびＯＭ１処置Ｔｇマウスのブレイ・カーチス距離に基づく操作的分類単位（ＯＴＵ）レベルに関する腸内微生物叢組成の主座標分析（ＰＣｏＡ）（ｎ＝７）。ポイントの形と色は、各個体のサンプルを示す。カラーの楕円は、各試験群の０．９５信頼区間（ＣＩ）の範囲を示す。ＰＣは主成分。 （ｂ）７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスおよびＯＭ１処置Ｔｇマウス間に属階級で表される有意な腸内微生物叢変化のヒートマップ（ｎ＝１７）。ヒートマップ上の色は、腸内微生物叢の相対存在量を示し、赤はアップレギュレーションを受けている細菌を示し、青はダウンレギュレーションを受けている細菌を示す。 （ｃ）７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスにおけるＯＭ１の強制経口投与前（左）および後（右）の、腸内微生物叢（青い丸の隣の数字で示す）と脳内リンパ球（カラーの丸）の相関関係の変化。右側に各腸内微生物叢の名称を挙げる。 （ｄ）７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスにおける脳内Ｔｈ１細胞の頻度に及ぼすＯＭ１処置の影響（ｎ＝５～７）。Ｔｈ１細胞総数（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）は、フローサイトメトリーにより検出されたＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞総数に対して示す。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１はスチューデントのｔ検定による。 （ｅ）ミクログリア細胞の活性化を反映する、７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウス由来の海馬切片において検出されたＩＢＡ１免疫蛍光染色の陽性シグナル密度に及ぼすＯＭ１処置の影響（ｎ＝４～６）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（２，１５）＝２１．９４）による。 （ｆ）サイトカイン抗体アレイにより検出される、７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスの脳ホモジネートにおけるサイトカインタンパク質のレベルに及ぼすＯＭ１処置の影響（ｎ＝５～６）。ヒートマップ上の色は、Ｒｏｗ Ｚスコアによって正規化された相対サイトカインレベルを示し、赤はアップレギュレーションを受けているサイトカインを示し、青はダウンレギュレーションを受けているサイトカインを示す。 （ｇ～ｈ）脳スライスにおいて評価される７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスの海馬におけるＡβ陽性領域（ｇ）およびタウ陽性領域（ｈ）に及ぼすＯＭ１の影響（ｎ＝４～７）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。Ａβ分析に関して：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（Ｆ（２，１４）＝２２．７８）。タウ分析に関して：＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｆ（２，１５）＝１３．０６）は一元配置ＡＮＯＶＡによる。 （ｉ）７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスの弁別学習能を評価するための試験における、８０％の成功を達成するためにかかる１０４秒のタイムアウト（方法参照）に及ぼすＯＭ１の影響（ｎ＝１０～１３）。時間は、８０％の遂行レベルに到達する時間（秒）を意味し、長くかかるほど、認知障害の重症度が高い（方法参照）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（２，３１）＝９．７５１）による。 ＯＭ１は、アミノ酸代謝を利用することによって神経炎症を阻害する。 （ａ）ＭＢＲＯＬＥを用いた、ＯＭ１処置を伴うまたは伴わない７か月齢の５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウスの３１種の糞便代謝産物のパスウェイエンリッチメント分析（ｎ＝６～８）。エンリッチメント結果のリストを、Ｐ値＜０．０５の基準を用いてスクリーニングしたＫＥＧＧモジュールおよびＫＥＧＧ酵素の相互作用とともに示す。 （ｂ）ＷＴ（ｎ＝３０）およびＴｇ（ｎ＝２６）群間の血中アミノ酸のリストは、ランダムフォレストモデル（ツリーの数：５００；予測因子の数：７；ランダム性：オン；方法参照）を用いて疾病進行期に識別することができたものである。 （ｃ）ＷＴ、Ｔｇ、およびＯＭ１処置Ｔｇマウスの糞便中のヒスチジン、フェニルアラニンおよびイソロイシンレベルの変化（ｎ＝６～１１）。赤、アップレギュレーション；青、ダウンレギュレーション。 （ｄ）ＷＴ、Ｔｇ、およびＯＭ１処置Ｔｇマウスの血中のヒスチジン、フェニルアラニンおよびイソロイシンレベルの変化（ｎ＝６～７）。赤、アップレギュレーション；青、ダウンレギュレーション。 （ｅ）フェニルアラニンおよびイソロイシンにより誘導されるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ０細胞）の、Ｔｈ１細胞への分化に及ぼすＯＭ１の影響。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をフェニルアラニン（１ｍＭ）またはイソロイシン（１ｍＭ）の存在下、ＯＭ１を伴って／伴わずに３日間培養した。Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋）細胞の頻度をフローサイトメトリーによって試験した。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表し、各群ｎ＝３の反復とする。左の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（２，６）＝１５．６４）による。右の＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（２，６）＝１０．３５）による。 （ｆ）フェニルアラニンおよびイソロイシンにより誘導されるＴｈ１細胞の増殖に及ぼすＯＭ１の効果。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅで染色し、フェニルアラニン（１ｍＭ）およびイソロイシン（１ｍＭ）の存在下、ＯＭ１を伴って／伴わずに３日間培養した。Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋）細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｅ蛍光の強度をフローサイトメトリーにより試験した（方法参照）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す、ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（４，９）＝２８．３４）による。 （ｇ）フェニルアラニンおよびイソロイシンの４日の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後の血中Ｔｈ１細胞変化（ｎ＝６）。＊＊＊Ｐ＜０．００１は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（２，２１）＝１０１．８）による。 （ｈ）健常対照（ＨＣ）およびＡＤによる軽度認知障害（ＭＣＩ）患者（第１コホート、ＡＤによるＭＣＩはｎ＝９、ＨＣはｎ＝１８）におけるアミノ酸変化のランダムフォレスト分類。 （ｉ）健常対照（ＨＣ）およびＡＤによる軽度認知障害（ＭＣＩ）患者（第１コホート、ＡＤによるＭＣＩはｎ＝８、ＨＣはｎ＝９）の血中のＴｈ１細胞の頻度。＊Ｐ＜０．０５はスチューデントのｔ検定による。縦軸は、Ｔｈ１細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージである。 （ｊ）健常対照（ＨＣ）およびＡＤによる軽度認知障害（ＭＣＩ）患者（第２コホート、両群ともｎ＝２２）の血中のフェニルアラニンおよびイソロイシンのレベル。＊Ｐ＜０．０５はスチューデントのｔ検定による。 ＡＤ進行および介入戦略における神経炎症の概略図 ＡＤ進行中の腸内微生物叢の変化はアミノ酸代謝の混乱を引き起こす。それは血中でナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の、Ｔｈ１細胞への分化を促進する。その間、アミノ酸およびＴｈ１細胞は血液循環を介して脳に浸潤することができる。末梢免疫細胞の浸潤およびミクログリアの活性化は、脳において病的な神経炎症をもたらし、認知障害に至る。ＯＭ１の経口投与は、腸内微生物叢を修復し、アミノ酸の異常な産生を阻害し、末梢免疫細胞の脳への浸潤を低減し、やがて神経炎症を消散することができる。 （ａ－ｂ）２か月齢の野生型（ＷＴ）マウスに対する５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（２、３、５、７、および９か月齢）由来の海馬切片におけるＡβ陽性領域（ａ）およびリン酸化タウ（ｐ－ＴＡＵ）陽性領域（ｂ）の変化（ｎ＝２～７）。代表的な蛍光画像を示し、スケールバーは１００μｍを表す。ラインチャートは、ＷＴマウスに対する総ての個々のポイントからの結果をまとめたものであり、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。ラインのフィッティングには三次スプラインアルゴリズムを用いる。Ｍ、月数。 （ｃ）ＷＴおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（２、３、５、７、および９か月齢）における操作的分類単位（ＯＴＵ）レベルでの腸内微生物叢組成の主成分分析（ＰＣＡ）からの主成分（ＰＣ）１（ｎ＝４～１０）。赤いポイントおよびラインはＴｇマウス；青いポイントおよびラインはＷＴマウス。フィッティングを行わずに自然に直線につながる。両側ウィルコクソンの順位和（階層和）検定を使用；＊は、同じ群の２か月齢と比較した有意差を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。＃は、齢が適合したＷＴマウスと比較した有意差を示す。＃Ｐ＜０．０５；＃＃Ｐ＜０．０１；＃＃＃Ｐ＜０．００１。 （ｄ）５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（２、３、５、７、および９か月齢）における科階級の腸内微生物の相対存在量の変化（ｎ＝４～１０）。異なる色は異なる科を表す。 （ｅ）５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（２、３、５、７、および９か月齢）の腸内微生物叢比較のＬＥｆＳｅ(linear discriminant analysis effect size）分析のクラドグラム（ｎ＝４～１０）。最も高い識別力を有する細菌を各月のグラフに表示する。色は、各月に存在度が高まった細菌分類群を示す。内円から外円は異なる分類レベルを示す（内円から外円へ、門、綱、目、科および属）。Ｍ、月数。ウェルコミクロビウム門(Verrucomicrobia)；アルファプロテオバクテリア門（AlphaProteobacteria）；バクテロイデス門；プレボテラ門(Prevotellaceae)；エリュシペロトリクス門(Erysipelotrichia)；ファーミキューテス門；ラクノクロストリジウム門(Lachnoclostridium)。 （ｆ）３、６、８、９、１２および１４か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスにおけるＯＴＵレベルでの腸内微生物叢のＰＣＡ分析（ｎ＝４～１２）。色および形は、異なる月数からのデータを示す。カラーの楕円は、各試験群内の０．９５信頼区間（ＣＩ）範囲を示す。ＰＣ、主成分。 （ｇ）３、６、８、９、１２および１４か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの門階級での腸内微生物の相対存在量の変化（ｎ＝４～１２）。色は異なる門を表す。Ｍ、月数。 （ｈ）２か月齢の野生型（ＷＴ）マウスに対する５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（２、３、５、７、および９か月齢）由来の海馬切片のＩＢＡ１陽性領域における代表的な蛍光画像変化（ｎ＝２～７）。スケールバーは、小枠（上）内は５００μｍを表し、大枠（下）内は２５０μｍを示す。Ｍ、月数。 （ｉ）フローサイトメトリーによって検出した場合に３、６、９および１４か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの全脳ホモジネートにおいて検出された浸潤細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈ）の頻度の変化（ｎ＝５～８）。細胞総数はＣＤ４５＋細胞の頻度に対して表し、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）の形式とする。ラインのフィッティングには三次スプラインアルゴリズムを用いる。 （ｊ）フローサイトメトリーによって検出した場合に３、６、９および１４か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの全脳ホモジネートにおける浸潤末梢Ｔｈ１細胞の頻度の変化（ｎ＝３～８）。Ｔｈ１細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）はＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に対して表す。データは平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。ラインのフィッティングには三次スプラインアルゴリズムを用いる。 ２、４、８および１８か月齢のＭｏｕｓｅａｃデータベースからの５つの動物モデルおよび野生型（ＷＴ）マウスにおけるＡＤの特徴の変化。 （ａ）Ａβ斑またはタウ神経原線維錯綜の相対密度の変化（各群ｎ＝４）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。色は異なるモデルを示し、ラインのフィッティングには多項式アルゴリズムを用いる。 （ｂ）シナプトフィジンのｌｏｇ２正規化発現レベルの変化（各群ｎ＝４）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。色は異なるモデルを示し、ラインのフィッティングには多項式アルゴリズムを用いる。 （ｃ～ｄ）Ｍ１およびＭ２細胞総数の変化を表す、ＣＤ８６およびＡＲＧ１のｌｏｇ２正規化発現レベルの変化（各群ｎ＝４）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。色は、異なるモデルを示し、ラインのフィッティングは多項式アルゴリズムを用いる。 （ｅ～ｈ）Ｔｈ１およびＴｈ２総数の変化を表す、ＴＩＰＭ、ＣＣＬ３、ＧＡＴＡ－３およびＭＩＦのｌｏｇ２正規化発現レベルの変化（各群ｎ＝４）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。色は、異なるモデルを示し、ラインのフィッティングには多項式アルゴリズムを用いる。 （ａ）７か月齢のＷＴ、共飼育ＷＴおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの弁別学習能を評価するための試験における、８０％の成功を達成するためにかかる１０４秒のタイムアウトに及ぼす共飼育の影響（ｎ＝５～８）。かかる時間は８０％の遂行レベルに達するまでの時間（秒）を意味し、かかる時間が長いほど、認知障害の重症度が高い（方法参照）。 （ｂ）Ａβを注射したＷＴレシピエントマウスにおける、脳内免疫細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）の総数に及ぼす、ＷＴマウスまたは５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスのいずれかの糞便を用いた糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）の影響（方法参照）。Ｔｈ１細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）およびＴｈ２細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６－ＣＣＲ４＋）は、ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞に対して表し（ｎ＝６～８）、データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。 （ｃ）５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの脳内Ｔｈ１細胞に及ぼす２か月齢のＷＴマウスからのＦＭＴの影響（ｎ＝６～７）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。 （ａ）ＯＭ１を経口投与した７か月齢の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの腸内微生物叢組成のＬＥｆＳｅ(linear discriminant analysis effect size）分析のクラドグラム（ｎ＝５～７）。最も高い識別力を有する細菌の門階級をグラフに表示する。青は、７か月齢のＴｇマウスにおいて存在度が高まった細菌。赤は、ＯＭ１を受容した７か月齢のＴｇマウスにおいて存在度が高まった細菌。内円から外円は異なる分類レベルを示す（内円から外円へ、門、綱、目、科および属）。Ｍ、月数。 （ｂ－ｃ）７か月齢の５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける、ＯＭ１によって生じたアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを受けた微生物を含む微生物叢と脳内免疫細胞サブタイプの頻度の間の相関。黄色のアスタリスク（＊）が付いた赤い四角（正の相関）または青い四角（負の相関）は、ピアソンのパラメトリック相関検定により評価したＰ＜０．０５を有し、各四角の中の数字は相関係数である。 （ｄ）ＷＴ、ＴｇおよびＯＭ１処置Ｔｇの脳海馬におけるＩＢＡ１染色、Ａβ沈着およびタウのリン酸化の代表的な画像。スケールバーは２５０μｍを表す。陽性シグナルは、基質３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて可視化し、暗褐色として示される。 （ｅ）Ａβ海馬注射を行ったレシピエントＣ５７マウスにおける脳内Ｔｈ１細胞に及ぼすＷＴ、ＴｇおよびＯＭ１処置ＴｇマウスからのＦＭＴの影響（ｎ＝４～５）。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。 （ｆ）ＯＭ１を経口投与した６か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックモデルマウスにおける、属階級の腸内微生物叢の相対存在量に及ぼす、抗生物質処置（アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、およびコリスチン（０．１ｍｇ／ｍＬ）の影響（ｎ＝６～８）。色は異なる属を示す。 （ｇ）抗生物質で処置した６か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳内Ｔｈ１細胞頻度に及ぼすＯＭ１の影響（方法参照）。Ｔｈ１細胞（ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）は、ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞に対して示す（ｎ＝６～８）、データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。左から右へ：＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。ＮＳ、有意でない。 （ｈ）抗生物質で処置した６か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス由来の海馬切片で検出されたＩＢＡ１陽性免疫蛍光染色の相対密度に及ぼすＯＭ１の影響（ｎ＝４～６、方法参照）。ＩＢＡ１陽性領域は、ミクログリア細胞の活性化を表す。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１はスチューデントのｔ検定による。ＮＳ、有意でない。 （ｉ）抗生物質を伴ってまたは伴わずにＡＰＰ／ＰＳ１およびＯＭ１で処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳におけるＩＢＡ１の代表的な免疫蛍光染色。ＩＢＡ１は、ＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体を用いて可視化し、緑として示される。核はＤＡＰＩで染色し、青として示される。スケールバーは２５０μｍを表す。 （ｊ）サイトカイン抗体アレイによって検出した場合の、７か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳ホモジネートにおけるサイトカインレベルに及ぼすＯＭ１の影響（ｎ＝５～６）。ヒートマップの色は、Ｒｏｗ Ｚスコアによって正規化した相対サイトカインレベルを示し、赤はアップレギュレーションを受けているサイトカインを示し、青はダウンレギュレーションを受けているサイトカインを示す。 （ａ）細菌上清で処理したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞への分化に及ぼすＯＭ１の影響。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を培養し、５ＸＦＡＤマウスの微生物叢からの上清を３日間、ＯＭ１の存在下／不在下で加えた。フローサイトメトリーにより、Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋）細胞およびＴｈ２（ＣＤ４＋ＩＬ－４＋）細胞にゲートを設定した。データは、平均±平均の標準誤差（平均±ｓｅｍ）として表し；各群ｎ＝３の反復とする。 （ｂ～ｃ）このボルカノプロットは、７か月齢のＷＴおよび５ＸＦＡＤ（Ｔｇ）マウス（ｎ＝６－８）（ｂ）およびＯＭ１で処置したまたは処置しない７か月齢のＴｇマウス（ｎ＝６）（ｃ）の腸内糞便メタボロミクスの生データからの代謝産物の分布を表す。赤のポイントは、有意に変化する代謝産物を示す。有意は、スチューデントのｔ検定のＰ値＜０．０５および（Ｔ）と野生型（ＷＴ）の変化倍率（ＦＣ）間で＜０．８３または＞１．２の変化倍率（ＦＣ）と定義される。ｘ軸はｌｏｇ２ＦＣを示し、ｙ軸は－ｌｏｇ１０Ｐを示す。 （ｄ～ｅ）ＴｇマウスとＷＴマウス間で差次的に調節された７８６の代謝産物（ｄ）、ならびにＯＭ１処置マウスと非処置Ｔｇマウス間の１４９の代謝産物（ｅ）のヒートマップ（ｎ＝６～８）。これらの代謝産物は、オンラインＭＥＴＬＩＮデータベースを用いて、有意なピークの分子質量データ（ｍ／ｚ）をアラインすることによって同定およびアノテーションを行った。 （ｆ）このベン図は、ＴｇマウスとＷＴマウス（Ｔ＿Ｗ）間およびＯＭ１処置マウスと非処置Ｔｇマウス間（Ｔｔｒｅａｔ＿Ｔ）で共通に脱調節された腸内糞便代謝産物を示す（ｎ＝６～８）。１２４の代謝産物は、２つの比較によって逆転したパターンを有しており、すなわち、代謝産物は、両方ともＴ＿Ｗが高く、Ｔｔｒｅａｔ＿Ｔが低いか、またはＴ＿Ｗが低く、Ｔｔｒｅａｔ＿Ｔが高いかのいずれかである。 （ｇ）このヒートマップは、３つのデータベース（ヒト代謝産物データベース（ＨＭＤＢ）、ＭＥＴＬＩＮ、ＫＥＧＧ(Kyoto Encyclopedia of Gebes and Genomes)）の総てにマッチし得た、ＷＴ、ＴｇおよびＯＭ１処置Ｔｇ群の間で差次的に調節されていた３１の同定された代謝産物を示す（ｎ＝６～８）。赤はアップレギュレーション；青はダウンレギュレーション。 （ｈ）疾病進行中の全アミノ酸の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）値を、ランダムフォレストアルゴリズムを用いて計算する。 （ｉ）血中フェニルアラニンおよびイソロイシンレベルに及ぼす糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）の影響。２か月齢のＷＴマウスの糞便を、７か月齢のＴｇマウスに移植した（ｎ＝６～７）。フェニルアラニンに関して、＊＊＊Ｐ＜０．００１（（Ｆ（２，１７）＝２６．５９））。イソロイシンに関して、＊＊Ｐ＜０．０１（Ｔｇ対ＷＴ）、＊＊Ｐ＜０．０１（Ｔｇ＋ＦＭＴ対Ｔｇ）は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｆ（２，１７）＝８．１８１）による。 （ｊ）種々の月（Ｍ）齢のＷＴ、共飼育ＷＴおよびＴｇの血液サンプルにおけるアミノ酸レベル。赤はアップレギュレーション；青はダウンレギュレーション。 （ｋ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞によるフェニルアラニンの取り込み。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、１３Ｃ標識フェニルアラニンを伴って／伴わずに０．５時間培養した。フェニルアラニン関連化合物の質量分析を調べた。１３Ｃ－フェニルアラニンは５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で投与し、Ｌ型アミノ酸輸送体により取り込まれる。 ＪＰＨ２０３ ５０ｍｇ／ｋｇは、脳のＴｈ１細胞の割合を効果的に抑制する。 対照と比較したＯＭ１投与後の腸内細菌のＯＴＵレベルの変化傾向－移植１週間後の糞便中のフェニルアラニン含量に及ぼすフェニルアラニン分解菌の影響のＰＣｏＡ分析 対照と比較したＯＭ１投与後の腸内細菌の相対存在量の変化傾向。移植１週間後の血中のＴｈ１細胞の割合に及ぼすフェニルアラニン分解菌の影響。 対照と比較したＯＭ１投与後の脳内サイトカイン含量の変化傾向。 腸内微生物の相対存在量を調節するために使用する薬剤：ＯＭ１または糞便細菌（腸内微生物複合体）の適用前および後の腸内微生物の分布における変化。 一部を詳細に列挙したＡＤおよびＨＣ間の門階級および属階級での違い。ＡＤ：ＡＤ患者；ＨＣ：Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ 健常対照。 ＡＤおよびＨＣの一部は細菌叢（属および種階級）を有意に変化させた。ＡＤ：ＡＤ患者；ＨＣ：Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ 健常対照。 ＡＤに関連するアミノ酸のリスト。多変量ＲＯＣ曲線に基づく探索的分析（Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、種々の月齢の野生型マウスおよび５ＸＦＡＤマウスの血中アミノ酸を分析し、野生型マウスと５ＸＦＡＤマウスを識別するためのマーカーとして可能性のあるアミノ酸の組合せを探した。以下は、選択頻度および全分類により選別された上位１５のアミノ酸リストである。 １か月間１００ｍｐｋ ＯＭ１を受容した後の、６．５か月齢の５ＸＦＡＤマウスは、野生型マウスの血中アミノ酸に回復する傾向にある血中アミノ酸を有する。 １か月間１００ｍｐｋ ＯＭ１を受容した後の６．５か月齢の５ＸＦＡＤマウスは、野生型マウスの糞便アミノ酸に回復する傾向にある糞便アミノ酸を有する。 ＯＭ１投与後に回復したサイトカインのリスト。６．５か月齢の５ＸＦＡＤマウスは１か月間１００ｍｐｋ ＯＭ１処置を受容し、野生型マウスの脳内サイトカインに回復する傾向にある脳内サイトカインを有した。 種々の月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける脳内Ｍ１細胞の変化傾向。
発明の詳細な説明
以下、本明細書に開示される生成物、方法、および使用の構造、機能、製造、および適用の原理の包括的理解を提供するために特定の例示的実施形態を記載する。これらの実装形態のうち１以上の例を後段で例示する。当業者は、本明細書に具体的に記載され、添付図面で具体的に説明される生成物、方法、および使用が限定されない例示的実施形態であり、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解するであろう。１つの例示的実施形態とともに説明または記載される特徴は、他の実施形態の特徴と組み合わせてよい。このような改変および変更は本発明の範囲内に含まれることが意図される。本明細書に引用されている刊行物、特許および特許出願は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
本発明の記載に関して（特に、下記の特許請求の範囲に関して）、本明細書において特に明記しない限りまたは文脈による明らかな矛盾がない限り、用語「１つの(a/an)」および「その(the)」ならびに類似の表現の使用は、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。特に明記しない限り、用語「を含んでなる」、「を有する」、「を含む」および「を含有する」は、オープンエンドの用語（すなわち、「限定するものではないが含む」）として解釈されるべきであるが、それらはまた「から実質的になる」および「からなる」の部分的クローズまたはクローズの用語も含む。本明細書において特に明記しない限り、本明細書の数値範囲の記載は、その範囲内に入る各個の値を独立に参照するための略記法として使用することを意図するにすぎず、各個の値は、それが本明細書に独立に列挙されているかのように本明細書に組み入れられる。本明細書において特に明記しない限り、または文脈による明らかな矛盾がない限り、本明細書に記載の総ての方法は、いずれの好適な順序で行ってもよい。特に明記しない限り、本明細書に示されるありとあらゆる例または例示用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く説明することを意図したものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいずれの用語も、特許請求されない要素が本発明の実施に必要であることを示すものと解釈されるべきでない。パーセンテージは総て重量パーセンテージであり、重量パーセンテージは総て組成物の総重量（任意選択の濃縮および／または希釈を行わない）に基づく。「１以上」という表現は、「２以上」および「３以上」などを含む。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。以上の説明を読んだ後、これらの好ましい実施形態に対する変更は、当業者に自明となるであろう。本発明者は、当業者がこのような変更を適宜採用するであろうと考え、また、発明者は、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは異なる様式で実施されるであろうと考えている。よって、本発明は、適用法によって許容される、添付の特許請求の範囲に記載の対象のあらゆる改変および等価物を含む。さらに、本明細書において特に明記しない限り、または文脈による明らかな矛盾がない限り、本発明は、上述の要素のあらゆる可能性のある変形形態のいずれの組合せも包含する。
本出願に一連の値が列挙される場合、列挙されているいずれの値もその数値範囲の上限または下限であり得ると理解されるべきである。また、本発明は総てのこのような数値範囲、すなわち、上限と下限の組合せを有する範囲を包含し、この上限および下限の個々の値は本発明に列挙される数値のいずれでもあり得ると理解されるべきである。例えば、１～１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の値の総て含み、該当する場合には分数値も含むと理解されるべきである。ある値「まで」（例えば、５まで）と表現される範囲は、０、１、２、３、４、および５などの総ての値（その範囲の上限を含む）として理解されるべきであり、該当する場合には分数値も含む。長くて１週間または１週間以内は、０．５、１、２、３、４、５、６または７日を含むと理解されるべきである。同様に、「少なくとも」によって定義される範囲は、示されている低い方の値とそれより高い総ての値を含むと理解されるべきである。
特に明記しない限り、パーセンテージは総て重量／重量である。
本発明において使用する場合、「約／およそ」は、平均値の３標準偏差内または特定の分野の標準許容範囲内に含まれると理解されるべきである。特定の実施形態では、約は、０．５を超えない変動と理解されるべきである。「約／およそ」は、後に列挙される総ての値を修飾する。例えば、「約１、２、３」は、「約１」、「約２」、「約３」を意味する。
特段の明示がない限り、用語「または」は、本発明において、用語「および／または」を指して包含的に使用され、それと互換的に使用することができる。
用語「例えば(such as)／例えば(for example)／例えば(e.g）」は、本発明において、「例えば(such as)／例えば(for example)／例えば(e.g）限定するものではないが)を表して使用され、それらと互換的に使用することができる。
当業者は、上記の種々の実施形態に記載される技術的特徴は単独で使用することもできるし、または本発明の種々の側面の技術的解決策と組み合わせて使用することもできると理解するべきである。
本発明者らは、重度かつ加速化された認知障害のためにＡＤ研究に広く使用されている５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデルを使用した。ＡＤ進行の種々の段階でＴｇマウスおよびＷＴマウスのエンテロタイプを分析することにより、Ｔｇマウスの腸内微生物叢が極めて動的であることが判明した（図１ｄ）。２～３か月齢では、バクテロイデス門、ファーミキューテス門およびウェルコミクロビウム門が３つの最も存在度の高い細菌門であり（それぞれ４６．８％、３２．３％および１２．６％）、７～９か月齢では、ファーミキューテス門が優勢細菌となり、バクテロイデス門およびウェルコミクロビウム門の存在量は有意に減少した。これはＷＴマウスの腸内微生物叢とは極めて対照的である。
本発明者らは、また、末梢免疫細胞Ｔｈ１およびＴｈ１ならびにミクログリアＭ１およびＭ２を分析し、ＣＤ４＋細胞の２つの主要なサブタイプ（浸潤Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）が、ミクログリアの２つの主要なサブタイプ（Ｍ１およびＭ２ミクログリア）と同様の動態を示したことを見出した（図１ｆおよび図１ｊ）。初期において、それは主としてＴｈ２細胞および神経保護Ｍ２ミクログリアであり、後期では、それは主としてＴｈ１細胞および炎症誘発性Ｍ１ミクログリアである。本発明者らは、腸内微生物叢パターンが変化すると、免疫細胞集団がＴｈ１およびＭ１優勢状態となる傾向にあると考える。
本発明者らは、また、Ｔｇマウスにおいて腸内微生物叢の存在量と脳内免疫細胞の間の相関を分析し、さらに、初期（２～３か月）の細菌組成は脳内のＭ２およびＴｈ２細胞総数と高い相関があり（図１ｋ上）、後期（７～９か月）では、細菌パターンの変化がＭ１およびＴｈ１細胞と高い相関を持っていた（図１ｋ下）ことを示した。全体的に見れば、これらの結果は、ＡＤの進行中に、腸内細菌は末梢免疫細胞浸潤および神経炎症に関連することを示す。
さらに、本発明者らは、種々の末梢免疫細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、樹状細胞（ＤＣ）および単球を含む）の脳への浸潤には腸内微生物叢の破綻が必要であることを明らかにした。とりわけ、Ｔｈ１細胞は、ＡＤの進行中にＭ１ミクログリアの活性化に密接に関連していることから特に注目すべきである。脳におけるＴｈ１とＭ１ミクログリアの間の機能的クロストークが認識されていることから、本発明者らは、腸内破綻がＴｈ１細胞の浸潤を促進して、Ｍ１ミクログリアとの局部的クロストークを可能とし、それにより、ミクログリアの、炎症誘発状態への分化を誘発することを提示する。本研究で得られた一連の発見によって、この機序の洞察は強められた。第１に、ＡＤの進行中の腸内微生物叢の組成の動的変化は、Ｔｈ１細胞の浸潤の増加に有意に関連している。第２に、ＡＤマウスにおいて、抗生物質処置による腸内微生物叢の除去(ablation)は、Ｔｈ１細胞の浸潤および次いでＭ１ミクログリアの活性化を遮断した（図２ａ～ｃ）。第３に、長期糞便細菌曝露（共飼育実験）およびＡＤマウス由来の糞便細菌の糞便微生物叢移植は両方とも、ＷＴマウスにおいてＴｈ１細胞の浸潤（図２ｅ）およびＭ１ミクログリアの活性化を有意に高め、一方、ＷＴマウス糞便微生物叢の、Ｔｇマウスへの移植は、レシピエントＴｇマウスのＴｈ１細胞を減少させた（図９ｃ）。本発明者らの研究結果は全体として、ＡＤの進行においてＴｈ１／Ｍ１ミクログリアにより導かれる神経炎症を促進するための駆動因子としての腸内微生物叢を強調する。
ＡＤにおける腸内微生物叢の破綻と神経炎症の間の因果関係はまだ明らかでない。本研究で、本発明者らは、１００を超える代謝産物がＷＴマウスと比較してＡＤマウスで有意に変化していたことを検出した。とりわけ、最も有意な変化は、特にフェニルアラニン関連経路のアミノ酸に生じた。本発明者らは、ＷＴマウスに比べてＡＤマウスの糞便および血液でフェニルアラニンおよびイソロイシンの存在量が増していたことを確認することができた。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方の機能評価によって、末梢炎症性Ｔｈ１細胞の分化および増殖の促進おけるフェニルアラニンおよびイソロイシンの役割が明らかになった。腸内微生物叢を除去するための抗生物質の使用は、同時に血中フェニルアラニンおよびイソロイシン、Ｔｈ１細胞の浸潤、およびＭ１細胞の活性化をもたらす。これらの所見は、Ｔｈ１細胞によって支配される神経炎症の刺激における、腸内微生物叢におけるフェニルアラニンおよびイソロイシンの異常な産生の役割を強調する。この観点と一致して、本発明者らは、ＡＤによって引き起こされるＭＣＩ患者の血中のフェニルアラニン／イソロイシン濃度およびＴｈ１細胞総数は健常対照群よりも高いことを検出した。
新たに浮上しているデータは、多糖類またはオリゴ糖類が腸内微生物叢を調節するという利点を持っていることを示す。マンヌロン酸オリゴ糖は、炭水化物系抗ＡＤ薬である。最近中国で終了した第ＩＩＩ相臨床試験において、軽度～中等度ＡＤの患者において認知障害を改善することが実証された。マンヌロン酸オリゴ糖は十分な忍容性があり、プラセボ対照と同等の安全性を有する。本研究において、本発明者らは、ＯＭ１が腸内微生物叢を有効に再調整し（図４ａ～ｂ；図１０ａ）、糞便および血液中のフェニルアラニンおよびイソロイシンの量を減らし（図５ｃ～ｄ）、Ｔｈ１関連神経炎症を軽減する（図４ｇ～ｉ）ことを見出した。ＯＭ１とともに処置されるＴｇ糞便はＯＭ１処置自体の治療効果を主として模倣し、抗生物質処置はその治療効果を排除するということは注目すべきことである。これらの所見は、ＯＭ１の治療効果が主として腸内微生物叢の回復によるものであるという重要なエビデンスを提供する。よって、ＯＭ１は、微生物叢に重点を置いたＡＤ治療戦略に魅力的なアプローチを提供することができ、さらなる研究の価値がある。
これらの所見は総て、本発明者らがＡＤの病因を理解する上での概念的発展を提案することを可能とする。ＡＤは局部的なＡβによって駆動される脳疾患であるばかりか、その発症にも腸、脳、および中間的炎症因子の間の全身的な相互作用が必要である（図６）。Ａβ沈着の場合、ＡＤ進行中に変化した腸内微生物叢組成がアミノ酸（特に、フェニルアラニンおよびイソロイシン）の異常な増加を引き起こす。これらのアミノ酸は、血液循環を介して、末梢Ｔｈ１細胞の、脳への浸潤を促進する。浸潤末梢Ｔｈ１細胞は脳内で局部的にＭ１ミクログリアとクロストークし、病的な神経炎症および認知障害をもたらし得る。ＡＤの病因に対するこれらの洞察は、抗神経炎症性応答を促進し、新たな治療解決策を提供すべく、腸内微生物叢を再調整するために使用することができる。
本発明者らの研究結果は、ＡＤの診断および治療に変革的重要性を有し得る。特定の細菌（例えば、Ｔｈ１／Ｍ１関連細菌）、アミノ酸（例えば、フェニルアラニンおよびイソロイシン）および脳浸潤免疫細胞（例えば、Ｔｈ１細胞優勢）の組成またはそれらの１以上の組合せは、ＡＤによって引き起こされたＭＣＩ患者の初期診断バイオマーカーとして使用することができ、大きなＡＤ患者コホートでさらなる確認を行う価値がある。
より重要なこととして、微生物叢に重点を置いたＯＭ１の、確立された抗ＡＤ効果は、今、腸内微生物叢を再調整することによる、ＡＤ治療の新規な治療アプローチを拓き、まだほとんど発見されていない糖化学を探索することによって未来に有効な療法の開発を導くであろう。
本発明者らによって特定された多くの特徴的な、脳腸軸に関連する腸内微生物、アミノ酸、免疫細胞およびサイトカインはそれぞれ、腸内微生物プロファイル、アミノ酸プロファイル、免疫細胞プロファイルおよびサイトカインプロファイルを構成する。これらのプロファイルの１以上（例えば、腸内微生物プロファイル）は、正常個体と罹患個体の間に違いを示す。本発明は、これらのプロファイルの１以上（例えば、腸内微生物プロファイル）を検出または調節することによって、個体の状態を検出または調節することを目的とする。いくつかの実施形態において、診断目的で、個体のプロファイル（例えば、腸内微生物プロファイル）を検出して、その個体が正常状態にあるかまたは罹患状態にあるかを決定するために、対応する正常個体の正常な特徴を有するプロファイル（例えば、腸内微生物プロファイル）および／または対応する罹患個体に特徴的な疾患を有するプロファイル（例えば、腸内微生物プロファイル）を比較し、それにより、その個体を診断することができる。いくつかの実施形態において、治療目的で、個体の疾患状態が正常状態に調節できるように、疾患特徴を有する個体のプロファイルを、対応する正常個体のプロファイルとなるように調整することができ、それにより、その個体を治療することができる。
よって、１つの側面において、本発明は、対象においてアルツハイマー病を治療するための薬剤の製造における、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤の使用を提供する。
別の側面において、本発明は、有効量の、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤を含んでなる、対象においてアルツハイマー病を治療するための医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、アミノ酸は以下から選択される１以上：４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン；好ましくは、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上；より好ましくは、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシン；最も好ましくは、フェニルアラニンである。
いくつかの実施形態において、薬剤は以下：アミノ酸分解経路の酵素；アミノ酸合成経路の酵素の阻害剤；アミノ酸リガンド；アミノ酸輸送体の作動剤もしくは阻害剤；腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤、またはそれらの組合せから選択される１以上を含んでなる。
いくつかの実施形態において、腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤は、炭水化物薬、腸内微生物複合体、またはそれらの組合せから選択され、炭水化物薬は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、もしくはそれらの誘導体、またはそれらの組合せおよび／もしくはそれらの誘導体、好ましくは、オリゴ糖類および多糖類、より好ましくは、マンヌロン酸オリゴ糖またはマンヌロン酸オリゴ糖を含んでなる組成物から選択され、腸内微生物複合体は、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、フソバクテリウム門、シアノバクテリア門、ウェルコミクロビウム門、またはそれらの組合せから選択される１以上を含んでなる。
いくつかの実施形態において、アミノ酸分解酵素は以下：フェニルアラニン－４－ヒドロキシラーゼ；フェニルアラニン２－モノオキシゲナーゼ；カタラーゼ－ペルオキシダーゼ；フェニルアセトアルデヒドシンターゼ；芳香族Ｌ－アミノ酸／Ｌ－トリプトファンデカルボキシラーゼ；フェニルアラニンデカルボキシラーゼ；フェニルアラニンＮ－アセチルトランスフェラーゼ；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；チロシンアミノトランスフェラーゼ；Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ；フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ；芳香族－アミノ酸トランスアミナーゼ；ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ；芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼＩＩ；フェニルアラニンラセマーゼ；フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；フェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼ；分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ；Ｌ－アミノ酸オキシダーゼから選択される１以上である。
いくつかの実施形態において、アミノ酸分解酵素は以下：フェニルアラニン－４－ヒドロキシラーゼ；芳香族Ｌ－アミノ酸／Ｌ－トリプトファンデカルボキシラーゼ；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；チロシンアミノトランスフェラーゼ、ＴＡＴ；Ｌ－アミノ酸酸オキシダーゼから選択される１以上である。
いくつかの実施形態において、アミノ酸分解酵素は、ベクターを介して送達され、好ましくは、ベクターは、アミノ酸分解酵素を発現することができる微生物（好ましくは、細菌、より好ましくは、大腸菌）である。
いくつかの実施形態において、対象由来の末梢血サンプルを検出することにより、薬剤は、そのアミノ酸レベルを約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００μＭもしくはそれを超えて調節し；および／またはそのアミノ酸レベルを対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる。
いくつかの実施形態において、対象由来の糞便サンプルを検出することにより、薬剤は、そのアミノ酸レベルを約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００μｍｏｌ／ｇもしくはそれを超えて調節し；および／またはそのアミノ酸レベルを対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる。
いくつかの実施形態において、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルの調節は、哺乳動物末梢血中の１以上のアミノ酸のレベルの増大、および／または哺乳動物末梢血中の１以上のアミノ酸の低下；好ましくは、以下：４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンから選択される１以上のアミノ酸のレベルの低下；より好ましくは、哺乳動物末梢血中の、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上のアミノ酸のレベルの低下；いっそうより好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンおよび／またはイソロイシンのレベルの低下；最も好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンのレベルの低下である。
さらに別の側面において、本発明は、アルツハイマー病を治療するために使用することができる薬物候補をスクリーニングするための方法であって、
ａ）試験薬剤を末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに投与すること、および
ｂ）アミノ酸レベルを調節する試験薬剤を、アルツハイマー病を治療するために使用することができる薬物候補として選択すること
を含んでなる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、この方法はまた、末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに陽性対照としてＧＶ－９７１を投与すること、好ましくは、ＧＶ－９７１と実質的に一致してアミノ酸レベルを調節する試験薬剤を選択することを含んでなる。
いくつかの実施形態において、この方法は、検証のために、末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに選択された試験薬剤を投与することをさらに含んでなり、哺乳動物モデル由来の末梢血サンプルを検出することにより、選択された試験薬剤は、そのアミノ酸レベルを５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００μＭもしくはそれを超えて調節し；および／またはそのアミノ酸レベルを対応する正常哺乳動物モデルの対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる。
いくつかの実施形態において、この方法は、検証のために、末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに選択された試験薬剤を投与することをさらに含んでなり、哺乳動物モデル由来の糞便サンプルを検出することにより、選択された試験薬剤は、そのアミノ酸レベルを１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００μｍｏｌ／ｇもしくはそれを超えて調節し；および／またはそのアミノ酸レベルを対応する正常哺乳動物モデルの対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる。
いくつかの実施形態において、このアミノ酸は以下：４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンから選択される１以上である；好ましくは、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上；より好ましくは、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシン；最も好ましくは、フェニルアラニンである。
いくつかの実施形態において、アミノ酸レベルの調整は、１以上のアミノ酸のレベルの増大および／または１以上のアミノ酸のレベルの低下；好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上のアミノ酸のレベルの低下；より好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンおよび／またはイソロイシンのレベルの低下；最も好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンのレベルの低下である。
さらに別の側面において、本発明は、アルツハイマー病を有する患者を治療するための方法であって、
（ａ）患者のアミノ酸レベルを検出し、それを対応する正常集団の対応するアミノ酸レベルと比較して、そのレベルが対応する正常集団の対応するアミノ酸のレベルとは異なるアミノ酸を選択すること；
（ｂ）選択されたアミノ酸のレベルを調節して対応する正常集団の対応するアミノ酸レベルに近づける、または到達させるために、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤を患者に投与すること
を含んでなる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、炭水化物薬はＯＭ１である。
いくつかの実施形態において、炭水化物薬はＯＭ１でない。
いくつかの実施形態において、マンヌロン酸オリゴ糖はＯＭ１である。
いくつかの実施形態において、マンヌロン酸オリゴ糖はＯＭ１でない。
マンヌロン酸オリゴ糖の構造および製造方法は、多くの先行技術文献に記載されている。先行技術特許ＣＮ２０１６１００６９７０３９は、オリゴマンヌロン酸の製造方法を開示し、先行技術特許ＣＮ２０１７１０７９６４８５３は、マンヌロン酸の重量平均分子量および量を決定するための方法を開示し、先行技術特許ＣＮ２０１７１１４６７５９６６は、マンヌロン酸の組成およびその製法を開示し、これらは総て引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。本発明において使用されるＯＭ１は、ＣＮ２０１８１０７２１３２７６による組成物Ａ（「アルギン酸オリゴサッカリン酸組成物」）であり、引用することにより本明細書の一部とされる。
微生物叢
本明細書では、対象の腸管内の微生物叢を変化させることを含む方法および組成物が開示される。用語「微生物叢」は、生物の腸管内に見出すことができるまたは存在する（定着する）１以上の細菌集団を指して使用される。この用語は、本明細書では、「微生物(microbes/microorganism)」または「腸内微生物(gut microbes/microorganism)」と互換的に使用することができる。２つ以上の微生物叢に関して、微生物叢は同じ型（株）であっても、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、および／またはファーミキューテス門、またはその亜群（綱、目、科、属、種）などの群の混合物であってもよい。微生物叢は、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門および／またはファーミキューテス門などの同じ階級の微生物の混合物であってよく、バクテロイデス門およびプロテオバクテリア門などの異なる階級の微生物の混合物であってもよい。
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、表１の門、綱、目、科、属、もしくは種、またはそれらの組合せから選択される１以上から選択される。
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、表２の門、綱、目、科、属、もしくは種、またはそれらの組合せから選択される１以上から選択される。
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、フソバクテリウム門、シアノバクテリア門、ウェルコミクロビウム門、またはそれらの組合せから選択される１以上から選択される。
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、下表の門またはそれらの組合せから選択される１以上である。
Figure 2022543014000002
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、下表の綱またはそれらの組合せから選択される１以上である。
Figure 2022543014000003
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、下表の目またはそれらの組合せから選択される１以上である。
Figure 2022543014000004
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、下表の科またはそれらの組合せから選択される１以上である。
Figure 2022543014000005
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、下表の属またはそれらの組合せから選択される１以上である。
Figure 2022543014000006
いくつかの実施形態において、腸内微生物は、以下の種またはそれらの組合せから選択される１以上である。
Figure 2022543014000007
本発明者らは、様々な腸内微生物が本発明に従って脳腸軸に関与することを見出した。実施例に示されるように、ＷＴマウスとＴＧマウスの間で、いくつかの腸内微生物のレベルが変化し、例えば、ＯＭ１の投与後に、これらの腸内微生物のレベルはＷＴマウスに回復した。このような腸内微生物は、腸内微生物のプロファイルを構成する。先に述べたように、このようなプロファイルは、診断目的および／または治療目的で使用することができる。
いくつかの実施形態において、対象における、上記の表の門、綱、目、科、属、および種から選択される１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６または６７）の腸内微生物のレベルの、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに比べての変化（例えば、増加または低下）は、その対象がＡＤを有するリスクがあるかまたはＡＤを有することを示す。１つの実施形態において、対象における、上記の表の門、綱、目、科、属、および種の腸内微生物からなる腸内微生物プロファイル中の腸内微生物のレベルの、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の変化（例えば、増加または低下）は、その対象がＡＤを有するリスクがあるかまたはＡＤを有することを示す。
いくつかの実施形態において、ＡＤを有する対象における、上記の表の門、綱、目、科、属、および種から選択される１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６または６７）の腸内微生物のレベルの、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに比べての、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに向かう変化（例えば、増加または低下）は、その対象が適当な処置を受けていることを示す。１つの実施形態において、ＡＤを有する対象における、上記の表の門、綱、目、科、属、および種の腸内微生物からなる腸内微生物プロファイル中の腸内微生物のレベルの、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに比べての、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに向かう、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の変化（例えば、増加または低下）は、その対象が適当な処置を受けていることを示す。
腸内微生物の相対存在量は、以下の方法：関連する微生物叢を含んでなる組成物を投与するか、または関連する腸内微生物の相対存在量を有意に増加および／または減少させる１以上の化合物を含んでなる組成物を投与することで、本発明の組成物または方法を使用することによって変化させることができる。
バクテロイデス門は、３つの主要な細菌綱：バクテロイデス、フラボバクテリアおよびスフィンゴバクテリアを含んでなる。それらは土壌、堆積物、海水、ならびに動物の腸および皮膚を含む環境中に分布している。
プロテオバクテリア門は、最大の細菌門である。これらの生物は極めて高い代謝多様性を示し、最も知られた細菌の医学的、工業的、および農業的重要性を表す。これは進化的、地質学的および環境的に重要である。総てのプロテオバクテリア門の細菌はグラム陰性であり、それらの外壁はリポ多糖類から構成される。多くはガス小胞、鞭毛を有し、またはスライディングによって移動することができ、それらは柄、その他のアペンデジを有することがあり、または多細胞の子実体を形成する能力がある。ほとんどのものは通性または偏性嫌気性、独立栄養性および従属栄養性であるが、例外もある。光合成ができる種もあれば、細胞の内外に硫黄を貯蓄する種もある。
ファーミキューテス門は、主としてグラム陽性細菌の門である。しかしながら、少数のものは有孔性の偽外膜を有し、このことがそれらをグラム陰性にしている。科学者はかつてファーミキューテス門を総てのグラム陽性細菌を含むと分類していたが、最近、それらは低Ｇ＋Ｃと呼ばれる関連形態とともにコア群として定義されている。それらは主として球菌（単球菌）と呼ばれる球状細胞か、または桿状（桿菌）である。多くのファーミキューテス門は、乾燥に耐性がある内生胞子を産生し、極限状態で生き残ることができ、それらを様々な環境で生残可能とする。
微生物叢を変化させる方法はまた、対象由来のサンプル中の１以上の腸内微生物の相対存在量を測定することを含み得る。次世代シーケンシングで、各サンプルの多くの配列が測定される。予備プロセシングの後に、シーケンスクラスタリングアルゴリズムを用い、９７％を超える類似性を有する配列を一緒にしてＯＴＵを形成する。次いで、ＯＴＵ＿ｔａｂｅｌが取得でき、これはＯＴＵが各サンプいくつのリードを含んでいるかを与えるマトリックスであり、すなわち、各サンプルは各ＯＴＵ中の配列リードの数に相当する。各サンプル（各列）に関する相対存在量は１００％であり、サンプル中の全リードの数に対する各ＯＴＵ中のリードの数のパーセンテージが計算される。よって、相対存在量は、そのサンプル中の各微生物の配列数の相対パーセンテージを指す。相対存在量は、本発明に記載の方法または１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出など、それを検出することができる当技術分野で公知の方法によって検出することができる。
腸内微生物の相対存在量は、対象からサンプルを得ることによって測定することができる。このサンプルは、唾液、糞便および胃、腸および／または直腸内容物；消化管組織（例えば、口腔組織、食道、胃、小腸、回腸、盲腸、結腸および／もしくは直腸）由来の組織サンプル；腸内組織中の腹水；および微生物叢アッセイを知る当業者が使用可能な他のいずれかのサンプルであり得る。
１以上の腸内微生物の相対存在量を、対応する腸内微生物の正常相対存在量と比較することができる。正常相対存在量は、同等の年齢、性別、人種などの１以上の対象から得られるものであり得る。正常相対存在量は、治療または治療的介入に応答したまたは有益な結果を示した、同等の年齢、性別、人種などの健常対象から得られるものであり得る。特定の実施形態において、正常相対存在量は、健常対象における腸内微生物の相対存在量である。
本発明の方法および組成物は、１以上の腸内微生物の相対存在量を変化させることを含み得る。例示的実施形態は、対象に腸内微生物を投与することにより腸内微生物の相対存在量を変化させるための方法または組成物を含み得る。所望の転帰（例えば、代謝産物の減少、脳へのリンパ球浸潤の減少、ミクログリアの活性化の低下、神経炎症の軽減、認知の改善、アルツハイマー病症状の緩和）および個々の対象によって、対象における腸内微生物の相対存在量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９～１００％もしくはそれを超えて、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値、例えば、約７％～約２８％など、もしくは約７％、１４％、２１％、２８％などで調節することができ、および／あるいは対象の腸内微生物の相対存在量を、対応する正常対象の対応する腸内微生物の相対存在量に近づける、または到達させることができる。
本発明を通して記載されるように、本発明は、対応する正常対象の対応する指標とは異なる指標を、対応する正常対象の対応する指標に向かって調節し、それにより、調節された指標が対応する正常対象の対応する指標に近づく、または到達するようにすることを目的とする。この調節は、本明細書に記載されるように調節される、または調節された様々な指標に適用可能である。明らかに、対応する正常対象の対応する指標に到達させることが理想的であるが、対応する正常対象の対応する指標に近づけることも望ましい。よって、本発明は、１以上の指標が調節される個体の１以上の指標を対応する正常対象の対応する指標に近づける、もしくは到達させることを目的とする。本明細書において使用する場合、用語「に近づける、または到達させる」とは、調節前の指標と対応する正常対象の対応する指標の間の差を、調節後の差に対して、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９ １０％以上、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値、例えば、約７％～約２８％など、もしくは約７％、１４％、２１％、２８％などで縮小することを意味する。調節前の指標と対応する正常対象の対応する指標の間の差が、調節後の差に対して約１００％縮小された場合、その調節された指標は対応する正常対象の対応する指標に到達する。当業者は、特定の差の値が例えば、調節対象、指標のタイプ、測定方法などによって異なることを理解している。
１以上の指標が調節される個体の１以上の指標を対応する正常対象の対応する指標に近づける、または到達させることができる薬剤が治療上望ましい。このような薬剤の選択は、例えば、陽性対照として役立つ薬剤（例えば、ＯＭ１）との比較に基づき得る。好ましくは、陽性対照として使用される薬剤（例えば、ＯＭ１）と実質的に一致して関連の指標を調節する試験薬剤が選択される。
他方、１以上の指標が調節される必要のある個体の１以上の指標は、参照指標（例えば、アルツハイマー病を診断するためのまたはアルツハイマー病患者において炭水化物薬感受性患者を特定するための参照指標）と実質的に一致し、それはその個体がアルツハイマー病を有するリスクがあるか、またはアルツハイマー病を有することを示し得る。
本明細書において使用する場合、用語「実質的に同じ」とは、参照指標に対する試験指標の標準化（すなわち、参照指標を１００％とする）を指し、試験指標と参照指標との差は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％以下、または上述の任意の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値、例えば、約７％～約２８％など、もしくは約７％、１４％、２１％、２８％などである。当業者は、特定の差の値が例えば、調節される対象、指標のタイプ、測定方法などによって異なることを理解している。
いくつかの実施形態において、腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤は、腸内微生物複合体を含んでなる。いくつかの実施形態において、腸内微生物複合体は、糞便材料または細菌ライブラリーに由来する微生物を含んでなる。いくつかの実施形態において、糞便材料は、正常対象またはアルツハイマー病患者に由来する。
細菌ライブラリーの定義：各ＯＴＵに対応する種の分類情報を得るために、ＲＤＰ分類器ベイジアンアルゴリズムを用いてＯＴＵ代表配列の９７％類似レベルに対して分類学的分析を行い、サンプルの集団組成を各分類階級（ドメイン、界、門、綱、目、科、属、種）でカウントする。細菌叢の１６Ｓ分析に使用される種分類学的データベース比較データベースは、ｓｉｌｖａ１３２／１６Ｓ：ｓｉｌｖａ１３２／１６Ｓ(http://www.arb-silva.de)である
関与する代謝産物
本発明者は、アミノ酸などの腸内微生物のいくつかの代謝産物が、本発明において検討されるＡＤ脳腸軸に関与していることを見出した。これらのアミノ酸は、例えば下表から選択される１以上、好ましくは、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチン；より好ましくは、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシンから選択される１以上；最も好ましくは、フェニルアラニンである。
Figure 2022543014000008
本発明者らは、本発明に従って、様々なアミノ酸が脳腸軸に関与することを見出した。例に示されるように、ＷＴマウスとＴＧマウスの間で、いくつかのアミノ酸のレベルが変化し、例えばＯＭ１の投与後に、これらのアミノ酸のレベルはＷＴマウスの方向に回復した。このようなアミノ酸はアミノ酸プロファイルを構成する。先に述べたように、このようなプロファイルは、診断目的および／または治療目的で使用することができる。いくつかの実施形態において、対象における、上記の表から選択される１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６）のアミノ酸のレベルの、対応する正常対象の対応するアミノ酸のレベルに比べての変化（例えば、増加または低下）は、その対象がＡＤを有するリスクがあるかまたはＡＤを有することを示す。１つの実施形態において、対象における、上記の表のアミノ酸から構成されるアミノ酸プロファイル中のアミノ酸のレベルの、対応する正常対象の対応するアミノ酸のレベルに比べての１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の変化（例えば、増加または低下）は、その対象がＡＤを有するリスクがあるかまたはＡＤを有することを示す。
いくつかの実施形態において、ＡＤを有する対象における、上記の表から選択される１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６）のアミノ酸のレベルの、対応する正常対象の対応するアミノ酸のレベルに比べての、対応する正常対象の対応するアミノ酸のレベルに向かう変化（例えば、増加または低下）は、その対象が適当な処置を受けていることを示す。１つの実施形態において、ＡＤを有する対象の、上記の表のアミノ酸から構成されるアミノ酸プロファイル中のアミノ酸のレベルの、対応する正常対象の対応するアミノ酸のレベルに比べての、対応する正常対象の対応するアミノ酸のレベルに向かう、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の変化（例えば、増加または低下）は、その対象が適当な処置を受けていることを示す。
本発明者らは、対象における上記の表の１以上のアミノ酸のレベルが、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルと一致しないことを見出し、これは対象の病状に帰することができる。対象のアミノ酸レベルが対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低い場合、そのアミノ酸レベルをアップレギュレーションすることが意図される。対象のアミノ酸レベルが対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルより高い場合、そのアミノ酸レベルをダウンレギュレーションすることが意図される。
いくつかの実施形態において、上記の表の１以上のアミノ酸は、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低い。いくつかの実施形態において、上記の表の１以上のアミノ酸は、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。いくつかの実施形態において、上記の表の１以上のアミノ酸は、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低いが、その他の１以上のアミノ酸は、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、例えば、調節される対象、指標のタイプ、測定方法などによって異なり得る。
いくつかの実施形態において、グルタミンレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低い。いくつかの実施形態において、メチオニンレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低い。いくつかの実施形態において、グルタミンおよびメチオニン両方のレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低い。
いくつかの実施形態において、グルタミンレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。いくつかの実施形態において、メチオニンレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。いくつかの実施形態において、グルタミンおよびメチオニン両方のレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。
いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジン、およびアセチルオルニチンのうち１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。いくつかの実施形態において、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシンのレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。いくつかの実施形態において、フェニルアラニンのレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。
いくつかの実施形態において、グルタミンおよびメチオニン両方のレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも低く、４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ギャバ、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンのうち１以上のレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。
いくつかの実施形態において、４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ギャバ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンのうち１以上のレベルは、対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルよりも高い。
いくつかの実施形態において、上記の表のアミノ酸の１以上がアップレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、上記の表のアミノ酸の１以上がダウンレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、上記の表の１以上のアミノ酸はアップレギュレーションを受けているが、他の１以上のアミノ酸はダウンレギュレーションを受けている。いくつかの場合、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、例えば、調節される対象、指標のタイプ、測定方法などによって異なり得る。
いくつかの実施形態において、グルタミンはアップレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、メチオニンはアップレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、グルタミンおよびメチオニンの両方がアップレギュレーションを受けている。
いくつかの実施形態において、グルタミンはダウンレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、メチオニンはダウンレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、グルタミンおよびメチオニンの両方がダウンレギュレーションを受けている。
いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジン、およびアセチルオルニチンのうち１つ、２つ、３つ、４つまたは５つがダウンレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシンがダウンレギュレーションを受けている。いくつかの実施形態において、フェニルアラニンはダウンレギュレーションを受けている。
いくつかの実施形態において、グルタミンおよびメチオニンの両方がアップレギュレーションを受け、４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ギャバ、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンのうち１以上がダウンレギュレーションを受けている。
いくつかの実施形態において、４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ギャバ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンのうち１以上がダウンレギュレーションを受けている。本発明者は、ナイーブＴ細胞または未分化Ｔ細胞などの免疫細胞が、ある場合には、アミノ酸（例示すれば、フェニルアラニンおよびイソロイシン）を取り込み、例えば、特定の輸送体、例示すれば、ＳＬＣ７Ａ５などによって、Ｔｈ１細胞などのＴ細胞の特定のタイプに分化することを見出した。本発明者らは、Ｔｈ１優勢状態をもたらすＴｈ１細胞への分化を様々な手段によって妨げると、Ｔｈ１優勢関連疾患を治療することができることを見出した。このような手段には、限定するものではないが、関連アミノ酸のレベルを低下させること、免疫細胞が関連アミノ酸を取り込まないようにすることなどが含まれる。
ＳＬＣ７Ａ５は、Ｌ型アミノ酸輸送体１（ＬＡＴ１）と呼ばれ、ＡＰＣスーパーファミリーに属す。これは保存的ジスルフィド結合を介して糖タンパク質ＣＤ９８（ＳＬＣ３Ａ２）と相互作用するヘテロ二量体アミノ酸輸送体を形成する。ＣＤ９８（４Ｆ２ｈｃ、ＳＬＣ３Ａ２）は、原形質膜へのその輸送を安定化させ促進する、ＬＡＴ１のシャペロンタンパク質として働くＩＩ型糖タンパク質である。この複合体は、胎盤および血液脳関門などの重要な身体領域で必須アミノ酸の取り込みを担う。その基質は、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンなどの一連の大型中性アミノ酸、ならびにＬ－ＤＯＰＡおよびガバペンチンを含む薬物を含む。
アミノ酸を分解して関連アミノ酸のレベルを低下させ、それにより、ナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１細胞への分化を減らすために、様々な薬剤（例えば、酵素）を使用することができる。下表に示される酵素は、フェニルアラニンおよびイソロイシンなどの関連アミノ酸を分解するために使用することができる。示される酵素は、アミノ酸を分解するために様々な手段、例えば、腸または末梢循環（例えば、末梢血）によって対象の適切な部分に送達することができる。例えば、酵素は、酵素を発現する微生物（例えば、大腸菌(Escherichia coli)）を適切な部位に送達して、その適切な部位で酵素を発現させることによって、適切な部位に送達することができる。この微生物は示されている酵素の１以上を発現することができる。当業者は、適切な部位で酵素を発現する能力を失わずに様々な送達経路（例えば、経口）によって適切な部位に送達することができるいずれの微生物も、酵素を送達するために使用可能であることを理解している。例えば、フェニルアラニンを分解するための酵素を発現するように操作された大腸菌がフェニルアラニン分解細菌として使用され、これはマウスにおいてフェニルアラニン含量を減らすため（糞便中のフェニルアラニンの含量を検出することによって示される）およびＴｈ１細胞の割合を減らすため（末梢血中のＴｈ１細胞の割合を検出することによって示される）にマウスに経口投与された。
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輸送体阻害剤は、輸送体（例えば、フェニルアラニンおよびイソロイシンに対する共通輸送体ＳＬＣ７Ａ５）を阻害し、それにより、ナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１細胞への分化を減らすことによってナイーブＴ細胞が関連のアミノ酸を取り込まないように阻害することにより、免疫細胞が関連のアミノ酸を取り込まないようにするために使用することができる。輸送体ＳＬＣ７Ａ５を阻害するために使用できる阻害剤としては、限定するものではないが、当技術分野で公知のＪＰＨ ２０３、ＢＣＨ、およびＫＭＨ－２３３が挙げられる。例えば、実施例４に示されるように、ＳＬＣ７Ａ５阻害剤ＪＰＨ ２０３のマウスへの投与は、マウス脳内のＴｈ１細胞の割合を有意に低下させる。
ＪＰＨ２０３は、ＬＡＴ１を選択的に阻害する、日本のＪ－Ｐｈａｒｍａ(http://www.j-pharma.com/b3_e.html)からから入手可能な化学的に合成された低分子量化合物である。ＣＡＳ番号１０３７５９２－４０－７(https: //www.medkoo.com/products/9544)
ＢＣＨは、既知のＬＡＴ１阻害剤である。ＣＡＳ番号２０４４８－７９－７(https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027)
ＫＭＨ－２３３は、既知のＬＡＴ１阻害剤である。ＣＡＳ番号１９４１１７４－１３－５(https://www.medkoo.com/products/9545)
当業者は、ナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１細胞への分化を妨げるために使用することができる手段はこれに限定されないことを理解している。ナイーブＴ細胞が腸内微生物および／またはそれらの代謝産物により影響を受けてＴｈ１細胞に分化しないようにするために使用することができる手段はいずれも、Ｔｈ１の割合を減らし、本明細書に記載するようなＴｈ１優勢状態を緩和するまたは回復させるために使用することができる。
本発明者らは、本発明に従い、様々なサイトカインが脳腸軸に関与していることを見出した。例に示されるように、ＷＴマウスとＴＧマウスの間で、いくつかのサイトカインのレベルが変化しており、例えばＯＭ１の投与後に、これらのサイトカインのレベルはＷＴマウスに向かって回復した。このようなサイトカインはサイトカインプロファイルを構成する。先に述べたように、このようなプロファイルは診断目的および／または治療目的で使用することができる。
いくつかの実施形態において、対象における、ＯＰＧ、レジスチン、ＴＡＲＣ、ＶＥＧＦ、ケメリン、ＩＬ－９、ＭＭＰ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＴＣＡ－３、ｇｐ１３０、ＭＭＰ－１０、６Ｃｋｉｎｅ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＩＬ－２２、ＩＬ－１ａ、ＩＦＮｇ Ｒ１、グランザイムＢ、ＬＩＸ、ＣＴ－１、ＣＤ２７Ｌ、エンドグリン、ＴＲＡＮＣＥ、ＭＣＳＦ、４－１ＢＢ、レプチンＲ、ＣＤ３６、ＴｒｅｍＬ １、ＶＥＧＦ Ｒ２、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－３ Ｒｂ、Ｈ６０から選択される１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１）のサイトカインのレベルの、対応する正常対象の対応するサイトカインのレベル比べての変化（例えば、増加または低下）は、その対象がＡＤを有するリスクがあるかまたはＡＤを有することを示す。１つの実施形態において、対象における、ＯＰＧ、レジスチン、ＴＡＲＣ、ＶＥＧＦ、ケメリン、ＩＬ－９、ＭＭＰ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＴＣＡ－３、ｇｐ１３０、ＭＭＰ－１０、６Ｃｋｉｎｅ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＩＬ－２２、ＩＬ－１ａ、ＩＦＮｇ Ｒ１、グランザイムＢ、ＬＩＸ、ＣＴ－１、ＣＤ２７Ｌ、エンドグリン、ＴＲＡＮＣＥ、ＭＣＳＦ、４－１ＢＢ、レプチンＲ、ＣＤ３６、ＴｒｅｍＬ １、ＶＥＧＦ Ｒ２、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－３ Ｒｂ、Ｈ６０から選択されるサイトカインから構成されるサイトカインプロファイル中のサイトカインのレベルの、対応する正常対象の対応するサイトカインのレベルに比べての１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の変化（例えば、増加または低下）は、その対象がＡＤを有するリスクがあるかまたはＡＤを有することを示す。
いくつかの実施形態において、ＡＤを有する対象における、ＯＰＧ、レジスチン、ＴＡＲＣ、ＶＥＧＦ、ケメリン、ＩＬ－９、ＭＭＰ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＴＣＡ－３、ｇｐ１３０、ＭＭＰ－１０、６Ｃｋｉｎｅ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＩＬ－２２、ＩＬ－１ａ、ＩＦＮｇ Ｒ１、グランザイムＢ、ＬＩＸ、ＣＴ－１、ＣＤ２７Ｌ、エンドグリン、ＴＲＡＮＣＥ、ＭＣＳＦ、４－１ＢＢ、レプチンＲ、ＣＤ３６、ＴｒｅｍＬ １、ＶＥＧＦ Ｒ２、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－３ Ｒｂ、Ｈ６０から選択される１以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１）のサイトカインのレベルの、対応する正常対象の対応するサイトカインのレベルに比べての、対応する正常対象の対応するサイトカインのレベルに向かう変化（例えば、増加または低下）は、その対象が適当な処置を受けていることを示す。１つの実施形態において、ＡＤを有する対象における、ＯＰＧ、レジスチン、ＴＡＲＣ、ＶＥＧＦ、ケメリン、ＩＬ－９、ＭＭＰ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＴＣＡ－３、ｇｐ１３０、ＭＭＰ－１０、６Ｃｋｉｎｅ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＩＬ－２２、ＩＬ－１ａ、ＩＦＮｇ Ｒ１、グランザイムＢ、ＬＩＸ、ＣＴ－１、ＣＤ２７Ｌ、エンドグリン、ＴＲＡＮＣＥ、ＭＣＳＦ、４－１ＢＢ、レプチンＲ、ＣＤ３６、ＴｒｅｍＬ １、ＶＥＧＦ Ｒ２、ＴＧＦｂ１、ＩＬ－３ Ｒｂ、Ｈ６０から選択されるサイトカインからなる腸内微生物プロファイル中のサイトカインのレベルの、対応する正常対象の対応するサイトカインのレベル比べての、対応する正常対象の対応する腸内微生物のレベルに向かう、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の変化（例えば、増加または低下）は、その対象が適当な処置を受けていることを示す。
本発明は、腸内微生物の相対存在量を所定の時間（例えば、次の用量を使用するまで）、所定のレベル（例えば、治療レベル）に直接または間接的に変化させることができる組成物を提供する。所定のレベルは、治療応答（例えば、代謝産物の減少、脳へのリンパ球浸潤の減少、ミクログリアの活性化の低下、神経炎症の軽減、認知の改善、アルツハイマー病症状の緩和）をもたらす、微生物叢の相対存在量の測定値から得ることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法、薬剤または組成物は、薬剤または組成物が、その薬剤または組成物の重量に対して少なくとも約５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９９重量％、もしくはそれを超える所望の腸内微生物、および／または薬剤または組成物の重量に対して約４０重量％、３０重量％、２０重量％、１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１重量％未満もしくはそれより少ない所望の腸内微生物を含んでなり得るように、十分に精製されたまたは濃縮された腸内微生物を含んでなり得る。
本発明に従って腸内微生物の相対存在量を調節する薬剤および組成物は、代謝機能の変更に至り得る。例えば、代謝機能の変更は、微生物代謝産物のアミノ酸レベルの調節を含み得る。
いくつかの実施形態において、対象からの末梢血サンプルを検出することによって、本発明の方法、薬剤、および組成物は、アミノ酸レベルを約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００μＭもしくはそれを超えて、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値だけ調節し、および／あるいはアミノ酸レベルを対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させることができる。
いくつかの実施形態において、対象からの糞便サンプルを検出することによって、本発明の方法、薬剤、および組成物は、アミノ酸レベルを約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００μｍｏｌ／ｇもしくはそれを超えて、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値だけ調節し、および／あるいはアミノ酸レベルを対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法、薬剤、および組成物は、脳への免疫細胞浸潤の変更を引き起こし得る。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞中の炎症誘発性Ｔｈ１細胞の割合が低減される。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤および組成物は、対象からのサンプル中のＣＤ４＋Ｔ細胞に対する炎症誘発性Ｔｈ１細胞の比率を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％もしくはそれを超えて低下させる、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞に対する炎症誘発性Ｔｈ１細胞の割合を対応する正常対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞に対する対応する炎症誘発性Ｔｈ１細胞の割合に近づける、もしくは到達させることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法、薬剤、および組成物は、ナイーブＴ細胞によるアミノ酸の相対的取り込みを低下させることができる。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤および組成物は、ナイーブＴ細胞によるアミノ酸の相対的取り込みを約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００もしくはそれを超えて低下させる、および／またはナイーブＴ細胞によるアミノ酸の相対的取り込みレベルを対応する正常対象の対応するナイーブＴ細胞によるアミノ酸の相対的取り込みレベルに近づける、もしくは到達させることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法、薬剤、および組成物は、脳内のミクログリアの活性化の変更をもたらし得る。例えば、脳内のミクログリアの活性化の変更は、脳内のミクログリアの活性化の増強または低下を含み得る。脳内のミクログリアの活性化は、約１～１００％、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％もしくは１００％、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値、例えば、約７％～約２８％など、または約７％、１４％、２１％、２８％などだけ増強または低下され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法、薬剤、および組成物は、ＩＢＡ１レベルの変化をもたらし得る。例えば、ＩＢＡ１レベルの変化は、ＩＢＡ１レベルの上昇または低下を含み得る。ＩＢＡ１レベルは、約０～約３０００の相対レベル、例えば、約０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００の相対レベル、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値、例えば、約５００～約３０００、または約５００、１０００、１５００などだけ上昇または低下させることができる。
処方物
本発明の薬剤または医薬組成物は、対象において腸内微生物の相対存在量を調節することができる腸内微生物を含有し得る。腸内微生物は、活性（生）菌、休眠菌、不活性菌または死菌であり得る。本発明の薬剤または医薬組成物は、対象における腸内微生物の相対存在量を調節することができる化合物または薬剤を含有し得る。１以上の化合物または薬剤を、対象における微生物叢を変化させるために使用することができる。このような化合物または薬剤としては、限定するものではないが、抗生物質処置および／または抗菌薬、プレバイオティクス、例えば、細菌細胞壁成分、細菌核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、細菌膜成分、および細菌構造成分（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質およびそれらの組合せ、例えば、リポタンパク質、糖エステルおよび糖タンパク質）、有機酸、無機酸、アルカリ、タンパク質およびペプチド、酵素および補酵素、アミノ酸および核酸、糖、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖エステル、ビタミン、生物学的に活性な化合物、無機成分を含んでなる代謝産物、小分子、例えば、含窒素分子または含亜硫酸分子、耐性デンプン、ジャガイモデンプンまたは高アミロースデンプン、加工デンプン（カルボン酸化デンプン、アセチル化デンプン、プロピオン酸化デンプンおよびブチル化デンプンを含む）、非消化性オリゴ糖類、例えば、フルクト－オリゴ糖、オリゴデキストロース、キシロ－オリゴ糖、ガラクト－オリゴ糖、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトマンナン多糖類、ポリデキストロース、オリゴフルクトース、イヌリンおよびそれらの誘導体が挙げられるが、プレバイオティクス的役割を果たし得る他のオリゴ糖類、他の可溶性繊維およびそれらの組合せも排除されない。糖は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはそれらの誘導体、またはそれらの組合せおよび／またはそれらの誘導体；好ましくは、オリゴ糖類および多糖類；より好ましくは、マンヌロン酸オリゴ糖から選択することができる。
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、例えば、アミノ酸、アミノ糖、糖アルコール、タンパク質、炭水化物、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、核酸、バッファー、界面活性剤、脂質、リポソーム、その他の賦形剤、およびそれらの混合物を含み得る。他の有用な成分としては、ステロイド、抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症薬、鎮痛薬、細胞、抗炎症薬、増殖因子、増殖因子断片、小分子創傷治癒刺激薬、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、抗体、酵素、単離された細胞、血小板、免疫抑制剤、核酸、細胞種、ウイルス、ウイルス粒子、必須栄養素、ミネラル、金属、またはビタミン、およびそれらの組合せを含み得る。さらに、本発明の薬剤および組成物は、水、生理食塩水またはバッファーなどの希釈剤を含んでなり得る。
本発明の薬剤または医薬組成物は、薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物として処方することができる。本明細書において使用する場合、「薬学上許容可能な担体」は、ありとあらゆる生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。１つの実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、対象への送達に好適な医薬組成物中に組み込んでもよい。医薬組成物はまた、薬学上許容可能な担体も含み得る。本明細書において使用する場合、「薬学上許容可能な担体」は、ありとあらゆる生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学上許容可能な担体の例としては、以下のうち１以上を含む：水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せ。多くの場合、組成物中に糖などの等張剤、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含むことが好ましい。
医薬組成物は様々な形態で処方することができる。これらには、例えば、液体、半固体、および固体製剤形態、例えば、液体溶液（例えば、注射および注入溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、坐剤、およびその他の処方物が含まれる。医薬組成物は高薬物濃度用に処方することができる。医薬組成物はさらに取り扱いおよび貯蔵条件下で無菌かつ安定であり得る。無菌注射溶液は、好適な溶媒中に必要量で上記に列挙した成分の１つまたはそれらの組合せ（必要であれば）を配合した後に濾過および滅菌を行うことによって調製することができる。
医薬組成物の例示形態は、意図される送達様式および治療適用によって異なり得る。１つの実施形態において、医薬組成物は、経口送達用に処方される。いくつかの組成物は、丸剤に基づく送達（２０１０年１０月２２日出願の"pill catchers"という名称の米国特許出願第１２／９７６、６４８号に開示されている通り）および延長放出の形態であってよい。１つの実施形態において、丸剤に基づく送達は、腸管内の正確な場所に送達を行うことを可能とするシステムの一部であり得る。別の実施形態において、医薬組成物は、延長放出処方物として処方することができる。別の実施形態において、医薬組成物は、患者の胃を出て行くまで分解し始めないコーティング中に封入されてもよい。別の実施形態において、医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル送達システムを含む持続放出または放出制御処方物などの、即放出から組成物を保護する担体を用いて調製することができる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用可能である。このような処方物を調製するための多くの方法は、特許権が付与されているか、当業者に周知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. "Sustained release"は、組成物の従来の処方物の送達によって達成される放出に比べて延長された時間にわたって組成物またはその有効化合物の放出を指す。
医薬組成物の別のタイプとしては、休眠または不活性状態（例えば、凍結乾燥状態）の微生物叢を含む組成物を処方するなどの活性化可能な形態が含まれる。合剤組成物において、微生物叢は、休眠もしくは不活性状態であり得、または微生物叢を培養する化合物もしくは薬剤は不活性であり得る。例示的実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの休眠または不活性微生物叢および微生物叢を培養する不活性化の合物または薬剤を含むように処方することができる。
開示される医薬組成物および合剤医薬組成物はまた、食品、飲料、栄養補助食品および／または添加物として処方することもできる。このような組成物はヒトおよび／または動物が消費するために好適である。当業者は、経口用または摂取可能な処方物に使用することができ、ヒトおよび／または動物投与に好適であると考えられる特殊な処方物を容易に知ることができる。多くの組成物は食品または食品添加物／栄養補助剤の製造に使用されるので、別の重要な側面は、対象の腸内微生物を調節するための微生物叢を含むヒトまたは動物食品または食品添加物／栄養補助剤を提供すことである。
消費できる組成物は、甘味剤、安定剤または結合剤、保湿剤、および／または天然および／または人工香味剤を含むように処方され得る。組成物はまた天然および／または人工着色剤および保存剤を含み得る。１つの実施形態において、組成物は、単糖類、二糖類および多糖類、例えば、限定するものではないが、スクロース（糖）、デキストロース、マルトース、デキストリン、キシロース、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、スクロマルト、フルクトース（レボース）、転化糖、コーンシロップ、マルトデキストリン、オリゴフルクトースシロップ、部分加水分解デンプン、コーンシロップ固体、ポリデキストロース、可溶性繊維、不溶性繊維、天然サトウキビ汁、ゼラチン、クエン酸、乳酸、天然着色剤、天然香味剤、分留ヤシ油、カルナウバ蝋、またはそれらの組合せを含み得る。
用量
本発明の薬剤または組成物は、「治療上有効な量」または「有効量」の成分を含んでなり得る。「治療上有効な量」は、必要な用量で、一定の期間内に所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。治療上有効な量の薬剤または医薬組成物は、個体の病状、年齢、性別、および脳、および個体において所望の応答を生じる組成の能力などの様々な因子によって極めて異なり得る。治療上有効な量はまた、薬剤または医薬組成物の治療上有益な効果が薬剤または医薬組成物の毒性作用または有害作用を上回る量でもある。例示的実施形態において、薬剤または医薬組成物の治療上有効な量は、１以上の腸内微生物の相対存在量が増加する量である。例えば、腸内微生物の相対存在量を調節するための治療上有効な量の薬剤は、対象において１以上の腸内微生物の相対存在量を増加させる。
本明細書において使用する場合、用語「治療」は一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状の完全なまたは部分的に防止するという点で予防的であってもよく、および／または疾患および／もしくは疾患による副作用を部分的または完全に安定化もしくは治癒させるという点で治療的であってもよい。「治療」は、本明細書において使用される場合、（ａ）疾患もしくは症状に感受性があるが、疾患とは診断されていない患者に見られる疾患もしくは症状の予防；（ｂ）疾患の進行の阻害および疾患の発生の予防などの疾患の症状の阻害；または（ｃ）疾患の症状の緩和、すなわち、疾患もしくは症状の退縮を含む、患者の疾患のいずれの処置も包含する。
適応
本発明の研究を通じ、本発明者らは、異常な腸内微生物パターンがナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１細胞への過剰分化を引き起こし、末梢血中のＴｈ１細胞のレベルは異常に上昇したことを見出した。末梢Ｔｈ１細胞のレベルの増大はより多くのＴｈ１細胞を脳に浸潤させ、アルツハイマー病などの疾患を引き起こす。腸内微生物叢を元も戻すことにより、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を減らすことができ、末梢血中の異常に高いレベルのＴｈ１細胞を減らすことができ、それにより、疾患を治療することができる。よって、本発明は、対象において高い末梢血Ｔｈ１細胞レベルに関連する疾患を治療するための方法が提供され、その方法は、本明細書に記載されるように対象において腸内微生物の相対存在量を調節すること、本明細書に記載されるように末梢血中のアミノ酸のレベルを低減すること、本明細書に記載されるように、またはナイーブＴ細胞が末梢血中のアミノ酸を取り込まないように阻害することを含んでなる。
用語「Ｔｈ１優勢」および「Ｔｈ１細胞優勢」は、本明細書において記載されるように互換的に使用される。いくつかの場合において、Ｔｈ１優勢は、高い末梢血Ｔｈ１細胞レベルによって示され得る。高い末梢血Ｔｈ１細胞レベルは、対象における末梢血Ｔｈ１細胞レベルが好適な対照（例えば、正常ヒト集団などの正常対照）のレベルよりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％もしくはそれを超えて高い、または上述の値の終点によって構成される範囲もしくはその中にある任意の値、例えば、約７％～約２８％など、または約７％、１４％、２１％、２８％などであることを指し得る。このような疾患としては、限定するものではないが、多発性硬化症、クローン病、１型糖尿病、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、白斑、シェーグレン症候群、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、セリアック病およびグレーブス病が挙げられる。
本明細書において使用する場合、用語「対象」は、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよびその他の類人猿およびサル、農用動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ、飼育哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの齧歯類を含む）を含むいずれの生きている生物も指す。この用語は、特定の齢および性を示さない。１つの実施形態において、対象はヒトである。本発明の文脈で、用語「対象」、「個体」および「患者」は互換的に使用される。
１つの実施形態において、対象における腸内微生物の１以上の相対存在量は、正常対象の存在量よりも高い。１つの実施形態において、対象における腸内微生物の１以上の相対存在量は、正常対象の存在量よりも低い。１つの実施形態において、対象における腸内微生物の１以上の相対存在量は、正常対象の存在量よりも高く、他の１以上の相対存在量は、対象の存在量よりも低い。
用量は、本発明の薬剤または医薬組成物中に存在する微生物叢のタイプによって異なり得る。用量はまた、対象中に存在する１以上の微生物叢の相対存在量に基づいて決定することもできる。
１つの実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、１以上の微生物叢の相対存在量を効果的に変化させることができる。別の実施形態において、薬剤または医薬組成物は、対象における微生物叢の相対存在量を効果的に増加または減少させることができる。１つの実施形態において、薬剤または医薬組成物は、対象における細菌叢の特定の微生物の相対存在量を増加または減少させ、対象における細菌叢の他の特定の微生物の相対存在量を減少させることができる。
別の実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物はまた、薬剤または医薬組成物の投与後に、対象中の細菌叢がアルツハイマーの治療法に応答する対象に存在する細菌叢を模倣するように、対象中の細菌叢を効果的に変化させることができる。薬剤または医薬組成物は、類似の脳、年齢、性別、人種などを有する正常および健常な対象の細菌叢をシミュレートするように細菌叢を効果的に変化させることができる。
投与計画は、最も好適な所望の応答（例えば、治療的応答または予防的応答）を提供するように調整することができる。例えば、単回のボーラスを送達することができ、複数の分割用量を経時的に送達ことができ、または用量は、治療状況の切迫度によって決まるように、相応に低減もしくは増加させることができる。用量の送達および均一性を助ける単位投与形で非経口組成物を処方することが特に有利である。単位投与形は、本明細書で使用される場合、治療される哺乳動物対象にとって単一用量として好適な物理的に独立した単位を指し、各単位は、必要とする医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の有効化合物を含有する。本発明において使用される単位投与形の明細は、以下によって定義されるか、または以下に直接依存する：（ａ）有効化合物のユニークな特性および達成される特定の治療効果または予防効果；ならびに（ｂ）個々の療法のためにこの有効化合物を組み合わせる分野における固有の制限。
本発明によって提供される方法に適用される場合、本発明の薬剤または医薬組成物の例示的用量範囲は、１～３用量などの１以上の用量で送達される約０．００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１～約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、約０．０５～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。正確な用量は、送達の頻度および様式、治療される対象の性、齢、体重および健康状態、治療される病態の性質および重症度、治療されるいずれかの共存症ならびに当業者に公知の他の因子によって異なる。
１つの実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の総濃度を有するウェルコミクロビウム門などの細菌叢を含んでなる。別の実施形態において、薬剤または医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の総濃度を有するウェルコミクロビウム門などの細菌叢を含んでなる。さらに別の実施形態において、薬剤または医薬組成物は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の総濃度を有するウェルコミクロビウム門などの細菌叢を含んでなる。
いくつかの側面において、本明細書に記載の薬剤、組成物、またはキットは、対象の重量に対する用量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬剤、組成物またはキットは、本明細書に記載される１以上の薬剤を対象の重量による量で含んでなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬剤、組成物またはキット中の本明細書に記載される薬剤の１以上の量は、対象の重量に対して約１．０～約５０．０ｍｇ／ｋｇもしくはそれを超える、好ましくは、約５．０～４０．０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約１０．０～３０．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬剤、組成物、またはキット中の、本明細書に記載される薬剤の１以上の量は、対象の重量に対して約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、３０．０、３０．５、３１．０、３１．５、３２．０、３２．５、３３．０、３３．５、３４．０、３４．５、３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、３７．５、３８．０、３８．５、３９．０、３９．５、４０．０、４０．５、４１．０、４１．５、４２．０、４２．５、４３．０、４３．５、４４．０、４４．５、４５．０、４５．５、４６．０、４６．５、４７．０、４７．５、４８．０、４８．５、４９．０、４９．５、５０．０ｍｇ／ｋｇもしくはそれを超える、または上述の値の終点によって構成される範囲またはその中にある値、例えば、約１．１～１．４ｍｇ／ｋｇなど、または約１．１、１．２、１．３、１．４ｍｇ／ｋｇなどである。
他の側面において、本明細書に記載される薬剤、組成物またはキットは、固定された用量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬剤、組成物またはキットは、固定された量の本明細書に記載される１以上の薬剤を含んでなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬剤、組成物またはキット中の本明細書に記載される薬剤の１以上の量は、それぞれ独立に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００ｍｇもしくはそれを超える、または上述の値の終点によって構成される範囲またはその中にある値、例えば、約１．１～１．４ｍｇなどまたは約１．１、１．２、１．３、１．４である。
さらに他の態様において、本明細書に記載される薬剤、組成物、またはキットのいくつかの成分は、上記のような対象の重量に対する用量で投与されるが、他の成分は、上記のような固定された用量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬剤、組成物、またはキット中のいくつかの成分は、上記のような対象の重量に対する量であり、他の成分は上記のような固定された量である。
送達
本発明の薬剤または医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって送達または投与され得る。用語「送達」、「に送達する」、「投与する」および「適用する」は本明細書において互換的に使用される。当業者が実現するように、送達経路および／または様式は、所望の結果によって異なる。１つの実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、経口送達される。別の実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、経口送達される。別の実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、鼻腔送達される。さらに別の送達様式は、腸への送達の方法および組合せを含み得る。
本発明の薬剤または医薬組成物は、対象における標的領域および／または構造に送達され得る。腸において標的とされ得る領域、限定するものではないが、胃、胆膵分岐（胆膵路）、Ｒｏｕｘ分岐、共通分岐、回腸、盲腸、または結腸が挙げられる。それは特定のｐＨ範囲、温度、湿度、および代謝産物含量を有する分化した生態学的場所を構成する構造に標的化され得る。細菌叢系譜の変化に関連する疾患または病態は、新規な微生物の存在、正常微生物の不在、または微生物の割合の変化を示し得る。
本発明の薬剤または医薬組成物の送達は、対象において１以上の領域に標的化することができる。この領域としては、限定するものではないが、腸内の領域が挙げられる。例示的実施形態において、送達は、腸における口腔、胃、胆膵分岐、Ｒｏｕｘ分岐、共通分岐、小腸、回腸、盲腸、大腸、または結腸に標的化される。送達はまた、対象において１以上の組織に標的化され得る。組織としては、腸、例えば、胃、胆膵分岐、Ｒｏｕｘ分岐、共通分岐、小腸、回腸、盲腸、大腸、または結腸中のいずれの組織も含み得る。
本発明の薬剤または医薬組成物の成分は、別個に処方することもできるし、またはそれらの一部もしくは全部を一緒に処方することもできる。１つの実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物は、単回または多回投与に好適な薬剤または医薬組成物として処方することができる。
本発明の薬剤または医薬組成物の成分は、別個に投与されてもよく、またはそれらの一部もしくは全部を一緒に投与してもよい。本発明の医薬組成物の薬剤または成分は、質的に異なる時点で投与してもよいし、またはそれらの一部もしくは全部を実質的に同時に投与してもよい。
本発明の医薬組成物の薬剤または成分は、それぞれ独立に、限定するものではないが、経口または非経口（静脈内、筋肉内、局所的または皮下経路による）を含む様々な好適な経路によって投与することができる。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤または医薬組成物の成分は、それぞれ独立に経口または注射、例えば、静脈内注射もしくは腹腔内注射により投与することができる。
本発明の薬剤または医薬組成物の成分は、それぞれ独立に、限定するものではないが、経口または非経口投与用の錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤（例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤、腸溶コーティングカプセル剤、マイクロカプセル）、エリキシル剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤（筋肉内、静脈内、腹腔内）、顆粒剤、乳剤、懸濁剤、液剤、分散剤、および徐放性製剤の投与形を含む好適な投与形であり得る。
本発明の医薬組成物の薬剤または成分は、それぞれ独立に、薬学上許容可能な担体および／または賦形剤を含んでなり得る。
本発明の薬剤または医薬組成物の成分は独立に、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１週間毎、２週間毎、３週間毎または１か月毎またはそれより低い頻度で投与され得る。
本発明の薬剤または医薬組成物中の成分は独立に、１日に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回またはそれより多く投与することができる。
本発明の薬剤または医薬組成物の成分は独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続日もしくはそれを超えて投与することができる。
本発明の薬剤または医薬組成物中の成分の１つは、他の成分の投与の前または後、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日またはそれを超える日に投与することができる。例えば、１つの実施形態において、本発明の医薬組成物の薬剤または成分１は１日目に投与され、本発明の医薬組成物の薬剤または成分２は２日後（すなわち、３日目）投与され、本発明の医薬組成物の薬剤または成分１はさらに３日後（すなわち、６日後）に投与される。
本発明の薬剤または医薬組成物の送達はまた、１回以上反復することもできる。本発明の薬剤または医薬組成物の反復送達は、疾患の処置の前および／または後に１回以上であり得る。反復送達は、最初の送達と同様の様式であり得る。
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、治療薬、予防薬または診断薬を含み得る薬剤とともに投与することもできる。治療薬、予防薬または診断薬は、小分子、核酸、タンパク質、例えば、ポリペプチドプレバイオティクス、例えば、細菌成分（例えば、細菌壁成分（例えば、ペプチドグリカン）、細菌核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、細菌膜成分、および細菌構造成分（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質およびこれらの組合せ、例えば、リポタンパク質、糖エステルおよび糖タンパク質））、細菌代謝産物、有機酸、無機酸、塩基、タンパク質およびペプチド、酵素および補酵素、アミノ酸および核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖エステル、ビタミン、生物学的に活性な化合物、無機成分を含んでなる代謝産物、小分子（例えば、含窒素分子または含亜硫酸分子）、耐性デンプン、ジャガイモデンプンまたは高アミロースデンプン、加工デンプン（カルボン酸化デンプン、アセチル化デンプン、プロピオン酸化デンプンおよびブチル化デンプンを含む）、非消化性オリゴ糖類、例えば、フルクトオリゴ糖、デキストロース、キシロ－オリゴ糖、ガラクト－オリゴ糖、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトマンナン多糖類、ポリデキストラン、オリゴフルクトース、イヌリンおよびそれらの誘導体（ただし、プレバイオティクス的役割を果たし得る他のオリゴ糖類も排除されない）他の可溶性繊維およびそれらの組合せから選択される。１つの実施形態において、送達される薬剤は、経口バイオアベイラビリティが低く、宿主の腸の微生物の場所で働く送達小分子である。医学では、腸管吸収がほとんどの経口処置の目標であるので、低い経口バイオアベイラビリティは一般に望ましくない。
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、上述の薬剤と同じ組成物で投与してもよいし、または発明の薬剤または医薬組成物の前、同時および／または後に投与する薬剤とは別個に投与してもよい。本発明の薬剤または医薬組成物は、薬剤投与の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１日前またはそれより前に投与することができる。本発明の薬剤または医薬組成物はまた、薬剤投与の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１日後またはそれより後に投与することもできる。
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、少なくとも部分的に埋め込み可能なシステムによって送達することもできる。埋め込み可能なシステムは当技術分野で、既知であって使用されているいずれのシステムであってもよい。このシステムには、プログラム可能なポンプ（例えば、糖尿病患者にインスリンを送達するために慣用されているもの）を含み得る。これらの成分の１以上は、ポート、針、パッチなどを含み得る経皮送達システムに対して調整および接続することができる。例示的実施形態において、埋め込み可能なシステムは、リザーバーおよびポートを含む。リザーバーは、組成物を保持するための詰め替え用のまたは再装填可能な容器を含み得る。別の実施形態において、このシステムは、カテーテルを含み得る。別の実施形態において、埋め込み可能なシステムは、経管カテーテルである。このシステムはまた、規定の用量および／または規定の間隔で組成物を送達するように構成することもできる。規定の用量および／または規定の間隔は、当業者により決定可能である。
本発明のいくつかの実施形態を以下の限定されない例により説明する。
材料および方法
動物 Ｔｇマウスおよび共飼育ＷＴマウス（ＴｇマウスとＣ５７マウスを交配させることによって作出した対応するＷＴマウス）を、誕生後に同じケージで飼育した。ＷＴマウス（Ｃ５７）は、細菌叢の交差移入を避けるために別のケージで飼育した。総てのマウスを２３℃の部屋にて１２時間（ｈ）明暗周期で維持した。処置前にマウスを異なる群に無作為に割り当てた。Ｔｇマウスの経時的分析のために、雄および雌Ｔｇマウスを２、３、５、７および９か月齢時に犠死させた。マウスの脳を採取し、免疫細胞分析およびサイトカイン分析のために染色した。マウスを犠死させる前に、腸内細菌叢分析のために糞便を採取した。第ＩＩＩ相治験において、４５０ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．（１日２回）に基づき、ＯＭ１処置のために６．５か月齢で、Ｔｇマウスを１００ｍｇ／ｋｇ ＯＭ１で、１日１回、１か月間経口投与で処置した。最後の処置の後に認知活性をモニタリングするために行動試験を行った。次に、マウスの脳および糞便を種々の分析に使用した。行動試験のために、種々の月数のＴｇマウスおよびＷＴマウスならびに処置マウスを、従前に報告されているように、弁別学習によって試験した。ＰｈｅｎｏＴｙｐｅｒ（ＨｏｍｅＣａｇｅ）に見られる総てのマウスの動きをコンピューター追跡システムによって記録し、これは遂行標準の８０％に達するのに要する進入の時間および回数を計算する（Ｎｏｌｄｕｓ、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ）。フェニルアラニンおよびイソロイシンの腹腔内注射については、４か月齢のＣ５７マウスを５０ｍｇ／ｋｇのフェニルアラニンまたはイソロイシンで４日間処置した。フェニルアラニンおよびイソロイシンの海馬内注射については、４か月齢のＣ５７マウスに３μＬのフェニルアラニンまたはイソロイシンを１２０ｍｍｏｌ／Ｌで注射した。１０日後、これらのマウスに、ＦＡＣＳを用いて血液サンプル分析および行動試験を行った。
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスタイムポイント分析のために、マウスおよび齢が一致する野生型マウスを３、９および１４か月齢で犠死させた。マウスの脳および血液を種々の分析のために採取した。犠死の前にマウス糞便を細菌叢分析のために採取した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウス処置のために、３か月間、抗生物質で処置したまたは処置しない６か月齢のマウスを５０ｍｇ／ｋｇのＯＭ１で１日１回強制経口投与によって処置した。最後の処置の後に認知活性をモニタリングするために行動試験を行った。動物実験は、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＩＰＰＲ－Ｂｋ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ（Ｎｏ．：２０１６００２）の倫理委員会によって承認されたものであった。
糞便サンプルＤＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅 総ての糞便サンプルをＤＮＡ抽出および分析前に－８０℃で凍結させた。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｓｏｉｌ ＤＮＡキット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、Ｕ．Ｓ．）を製造者のプロトコールに従って用い、糞便サンプルから微生物ＤＮＡを抽出し、最終ＤＮＡ濃度および精製をＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＵＳＡ）により決定し、ＤＮＡ品質を１％アガロースゲル電気泳動により確認した。細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４超可変領域を、サーモサイクラーＰＣＲシステム（ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００、ＡＢＩ、ＵＳＡ）により、プライマー３３８ Ｆ（５’－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’）および８０６ Ｒ（５’－ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ－３’）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応は以下のプログラムを用いて行った：９５℃で３分の変性、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒のアニーリング、および伸張のための７２℃で４５秒を２７サイクル、ならびに７２℃で１０分間の最終伸張。ＰＣＲ反応は、４μＬの５×ＦａｓｔＰｆｕバッファー、２μＬの２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、０．８μＬの各プライマー（５μｍｏｌ／Ｌ）、０．４μＬのＦａｓｔＰｆｕポリメラーゼおよび１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含有する２０μＬ混合物中、３反復で行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルから抽出し、ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡゲル抽出キット（Ａｘｙｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ユニオンシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてさらに精製し、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（商標）－ＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を製造者のプロトコールに従って用いて定量した。縮重プライマーとは、単一のアミノ酸をコードする異なる塩基の可能性の総てを表す異なる配列の混合物を指す。特異性を高めるために、種々の生物の塩基使用選択性に従って縮重を減らすようにコドン使用頻度表を参照することができる。Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣの通常の４つの塩基記号の他、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｋなどの他の文字もヌクレオチド鎖に見られ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔである。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンシング Ｍａｊｏｒｂｉｏ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（上海、中国）の標準プロトコールに従い、精製アンプリコンを等モルでプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＵＳＡ）でペアードエンドシーケンシング（２×３００）を行った。
シーケンシングデータの処理 未処理のｆａｓｔｑファイルのデマルチプレックスを行い、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃによりクオリティのフィルタリングを行い、以下の基準に基づいてＦＬＡＳＨによりマージした：（ｉ）５０ｂｐのスライディングウインドウで平均クオリティスコア＜２０を受けた部位においてはリードを切り捨てた。（ｉｉ）２ヌクレオチドのミスマッチを許容してプライマーを正確に適合させ、不明確な塩基を含むリードを除去した。（ｉｉｉ）１０ｂｐよりも長いオーバーラップを有する配列は、それらのオーバーラップ配列に従ってマージした。ＵＰＡＲＳＥ(version7.1 http://drive5.com/uparse/)を用い、９７％類似性カットオフで操作的分類単位(Operational taxonomic units)（ＯＴＵ）のクラスタリングを行い、ＵＣＨＩＭＥを用いてキメラ配列を同定し、除去した。各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の分類法を７０％の信頼閾値を用い、Ｓｉｌｖａ（ＳＳＵ１２３）１６Ｓ ｒＲＮＡデータベースに対してＲＤＰクラシファイアーアルゴリズム(http://rdp.cme.msu.edu/)によって分析した。
代謝産物サンプルの調製 －８０℃で保存したサンプルを取り出し、室温で解凍した。実験では、５０ｍｇのサンプルを用い、４００μＬのメタノール－水（４：１、ｖ／ｖ）を加え、ホモジナイザーを用いて１０秒間サンプルをホモジナイズした。溶液を氷上で１０分間、超音波抽出し、－２０℃で３０分間保存した後、１３０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。ＬＣ－ＭＳ分析のたに、２００μＬの上清を使用した。
ＬＣ／ＭＳ分析パラメーター ＬＣ－ＭＳは、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００ＴＭ質量分析計システム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）で行った。ＬＣ条件：カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．、１．７μｍ；Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、ＵＳＡ）。溶媒：カラムを４０℃で維持し、分離は以下の勾配：０～３分で５％Ｂ～３０％Ｂ、３～９分で３０％Ｂ～９５％Ｂ、９～１３．０分で９５％Ｂ～９５％Ｂ；１３．０～１３．１分で９５％Ｂ～５％Ｂ、および１３．１～１６分５％Ｂで保持を用いて行い、流速は０．４０ｍＬ／分であり、Ｂはアセトニトリル：イソプロパノール１：１（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）であり、Ａはギ酸水溶液（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）である。注入容量は２０μＬであった。質量スペクトルデータは、キャピラリ電圧１．０ｋＶ、サンプルコーン４０Ｖ、衝突エネルギー６ｅＶの、ポジティブまたはネガティブイオンモードのいずれかで作動するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００ＴＭ質量分析計システムを用いて収集した。イオン源温度は１２０℃に設定し、脱溶媒和ガス流は４５Ｌ／時とした。５０から１０００ｍ／ｚまで、３００００分解能で質量中心データを収集した。
代謝産物ＱＣサンプルの調製 ＱＣサンプルは、総てのサンプルのアリコートを混合してプールサンプルとすることによって調製し、次いで、分析サンプルを用いる場合と同じ方法を用いて分析した。反復可能性が評価されるデータセットを提供するために、分析の実行中、規定の間隔（１０サンプル毎）でＱＣを注射した。
マウス糞便の上清により誘導されるナイーブＣＤ４の、Ｔｈ１およびＴｈ２へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、＃１９７６５）を用いて、８か月齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの脾細胞から分離した。上記のように、７か月齢のマウスの糞便の上清を調製した。０．５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０培地中、合計０．５×１０６細胞／ウェルを４８ウェルの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８プレコーティングプレートに播種し、この培養培地にサイトカインおよびブロッキング抗体を添加した。Ｔｈ０：２０ｎｇ／ｍＬ ｍＩＬ－２；Ｔｈ１：２０ｎｇ／ｍＬ ｍＩＬ－２、１０μＬ上清、５０００ｎｇ／ｍＬ １１Ｂ１１；Ｔｈ２：２０ｎｇ／ｍＬ ｍＩＬ－２、１０μＬ上清、５０００ｎｇ／ｍＬ ＸＭＧ１．２。ＯＭ１は指定されたウェルに終濃度１００μｇ／ｍＬまで加えた。３７℃、５％ＣＯ２中で５日間のインキュベーションの後、細胞をＢＤ Ａｒｉａ ＩＩＩサイトメーターで捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いてデータを分析した。
免疫組織化学 ３，３０－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）現像染色のために、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ－ＲＸ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒ ＣＶ５０３０（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造のＩＨＣプロトコールに従って用い、切片を免疫染色した。簡単に述べれば、切片に、エピトープ賦活化溶液２（ＥＲ２、ＡＲ９６４０、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２０分間、熱誘導エピトープ賦活化を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を３％～４％（ｖ／ｖ）過酸化水素（ＤＳ９８００の一部、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で１０分間ブロッキングした。次に、切片をブロッキングバッファー（０．３％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００を含むＰＢＳ中１０％ＮＧＳ）で６０分間インキュベートした。最後に、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ検出システム（ＤＳ９８００、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者のプロトコールに従って用い、染色を行った。一次抗体のインキュベーション時間は３０分であった。切片を、活性化ミクログリアに関してはウサギ抗ＩＢＡ１抗体（１：１、０００、ｃａｔ＃０１９－１９７４１、Ｗａｋｏ）を用い、アミロイド沈着に関してはマウス抗Ａβ４２抗体（１：１，０００；ｃａｔ＃８０３００３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびタウリン酸化に関してはマウス抗ＰＨＦ－タウ＆錯綜－Ｔｈｒ２３１抗体（１：３００、ｃａｔ＃ＭＮ１０４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて染色した。染色した切片は、ハイスループット明視野スキャナー（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）によって自動スキャンし、画像をＮＤＰ．スキャン３．２ソフトウエア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）によって得た。蛍光染色については、切片をブロッキングバッファー（０．３％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００を含むＰＢＳ中、１０％ＮＧＳ）により室温で１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体溶液（Ｉｂａ－１ １：１，０００、Ａβ４２ １：１、０００、タウ １：３００）中、一晩、４℃でインキュベートした。洗浄後、切片を蛍光抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに６０分間室温でインキュベートし、ＰＢＳ中でさらに３回洗浄した。最後に、切片をＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：１００００、Ｓｉｇｍａ）で５分間室温にて対比染色し洗浄し、密閉し、画像取得のために４℃で保存した。正立蛍光顕微鏡Ｚｍａｇｅｒ－ｍ２（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）により、１０倍対物レンズ下、Ｚｅｎソフトウエア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて代表的な蛍光画像を取得した。
神経毒性試験 ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を、白色ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に５０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃および５％ＣＯ２加湿インキュベーターにて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）中で培養した。２４時間後、Ｌ－フェニルアラニンまたはＬ－イソロイシン（Ｓｉｇｍａ）用い、それぞれ終濃度１０ｍＭ、１ｍＭ、および０．１ｍＭで細胞を処理した。２４時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて細胞生存を検出した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ５装置を（ＢｉｏＴｅｋ）用いて発光シグナルを記録した。
アミノ酸検出 アミノ酸標準混合物溶液のセットを１００～２０００μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲で調製した。１０μＬ部の各標準混合物溶液または血漿サンプルの一部をピペットで試験管の底にピペットで移した後、７０μＬのホウ酸ナトリウムバッファー（２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．８）を加えた。２０μＬのカルバミン酸６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＡＱＣ）（アセトニトリル中４ｍｇ／ｍＬ）を加え、試験管を密閉し、１０分間５５℃で加熱してＡＱＣ－アミノ酸を形成した。次に、この溶液を室温に冷却し、それ以上精製せずに、アミノ酸分析のために２μＬ部の各溶液をＵＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳシステムに注入した。
ヒト対象
ＡＤ患者によるＭＣＩおよび健常対照由来の血液をパイロット研究から収集した。ＡＤによるＭＣＩは、ＮＩＡ－ＡＡ ２０１１ ＡＤによるＭＣＩに関する臨床および研究診断基準で定義される。本試験におけるＡＤによるＭＣＩ患者は以下の基準を満たさなければならない。第１に、認知の変化に関する懸念。第２に、１以上の認知領域における障害。第３に、機能的能力における独立性の維持。第４に、認知症ではないこと（ＮＩＡ－ＡＡ ２０１１ ＡＤによるＭＣＩに関する臨床診断基準）。総ての参加者が病歴の再検証、身体および神経学的検査、臨床検査、およびＭＲＩスキャンを含んだスクリーニングプロセスを受けた。軽度認知障害または認知症の臨床評価には、神経心理学的検査、ならびに担当の精神科医によって行われる行動および精神医学面接を含んだ。ＡＤ患者はハチンスキー虚血スコアで＜４のスコアを記録し、著明な全身的もしくは精神医学的状態、または脳機能を損なう可能性のある外傷的脳損傷の履歴を示していなかった。参加者の総てで臨床的認知症尺度(Clinical Dementia Rating)（ＣＤＲ）およびモントリオール認知評価(Montreal Cognitive Assessment)（ＭｏＣＡ）を評価した。評価に基づき、本発明者らは、ＡＤによるＭＣＩ対象を保持し、その他、例えば、単一の非記憶領域に障害を持った（単一の非記憶領域ＭＣＩサブタイプ）対象および２つ以上の領域に障害を有する対象（複数領域超軽微障害ＭＣＩサブタイプ）は除外した。正常対照の対象は、認知機能低下、神経障害、または管理されない全身性の医学的障害の履歴を持っていなかった。本試験に含まれる総ての対象は、ＦＬＡＩＲ(MRI fluid-attenuated inversion recovery)配列によって明らかにされるラクナ虚血（直径＜１ｃｍ）が２つ以下であった。
第１コホート（図５ｈ、ｉ）のサンプルサンプルは、ＡＤによるＭＣＩ患者９名および健常対象１８名である。第２コホート（図５ｊ）のサンプルサイズは、ＡＤによるＭＣＩ患者２２名および健常対象２２名である。ＭＣＩの診断は、ピーターセンのＭＣＩ診断基準から採用した以下の基準に基づいた：（１）記憶の不満、好ましくは、配偶者または関係者による確証；（２）客観的記憶障害；（３）正常な全般的認知機能；（４）日常生活の活動に問題がない；および（５）認知症の不在。上海精神保健センター治験審査委員会の倫理委員会は、この試験を承認した（Ｎｕｍｂｅｒ：２０１６－２２Ｒ１）。対象および対象の保護者からインフォームド・コンセントを得た。性別および年齢などの情報を以下に示す。
Figure 2022543014000011
Figure 2022543014000012
Figure 2022543014000013
フェニルアラニンおよびイソロイシンによって誘導されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および増殖 ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、＃１９７６５）を用いて、８か月齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの脾細胞からナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ｃ３４５５７）で染色した。０．２ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０培地中、合計１×１０５細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、培養培地にサイトカインまたはブロッキング抗体を添加した。Ｔｈ０：１０ｎｇ／ｍＬ ｍＩＬ－２；Ｔｈ１：１０ｎｇ／ｍＬ ｍＩＬ－２、５０００ｎｇ／ｍＬ １１Ｂ１１。フェニルアラニン（終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ）、イソロイシン（終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＯＭ１（終濃度１００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ指定のウェルに加えた。３７℃、５％ＣＯ２中で５日間のインキュベーションの後、細胞をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターで捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いてデータを分析した。
フェニルアラニンの取り込み ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｃａｔ Ｎｏ．１９７６５）を用いて、８か月齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの脾細胞からナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１２によりＴｈ１分化へ誘導した。３日後、０．５ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０培地中、合計５×１０５細胞／ウェルのＴｈ１細胞およびＴｈ０細胞を、４８ウェルプレートに播種した。１３Ｃ標識フェニルアラニンおよび５ｍＭアミノ輸送体阻害剤ＢＣＨを指定のウェルに加えた。０．５時間語、細胞を集め、氷冷Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄した。５０μＬの脱イオン水を加え、－８０℃での２回の凍結および解凍によって細胞を溶解させた。細胞溶解液を１２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清中の１３Ｃ標的フェニルアラニンを質量分析によって分析した。
抗生物質処置 無菌飲水中にアンピシリン（飲水中終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（飲水中終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）、およびコリスチン（飲水中終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する抗生物質溶液（ＡＴＢ）を加えることによりマウスを処置した。溶液およびボトルをそれぞれ１週間に３回および１回変えた。抗生物質活性は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによって確認した。Ｔｇ群では、相対存在量が０．０１未満の細菌種が消滅する。ＡＢＸ処置の期間は、試験状況に基づいて若干異なった。糞便微生物移植試験については、マウスに３日間ＡＴＢを受容させた翌日に、動物用経口ゾンデを用いた強制経口投与により、糞便細菌叢移植を行った。
糞便細菌叢移植（ＦＭＴ）試験 ＦＭＴは、糞便材料を解凍することにより行った。次に、各ＡＴＢ前処置レシピエントに２００μＬの懸濁液を強制経口投与によって移入した。ＦＭＴは５日で３回行った。１２か月齢のＣ５７マウスをまず、飲水中の抗生物質カクテルで３日間処置し、次に、ＰＢＳに懸濁させ４０ｍｇの混合便を各マウスに強制経口投与によって、間に２日の休止を設けて３回挿入した。３日後、４．２μｇのＡβ １～４０オリゴマーを両側の海馬に注射した。マウスを３日後に犠死させ、種々の分析に使用した。
生物情報科学分析 パスウェイ分析および生物学的機能エンリッチメント分析は、ＫＥＧＧ(Kyoto Encyclopedia of Gebes and Genomes)を用いて行った。データのエンリッチメントは、パッケージ「ＤＯＳＥ」、「ＧＯ．ｄｂ」、「ＧＳＥＡＢａｓｅ」および「ＣｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ」を用いて行った。ＦＤＲ(false discovery rate)補正ｐ値が＜０．０５のパスウェイだけを表した。Ｒパッケージ「ｇｇｃｏｒｒｐｌｏｔ」を相関分析に使用した。Ｒパッケージ「ｉｇｒａｐｈ」を用いて相関サーカスグラフを作成した。Ｒパッケージ「ｇｇａｌｌｕｖｉａｌ」および「ｎｅｔｗｏｒｋＤ３」を用いて細菌流れ図およびサンキーダイアグラムを描いた。トレンドクラスター分析のためにＲパッケージ「Ｍｆｕｚｚ」を用いた。他のバイオインフォマティクス分析は、Ｍａｊｏｒｂｉｏ Ｉ－Ｓａｎｇｅｒ Ｃｌｏｕｄのオンラインプラットフォーム(www.i-sanger.com)を用いて行った。ＲＯＣバイオマーカー分析およびランダムフォレスト分類は、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ４．０（https://www.metaboanalyst.ca/)を用いて行った。
フローサイトメトリーサンプルの調製および分析 マウスを麻酔し、血液サンプルをＥＤＴＡ含有チューブに採取し、１×赤血球溶解バッファーを用いて赤血球を除去した。組織の採取前に、循環血液免疫細胞をサンプリングしないように脳を氷冷ＰＢＳで潅流して、脳を取り出し、細片に刻み、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、成体脳解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ Ｎｏ．１３０－１０７－６７７）の導入に従って解離させた。脳ホモジネートを７０μｍセルストレーナーで濾過し、４℃にて３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを冷ＰＢＳバッファーに再懸濁させ、再び４℃にて３００×ｇで５分間遠心分離した。全サンプルを計数し、２～３×１０６／１００μＬの密度に調調整し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄキットで３０分間標識した後、４℃にて５００×ｇで３分間遠心分離した。細胞を１００μＬのＰＢＳバッファーに再懸濁し、抗ＣＤ１６／３２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．１０１３２０）で１０分間ブロッキングし、４℃で３０分間、製造者のプロトコールに従って抗体とともにインキュベートした。以下の抗体をＦＡＣＳ分析で使用した：ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）－ＡＰＣ－Ｃｙ７（１０３１１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）－ＦＩＴＣ（１０１２０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＸ３ＣＲ１（ＳＡ０１１Ｆ１１）－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ ５９４（１４９０１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）－ＢＶ４２１（１２３１３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８６（ＩＴ２．２）－ＰＥ（３０５４３８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２０６（１５－２）－ＡＰＣ（３２１１１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２０６（１５－２）－ＢＶ７８５（３２１１４２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）－ＰＥ－Ｃｙ７（１１７３１８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（５３－６．７）－Ｐｅｒｃｐ－Ｃｙ５．５（１００７３４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ－６Ｃ（ＨＫ１．４）－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ ５９４（１２８０４４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｇｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）－Ｐｅｒｃｐ－Ｃｙ５．５（１０８４２８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）－ＢＶ４２１（１０３２４０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（６Ｄ５）－ＰＥ（１１５５０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）－ＰＥ－Ｃｙ７（１０８９２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）－ＰＥ－Ｃｙ７（１００４２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）－ＦＩＴＣ（１００４０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３－１７３）－ＢＶ４２１（１２６５２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ４（Ｌ２９１Ｈ４）－ＰＥ－Ｃｙ７（３５９４１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ６（２９－２Ｌ１７）－ＡＰＣ（１２９８１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１２７（Ａ０１９Ｄ５）－ＰＥ（３５１３０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（３Ｃ７）－Ｐｅｒｃｐ－Ｃｙ５．５（１０１９１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（４２３１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞を５００μＬのＰＢＳバッファーに加え、４℃にて５００×ｇで３分間遠心分離し、２００μＬのランニングバッファーに再懸濁させた。関連の陰性対照、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照および各蛍光補正サンプルを用いて蛍光補正を調整し、対象とする集団を同定した。細胞をＢＤ Ａｒｉａ ＩＩＩサイトメーターで捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いてデータを分析した。
抗体アレイ 脳ホモジネート（２０ｍｇ組織）を、２００のタンパク質を含むスライドガラスに基づく抗体サイトカインアレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、ＧＳＭ－ＣＡＡ－４０００－１）を用いて分析した。１００μＬのサンプル希釈剤を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。次に、バッファーを別の１００μＬのサンプルに置き換え、室温で２時間インキュベートした。これらのサンプルを廃棄し、室温で穏やかに振盪しながら、１５０μＬの１×洗浄バッファーＩで５回（各５分）および１５０μＬの１×洗浄バッファーＩＩで２回（各５分）、室温で穏やかに振盪しながら洗浄した。８０μＬの検出抗体カクテルを各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。このスライドを、室温で穏やかに振盪しながら、１５０μＬの１×洗浄バッファーＩで５回（各５分）、次いで、１５０μＬの１×洗浄バッファーＩＩで２回（各５分）洗浄した。８０μＬのＣｙ３同等色素コンジュゲートストレプトアビジンを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。５回洗浄した後（各５分）、シグナルをレーザースキャナーで可視化した。次に、データをヒートマップダイアグラム(www.metaboanalyst.ca)によって可視化した。
脳切片の調製 マウスをペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）による深麻酔の後に０．９％ＮａＣｌで経心的に潅流した。脳組織を手早く取り出し、凍結させ、－７０℃で保存した。スライディング凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて連続冠状脳切片（１２μｍ厚）を作製し、スライドに載せ、一晩室温で風乾した。組織切片を－７０℃で保存するか、またはすぐに使用した。
レーザー顕微解剖およびＱ－ＰＣＲ分析 凍結したマウス脳サンプルを切片とし、ＰＥＮメンブランスライド（Ｌｅｉｃａ、１１６００２８８）上に収集した。海馬はレーザー顕微解剖顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＬＭＤ６）によって単離した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４００４）で抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得た（Ｔａｋａｒａ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＲＲ０３６Ａ）。Ｑ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ法（Ｔａｋａｒａ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ）にてＡＢＩ ７５００システムを用いて行った。以下のプライマーを使用した：シナプトフィジン－フォワード：ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＧ；シナプトフィジン－リバース：ＡＣＴＣＴＣＣＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣＡＣ；アクチン－フォワード：ＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴ；アクチン－リバース：ＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧ。
統計分析 行動試験において、動物を異なる群に無作為に分配した。２群の比較のために、対応のない両側スチューデントのｔ検定を適用した。２群より多い比較のためには、一元配置ＡＮＯＶＡまたは２元配置ＡＮＯＶＡとその後にダネット検定を行った。エラーバーの付いた総てのデータは、平均±ＳＥＭとして表す。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。ほとんどのデータはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。画像の定量のために、Ｉｂａ－１陽性、Ａβ４２陽性およびリン酸化タウ陽性細胞をＩｍａｇｅＪ ｖ１．８．０により「エリア」リードアウトで分析した。
行動試験 以下の行動試験を行った：モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ、ＭＷＭ）、Ｙ型迷路および高架十字迷路（ＥＰＭ）。総ての軌跡を、カメラを用いて記録し、ソフトウエア（Ｊｉｌｉａｎｇ）を用いて関連のパラメーターを計算した。
ＭＷＭ試験を用いて、従前に公開されているプロトコールに従い、空間学習および記憶を測定した。簡単に述べれば、マウスに６日の馴化試験を行い、各マウスは１日３つの試験を遂行した。動物を所望のスタート位置で見ずに離し、逃避台を見つけるまでの潜時を測定した。７日目に、逃避台を取り去り、マウスを６０秒間泳がせた。軌跡および逃避台位置横断回数を、ビデオカメラを用いて記録した。
ワーキングメモリは、いくつかの修正を施して文献に従い、Ｙ型迷路によって評価した。Ｙ型迷路は、異なる手がかりがある同一のアーム（Ａ、Ｂ、Ｃ）から構成された。マウスをスタートアーム（Ａ）に載せ、探索したアームの順序を記録した（例えば、ＡＢＣＢＡ）。アーム進入の総回数および交替行動を、ビデオカメラを用いて記録した。Ｙ型迷路の精度は、適切な交替反応と総交替反応の比率とした。
ＥＰＭ試験は、動物の不安を評価するために広く使用され、２つのオープンアーム（３０ｃｍ×６ｃｍ）、２つのクローズドアーム（３０ｃｍ×６ｃｍ×２２ｃｍ）およびセンターエリア（６ｃｍ×６ｃｍ）からなる。各マウスをクローズドアームに面した迷路の中央に載せ、迷路を５分間探索させた。軌跡を記録し、オープンアームに訪れた頻度を計算し、これはマウスの不安と負の相関がある。
実施例
実施例１： ＡＤ進行は腸内細菌叢および免疫細胞浸潤の変化に関連する
ＡＤ病因における腸内細菌叢の変化の役割を評価するために、本発明者らは、その迅速な発症と複数のＡＤ関連の病理学的特徴および臨床像の忠実な再現のためにＡＤ試験において広く使用されている５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデルを使用した。このマウスは生後４か月で記憶障害、７か月で行動変化、９か月でニューロンの損失を呈する。同じ条件で飼育した同系統からの、齢が適合する野生型（ＷＴ）マウスを対照として使用した。これまでの報告と一致して、本発明者らはＡβ斑沈着、タウのリン酸化、シナプトフィジン発現、行動などの変化を認めた。具体的には、皮質および海馬のＡβ斑沈着は生後３か月から休息に蓄積し始めている（図７ａ）。Ｔｇマウスの脳におけるタウのリン酸化は、３か月に初めて見られ、齢とともに徐々に増加し（図７ｂ）、海馬におけるシナプトフィジンの発現レベルは、７か月～９か月に有意に低下し（図１ａ）、これはシナプス変性の指標である。Ｔｇマウスにおける行動試験は、９か月齢で分別学習に有意な低下を示した（図１ｂ）。本発明のＴｇマウスの初期（２～３か月）および後期（７～９か月）はヒト臨床ＡＤの初期および後期と同じ概念ではないことに留意されたい。Ｔｇマウスの後期は、症候的には、ヒトにおけるＡＤによる軽度認知障害（ＭＣＩ）に匹敵する。従って、本発明においては、ＡＤによるＭＣＩ患者がヒト研究対象として使用される。
ＴｇマウスにおけるＡＤ進行中の腸内細菌叢組成の顕著なシフトは、一連の時点に対するさらなる主成分分析（ＰＣＡ）で明らかになったが、ＷＴマウスでは時間が経っても変化はほとんど見られなかった（図１ｃ；図７ｃ）。
Ｔｇマウスにおける種々の細菌門の存在量の動態を追跡するためにＯＴＵを用い、本発明者らは、疾病進行中のＴｇマウスにおける腸内細菌叢プロファイルの、２つの明らかな変化を見出した。２～３か月齢で、バクテロイデス門、ファーミキューテス門およびウェルコミクロビウム門は三大存在度の細菌門となった（それぞれ４６．８％、３２．３％および１２．６％）。７～９か月齢では、ファーミキューテス門は優勢細菌となり、一方、バクテロイデス門およびウェルコミクロビウム門の存在量は顕著に減少し、このことは細菌のタイプの変化を示す（図１ｄ）。本発明者らは、各時点におけるＴｇマウス由来の代表的な細菌をさらに探索した（図７ｄ、図７ｅ）。これらの結果は、ＷＴマウスとは極めて対照的に、Ｔｇマウスの腸内細菌叢が極めて動的であることを示した。ＡＤ試験に広く使用されているもう１つのモデルであるＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスモデルでも同様の結果が得られた（図７ｆ、図７ｇ）。
本発明者らは、ＡＤ進行中に認められる腸内細菌叢変化は神経炎症に関連し得るという仮説を立てた。この仮説を検証するために、本発明者らは、Ｔｇマウスの炎症状態を評価した。ＡＤマウス脳切片におけるミクログリアの活性化の特徴であるＩＢＡ１の免疫染色は、それぞれ３か月と７～９か月の２つの明らかなミクログリア活性化段階を明らかにした（図１ｅ）。ミクログリアの活性化が２つの反対種、すなわち、炎症誘発性Ｍ１サブタイプと神経保護Ｍ２サブタイプに類別できることを考え、本発明者らはまたＭ１表現型とＭ２表現型を注意深く特徴付けた。２～３か月齢の初期には、Ｍ１およびＭ２ミクログリアは両方とも増加した。続いての月齢では、Ｍ１サブタイプが増え続け、７～９か月にピークがあり、一方、Ｍ２型ミクログリアは３～５か月まで減少し、その後低レベルで維持された（図１ｆ）。ＴｇマウスのＡＤが経時的に進行するにつれ、脳内の炎症誘発性Ｍ１ミクログリアサブタイプが、神経保護Ｍ２ミクログリアサブタイプと比較できるものから（図１ｆ、２～３か月）ミクログリア中に優勢であるもの（図１ｆ、５～９か月）に変化しており、全体としてのミクログリアの活性化の増加をもたらした（図１ｅ、５～９か月）ことが見て取れる。
ミクログリアの活性化に加え、ＡＤ関連神経炎症は末梢免疫細胞の浸潤を含むことが知られている。よって、本発明者らはまた、ＡＤ進行中の脳内の浸潤末梢免疫細胞を分析した。ＩＢＡ１染色の結果と同様に、脳内のＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞がＴｇマウスではＷＴマウスよりも有意に高いことが見出された（図１ｇ）。ＡＤ進行中に一連の時点のＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞サブタイプをさらに分析したところ、ＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の主成分としてのＣＤ４＋Ｔ細胞の変化が、ＩＢＡ１と同様の変化傾向を密接に有することが明らかになった（図１ｈ～ｉ）。本発明者らが探索した時間では、ＣＤ４＋細胞の２つの主要なサブタイプである浸潤Ｔｈ１およびＴｈ２細胞が、Ｍ１およびＭ２ミクログリア細胞と同様の動態を示した（図１ｊ）。ＴｇマウスにおけるＡＤの経時的進行において、Ｔｈ１はＴｈ２と比較できるもの（図１ｊ、２～３か月）からＣＤ４＋Ｔ細胞中に優勢であるもの（図１ｊ、５～９か月）に変化し、全体としてのＣＤ４＋Ｔにおける増加をもたらした（図１ｉ、５～９か月）ことが見て取れる。
よって、腸内細菌叢のパターンがシフトすると、免疫細胞集団がＴｈ１優勢およびＭ１優勢状態に変化する傾向があり、特に、これらの変化の時間的妥当性が顕著であると思われた（図１ｄ～ｊ）。同様の結果がＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルでも認められた（図８、図７ｉ、図７ｊ、図２３）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルおよび５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデルは、ＡＤの進行において経時的に異なることを指摘しておくべきである。Ｔｇマウスは５か月齢で明らかなＡβ沈着を有したが（図７ａ）、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスには５か月齢で明らかなＡβ沈着はない（図８ａ）。これら２つの腸内微生物の経時的変化（図１ｄ、図７ｇ）は完全には一致しないが、これは種内および個体間のＡＤ進行間および腸内微生物の違いを反映しているが、それらは総て経時的な腸内微生物パターンの変化と免疫細胞の変化の間の相関を示す。
本発明者らはまた、腸内細菌叢の存在量と脳の免疫細胞頻度の間の相関も分析し、初期（２～３か月）の細菌組成は脳内のＭ２およびＴｈ２細胞総数との相関が高いが（図１ｋ、上）、細菌パターンの変化はＭ１およびＴｈ１細胞との相関が高かった（図１ｋ、下）ことを示した。免疫細胞と有意に相互関係があった細菌を図１ｋの右のパネルに列挙したが、これによっても腸内細菌叢パターンと免疫細胞、特にＴｈ１およびＭ１の間の相関が確認される。
全体として、これらの結果は、ＡＤ進行中に、腸内細菌が末梢免疫細胞の浸潤および神経炎症の存在に関連していたことを示し、このことを以下でさらに検討する。
実施例２： 腸内細菌叢の変化は脳内でＴｈ１細胞の過剰な浸潤およびＭ１ミクログリアの過剰な活性化をもたらす
ＡＤ進行における末梢免疫細胞の浸潤、続いての神経炎症を引き起こすために腸内細菌叢の変化が必要とされるかどうかを判定するために、本発明者らは、腸内細菌叢を除去するために後期（７か月齢）のＴｇマウスにおいて、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、およびコリスチン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有する抗生物質カクテルを使用した。後期（７か月齢）Ｔｇマウスにおける抗生物質処置は、腸内の微生物の多様性および存在量の両方に著しい減少をもたらした（図２ａ）。
この変化とともに、本発明者らは、脳内に浸潤炎症誘発性Ｔｈ１細胞（図２ｂ）およびＭ１細胞（図２ｃ）の両方の減少を認めた。このことは、ＡＤマウスの腸内微生物の分布に干渉することによって後期ＡＤマウスにおけるＴｈ１およびＭ１の優勢状態を変化させ得ることを予備的に証明し、腸内微生物の変化と免疫細胞の変化の間の因果関係を示す。
さらに、これらの所見は、共飼育試験によっても確認された。ＷＴマウスを、誕生後７か月間、同齢のＴｇマウスと共飼育した。共飼育ＷＴマウスはＴｇマウスに比べて弁別学習に低下を示した（図９ａ）。理由を見つけるために、これら７か月齢のマウスの腸内細菌叢の変化の分析は、後期（７か月齢）の共飼育ＷＴマウスとＴｇマウスとで腸内細菌叢の組成は全く同じであるが、分離飼育下の同齢のＷＴマウスとは優に異なることを示し（図２ｄ）、このことは、ＷＴマウスがＴｇ細菌に長期間曝されると（すなわち、ＴｇマウスのＡＤ腸内微生物モデル）ＷＴマウスの腸内細菌叢の組成をＴｇマウスの方向に向かってシフトさせ、同時に認知障害も引き起こしたことを示す。このことは、従来のスキームとは異なる、すなわち、ＷＴモデルの腸内細菌叢パターンをＡＤモデルの腸内細菌叢パターンに変化するように調節することによって、ＡＤモデルを構築するための戦略を提案する。
さらに、共飼育ＷＴとＴｇマウスの間の浸潤Ｔｈ１細胞は同等であり、これらは両方とも分離飼育したＷＴマウスよりも有意に高かった（図２ｅ）。一方、Ｍ１細胞は共飼育ＷＴマウスでは増加していた（図２ｆ）。免疫細胞の変化と一致して、脳内のサイトカインの発現は、共飼育ＷＴとＴｇマウスの間で顕著な類似性をしめしたが、ＷＴマウスとは異なっていた（図２ｇ）。
よって、上記の説明により、ＷＴマウスの腸内細菌叢をＴｇマウスの腸内細菌叢に変化させることにより、ＷＴマウスのＴｈ１細胞およびＭ１細胞がＴｇマウスのものに類似した状態に転換され、類似の認知障害をもたらすことが確認され、ここでもまた、腸内細菌叢の変化と免疫細胞ならびに認知の変化の間の因果関係が確認される。
さらに、本発明者らは、上記の方法の治療的価値を証明するためのモデルを構築するためにＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスを用いた。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスを用いて糞便細菌叢移植（ＦＭＴ）試験を行い、結果を図１６の６～１０列に示す。
続いての糞便細菌叢移植のための初期環境を提供するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウスを抗生物質で処置した。凝集したＡβをその海馬に注射した後、７～９か月齢のＴｇマウス由来の糞便細菌（「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿Ｃ５７＿Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ＴＧ Ｆｅｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ」）または対照としてのＷＴマウス由来の糞便細菌（「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿Ｃ５７＿Ｒｅｃｅｉｖｅ ＷＴ Ｆｅｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ」）を経口投与した。これは、対照と比較して脳内のＴｈ１細胞の有意な増加およびＴｈ２細胞の有意な減少をもたらし（図９ｂ）、これは上記のＴｇマウスにおける変化と一致している。このことは、Ｔｇ糞便の移植はＷＴマウスの腸内微生物パターンの変化をもたらすことができ、これがまた免疫細胞パターンの変化に至ることを証明した。
他方、逆に、正常腸内微生物分布パターンを有するＷＴマウス由来の糞便の移植はレシピエントＴｇマウスの脳内のＴｈ１細胞を低下させた（図９ｃ）。このことは、Ｔｇマウスの腸内微生物パターンがＷＴマウスのものに変化し、免疫細胞パターンもまた変化することを証明した。
これらの結果により、ここでもまた、ＡＤの進行における、腸内細菌叢の変化と脳の免疫細胞（特にＴｈ１／Ｍ１）および認知の変化の間の因果関係が確認された。ＡＤを治療するために脳腸軸を用いる戦略が提案され、確認された。
これらの所見を考え合わせると、腸内細菌叢の変化がＡＤ進行における末梢免疫細胞の浸潤および神経炎症の活性化を引き起こすことが示唆される。腸内微生物分布が病的パターンを示すＴｇマウスに対して腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤（例えば、正常な腸内微生物分布パターンのＷＴ糞便または以下に例示するＯＭ１）を投与することにより、Ｔｇマウスの腸内微生物分布は、初期の正常な腸内微生物分布に向かって再調整される。これはＴｇマウスにおいてＴｈ１／Ｍ１が優勢となる免疫細胞パターンを効果的に回復させ、それにより認知を改善し、ＡＤを治療する。このことは、免疫細胞パターンを回復させるためにヒトＡＤ患者における腸内微生物の分布を再調整すること（例えば、腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤を使用する戦略）によるさらなる認知の改善およびＡＤの治療に関する、ならびにＡＤ進行のマーカーとしての腸内微生物分布および／または免疫細胞の状態（例えば、Ｔｈ１の状態（例えば、集団における割合）、Ｍ１の状態（例えば、集団における割合））に関する、強固な基盤および確証を提供する。
実施例３ ＯＭ１は腸内細菌叢を調節することにより神経炎症を緩和する
本明細書において明らかになったＡＤ進行における腸内細菌叢の不可欠な役割は、腸内細菌叢の介入による治療的意味合いを示唆し得る。ここでも証明のために、本発明者らは、褐藻から抽出された、臨床的に証明された抗ＡＤ薬であるＯＭ１を使用した。ＯＭ１は、重合度が二量体～十量体の範囲であり、平均分子量が約１ｋＤａである酸性直鎖オリゴ糖類の混合物である（図３ａ）。
３か月間ＯＭ１で処置した９か月齢～１２か月齢の後期ＡＤモデルＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、モリス水迷路（ＭＷＭ）課題における訓練試験（図３ｂ）および探索試験（図３ｃ）の両方でのＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間学習および記憶性能の向上によって示されるように、ＯＭ１は認知障害に対して有意な改善効果を示した。ＯＭ１はまた、Ｙ型迷路のけるマウスの成績を有意に向上させた（図３ｄ）。最近、ＯＭ１は、中国における３６週多施設無作為化二重盲検プラセボ対照第３相臨床試験（臨床試験コード：ＣＴＲ２０１４０２７４）においてＡＤ患者の認知障害の回復に対して治療効果を示した。本発明者らは、ＯＭ１がＡＤ患者の腸内細菌叢に影響を与えることによって認知向上効果を示すのかどうかを理解することに着目している。
興味深いことに、７か月齢から開始する後期ＴｇマウスにおけるＯＭ１の１か月の経口投与は、腸内細菌叢の組成を顕著に変化させ（図４ａ～ｂ；図１０ａ）、ＷＴパターンに近づくように回復させた（図１３～１４；図１６）。
腸内細菌叢の変化と一致して、ＴｇマウスにおけるＯＭ１処置は、脳のリンパ球総数と腸内細菌の変化の間の相関を打破し（図４ｃ；図１０ｂおよびｃ）、脳内のＴｈ１細胞を減少させ（図４ｄ）、ミクログリアの活性化をＷＴマウスと同等のレベルに有意に低下させ（図４ｅ）、脳のサイトカインレベルを低下させ（図４ｆ）、ＷＴパターンに近づくように回復させた（図１５）。並行して、ＯＭ１処置は、Ｔｇマウスに見られたＡβ斑の沈着、タウのリン酸化、および弁別学習の低下を有意に軽減した（図４ｇ～ｉ）。ここでも、免疫細胞パターンを回復させ、それにより認知を改善しＡＤを治療するために腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤を使用するなど、腸内微生物の分布を再調整する戦略が証明された。
さらに、本発明者らは、凝集したＡβを脳室内に注射したレシピエントＣ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスにＯＭ１処置Ｔｇマウスの糞便を移植する糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）を行った。ＯＭ１処置Ｔｇマウスの糞便は、ＯＭ１処置を行わなかったＴｇマウスに比べて、レシピエントマウスの脳内のＴｈ１細胞の低下をもたらした（図１０ｅ）。ＯＭ１で処置したＴｇマウス由来の糞便と実施例２で証明されたＷＴマウス由来の糞便は、腸内微生物の分布の回復およびＴｈ１の減少に同等の効果を有することを認め、これにより、Ｔｇマウスの腸内微生物に対するＯＭ１の回復効果が証明される。一貫して、抗生物質処置はＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおけるＴｈ１細胞、ＩＢＡ１レベルおよびサイトカイン発現に対するＯＭ１の効果を損なった（図１０ｆ～ｊ）。これらのデータは総て、ＯＭ１が腸内破綻を調整することによって神経炎症および認知低下を緩和することができたことを示唆した。
一般に、マウスにおける上記のｉｎ ｖｉｖｏ試験により、腸内微生物およびそれらの調節の変化－免疫細胞のＴｈ１／Ｍ１優勢傾向およびその回復－－認知障害およびそれらの改善、例えば、ＡＤ脳腸軸調節経路およびそれらの介入処置が十分に確認された。そして、初期状態において、またこれらのマウス間の腸内微生物のプロセス移行において特定の種内および個体間差が存在するものの、このような調節経路および介入は、様々な異なるマウスモデル（５ＸＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデル、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデル、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデル）において一貫して証明される。従って、様々な個体においてこのような調節経路および介入が共通のものであることが十分に確認された。よって、腸内微生物を調節して、免疫細胞疾患モードを回復させるように腸内微生物を正常および健常モードに再調整することによって認知を改善しＡＤを治療する戦略が提案される。
本発明者らは、表１～２に列挙され、図１７～１８に例示されるように、２つの間に違いがあるＡＤ脳腸軸関連腸内微生物を調節標的として比較および分析するために、ヒトＡＤ患者および健常対照のデータを使用した。上述のＡＤ脳腸軸処置戦略をヒトに適用する場合、齧歯類として試験されるマウスと本発明で試験される霊長類としてのヒトの間の種間腸内微生物の違いの他、ＡＤ患者間の種内および個体腸内微生物間の違いも十分に考慮しなければならない。よって、上記の試験に具体的に示したマウス腸内微生物のタイプは示唆に富むが、ヒトＡＤ患者にそのまま機械的に当てはめるべきではない。
実施例４： ＯＭ１はアミノ酸代謝を調節することにより神経炎症を阻害する
本発明はまた、腸内細菌叢の変化と免疫細胞の変化の間の中間的な連関およびその介入を探索する。
腸内微生物の代謝産物とナイーブＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２への分化の間の因果関係、およびその介入
免疫調整における代謝産物の可能性のある関与を調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した、７か月齢Ｔｇマウス由来の糞便の上清をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞培養物に加え、これによりナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１およびＴｈ２細胞への分化を刺激した。これに対し、ＯＭ１で処置したＴｇマウスの糞便上清はＴｈ２分化を促進し、Ｔｈ１分化を阻害し（図１１ａ）、このことは腸内微生物の代謝産物がナイーブＴ細胞のＴｈ１およびＴｈ２細胞への分化に影響を及ぼすことを示す。
腸内微生物の代謝産物におけるアミノ酸とナイーブＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２への分化の間の因果関係およびその介入
本発明者らは、次に、糞便メタボロームを特徴付けるためにノンターゲットメタボロミクス技術を使用した。ＷＴ、ＴｇおよびＯＭ１処置Ｔｇマウスの糞便サンプルにおいて合計１１２８９の代謝産物を同定した（図１１ｂ～ｃ）。これらの代謝産物のうち、ＭＥＴＬＩＮデータベースにアノテーションされるように、１２４の代謝産物の存在量が、ＷＴマウスに比べてＴｇマウスで有意に変化、ダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションを受けていたが、このことはそれがＡＤに関連していることを示す。顕著なことに、これらの代謝産物の変化は総てＯＭ１処置によって大幅に回復させることができ（図１１ｄ～ｆ）、このことはこのＡＤ治療がこれらのＡＤ関連代謝産物の異常な状態を修復したことを示す。これらの変化した代謝産物は、ヒトメタボロームデータベース（ＨＭＤＢ）およびＫＥＧＧ(Kyoto Encyclopedia of Gebes and Genomes)でさらなるアノテーションを得、３つ総てのデータベース（ＨＭＤＢ、ＭＥＴＬＩＮ、ＫＥＧＧ）にマッチし得る、ＷＴ、ＴｇおよびＯＭ１処置Ｔｇマウス間で差次的に調節された合計３１の代謝産物が得られた。ＭＢＲＯＬＥまたはＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔを用いたこれらの代謝産物のパスウェイエンリッチメント分析により、アミノ酸関連代謝経路および酵素、特に、フェニルアラニン関連経路の有意な変化がさらに明らかになった（図５ａ）。
従って、本発明者らは、さらなる研究のためにアミノ酸に焦点を当てることにした。合計３６のアミノ酸の血漿濃度（表３）をＷＴマウスおよびＴｇマウスの両方でスクリーニングした。ランダムフォレストアルゴリズムを用いてこれらのアミノ酸を分類し、図１９に示し、表４に列挙するようにそれらのいくつかを選別する。フェニルアラニンは最高のヒットとして評価され、次いで、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジン、およびアセチルオルニチンであった。これらの５つのアミノ酸の多変量探索的分析から、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線に従ってＷＴマウスとＴｇマウスの間の有意差が明らかになり（図５ｂ；図１１ｈ）、それらが疾病進行に密接に関連することが示された。本発明者らは、次に、ＯＭ１処置または非処置Ｔｇマウスにおいて糞便および血中サンプル中の、選択されたアミノ酸の濃度を調べ、それをＷＴマウスのものと比較した。図２０および図２１を参照すると、本発明者らは、様々なアミノ酸がＯＭ１によって影響を受け、Ｔｇパターンから野生型パターンへ回復したことを見出した。特に、フェニルアラニンおよびイソロイシンの濃度は、ＷＴマウスよりもＴｇマウスの糞便で有意に高く、ＯＭ１処置は、それらの濃度をＷＴマウスに匹敵するレベルに有意に低下させた（図５ｃ）。血中でも、フェニルアラニンおよびイソロイシンの存在量における同様の変化様式が検出された（図５ｄ）。フェニルアラニンおよびイソロイシンは疾病進行とともに変化する腸内微生物代謝産物の代表例であり、ＯＭ１によって回復することに留意されたい。さらに、本発明者らはまた、ＯＭ１を受容した後に、マウスのサイトカインが野生型パターンに回復する傾向にあることも見出した（図２２）。これは、Ｔｇマウスと共飼育した場合に、図２ｇに示されるように、ＷＴマウスのサイトカイン状態がＴｇマウスパターンに変化する傾向に相当する。
これらのアミノ酸の上昇が腸内細菌叢の変化から生じ、それにより腸内細菌叢に干渉することによってアミノ酸の介入を可能とするかどうかを調べるために、本発明者らは、ＦＭＴ試験でアミノ酸濃度を調べた。２か月齢のＷＴマウス由来の糞便は、Ｔｇマウスにおいてフェニルアラニンおよびイソロイシンのレベルを有意に低下させることができた（図１１ｉ）。同様に、図２のいたるところに記載される共飼育ＷＴマウスでも、血中のフェニルアラニンおよびイソロイシン濃度がＴｇマウスに比べて上昇していた（図１１ｊ）。よって、ＷＴマウスをそれらの固有のＷＴ腸内微生物パターンをＴｇパターンに転換させるためにＴｇマウスと共飼育した場合に、フェニルアラニンおよびイソロイシンの異常な産生が起こり、フェニルアラニンおよびイソロイシンのレベルが増加したことを決定付けることができた。対照的に、正常なＷＴ腸内細菌叢を含有するＷＴマウス糞便をＴｇマウスに移植すると、Ｔｇマウス腸内細菌叢をＷＴパターンにシフトさせ、フェニルアラニンおよびイソロイシンの異常な産生の回復およびフェニルアラニンおよびイソロイシンレベルの低下がもたらされる。このことにより、Ｔｇマウスの腸内細菌叢を回復させることによって、腸内微生物の代謝産物であるフェニルアラニンおよびイソロイシンのレベルが再調整され得ることが確認された。
フェニルアラニンおよびイソロイシンがナイーブＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２への分化に影響を及ぼすことの確認およびそれらの介入
細胞に及ぼすフェニルアラニンおよびイソロイシンの影響を評価するために、これら２つの化合物をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞培養物に直接加えた。Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化（図５ｅ）およびＴｈ１細胞の増殖（図５ｆ）の両方が増大した。これに対して、ＯＭ１処置はフェニルアラニンおよびイソロイシンにより誘導されたＴｈ１の分化ならびに刺激されたＴｈ１細胞の増殖を阻害することができ、このことは、ＯＭ１が腸内微生物に影響を及ぼすだけでなく、その代謝産物アミノ酸自体にも直接影響を及ぼすことを示す。さらに、本発明者らは、ＷＴマウスをフェニルアラニンおよびイソロイシンの腹腔内注射で処置し、血中のＴｈ１細胞総数が有意に増加したことを見出し（図５ｇ）、このことから、アミノ酸はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＴｈ０のＴｈ１への分化を促進することが確認される。これらの結果は、フェニルアラニンおよびイソロイシンの蓄積が血中のＴｈ１細胞総数を増加させ得ることを示す。
ナイーブＴ細胞によりアミノ酸の取り込みに干渉することによるナイーブＴ細胞の分化への介入
アミノ酸は、特定の輸送体を介して免疫細胞に取り込まれ得る。本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞において、フェニルアラニンおよびイソロイシンの輸送体であるＳＬＣ７Ａ５の発現レベルをさらに検討し、ＳＬＣ７Ａ５がＣＤ４＋Ｔ細胞で発現されたことを見出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を１３Ｃ標識フェニルアラニンとともにインキュベートすることで、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるフェニルアラニンの取り込みを明らかにし、これはＳＬＣ７Ａ５の薬理学的阻害剤であるＪＰＨ ２０３によってブロックすることができ（図１１ｋ）、このことはアミノ酸輸送体を阻害することによって免疫細胞によりアミノ酸の取り込みを阻害し得ることを示唆する。本発明者らは、結果としてのＴｈ１細胞の割合の変化をさらに検討した。６か月齢の５ＸＦＡＤマウスに毎日、５０ｍｇ／ｋｇのＪＰＨ ２０３またはビヒクル対照を腹腔内注射により与えた。投与１か月後に、マウスを安楽死させ、対照群およびＪＰＨ ２０３処置群のマウスの脳における炎症誘発性Ｔｈ１細胞の割合をフローサイトメトリーにより分析した。これは脳における神経炎症を反映する代表的なものである。結果を図１３に示す。ビヒクル対照群に比べて、１か月間のＪＰＨ２０３処置は、マウス脳内の炎症誘発性Ｔｈ１細胞の割合を有意にダウンレギュレーションし、アミノ酸輸送体を阻害することにより、免疫細胞によるアミノ酸の取り込みが阻害され、それによりアミノ酸による免疫細胞の分化の促進が妨げられ、脳内の神経炎症が軽減するこが証明される。
ヒトＡＤ対象における異常なレベルのフェニルアラニンおよびイソロイシンの確認
最後に、本発明者はこれをヒトで確認し、上記の所見がＡＤによるＭＣＩ（本研究において使用する定義については、本研究に使用した方法を参照のこと）患者において再現され得るかどうかを検討した。実際に、ＡＤによるＭＣＩ対象（ｎ＝９）の血中のフェニルアラニンおよびイソロイシン濃度ならびにＴｈ１細胞総数は、年齢が一致する健常対象者（ｎ＝１８）（よりも有意に高かった図５ｈ、ｉ）。血中のフェニルアラニンおよびイソロイシン両方のレベルの増加は、別の小規模のＡＤによるＭＣＩコホートでも確認され（図５ｊ）、従って、これに基づいてヒト診断および治療戦略を計画することが可能である。
まとめると、本発明者らは、腸内微生物代謝産物中の数種の代謝産物が続いての免疫細胞のＴｈ１優勢状態への移行に関与することを見出した。本発明者らは、特に、代謝産物中のアミノ酸、特にフェニルアラニンおよびイソロイシンを検討し、腸内細菌叢の組成の変化、フェニルアラニンおよびイソロイシンの異常な産生とナイーブＴ細胞の過剰なＴｈ１分化の間の因果関係を確認した。Ｔｇマウスの異常な腸内細菌叢を正常なＷＴ腸内細菌叢へ再調整することが上記で確認されたＷＴ糞便細菌およびＯＭ１を投与することにより、異常に高いレベルのフェニルアラニンおよびイソロイシンが低下し、正常レベルに戻った。さらに、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化は阻害され、Ｔｈ１が優勢な病的状態を回復させ、これにより、腸内微生物代謝産物が異常な腸内細菌叢組成と異常な免疫細胞状態の間の架け橋となり、ＡＤ脳腸軸間の関係の一部であることが確認される。本発明者らはまた、腸内微生物の代謝産物により引き起こされる下流の異常な免疫細胞状態、および従って認知の状態に介入するために、代謝産物のレベルを低下させることまたは免疫細胞による代謝産物の取り込みを妨げることなど、代謝産物に干渉する他の手段も検討した。
以上、本発明の原理を好ましい実施形態と併せて説明したが、明らかに、単に例として説明するにすぎず、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。
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Claims (18)

  1. 対象においてアルツハイマー病を治療するための薬剤の製造における哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤の使用。
  2. 対象においてアルツハイマー病を治療するための医薬組成物であって、有効量の、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤を含んでなる、医薬組成物。
  3. 前記アミノ酸が以下から選択される１以上：４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン；好ましくは、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上；より好ましくは、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシン；最も好ましくは、フェニルアラニンである、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記薬剤が以下：アミノ酸分解経路の酵素；アミノ酸合成経路の酵素の阻害剤；アミノ酸リガンド；アミノ酸輸送体の作動剤もしくは阻害剤；腸内微生物の相対存在量を調節するための薬剤、またはそれらの組合せから選択される１以上を含んでなる、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の医薬組成物。
  5. 前記腸内微生物の相対存在量を調整するための薬剤が、炭水化物薬、腸内微生物複合体、またはそれらの組合せから選択され；前記炭水化物薬は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、もしくそれらの誘導体、またはそれらの組合せおよび／もしくはそれらの誘導体；好ましくは、オリゴ糖類および多糖類；より好ましくは、マンヌロン酸オリゴ糖またはマンヌロン酸オリゴ糖を含んでなる組成物から選択され；前記腸内微生物複合体は、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、フソバクテリウム門、シアノバクテリア門、ウェルコミクロビウム門、またはそれらの組合せから選択される１以上を含んでなる、請求項４に記載の使用または医薬組成物。
  6. 前記アミノ酸分解酵素が以下：フェニルアラニン－４－ヒドロキシラーゼ；フェニルアラニン２－モノオキシゲナーゼ；カタラーゼ－ペルオキシダーゼ；フェニルアセトアルデヒドシンターゼ；芳香族Ｌ－アミノ酸／Ｌ－トリプトファンデカルボキシラーゼ；フェニルアラニンデカルボキシラーゼ；フェニルアラニンＮ－アセチルトランスフェラーゼ；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；チロシンアミノトランスフェラーゼ；Ｌ－アミノ酸酸オキシダーゼ；フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ；芳香族アミノ酸酸トランスアミナーゼ；ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ；芳香族アミノ酸酸アミノトランスフェラーゼＩＩ；フェニルアラニンラセマーゼ；フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；フェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼ；分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ；Ｌ－アミノ酸酸オキシダーゼから選択される１以上である、請求項５に記載の使用または医薬組成物。
  7. 前記アミノ酸分解酵素が以下：フェニルアラニン－４－ヒドロキシラーゼ；芳香族Ｌ－アミノ酸／Ｌ－トリプトファンデカルボキシラーゼ；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；チロシンアミノトランスフェラーゼ、ＴＡＴ；Ｌ－アミノ酸酸オキシダーゼから選択される１以上である、請求項５に記載の使用または医薬組成物。
  8. 前記アミノ酸分解酵素がベクターを介して送達され、好ましくは、前記ベクターは、アミノ酸分解酵素を発現することができる微生物（好ましくは、細菌、より好ましくは、大腸菌）である、請求項５に記載の使用または医薬組成物。
  9. 対象由来の末梢血サンプルを検出することにより、前記薬剤は、前記アミノ酸レベルを約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００μＭもしくはそれを超えて調節し；および／または前記アミノ酸レベルを対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の医薬組成物。
  10. 対象由来の糞便サンプルを検出することにより、前記薬剤は、前記アミノ酸レベルを約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００μｍｏｌ／ｇもしくはそれを超えて調節し；および／または前記アミノ酸レベルを対応する正常対象の対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の医薬組成物。
  11. 前記哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルの調整が、哺乳動物末梢血中の１以上のアミノ酸のレベルの増大および／または哺乳動物末梢血中の１以上のアミノ酸のレベルの低下；好ましくは、以下：４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンから選択される１以上のアミノ酸のレベルの低下；より好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上のアミノ酸のレベルの低下；いっそうより好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンおよび／またはイソロイシンのレベルの低下；最も好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンのレベルの低下である、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の医薬組成物。
  12. アルツハイマー病を治療するために使用することができる薬物候補をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）試験薬剤を末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに投与すること、および
    ｂ）アミノ酸レベルを調節する試験薬剤を、アルツハイマー病を治療するために使用することができる薬物候補として選択すること
    を含んでなる、方法。
  13. 末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに陽性対照としてＧＶ－９７１を投与すること、好ましくは、ＧＶ－９７１と実質的に一致してアミノ酸レベルを調節する試験薬剤を選択することをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 検証のために、末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに選択された試験薬剤を投与することをさらに含んでなり、哺乳動物モデル由来の末梢血サンプルを検出することにより、選択された試験薬剤は、そのアミノ酸レベルを５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００μＭもしくはそれを超えて調節し；および／またはそのアミノ酸レベルを対応する正常哺乳動物モデルの対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 検証のために、末梢血中に特定のアミノ酸レベルを有する哺乳動物モデルに選択された試験薬剤を投与することをさらに含んでなり、哺乳動物モデル由来の糞便サンプルを検出することにより、選択された試験薬剤は、そのアミノ酸レベルを１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００μｍｏｌ／ｇもしくはそれを超えて調節し；および／またはそのアミノ酸レベルを対応する正常哺乳動物モデルの対応するアミノ酸レベルに近づける、もしくは到達させる、請求項１２または１３に記載の方法。
  16. 前記アミノ酸が以下から選択される１以上：４－ＯＨプロリン、アセチルオルニチン、アラニン、α－アミノアジピン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、非対称性ジメチルアルギニン、β－アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ハイポタウリン、イソロイシン、キヌレニン、ロイシン、リシン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、オルニチン、フェニルアラニン、ピペコリン酸、プロリン、プトレシン、ピログルタミン酸、セリン、セロトニン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン；好ましくは、フェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上；より好ましくは、フェニルアラニンおよび／またはイソロイシン；最も好ましくは、フェニルアラニンである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記アミノ酸レベルの調節が、１以上のアミノ酸のレベルの増大および／または１以上のアミノ酸のレベルの低下；好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニン、イソロイシン、セロトニン、ヒスチジンおよびアセチルオルニチンから選択される１以上のアミノ酸のレベルの低下；より好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンおよび／またはイソロイシンのレベルの低下；最も好ましくは、哺乳動物末梢血中のフェニルアラニンのレベルの低下である、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. アルツハイマー病を有する患者を治療するための方法であって、
    （ａ）前記患者のアミノ酸レベルを検出し、それを対応する正常集団の対応するアミノ酸レベルと比較して、そのレベルが、対応する正常集団の対応するアミノ酸のレベルと異なるアミノ酸を選択すること；
    （ｂ）選択されたアミノ酸のレベルを調節して、それらを対応する正常集団の対応するアミノ酸レベルに近づける、または到達させるために、哺乳動物末梢血中のアミノ酸レベルを調節するための薬剤を前記患者に投与すること
    を含んでなる、方法。
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