JP2022120248A - ウィルス感染抑制剤、及び、細胞へのウィルス感染抑制方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞に対するウィルスの感染を抑制できる、ウィルス感染抑制剤の提供。
【解決手段】式（１）で表される化合物を含有し、細胞１へのウィルス４付着を抑制することで、細胞へのウィルス感染を抑制する、ウィルス感染抑制剤。

（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立に１以上の整数を表し、Ｘは疎水性部位２であり、Ｙは、鎖長が、４．５ｎｍ以上の親水性高分子からなる高分子鎖である、親水性部位３であり、ｎ＋ｍが２のとき、Ｌは単結合、又は、２価の基であり、ｎ＋ｍが３以上のとき、Ｌはｎ＋ｍ価の基である。
【選択図】図１

Description

本発明は、ウィルス感染抑制剤、及び、細胞へのウィルス感染抑制方法に関する。

細胞培養物、及び、生体器官等から採取された試料中においては、複数の細胞が凝集して細胞塊を形成している場合がある。このような細胞塊を含有する試料をフローサイトメーター等を用いて測定する場合には、細胞塊を分散させる処理、及び／又は、分散処理後の細胞が再凝集しないよう維持する処理等が必要になることがある。
特許文献１には、所定の化合物を含有する細胞凝集抑制剤が記載されている。

特開２０２０－４８４４６号公報

本発明は、細胞に対するウィルスの感染を抑制できる、ウィルス感染抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、細胞へのウィルス感染抑制方法を提供することも課題とする。

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

［１］ 後述する式１で表される化合物を含有し、細胞へのウィルス付着を抑制することで、細胞へのウィルス感染を抑制する、ウィルス感染抑制剤。
［２］ 後述する式１中のＹの親水性高分子がポリアルキレングリコール、及び、ポリグリセリンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載のウィルス感染抑制剤。
［３］ 上記親水性高分子の重量平均分子量が４４００以上である、［１］又は［２］に記載のウィルス感染抑制剤。
［４］ 後述する式１中のＹの高分子鎖の鎖長が４．９ｎｍ以上である、［１］～［３］のいずれかに記載のウィルス感染抑制剤。
［５］ 細胞と細胞間基質からなる組織、及び、細胞からなる群より選択される少なくとも一方と、液体媒体とを含有する対象物に、［１］～［４］のいずれかに記載のウィルス感染抑制剤を添加する、細胞へのウィルス感染抑制方法。

本発明によれば、細胞に対するウィルスの感染を抑制できる、ウィルス感染抑制剤が提供できる。また、本発明によれば、細胞へのウィルス感染抑制方法も提供できる。

細胞に固定された特定化合物を表す模式図である。 ＰＥＧ－ＣＬＳを結合したＨｅｋ２９３Ｔ細胞の走査型電子顕微鏡像である。

以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。
また、本明細書において、「（ポリ）オキシアルキレン」はポリオキシアルキレン及びオキシアルキレンの双方、又は、いずれかを表す。

［ウィルス感染抑制剤］
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤は、後述する式１で表される化合物（以下、「特定化合物」ともいう。）を含有する。

式１中、ｎ及びｍはそれぞれ独立に１以上の整数を表し、Ｘは、ステロール及びステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種から任意の水素原子を除いた１価の基、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルケニル基、並びに、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキニル基からなる群より選択される少なくとも１種の基であり、複数あるＸは同一でも異なってもよく、複数あるＸは互いに連結して環を形成してもよく、Ｙは、水溶液中における末端の蛍光共鳴移動効率から実測した実効的な長さが、４．５ｎｍ以上の親水性高分子からなる高分子鎖であり、ｎ＋ｍが２のとき、Ｌは単結合、又は、２価の基であり、ｎ＋ｍが３以上のとき、Ｌはｎ＋ｍ価の基である。

上記ウィルス感染抑制剤は、細胞と細胞間基質からなる組織、及び、細胞（以下、「組織等」ともいう。）に添加して用いることができる。なかでも、組織等に液体媒体を加えたものに添加することが好ましい。また、予め液体媒体に本ウィルス感染抑制剤を分散させ、ここに組織等を添加する方法も好ましい。

特定化合物中、式１のＸで表される部位（以下、「疎水性部位」ともいう。）は、細胞が有する細胞膜との親和性が高い。言い換えれば、上記の疎水性部位は細胞膜に吸着しやすく、及び／又は、細胞膜と結合しやすい。つまり、特定化合物は、疎水性部位をアンカーとして細胞膜に固定されやすい。

特定化合物は、式１のＹで表される部位（以下、「親水性部位」ともいう。）も有する。
図１は、細胞に固定された特定化合物を表す模式図である。図１の記載のとおり、疎水性部位２と、親水性部位３とを有する特定化合物は、液体媒体と細胞１とを含有する混合物中に添加されると、細胞膜側に疎水性部位が固定され、細胞の外側（液体媒体側）に親水性部位が張り出す形態となる。

この親水性部位が水溶液中における末端の蛍光共鳴移動効率から実測した実効的な長さが、４．５ｎｍ以上の親水性高分子からなると、驚くべきことに、細胞膜へのウィルス４の付着を抑制する効果が得られる。一方、４．５ｎｍ未満であると、十分な効果は得られない。

なお、上記鎖長は、水溶液中において、ポリマーの両端にそれぞれ結合させた、蛍光共鳴移動が起こり得る蛍光特性をもつ蛍光色素のペアの間における蛍光共鳴移動の効率をポリマーの長さを変えて計測し、蛍光共鳴移動効率の理論計算式からポリマー末端間の距離を算出する方法で得られた値を意味する。

ウィルス感染抑制剤中における特定化合物の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、一般にウィルス感染抑制剤の全質量に対して、０．０１～９９．９質量％が好ましい。
なお、ウィルス感染抑制剤は、特定化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。ウィルス感染抑制剤が、２種以上の特定化合物を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。

式１中、ｎ及びｍはそれぞれ独立に１以上の整数であり、特に制限されないが、それぞれ独立に１～５が好ましく、１～３がより好ましく、１又は２が更に好ましい。

なかでも、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、特定化合物としては、式１Ａ：（Ｘ）_ｎ－Ｌ_１ａ－Ｙで表される化合物が好ましい。なお、式１Ａ中、ｎ、Ｘ、及び、Ｙは、式１中のそれぞれの記号と同義である。また、Ｌ_１ａはｎ＋１価の基であり、その形態としては、式１中のＬと同様である。

＜疎水性部位＞
式１中、Ｘで表される疎水性部位は、ステロール、及び、ステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種から任意の水素原子を除いた１価の基（以下、「置換基Ａ」ともいう）、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルケニル基、及び、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキニル基からなる群より選択される少なくとも１種の基であり、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、置換基Ａ、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基、及び、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルケニル基からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、置換基Ａ、及び、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基からなる群より選択される少なくとも１種がより好ましく、置換基Ａが更に好ましい。

（置換基Ａ）
置換基Ａはステロール、及び、ステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種から任意の水素原子を除いた１価の基である。
本明細書において、ステロール誘導体とは、ステロイド核を有し、かつ、ステロイド核の３位の炭素原子にヒドロキシ基が結合されてなり、かつ、ステロイド核の炭素原子に結合した水素原子の少なくとも１個が、任意の１価の基で置換された化合物を意味し、１価の基としては特に制限されないが、後述する置換基Ｗが挙げられ、なかでも、炭化水素基、ヒドロキシ基、及び、ハロゲン原子等が好ましい。

置換基Ａとしては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、以下の式２で表される化合物から任意の水素原子を１つ除いた１価の基であることが好ましい。

式２中、環Ａ～Ｄは飽和又は不飽和のステロイド核を表し、式２中、Ｒは水素原子、又は、１価の基であり、１価の基としては特に制限されないが、後述する置換基Ｗが挙げられ、なかでも、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、ヘテロ原子を有していてもよい１価の炭化水素基がより好ましく、直鎖状、分岐鎖状、又は、環状のアルキル基がより好ましく、アルキル基の炭素数としては特に制限されないが、１～２０個が好ましく、２～１０個がより好ましく、３～８個が更に好ましい。
また、上記ステロイド核の炭素原子に結合した水素原子は１価の基で置換されていてもよく、１価の基としては後述する置換基Ｗが挙げられる。

より具体的には、式２で表される化合物としては、カンペステロール、カンペスタノール、ブラシカステロール、２２－デヒドロカンペステロール、スチグマステロール、スチグマスタノール、２２－ジヒドロスピナステロール、２２－デヒドロスチグマスタノール、７－デヒドロスチグマステロール、シトステロール、チルカロール、オイホール、フコステロール、イソフコステロール、コジステロール、クリオナステロール、ポリフェラステロール、クレロステロール、２２－デヒドロクレロステロール、フンギステロール、コンドリラステロール、アベナステロール、ベルノステロール、及び、ポリナスタノール等のフィトステロール；
コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレスタノール、コプロスタノール、エピコプロステロール、エピコプロスタノール、２２－デヒドロコレステロール、デスモステロール、２４－メチレンコレステロール、ラノステロール、２４，２５－ジヒドロラノステロ－ル、ノルラノステロ－ル、スピナステロール、ジヒドロアグノステロール、アグノステロール、ロフェノール、及び、ラトステロール等の動物性ステロール；
デヒドロエルゴステロール、２２，２３－ジヒドロエルゴステロール、エピステロール、アスコステロール、及び、フェコステロール等の菌類性ステロール等；
が挙げられる。

式２で表される化合物と、式１のＬとの結合位置としては特に制限されないが、ステロイド核の３位の炭素原子に結合したヒドロキシ基が好ましい。ヒドロキシ基とＬとの結合は、例えば、エーテル結合、エステル結合、及び、アミド結合等により容易に形成可能である。
特に制限されないが、Ｙが置換基Ａである場合の特定化合物としては、例えば、以下の式（３）で表される化合物が好ましい。

式３中、環Ａ～Ｄ、及び、Ｒは式２中の各記号と同義である。また、式３中、Ｙ及びｍは、式１中の各記号と同義である。
式３中、Ｌ_ｂは、単結合、又は、－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｌ_ｃは、単結合、又は、ｍ＋１価の基であり、Ｌ_ｃのｍ＋１価の基の形態は、式１中のＬと同様である。

なかでも、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、ステロール、及び、ステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種から任意の水素原子を除いた１価の基としては、以下の式３で表される基が好ましい。

式４中、Ｒは水素原子、又は、１価の基であり、１価の基としては特に制限されないが、後述する置換基Ｗが挙げられ、なかでも、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、ヘテロ原子を有していてもよい１価の炭化水素基がより好ましく、直鎖状、分岐鎖状、又は、環状のアルキル基がより好ましく、アルキル基の炭素数としては特に制限されないが、１～２０個が好ましく、２～１０個がより好ましく、３～８個が更に好ましい。
また、＊は、結合位置を表す。

疎水性部位が、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基である場合、炭素数としては特に制限されないが、１０以上が好ましく、１２以上がより好ましく、１３以上が更に好ましく、１４以上が特に好ましく、１５以上が最も好ましい。なお、炭素数の上限としては特に制限されないが、一般に３０個以下が好ましく、２４個以下がより好ましい。
直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基としては、直鎖状の炭素数８以上のアルキル基が好ましい。

疎水性部位が、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルケニル基である場合、炭素数としては特に制限されないが、１０以上が好ましく、１２以上がより好ましく、１３以上が更に好ましく、１４以上が特に好ましく、１５以上が最も好ましい。なお、炭素数の上限としては特に制限されないが、一般に３０個以下が好ましく、２４個以下がより好ましい。
直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルケニル基としては、直鎖状の炭素数８以上のアルケニル基が好ましい。

疎水性部位が、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキニル基である場合、炭素数としては特に制限されないが、１０以上が好ましく、１２以上がより好ましく、１３以上が更に好ましく、１４以上が特に好ましく、１５以上が最も好ましい。なお、炭素数の上限としては特に制限されないが、一般に３０個以下が好ましく、２４個以下がより好ましい。
直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキニル基としては、直鎖状の炭素数８以上のアルキニル基が好ましい。

＜Ｌ＞
式１中、Ｌは、ｎ＋ｍ（ｎとｍの和）が２のとき、単結合、又は、２価の基である。ｎ＋ｍが３以上のとき、Ｌはｎ＋ｍ価の基である。

Ｌの２価の基としては特に制限されないが、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ_２－（Ｒ_２は水素原子又は１価の有機基を表す）、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｏ^－Ｍ^＋）－、アルキレン基（炭素数１～１０個が好ましい）、シクロアルキレン基（炭素数３～１０個が好ましい）、アルケニレン基（炭素数２～１０個が好ましい）、及び、これらの組み合わせ等が挙げられる。なお、Ｍ^＋は対イオンであり、Ｎａ^＋及びＮＨ_４ ^＋等が挙げられる。

Ｌの３価以上の基としては、特に制限されないが、例えば、以下の式（１ａ）～（１ｄ）で表される基が挙げられる。

式１ａ中、Ｌ_３は３価の基を表す。Ｔ_３は単結合又は２価の基を表し、３個のＴ_３は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
Ｌ_３としては、３価の炭化水素基（炭素数１～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、３価の複素環基（５員環～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ_３の具体例としては、グリセリン残基、トリメチロールプロパン残基、フロログルシノール残基、及びシクロヘキサントリオール残基等が挙げられる。

式１ｂ中、Ｌ_４は４価の基を表す。Ｔ_４は単結合又は２価の基を表し、４個のＴ_４は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ_４の好適形態としては、４価の炭化水素基（炭素数１～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、４価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ_４の具体例としては、ペンタエリスリトール残基、及びジトリメチロールプロパン残基等が挙げられる。

式１ｃ中、Ｌ_５は５価の基を表す。Ｔ_５は単結合又は２価の基を表し、５個のＴ_５は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ_５の好適形態としては、５価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、５価の複素環基（５～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ_５の具体例としては、アラビニトール残基、フロログルシドール残基、及びシクロヘキサンペンタオール残基等が挙げられる。

式１ｄ中、Ｌ_６は６価の基を表す。Ｔ_６は単結合又は２価の基を表し、６個のＴ_６は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ_６の好適形態としては、６価の炭化水素基（炭素数２～１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、６価の複素環基（６～７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、－Ｏ－）が含まれていてもよい。Ｌ_６の具体例としては、マンニトール残基、ソルビトール残基、ジペンタエリスリトール残基、ヘキサヒドロキシベンゼン、及び、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン残基等が挙げられる。

式１ａ～式１ｄ中、Ｔ_３～Ｔ_６で表される２価の基の具体例及び好適形態は、すでに説明したＬの２価の基と同様であってよい。
また、Ｌが７価以上の基である場合には、式１ａ～式１ｄで表した基を組み合わせた基を用いることができる。

＜親水性部位＞
式１中、Ｙは親水性部位であり、水溶液中における末端の蛍光共鳴移動効率から実測した実効的な長さが、４．５ｎｍ以上の親水性高分子からなる高分子鎖である。なお、本明細書において、「親水性高分子からなる高分子鎖」とは、親水性高分子がＬと結合して得られた特定化合物における部分構造を意味し、親水性高分子におけるＬとの結合位置としては特に制限されないが、例えば、親水性高分子の末端が挙げられる。

本明細書において親水性高分子とは、親水性基を有する高分子を意味する。
親水性基の種類は特に制限されず、例えば、ポリオキシアルキレン基（例えば、ポリオキシエチレン基、ポリオキシプロピレン基、オキシエチレン基とオキシプロピレン基がブロック又はランダム結合したポリオキシアルキレン基)、アミノ基、カルボキシ基、カルボキシ基のアルカリ金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アミド基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、スルホン酸基、及び、スルホン酸基のアルカリ金属塩等が挙げられる。

親水性高分子の主鎖の構造は特に制限されず、例えば、ポリウレタン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテル、及び、ポリウレア等が挙げられる。
なお、ポリ（メタ）アクリル酸エステルとは、ポリアクリル酸エステル及びポリメタアクリル酸エステルの両方を含む概念である。

また、親水性高分子は、タンパク質（糖タンパク質）であってもよい。タンパク質としては、ウイルスと結合する、あるいはウイルス外殻の分子を活性化させる、などしてウイルスの細胞への感染を誘導する機能がない分子であれば、特に制限されない。すなわち、親水性高分子として用いることができるタンパク質は、ウイルスの細胞への結合・感染を誘導するタンパク質とは異なるタンパク質である。または細胞内でその遺伝子から発現した場合においてウイルスの感染を誘導するタンパク質分子であっても、疎水基を付加した両親媒性分子として細胞培養液中に添加して細胞膜に結合した場合にウイルス感染を誘導しない分子であれば、制限されない。

一般に、細胞へのウイルスの感染には、タンパク質等の細胞膜発現分子が関与していると推測される。この関与の形態には、例えば、ウイルス外殻に発現するタンパク質と親和性を持ち結合する特定の細胞表面のタンパク質等の分子、すなわちレセプター、及び、ウイルス外殻に発現するタンパク質の一部を切断して細胞表面のタンパク質に結合できる形へ変形する機能を持つタンパク質、すなわちプロテアーゼ；等があると推測される。

上記のいずれの場合であっても、本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤を導入すると、所定の鎖長を有する親水性高分子が立体的に細胞膜表面上から突き出す構造が形成されることにより、近接する細胞とウイルスの表面間の距離が拡大し、これらの細胞膜上のタンパク質等分子がウイルス外殻上の分子と相互作用して機能する頻度が減少する、すなわち細胞膜表面上から突き出す親水性高分子による立体斥力が生じていると推測される。

親水性高分子としては、例えば、合成高分子、タンパク質（糖鎖修飾を含む）、ペプチド、オリゴＤＮＡ、及び、糖鎖（タンパク質を含まない）等を使用してもよい。

親水性高分子としては、より具体的には、ポリビニルピロリドン、ポリアルキレングリコール、ポリグリセリン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロール、ヒドロキシプロピルセルロース、及び、ヒドロキシエチルセルロース等）、デンプン誘導体（プルラン）、ポリビニルアルコール、エチル酢酸ビニル、オイドラギット、ゼラチン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ソーダ、ポリイソブチレン無水マレイン酸共重合体、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、アラビアゴム、トラガント、カラヤゴム、及び、ポリビニルメタクリレート等が挙げられる。

親水性高分子としては、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、ポリアルキレングリコール、及び、ポリグリセリンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
ポリアルキレングリコール、及び、ポリグリセリンは、ほとんどの生体分子との相互作用が弱く、ウイルスとの相互作用も弱いと推測される。そのため、ウイルスの種類によらず、より優れた感染抑制作用が得られやすいものと推測される。

式１におけるＹで表される親水性部位は、上記親水性高分子がＬと結合して形成される特定化合物における部分構造（高分子鎖）であり、上記親水性高分子は、水溶液中における末端の蛍光共鳴移動効率から実測した実効的な長さ（鎖長）が、５．０ｎｍ以上である。
鎖長は、４．５ｎｍ以上であれば特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、４．９ｎｍ以上が好ましく、７．０ｎｍ以上がより好ましく、７．３ｎｍ以上が更に好ましく、１０ｎｍ以上が特に好ましく、１０．９ｎｍ以上が最も好ましい。

一方、鎖長の上限は特に制限されないが、２０．０ｎｍ以下であると、ウィルス感染抑制剤の親水性が適度な範囲で調整されやすく、ウィルス感染抑制剤が感染抑制対象の細胞の細胞膜により定着しやすい点で好ましい。

なお、上記鎖長は、測定対象とする親水性高分子の両末端に、蛍光共鳴移動が起こり得る蛍光特性をもつ蛍光色素をそれぞれ結合させて得た試料を水溶液中に分散させ、蛍光共鳴移動の効率を測定し、蛍光共鳴移動効率の理論計算式からポリマー末端間の距離を算出する方法である。上記方法によれば、高分子鎖の実効的な長さを測定できる。

例えば、親水性高分子がポリアルキレングリコールである場合、片末端をビオチン化、他方の末端をマレイミド化し、ビオチン側末端はビオチン固定プラスチックプレート上に結合させた蛍光（ＤｙＬｉｇｈｔ６４９）ラベルストレプトアビジンに結合させ、マレイミド側末端は他の蛍光ラベルしたタンパク質（例えば、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９ラベルしたＩＥｋＭＣＣ）のシステイン基と共有結合にて結合させてサンプルを準備する。このサンプルを水に分散させ、蛍光強度を測定すると、ＤｙＬｉｇｈｔ５４９の蛍光スペクトルとＤｙＬｉｇｈｔ６４９の吸収スペクトルがオーバーラップするため、両色素間の距離に応じた蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ）が発生し、ポリマー末端間の距離を算出できる。

なお、上記測定方法は、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４ Ｎｏｖ １０；９（１１）：ｅ１１２２９２に記載されており、上記の内容は本明細書に組み込まれる。
なお、親水性高分子の鎖長を調整する方法としては特に制限されないが、親水性高分子の一次構造、及び、分子量等により調整することができ、その方法は当業者にとって公知である。

親水性高分子の分子量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、４４００以上が好ましく、５０００以上がより好ましく、９４００以上が更に好ましく、１００００以上が特に好ましく、１８０００以上が最も好ましい。
分子量の上限値としては特に制限されないが、一般に、２０００００以下が好ましく、１０００００以下がより好ましい。
なお、本明細書において分子量とは、ゲル浸透クロマトグラフィー法によって測定した重量平均分子量を意味する。

特定化合物としては、特に制限されないが、例えば、以下の式で表される化合物が挙げられる。

各式中、Ｒは水素原子、又は、１価の基を表し、Ｒ_１はＹの高分子鎖を表し、ｐは２以上の整数を表し、ｑは、０～２の整数を表し、Ｍは対イオン（例えば、Ｎａ^＋及びＮＨ_４ ^＋等が挙げられる。）
特定化合物は公知の方法で合成することができ、また、ｓｉｇｍａ社、ｎａｎｏｃｓ社Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ社、及び、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製の市販品を用いることもできる。

〔その他の成分〕
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤は、本発明の効果を奏する範囲内において、特定化合物以外の他の成分を含有していてもよい。他の成分としては特に制限されないが、緩衝化剤、及び、キレート剤等が挙げられる。

＜緩衝化剤＞
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤は、緩衝化剤を含有していてもよい。
ウィルス感染抑制剤中における緩衝化剤の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、一般にウィルス感染抑制剤の全質量に対して、０．００１～９９質量％が好ましい。なお、ウィルス感染抑制剤は、緩衝化剤の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。ウィルス感染抑制剤が、２種以上の緩衝化剤を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。

緩衝化剤としては、特に制限されないが、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び、イプシロン－アミノカプロン酸等が挙げられる。

＜キレート剤＞
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤は、キレート剤を含有していてもよい。ウィルス感染抑制剤におけるキレート剤の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するウィルス感染抑制剤が得られる点で、一般にウィルス感染抑制剤の全質量に対して、０．００１～９９質量％が好ましい。なお、ウィルス感染抑制剤は、キレート剤の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。ウィルス感染抑制剤が、２種以上のキレート剤を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。

キレート剤としては、特に制限されないが、例えば、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸、アスコルビン酸、エチドロン酸、及び、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）等のヒドロキシ酸系；
エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、グルタミン酸二酢酸四ナトリウム、グリコールエーテルジアミン四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ′－ジコハク酸、及び、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸等のアミノカルボン酸系；
カルボキシメチルタルトロン酸（ＣＭＴ）、及び、カルボキシメチルオキシコハク酸（ＣＭＯＳ）等のエーテルカルボン酸系；
等が挙げられる。

〔ウィルス感染抑制剤の用途〕
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤は、細胞にウィルスが付着するのを抑制する目的で、液体媒体に本ウィルス感染抑制剤を分散させたものを組織等に添加して用いることができる。また、組織等に液体媒体を加えたものに添加することもできる。また、予め液体媒体に本ウィルス感染抑制剤を分散させ、ここに組織等を添加してもよい。本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤を用いることで、各細胞表面へのウィルスの付着を抑制することができる。

また、本発明の実施形態に係るウイルス感染抑制剤は、適切な濃度・鎖長範囲で使用した場合には、別の用途として細胞分散剤として機能することができる（特開２０２０－０４８４４６号公報）。すなわち接着・相互作用する細胞間の距離を拡張することができる。
従って、本発明の実施形態に係るウイルス感染抑制剤の添加により、外部溶液中におけるウイルスの細胞への付着を抑制するとともに、すでにウイルス感染を起こした細胞から出芽するウイルスが隣接・接着する細胞へ細胞間感染を引き起こす事を抑制することができる。

特に、親水性高分子がポリアルキレングリコールである場合、非毒性で鎖長を制御しやすい点で、より優れている。本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制剤においては、上記親水性高分子からなる高分子鎖は細胞内へ導入されないものと推測される。一方で、結合・剥離しやすい疎水性部位により、細胞膜上へ上記高分子鎖を固定し、必要なときには溶液中（細胞を含む、細胞懸濁液中）に親水性高分子を保持し、不要になれば溶液を洗浄することで、速やかに除去できる。

（置換基Ｗ）
置換基Ｗとしては、ハロゲン原子、アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、及び、ペンタデシル等）、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、及び、シクロヘキシル等）、アルケニル基（例えば、ビニル、及び、アリル等）、アルキニル基（例えば、エチニル、及び、プロパルギル等）、芳香族炭化水素環基（芳香族炭素環、アリール等ともいい、例えば、フェニル、ｐ－クロロフェニル、メシチル、トリル、キシリル、ナフチル、アントリル、アズレニル、アセナフテニル、フルオレニル、フェナントリル、インデニル、ピレニル、及び、ビフェニリル等）、芳香族へテロ環基（５又は６員環の芳香族へテロ環基が好ましく、また環構成ヘテロ原子は、硫黄原子、窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、ホウ素、及び、セレン原子が好ましく、例えば、ピリジル、ピリミジニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、トリアゾリル（例えば、１，２，４－トリアゾール－１－イル、及び、１，２，３－トリアゾール－１－イル等）、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラザニル、チエニル、キノリル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾチエニル、インドリル、カルバゾリル、カルボリニル、ジアザカルバゾリル（上記カルボリニル基のカルボリン環を構成する炭素原子の一つが窒素原子で置き換わったものを示す）、キノキサリニル、ピリダジニル、トリアジニル、キナゾリニル、フタラジニル、ボロール、アザボリン等）、ヘテロ環基（芳香族でないヘテロ環基で、飽和環であっても不飽和環であってもよく、５又は６員環が好ましく、また環構成ヘテロ原子は、硫黄原子、窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、又は、セレン原子が好ましく、例えば、ピロリジル、イミダゾリジル、モルホリル、オキサゾリジル等）、アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、オクチルオキシ、ドデシルオキシ等）、シクロアルコキシ基（例えば、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ等）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ナフチルオキシ等）、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオ、オクチルチオ、ドデシルチオ等）、シクロアルキルチオ基（例えば、シクロペンチルチオ、シクロヘキシルチオ等）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオ、ナフチルチオ等）、アルコキシカルボニル基（例えば、メチルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニル、ブチルオキシカルボニル、オクチルオキシカルボニル、ドデシルオキシカルボニル等）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル等）、スルファモイル基（例えば、アミノスルホニル、メチルアミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、ブチルアミノスルホニル、ヘキシルアミノスルホニル、シクロヘキシルアミノスルホニル、オクチルアミノスルホニル、ドデシルアミノスルホニル、フェニルアミノスルホニル、ナフチルアミノスルホニル、２－ピリジルアミノスルホニル等）、

アシル基（例えば、アセチル、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、ペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、オクチルカルボニル、２－エチルヘキシルカルボニル、ドデシルカルボニル、アクリロイル、メタクリロイル、フェニルカルボニル、ナフチルカルボニル、ピリジルカルボニル等）、アシルオキシ基（例えば、アセチルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ブチルカルボニルオキシ、オクチルカルボニルオキシ、ドデシルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ等）、アミド基（例えば、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノ、ジメチルカルボニルアミノ、プロピルカルボニルアミノ、ペンチルカルボニルアミノ、シクロヘキシルカルボニルアミノ、２－エチルヘキシルカルボニルアミノ、オクチルカルボニルアミノ、ドデシルカルボニルアミノ、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ等）、カルバモイル基（例えば、アミノカルボニル、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、プロピルアミノカルボニル、ペンチルアミノカルボニル、シクロヘキシルアミノカルボニル、オクチルアミノカルボニル、２－エチルヘキシルアミノカルボニル、ドデシルアミノカルボニル、フェニルアミノカルボニル、ナフチルアミノカルボニル、２－ピリジルアミノカルボニル等）、ウレイド基（例えば、メチルウレイド、エチルウレイド、ペンチルウレイド、シクロヘキシルウレイド、オクチルウレイド、ドデシルウレイド、フェニルウレイド、ナフチルウレイド、２－ピリジルアミノウレイド等）、スルフィニル基（例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ブチルスルフィニル、シクロヘキシルスルフィニル、２－エチルヘキシルスルフィニル、ドデシルスルフィニル、フェニルスルフィニル、ナフチルスルフィニル、２－ピリジルスルフィニル等）、アルキルスルホニル基（例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ブチルスルホニル、シクロヘキシルスルホニル、２－エチルヘキシルスルホニル、ドデシルスルホニル等）、アリールスルホニル基又はヘテロアリールスルホニル基（例えば、フェニルスルホニル、ナフチルスルホニル、２－ピリジルスルホニル等）、アミノ基（アミノ基、アルキルアミノ基、アルケニルアミノ基、アリールアミノ基、ヘテロ環アミノ基を含み、例えば、アミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ブチルアミノ、シクロペンチルアミノ、２－エチルヘキシルアミノ、ドデシルアミノ、アニリノ、ナフチルアミノ、２－ピリジルアミノ等）、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、シリル基（例えば、トリメチルシリル、トリイソプロピルシリル、トリフェニルシリル、フェニルジエチルシリル等）等が挙げられる。
これらの各基は、更に置換基を有していてもよく、この置換基としては上記の置換基が挙げられる。例えば、アルキル基にアリール基が置換したアラルキル基、アルキル基にヒドロキシ基が置換したヒドロキシアルキル基等が挙げられる。なお、置換基Ｗが更に複数の置換基を有する場合、複数の置換基同士は互いに結合して環を形成してもよい。

［ウィルス感染抑制方法］
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制方法は、細胞と細胞間基質からなる組織、及び、細胞からなる群より選択される少なくとも一方と、液体媒体と、を含有する対象物に、上記のウィルス感染抑制剤を添加する、細胞へのウィルス感染抑制方法である。
本発明の実施形態に係るウィルス感染抑制方法が適用できる組織等としては特に制限されず、生体器官から採取された組織（気管支、鼻腔、及び、咽頭等）であってもよいし、培養された細胞又は組織であってもよいし、生体器官そのものであってもよい。

液体媒体としては特に制限されないが、例えば、水、水溶性有機溶媒、及び、水溶液と水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。なかでも、水、又は、水と水溶性有機溶媒の混合溶媒が好ましい。

ウィルス感染抑制剤を対象物に添加する方法としては特に制限されないが、例えば、対象物に所定量のウィルス感染抑制剤を加える（必要に応じて撹拌してもよい）方法、及び、予めウィルス感染抑制剤と液体媒体とを混合し、得られた混合液を対象物に加える方法等が挙げられる。
なお、ウィルス感染抑制剤の添加量としては特に制限されないが、一般に、対象物中において、０．１ｎＭ～１０ｍＭが好ましい。

以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。

（特定化合物の準備）
特定化合物は、いずれもＢｉｏｃｈｅｍｐｅｇから購入した。特定化合物は以下の式で表される化合物であり、使用した特定化合物とその鎖長とが表１に示されている。なお、以下では、各特定化合物をあわせてＰＥＧ－ＣＬＳといい、高分子鎖（ＰＥＧ鎖）の重量平均分子量により、「ＰＥＧ－２０００ＣＬＳ」等と呼ぶものとする。

なお、表１における「鎖長」は、水溶液中において、ポリマーの両端にそれぞれ結合させた、蛍光共鳴移動が起こり得る蛍光特性をもつ蛍光色素のペアの間における蛍光共鳴移動の効率をポリマーの長さを変えて計測し、蛍光共鳴移動効率の理論計算式からポリマー末端間の距離を算出する方法で得られた値を意味する。ＰＥＧ－ＣＬＳにおいては、（鎖長）＝０．０３５×（ＰＥＧ鎖の重量平均分子量）^{０．５７９７}で計算される「鎖長」を小数第２位を四捨五入して小数第１位までの数として求められるものである。

（ウィルスの準備）
・レンチウイルス
理研バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）からｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖ（これらのＶＳＶ－ＧをＨＣＶ Ｅ１Ｅ２に組み替えたもの）、及び、ＡｄｄｇｅｎｅからｐＬＶ－ｅＧＦＰ（又はｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＬＵＣ）を入手した。これらのプラスミドベクターをポリエチレンイミンを用いてＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）培地中で培養中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、その４８時間後に培地溶液からレンチウイルスを回収した。
レンチウイルス（又はその組み替え体）の回収溶液は、０．２２μｍのフィルターにより夾雑物をろ過した後に、必要に応じてＰＥＧ８０００による共沈法又は超遠心法により濃縮し、ディープフリーザー内で－８０℃で保管した。

・アデノ随伴ウィルス
ＡｄｄｇｅｎｅからＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ２／２、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６を入手した。これらのプラスミドベクターをポリエチレンイミンを用いてＤＭＥＭ培地中で培養中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、４８時間後に培地溶液と細胞破砕液からアデノ随伴ウィルスを回収した。

・アデノウィルス
ＲＩＫＥＮ ＢＲＣからＡｘ１－ＣＡ－ｇｆｐを入手した。これをＤＭＥＭ培地中で培養中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させて増幅し、４８時間後に培地溶液と細胞破砕液から回収した。
アデノ随伴ウイルス、及び、アデノウイルスは各粗抽出液をそのまま、又は、必要に応じて塩化セシウムを用いた密度勾配遠心法により精製し濃縮した後に－８０℃で保管した。

準備したこれらのウィルスのうち、レンチウイルス（ＶＳＶ（水疱性口炎ウイルス）のＧタンパクを外殻に持つ）はＨｅｋ２９３Ｔ細胞、及び、Ｊｕｒｋａｔ細胞に感染させた。
レンチウイルスの外殻にＶＳＶ－ＧではなくＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）のＥ１－Ｅ２分子を発現するものは、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞にヒトＯｃｃｌｕｄｉｎ遺伝子をトランスフェクションにより導入した細胞に感染させた。
アデノウイルスはＨｅｋ２９３Ｔ細胞に感染させた。アデノ随伴ウイルスはＨｅｋ２９３Ｔ細胞に感染させた。

（感染実験方法）
・浮遊細胞、又は、剥離した接着細胞
Ｊｕｒｋａｔ細胞等の浮遊細胞、及び、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞をＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）の存在下で浮遊させた細胞；Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞をトリプシンによる短時間の酵素処理で浮遊させた細胞；マイクロプレートに１日間培養した後に必要な遺伝子をプラスミドベクターのトランスフェクションにより導入して更に１日間培養した～８０％コンフルエントとなったＨｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞をＥＤＴＡを含むＰＢＳの存在下で剥離させた細胞；をそれぞれ準備し、１．５×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で懸濁した。

５％ＣＯ_２存在下において、細胞懸濁液に終濃度０．０１～２５μＭのＰＥＧ－ＣＬＳを添加し、穏やかに回転しながら３７℃で３０分間保持し、細胞膜へＰＥＧ－ＣＬＳを結合させた。３０分間のインキュベーションを行い、飽和に近い分子結合密度を得た。

インキュベーション後、細胞液へ任意の濃度の各ウイルスを添加した。コントロールサンプル（ＰＥＧ－ＣＬＳを含まないサンプル）における感染細胞の割合が～２０％となるように、予め計測したウイルスストックの力価を基に適宜希釈し、十分なダイナミックレンジを確保した。

５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２時間穏やかに回転しながらウイルスを感染させた。２時間経過後、混合液をそのまま、又は混合液に対してＰＢＳによる細胞懸濁と遠心分離の複数回繰り返しによる洗浄でウイルスと遊離ＰＥＧ－ＣＬＳを培養液中から除去した後に、細胞培養用プレートに移して２日間培養を行った後に、細胞へのウイルス感染を遺伝子発現（ＧＦＰの蛍光または発現するルシフェラーゼ酵素の活性）によって定量した。

・接着細胞
２４ウェルマイクロプレートに１日間培養したＨｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞；２４ウェルマイクロプレートに１日間培養した後に必要な遺伝子をプラスミドベクターのトランスフェクションにより導入して更に１日間培養した～８０％コンフルエントとなったＨｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞；これらの細胞懸濁液の培地の液量を２００μＬまで減少させた後に終濃度０．０１～２５μＭのＰＥＧ－ＣＬＳを添加し５％ＣＯ_２存在下で３７℃において３０分間インキュベーションした後に、感染細胞の割合が～２０％となるように、予め計測してあるストック液の力価を基に適宜希釈したウイルスを添加し、５％ＣＯ_２存在下において、３７℃で３時間感染させた。
その後ウイルスとＰＥＧ－ＣＬＳを含む培地を除き５００μＬの新鮮培地を添加して２日間細胞を培養した後、細胞へのウイルス感染を遺伝子発現（ＧＦＰの蛍光または発現するルシフェラーゼ酵素の活性）によって定量した。

（計測方法）
・フローサイトメトリー
ＧＦＰ遺伝子を含むウイルスを感染させた細胞は培養期間後に培養プレートから回収してＰＢＳ溶液に懸濁した後、フローサイトメトリーにてＧＦＰタンパクの発現量を計測することで感染を計測した。ＧＦＰ蛍光の平均強度を感染量として計測するか、又は、無感染細胞の蛍光値をしきい値としてそれ以上の蛍光値を示す細胞をＧＦＰ発現細胞すなわち感染細胞としてその割合を感染量として計測した。

（ルシフェラーゼアッセイ）
ルシフェラーゼ遺伝子含むウイルスを感染させた接着細胞は、接着状態のままで培養プレートウェル内をＰＢＳで洗浄して培地溶液を除いた後、界面活性剤等を含むＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社 Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）をそれぞれ添加して、室温、１５分以上振盪状態でインキュベーションした。

ルシフェラーゼ遺伝子含むウイルスを感染させた浮遊細胞は培養プレートから回収して遠心分離で培地を除き、更にＰＢＳで洗浄した後に、界面活性剤等を含むＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社 Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）をそれぞれ添加し、溶液内で懸濁した後、室温、１５分以上振盪状態でインキュベーションを行った。

その後、各ライシス（Ｌｙｓｉｓ）液を回収し細胞を遠心分離で除去した後、その溶液より最大２０μＬをルシフェリン及びＡＴＰを含む１００μＬのＬＡＲ ＩＩ溶液（プロメガ社 Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）に混合し、ルミノメーターで酵素反応を計測することで、細胞溶液内のルシフェラーゼ発現量を定量した。

・顕微鏡観察
ＰＥＧ－ＣＬＳが導入された細胞の変形を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察した。１．５×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨｅｋ２９３Ｔ細胞について、ＰＥＧ－ＣＬＳを含まない試料、２５μＭのＰＥＧ－２０００ＣＬＳ、又は、ＰＥＧ－２００００ＣＬＳを含む試料を３７℃、１時間インキュベーションした後に、以下の方法で固定しＳＥＭで観察した。

固定方法：細胞は遠心分離によりＰＥＧ－ＣＬＳ溶液を除去、その後２．５％グルタールアルデヒドを含むＰＢＳで細胞を懸濁して４℃で１日放置して前固定を行った。その後にグルタールアルデヒドを除去してＰＢＳに再懸濁した。懸濁液をホルダー上に滴下・吸引しメンブレン上に細胞を吸着させた。吸着細胞に対して、後固定液（１％四塩化オスミウム－０．１Ｍリン酸緩衝液 １：１）で、１時間固定した。その後５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１００％、１００％エタノールで、各１０分脱水を行った。脱水後の試料を酢酸３－メチルブチルに約１０分浸漬した後に臨界点乾燥装置で乾燥させた。乾燥サンプルに対してオスミウムプラズマコーターで、オスミウム蒸着（５ｎｍ）した。

・蛍光顕微鏡観察
ＰＥＧ－ＣＬＳが導入された細胞の変形を蛍光顕微鏡を用いて観察した。
１μｇ／ｍＬのカルセインーＡＭを含む存在下ＲＰＭＩ培地中にて、１．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＪｕｒｋａｔ細胞に、ＰＥＧ－ＣＬＳを含まない試料、２５μＭのＰＥＧ－２０００ＣＬＳを含む試料、及び、ＰＥＧ－２００００ＣＬＳを含む試料を、３７℃、１時間インキュベーションした後に蛍光顕微鏡にて細胞を撮影し、その後１５分、１５分、２時間と計３回ＲＰＭＩ培地で洗浄して液中、又は、細胞結合するＰＥＧ－ＣＬＳ濃度を低下させた後に再度細胞を蛍光顕微鏡にて撮影した。
蛍光顕微鏡画像はＩｍａｇｅＪ（ソフトウェア、ＮＩＨ）で解析し、各細胞のＲｏｕｎｄｎｅｓｓを４×ａｒｅａ／（π Ｘ ｍａｊｏｒ－ａｘｉｓ^２）として計算した。

その結果、ＰＥＧ－２０００ＣＬＳ、ＰＥＧ－２００００ＣＬＳが導入された細胞はいずれもＲｏｕｎｄｎｅｓｓが増加することがわかった。また、細胞が膨張・球形化していることがわかった。この結果はＳＥＭの観察と一致した。また、洗浄によりＰＥＧ－ＣＬＳが除去され細胞状態が復元することもわかった。

（結果）
図２は、ＰＥＧ－ＣＬＳを結合したＨｅｋ２９３Ｔ細胞のＳＥＭ像である。蛍光顕微鏡写真解析から見出された細胞の膨張の様子を高倍率で観察した。図２の結果から、ＰＥＧ－ＣＬＳの導入の如何に関わらず、細胞表面には、ウイルスの接着を妨害するような構造体を観察することはできなかった。すなわち、ウイルスの感染抑制が、電子顕微鏡ＳＥＭの解像度よりも小さい構造体（分子）によりなされていることを示唆された。また鎖長の異なるＰＥＧ－２０００ＣＬＳ、ＰＥＧ－２００００ＣＬＳについても、構造的な差は、ＳＥＭ像からは見出されなかった。なお、図２中、「２ＫＰＥＧ－ＣＬＳ］は「ＰＥＧ－２０００ＣＬＳ」を、２０ＫＰＥＧ－ＣＬＳは「ＰＥＧ－２００００ＣＬＳ」を表す。

表２は、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に対し２５μｍｏｌ／ＬとなるようＰＥＧ－ＣＬＳを添加し、２時間レンチウイルスを感染させた後、ウイルスとＰＥＧ－ＣＬＳを除去して４８時間の細胞培養後にＦＡＣＳで感染細胞（ＧＦＰ発現細胞）の割合を計測し、コントロールとなるＰＥＧ－ＣＬＳ無添加の細胞における発現細胞を対照に正規化した結果である。
数値が１．００以下のものは、ウィルスの感染が抑制されたことを表している。

表３は、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に対し２５μｍｏｌ／ＬとなるようＰＥＧ－ＣＬＳを添加し、２時間アデノウイルスを感染させた後、ウイルスとＰＥＧ－ＣＬＳを除去して４８時間の細胞培養後にＦＡＣＳで感染細胞（ＧＦＰ発現細胞）の割合を計測し、コントロールとなるＰＥＧ－ＣＬＳ無添加の細胞における発現細胞を対照に正規化した結果である。
数値が１．００以下のものは、ウィルスの感染が抑制されたことを表している。

表２、及び、表３の結果から、ＰＥＧ－ＣＬＳのＰＥＧ鎖の鎖長が４．５ｎｍ以上であると、優れたウィルス感染抑制作用を有することがわかった。一方で、ＰＥＧ－ＣＬＳの鎖長が４．５ｎｍ未満であると、ウィルス感染抑制作用は得られなかった。

表４は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対し各濃度のＰＥＧ－２００００ＣＬＳ存在下で４８時間レンチウイルスを感染させＦＡＣＳにて感染細胞（ＧＦＰ発現細胞）の割合を計測し、コントロールとなるＰＥＧ－ＣＬＳ無添加の細胞における発現細胞を対照に正規化した結果である。
表４の結果から、ＰＥＧ－ＣＬＳはレンチウイルスに対する感染抑制作用を有することがわかった。

表５は、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に対し各濃度のＰＥＧ－２００００ＣＬＳ存在下で２時間アデノ随伴ウイルスを感染させた後、ウイルスとＰＥＧ－ＣＬＳを除去して４８時間の細胞培養後にＦＡＣＳで感染細胞（ＧＦＰ発現細胞）の割合を計測し、コントロールとなるＰＥＧ－ＣＬＳ無添加の細胞における発現細胞を対照に正規化した結果である。
表５の結果から、ＰＥＧ－ＣＬＳはアデノ随伴ウィルスに対する感染抑制作用を有することがわかった。

（レンチウイルス細胞取り込み量計測実験方法）
Ｊｕｒｋａｔ細胞等の浮遊細胞、及び、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞をＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）の存在下で浮遊させた細胞；Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞をトリプシンによる短時間の酵素処理で浮遊させた細胞；マイクロプレートに１日間培養した後に必要な遺伝子をプラスミドベクターのトランスフェクションにより導入して更に１日間培養した～８０％コンフルエントとなったＨｅｋ２９３Ｔ細胞等の接着細胞をＥＤＴＡを含むＰＢＳの存在下で剥離させた細胞；をそれぞれ準備し、１．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で懸濁した。

５％ＣＯ_２存在下において、細胞懸濁液に終濃度０．０１～２５μＭのＰＥＧ－ＣＬＳを添加し、穏やかに回転しながら３７℃で３０分間保持し、細胞膜へＰＥＧ－ＣＬＳを結合させた。３０分間のインキュベーションを行い、飽和に近い分子結合密度を得た。

インキュベーション後、細胞液へＤＩＤ（１，１′－Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３′，３′－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）を予め混合することで蛍光標識したレンチウイルスを添加した。

５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２時間穏やかに回転しながらウイルスを感染させた。２時間経過後、混合液をそのまま、又は混合液に対してＰＢＳによる細胞懸濁と遠心分離の複数回繰り返しによる洗浄でウイルスと遊離ＰＥＧ－ＣＬＳを培養液中から除去した後に、感染細胞に結合し取り込まれたウイルスの量をＤＩＤの蛍光強度をフローサイトメトリーで計測することで評価した。

表６は、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に対し０．１～２５μｍｏｌ／ＬとなるようＰＥＧ－２００００ＣＬＳを添加し、２時間ＤＩＤにより蛍光標識したレンチウイルスを感染させた後、ウイルスとＰＥＧ－ＣＬＳを除去した直後にＦＡＣＳでウイルスを取り込んだ細胞（ＤＩＤ蛍光量が掲出された細胞）の割合を計測し、コントロールとなるＰＥＧ－ＣＬＳ無添加の細胞における発現細胞を対照に正規化した結果である。
数値が１．００以下のものは、ウィルスの感染が抑制されたことを表している。

本ウィルス感染抑制剤は、細胞にウィルスが付着するのを抑制する目的で、組織等に添加して用いることができる。本ウィルス感染抑制剤を用いることで、各細胞表面へのウィルスの付着を抑制することができる。

１ 細胞
２ 疎水性部位
３ 親水性部位
４ ウィルス

Claims (5)

1. 下記式１で表される化合物を含有し、細胞へのウィルス付着を抑制することで、細胞へのウィルス感染を抑制する、ウィルス感染抑制剤であって、
   

   

   
   式１中、ｎ及びｍはそれぞれ独立に１以上の整数を表し、Ｘは、ステロール及びステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種から任意の水素原子を除いた１価の基、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキル基、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルケニル基、並びに、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数８以上のアルキニル基からなる群より選択される少なくとも１種の基であり、複数あるＸは同一でも異なってもよく、複数あるＸは互いに連結して環を形成していてもよく、Ｙは、水溶液中における末端の蛍光共鳴移動効率から実測した実効的な鎖長が、４．５ｎｍ以上の親水性高分子からなる高分子鎖であり、複数あるＹは同一でも異なってもよく、ｎ＋ｍが２のとき、Ｌは単結合、又は、２価の基であり、ｎ＋ｍが３以上のとき、Ｌはｎ＋ｍ価の基である、ウィルス感染抑制剤。
2. 前記親水性高分子がポリアルキレングリコール、及び、ポリグリセリンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のウィルス感染抑制剤。
3. 前記親水性高分子の重量平均分子量が４４００以上である、請求項１又は２に記載のウィルス感染抑制剤。
4. 前記鎖長が４．９ｎｍ以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載のウィルス感染抑制剤。
5. 細胞と細胞間基質からなる組織、及び、細胞からなる群より選択される少なくとも一方と、液体媒体とを含有する対象物に、請求項１～４のいずれか１項に記載のウィルス感染抑制剤を添加する、細胞へのウィルス感染抑制方法。

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