JP2021054801A - １９ｆ−ｍｒ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ及びその製造方法並びに応用 - Google Patents

１９ｆ−ｍｒ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ及びその製造方法並びに応用 Download PDF

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Abstract

【課題】１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ及びその製造方法並びに応用を提供する。【解決手段】ペルフルオロカーボンキャリアが分子標的治療薬物を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングして形成されたナノ粒子である、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブである。【効果】当該プローブは、生体内の１９Ｆ−ＭＲ分子画像及び光学的画像を実現し、腫瘍の分子レベルの正確な診断を実現することができ、担持された分子標的治療薬物で標的結合する作用を果たすことができるだけでなく、同時に、標的治療を実現することもでき、コアにおけるペルフルオロが酸素ガスを大量に運搬又は放出することができるという特性によって、腫瘍における酸素欠如微環境を向上させ、化学治療で増感する作用を達成することによって、最終的に腫瘍の診断治療一体化を実現する。【選択図】図４

Description

本発明は、医学診断の技術分野に属し、具体的には、肺がんの診断及びその治療のための１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法と応用に関する。
全世界のがん統計データによると、肺がんは、全世界の発展国の男性及び女性のがん死亡の主な原因である。さらに、２０１８年、中国では肺がんの発病率と死亡率が最も高く、２０１８年、アメリカでは関連の死亡率が最も高かった。大多数の肺がん患者は非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）（８７％）と診断され、残りの悪性腫瘍は小細胞性肺がんに起因する。肺がんの８０％は、気管支と肺胞気管粘膜上皮層の前がん病変に由来し、その後、徐々に潜在的な実質組織に浸透する。しかしながら、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴（ＭＲ）又はポジトロン断層撮影／ＣＴ（ＰＥＴ／ＣＴ）の解像度は臨床上のこれらの微小な早期病変を検出するのに十分ではない。従来の１ＨＭＲＩの制限は、呼吸運動及び空気組織の化学シフトのアーティファクトによって影響されるが、１９ＦＭＲＩは最適化後、感度が高く、信号対雑音比が高く、コントラストが高く、それに背景雑音が小さいなどのメリットを有する。
ペルフルオロカーボン（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ、ＰＦＣ）は通常の有機化合物（例えば、アルカン）に類似の構造を有する分子であり、違いは全ての水素原子がフッ素によって置換されていることであり、医療用途に適している。ペルフルオロカーボンは、生体適合性が高く、安全で毒性がなく、さらに酸素運搬能が高いなどの特徴を有し、血液代替品として用いられる。それに、水に不溶であり、水性エマルションを製造することができる。特に、ペルフルオロカーボンは、生物医学の診断画像プローブとして用いられ、血液プールの画像、炎症の画像及び細胞追跡のために用いられる。同時に、選択的かつ定量的に薬物を放出し、薬物を標的細胞に迅速に輸送し、薬物放出キャリアとして用いることができる。さらに、ペルフルオロカーボン（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ、ＰＦＣ）は、１９ＦＭＲＩの感度が高いという顕著なメリットを有するとともに、その血液と組織のクリアランス時間が比較的長く、磁気共鳴画像の検出のために十分な時間を残している。従って、ペルフルオロカーボンに対する１９ＦＭＲＩは、既に独特で且つ非侵襲的な定量方法になっており、組織の生理学的及び病理学的な評価において幅広い用途があり、特に、分子画像で、その肺がんの微小な早期病変を診断することができる。しかし、ペルフルオロカーボンナノプローブは、単なる診断プローブであり、肺がんに対する治療は明らかではない。
ＡＺＤ９２９１は、第３世代の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）として、その作用メカニズムはＣｙｓ−７９７によってＡＺＤ９２９１をＥＧＦＲＴ７９０Ｍと組み合せて共有結合モードを形成する。非小細胞性進行肺がんに対する薬物であり、Ｔ７９０Ｍ腫瘍をより効果的に標的とすることができると同時に、野生型のＥＧＦＲの活性を保留し、臨床の第一選択治療のために用いられる。しかしながら、ＡＺＤ９２９１の定期的な投与ルートは経口投与であり、薬物の脂溶性が高いことが限界であり、その分子が多くの標的と結合し、汎宿主性が大きくなり、それによる薬物毒性が高くなり、その溶解性と代謝クリアランス率が悪くなる。それに、薬物の局所放出率が低く、腫瘍に対する治療効果を最大化することができない。さらに、ＡＺＤ９２９１の単純な投与では、診断結果の取得と対症療法の効果の両立を実現することができない。
これらの制限を改善するために、最近の研究では、診断と治療という二つの別の過程を一つのナノキャリアに集め、即ち、診断一体化ナノプラットフォームを構成する。ナノ技術は多くのメリットがあり、例えば、多機能修飾でき、固形腫瘍の高透過性と残存効果（ＥＰＲ効果）を有し、生物学的利用度が高く、安定性が高く、標的性を有する以外に、良好な緩和緩解機能と放出制御機能を有し、薬物放出キャリアとして用いられる。従って、分子画像プローブを薬物と一緒に組み合わせて、病状をリアルタイムで正確に診断するとともに同時に治療を行うことができ、又、治療効果をモニタリングして、治療中投与スケジュールをリアルタイムに調整することができ、最適な治療効果に到達することに役立ち、毒性や副作用を低減する。従って、本分野では、診断と治療の二重の機能を有することができるナノ分子プローブが望まれている。
従来技術の欠点に対して、本発明は、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ及びその製造方法並びに応用を提供することを目的とする。
本発明の技術的解決手段は、以下の通りである：
１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブであって、ペルフルオロカーボンキャリアが分子標的低分子様治療薬物を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングして形成されたナノ粒子であることを特徴とする。
上記解決手段では、
前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブは、前記ペルフルオロカーボンがペルフルオロクラウンエーテル（ＰＦＣＥ）であることを特徴とする。
前記分子標的低分子様治療薬物は、第３世代の上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＡＺＤ９２９１を選択することによって、Ｔ７９０Ｍ腫瘍をより効果的に標的とすることができる。
前記蛍光染料は、波長が５８０ｎｍの２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（１６：０ ＬｉｓｓＲｈｏｄ ＰＥ）である。
１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法は、分子標的低分子様治療薬物とペルフルオロカーボンで形成された薬物担持ナノ粒子の合成方法が、物理的コーティング法によるものであることを特徴とする。具体的には、自己組織化溶媒蒸発法、透析法及び乳化−溶媒揮発法の三つの方法の組み合せである。
上記方法の解決手段は、以下の工程を含む。
ペルフルオロカーボンをキャリアとして利用して、分子標的低分子様治療薬物を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングして形成するナノ粒子工程と、工程（１）で得られたナノ粒子をグリセリン、水と均一に混合して、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る工程。
具体的には、分子標的低分子様治療薬物を界面活性剤、及び蛍光染料と均一に混合し、その界面活性剤が表面張力で分子標的低分子様治療薬物を物理的にコーティングした後に、揮発性有機溶媒に溶解して、室温で１０分間撹拌して、ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を蒸発させて、その後、３７℃の真空乾燥オーブンで１２Ｈを乾燥させ、最後に超音波処理によって水に分散させて混合物を得て、使用に供する工程Iと、
ペルフルオロカーボンを工程Iで得られた混合物に均一に分散させ、グリセリンと水をそれぞれ滴下して、高圧ホモジナイザーで５ｍｉｎ混合して、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを含むエマルションを製造する工程IIと、
工程IIで得られたエマルションをｐＨ値７．４、室温環境で、透析を用いて、効果的にコーティングされていない成分を除去し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る工程IIIである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記界面活性剤レシチン９５％（ＰＣ）の使用量は４５−５０ｍｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記コレステロールの使用量は５−６ｍｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記蛍光染料の使用量は０−１ｍｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記揮発性有機溶媒の使用量は１００−３００ｕｌである。
工程Iに記載の揮発性有機溶媒は、クロロホルム又はクロロホルムとメタノールとの混合溶媒である。
工程Iに記載の撹拌は、暗所で行われる。
工程Iに記載の超音波処理の周波数は２０−４０ｋＨｚであり、パワーは４０−９０Ｗであり、超音波時間は５−１０ｍｉｎである。
さらに、工程IIに記載のペルフルオロカーボンと分子標的低分子様治療薬物のモル比は（５０−１０００）：１であり、好ましくは（７０−２００）：１である。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記グリセリンの使用量は０−０．５ｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記水の使用量は２−５ｍｌである。
好ましくは、前記水は超純水である。
１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの肺がん分類と診断治療のための画像造影剤を製造する用途。
本発明は、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを提供し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブは、ペルフルオロカーボンキャリアが分子標的治療薬物（低分子様）を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングして形成されたナノ粒子である。このような１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブはコアシェア型の構造であり、サイズはナノレベルであり、表面は正に帯電しており、薄紫色のエマルション状の液体である。
本発明では、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブにおけるペルフルオロカーボンは、固形腫瘍の高透過性と残存効果（ＥＰＲ効果）によって、腫瘍細胞に貪食され、生体内の１９Ｆ−ＭＲ分子画像を実現でき、腫瘍の分子レベルの正確な診断を実現すると同時に、細胞内での分解を遅くする作用を有し、薬物キャリアとすることができる。
前記分子標的治療薬物（低分子様）は、第３世代の上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＡＺＤ９２９１である。このような薬物は強い疎水性を有し、ＤＭＳＯなどの有機溶媒にのみ溶解するが、水に不溶であり、体内で循環する時に不安定となり標的部位に到達しにくいが、本発明に係るナノ分子プローブによって疎水性薬物の溶解問題及び体内で循環する安定性問題を首尾よく解決し、薬物の生物学的利用度と治療効果を高める。
好ましくは、前記蛍光染料は、波長５８０ｎｍの２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（１６：０ ＬｉｓｓＲｈｏｄ ＰＥ）である。本発明に記載のナノプローブをコーティングする蛍光染料は、光学画像を実現し、動物モデルへの到達部位を観察することができる。本発明に記載のナノプローブは、標的性を有するだけでなく、それに良好な生体適合性、高安定性、高い薬物担持量などのメリットを有する。
好ましくは、前記分子標的治療薬物（低分子様）とペルフルオロカーボンで形成された薬物担持ナノ粒子の合成方法は、物理的コーティング法によるものであり、具体的には、自己組織化溶媒蒸発法、透析法及び乳化−溶媒揮発法の三つの方法の組み合わせであり、それによって、標的薬物とペルフルオロカーボンとの効果的で安定な結合を実現し、且つ、二つの機能が干渉することはない。
本発明は、上記のような１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法を提供する。前記方法は、以下の工程を含む。
ペルフルオロカーボンをキャリアとして利用して、分子標的治療薬物（低分子様）を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングし、即ちナノ粒子を形成する工程（１）と、
工程（１）で得られたナノ粒子をグリセリン、水と均一に混合し、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを取得する工程。
本発明は、物理的コーティング法で１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを製造し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの前記特徴構造で物理的コーティング法のみによって、薬物担持量が高く、粒径が均一で安定なナノプローブを形成することができ、その他のナノプローブのように乳化法と回転超音波法で製造すると、システムを不安定化させ、薬物と蛍光染料をうまくコーティングして本発明記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得ることができない。
本発明の好ましい技術的解決手段として、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法は、具体的には、以下の工程を含む。
分子標的治療薬物（低分子様）を界面活性剤、及び蛍光染料と、均一に混合し、その界面活性剤は、表面張力で分子標的治療薬物（低分子様）を物理的にコーティングする。その後、揮発性有機溶媒に溶解し、室温で１０分間撹拌して、ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を蒸発させて、その後、３７℃の真空乾燥オーブンで１２Ｈを乾燥させ、最後に超音波処理によって水に分散させて混合物を得て、使用に供する工程Iと、
ペルフルオロカーボンを工程Iで得られた混合物に均一に分散させ、グリセリンと水をそれぞれ滴下して、高圧ホモジナイザーで５ｍｉｎ混合して、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを含むエマルションを製造する工程IIと、
工程IIで得られたエマルションをｐＨ値７．４、室温環境で、透析を用いて、効果的にコーティングされていない成分を除去し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る工程IIIを含む。
好ましくは、工程Iに記載の分子標的治療薬物（低分子様）５．５ｍｇに対して、前記界面活性剤レシチン９５％（ＰＣ）の使用量は４５−５０ｍｇであり、例えば、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ又は５０ｍｇである。
好ましくは、工程Iに記載の分子標的治療薬物（低分子様）５．５ｍｇに対して、前記コレステロールの使用量は５−６ｍｇであり、例えば、５．１ｍｇ、５．３ｍｇ、５．４ｍｇ、５．６ｍｇ、５．８ｍｇ又は６ｍｇである。
好ましくは、工程Iに記載の分子標的治療薬物（低分子様５．５ｍｇ）に対して、前記蛍光染料の使用量は０−１ｍｇであり、例えば、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７ｍｇ、０．９ｍｇ又は１ｍｇである。
好ましくは、工程Iに記載の分子標的治療薬物（低分子様）５．５ｍｇに対して、前記揮発性有機溶媒の使用量は１００−３００ｕｌであり、例えば、１０５ｕｌ、１６０ｕｌ、２００ｕｌ、２３０ｕｌ、２８０ｕｌ又は３００ｕｌである。
好ましくは、工程Iに記載の揮発性有機溶媒は、クロロホルム又はクロロホルムとメタノールとの混合溶媒である。
好ましくは、工程Iに記載の撹拌は、暗所で行われる。
好ましくは、工程Iに記載の超音波処理の周波数は２０−４０ｋＨｚであり、パワーは４０−９０Ｗであり、超音波時間は５−１０ｍｉｎである。
工程IIに記載のペルフルオロカーボンと分子標的治療薬物（低分子様）のモル比は（５０−１０００）：１であり、例えば、５０：１、７０：１、９０：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、４００：１、６００：１、８００：１又は１０００：１であり、好ましくは（７０−２００）：１である。
好ましくは、工程Iに記載の分子標的治療薬物（低分子様）５．５ｍｇに対して、前記グリセリンの使用量は０−０．５ｇであり、例えば、０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ又は０．５ｇである。
好ましくは、工程Iに記載の分子標的治療薬物（低分子様）５．５ｍｇに対して、前記水の使用量は２−５ｍｌであり、例えば、２ｍｌ、２．５ｍｌ、３ｍｌ、３．５ｍｌ、４ｍｌ、４．５ｍｌ又は５ｍｌである。
好ましくは、前記水は超純水である。
本発明では、工程IIで得られたエマルションをｐＨ値７．４、室温環境で、透析によって効果的にコーティングされていない成分を除去し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る。
本発明は上記のような１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの肺がん分類と診断治療のための画像造影剤を製造する用途を提供する。
本発明の有益な効果は、本発明に係るプローブが生体内の１９Ｆ−ＭＲ分子画像及び光学的画像を実現でき、腫瘍の分子レベルの正確な診断を実現し、運搬される分子標的治療薬物は標的結合する作用を発揮できるだけでなく、同時に、標的治療を実現でき、コア内における全フッ素が酸素ガスを大量に運搬と放出できる特性によって、腫瘍における低酸素微少環境を改善し、化学治療で増感する作用を達成することによって、最終的に腫瘍の診断治療一体化を実現することであり、実験によって、本発明に係るプローブの１９Ｆ信号増強能力がサンプルの濃度と正の関係があり、サンプルの濃度が高くなるにつれて、信号が直線状に強くなる。本発明に係るプローブは優れた１９Ｆ磁気共鳴画像能力を有する。本発明に係る薬物担持ナノ粒子は優れた標的抗腫瘍効果を有する。
図１は、当該プローブのサイズ分布テストである。 図２は、当該プローブの表面電位分析である。 図３は、当該プローブの透過型電子顕微鏡写真である。 図４は、当該プローブの１９Ｆ−ＭＲＩ ｐｈａｎｔｏｍ画像図である。 図５は、肺腺がんＨ１９７５担持マウスの当該プローブを静脈を経て輸送した後の多核磁気共鳴画像図である。 図６は、異なるナノプローブを使用してＨ１９７５細胞を２４時間インキュベートした後の細胞活力測定である。 図７は、異なるナノプローブを使用して肺腺がんＨ１９７５担持マウスの移植腫瘍を治療した２４日内の体重変化である。 図８は、異なるナノプローブを使用して肺腺がんＨ１９７５担持マウスの移植腫瘍を治療した２４日内の相対的な腫瘍体積変化である。 図９は、異なるナノプローブを使用して肺腺がんＨ１９７５担持マウスの移植腫瘍を治療した抗腫瘍効果を評価するための腫瘍組織学測定である。
以下、具体的な実施例及び図１−図９と併せて本発明をさらに説明する。
実施例１
１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法
I、分子標的治療薬物（低分子様）を界面活性剤、及び蛍光染料と均一に混合する。この界面活性剤は、表面張力で分子標的治療薬物（低分子様）を物理的にコーティングする。次に、揮発性有機溶媒に溶解し、室温で１０分間撹拌して、ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を蒸発させて、その後、３７℃の真空乾燥オーブンで１２Ｈ乾燥させ、最後に超音波処理によって水に分散させて混合物を得て、使用に供する。
II、ペルフルオロカーボンを工程Iで得られた混合物に均一に分散させ、グリセリンと水をそれぞれ滴下して、高圧ホモジナイザーで５ｍｉｎ混合して、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを含むエマルションを製造する。
III、工程IIで得られたエマルションをｐＨ値７．４、室温環境で、透析を用いて、効果的にコーティングされていない成分を除去し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記界面活性剤レシチン９５％（ＰＣ）の使用量は４５−５０ｍｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記コレステロールの使用量は５−６ｍｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記蛍光染料の使用量は０−１ｍｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記揮発性有機溶媒の使用量は１００−３００ｕｌである。
工程Iに記載の揮発性有機溶媒は、クロロホルム又はクロロホルムとエタノールとの混合溶媒である。
工程Iに記載の撹拌は、暗所で行われる。
工程Iに記載の超音波処理の周波数は２０−４０ｋＨｚであり、パワーは４０−９０Ｗであり、超音波時間は５−１０ｍｉｎである。
さらに、工程IIに記載のペルフルオロカーボンと分子標的低分子様治療薬物のモル比は（７０−２００）：１である。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記グリセリンの使用量は０−０．５ｇである。
工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記水の使用量は２−５ｍｌである。
好ましくは、前記水は超純水である。
透過型電子顕微鏡を用いて実施例１のナノ粒子を観察したところ、製造された薬物担持ナノ粒子は、大きさが均一で安定な球形構造であり、平均粒径は約１１５ｎｍ（図３）であり、動的光散乱によって測定した粒径分布は１１０−１３０ｎｍ（図１）であり、電子顕微鏡によるものと一致し、表面ポテンシャルは約＋６２ミリボルト（図２）であった。
実施例２
１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ（実施例１で製造）の画像造影剤としての用途。
１、当該プローブの１９Ｆ−ＭＲＩ ｐｈａｎｔｏｍテストは、実施例１の製造で得られたナノプローブ溶液を１．７％Ａｇｒｏｓｅゾルとブレンドし、最終濃度は、それぞれ７．６７ｍｍｏｌ／Ｌ、１５．３５ｍｍｏｌ／Ｌ、３０．６９ｍｍｏｌ／Ｌ、６１．３８ｍｍｏｌ／Ｌ、１２２．７６ｍｍｏｌ／Ｌのｐｈａｎｔｏｍのサンプルであり、その１９Ｆ画像能力をテストした結果を図４に示す。当該結果から、当該プローブの１９Ｆ信号増強能力はサンプルの濃度と正の関係があり、サンプルの濃度が高くなるにつれて、信号が直線的に増加することが分かる。
２、当該プローブを静脈を経て送達した後の磁気共鳴画像
先ず、ヌードマウスをイソフルランガスで麻酔処置し、麻酔に成功した後、三匹のヌードマウスを順に取って番号順に当該プローブ３００ｕｌを静脈内送達して、１Ｈ／１９Ｆデュアルチューニングコイルで、ヌードマウスの体はスキャンベッドに平行で、ヘッドが先に進んでヘッドが主磁界の方向に一致し、皮下移植腫瘍をできるだけ１Ｈ／１９Ｆコイルの中央の同一の水平線に位置させる。スキャンニングの過程で生命モニタリングシステムを用いて呼吸周波数をモニタリングするとともに、実験動物の酸素供給と３７±０．５℃の体温を維持する。１Ｈ／１９Ｆデュアルチューニングコイルを用いて、Ｔ１ＷＲＡＲＥ配列で解剖学局在画像を行ったところ、画像パラメータＴＲ＝８２０ｍｓであり、ＴＥ＝１２ｍｓであり、ＮＡ＝４であり、ＲＡＲＥｆａｃｔｏｒ＝８であり、ｍａｔｒｉｘ＝２５６ｘ２５６であり、ＦＯＶ＝３８．４ｘ３８．４ｍｍ２であり、ｓｌｉｃｅｔ ｈｉｃｋｎｅｓｓ＝１．５ｍｍであった。１９Ｆ ＲＡＲＥ配列を１Ｈと共局在化したところ、画像パラメータＴＲ＝２０００ｍｓであり、ＴＥ＝１００ｍｓであり、ＮＡ＝１２８であり、ＲＡＲＥｆａｃｔｏｒ＝３２であり、ｍａｔｒｉｘ＝６４ｘ６４であり、ＦＯＶ＝３８．４ｘ３８．４ｍｍ２であり、ｓｌｉｃｅｔＨｉｃｋｎｅｓｓ＝３ｍｍであった。スキャンニング総時間は１２ｍｉｎであった。
健康なヌードマウスの体内に当該プローブを静脈内送達後、磁気共鳴による多核融合画像図が図５に示されるように、腫瘍におけるハイライトは本発明のプローブを静脈内送達した後に得られた多核画像信号である。当該図から、本発明のプローブは優れた１９Ｆ磁気共鳴画像能力を有することが分かる。
実施例３
当該プローブ（実施例１で製造）の標的治療の治療効果評価
１．当該プローブ（実施例１で製造）の細胞レベルの治療効果評価
１０％牛胎児血清を含む培養液を用いて細胞を単一細胞懸濁液に配合し、２００００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、１ウェル当たりの体積は２００ｕｌであった。一晩インキュベートした後、濃度が異なるナノプローブを加える。２４時間後、ＭＴＴ液、ジメチルスルホキシドを加え、振盪機に入れて１５ｍｉｎ低速で振盪した。マイクロプレートリーダーＯＤを用いて５７０ｎｍでそれぞれのウェルにおける吸光度を測定した。
図６から、ＰＦＣＥとインキュベートした後、全ての細胞生存率がいずれも９０％より大きいことが分かる。これは、ＰＦＣＥがＨ１９７５細胞に顕著な細胞毒性を起こさないことを示している。ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１は、２４時間でＰＦＣＥと生理食塩水より高いレベルの細胞毒性を有する。ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１のＨ１９７５細胞に対するインビトロ抗腫瘍活性は顕著な濃度依存性を示す。
２．当該プローブ（実施例１で製造）の肺腺がんＨ１９７５担持マウスの移植腫瘍を標的治療する治療効果評価
１０６のＨ１９７５細胞を５−６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌ヌードマウスの右足に接種して移植腫瘍を樹立した。２０日間接種後、移植腫瘍が６−８ｍｍサイズまで生長した時に追加の実験を行った。マウスを３組（ｎ＝５）に分け、各組のマウスにそれぞれ生理食塩水、ＰＦＣＥ、ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１を投与する。３日毎に５０ｕｌ／回の用量で薬物を投与する。２日毎にノギスで腫瘍のサイズを測定し、公式（ＬｘＷ２）／２によって体積を計算した。ただし、Ｌは腫瘍の最長径であり、Ｗは最短径である。同時に、電子スケールでマウスの体重を量る。２４日モニタリングした後、マウスを殺して、腫瘍を取って組織学と免疫組織化学実験を行う。ヘマトキシリン‐エオジン染色法（ＨＥ染色）で組織をスライスにして組織の病理学変化を鑑定した。腫瘍細胞の増殖と死亡を評価するために、増殖細胞核抗原（Ｋｉ６７）及び末端デオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰギャップエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）染色する。
腫瘍の生長曲線を観察することによって、ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１ナノ粒子でマウスの腫瘍を治療した後、体積の増加がその他の２グループより遅くなったことは、設計した化学治療薬物を担持したナノ粒子が良好な抗腫瘍効果（図７）を有することを示す。さらに、治療中、すべてのグループ間で体重が統計学的に有意な差異はなかった（図８）。同時に、腫瘍スライスのヘマトキシリン‐エオジン染色法（ＨＥ染色）によって、ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１グループの細胞壊死数量がその他の２グループの細胞壊死数量より大きく、末端デオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰギャップエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）染色によって、ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１グループが大量の死亡細胞（緑色蛍光）を示し、増殖細胞核抗原（Ｋｉ６７）の染色によって、ＰＦＣＥ−ＡＺＤ９２９１グループの増殖する細胞数量が生理食塩水グループとＰＦＣＥグループより著しく少ない。本発明の薬物担持ナノ粒子が優れた標的抗腫瘍効果を有することが示される（図９）。

Claims (10)

  1. ペルフルオロカーボンキャリアが分子標的低分子様治療薬物を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングして形成されたナノ粒子であることを特徴とする１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ。
  2. 前記ペルフルオロカーボンがペルフルオロクラウンエーテル（ＰＦＣＥ）であることを特徴とする請求項１に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ。
  3. 前記分子標的低分子様治療薬物は、第３世代の上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＡＺＤ９２９１を選択することによって、Ｔ７９０Ｍ腫瘍をより効果的に標的とすることができることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ。
  4. 前記蛍光染料は波長５８０ｎｍの２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（１６：０ ＬｉｓｓＲｈｏｄ ＰＥ）であることを特徴とする請求項３に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ。
  5. 分子標的低分子様治療薬物とペルフルオロカーボンで形成した薬物担持ナノ粒子を合成する方法は物理的コーティング法によるものであり、具体的には、自己組織化溶媒蒸発法、透析法及び乳化−溶媒揮発法の三つの方法の組み合せであることを特徴とする請求項４に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ。
  6. ペルフルオロカーボンをキャリアとして利用して、分子標的低分子様治療薬物を含む界面活性剤と蛍光染料の混合物をコーティングして形成するナノ粒子工程と、工程（１）で得られたナノ粒子をグリセリン、水と均一に混合して、１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る工程とを含むことを特徴とする請求項５に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブ。
  7. 分子標的低分子様治療薬物を界面活性剤、及び蛍光染料と均一に混合し、その界面活性剤が表面張力で分子標的低分子様治療薬物を物理的にコーティングした後に、揮発性有機溶媒に溶解して、室温で１０分間撹拌して、ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を蒸発させて、その後、３７℃の真空乾燥オーブンで１２Ｈを乾燥させ、最後に超音波処理によって水に分散させて混合物を得て、使用に供する工程Iと、
    ペルフルオロカーボンを工程Iで得られる混合物に均一に分散して、グリセリンと水をそれぞれ滴下して、高圧ホモジナイザーで５ｍｉｎ混合して、制成含有１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを含有するエマルションを調製する工程IIと、
    工程IIで得られたエマルションをｐＨ値７．４、室温環境で、透析を用いて、効果的にコーティングされていない成分を除去し、前記１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブを得る工程IIIを含むことを特徴とする請求項６に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法。
  8. 工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記界面活性剤であるレシチン９５％（ＰＣ）の使用量は４５−５０ｍｇであり、工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記コレステロールの使用量は５−６ｍｇであり、工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記蛍光染料の使用量は０−１ｍｇであり、工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記揮発性有機溶媒の使用量は１００−３００ｕｌであり、工程Iに記載の揮発性有機溶媒は、クロロホルム又はクロロホルムとメタノールとの混合溶媒であり、工程Iに記載の撹拌は遮光条件下で行い、工程Iに記載の超音波処理の周波数は２０−４０ｋＨｚであり、パワーは４０−９０Ｗであり、超音波時間は５−１０ｍｉｎであることを特徴とする請求項７に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法。
  9. 工程IIに記載のペルフルオロカーボンと分子標的低分子様治療薬物のモル比は（５０−１０００）：１であり、好ましくは（７０−２００）：１であり、工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記グリセリンの使用量は０−０．５ｇであり、工程Iに記載の分子標的低分子様治療薬物５．５ｍｇに対して、前記水の使用量は２−５ｍｌであるか前記水は超純水であることを特徴とする請求項に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブの製造方法。
  10. 請求項９に記載の１９Ｆ−ＭＲ／蛍光マルチモード分子画像と薬物担持用の診断一体化ナノプローブによる肺がんの分類と診断治療のための画像造影剤を製造する用途。
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