JP2019140958A - アセト酢酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ハロモナス属に属する好塩菌を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気培養工程、
好気培養工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体をpH6.5〜8.0の中性領域で培養し、培養液にてアセト酢酸又はその塩を産生する微好気培養工程、
微好気培養工程で得られる培養液から、アセト酢酸又はその塩を回収する回収工程
を順に行う点にある。
ハロモナス属に属する好塩菌を培養して、アセト酢酸又はその塩を生産する場合に、ハロモナス属に属する好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として、単糖や二糖類を用いる。
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気培養工程、
(2)好気培養工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体をpH6.5〜8.0の中性領域で培養し、培養液にてアセト酢酸又はその塩を産生する微好気培養工程、
(3)微好気培養工程で得られる培養液から、アセト酢酸又はその塩を回収する回収工程
本発明の実施形態に係るアセト酢酸の製造方法における好気培養工程は、ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程である。
本発明の実施形態に係るアセト酢酸の製造方法の好気培養工程にて用いる好塩菌は、下記の(i)又は(ii)のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
(i)無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地にて好気的に増殖し、3HB又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
(ii)無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地にて好気的に増殖し、PHBを自らの菌体内にて蓄積した後、pHを調整することで、3HB又はその塩を菌体外の培地に分泌産生することを特徴とする好塩菌。
好気培養工程にて用いる培地は、無機塩及び有機炭素源を含有する。培地のpHは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすpHであることが好ましく、具体的にはpH5〜12程度にすればよい。より好ましくはpH8.8〜12の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌された3HBがクロトン酸へ変化するのを抑制するので好ましい。
好気培養工程における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。好気培養工程における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にPHBが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされない。
本発明の実施形態に係るアセト酢酸の製造方法における微好気培養工程は、前記菌体をpH6.5〜8.0の中性領域で培養し、培養液にて微生物に酸素供給を積極的には行わない条件下でアセト酢酸又はその塩を産生する工程である。微生物に積極的に酸素供給を行わずに培養を継続すると、系内の酸素が消費され無酸素に近い状態となるが、絶対嫌気とまではならない酸素濃度数%の環境が維持されるため、微好気培養に適した環境を維持できる。
回収工程において、「培地中にアセト酢酸を生産させる」とは、好気培養工程〜微好気培養工程にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から、その培地中に3HBに3HBデヒドロゲナーゼを作用させ、アセト酢酸を分泌させることを意味する。
上記実施例における好気培養工程で得られた培養液のうち、微好気培養工程に供する直前のものを採取し、下記にしたがって、3HBデヒドロゲナーゼ活性試験を行った。
・好気培養工程で得られた培養液のうち、微好気培養工程に供する直前のものを用いた。
・Tris−HCI bufferの作製
Tris 1.011g 100mlに溶解し、HClでpH調整し、pH6.98、7.47、8.04、8.49の0.1M bufferとした。
Na2CO3 10.6gおよび、NaHCO3 8.4gをそれぞれ1Lの水に溶解し、Na2CO3水溶液300mlにNaHCO3水溶液を加えてpH調整し、pH8.86の0.1M bufferとした。
3HB 158mM (200mg D,L−3−Hydroxybutyrate Na (MW=126.09)/10ml H2O)を作成し、基質溶液とした。
NAD 27.9mM (74mg NAD+(MW=663.42g)/4.0ml of H2O)を作成し、補酵素として用いた。
・菌体破砕用緩衝液は、蒸留水にEDTA 終濃度1mM(50倍濃度溶液を作製して1/50量添加)に調整、Tween20 終濃度0.1%に調整した。上記培養液を5ml 採取し、遠心後、3回水洗浄。最終5mlになるように調整した。
超音波破砕機を使用し、氷上で1分間×5回超音波破砕を行い、13500rpmで遠心後、上清を0.2μmで濾過したろ過液を粗酵素液とした。
(A) 0.1M buffer solution 153μL
(B) Substrate solution 30μL
(C) NAD+ solution 30μL
上記反応液を8連ピペットマン使用して、マイクロタイタープレートに添加。粗酵素液を入れるまで、5分間37℃で保温。最後に、粗酵素液を30μL添加して、波長340nmで反応液の組成の変化を測定し、反応時間600秒まで30秒ごとに測定した(採用測定値:30秒〜210秒)。また、反応後に、pHを測定し、微好気培養工程のpHとした。測定は、BLANK、粗酵素の希釈倍率1倍、1/2倍、1/4倍のものでそれぞれ比較した。
酵素活性(U/ml)=ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×Vt×df/6.22×0.25×Vs
=ΔOD/min×5.21×df
但し、
Vt :Total volume (0.243ml)
Vs :Sample volume (0.03ml)
6.22 :Millimolar extinction coefficient of NADH at 340nm (F/micromole)
0.25 :Light path length (cm)
df :Dilution factor
である。
Claims (1)
- ハロモナス属に属する好塩菌を、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源とを含む培地で好気培養する好気培養工程、
好気培養工程の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して、前記ハロモナス属に属する好塩菌をpH6.5〜8.0の中性領域で培養し、培養液にてアセト酢酸又はその塩を産生する微好気培養工程、
微好気培養工程で得られる培養液から、アセト酢酸又はその塩を回収する回収工程
を順に行うアセト酢酸の製造方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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